Upload
others
View
0
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
DHIONNE CORRÊIA GOMES
PRODUÇÃO DE ESCLEROTIORINA POR
Penicillium sclerotiorum E OBTENÇÃO DE
DERIVADOS COM APLICAÇÃO POTENCIAL EM
ALIMENTOS
Faculdade de Farmácia da UFMG Belo Horizonte, MG
2011
2
DHIONNE CORRÊIA GOMES
PRODUÇÃO DE ESCLEROTIORINA POR
Penicillium sclerotiorum E OBTENÇÃO DE
DERIVADOS COM APLICAÇÃO POTENCIAL EM
ALIMENTOS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciência de Alimentos da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre em Ciência de Alimentos Orientadora: Profª. Drª. Jacqueline A. Takahashi
Faculdade de Farmácia da UFMG Belo Horizonte, MG
2011
3
4
Dedico este trabalho à minha família, que mesmo nos momentos mais difíceis, deram sempre o impulso que eu precisava para pular em direção dos meus sonhos
5
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus, pois sem Ele nada é possível, e somente nEle se encontram as
respostas.
À Professora Jacqueline, por ter acreditado e confiado em mim desde quando este
projeto estava somente no papel. Por ser sempre exemplo de dedicação, de
inteligência, mas também de respeito, honestidade e fé.
À minha mãe Helena, por ter me dado não somente o dom da vida, mas também por
ter instigado em mim a curiosidade, e me transmitido a sabedoria e inteligência.
Aos meus irmãos Diego e Diogo, meus melhores amigos, meus pilares, meu apoio.
A meu pai.
Aos colegas de laboratório, em especial aos mais presentes: Fabiana, Karine, Ana
Sarah, Adriana, Ana Paula, Willian, Bruna, Erick, Rafael, Camila, Paulo e Isabela pelo
auxílio e por fazer com que o ambiente de trabalho, e consequentemente a realização
deste projeto, se tornasse mais agradável.
Aos meus amigos do CEFET e da graduação por estarem sempre presentes em
minhas conquistas.
Ao Philipe, pelo apoio, sensatez e compreensão nos momentos difíceis.
Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Ciência de Alimentos, pela
contribuição em minha formação científica, em especial à professora Evelyn, presente
em minha formação desde a época da graduação.
Aos amigos do laboratório de Microbiologia Industrial, em especial à Raquel e à Ana
Diolina, que foram parte fundamental na minha caminhada até aqui.
À Ivana e à Vany, pelo auxílio na obtenção e interpretação dos espectros de RMN e
dos cromatogramas.
À Professora Cidinha, pelo auxílio com a identificação de fungos.
Ao CNPQ e FAPEMIG, por terem fornecido os recursos necessários para a realização
deste projeto.
A todos os outros que, de uma maneira ou outra, com menor ou maior intensidade,
ajudaram-me a construir este sonho.
6
“Só sabemos com exatidão quando sabemos pouco. À medida que vamos adquirindo conhecimento, instala-se a dúvida”
Johann Wolfgang Von Goethe
7
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS ................................................................................................ 8 LISTA DE FIGURAS ................................................................................................. 9 LISTA DE SIGLAS .................................................................................................... 10 RESUMO ................................................................................................................... 11 ABSTRACT ............................................................................................................... 12 1 INTRODUÇÃO ............................................................................................... 13 2 REVISÃO DA LITERATURA ......................................................................... 14 2.1 Biotecnologia ................................................................................................ 14 2.1.1 Biotecnologia da indústria de alimentos ......................................................... 15 2.2 Fungos ........................................................................................................... 15 2.2.1 Metabólitos secundários ................................................................................. 16 2.2.2 Azafilonas ....................................................................................................... 18 2.3 Penicillium sclerotiorum .............................................................................. 19 2.3.1 Esclerotiorina .................................................................................................. 21 2.4 Corantes naturais ......................................................................................... 23 2.4.1 Corantes naturais usados em alimentos ........................................................ 24 2.5 Biotransformações ....................................................................................... 29 2.5.1 Beauveria bassiana ........................................................................................ 30 3 MATERIAL ..................................................................................................... 34 4 MÉTODOS ..................................................................................................... 38 4.1 Manutenção dos micro-organismos ........................................................... 38 4.2 Preparo do extrato de Penicillium sclerotiorum ........................................ 38 4.3 Purificação da esclerotiorina ...................................................................... 39 4.4 Biotransformação da esclerotiorina pelo Beauveria bassiana ................ 40 4.4.1 Cultivo do B. bassiana e biotransformação .................................................... 40 4.4.2 Análise e purificação do biotransformado ...................................................... 41 4.5 Obtenção de produtos de síntese com diazometano ............................... 42 4.5.1 Síntese ........................................................................................................... 42 4.5.2 Análise e purificação ...................................................................................... 42 4.6 Biotransformação do 1-metil-esclerotiorina pelo Beauveria bassiana ... 42 4.6.1 Cultivo do B. bassiana e biotransformação .................................................... 42 4.6.2 Análise e purificação do produto biotransformado ......................................... 42 4.7 Obtenção de outros derivados da esclerotiorina ...................................... 43 4.7.1 Triagem de fungos .......................................................................................... 43 4.7.2 Análise de CLAE ............................................................................................ 44 4.8 Identificação do Cladosporium sphaerospermum .................................... 45 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ..................................................................... 47 5.1 Produção e extração da esclerotiorina de Penicillium sclerotiorum ...... 47 5.2 Purificação da esclerotiorina ...................................................................... 48 5.3 Biotransformação da esclerotiorina pelo Beauveria bassiana ................ 50 5.3.1 Cultivo de Beauveria bassiana ....................................................................... 50 5.3.2 Obtenção dos produtos biotransformados ..................................................... 52 5.3.3 Elucidação estrutural do Biotransformado 1 ................................................... 53 5.3.4 Elucidação estrutural dos outros biotransformados ....................................... 58 5.4 Síntese da 1-metil-esclerotiorina ................................................................ 62 5.4.1 Elucidação estrutural do Produto 1 ................................................................ 63 5.5 Biotransformação da 1-metil-esclerotiorina pelo Beauveria bassiana ... 65 5.6 Obtenção de outros derivados da esclerotiorina ...................................... 67
8
5.6.1 Identificação do Cladosporium sphaerospermum .......................................... 68 5.6.2 Análise por CLAE ........................................................................................... 69 5.6.3 Interpretação dos resultados da triagem ........................................................ 70 5.6.4 Interpretação dos resultados da biotransformação em uma etapa de B.
bassiana .........................................................................................................
73 5.6.5 Extrato de P. sclerotiorum .............................................................................. 74 5.7 Projeção para uso dos resultados em alimentos ...................................... 75 6 CONCLUSÕES .............................................................................................. 77 7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................. 79 8 APÊNDICES E ANEXOS ............................................................................... 87
LISTA DE TABELAS
1 Corantes naturais autorizados e suas principais fontes .................................... 25 2 Meio de cultura utilizado no crescimento de Penicillium sclerotiorum ............... 36 3 Meio de cultura utilizado no crescimento de Beauveria bassiana ..................... 36 4 Eluentes utilizados na coluna cromatográfica de purificação da esclerotiorina . 39 5 Gradientes de eluição utilizados na análise do HPLC ....................................... 44 6 Informações obtidas a partir dos espectros de RMN de 1H e de 13C, sub-
espectro DEPT e mapa de contornos HSQC para a esclerotiorina ...................
51 7 Massas das substâncias isoladas da biotransformação da esclerotiorina por
B. bassiana e respectivos rendimentos .............................................................
53 8 Deslocamentos químicos dos átomos de carbono inseridos na molécula de
esclerotiorina pela biotransformação .................................................................
54 9 Resultado da análise elementar do biotransformado 1, e número de átomos
correspondentes, levando-se em conta a massa obtida no espectro de massas ESI-MS .................................................................................................
55 10 Propriedades físico-químicas do biotransformado 1 ......................................... 60 11 Propriedades físico-químicas do biotransformado 4 ......................................... 61 12 Propriedades físico-químicas do biotransformado 5 ......................................... 61 13 Propriedades físico-químicas da 1-metil-esclerotiorina ..................................... 66 14 Algumas referências bibliográficas sobre biotransformações realizadas pelos
fungos utilizados neste experimento .................................................................
67 15 Substâncias detectadas por CLAE em extratos de biotransformação de mais
de um fungo .......................................................................................................
73
9
LISTA DE FIGURAS
1 Classes de metabólitos secundários fúngicos ................................................... 17 2 Fruto de Garcinia atroviridis ............................................................................... 20 3 Metabólitos secundários isolados de P. sclerotiorum ........................................ 20 4 Dimerização do herbertenediol .......................................................................... 21 5 Estrutura molecular da esclerotiorina ................................................................ 21 6 Corantes produzidos por fungos ........................................................................ 24 7 Possíveis mudanças estruturais das antocioanidinas em meio aquoso em
função do pH .....................................................................................................
27 8 Estrutura básica do corante Arpink Red e estruturas das Monascusonas A e
B ........................................................................................................................
28 9 Estruturas da Ankaflavina e Monascina ............................................................ 28 10 Redução assimétrica do naftalenan-6-ona por B. bassiana .............................. 30 11 Oxidação da benzidrilsulfanil acetamida por B. bassiana ................................. 31 12 Hidroxilação de um derivado do adamantano por B. bassiana ......................... 31 13 4´-O-metil-glicosilação do composto CGP-62706 por B. bassiana ................... 32 14 Hidrólise do composto CGP-291 por B. bassiana ............................................. 32 15 Acetilação da 3,4-dicloroanilina pelo B. bassiana ............................................. 32 16 Produtos formados pela desmetilação do Diuron por B. bassiana .................... 33 17 Montagem das vidrarias na preparação de diazometano .................................. 37 18 Penicillium sclerotiorum em ágar batata inclinado após 3 dias. Frente (A) e
verso (B) do tubo ...............................................................................................
47 19 Estrutura molecular da esclerotiorina ................................................................ 48 20 Cromatografia em camada delgada comparativa do padrão de esclerotiorina
(A) e o extrato de Penicillium sclerotiorum (B) ..................................................
49 21 Coluna cromatográfica de purificação da esclerotiorina em três etapas de
eluição ...............................................................................................................
49 22 Beauveria bassiana em ágar batata inclinado após 3 dias. Frente (A) e verso
(B) do tubo .........................................................................................................
52 23 Comparação entre os deslocamentos químicos de RMN de 13C da
esclerotiorina (em preto) e do biotransformado 1 (em vermelho) ......................
54 24 Comparação entre os deslocamentos químicos de RMN de 13C da
isocromofilona VI (em preto) e do biotransformado 1 (em vermelho) ...............
55 25 Estruturas da esclerotiorina (1) e da isocromofilona VI (2), mostrando os
diferentes cromóforos ........................................................................................
56 26 Correlações observadas no espectro bidimensional de HMBC para o
biotransformado 1 ..............................................................................................
57 27 Correlações observadas no espectro bidimensional de HMBC para o
biotransformado 1 ..............................................................................................
57 28 Estrutura molecular proposta para o Biotransformado 1 ................................... 57 29 Fragmento estrutural comum nos biotransformados 1, 4 e 5 ............................ 58 30 Provável estrutura do biotransformado 4 ........................................................... 59 31 Provável estrutura do biotransformado 5 ........................................................... 59 32 Mecanismo proposto para a reação entre azafilonas e aminas primárias ........ 62 33 Reação de formação do diazometano ............................................................... 62 34 Comparação entre os deslocamentos químicos da esclerotiorina (em preto) e
do Produto 1 (em vermelho) ..............................................................................
64 35 Correlações observadas no mapa de contornos HMBC para o produto 1 ........ 64 36 Estrutura molecular do Produto 1 (1-metil-esclerotiorina) ................................. 65
10
37 Microcultivo de Cladosporium sphaerospermum ............................................... 68 38 Cladosporium sphaerospermum inoculado em tubo inclinado. Frente (A) e
verso (B) ............................................................................................................
68 39 Características microscópicas do Cladosporium sphaerospermum.
Conidióforos (a), hifas septadas (b), esporos sexuais (c), detalhe da reprodução assexuada (d) .................................................................................
69 40 Cromatograma da biotransformação em duas etapas em contraste com o
cromatograma dos biotransformados isolados ..................................................
74 41 Cromatograma do extrato de Penicillium sclerotiorum ...................................... 75
LISTA DE SIGLAS
CCD Cromatografia em coluna delgada CEPT Proteína de transferência de colesterol esterificado CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência COSY Correlation spectroscopy DEPT Distortionless enhancement by polarization transfer ESI-MS Espectroscopia de massas por ionização por eletrospray FDA Food and Drug Administration HDL Lipoproteína de alta densidade HIV Vírus da imunodeficiência humana HMBC Heteronuclear multiple bond correlation HPLC Cromatografia líquida de alta eficiência HSQC Heteronuclear single quantum coherence IV Infravermelho LDL Lipoproteína de baixa densidade NADPH Fosfato de dinucleótido de nicotinamida e adenina NOESY Nuclear Overhauser effect spectroscopy RMN Ressonância magnética nuclear TOCSY Total correlation spectroscopy UFMG Universidade Federal de Minas Gerais USP Universidade de São Paulo UV Ultravioleta
11
RESUMO
O fungo Penicillium sclerotiorum produz uma grande variedade de metabólitos
secundários, entre eles, a esclerotiorina, que tem tido aplicações nas indústrias
alimentícia e farmacêutica. Devido à sua forte coloração alaranjada, sua capacidade
antioxidante, potencial atividade biológica de redução do colesterol plasmático e no
tratamento da diabetes, esta substância tem sido alvo de diversos estudos na área de
alimentos. Neste projeto, foram produzidas substâncias através da biotransformação da
esclerotiorina com o fungo Beauveria bassiana, obtendo-se cinco produtos de forte
coloração avermelhada. A mudança na coloração da substância aconteceu devido à
troca de um heteroátomo de oxigênio ligado ao carbono 1 da molécula de esclerotiorina
por um átomo de nitrogênio. O experimento de biotransformação foi repetido utilizando,
como substrato, a 1-metil-esclerotiorina, uma substância semi-sintética, porém os
mesmos resultados não foram obtidos. Após a obtenção destes resultados, foi feita
uma triagem com 14 diferentes espécies de fungos, além de Beauveria bassiana, para
verificar a capacidade destes fungos em biotransformar a esclerotiorina. Os extratos
foram analisados por CLAE e mostraram que, destes 14 fungos, nove foram capazes
de biotransformar a molécula de esclerotiorina em uma ou mais substâncias que
apresentaram coloração avermelhada.
Palavras-chave: esclerotiorina, biotransformação, corantes, alimentos
12
ABSTRACT
The fungus Penicillium sclerotiorum produces a wide variety of secondary
metabolites, among them the sclerotiorin, which has many uses in food and
pharmaceutical industries. Due to its strong orange color, its antioxidant activity and
other functions related to cholesterol reduction and treatment of diabetes, this
substance has been subject of extensive studies in food science. In this project,
substances were produced by esclerotiorin biotransformation with the fungus Beauveria
bassiana. Five new products with strong red color were obtained. The change in
coloration of the molecule was due to the exchange of the oxygen heteroatom attached
to sclerotiorin carbon 1 by a nitrogen atom. The biotransformation experiment was
repeated using, as substrate, 1-methyl-sclerotiorin, a semi-synthetic substance, but the
same results were not obtained. After these results, it was performed a screening with
14 different fungi, besides Beauveria bassiana, to evaluate their capacity to
biotransform sclerotiorin. The extracts were analyzed by HPLC and showed that, from
these 14 fungi, nine were able to transform sclerotiorin molecule in one or more
substance with red color.
Key words: sclerotiorin, biotransformation, colorants, food
13
INTRODUÇÃO
Os fungos podem ser utilizados na indústria de duas maneiras: como agentes
produtores de alguma substância de interesse ou como promotores de reações para a
produção de importantes substâncias, sendo os dois processos conhecidos como,
respectivamente, fermentação e biotransformação. Utilizando-se processos
fermentativos, podem-se obter substâncias de atividades interessantes como anti-
oxidantes, antimicrobianos ou corantes.
Os corantes naturais, isolados de plantas ou micro-organismos, podem
apresentar atividades importantes na indústria farmacêutica e de alimentos. Há
necessidade constante de estudos nessa área, pois grande parte desse potencial
biotecnológico não é explorado.
As biotransformações, por serem regio e estereoespecíficas, são pontos
importantes na produção de variadas substâncias. O uso de micro-organismos para a
promoção de determinada reação causa redução de tempo e custo, pois dispensa o
uso de grandes quantidades de reagentes químicos e controle das condições do meio
reativo. Muitos produtos de biotransformação são utilizados na indústria farmacêutica e
de alimentos.
O objetivo geral do trabalho foi produzir derivados do corante natural fúngico
esclerotiorina que possam posteriormente ser usados como corantes, anti-oxidantes ou
conservantes alimentares.
Os objetivos específicos foram:
Produzir esclerotiorina a partir do cultivo do fungo Penicillium sclerotiorum por
meio de fermentação em meio submerso;
Extrair e purificar a esclerotiorina do meio de cultivo utilizando técnicas
cromatográficas;
Obter derivados da esclerotiorina em reações de síntese com diazometano;
Obter produtos biotransformados da esclerotiorina e de derivados com o
emprego do fungo Beauveria bassiana, visando a produção de azafilonas inéditas;
Avaliar a possibilidade de produção de derivados inéditos da esclerotiorina por
outros fungos presentes na coleção de fungos do LaBβ.
14
REVISÃO DA LITERATURA
2.1 – Biotecnologia
Biodiversidade ou diversidade biológica refere-se à variedade de vida na Terra,
como o resultado de bilhões de anos de evolução, compreendendo um número
extraordinário de plantas, animais e micro-organismos. Embora demasiadamente
afetada pela intervenção humana, a biodiversidade tem fornecido muitos micro-
organismos e moléculas com importantes atividades metabólicas, farmacológicas e
grande valor de mercado. Quando corretamente explorada por países de rica
biodiversidade (usualmente países em desenvolvimento ou subdesenvolvidos), o uso
dos recursos naturais de forma sustentável torna-se ferramenta para a diminuição da
pobreza, beneficiando também o planeta como um todo (Rouhi, 2003). Da extensa
biodiversidade brasileira, somente uma pequena fração de espécies de plantas e
micro-organismos já foi estudada quimicamente (Gottlieb, 1980; Hawksworth, 1991).
