Produção de proteínas em Produção de proteínas em bactériasbactérias

Prof. Fabricio Rochedo Conceiçãofabricio.rochedo@ufpel.edu.br

06 de abril de 2010

Graduação em BiotecnologiaDisciplina de Biotecnologia Microbiana II

Proteína recombinante

Proteína produzida a partir da expressão de uma moléculade DNA recombinante em um sistema

de expressão adequado.

DNA recombinante

Molécula de DNA produzida a partir da combinação de seqüências de DNA provenientes de diferentes fontes.

Por que produzir e purificar proteínas recombinantes?

Estudos bioquímicos

Determinação da estrutura 3D

Aplicações biotecnológicas - Terapia - Vacinas - Diagnóstico...

Alternativa para as seguintes limitações:

Quantidade

Dificuldade de purificação a partir do tecido original

Contaminação (príons, vírus, oncogenes...)

Estabilidade: proteínas recombinantes podem ser engenheiradas

Processo completamente controlado

Alguns microrganismos não são cultiváveis in vitro ou são fastidiosos

Mycoplasma hyopneumoniae

Pneumonia Micoplásmica Suína

Sistemas de expressão heteróloga

***Animais e plantas

Produção de proteínas recombinantes em bactérias

Depois do Homo sapiens, a bactéria E. coli é o organismo mais estudado!

Escherichia coli Bacillus subtilis

Engenharia genética X expressão heteróloga

1. Obtenção do DNA a ser clonado

2. Preparo do vetor

3. Ligação do vetor com o “inserto”

4. Transformação da bactéria

5. Seleção dos clones recombinantes

• Necessitam de um promotor forte, de um RBS e de ATG

• Sítio de múltipla clonagem (polylinker)

• Promotores induzíveis (controle da expressão)

• Sinais de secreção

• Fusão com proteínas carreadoras (solubilidade e purificação)

Vetores de Expressão

pAE2831 bp

AmpR

6x His

f1 ori

pUC ori

pT7

Bam HI (137)

Eco RI (171)

Hin dIII (178)

Apa LI (1092)

Apa LI (2338)

Ava I (131)

Ava I (146)

Vetor de expressão em E. coli

RBS ou sequência de Shine Dalgarno

Regulação da expressão gênica – controle da expressão

Operon Lac

Vetores da família pET (Novagen)

• Altos níveis de expressão• Promotor T7 é mais forte que o lac• Controle rigoroso pelo lacO• Necessita de cepa de E. coli especial – BL21(DE3)

IPTG (isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)

Extrato total proteico de bactérias separado em SDS-PAGE

não induzidas

induzidas com IPTG

Proteína recombinan

te de 70 kDa

Produção de proteínas recombinantes em bactérias

(sistema pET)

Vetor de expressão com cauda de histidina

Cromatografia de afinidade – Ni-Sepharose

-Purificação de proteínas com cauda de histidina (his-tag)

-Minimizar a proteólise-Maximizar a expressão-Minimizar “vazamento” de expressão (importante para expressão de proteínas tóxicas)-Facilitar o folding-Solubilidade

Algumas companhias que comercializam vetores de expressão

http://www.promega.com

http://www.neb.com

http://www.stratagene.com

http://www.invitrogen.com

Primeiro hormônio recombinante disponível comercialmente para humanos;

Antes de ser disponibilizada comercialmente era extraída de pâncreas de animais;

Atualmente a forma recombinante é a mais usada no tratamento do diabetes.

Produção de insulina recombinante(Humulin: Human insulin da Eli Lilley Corporation)

Estrutura e biossíntese da molécula de insulina humana

Cadeia α

Cadeia β

Ligações dissulfeto

Seq sinal

Peptídeo CCadeia β Cadeia α

Clivagem da sequência sinal de secreçãoPreproinsulina

ProinsulinaClivagem do peptídeo C

Insulina funcinal

Peptídeo CCadeia β Cadeia α

Obtenção de insulina recombinante

Algumas proteínas recombinantes disponíveispara terapia humana

Insulina (rhI);

Hormônio do crescimento (rhGH);

Hormônio folículo estimulante (rhFSH);

Fator VIII (rhFactorVIII);

Eritropoetina (EPO);

Fator estimulante de colônias de granulócitos (rhG-CSF);

N-acetilgalactosamina-4-sulfatase (rhASB);

DNAse

Ativador do plasminogênio tecidual (rhTPA);

Glicocerebrosidase (rhGBA);

Interferon-alfa, -beta e gama (rhIFN-alpha, -beta e -gama);

Fator de crescimento semelhante à insulina (IGF-1).

Vantagens Desvantagens

Genética e fisiologia bem conhecidas Não faz certas modificações pós-traducionais

Enorme variedade de vetores disponíveis

Atividade biológica pode diferir da proteína natural

Fácil controle da expressão gênica A bactéria apresenta alto conteúdo de endotoxinas

Facilidade de manutenção em laboratório Falta de um mecanismo de secreção

Alta produção de proteínas heterólogas Formação de corpos de inclusão

Vantagens e desvantagens do sistema de expressão heteróloga em E. coli

* Formar grupos com 4 componentes

* Buscar no PubMed artigo científico relacionado a expressão de

proteína heteróloga em E. coli

* Entregar até 12-04-10

- Referência bibliográfica - Descrição da proteína recombinante - Aplicação da proteína recombinante - Vetor utilizado para a expressão - Características do vetor de expressão - Estratégia de purificação da proteína recombinante - Resultados relacionados a expressão da proteína recombinante

Trabalho complementar