Atualmente, a prospecção da biodiversidade tem sido ativamente direcionada ao
desenvolvimento de novos fármacos, em processos dinâmicos de monitoramento da
atividade biológica, bem como para a descoberta de novos micro-organismos para
serem usados em processos industriais visando à produção de alimentos ou aditivos
alimentares (Araujo et al., 2006).
A biotecnologia industrial atua no desenvolvimento de produtos e processos
utilizando seres vivos, ou parte deles, sendo uma área de grande importância na
indústria de alimentos e medicamentos, principalmente quando integrada à prospecção
da biodiversidade (Butler, 2004). Processos fermentativos são utilizados na indústria
química para a produção de solventes, ácidos orgânicos, principalmente os ácidos
cítrico, lático, fumárico e giberélico. Metais diversos, como o cobre, zinco, prata, ouro
ou urânio podem ser extraídos com o emprego de micro-organismos, a partir de
minérios de baixo teor (Borzani et al., 2008).
Os processos biotecnológicos na indústria farmacêutica englobam a produção
de antibióticos, esteróides, vitaminas, aminoácidos, polissacarídeos e várias proteínas.
Modificações na estruturas de esteróides e antibióticos são obtidas com o uso de
micro-organismos que podem proporcionar reações de hidroxilação, hidrogenação,
desidrogenação, hidrólise, esterificação, isomerização, aminação ou ruptura de cadeias
(Borzani et al., 2008).
15
Processos de tratamento biológico dos resíduos (águas residuais, lixo) também
são processos fermentativos. Há, ainda, os processos que tem por objetivo a produção
industrial de micro-organismos que podem ser utilizados como fixadores de nitrogênio
do ar na agricultura (bactérias do gênero Rhizobium), no controle biológico de pragas
(bactérias do gênero Bacillus), na produção de vacinas (Borzani et al., 2008), ou ainda
para produção de massa celular como para produção de fermento biológico (levedura
prensada) ou de levedura forrageira (“single cell protein”).
2.1.1 – Biotecnologia na indústria de alimentos
A produção de alimentos fermentados, principalmente bebidas, representa o
maior uso dos micro-organismos na indústria alimentícia. Há pesquisas consolidadas
onde os melhores parâmetros para este tipo de fermentação são descritos, bem como
tem sido descrita a utilização de resíduos da indústria de alimentos para a produção
destas bebidas (Alvarenga, 2006 e Alvarenga et al., 2008). Os leites fermentados tem
sido alvo de grande número de estudos, devido aos benefícios comprovados destes
alimentos (Gonzáles-Sánchez et al., 2010).
Além disso, destaca-se a produção de vinagres, manteigas, queijos, picles,
chucrute, azeitonas, pão e cacau. Concentrados protéico-vitamínicos são produzidos
através de algas e leveduras do gênero Candida. O enriquecimento protéico de
farinhas e farelos pode ser feito pela ação de bolores (Aquarone et. al., 2008).
Fungos também podem ser utilizados em processos de biorremediação para uso
de água proveniente de indústria de alimentos (Azab, 2000).
2.2 – Fungos
Os fungos são organismos eucariotas, podendo ser unicelulares, como as
leveduras, ou pluricelulares, como os cogumelos, sendo diferenciados dos outros
reinos por possuírem parede celular contendo quitina, e ausência de clorofila (Tortora
et al., 2002). Os fungos filamentosos e leveduras apresentam a vantagem de
crescimento relativamente fácil em processos fermentativos, sendo bem adaptáveis à
produção industrial (Smedsgaard e Nielsen, 2004).
O grande avanço, intrínseco ao uso de fungos e seus metabólitos secundários,
advém de múltiplos fatores, como a relativa facilidade de produção do metabólito ativo
por fermentação; a concomitante pronta possibilidade de um scale up do processo
16
fermentativo; o fato de que mesmo espécies comuns de fungos, como aquelas dos
gêneros Penicillium e Aspergillus, conhecidos por sua ubiqüidade, produzem
metabólitos bioativos (Takahashi e Lucas, 2008). A produção de antibióticos por fungos
tem algumas características, comuns à produção de outros metabólitos secundários: a
produção do metabólito é específica da linhagem; há uma instabilidade no processo
biossintético, com tendência a uma diminuição com repiques sucessivos usados para a
manutenção das linhagens; a produção de antibióticos segue uma cinética de
crescimento fúngico associado a um meio de cultura específico (Wijeratne et al., 2004);
o aumento da produtividade freqüentemente ocorre na etapa de esporulação do micro-
organismo; e a variedade estrutural dos metabólitos biossintetizados pode ser
aumentada com pequenas variações das condições de cultivo (Takahashi e Lucas,
2008).
Fungos do filo Basidiomycota e Ascomycota sempre foram utilizados na
alimentação humana, principalmente nos países orientais. Estudos sobre o perfil
nutricional de fungos filamentosos mostram que a biomassa de alguns fungos inferiores
apresenta alto teor de proteínas, com destaque para Penicillium sclerotiorum,
Penicillium janthinellum, Syncephalastrum racemosum e Rhizopus stolonifer. Fungos
da espécie Penicillium sclerotiorum, P. citrinum e P. pinophillum apresentam boa
relação entre ácidos graxos poliinsaturados e saturados, podendo ser considerados
alimentos saudáveis (Carvalho, 2009).
2.2.1 – Metabólitos secundários
Metabólitos secundários são diferenciados dos primários por não participarem
das reações básicas fundamentais à sobrevivência dos micro-organismos. São
geralmente bioativos, de baixa massa molecular e são produzidos como famílias de
compostos em partes restritas do ciclo de vida, geralmente na fase exponencial do
crescimento fúngico, com a produção geralmente correlacionada a um estado
específico de diferenciação morfológica (Keller et al., 2005). Além das plantas,
apresentam metabolismo secundário alguns micro-organismos como as bactérias
filamentosas, as bactérias formadoras de esporos e os fungos filamentosos.
Peptídeos, alcalóides, terpenos e policetídeos são grupos representativos de
metabólitos secundários (Figura 1).
17
Figura 1 – Classes de metabólitos secundários fúngicos (adaptado de Keller et al.
2005)
18
Considerando os vinte medicamentos mais prescritos atualmente, seis são
substâncias provenientes do metabolismo secundário de fungos. Levando-se em conta
que apenas 5% dos fungos estão descritos, há um potencial muito grande a ser
explorado. A busca de metabólitos secundários deve ser feita levando em conta que
sua síntese pode corresponder ao nicho ecológico do fungo e que a interação entre
metabólitos pode induzir um aumento de sua produção (Schulz et al. 2002).
O primeiro produto cristalino considerado um metabólito bioativo foi o ácido
micofenólico, isolado de Penicillium glaucoma, em 1896, por Gosio. Alguns produtos do
metabolismo de fungos tem sido usados na prática de diferentes maneiras como, pela
aplicação direta do produto na medicina, agricultura ou indiretamente, usando-se o
produto original como material de partida para subseqüente modificação química ou
microbiológica (biotransformações), ou utilizando-o como composto principal para
sínteses químicas de novos análogos (Bérdy, 2005).
A grande maioria dos metabólitos bioativos produzidos por fungos vem de
espécies da classe dos ascomicetos e outros fungos filamentosos, além de espécies
endofíticas (fungos que vivem associados a plantas). Algumas espécies de
basidiomicetos vem sendo estudadas, como o caso do Mycena leaiana, um fungo
superior de coloração laranja, cuja substância responsável pela cor apresenta atividade
antibiótica. O número total de substâncias bioativas conhecidas produzidas por fungos
é de aproximadamente 8600, representando 38% de todos os produtos microbianos
(Brizuela et al. 1998; Bérdy, 2005).
Alguns fungos são capazes de produzir metabólitos secundários, muitos dos
quais são tóxicos e mesmo cancerígenos tanto para o homem, como para os animais.
Fungos que crescem nos alimentos, produtores de metabólitos tóxicos, são chamados
toxigênicos e os metabólitos são denominados micotoxinas (Sabino et al., 1982).
Entre as micotoxinas de grande interesse para a Saúde Pública e de importância
agroeconômica estão as aflatoxinas, ocratoxinas, tricotecenos, zearalenona,
fumonisinas e os alcalóides do ergot. Uma única espécie de fungo é capaz de produzir
uma ou várias micotoxinas, e uma mesma micotoxina pode ser produzida por
diferentes espécies de fungos (Hussein e Brasel, 2001).
2.2.2 – Azafilonas
Os policetídeos fúngicos podem variar de tetracetídeos a octacetídeos, tendo
entre 4 ou 8 unidades C2 que contribuem para a cadeia policetídica. Alguns são
produzidos por biosíntese mista, podendo envolver a rota da síntese dos aminoácidos
19
ou terpenóides. Esta classe inclui as antraquinonas, hidroxiantraquinonas,
naftoquinonas e azafilonas, cada uma contendo grande variedade de cores (Mapari et
al. 2010).
As azafilonas são um grupo de substâncias que geralmente apresentam
coloração forte. Pertencem a uma classe de metabólitos secundários estruturalmente
diversa, com uma estrutura pirona-quinona, contendo um anel bicíclico altamente
oxigenado e um centro quaternário quiral (Osmanova et. al., 2010).
Azafilonas exibem uma ampla gama de interessantes atividades biológicas,
como atividade antibacteriana, antiviral, antifúngica, antioxidante, citotóxica, nematicida
e antiinflamatória. A potente atividade não seletiva das azafilonas pode estar
relacionada à formação de γ-piridonas (Osmanova et. al., 2010).
A maioria das espécies produtoras de azafilonas são pertencentes aos gêneros
Penicillium, Monascus, Chaetomium e Talaromyces (Osmanova et. al., 2010).
Musso e colaboradores investigaram a capacidade de inibição da proteína
molecular Hsp90 por azafilonas sintetizadas por Bulgaria inquinans, Monascus
purpureus e Arpergillus deflectus, assim como seus derivados semi-sintéticos. A
proteína Hsp90 atua na proliferação celular e sua inibição pode ser benéfica no
tratamento do câncer (Musso et al. 2010).
2.3 – Penicillium sclerotiorum
Muitas espécies do gênero Penicillium possuem a capacidade de produzir
substâncias bioativas, como a xestodecalactona, que possui propriedades antifúngicas
(Edrada et al., 2002) e a metil-acetal-atrovenetinona, substância com atividade anti-HIV
(Shiomi et al., 2005).
Penicillium sclerotiorum é um micro-organismo mesófilo, de coloração
esverdeada, com aspecto cotonoso. Está presente em solos, porém, já foi isolado do
interior da planta Garnicia atroviridis (Figura 2), podendo, portanto, ser também
classificado como fungo endofítico. Os extratos isolados com hexano e acetato de etila
de P. sclerotiorum apresentam atividade antimicrobiana e anti-HIV.
A investigação química dos extratos de P. esclerotiorum levou à identificação
das seguintes azafilonas: penicilazafilona A (13) e B (14) e decloroisocromofilona III
(15), além de outras substâncias: penicilisorina (16), 2,4-di-hidroxi-6-(5,7S-dimetil-2-
oxo-trans-3-trans-5-nonadienil)-3-metilbenzaldeído (17), ácido (2E,4E,6S)-4,6-di-
20
metilocta-2,4-dienóico (18) e (5S,6R)-5,6-di-hidro-3,5,6-trimetilpiran-2-ona (19)
(Arunpanichlert et al., 2010). Porém, o constituinte em maior concentração nos extratos
de P. sclerotiorum é a azafilona esclerotiorina (20) (Arunpanichlert et al., 2010). Lucas e
colaboradores descreveram estudos sobre a atividade antimicrobiana de três
substâncias isoladas dos extratos de P.sclerotiorum, pencolídeo (21), isocromofilona VI
(22), além da esclerotiorina (20). As estruturas moleculares se encontram
representadas na Figura 3 (Lucas et. al., 2007; Arunpanichlert et. al., 2010).
Fonte: The Plant Observatory, 2010
Figura 2 – Fruto de Garcinia atroviridis
Figura 3 – Metabólitos secundários isolados de P. sclerotiorum
21
Espécies do gênero Penicillium, além da produção de metabólitos, possuem um
longo histórico de uso biotecnológico na produção de enzimas. Knob e Carmona
descreveram uma β-xilosidase com grande atividade extraída de P. sclerotiorum. Esta
enzima degrada a xilana, a mais abundante fonte de carbono não-celulósica presente
em madeira e resíduos agroindustriais. A adição desta enzima a rações animais pode
aumentar seu valor nutritivo. Outro uso seria na clarificação e maceração de sucos e
vinho (Knob e Carmona, 2009).
Penicillium sclerotiorum também é relatado na literatura como útil em alguns
experimentos de biotransformação, como a dimerização do herbertenediol (23), para
formar mastigoforenos A (24) e B (25), como é mostrado na Figura 4 (Harinantenaina
et. al., 2005).
Figura 4 – Dimerização do herbertenediol
2.3.1 – Esclerotiorina
O constituinte químico predominante em P. sclerotiorum é a esclerotiorina (20),
pigmento contendo um átomo de cloro. A esclerotiorina (20) foi primeiramente isolada
em 1940 por MacCurtin (MacCurtin e Reilly, 1940). Estudos vêm mostrando que este
pigmento possui algumas atividades biológicas interessantes, como a indução de
formação de clamidosporo, célula hifal que se comporta como esporo no fungo, de
maior resistência térmica (Weng et al., 2004).
O
O
Cl
O
O
O
20
Figura 5 – Estrutura molecular da esclerotiorina
22
A esclerotiorina (20) tem tido aplicações importantes na indústria de alimentos,
como, por exemplo, a inibição da lipoxigenase. Esta enzima catalisa a oxidação regio e
estereoespecífica de ácidos graxos contendo um sistema cis,cis-1,4-pentadieno,
formando hidroperóxidos. A peroxidação de ácidos graxos provoca a rancificação de
alimentos oleoginosos e gorduras de origem vegetal e animal, alterando o sabor, odor,
coloração e reduzindo seu valor nutritivo. Em mamíferos, os produtos das reações
catalisadas pela lipoxigenase são responsáveis por uma grande variedade de
desordens, como aterosclerose, alergias, inflamação, asma e hipersensibilidade. Por
esse motivo, inibidores da lipoxigenase podem ser usados tanto em indústria de
alimentos, como antioxidantes; ou em setores de saúde, graças a seus benefícios
farmacológicos (Chidananda e Sattur, 2007).
Sabe-se também que a esclerotiorina (20) é capaz de inibir a proteína de
transferência de colesterol esterificado (CETP). A CETP é conhecida por transferir
colesterol esterificado entre as lipoproteínas do plasma. Vários fatores indicam a
importância desta proteína no desenvolvimento da aterosclerose, pois ela diminui a
concentração do colesterol nas lipoproteínas de alta densidade (HDL). Pessoas com
deficiência genética de CETP possuem alto HDL, baixos níveis de lipoproteína de baixa
densidade (LDL) e apresentam baixa incidência de aterosclerose (Tomoda et al., 1999).
Outra atividade importante da esclerotiorina (20) é a inibição da enzima aldose
redutase, uma oxiredutase dependente de NADPH que catalisa a conversão de glicose
em álcool, e promove acúmulo de sorbitol em vários tecidos, quando em condições de
hiperglicemia, como é o caso da diabetes mellitus. Este nível elevado de sorbitol pode
levar a várias complicações como retinopatia, catarata, neuropatia e nefropatia. Os
inibidores da aldose redutase podem reverter essa mudança bioquímica ou até prevenir
estas complicações (Chidananda et al., 2006).
Além dos possíveis usos na área de alimentos, estudos mostram várias outras
atividades farmacológicas interessantes da esclerotiorina (20), como a inibição da
monoamina oxidase, alvo da ação de antidepressivos; inibição do receptor de
endotelinas, responsável pela vasoconstrição e fibrose de vasos sanguíneos; ou até
mesmo sua atividade antibacteriana (Pairet et al., 1995; Weng et al., 2004). Estudos
mais recentes mostram uma atividade inibidora da protease e invertase do HIV
(Arunpanichlert et al., 2010).
23
2.4 – Corantes naturais
Um corante natural é definido como um pigmento que é sintetizado e acumulado
ou excretado a partir de células vivas. Certos pigmentos, assim como fenóis oxidados e
outros derivados mais simples de fenóis podem ser formados até mesmo por células
em processo de morte (Hendry, 1996).
A presença ou ausência de coloração de uma molécula biológica é determinada
por sua estrutura, principalmente a estrutura eletrônica, o tamanho da molécula,
solubilidade e a composição elementar. Algumas alterações na estrutura de molécula
incolores podem fazer com que ela absorva energia em comprimentos de onda menos
energéticos, e consequentemente, dão cor à substância. Esta alteração é chamada de
mudança batocrômica e pode ser causada por seis modificações estruturais: aumento
do tamanho da cadeia, ramificação da cadeia carbônica, rearranjo em um simples anel,
adição de nitrogênio ou oxigênio, ligação de dois ou mais anéis e adição de certos
metais de transição. Moléculas que já possuem coloração, ao sofrerem uma mudança
batocrômica, podem ter sua coloração alterada (Hendry, 1996).
Fungos filamentosos, particularmente ascomicetos e basidiomicetos, e liquens
são conhecidos por sintetizarem e secretarem diversas classes de pigmentos, como
metabólitos secundários, que possuem uma extraordinária gama de cores. Cogumelos
e liquens são difíceis de cultivar em laboratório, e, consequentemente, difíceis de
extrapolar a produção de seus metabólitos para escala industrial. Muitos ascomicetos,
ao contrário, são adequados à produção industrial pela facilidade de crescimento em
laboratório. O controle das condições de cultivo em biorreatores minimiza as variações
entre lotes (Mapari et al. 2010).
Diferentemente das plantas, fungos não produzem clorofilas e poucas espécies
são produtoras de carotenos. Algumas espécies fúngicas acumulam substâncias
pigmentadas que, em geral, estão ausentes ou presentes somente em baixas
concentrações em espécies de outros reinos, como é o caso da riboflavina (vitamina
B2), que proporciona a coloração amarela a fungos dos gêneros Russula e Lyophyllum.
Os únicos pigmentos comuns entre fungos e plantas ou animais são as betalaínas,
melaninas, um pequeno número de carotenóides e algumas antraquinonas (Hendry,
1996).
Os pigmentos policetídeos são encontrados predominantemente nos
ascomicetos, e em alguns basidiomicetos. Além desses, as terfenilquinonas e outros
24
derivados fenólicos, como os derivados dos ácidos fenilpropanóico e cinâmicos
também são responsáveis pela coloração de alguns fungos (Hendry, 1996).
Os corantes sintetizados por fungos apresentam diversas funções, variando de
proteção contra foto-oxidantes letais, como os carotenóides, proteção contra o estresse
ambiental, como as melaninas, ou até agindo como cofatores em catálises enzimáticas,
como o caso das flavinas (Mapari et al. 2005).
A Figura 6 apresenta a estrutura de algumas classes de corantes produzidos por
fungos, o β-caroteno (26), um carotenóide, a monascina (27), um policetídeo e o ácido
leprarínico (28), uma terfenilquinona.
Figura 6 – Corantes produzidos por fungos (adaptado de Hendry, 1996)
2.4.1 – Corantes naturais usados em alimentos
Corantes utilizados em alimentos são chamados aditivos de cor. Segundo o
FDA, aditivo de cor é qualquer corante, pigmento ou substância que, quando
adicionado ou aplicado a um alimento, droga ou cosmético, ou até ao corpo humano, é
capaz de, sozinho, ou através de reações com outras substâncias, transmitir cor (FDA,
2010).
Aditivos de cor são utilizados em alimentos por muitas razões: para encobrir a
perda de cor devido à exposição à luz, ar, temperaturas extremas, umidade e
condições de estocagem; para corrigir variações naturais na cor; para melhorar cores
que existem naturalmente e para prover cor a alimentos sem cor. Refrigerantes de cola,
margarina e balas de menta são exemplos de alimentos que possuem a coloração
devido ao uso de aditivos (FDA, 2010).
25
A preferência dos consumidores por corantes extraídos de fontes naturais está
associada à imagem de serem produtos saudáveis e de boa qualidade. Corantes
sintéticos tendem a ser julgados como indesejáveis e prejudiciais. Alguns são
considerados responsáveis por reações alérgicas e intolerâncias (Blenford, 1995).
Os corantes naturais mais utilizados estão listados na Tabela 1:
Tabela 1 – Corantes naturais autorizados e suas principais fontes (adaptado de
Mapari et. al., 2005)
Pigmento Fonte Gama de cor
Ácido carmínico e carmina Cochonilha fêmea – inseto do
Peru e Equador
Laranja a vermelho
Rosa a vermelho
Antocianinas Sabugueiro, uva, cenoura roxa,
repolho
Rosa/vermelho a
azul/malva –
dependente do pH
Betanina Beterraba Rosa a vermelho
Caramelo Carboidratos comestíveis Marrom
Carbo medicinalis Planta Preto
Carotenóides
β-caroteno Óleo de palma Amarelo a laranja
Bixina ou norbixina Sementes de urucum (Bixa
orellana) da América do Sul
Laranja
Capsantina e
capsorubina
Páprica (Capsicum annum L.) Laranja avermelhado
Licopeno Tomate (Lycopersicum
esculentum)
Vermelho alaranjado
Luteína Malmequer (Tagestas erecta) Amarelo dourado
Cantaxantina Salmão, camarão e flamingos Rosa alaranjado
Clorofila Grama, luzerna e urtiga Verde a oliva
Clorofilina (complexo
cúprico da clorofila)
Grama, luzerna e urtiga Verde azulado
Curcumina Rizoma de planta (Curcuma
longa) da Índia
Laranja-amarelo
Riboflavina Semi-sintética, usando ribose
produzida por fermentação
bacteriana
Amarelo
26
Os corantes naturais que são atualmente autorizados para uso na União
Européia são derivados de variadas fontes, de plantas a insetos, como o caso do ácido
carmínico, derivado da cochonilha, um inseto da família Dactylopiidae. A atual
produção de corantes naturais depende do suprimento externo e sazonal de diversos
materiais, resultando em variações no perfil do pigmento extraído. Como os corantes
são extraídos de fontes naturais, eles são, na maioria dos casos, misturas de
composição variada que dependem do cultivar e das condições climáticas, e são
difíceis de serem caracterizados no que diz respeito à pureza e presença de
contaminantes (Mapari et al. 2010).
Há uma grande variação na estabilidade e funcionalidade de diferentes classes
de corantes naturais existentes. Problemas de estabilidade perante aquecimento, luz e
pH limitam a aplicação de certos corantes a certos tipos de produtos. Antocianinas são
flavonóides e são caracterizadas por uma estrutura catiônica básica. A cor violeta
básica de antocioaninas é sensível à oxidação, branqueando com dióxido de enxofre, e
variando com o pH, o que limita a sua aplicação a alimentos ácidos e bebidas. A Figura
7 representa as mudanças na estrutura de antocionanidinas que resultam na mudança
da coloração. Betaninas, carotenóides e pigmentos de clorofila são facilmente
descoloridos por oxidação, sendo sensíveis à luz, ao aquecimento e ao oxigênio. O
corante curcumina apresenta um problema diferente, pois este pigmento carrega um
sabor picante, o que limita o seu uso como corante (Mapari et. al., 2005).
27
O
OAçúcar
OH
HO
R
R'
OH
O
OAçúcar
OH
O
R
R'
OH
O
OAçúcar
OH
HO
R
R'
OH
OH O
OAçúcar
OH
O
R
R'
O-
O
OAçúcar
O-
O
R
R'
O-
O-
OAçúcar
O-
-O
R
R'
O-
O
H+
OH-
-H 2O
+H 2O
H+ OH-
-H2O +H2O
H+ OH-
OH-H+
H+
OH-
pH 1-2
cátion flavílico, vermelho
pH 6,5-8
anidrobase, violeta
anidrobases, azul
pH 9-12
pH<6
carbinol, incolor
pH 13-14
pseudobase chalcona, amarelo
29 30
3132
3334
Figura 7 – Possíveis mudanças estruturais das antocioanidinas em meio aquoso
em função do pH (Terci e Rossi, 2002)
Estudos sobre corantes produzidos por fungos visam a sua utilização em
alimentos. Na República Checa, um novo corante de alimentos chamado Arpink RedTM
(35), uma antraquinona produzida por Penicillium oxalicum, foi liberado para
comercialização entre 2004 e 2006. Fungos do gênero Monascus são utilizados no sul
da China, Japão e sudeste da Ásia para produzir vinho vermelho de arroz, queijo de
soja vermelho e Anka (arroz vermelho). Estes fungos são conhecidos por produzirem
pigmentos que variam do laranja ao violeta, além das monascusonas A (36) e B (37),
pigmentos amarelos descobertos recentemente. Estes pigmentos, além do corante de
alimentos Arpink RedTM (35) estão representados na Figura 8. Entretanto, algumas
cepas de Monascus também produzem citrinina, uma micotoxina, o que limita o seu
28
uso na área de alimentos. No Japão, apenas a espécie Monascus purpureus é
autorizada para uso em alimentos (Mapari et. al., 2005 e Mapari et. al., 2010).
Figura 8 – Estrutura básica do corante Arpink Red e estruturas das
Monascusonas A e B
A toxicidade de outros policetídeos produzidos por fungos, principalmente do
gênero Monascus, têm sido pesquisada. O pigmento amarelo ankaflavina (38) e seu
análogo estrutural, monascina (39) (representados na Figura 9), apresentam baixa ou
nenhuma citotoxidade para células, o que indica que são substâncias seguras, se
consumidas em doses apropriadas (Mapari et. al., 2010).
Figura 9 – Estruturas da Ankaflavina e Monascina
Corantes vermelhos e amarelos tem sido amplamente usados em alimentos,
porém ainda há uma demanda de corantes azuis. Os ascomicetos são capazes de
produzir policetídeos que variam do vermelho ao amarelo, e até mesmo verde e azul.
29
Muitos destes corantes apresentam atividade anti-oxidante e anti-aterogênica, e alguns
já possuem estudos sobre sua toxicidade. Além de alguns policetídeos produzidos por
Monascus, corantes laranjas extraídos de P. aculeatum e corantes amarelos extraídos
de E. nigrum são potencialmente seguros. Porém, grande parte dos corantes
estudados são instáveis à luz, o que pode degradar a coloração apresentada (Mapari
et. al., 2010).
2.5 – Biotransformações
Transformações microbianas ou biotransformações representam uma série de
reações biológicas, geralmente de xenobióticos, substâncias estranhas para o
organismo, catalisadas por células íntegras ou enzimas isoladas. Devido à sua alta
regio e estereosseletividade, transformações microbianas complementam sínteses
orgânicas e tem sido muito aplicadas na indústria farmacêutica e de alimentos. As
reações de biotransformação, especialmente aquelas que utilizam fungos, também tem
sido usadas como modelos in vitro do metabolismo mamífero de uma variedade de
compostos bioativos e drogas (Rai, 2009).
As biotransformações podem ser realizadas por bactérias, fungos, leveduras e
plantas, e podem envolver diferentes enzimas, como oxigenases, redutases e
hidratases (Duetz et al., 2003; Palmqvist et al., 2006).
Biotransformações tem sido usadas na indústria de alimentos para diversos fins.
Por exemplo, as catequinas do chá são naturalmente convertidas em teaflavinas
durante o seu processamento, através da enzima polifenol oxidase. As teaflavinas são
substâncias bioativas, com alta atividade antioxidante, além de propriedades
antimutagênicas e antiinflamatórias, e aumentam a qualidade da bebida. Esta
conversão acontece naturalmente, porém, pode ser feita com maiores rendimentos
utilizando extratos de planta contendo a enzima ou até mesmo utilizando a enzima
purificada (Sharma et al., 2009).
Outro exemplo é a obtenção de compostos de aroma a partir de carotenóides. A
clivagem da molécula de carotenóides é obtida através de degradação térmica,
fotoxigenação ou autoxidação, o que gera a formação de compostos de aroma. Esta
clivagem também pode ser obtida através do sistema enzimático de dioxigenases de
micro-organismos ou plantas (Uenojo et al., 2007).
30
2.5.1 – Beauveria bassiana
Beauveria bassiana é um fungo filamentoso de ocorrência global em solos.
Como um agressivo fungo entomopatogênio e parasita, ele é causador da doença
muscardina em insetos. O fungo prolifera no corpo do inseto, produzindo toxinas, como
a beauvericina, que enfraquece o sistema imune do hospedeiro, eventualmente
matando-o (Rai, 2009).
Beauveria bassiana tem sido frequentemente empregado em estudos de
biotransformação devido a seu eficiente sistema enzimático, ampla aceitabilidade de
substratos e sua capacidade de realizar diferentes tipos de reação. Tem sido relatado
que este fungo é capaz de biotransformar mais de 300 tipos diferentes de substratos
(Rai, 2009).
Beauveria bassiana é um importante catalisador microbiano, o segundo micro-
organismo mais frequentemente usado como biocatalisador, atrás somente do
Aspergillus niger, e suas aplicações são superadas somente por A. niger,
Pseudomonas putida e Saccharomyces cerevisiae (Rai, 2009).
As principais reações catalisadas por Beauveria bassiana são descritas a seguir.
Os exemplos também representam as principais reações de biotransformação
realizadas por fungos (Rai, 2009).
Redução
Uma variedade de reduções catalisadas por fungos é conhecida, sendo que a
mais comum é a redução do grupo carbonila. A Figura 10 representa a redução
assimétrica do naftalenan-6-ona (40) por B. bassiana (Rai, 2009).
O
O
O O
O
OH O
O
OH
40 41 42
Figura 10 – Redução assimétrica do naftalenan-6-ona por B. bassiana
Oxidação
Alguns estudos sobre oxidação biocatalítica tem sido focados em reações de
sulfoxidação. A Figura 11 representa a oxidação da benzidrilsulfanil acetamida (43)
levando ao isômero R do modafinil (44), catalisada por Beauveria bassiana. Modafinil é
31
um fármaco neurotrópico autorizado para uso nos Estados Unidos para o tratamento da
narcolepsia e apnéia do sono (Rai, 2009).
S
NH2
O
S
NH2
OO
43 44
Figura 11 – Oxidação da benzidrilsulfanil acetamida por B. bassiana
Hidroxilação
Hidroxilação microbiana é uma das reações de biotransformação mais comuns e
importantes. Baseia-se na introdução regio e estereosseletiva de um grupo hidroxila em
um carbono não ativado, o que é difícil de se obter pelos métodos químicos
tradicionais. A Figura 12 representa a hidroxilação de um derivado éster do
adamantano (45) por Beauveria bassiana (Rai, 2009).
O
O
O
O
OH
45 46
Figura 12 - Hidroxilação de um derivado do adamantano por B. bassiana
Glicosilação
A inserção de uma molécula de glicose e, principalmente, a inserção de um
grupo 4’-O-metil-glicose é uma típica reação catalizada por B. bassiana. A Figura 13
mostra a glicosilação do composto CGP-62706 (47) por este fungo. Este composto é
um potente inibidor da tirosina quinase, enzima que transfere um grupo fosfato a um
resíduo de tirosina de uma proteína, e deste modo, regulando importantes funções no
corpo, como a abertura de canais iônicos e a expressão gênica (Rai, 2009).
32
N N
HN HN Cl
N N
HN HN Cl
4'-O-Metil-glicose
O
47
48
Figura 13 – 4´-O-metil-glicosilação do composto CGP-62706 por B. bassiana
Hidrólise
Hidrólise de ésteres e epóxidos são relatadas para Beauveria bassiana. A Figura
14 representa a desacetilação do composto CGP-291 (49), um agente antiprotozoário
(Rai, 2009).
N N
N
NO2N
O O
N NH
N
NO2N
O
49 50
Figura 14 – Hidrólise do composto CGP-291 por B. bassiana
Acetilação
A Figura 15 representa a biotransformação da 3,4-dicloroanilina (51) pelo B.
bassiana (Rai, 2009).
Cl
Cl
NH2 Cl
Cl
HN
O51 52
Figura 15 - Acetilação da 3,4-dicloroanilina pelo B. bassiana
33
Desmetilação
A Figura 16 representa a degradação do herbicida Diuron (53), através de
desmetilações. Os produtos formados são menos tóxicos do que o herbicida e, por esta
razão, o B. bassiana pode ser utilizado para recuperação de solos contendo este
produto tóxico (Rai, 2009).
Cl
Cl
HN N
O
Cl
Cl
HN
HN
O
Cl
Cl
HN NH2
O
53 54 55
Figura 16 – Produtos formados pela desmetilação do Diuron por B. bassiana
34
MATERIAL
A maior parte dos materiais utilizados no desenvolvimento do projeto se
encontra no LaβB, Laboratório de Biotecnologia e Bioensaios, do Departamento de
Química da UFMG.
As análises de RMN, CLAE e as análises elementares foram feitas no
Departamento de Química da UFMG. A identificação do fungo foi feita no Laboratório
de Micologia, do Instituto de Ciências Biológicas. As análises por espectrometria de
massas foram feitas na Central Analítica, USP. Os fungos utilizados fazem parte da
coleção de fungos do LaβB.
Equipamentos:
Espectrômetro Bruker Avance DRX400 e DPX200 – foram utilizados para
registrar espectros de RMN
PE 2400 CHN Elemental Analyzer – foi utilizado para análise elementar
HPLC Shimadzu prominence LC-20AT
Espectometro de massas Burker Daltonics modelo MicroTOF lc
Espectômetro de massas MicroMass Waters Q-TOF-Micro
Infravermelho Perkin Elmer Spectrum BX
Ultravioleta B-380 Micronal
Ponto de fusão Gehaka modelo PF 1000, série 0530/06001020
Autoclave vertical Fanen, modelo 415/3, série J03610
Balança analítica Quimis, modelo Q-ILA2104, 210g/ 0,1mg
Balança eletrônica Digimed KN1000C, classe de exatidão II, série 04G6
Bomba de vácuo e pressão Tecnal TE-0581
Estufa de secagem Fanen Ltda Modelo 002 CB
Estufa para placa cromatográfica Quimis G-317 8122
Evaporador rotativo Fisatom Modelo 803
Capela VECO, modelo JLF 912, série FL 5799
Refrigerador Nuaire -86ºC Ultralow Freezer
Câmera fotográfica Sony Cyber-shot 7.2 mega pixels
Microondas Master Cooking CCE M-500
Mili-Q Plus Milipore Qpak 1 CPMQ004R1
35
Micropipeta automática Digipet 1-5 mL
Micropipeta automática Digipet 20-200 µL
Incubadora de bancada Cientec CT-712
Microscópio eletrônico Olympus CX 40
Coluna cromatográfica de vidro de 5cm de diâmetro e 100cm de altura
Coluna cromatográfica de vidro de 1,5cm de diâmetro e 100cm de altura
Reagentes e meios de cultura:
D-glicose
Peptona bacteriológica
Fosfato de potássio dibásico
Cloreto de sódio
Ágar batata dextrosado
Extrato de levedura
Sulfato de magnésio hepta-hidratado
Hidróxido de sódio
N-methyl-N-nitroso-p-toluenosulfonamida – Diazald
Acetato de etila
Diclorometano
Hexano
Álcool metílico
d-clorofórmio
Metanol grau HPLC
Acetonitrila grau HPLC
Termômetro Incoterm, série 313675
Sílica gel 60G (Vetec) para cromatografia em camada delgada
Sílica gel (Vetec 70-230 mesh) pra cromatografia em coluna
Sílica gel (Sigma 230-400 mesh) para cromatografia em coluna flash
Preparo de meios de cultura:
Meio base 1 (Lucas et al., 2007)
Os ingredientes listados na Tabela 2 foram dissolvidos em quantidade suficiente de
água para alcançar a concentração desejada. A solução obtida foi transferida para
recipiente adequado e esterilizado em autoclave vertical a 121 ºC por 15 min.
36
Tabela 2 – Meio de cultura utilizado no crescimento de Penicillium sclerotiorum
Ingrediente Concentração (g.L-1)
Glicose 20
Peptona de carne bacteriológica 5
Fosfato de potássio monobásico 1
Cloreto de sódio 5
Sulfato de magnésio hepta-hidratado 0,5
Meio base 2
O meio base 2 foi preparado conforme descrito para o meio base 1, porém,
utilizando 50% da concentração dos ingredientes. A solução obtida foi transferida para
recipiente adequado e esterilizado em autoclave vertical a 121 ºC por 15 min.
Meio base 3 (Martins, 2009)
Os ingredientes listados na Tabela 3 foram dissolvidos em quantidade suficiente de
água para alcançar a concentração desejada. A solução obtida foi transferida para
recipiente adequado e esterilizado em autoclave vertical a 121 ºC por 15 min.
Tabela 3 – Meio de cultura utilizado no crescimento de Beauveria bassiana
Ingrediente Concentração (g.L-1)
Glicose 20
Peptona de carne bacteriológica 10
Extrato de levedura 0,5
Ágar batata dextrosado
Foi preparado segundo instruções do fabricante. Em um béquer foram
adicionadas quantidades de ágar batata dextrosado e água suficientes para alcançar a
concentração de 39 g.L-1. Este béquer foi aquecido em forno de microondas até fusão
do ágar. A preparação obtida foi transferida para recipiente adequado e esterilizada em
autoclave vertical a 121 ºC por 15 min.
Ágar Sabouraud
Foi preparado segundo instruções do fabricante. Em um béquer foram
adicionados ágar sabouraud e água para alcançar a concentração de 65 g.L-1. Este
béquer foi aquecido em microondas até garantir total fusão do ágar. A preparação
37
obtida foi transferida para recipiente adequado e esterilizada em autoclave vertical a
121 ºC por 15 min.
Preparo de diazometano (Hudlicky, 1980)
Em um balão de fundo redondo, foram adicionados 200 mL de etanol P.A. e 100
mL de hidróxido de sódio a 10%. Em um funil de separação foram adicionados 10,4 g
de Diazald diluídos em 80 mL de éter etílico P.A.. Conforme a montagem (Figura 17), a
solução etérea foi gotejada no balão lentamente, devido ao risco de explosão, em
temperatura controlada de 60 ºC. O diazometano, diluído em éter etílico, foi recolhido
em um erlenmeyer.
Figura 17 – Montagem das vidrarias na preparação de diazometano
Preparo de solução de esclerotiorina 20 mg.mL-1:
Em uma proveta de 10 mL, foram dissolvidos 200 mg de esclerotiorina em 10 mL
de acetato de etila.
38
MÉTODOS
4.1 – Manutenção dos micro-organismos
Os fungos da coleção do LaβB são armazenados como uma suspensão de
esporos em glicerol 12% a -86 ºC. Os fungos a serem utilizados foram retirados do
armazenamento, transferidos para geladeira (a 8 ºC) onde permaneceram por dois
dias. Em seguida, retirou-se uma alíquota desta suspensão e inoculou-se em uma
placa de Petri contendo ágar batata dextrosado (Takahashi et al., 2008).
4.2 – Preparo do extrato de Penicillium sclerotiorum
Um pedaço do cultivo do Penicillium sclerotiorum no ágar em placa de petri foi
recortado e transferido para um tubo contendo ágar batata dextrosado inclinado. Após
três dias, a biomassa do fungo foi retirada do meio inclinado por meio de raspagem
com alça de platina, utilizando água esterilizada e inoculado em erlenmeyer de 250 mL
contendo 100 mL de meio base 1.
Este erlenmeyer foi mantido sob agitação em agitador rotatório a 100rpm, a
temperatura ambiente durante 3 dias, e após crescimento, o conteúdo foi transferido
para erlenmeyers de maior capacidade, totalizando 7 litros de meio base 2. O
crescimento ocorreu durante 21 dias, à temperatura ambiente, sem agitação.
Após o crescimento e consequente produção de esclerotiorina, o micélio foi
separado do meio de cultura através de filtração a vácuo em funil de Buchner,
utilizando filtros com poros de 14 µm. Foi adicionado acetato de etila nas duas partes:
no micélio, quantidade suficiente para cobrir o fungo e emergi-lo em todo o solvente e,
na parte líquida, quantidade relativa a 30% do volume de meio de cultura. O micélio foi
deixado em contato com o acetato de etila por 15 min, para extrair a esclerotiorina que
também estava presente nesta parte. A parte líquida foi transferida para um funil de
decantação, sendo separada a fase aquosa da fase orgânica, esta última contendo os
metabólitos secundários desejados. A fase orgânica foi reservada e procedeu-se a
extração da fase aquosa com acetato de etila por mais duas vezes.
39
Todas as frações orgânicas obtidas, juntamente com o solvente que havia sido
deixado em contato com o micélio, foram reunidas e concentradas em evaporador
rotativo, a 65 ºC, utilizando vácuo.
4.3 – Purificação da esclerotiorina
A presença de esclerotiorina (20) no extrato foi comprovada por cromatografia
em camada delgada (CCD), sendo purificada por cromatografia em coluna de sílica. O
extrato foi solubilizado em diclorometano, e a esta solução foi incorporada uma
quantidade de sílica que ocupasse aproximadamente o mesmo volume de extrato
utilizado. Após a evaporação do solvente, feita em evaporador rotativo a 50 ºC, a sílica
contendo o extrato e foi adicionada lentamente ao topo da coluna.
A partir daí, foi dado início ao processo de eluição, retirando-se frações de 250
mL. A ordem dos eluentes utilizados encontra-se listada na Tabela 4. Cada fração
retirada da coluna foi evaporada em evaporador rotativo a 65 º C, utilizando vácuo.
Tabela 4 – Eluentes utilizados na coluna cromatográfica de purificação da
esclerotiorina
Fração Eluente
1 Hexano
2 a 3 Hexano + Diclorometano 85:15
4 a 5 Hexano + Diclorometano 50:50
6 a 7 Hexano + Diclorometano 25:75
8 a 14 Diclorometano
15 a 16 Diclorometano + Acetato de etila 97:3
17 a 20 Diclorometano + Acetato de etila 95:5
21 a 22 Metanol
Procedeu-se à análise de cada fração por cromatografia em camada delgada
comparativa, constatando-se que as frações 11 a 16 continham esclerotiorina (20) em
boa quantidade, porém a amostra resultante da combinação destas frações ainda não
estava pura. Deste modo, procedeu-se a uma cromatografia em coluna flash. Esta
técnica é feita utilizando pressão na coluna e a eluição é isocrática (Still et al., 1978). O
eluente escolhido foi diclorometano/acetato de etila 99:1, sendo retiradas 19 frações de
40
50 mL. Cada fração foi analisada por CCD, constatando-se que as frações 4 a 15
estavam aparentemente puras. Desta forma, elas foram combinadas, analisadas por
CCD e uma pequena parte desta amostra foi submetida à análise de ponto de fusão.
Parte desta amostra (20mg) foi enviada para análise por RMN. Como solvente
foi utilizado clorofórmio deuterado (CDCl3).
4.4 – Biotransformação da esclerotiorina pelo Beauveria bassiana
4.4.1 – Cultivo de B. bassiana e biotransformação
Um frasco de armazenamento contendo o fungo Beauveria bassiana foi retirado
do ultra-freezer, transferido para um tubo de ensaio contendo meio ágar batata
inclinado, onde ficou por quatro dias, à temperatura ambiente. Após crescimento, a
biomassa foi transferida, por meio de raspagem com alça de platina, para erlenmeyer
de 250 mL, contendo 100 mL de meio base 1.
Foi feita uma biotransformação em duas etapas, procedimento que consiste em
se cultivar o fungo em meio de cultura apropriado e, posteriormente, transferir sua
biomassa para um recipiente contendo somente água destilada adicionada do
composto a ser biotransformado. Isso permite que as duas etapas sejam otimizadas
separadamente.
Em ensaios de biotransformação em duas etapas, na etapa de obtenção de
massa celular (fase de cultivo) o meio de cultura pode ser enriquecido de nutrientes, o
que permite o desenvolvimento mais rápido do micro-organismo. O meio usado na
biotransformação propriamente dita, ao contrário, deve ser bem simples, contendo
basicamente um tampão, solução fisiológica, ou apenas água destilada, como foi
utilizado no experimento realizado. Nessas condições, não são disponibilizados
nutrientes para o micro-organismo, impedindo sua multiplicação (crescimento), mas
sua massa celular continua viável por um período, biotransformando compostos que
sejam adicionados ao cultivo. Algumas vantagens deste processo em relação ao
processo de uma única etapa são: menor tempo de transformação, maior concentração
de substrato, controle mais fácil de reações e facilidade na extração e purificação do
produto (Medeiros, 2002).
Foram utilizados onze erlenmeyers de 500 mL contendo, cada um deles, 200 mL
de meio base 3. O inoculo do fungo B.bassiana, previamente preparado, foi transferido
para os onze erlenmeyers contendo o meio de cultura 3. Após dez dias de cultivo sem
41
agitação, à temperatura ambiente, o conteúdo de cada erlenmeyer foi filtrado a vácuo,
em funil de Buchner, e o micélio foi transferido para um outro erlenmeyer de 500 mL
contendo apenas 200 mL de água destilada esterilizada.
Dos onze erlenmeyers contendo o micélio do fungo imerso em água destilada,
um foi utilizado como controle do fungo e dez foram utilizados para a realização da
biotransformação, sendo que nesses, foi adicionado 1 mL de solução de esclerotiorina
(20) em acetato de etila na concentração de 20 mg.mL-1. Também foi adicionado 1 mL
desta solução em outro erlenmeyer de 500 mL contendo 200 mL água destilada estéril,
de modo a servir como controle do substrato. Todos os erlenmeyers utilizados, os dez
do experimento da biotransformação e os dois controles foram incubados sob agitação
a 100 rpm durante 14 dias, à temperatura ambiente.
Após este período, em cada erlenmeyer o micélio foi separado por filtração a
vácuo em funil de Buchner. O filtrado foi transferido para um funil de separação e
extraído 3 vezes utilizando 60 mL de acetato de etila. O solvente foi removido em
evaporador rotativo a 65 ºC a vácuo
4.4.2 – Análise e purificação de biotransformado
O extrato foi analisado por CCD, primeiramente utilizando como solvente
diclorometano e, depois, diclorometano/acetato de etila 98:2. Nenhum produto com Rf
próximo ao da esclerotiorina (20) foi observado, porém, observou-se uma mancha
vermelha mais polar, perto do ponto de aplicação da amostra. Desta forma, foi feita
outra CCD, utilizando como solvente acetato de etila e como eluente
diclorometano/acetato de etila 75:25, sendo observadas cinco manchas vermelhas.
Estas manchas não foram encontradas no perfil cromatográfico dos dois controles, e
foram classificadas como produtos novos, provavelmente, produtos de
biotransformação.
Os produtos biotransformados foram submetidos a cromatografia em coluna e
cromatografia em placa preparativa. Os produtos 1, 4 e 5 estavam presentes em maior
quantidade e foram enviados para análise por RMN. Como solvente foi utilizado o
clorofórmio deuterado (CDCl3).
42
4.5 – Obtenção de produtos de síntese com diazometano
4.5.1 – Síntese
Foram adicionados 900 mg de esclerotiorina (20) em um balão de fundo
redondo, e 100 mL de éter etílico. Após a dissolução total da amostra, o diazometano
previamente preparado foi adicionado lentamente até se verificar o desaparecimento
total das bolhas. A amostra foi deixada em repouso por 10 min e, em seguida, levada
ao evaporador rotativo para evaporação do solvente e, consequentemente, o término
da reação (Hudlicky, 1980).
4.5.2 – Análise e purificação
O produto da reação foi analisado por CCD, utilizando diclorometano como
solvente e diclorometano/acetato de etila 98:2 como eluente, em comparação com um
padrão de esclerotiorina (20). Estas condições evidenciaram a formação de dois novos
compostos com o RF próximo ao da esclerotiorina (20), um mais polar e outro menos
polar, sendo que este último estava em maior quantidade.
O derivado sintético mais polar que a esclerotiorina (20) foi separado através de
cromatografia em coluna. Foram retiradas 18 frações, sendo que o derivado foi eluído
com diclorometano. Análises de CCD mostraram que o derivado estava puro. Desta
forma, uma parte foi separada para análise do ponto de fusão. O material foi enviado
para análise por RMN, utilizando clorofórmio deuterado (CDCl3) como solvente. O
produto teve sua estrutura determinada como sendo o 1-metil-esclerotiorina (64).
4.6 – Biotransformação do 1-metil-esclerotiorina pelo Beauveria bassiana
4.6.1 – Cultivo do B. bassiana e biotransformação
O procedimento utilizado para a biotransformação do 1-metil-esclerotiorina (64)
foi o mesmo utilizado no item 4.4.1.
4.6.2 – Análise e purificação do produto biotransformado
Análises por CCD, utilizando acetato de etila como solvente e
diclorometano/acetato de etila (75:25) como eluente evidenciaram a presença de um
único ponto vermelho, ausente no perfil cromatográfico dos controles.
43
Através de cromatografia em coluna de sílica flash (230-400 mesh), foi possível
isolar o produto vizualizado por CCD nas frações coletadas com diclorometano/acetato
de etila 80:20.
4.7 – Obtenção de outros derivados da esclerotiorina
4.7.1 – Triagem de fungos
Para verificar outras possibilidades de produção de novos biotransformados,
foram selecionadas 14 espécies de fungos da coleção do LaBβ, e, juntamente com o
Beauveria bassiana, foi feita uma triagem. Os fungos utilizados foram:
Absidia cylindrospora
Aspergillus parasiticus
Beauveria bassiana
Cladosporium sphaerospermum
Clonostachys rosea f catenulata
Microsporum gypseum
Mucor plumbeus
Paecilomyces lilacinus
Paecilomyces varioti
Penicillium janthinellum
Pestalotiopsis palustris
Rhizopus oryzae
Rhizopus stolonifer
Syncephalastrum racemosum
Thamnostylum sp.
As biotransformações foram feitas em uma única etapa. Neste processo não há
a separação do meio de cultivo, e a substância de interesse é adicionada diretamente
ao fungo, após o crescimento deste (Sato, 2001). Os fungos, após serem retirados do
armazenamento, foram repicados para tubos de ensaio contendo ágar batata
dextrosado inclinado e incubados por três dias a temperatura ambiente. Após este
período, cada fungo foi transferido através de raspagem com alça de platina e água
esterilizada para dois erlenmeyers de 250 mL, contendo cada um 100 mL de meio base
2 e deixados a temperatura ambiente, sob agitação a 100 rpm. Após três dias, os
fungos apresentaram bom crescimento, e a esclerotiorina (20) foi adicionada em um
44
dos erlenmeyers contendo cada fungo. O segundo erlenmeyer não recebeu a
substância e foi utilizado como controle. Foi adicionado 0,5 mL de solução de
esclerotiorina (20) em acetato de etila (20 mg.mL-1). Os erlenmeyes foram deixados
sob as mesmas condições de agitação e temperatura durante 14 dias.
Após este período, o conteúdo de cada frasco foi filtrado a vácuo com funil de
Buchner, o micélio foi separado, e o meio foi transferido para um funil de separação.
Procedeu-se uma extração com três volumes de 30 mL de acetato de etila, que foi
posteriormente evaporado, dando origem aos extratos. O extrato de cada fungo, assim
como seus respectivos controles, foram analisados por CLAE.
O extrato da biotransformação da esclerotiorina (20) pelo Beauveria bassiana
em duas etapas obtido no item 4.4.1 também foi analisado por CLAE. Este resultado foi
comparado com o resultado do ensaio do B. bassiana descrito neste tópico para
estimar qual dos experimentos (o primeiro, em duas etapas, ou o segundo, em uma
etapa) alcançou maior rendimento. Um extrato do Penicillium sclerotiorum (item 4.2)
também foi analisado por CLAE para obter o tempo de retenção dos metabólitos deste
fungo, inclusive o tempo de retenção da esclerotiorina (20).
4.7.2 – Análise por CLAE
Cada extrato em metanol (1 mg.mL-1) foi filtrado com uma membrana com poros
de 0,45 µm de tamanho e transferido para frasco devidamente identificado. Foram
injetados 20 µL de cada amostra no cromatógrafo. Como fase estacionária foi utilizada
uma coluna de polaridade inversa (C18). Como fase móvel, foi utilizado um gradiente
de misturas de acetonitrila e água deionizada, contendo 0,05% de ácido fórmico
(conforme Tabela 5), com um fluxo constante de 1 mL/min. Foram utilizados solventes
de grau HPLC para a eluição e preparo das amostras. Os solventes, assim como a
água, passaram por processo de desgaseificação anterior ao seu uso.
Tabela 5 – Gradientes de eluição utilizados na análise do HPLC
Tempo de análise (min) Acetonitrila (%) Água (%)
0 50 50
30 100 0
40 100 0
45
O detector foi ajustado para os comprimentos de onda 470 e 530 nm. Entre uma
análise e outra, a coluna foi lavada por 15 min com acetonitrila/água (1:1) (Castro,
2008).
Para comparação dos tempos de retenção entre diferentes amostras, foi
calculado o intervalo de confiança da média dos tempos de retenção da esclerotiorina
(20) nas diferentes amostras, e este foi extrapolado como o intervalo de confiança do
método. O intervalo de confiança é calculado pela fórmula:
Equação 1 – Intervalo de confiança
onde é a média dos tempos de retenção da esclerotiorina (20), t é o coeficiente de t
student e EPM é o erro padrão da média. O erro padrão da média pode ser calculado
pela fórmula a seguir, onde é o desvio padrão populacional e n é o número de
amostras.
Equação 2 – Erro padrão da média
O coeficiente t é obtido da tabela de distribuição de t student (Anexo 1), levando-se em
conta a confiabilidade e o número de graus de liberdade, obtido por GL = n-1.
(Pimentel-Gomes, 2000)
4.8 – Identificação do Cladosporium sphaerospermum
No início deste trabalho, o fungo C. sphaerospermum era o único que ainda não
tinha tido sua taxonomia determinada. Sua identificação foi realizada no Instituto de
Ciências Biológicas da UFMG, sob a supervisão da Profª Drª Maria Aparecida de
Resende, como descrito a seguir, a partir de seu microcultivo em ágar sabouraud.
O micro-organismo foi inoculado em uma lâmina de microcultivo para que
pudesse ser feita a sua identificação. Um pequeno bloco de ágar sabouraud foi cortado
e colocado na superfície de uma lâmina microscópica estéril. O fungo foi inoculado
neste bloco de ágar e uma lamínula estéril foi colocada em cima do ágar. O sistema foi
46
armazenado a 37 ºC em uma placa de Petri estéril com um pedaço de algodão
embebido em água glicerinada (Funder, 1968).
Após 10 dias de crescimento, a lamínula e o ágar foram retirados, o fungo foi
corado com lactofenol e outra lamínula foi posta em cima da lâmina. A lâmina foi
analisada em microscópio ótico. As hifas e estruturas de reprodução, assim como as
características macroscópicas foram utilizadas para determinar o gênero e espécie do
fungo filamentoso.
47
RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 – Produção e extração da esclerotiorina de Penicillium sclerotiorum
Penicillium sclerotiorum é um fungo filamentoso que apresenta coloração
esverdeada. Geralmente, o meio utilizado para seu cultivo fica alaranjado após alguns
dias, devido à produção de metabólitos secundários. Após três dias de cultivo em tubo
com ágar batata inclinado, o fungo apresentou bom crescimento e esporulação (Figura
18).
Figura 18 – Penicillium sclerotiorum em ágar batata inclinado após 3 dias. Frente
(A) e verso (B) do tubo.
O meio base 1 foi escolhido por ter apresentado resultados satisfatórios em
outros trabalhos desenvolvidos no laboratório relacionados a crescimento de fungos
filamentosos (Bracarense, 2008; Carvalho, 2009). Este meio possui quantidades
suficientes de fontes de carbono, nitrogênio, além de minerais necessários para o
crescimento deste fungo. Após três dias neste meio, o fungo apresentava quantidade
satisfatória de biomassa, sem indícios aparentes de contaminação. Os micélios
estavam homogêneos, e o meio apresentava coloração alaranjada, sem turvação, o
que, caso acontecesse, poderia ser um indício de contaminação por leveduras e/ou
bactérias.
O próximo passo foi o cultivo deste fungo em uma escala maior, que foi obtido
por cultivo em meio de cultura líquido em frascos erlenmeyer contendo um total de sete
litros de meio de cultura. O meio foi dividido em vários recipientes com o objetivo de se
48
ter uma superfície de contato do meio de cultura com o ar maior, uma vez que o P.
sclerotiorum é um micro-organismo aeróbio. O meio foi preparado com metade da
concentração dos constituintes, com o objetivo de que os nutrientes se esgotassem
mais rapidamente e os micro-organismos alcançassem mais rapidamente a fase
estacionária, onde acontece a produção de metabólitos secundários. O crescimento foi
realizado até o 21º dia, quando o meio de cultura apresentou uma forte coloração
alaranjada.
Após a extração do conteúdo total de meio de cultura, foram obtidos 3,07 g de
extrato.
5.2 – Purificação da esclerotiorina
A estrutura da esclerotiorina (20), assim como a numeração dos átomos de
carbono, encontra-se na Figura 19.
Figura 19 – Estrutura molecular da esclerotiorina
A presença de esclerotiorina (20) no extrato foi averiguada por cromatografia em
camada delgada utilizando diclorometano como solvente e diclorometano/acetato de
etila (98:2) como eluente. Um padrão de esclerotiorina (20) pura também foi aplicado
na placa. Como o composto pesquisado possui uma forte coloração alaranjada, neste
caso não foi necessária a utilização de agentes reveladores (Figura 20). Nestas
condições, a esclerotiorina (20) apresentou um fator de retenção Rf = 0,37.
Como método de purificação da esclerotiorina (20) a partir do extrato bruto de P.
sclerotiorum, foi escolhida a cromatografia em coluna (Figura 21), pelo fato de este
metabólito possuir uma forte coloração alaranjada, o que facilita o uso desta técnica de
purificação.
49
Figura 20 – Cromatografia em camada delgada
comparativa do padrão de esclerotiorina (A) e o extrato de
Penicillium sclerotiorum (B)
Figura 21 – Coluna cromatográfica de purificação da esclerotiorina em três
etapas de eluição
50
O primeiro fracionamento do extrato gerou 22 frações, sendo que a combinação
das frações 11 a 16 gerou uma amostra com boa quantidade de esclerotiorina (20),
porém impura, que foi novamente submetida a cromatografia em coluna de sílica. Com
este segundo fracionamento, as frações 4 a 15 resultaram em esclerotiorina (20)
aparentemente pura.
Para comprovar a pureza desta substância, foi feita uma CCD, que apresentou
somente uma mancha, com o mesmo Rf que o padrão de esclerotiorina (20), também
aplicado na placa. A análise de ponto de fusão mostrou que a amostra fundiu entre 199
e 202 ºC, o que comprovou a pureza da amostra.
Foram obtidos 914,2 mg de esclerotiorina (20) por este procedimento, relativos a
aproximadamente 30% de rendimento em relação à massa total do extrato.
A análise por RMN comprovou que a substância isolada foi a esclerotiorina (20).
Os dados encontram-se na Tabela 6, página 51. Os espectros de RMN encontram-se
nos Apêndices 1 a 6. A numeração utilizada foi descrita na Figura 19, página 48.
5.3 – Biotransformação da esclerotiorina pelo Beauveria bassiana
5.3.1 – Cultivo do Beauveria bassiana
O fungo Beauveria bassiana foi escolhido, pois na literatura são relatados
diversos experimentos em que este fungo foi usado na biotrasnformação de várias
substâncias (Buchanan et al., 2001; Zhan et al., 2006; Osorio-Lozada et al., 2008).
Além do que, este micro-organismo produz baixas quantidades de metabólitos
secundários, e nenhum possui uma coloração forte, o que poderia dificultar o emprego
das técnicas cromatográficas utilizadas.
Para o cultivo do Beauveria bassiana, foi escolhido o meio base 3. É relatado na
literatura que o B. bassiana apresenta crescimento adequado neste meio de cultura
(Martins, 2009). Foi feito um estudo comparativo em laboratório, o que comprovou este
dado. Após três dias de cultivo em ágar batata inclinado (Figura 22), o B. bassiana foi
transferido para erlenmeyer contendo o meio base 3, onde foi incubado por 10 dias,
sem agitação, a temperatura ambiente, apresentando bom crescimento por toda a
superfície do meio de cultura.
51
Tabela 6 – Informações obtidas a partir dos espectros de RMN de 1H e de 13C,
sub-espectro DEPT e mapa de contornos HSQC para a esclerotiorina
Numeração Multiplicidade δC (ppm) δH (ppm) JH (Hz)
1 CH 152,63 7,93 -
3 C 158,11 - -
4 CH 106,38 6,65 -
4a C 138,67 - -
5 C 110,81 - -
6 C 185,97 - -
7 C 84,58 - -
8 C 191,78 - -
8a C 114,57 - -
9 CH 115,68 6,08 d, 15,8
10 CH 142,86 7,06 d, 15,8
11 C 131,97 - -
12 CH 148,84 5,70 d, 10,0
13 CH 35,13 2,49 m
14 CH2 30,06 1,37 m
15 CH3 11,94 0,87 t, 7,2; 7,2
16 CH3 20,18 1,01 d, 6,8
17 CH3 12,35 1,85 -
18 CH3 22,53 1,57 -
19 C 170,10 - -
20 CH3 20,06 2,17 -
52
Figura 22 – Beauveria bassiana em ágar batata inclinado após 3 dias. Frente (A) e
verso (B) do tubo.
5.3.2 – Obtenção dos produtos biotransformados
O micélio de B. bassiana foi colocado em recipiente contendo água destilada
estéril, e a esclerotiorina (20) foi adicionada como solução concentrada em acetato de
etila, de modo que fosse usado um volume pequeno do solvente, portanto, em
condições de baixa toxicidade para o fungo.
O micélio do fungo e a esclerotiorina (20) foram deixados em contato por 14
dias. Muitos trabalhos relatam que este tempo é suficiente para reações de
biotransformação (Sakamaki et al., 2001, Miyazawa et al., 1995, Liu et al., 1984). Após
este período, procedeu-se a extração, sendo obtidos 360,8 g de extrato.
A purificação das substâncias se iniciou com uma cromatografia em coluna.
Foram retiradas 22 frações de 200mL, sendo utilizados como eluentes, nesta ordem,
hexano, misturas de hexano/diclorometano, diclorometano e misturas de
diclorometano/acetato de etila até a concentração de 1:1. Com este procedimento,
foram isoladas 4 frações, utilizando como eluentes, misturas de diclorometano/acetato
de etila nas concentrações de 85:15, 80:20, 60:40 e 50:50, nesta ordem. A ordem de
eluição encontra-se na Tabela 7. Análises por CCD mostraram que o material obtido
nas polaridades diclorometano/acetato de etila 85:15, 60:40 e 50:50 estavam puros.
A amostra isolada com a polaridade diclorometano/acetato de etila 80:20
possuía duas substâncias distintas, que posteriormente foram isoladas utilizando placa
preparativa de sílica gel. Este procedimento consistiu em preparar placas
cromatográficas de 10 x 10 cm, com espessura de 1 mm de sílica gel. A amostra foi
aplicada inteiramente na placa e, após a eluição e conseqüente separação dos
constituintes, as duas substâncias foram separadas pela raspagem seletiva de cada
banda visualizada na placa, diluídas com metanol e filtradas em filtro quantitativo com
poros de 14 µm. Neste procedimento, utilizando acetato de etila como solvente e
53
hexano/acetato de etila (8:2) como eluente, foi possível separar os biotransformados 2
e 3.
A massa obtida de cada substância encontra-se na Tabela 7
Tabela 7 – Massas das substâncias isoladas da biotransformação da
esclerotiorina por B. bassiana e respectivos rendimentos
Polaridade Substância Massa
(mg)
Rendimento
(%)
Diclorometano/acetato de etila 85:15 Biotransformado 1 27,5 13,8
Diclorometano/acetato de etila 80:20 Biotransformado 2 8,3 4,2
Diclorometano/acetato de etila 80:20 Biotransformado 3 1,9 1
Diclorometano/acetato de etila 60:40 Biotransformado 4 12,8 6,4
Diclorometano/acetato de etila 50:50 Biotransformado 5 13,7 6,8
Os cinco produtos de biotransformação isolados do extrato de B. bassiana
possuem aparentemente as mesmas características físicas. São sólidos à temperatura
ambiente, com coloração vermelho forte, muito solúveis em diclorometano, acetato de
etila ou metanol.
5.3.3 – Elucidação estrutural do Biotransformado 1
O processo de elucidação estrutural de substâncias geralmente inicia-se com a
análise do espectro no infravermelho, cujas bandas indicam os grupos funcionais
presentes na estrutura. O próximo passo é a análise dos espectros de RMN de 1H e de
13C e do sub-espectro DEPT, que mostram a quantidade de átomos de carbono e
hidrogênio presentes, dando uma boa noção de sua vizinhança. Os espectros de RMN
bidimensionais mostram as correlações entre átomos de carbono e hidrogênio, o que,
na maioria das vezes, já permite montar a estrutura da molécula. Muitas vezes,
algumas análises suplementares como a análise elementar, espectometria de massas
ou ultravioleta podem ser necessárias para confirmar a presença de algum fragmento
estrutural ou confirmar a molécula proposta (Silverstein et al., 2005).
Em casos de reação ou biotransformação, a elucidação estrutural do produto
pode ser iniciada pela comparação de seu espectro de RMN com o espectro do
material de partida. Os deslocamentos químicos de RMN de 13C do biotransformado 1
foram comparados com os deslocamentos da esclerotiorina (20), apresentando
semelhança por toda a molécula, com exceção dos átomos de carbono próximos ao
54
oxigênio participante do heterociclo (Figura 23), podendo-se concluir que a molécula do
biotransformado 1 possui um esqueleto parecido com o da esclerotiorina (20), com
alguma alteração neste ponto da molécula.
Figura 23 – Comparação entre os deslocamentos químicos de RMN de 13C da
esclerotiorina (em preto) e do biotransformado 1 (em vermelho)
A análise do espectro de RMN de 13C do biotransformado evidenciou, ainda, a
presença de oito novos átomos de carbono, não presentes na molécula original da
esclerotiorina (20). A comparação entre os dados obtidos dos espectros de RMN de
13C (Figura 23) indica que a inserção destes átomos foi perto dos anéis da molécula.
A análise do espectro de RMN de 1H, do sub-espectro DEPT, do mapa de
contornos HSQC, assim como os valores dos deslocamentos químicos no espectro de
RMN de 13C (Tabela 8) permitiram concluir que os sinais correspondiam a: 2 carbonos
secundários, 5 carbonos terciários e 1 carbono quaternário.
Tabela 8 – Deslocamentos químicos dos átomos de carbono inseridos na
molécula de esclerotiorina pela biotransformação
Deslocamento químico δC Multiplicidade (DEPT)
36,6 CH2
55,4 CH2
127,7 CH
128,7 CH
128,7 CH
129,2 CH
129,2 CH
135,8 C
55
A análise elementar (Tabela 9) indicou a presença de um átomo de nitrogênio na
molécula. O cálculo do número de átomos foi feito usando-se massa molecular
493,2060, obtida a partir do espectro de massas ESI-MS (Apêndice 14). O pico de
massas 516,1876 é referente ao íon M+Na, inerente ao método. O pico de massas
437,1927 é referente a fragmento da molécula. Apesar da técnica de ESI-MS não ser
uma técnica destrutiva, alguns poucos fragmentos podem aparecer nos espectros
produzidos.
Tabela 9 – Resultado da análise elementar do biotransformado 1, e número de
átomos correspondentes, levando-se em conta a massa obtida no espectro de
massas ESI-MS
Átomo % de massa Número de átomos
Carbono 68,95 29
Hidrogênio 6,23 32
Nitrogênio 2,80 1
A literatura relata a produção da isocromofilona VI (22), um composto que possui
o mesmo esqueleto básico da esclerotiorina (20), porém, o heteroátomo ligado ao anel
é um nitrogênio. Os valores dos deslocamentos químicos da isocromofilona VI (22)
(Anexo 2), em comparação com os deslocamentos do biotransformado são bem
semelhantes (Figura 24), um outro indício da presença do átomo de nitrogênio na nova
molécula.
Figura 24 – Comparação entre os deslocamentos químicos de RMN de 13C da
isocromofilona VI (em preto) e do biotransformado 1 (em vermelho)
56
Finalmente, a confirmação de que a biotransformação da esclerotiorina (20)
também alterou o cromóforo da molécula foi vizualizada pela coloração do
biotransformado 1, que é bem similar à coloração da isocromofilona VI (22), que possui
o átomo de nitrogênio em seu cromóforo, o que está de acordo com o cromóforo do
biotransformado possuir um átomo de nitrogênio (Figura 25).
Figura 25 – Estruturas da esclerotiorina (1) e da isocromofilona VI (2), mostrando
os diferentes cromóforos
Deste modo, foi possível considerar que os oito novos átomos de carbonos
estavam ligados a um átomo de nitrogênio, o qual faria parte do esqueleto da molécula
do biotransformado.
Atráves do espectro bidimensional de RMN HSQC-TOCSY, foi possível mostrar
que os dois carbonos secundários fazem parte do mesmo sistema de spins, estando
separados dos 5 carbonos terciários, os quais também fazem parte de um segundo
sistema de spins. Com esta informação, e utilizando os acoplamentos indicados no
espectro de HMBC, foi possível propor o seguinte fragmento (Figura 26).
57
Figura 26 – Correlações observadas no espectro bidimensional de HMBC para o
biotransformado 1
Como o sistema de spins dos carbonos terciários é diferente dos carbonos
secundários, foi proposto que o próximo constituinte desta cadeia seria o único carbono
quaternário (Figura 27).
Figura 27 – Correlações demonstradas no espectro bidimensional de HMBC para
o biotransformado 1
Os deslocamentos químicos dos cinco carbonos terciários restantes são bem
próximos, e característicos de carbonos aromáticos. Desta forma, chegou-se à seguinte
estrutura (Figura 28):
Figura 28 – Estrutura molecular proposta para o Biotransformado 1
58
Na estrutura proposta, o anel aromático possui dois pares de carbonos que
possuem a mesma vizinhança. O espectro de RMN de 13C (Apêndice 8, página 90)
mostra que estes dois pares de sinais possuem o mesmo deslocamento químico, e
pode-se supor que possuam a mesma vizinhança. Os átomos de carbono são
conectados entre si e com os outros carbonos próximos da estrutura.
A estrutura proposta possui a fórmula estrutural de C29H32O4NCl. Calculando a
massa molecular teórica a partir das massas atômicas exatas (Silverstein, 2005), se
encontra um valor de 492,0214. A massa molecular obtida com o espectro de massas
(Apêndice 14) foi de 493,2060, o que está de acordo com a estrutura proposta.
Os dados da nova substância encontram-se na Tabela 10, página 60. Os
espectros encontram-se nos Apêndices 7 a 16.
5.3.4 – Elucidação estrutural dos outros biotransformados
Devido à pouca quantidade de massa obtida, não foi possível realizar análises
com os biotransformados 2 e 3. Os biotransformados 4 e 5 foram enviados para análise
por RMN, porém, os espectros obtidos não tinham resolução suficiente para dar
prosseguimento à elucidação estrutural. Com os dados obtidos, supôs-se que, nas
duas moléculas, assim como na molécula do biotransformado 1 (56), houve a troca do
átomo de oxigênio próximo ao carbono 1 por um átomo de nitrogênio, com a inserção
de dois carbonos secundários, que dão continuidade à molécula (Figura 29).
Figura 29 – Fragmento estrutural comum nos biotransformados 1, 4 e 5
O espectro de massas do biotransformado 4 mostra que este composto difere do
biotransformado 1 apenas por um grupo hidroxila. A provável estrutura molecular para
esta substância seria aquela proposta na Figura 30.
59
N
OH
O
Cl
O
O
O
57
Figura 30 – Provável estrutura do biotransformado 4
O biotransformado 5 possui a mesma massa que a isocromofilona VI (22),
metabólito do Penicillium sclerotiorum, e os sinais referentes à cadeia lateral da
isocromofilona VI (22) estão presentes no espectro de RMN do biotransformado. Deste
modo, a provável estrutura molecular para esta substância seria a proposta na Figura
31.
N
HO
O
Cl
O
O
O
58
Figura 31 – Provável estrutura do biotransformado 5
É importante ressaltar que nenhuma dessas estruturas pode ser confirmada sem
a obtenção de espectros de RMN com maior quantidade de amostra, ou maior pureza
desta.
Seguem abaixo os dados físico-químicos dos biotransformados 4 (57) e 5 (58).
Os espectros encontram-se nos Apêndices 17 a 22.
60
Tabela 10 – Propriedades físico-químicas do biotransformado 1
Propriedade Biotransformado 1 (56)
Estrutura molecular
Aspecto Sólido vermelho, cristalino
Fórmula molecular C29H32O4NCl
Temperatura de fusão 110-112ºC
Massas (ESI-MS) m/z 493,2060
UV (λ, nm) 375 nm
IV (KBr) (ν, cm-1) 3440, 2920, 1700, 1600, 1500, 1220, 1140
RMN de 1H, 400 MHz, CDCl3 (δ) 0,89 (3H, t, H-15, J=7,2; 7,2 Hz); 1,03 (3H, d, H-
16, J=6,4 Hz); 1,40 (2H, m, H-14); 1,52 (3H, s, H-
18); 1,81 (3H, s, H-17); 2,16 (3H, s, H-20); 2,48
(1H, m, H-13); 3,03 (2H, m, H-21); 4,05 (2H, m,
H-22); 5,68 (1H, d, H-12, J=10 Hz); 5,98 (1H, d,
H-9, J=15,6 Hz); 6,90 (1H, d, H-10, J=15,6 Hz);
6,97 (1H, s, H-4); 7,10 (1H, m, H-25); 7,10 (1H,
m, H-27); 7,26 (1H, s, H-26); 7,31 (1H, m, H-24);
7,31 (1H, m, H-28); 7,54 (1H, s, H-1)
RMN de 13C, 100 MHz, CDCl3 (δ) 11,99 (C-15); 12,62 (C-17); 20,23 (C-16); 20,30
(C-20); 23,23 (C-18); 30,04 (C-14); 35,05 (C-13);
36,63 (C-21); 55,44 (C-22); 84,82 (C-7); 102,44
(C-4a); 111,58 (C-4); 114,59 (C-8a); 114,64 (C-9);
127,71 (C-26); 128,73 (C-25); 128,73 (C-27);
129,25 (C-24), 129,25 (C-28); 131,54 (C-11);
135,79 (C-23), 140,86 (C-1); 144,30 (C-5); 144,95
(C-10); 147,80 (C-12); 148,04 (C-3); 170,04 (C-
19); 184,37 (C-6); 193,77 (C-8)
Solubilidade Solúvel em diclorometano, acetato de etila e
metanol, insolúvel em água
Rf, diclorometano/acetato de etila
(8:2)
0,42
61
Tabela 11 – Propriedades físico-químicas do Biotransformado 4
Propriedade Biotransformado 4 (57)
Aspecto Sólido vermelho, cristalino
Temperatura de fusão 87-90º C
Massas (ESI-MS) m/z 509,3581
UV (λ, nm) 375 nm
IV (KBr) (ν, cm-1) 3440, 2920, 1700, 1600, 1500, 1220
Solubilidade Solúvel em diclorometano, acetato de etila e
metanol, insolúvel em água
Rf, diclorometano/acetato de etila
(1:1)
0,41
Tabela 12 – Propriedades físico-químicas do Biotransformado 5
Propriedade Biotransformado 5 (58)
Aspecto Sólido vermelho, oleoso
Massas (ESI-MS) m/z 433,3309
UV (λ, nm) 375 nm
IV (KBr) (ν, cm-1) 3320, 2920, 1640, 1460, 1360,1240, 740
Solubilidade Solúvel em diclorometano, acetato de etila e
metanol, insolúvel em água
Rf, diclorometano/acetato de etila
(1:1)
0,20
Supõe-se que os cinco biotransformados de coloração vermelha produzidos pelo
Beauveria bassiana apresentaram como ponto comum a troca do átomo de oxigênio
por um átomo de nitrogênio, ligado a uma cadeia lateral, que difere em cada
biotransformado.
Wei e Yao descrevem a reatividade de azafilonas perante aminas primárias, o
que resulta na troca do heteroátomo presente no anel bicíclico. O mecanismo proposto
para esta reação encontra-se representado na Figura 32 (Wei e Yao, 2005).
62
O
X
O
O2R
R O
R NH2
O
X
O
O2R
R O
N
H H
R
O
X
O
O2R
R O
N
H H
R
O
X
O
O2R
R O
N
H H
R
OH
X
O
O2R
R O
N
H
R
O
X
O
O2R
R O
N
H
R
N
X
O
O2R
R O
R
OH
N
X
O
O2R
R O
R
- H2O
59
60
Figura 32 – Mecanismo proposto para a reação entre azafilonas e aminas
primárias
Desta forma, sugere-se que aminas primárias produzidas pelo Beauveria
bassiana reagiram com a esclerotiorina (20), dando origem aos produtos de
biotransformação 1-5.
5.4 – Síntese da 1-metil-esclerotiorina
Na tentativa de se obter um derivado semi-sintético da esclerotiorina (20) para
posterior biotransformação, foi feito uma reação com o diazometano. Este composto é
altamente reativo e instável, e por isso foi preparado anteriormente ao uso. Em razão
de suas características tóxicas (principalmente a teratogenicidade), o seu preparo foi
feito levando em conta todas as medidas de segurança necessárias (Figura 17, página
37). Seu preparo a partir do Diazald® segue a equação abaixo (Figura 33) (Struempel
et al., 2008).
Figura 33 – Reação de formação do diazometano
63
As reações com diazometano geralmente resultam em produtos metilados, e
esta metilação acontece por uma substituição de um hidrogênio na molécula do
reagente, geralmente o hidrogênio mais ácido (Solomons, 2002).
O hidrogênio 1 da molécula da esclerotiorina (20) possui maior acidez do que os
outros hidrogênios da molécula. Sua retirada é estabilizada por ressonância nos dois
anéis da molécula. A metilação na posição 1 da molécula da esclerotiorina (20) é o
evento com maior probabilidade de ocorrer a partir da reação desta molécula com o
diazometano.
A esclerotiorina (20), figura 19, página 48, foi deixada em contato com o
diazometano por 10 minutos, uma vez que este é muito reativo, e um maior tempo de
contato poderia levar à formação de produtos de degradação, diminuindo o rendimento
da reação principal. Os reagentes encontram-se dissolvidos em éter, e a evaporação
deste leva ao término da reação. A reação com diazometano também leva à formação
de nitrogênio gasoso, e o desprendimento deste pode evidenciar que a reação está em
andamento.
Análises por CCD evidenciaram a formação de dois produtos principais, um mais
polar e outro menos polar do que o material de partida, além de produtos em menor
quantidade. O produto menos polar mostrou-se altamente instável, e foi degradado
pela sílica usada na CCD e na coluna cromatográfica em menos de 30 minutos,
tornando inviável seu isolamento para posteriores estudos e análises. O produto mais
polar foi separado por meio de cromatografia em coluna. A análise do ponto de fusão
mostrou que esta substância fundiu entre 177 e 179 ºC, o que comprovou o alto grau
de pureza da amostra.
A reação foi feita com 900 mg de esclerotiorina (20) e foram obtidos 276,9 mg de
produto, o que representa um rendimento de reação de 31%.
5.4.1 – Elucidação estrutural do Produto 1
Foram obtidos espectros de RMN de 1H e de 13C, sub-espectros DEPT, além de
espectros bidimensionais do novo produto, e os valores dos deslocamentos químicos
foram comparados com os deslocamentos químicos do material de partida, a
esclerotiorina (20). Os valores encontrados foram bem próximos aos da esclerotiorina
(20), com exceção da região próxima ao carbono 1, onde os valores sofreram alguma
alteração. Isto mostra que o produto da reação manteve a estrutura parecida com a
estrutura do material de partida, porém, com alguma alteração nesta área da molécula
(Figura 34).
64
Figura 34 – Comparação entre os deslocamentos químicos da esclerotiorina (em
preto) e do Produto 1 (em vermelho).
Análises dos espectros de RMN de 1H e de 13C mostraram que, além da
estrutura básica da esclerotiorina (20), o novo produto possuía um átomo de carbono a
mais e, segundo seu valor de deslocamento químico e posicionamento no sub-espectro
de DEPT, tratava-se de um carbono primário. Os valores de deslocamento químico no
novo grupo são: δC = 20,20, δH = 2,65, simpleto.
O mapa de contornos HMBC mostrou as correlações existentes entre este
carbono primário e C1 e C8a (Figura 35), indicando que este estava ligado ao carbono
1 da molécula da esclerotiorina (20).
Figura 35 – Correlações observadas no mapa de contornos HMBC para o produto
1
O sinal de H1 na molécula da esclerotiorina (20) não foi observado nos espectros
do produto 1, o que está de acordo com a proposta de sua substituição por um grupo
CH3. Nenhuma outra alteração foi encontrada nos espectros de RMN desta molécula. A
estrutura do produto 1, identificado como 1-metil-esclerotiorina (64), está representada
na Figura 36.
65
Figura 36 – Estrutura molecular do Produto 1 (1-metil-esclerotiorina)
Os dados da nova substância encontram-se na Tabela 13, página 66. Os
espectros encontram-se nos Apêndices 23 a 32.
5.5 – Biotransformação da 1-metil-esclerotiorina pelo Beauveria bassiana
O mesmo procedimento utilizado para a biotransformação da esclerotiorina (20)
foi utilizado agora com o seu produto metilado. O objetivo foi verificar se as mesmas
alterações causadas na molécula da esclerotiorina (20) pelo Beauveria bassiana
também são causadas em uma molécula com estrutura semelhante.
A biotransformação da esclerotiorina (20) resultou em muitos novos produtos,
sendo que alguns deles foram produzidos com altos rendimentos (Tabela 7, página 53).
Este resultado não foi observado quando o substrato oferecido para o fungo foi a 1-
metil-esclerotiorina (64). Alguns poucos produtos com a mesma coloração alaranjada
foram produzidos e apenas um produto mais polar com coloração vermelha foi
observado, mesmo assim, nenhum desses em quantidade o suficiente para ser isolado
e enviado para análise visando elucidação estrutural.
Tendo em vista que um dos produtos de biotransformação da esclerotiorina (20)
por B. bassiana foi formado pelo ataque dos elétrons livres das aminas produzidas por
este fungo ao carbono 1, a metilação desta posição impediu este ataque nucleofílico, já
que, na 1-metil-esclerotiorina (64), este carbono está ligado ao grupo metila. Deste
modo, esta reação não foi possível de ocorrer, ou ocorreu em baixíssimos rendimentos.
66
Tabela 13 – Propriedades físico-químicas da 1-metil-esclerotiorina
Propriedade 1-metil-esclerotiorina (64)
Estrutura molecular
Aspecto Sólido alaranjado, cristalino
Fórmula molecular C22H25O5Cl
Temperatura de fusão 177-179 ºC
Massas (ESI-MS) m/z 404,2026
UV (λ, nm) 355 nm
IV (KBr) (ν, cm-1) 3420, 2960, 1720, 1620, 1520, 1400, 1220, 1140,
1100, 980
RMN de 1H, 400 MHz, CDCl3 (δ) 0,88 (3H, t, H-15, J=14,8; 14,8 Hz); 1,03 (3H, d,
H-16, J=13,2 Hz); 1,36 (2H, m, H-14); 1,57 (3H, s,
H-18); 1,86 (3H, s, H-17); 2,19 (3H, s, H-20); 2,50
(1H, m, H-13); 2,65 (3H, s, H-21); 5,72 (1H, d, H-
12, J=19,6 Hz); 6,07 (1H, d, H-9, J=31,4 Hz); 6,72
(1H, s, H-4); 7,06 (1H, d, H-10, J=31,4 Hz)
RMN de 13C, 100 MHz, CDCl3 (δ) 11,98 (C-15); 12,40 (C-17); 20,20 (C-20); 20,20
(C-21); 20,25 (C-16); 22,93 (C-18); 30,08 (C-14);
35,10 (C-13); 85,33 (C-7); 106,45 (C-4); 109,93
(C-5); 110,71 (C-8a); 115,74 (C-9); 131,98 (C-11);
140,47 (C-4a); 142,26 (C-10); 148,44 (C-12);
156,74 (C-3); 166,87 (C-1); 169,84 (C-19); 185,65
(C-6); 192,87 (C-8)
Solubilidade Solúvel em diclorometano, acetato de etila e
metanol, insolúvel em água
Rf, diclorometano/acetato de etila
(98:2)
0,28
67
5.6 – Obtenção de outros derivados da esclerotiorina
Para uma triagem, quinze fungos da coleção de fungos do LaBβ foram
selecionados, levando-se em conta os seguintes critérios: alta taxa de multiplicação,
fácil crescimento no meio base, baixa produção de metabólitos secundários e ausência
de metabólitos com coloração forte. À exceção de Pestalotiopsis palustris, os demais
micro-organismos escolhidos já foram usados em experimentos de biotransformação,
como indica a Tabela 14.
Tabela 14 – Algumas referências bibliográficas sobre biotransformações
realizadas pelos fungos utilizados neste experimento
Micro-organismo Referências
Absidia cylindrospora Guiraud et al., 2008; Lacroix et al. 1999
Aspergillus parasiticus Gengar et al. 1999
Beauveria bassiana Osorio-Lozada et al., 2008; Zhan et al., 2006;
Buchanan et al., 2001
Clonostachys rósea Kakeya et al., 2002
Microsporum gypseum Siebers-Wolff et al., 1993; Olivo et al., 2005
Mucor plumbeus Lacroix et al. 1999; García-Granados et al., 2007;
Souza et al., 2009
Paecilomyces lilacinus Rosche et al., 2001; Gesell et al., 2001
Paecilomyces variotii Sachan et al., 2006; Mukherjee et al., 2006
Penicillium janthinellum Zhang et al., 2005; Kiehlmann et al., 1996
Rhizopus oryzae Rosche et al., 2001; Shiva et al. 2007
Rhizopus stolonifer Choudhary et al., 2009; Xiangjiu et al., 2010
Syncephalastrum racemosum Lacroix et al. 1999; Kiehlmann et al., 1996
Thamnostylum sp. Lacroix et al. 1999; Souza et al., 2009
68
5.6.1 – Identificação do Cladosporium sphaerospermum
A Figura 37 representa o microcultivo do fungo, três dias após a inoculação.
Figura 37 – Microcultivo de Cladosporium sphaerospermum
O fungo apresentou crescimento lento. Macroscopicamente, o fungo apresenta
coloração escura, tendendo ao esverdeado até marrom, com textura aveludada (Figura
38). Microscopicamente, o fungo possui hifas septadas, conidióforos curtos e pouco
pigmentados como estrutura de reprodução (Figura 39).
Estas características permitiram classificar o fungo como pertencente à espécie
Cladosporium sphaerospermum. Outros trabalhos sobre identificação de fungos do
gênero Cladosporium relatam as mesmas características (Pereira, 2005).
Figura 38 – Cladosporium sphaerospermum inoculado em tubo inclinado. Frente
(A) e verso (B)
69
Figura 39 – Características microscópicas do Cladosporium sphaerospermum.
Conidióforos (a), hifas septadas (b), esporos sexuais (c), detalhe da reprodução
assexuada (d)
5.6.2 – Análises por cromatografia líquida de alto desempenho (CLAE)
Em uma separação cromatográfica de alto desempenho, os compostos são
retidos e particionados por um único mecanismo de retenção. Em fases reversas, os
solutos interagem hidrofobicamente com as caldeias alquílicas do empacotamento,
porém, existe a possibilidade de interação de alguns compostos com os grupos silanol
residual, que, às vezes, chegam a mais de 20% dos grupos hidroxila da matéria prima.
Estas interações podem levar à formação de caudas, devido à interação mais forte
entre o soluto e os grupos silanol. As caudas também podem ser formadas por
diferenças do tempo de retenção entre duas formas da mesma substância, seja por
isomeria ou equilíbrio ácido base (Ciola, 2003). Para minimizar os efeitos do equilíbrio
ácido base, foi adicionado 0,05% de ácido fórmico à água utilizada na eluição.
A eluição por gradiente pode proporcionar melhor visualização do perfil
cromatográfico dos extratos. O gradiente foi otimizado a partir de uma solução de
esclerotiorina (20) e do biotransformado 1 (56). Vários sistemas de eluição foram
70
testados, sendo que o sistema apresentado na Tabela 5, página 44 foi o que
apresentou melhor separação e visualização dos picos das duas substâncias.
O detector utilizado foi ajustado para os comprimentos de onda 470 e 530 nm.
As substâncias com coloração avermelhada são detectadas nestes dois comprimentos
de onda, sendo que as substâncias com coloração alaranjada são detectadas apenas
pelo comprimento de onda de 470 nm. Desta forma, a análise de CLAE foi capaz de
discriminar substâncias alaranjadas e vermelhas, e detectar, entre os produtos novos,
quais tiveram o seu cromóforo alterado, como no caso da biotransformação da
esclerotiorina (20) pelo B. bassiana.
O cromatograma do controle também foi analisado para garantir que as
substâncias indicadas como produtos de biotransformação não eram metabólitos
produzidos pelos fungos.
Os cromatogramas encontram-se nos Apêndices 33 a 50.
5.6.3 – Interpretação dos resultados da triagem
As diferenças entre o tempo de retenção de uma mesma substância em
amostras diferentes podem ser causadas por vários fatores, como as alterações de
pressão da coluna, impurezas nos eluentes, e as diferenças das matrizes das amostras
(Ciola, 2003). Todas as amostras, com exceção dos controles, possuíam esclerotiorina
(20) e as diferenças nos tempos de retenção desta substância nos diferentes extratos
representa a variabilidade inerente ao experimento.
Os extratos de biotransformação dos fungos Mucor plumbeus, Pestalotiopsis
palustris, Rhizopus oryzae e Rhizopus stolonifer apresentaram em seus
cromatogramas nenhum pico ou picos muito pequenos indicando a presença de
poucos novos biotransformados. O cromatograma do extrato do Thamnostylum sp. não
apresentou precisão suficiente para ser analisado, mesmo após repetição do
experimento. Apesar de apresentar bons resultados na biotransformação em duas
etapas, Beauveria bassiana não apresentou nenhum biotransformado em grande
quantidade nesta triagem feita em uma etapa.
O extrato da biotransformação com Absidia cylindrospora apresentou três picos
com tempos de retenção de 8,011, 8,219 e 8,742 min, sendo que os três foram
visualizados pelos dois comprimentos de onda.
O extrato da biotransformação com Aspergillus parasiticus apresentou um pico
intenso com tempo de retenção de 8,721 min, lido pelos dois comprimentos de onda.
Foram observados três picos com tempos de retenção de 18,119, 18,413 e 20,965 min,
71
lidos somente pelo comprimento de onda de 470nm. Outros picos foram observados,
porém referem-se a metabólitos presentes no controle.
O extrato da biotransformação com Cladosporium sphaerospermum apresentou
três picos com tempos de retenção de 3,368, 3,552 e 8,748 min, sendo que os três
foram lidos pelos dois comprimentos de onda. Foram observados dois picos intensos
com tempos de retenção de 4,866 e 5,355 min, sendo que ambos foram lidos somente
pelo comprimento de onda de 470 nm.
Clonostachys rosea f catenulata apresentou um extrato com dois picos com
tempos de retenção de 8,669 e 10,053 min, sendo que os dois foram lidos pelos dois
comprimentos de onda.
Microsporum gypseum apresentou, em seu extrato, um pico com tempo de
retenção de 9,685 min, lido pelos dois comprimentos de onda. Foram observados cinco
picos com tempos de retenção de 7,769, 8,417, 10,805, 11,192 e 11,845 min, lidos
somente pelo comprimento de onda de 470 nm, sendo que o primeiro deles é bem
intenso.
Paecilomyces lilacinus apresentou, em seu extrato, um pico com tempo de
retenção de 8,941 min, lido pelos dois comprimentos de ondas.
O extrato obtido de Paecilomyces varioti apresentou dois picos intensos com
tempo de retenção de 8,950 e 10,364 min, sendo que os dois foram lidos pelos dois
comprimentos de onda.
Penicillium janthinellum apresentou, em seu extrato, quatro picos com tempos de
retenção de 8,717, 9,070, 10,092 e 10,551 min, todos lidos pelos dois comprimentos de
onda, sendo que os com tempos de retenção de 8,717 e 10,092 min são bem intensos.
Foram observados dois picos com tempos de retenção de 18,934 e 21,029 min, sendo
que os dois foram lidos somente pelo comprimento de onda de 470 nm.
A biotransformação com Syncephalastrum racemosum apresentou um extrato
com sete picos com tempos de retenção de 3,447, 3,823, 5,215, 7,996, 8,201, 8,717 e
9,063 min, todos foram lidos pelos dois comprimentos de onda, sendo que, o pico com
o tempo de retenção de 8,717 min é bem intenso.
Dos 15 fungos selecionados, nove produziram alguma substância nova em
contato com a esclerotiorina (20), sendo que todos estes produziram substâncias
avermelhadas, supostamente, resultante da troca do heteroátomo de oxigênio vizinho
ao carbono 1, por um átomo de nitrogênio. Aspergillus parasiticus, Cladosporium
sphaerospermum, Microsporum gypseu e Penicillium janthinellum também
apresentaram outros produtos de biotransformação onde não houve mudança do
72
cromóforo e as substâncias mantiveram a coloração alaranjada da esclerotiorina (20), o
que indica que estes fungos são capazes de fazer outra alteração na molécula, além da
troca do heteroátomo.
Todos os produtos de biotransformação produzidos pelos fungos apresentam
características mais polares do que a esclerotiorina (20), com exceção do composto
com tempo de retenção de 20,997 min, menos polar, produzido por Aspergillus
parasiticus e Penicillium janthinellum.
Aspergillus parasiticus, Cladosporium sphaerospermum, Microsporum gypseum,
Paecilomyces varioti, Penicillium janthinellum e Syncephalastrum racemosum
produziram um ou mais produtos com grandes rendimentos, evidenciado pela
intensidade dos respectivos picos das substâncias.
A média do tempo de retenção da esclerotiorina (20) nas 14 amostras que
resultaram em cromatogramas com boa resolução foi de 19,5014 e o desvio padrão foi
de 0,2280. Para saber se os 14 valores seguem a distribuição normal, foi aplicado o
teste de normalidade de Ryan-Joiner. O valor crítico para n=14, com α=0,01, é de
0,9402 e o valor obtido com o teste de normalidade foi de 0,9585, o que comprova,
com 99% de confiabilidade, que os valores seguem a distribuição normal.
O erro padrão médio foi de 0,0770, o que levou a um intervalo de confiança de
19,5014 ± 0,1662, com 95% de confiabilidade, utilizando 13 graus de liberdade. Esse
intervalo de confiança foi extrapolado para se comparar os tempos de retenção das
outras substâncias dos cromatogramas. Deste modo, foi possível comparar os tempos
de retenção de substâncias produzidas por diferentes fungos e estimar se a mesma
substância é produzida por fungos diferentes. Como critério, também foi levado em
conta o comprimento de onda que as substâncias absorvem. Cladosporium
sphaerospermum e Syncephalastrum racemosum produzem uma substância com
tempo de retenção 5,285 min, porém não se trata da mesma substância, pois este pico,
no primeiro fungo é lido pelos dois comprimentos de onda e, no segundo, é lido
somente pelo comprimento 470nm.
A Tabela 15 lista as substâncias produzidas por mais de um fungo. O tratamento
estatístico garante 95% de confiabilidade.
73
Tabela 15 – Substâncias detectadas por CLAE em extratos de biotransformação
de mais de um fungo
Tempo de retenção médio (min) Fungos produtores
3,408 Cladosporium sphaerospermum
Syncephalastrum racemosum
8,004 Absidia cylindrospora
Syncephalastrum racemosum
8,210 Absidia cylindrospora
Syncephalastrum racemosum
8,722 Absidia cylindrospora
Aspergillus parasiticus
Cladosporium sphaerospermum
Clonostachys rosea f catenulata
Penicillium janthinellum
Syncephalastrum racemosum
9,006 Paecilomyces lilacinus
Paecilomyces variotii
Penicillium janthinellum
Syncephalastrum racemosum
10,089 Clonostachys rosea f catenulata
Penicillium janthinellum
20,997 Aspergillus parasiticus
Penicillium janthinellum
5.6.4 – Interpretação dos resultados da biotransformação em uma etapa de B. bassiana
O cromatograma do extrato obtido com a biotransformação em duas etapas do
Beauveria bassiana (item 4.4.1) apresentou quatro dos cinco biotransformados
evidenciados por CCD e isolados no item 5.3.2 deste trabalho. Os tempos de retenção
foram 8,625, 12,22, 16,285 e 18,060 min, sendo que os quatro foram lidos pelos dois
comprimentos de onda (Figura 40). O cromatograma do biotransformado 3 não
apresentou boa resolução mesmo após repetição do experimento, mas, pela sua
polaridade, estima-se que ele possua um tempo de retenção próximo ao do
biotransformado 2 (16,285 min). O cromatograma também evidenciou uma outra
substância com tempo de retenção de 9,993 min, que não foi isolada do extrato bruto.
74
Figura 40 – Cromatograma da biotransformação em duas etapas em contraste
com o cromatograma dos biotransformados isolados
O cromatograma obtido com o extrato da biotransformação em uma etapa não
apresentou nenhuma substância em quantidade considerável. Como já citado na
literatura (Medeiros, 2002), a biotransformação em duas etapas produz substratos em
maior quantidade, o que foi demonstrado na biotransformação da esclerotiorina (20)
pelo Beauveria bassiana.
5.6.5 – Extrato de P. sclerotiorum
O cromatograma do extrato de Penicillium sclerotiorum, obtido no item 4.2,
apresentou os três metabólitos secundários produzidos por este fungo citados na
75
literatura (Castro, 2008): isocromofilona VI (22), esclerotiorina (20) e pencolídeo (21),
respectivamente com os tempos de retenção de 8,94, 19,78 e 22,10 min, sendo que os
dois últimos são lidos somente pelo comprimento de onda de 470nm e a isocromofilona
VI (22) é lida pelos dois comprimentos de onda (Figura 41).
Figura 41 – Cromatograma do extrato de Penicillium sclerotiorum
5.7 – Projeção para uso dos resultados em alimentos
Com os experimentos elaborados, foi possível obter várias substâncias novas a
partir da biotransformação da esclerotiona, sendo que cinco delas foram isoladas e
uma teve sua estrutura proposta.
A esclerotiorina (20) é um corante e antioxidante de atividade comprovada
(Chidananda e Sattur, 2007), com baixa toxicidade e registros de uso em alimentos
(Negishi et al., 2000). O estudo da obtenção de derivados desta molécula pode resultar
na descoberta de substâncias com melhores características, como: alteração de cor,
maior efeito antioxidante, menor toxicidade, ou melhor incorporação em alimentos.
Devido à baixa toxicidade da esclerotiorina (20), pode-se supor que alguns de
seus produtos derivados possam ser aplicados na indústria de alimentos, porém, para
isso serão necessários mais testes, principalmente os de toxicidade. A biotecnologia
tem grande importância no estudo dos alimentos e biotransformações podem ser
usadas na busca de novas substâncias para este segmento.
Tendo em mente as limitações do uso de corantes naturais, como a
dependência de materiais sazonais e a variação do perfil do pigmento e, notando o
crescente mercado para corantes naturais, pode-se inferir que o futuro da produção
industrial de corantes naturais se baseará em três áreas: produção robusta com
76
qualidade uniforme, descoberta de fontes alternativas de novas ou conhecidas classes
de pigmentos e cores, e melhoria da funcionalidade. A habilidade da classe dos
policetídeos de servir como corantes de alimentos tem escapado da atenção de
cientistas de alimentos, inclusive na indústria. A recente aprovação de carotenóides
derivados de fungos filamentosos para uso como corantes em alimentos destaca o
potencial dos policetídeos, que tem sido pouco explorado, com exceção dos pigmentos
produzidos por fungos do gênero Monascus (Mapari et al., 2010).
Estudos recentes indicam como fungos filamentosos podem ser usados como
fábricas celulares para produção de pigmentos e podem ser desenvolvidos para
expandir a paleta de cores dos corantes naturais existentes. No entanto, é preciso
compreender melhor como, porque e sob quais circunstâncias fungos filamentosos
produzem pigmentos policetídeos. Assim como outros corantes, os policetídeos
precisam passar por testes de toxicidade antes de serem aprovados. No que se diz
respeito à aceitação dos consumidores e das autoridades, os policetídeos devem ser
tratados de maneira igual aos atuais corantes aprovados que vem de fontes exóticas,
como o ácido carmínico, extraído do inseto cochonilha, e os carotenóides de origens
fúngicas (Mapari et al., 2010).
77
CONCLUSÕES
O fungo Penicillium sclerotiorum produziu esclerotiorina (20) em meio de cultura
líquido, em cultivo estático. Após 21 dias de cultivo, a extração com acetato de etila
gerou 3,07 g de extrato.
A esclerotiorina (20) presente no filtrado do cultivo do fungo foi isolada do
extrato, com alto grau de pureza, por cromatografia em coluna, utilizando
diclorometano como eluente. Foram obtidos 914,2 mg de esclerotiorina (20), relativos a
30% da massa total do extrato.
A reação da esclerotiorina (20) com o diazometano resultou na metilação da
posição 1 da molécula de esclerotiorina (20). A reação de formação do 1-metil-
esclerotiorina (64) teve rendimento de 31%.
A biotransformação da esclerotiorina (20) pelo fungo Beauveria bassiana foi
pouco eficiente quando foi adicionada diretamente no cultivo do fungo
(biotransformação em uma etapa).
A biotransformação da esclerotiorina (20) pelo fungo B. bassiana foi eficiente
quando o meio de reação continha apenas massa celular e o substrato em água
destilada (biotransformação em duas etapas).
Foram isolados cinco produtos da biotransformação da esclerotiorina (20) por B.
bassiana em duas etapas. A quantidade obtida dos biotransformados 1 a 5 foram,
respectivamente, 27,5 mg, 8,3 mg, 1,9 mg, 12,8 mg e 13,7 mg, o que representa
rendimentos de 13,75%, 4,15%, 0,95%, 6,4% e 6,85%, respectivamente.
Todos os produtos biotransformados apresentaram um átomo de nitrogênio em
substituição ao átomo de oxigênio ligado ao carbono 1 da molécula de esclerotiorina
(20), ligado a uma cadeia lateral, diferente em cada um dos cinco produtos. O
biotransformado 1 (56) foi isolado e sua estrutura molecular foi determinada por
métodos espectroscópicos.
78
A biotransformação em duas etapas da 1-metil-esclerotiorina (64) pelo Beauveria
bassiana não apresentou os mesmos resultados apresentados quando se usou a
esclerotiorina (20). O heteroátomo ligado ao carbono 1 não foi substituído,
provavelmente pelo fato de este sítio estar alterado, com um grupo metila ligado
Da triagem de 15 fungos selecionados, para verificar a capacidade de
biotransformação da esclerotiorina (20) em uma etapa, nove produziram alguma
substância com coloração vermelha, e destes, quatro produziram também alguma outra
substância de coloração alaranjada.
Os metabólitos secundários produzidos pelo Penicillium sclerotiorum,
isocromofilona VI (22), esclerotiorina (20) e pencolídeo (21), após a injeção no HPLC,
apresentaram respectivamente os tempos de retenção de 8,94, 19,78 e 22,10 min.
79
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Alvarenga, L.M. Efeito do tratamento enzimático da polpa na produção de aguardente
de manga (Mangifera indica L.). Faculdade de Farmácia, Universidade Federal de
Minas Gerais, 2006. (Dissertação: Mestrado em Ciências de Alimentos)
Alvarenga, R.M., Gomes, D.C., Oliveira, E.S., Lara, S.R. Uso de diferentes linhagens
de leveduras para fermentação de polpa de manga para produção de aguardente
de manga. In: XXI Congresso Brasileiro de Ciência e Tecnologia de Alimentos. 2008
Aquarone, E., Borzani, W., Schmidell, W., Lima, U.A. Biotecnologia Industrial, Volume
4: Biotecnologia na produção de alimentos. Editora Edgard Blücher Ltda. 1ª Ed.
2008. São Paulo, Brasil
Araujo, K.G.L., Domingues, J.R., Srur, A.U.O.S.; da Silva, A.J.R. Production of
antioxidants by Anabaena PCC 7119 and evaluation of their protecting activity
against oxidation of soybean oil. Food Biotechnology. Vol 20. No 1. 2006. 65-77p
Arunpanichlert, J., Rukachaisirikul, V., Sukpondma, Y., Phongpaichit, S., Tewtrakul, S.,
Rungjindamai, N., Sakayaro, J. Azaphilone and Isocoumarin derivatives from the
endophytic fungus Penicillium sclerotiorum PSU-A13. Chem Pharm Bull. Vol 58.
2010. 1033-1036p
Azab, M.S. Re-use of wastewater of food industries for the production of fungal biomass
and enzymes for the bio-treatment of wastewater. Egyptian Journal of Biotechnology.
Vol 7. 2000. 163-179p
Bérdy, J. Bioactive microbial metabolites. J Antibiot. Vol 58. No 1. 2005. 1-26p
Blendford, D. Colouring consumers perceptions. Food Ingredients Anal. Vol 17. 1995.
10-15p
Borzani, W., Schmidell, W., Lima, U.A., Aquarone, E. Biotecnologia Industrial, Volume I:
Fundamentos. Editora Edgard Blücher Ltda. 1ª Ed. 2008. São Paulo, Brasil
Bracarense, A.A.P. Isolamento, preparo de derivados e bioprospecção da atividade
biológica de metabólitos de fungos filamentosos. Belo Horizonte: Departamento de
Química, Universidade Federal de Minas Gerais. 2008. 130p. (Dissertação:
Mestrado em Química)
Brizuela, M.A., García, L., Pérez, L., Mansur, M. Basidiomicetos: nueva fuente de
metabolitos secundários. Rev Iberoam Micol. Vol 15. 1998. 69-74p
Buchanan, G.O., Reese, P.B. Biotransformation of diterpenes and diterpene derivatives
by Beauveria bassiana ATCC 7159. Phytochemistry. Vol 56. 2001. 141-151p
80
Butler, M.S., The role of natural product chemistry in drug Discovery. J Nat Prod. Vol
67. 2004. 2141-2153p
Carvalho, S.A. Avaliação do potencial de fungos macro e microscópicos como fonte de
ácidos graxos e outros macro e micronutrientes de interesse para a indústria
alimentícia. Belo Horizonte: Departamento de Química, Universidade Federal de
Minas Gerais. 2009. 136p. (Tese: Doutorado em Química)
Castro, M.C.M. CLAE e investigação da atividade biológica de metabólitos de
Penicillium sclerotiorum. Belo Horizonte: Departamento de Química, Universidade
Federal de Minas Gerais. 2008. 85p. (Dissertação, Mestrado em Química)
Chidananda, C., Rao, L.J.M., Sattur, A.P. Sclerotiorin, from Penicillium frequentans, a
potent inhibitor of aldose reductase. Biotechnol Lett. Vol 28. 2006. 1633-1636p
Chidananda, C., Sattur, A.P. Sclerotiorin, a novel inhibitor of lipoxygenase from
Penicillium frequentans. J Agric FoodChem. Vol 55. 2007. 2879-2883p
Choudhary, M.I., Mohammad, M.Y., Musharraf, S. G., Parvez, M., Al-Aboudi, A., Atta-
ur-Rahman. New oxandrolone derivatives by biotransformation using Rhizopus
stolonifer. Steroids. Vol 74. 2009. 1040-1044p
Ciola, R. Fundamentos da Cormatografia a Líquido de Alto Desempenho: HPLC. 1 ed.
2005. Editora Edgard Blücher LTDA. São Paulo, SP
Duetz, W.A., Bouwmeester, H., Beilen, J.B.V., Witholt, B. Biotransformation of limonene
by bacteria, fungi, yeasts and plants. Appl Microbiol Biotechnol. Vol 61. 2003. 269-
277p
Edrada R.A., Heubes, M., Brauers, G., Wray, V., Berg, A., Gräfe, U., Wohlfarth, M.,
Mühlbacher, J., Schaumann, K., Sudarsono, Bringmann, G., Proksch, P. Online
analysis os Xestodecalactones A-C, novel bioactive metabolites from the fungus
Penicillium cf. montanense and their subsequent isolation from the sponge
Xestospongia exigua. J Nat Prod. Vol 65. 2002. 1598-1604p
FDA – U.S. Food and Drug Administration, IFIC – International Food Information
Council, Food Ingredients and Colors. Disponível em:
<http://www.fda.gov/food/foodingredientspackaging/ucm094211.htm>. Abril 2010.
Acesso em: 11 nov. 2010
Funder, S. Practical mycology: manual for identification of fungi. 3 ed. 1968. Hafner
Publishing Company. Noruega.
García-Granados, A., Martínez, A., Parra, A., Rivas, F. Manoyl-oxide biotransformations
with filamentous fungi. Current Organic Chemistry. Vol 11. 2007. 679-692p
81
Gengar, R.M., Chuturgoon, A.A., Mulholland, D.A., Dutton, M.F. Synthesis of
sterigmatocystin derivatives and their biotransformation to aflatoxins by a blocked
mutant of Aspergillus parasiticus. Mycopathologia. Vol 144. 1999. 115-122p
Gesell, M., Hammer, E., Specht, M., Francke, W., Schauer, F. Biotransformation of
Biphenyl by Paecilomyces lilacinus and Caracterization of Ring Cleavage Products.
Applied and Environmental Microbiology. Vol 67. No 1. 2001. 1551-1557p
González-Sánchez, F., Azaola, A., Gutiérrez-López, G.F, Hernández-Sánchez, H.
Viability of microencapsulated Bifdobacterium animalis ssp. lactis BB12 in kefir
during refrigerated storage. International Journal of Dairy Technology. Vol 63. No 3.
2010. 431-436p
Gottlieb, O.R., Mors, N.B. Potencial utilization of brazilian wood extractives. Journal of
Agricultural and Food Chemistry. Vol 28. 1980, 196-215p
Guiraud, P., Bonnet, J.L., Boumendjel, A., Kadri-Dakir, M., Dusser, M., Bohatier, J.,
Steiman, R. Involvement of Tetrahymena pyriformis and selected fungi in the
elimination of anthracene, and toxicity assessment of the biotranformation products.
Ecotoxicology and Environmental Safety. Vol 69. 2008. 296-305p
Harinantenaina, L., Noma, Y., Asawaka, Y. Penicillium sclerotiorum catalyses the
conversion of herbertenediol into its dimmers: mastigophorenes A and B. Chem
Pharm Bull. Vol 53. No 2. 2005. 256-257p
Hawksworth, D.L. The fungal dimension of biodiversity: magnitude, significance, and
conservation. Mycological Research. Vol 95. 1991. 641-655p
Hendry, G.A.F, Houghton, J.D. Natural Food Colorants. 2 ed. Chapman & Hall. 1996.
Glasgow, Escócia
Hudlicky, M. An improved apparatus for the laboratory preparation of diazomethane.
The Journal of Organic Chemistry. Vol 45. 1980. 5377-5378p
Hussein, H.S., Brasel, J.M. Review: toxicity, metabolism and impact os mycotoxiins on
humans and animals. Toxicology. Vol 167. No 2. 2001. 101-134p
Kakeya, H., Takahashi-Ando, N., Kimura, M., Onose, R., Yamaguchi, I., Osada, H.
Biotransformation of the Mycotoxin, Zearalenone, to a Non-estrogenic Compound by
a Fungal Strain of Clonostachys sp. Biosci Biotechnol Biochem. Vol 66. 2002. 2723-
2726p
Keller, N.P., Turner, G., Bennett, J.W. Fungal secondary metabolism, from biochemistry
to genomics. Nature reviews, Microbiology. Vol 3. 2005. 937-947p
82
Kiehlmann, E., Pinto, L., Moore, M. The biotransformation of chrysene to trans-1,2-
dihydroxy-1,2-dihydrochrysene by filamentous fungi. Can J Microbiol. Vol 42. No 6.
1996. 604-608p
Knob, A., Carmona, E.C. Cell-associated acid β-xylosidade production by Penicillium
sclerotiorum. New Biotechnology. Vol 26. No 1/2. 2009. 60-67p
Lacroix, I., Biton, J., Azerad, R. Microbial Models of Drug Metabolism: Microbial
Transformations of Trimegestone® (RU27987) a 3-Keto-Δ4,9(10)-19-norsteroid Drug.
Bioorganic & Medicinal Chemistry. Vol 7. 1999. 2329-2341p
Liu, D., Thomson, K., Anderson, A.C. Identification of nitroso compounds from
biotransformation of 2,4-dinitrotoluene. Applied an Environmental Microbiology. Vol
47. No 6. 1984. 1295-1298p
Lucas, E.M.F., Castro, M.C.M., Takahashi, J.A. Antimicrobial properties of sclerotiorin,
isochromophilone VI and pencolide, metabolites from a Brazilian Cerrado isolate of
Penicillium sclerotiorum van Beyma. Brazilian Journal of Microbiology. Vol 38. 2007.
785-789p
MacCurtin, T., Reilly, J. Sclerotiorine, a chlorinated metabolic product of Penicillium
sclerotiorum, Van Beyma. Biochem J. Vol 34. 1940. 1419-1421p
Mapari, S.A.S., Nielsen, K.F., Larsen, T.O., Frisvad, J.C., Meyer, A.S., Thrane, U.
Exploring fungal biodiversity for the production of water-soluble pigments as
potential natural food colorants. Current Opinion in Biotechnology. Vol 16. 2005.
231-238p
Mapari, S.A.S., Meyer, A.S., Thrane, U., Frisvad, J.C. Identification of potentially safe
promising fungal cell factories for the production of polyketide natural food
colorants using chemotaxonomic rationale. Microbial Cell Factories. Vol 8. No 24.
2009. 1-15p
Mapari, S.A.S., Thrane, U., Meyer, A.S. Fungal polyketide azaphilone pigments as
future natural food colorants? Trends in Biotechnology. Vol 28. 2010. 300-307p
Martins, L.R. Avaliação do potencial biotecnológico de fungos brasileiros em reações
de biotransformação e biorremediação. Belo Horizonte: Departamento de Química,
Universidade Federal de Minas Gerais. 2009. 189 p. (Tese, Doutorado em Química)
Medeiros, S.F. Biotransformação de derivados da artemisinina com ação antimalárica
por Mucor ramannianus. Rio de Janeiro: Escola de Química, Universidade Federal
do Rio de Janeiro. 2002. 138p. (tese, Doutorado em Tecnologia de processos
químicos e bioquímicos)
83
Miyazawa, M., Nankai, H., Kameoda, H. Biotransformation of (+)-cedrol by plant
pathogenic fungus, Glomerella cingulata. Phytochemistry. Vol 40. No 1. 1995. 69-
72p
Mukherjee, G., Sachan, A., Shashwati, G., Mitra, A. Conversion of sinapic acid to
syringic acid by a filamentous fungus Paecilomyces variotii. J Gen Appl Microbiol.
Vol 52. 2006. 131-135p
Musso, L., Dallavalle, S., Merlini, L., Bava, A., Nasini, G., Penco, S., Giannini, G.,
Giomarelli, C., Cesare, A., Zuco, V., Vesci, L., Pisano, C., Piaz, F., Tommasi, N.,
Zunino, F. Natural and semisynthetic azaphilones as a new scaffold for Hsp90
inhibitors. Bioorganic & Medicinal Chemistry. Vol 18. 2010. 6031-6043p
Negishi, Y., Matsuo, N., Miyadera, K., Tanishima, M. Lipase inhibitors containing
sclerotiorin. Jpn Pat. 2000. 98-376263 19981224
Olivo, H.F, Ozorio-Lozada, A., Peeples, T.L. Microbial oxidation/amidation of
benzhydrylsulfanyl acetic acid. Synthesis of (+)-modafinil. Tetrahedron: Asymmetry.
Vol 16. 2005. 3507-3511p
Osmanova, N., Schultze, W., Ayoub, N. Azaphilones: a class of fungal metabolites with
diverse biological activities. Phytochem Rev. Vol 9. 2010. 315-342p
Osorio-Lozada, A., Miranda, R.T., Olivo, H.F. Biotransformation of N-
piperidinylacetophenone with Beauveria bassiana ATCC-7159. Journal of molecular
catalysis B: Enzymatic. Vol 55. 2008. 30-36p
Pairet, L., Wrigley, S.K., Chetland, I., Reynolds, E.E., Hayes, M.A., Holloway, J.,
Ainsworth, A.M., Katzer, W., Cheng, X-M., Hupe, D.J., Charlton, P., Doherty, A.M.
Azaphilones with endothelin receptor binding activity produced by Penicillium
sclerotiorum: taxonomy, fermentation, isolation, structure elucidation and biological
activity. The Journal of Antibiotics. Vol 48. No 9. 1995. 913-922p
Palmqvist, A., Rasmussen, L.J., Forbes, V.E. Influence of biotransformation on trophic
transfer of the PAH, fluoranthene. Aquatic Toxicology. Vol 80. 2006. 309-319p
Pereira, R.T.G., Pfenning, L.H., Castro, H.A. Caracterização e dinâmica de colonização
de Cladosporium cladosporioides (Fresen.) de vries em fruto do cafeeiro (Coffea
arábica L.). Ciênc agrotec Lavras. Vol 29. No 6. 2005. 1112-1116p
Pimentel-Gomes, F. Curso de estatística experimental. 14 ed. Editora Degaspari. 2000.
Piracicaba. 477p
Rai, M. Advances in Fungal Biotechnology. 1a ed. I.K. International Publishing House.
2009. New Delhi, India
84
Rosche, B., Sandford, V., Breuer, M., Hauer, B., Rogers, P. Biotransformation of
benzaldehyde into (R)-phenylacetylcarbinol by filamentous fungi or their extracts.
Appl Microbiol Biotechnol. Vol 57. 2001. 309-315p
Rouhi, A.M. Rediscovering natural products. Chemical and Engineering News. Vol 81.
2003. 77-78p
Sabino, M., Inomata, E.I., Lamarco, L.C.A. Variação dos níveis de aflatoxina B1 em
pasta de amendoim e paçoca consumidas no estado de São Paulo. Revista Instituto
Adolfo Lutz. Vol 42. No 1/2. 1982. 39-44p
Sachan, A., Ghosh, S., Mitra, A. Biotransformation of p-coumaric acid by Paecilomyces
variotti. Letters in Applied Microbiology. Vol 46. No 1. 2006. 35-41p
Sakamaki, H., Kitanaka, S., Chai, W., Hayashida, Y., Takagi, Y., Horiuchi, C.A.
Biotransformation of Thujopsene by Caragana chamlagu. J Nat Prod. Vol 64. 2001.
630-631p
Sato, S. Produção de esteróides. In: Lima, U.A., Aquarone, E., Borzani, W., Schmidell,
W. Biotenologia Industrial: Processos Fermentativos e Enzimáticos. São Paulo, 4
ed. 2001. Cap 9. 179-197p
Schulz, B., Boyle, C., Draeger, S., Römmert, A.K., Krohn, K. Endophytic fungi: a source
of novel biologically active secondary metabolites. Mycol Res. Vol 106. 2002. 996-
1004p
Sharma, K., Bari, S.S., Singh, H.P. Biotransformation of tea catechins into theaflavins
with immobilized polyphenol oxidase. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic.
Vol 56. No 4. 2009. 253-258p
Shiomi, K., Matsui, R., Isozaki, M., Chiba, H., Sugai, T., Yamaguchi, Y., Masuma, R.,
Tomoda, H., Chiba, T., Yan, H., Kitamura, Y., Sugiura, W., Omura, S., Tanaka, H.
Fungal phenalenones inhibit HIV-1 integrase. J Antibiot. Vol 58. 2005. 65-68p
Shiva, S.K., Hara, K.K., Sanjit, K., Sunil, M., Narayana, M.U.S., Prasad, R.B.N.
Biotransformation of ferulic acid to acetovanillone using Rhizopus oryzae.
Biocatalysis & Biotransformation. Vol 25. No 1. 2007. 109-112p
Siebers-Wolff, S., Arfmann, H.A., Abraham, W.R., Kieslich, K. Microbiological
Hydroxylation and N-oxidation of Cinchona Alkaloids. Biocatalysis and
Biotransformation. Vol 8. No 1. 1993. 47-58p
Silverstein, R.M., Webster, F.X., Kiemle, D.J. Spectrometric Identification of Organic
Compounds. 7 ed. Wiley books. 2005. New York, EUA
85
Smedsgaard, J., Nielsen, J. Metabolite profiling of fungi and yeast: from phenotype to
metabolome by MS and informatics. Journal of Experimental Botany. Vol 56. 2005.
273-286p
Solomons, T.W.G. Química Orgânica. 7ª Ed. Editora LTC. 2002. Rio de Janeiro, RJ
Souza, G.G., Anconi, C.P.A., Cornelissen, S., Almeida, W.B., Santos, H.F., Fortes,
I.C.P., Takahashi, J.A. Selective activity of Mucor plumbeus reductase towards (-)-
camphorquinone. J Ind Microbiol Biotechnol. Vol 36. 2009. 1023-1027p
Still, W.C., Kahn, M., Mitra, A. Rapid Chromatographic Technique for Preparative
Separations with Moderate Resolution. J Org Chem. Vol 43. No 14. 1978. 2923-
2925p
Struempel, M., Ondruschka, B., Daute, R., Stark, A. Making diazomethane accessible
for R&D and industry: generation and direct conversion in a continuous micro-
reactor set-up. Green Chemistry. Vol 10. 2008. 41-43p
Takahashi, J.A., Lucas, E.M.F. Ocorrência e diversidade estrutural de metabólitos
fúngicos com atividade antibiótica. Química Nova. Vol 31. 2008. 1807-1813p
Takahashi, J.A., Castro, M.C.M., Souza, G.G., Lucas, E.M.F., Bracarense, A.A.P.,
Abreu, L.M., Marriel, I.E., Oliveira, M.S., Floreano, M.B., Oliveira, T.S. Isolation and
screening of fungal species isolated from Brazilian cerrado soil for antibacterial
activity against Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium,
Streptococcus pyogenes and Listeria monocytogenes. J Mycologie Méd. Vol 18.
2008. 198-204p
Terci, D.B.L., Rossi, A.V. Indicadores naturais de pH: usar papel ou solução? Química
nova. Vol 25. No 4. 2002. 684-688p
The Plant Observatory. Garcinia atroviridis (Asam Gelugur). Disponível em:
<http://www.natureloveyou.sg/Garcinia%20atroviridis/Main.html>. Março 2010.
Acesso em: 16 nov. 2010
Tomoda, H., Matsushima, C., Tabata, N., Namatame, I., Tanaka, H., Bamberger, M.J.,
Arai, H., Fukazawa, M., Inoue, K., Omura, S. Structure-specific inhibition of
cholesteryl ester transfer protein by azaphilones. The Journal of Antibiotics. Vol 52.
No 2. 1999. 160-170p
Tortora, G.J., Funke, B.R., Case, C.L. Microbiology: an introduction. 7 ed. Benjamin
Cummings. 2002. Boston, USA
Uenojo, M., Junior, M.R. W., Pastore, G.M. Carotenóides: propriedades, aplicações e
biotransformação para formação de compostos de aroma. Química nova. Vol 30. No
3. 2007. 616-622p
86
Wei, W.G., Yao, Z.J. Synthesis studies toward chloroazaphilones and vinylogous γ-
pyridones: two common natural product core structures. J Org Chem. Vol 70. 2005.
4585-4590p
Weng, S.H., Su, N.W., Choong, Y.M., Lee, M.H. HPLC/colorimetry combination method
for quantitative analyses of sclerotiorin produced by Penicillium sclerotiorum. Journal
of Food and Drug Analysis. Vol 12. No 3. 2004. 199-204p
Wijeratne, E. K., Carbonezi, C. A., Takahashi, J. A., Seliga, C. J., Turbyville, T. J.,
Pierson, E. E., Pierson-Iii, L. S., Whitesell, L., Bolzani, V. S., Gunatilaka, A. A. L.
Isolation, Optimisation Of Production and Structure-Activity Relationship Studies of
Monocillin I, the Cytotoxic Constituent of Paraphaeosphaeria quadriseptata. The
Journal of Antibiotics. Vol 57. No 8. 2004. 541-550p
Xiahgjiu, H., Zeng, X., Hu, H., Wu, Y. Cytotoxic biotransformed products from
andrographolide by Rhizopus stolonifer ATCC 12939. Journal of Molecular Catalysis
B: Enzymatic. Vol 62. 2010. 242-247p
Zhan, J, Gunatilaka, A.A.L. Biotransformation of Amino- and Hydroxyanthraquinones by
Beauveria bassiana ATCC 7159. J Nat Prod. Vol 69. 2006. 1525-1527p
Zhang, H., Qiu, F., Qu, G., Yao, X. The directional biotransformation of curcumol by
Penicillium janthinellum. Chinese Journal of Medicinal Chemistry. Vol 15. No 5.
2005. 305-306p
87
APÊNDICES E ANEXOS
Apêndice 1 – Espectro de RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) da esclerotiorina
Apêndice 2 – Espectro de RMN de 13C (100 MHz, CDCl3) da esclerotiorina
88
Apêndice 3 – Espectro DEPT (100 MHz, CDCl3) da esclerotiorina
Apêndice 4 – Mapa de contornos HSQC (400 MHz, CDCl3) da esclerotiorina
89
Apêndice 5 – Mapa de contornos HMBC (400 MHz, CDCl3) da esclerotiorina
Apêndice 6 – Mapa de contornos COSY (400 MHz, CDCl3) da esclerotiorina
90
Apêndice 7 – Espectro de RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) do biotransformado 1
Apêndice 8 – Espectro de RMN de 13C (100 MHz, CDCl3) do biotransformado 1
91
Apêndice 9 – Espectro DEPT (100 MHz, CDCl3) do biotransformado 1
Apêndice 10 – Mapa de contornos HSQC (400 MHz, CDCl3) do biotransformado 1
92
Apêndice 11 – Mapa de contornos HMBC (400 MHz, CDCl3) do biotransformado 1
Apêndice 12 – Mapa de contornos COSY (400 MHz, CDCl3) do biotransformado 1
93
Apêndice 13 – Mapa de contornos HSQC-TOCSY (400 MHz, CDCl3) do
biotransformado 1
Apêndice 14 – Espectro de massas (ESI-MS) do biotransformado 1
437.1927
494.2060
516.1876
+MS, 0.1-0.6min #(6-34)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
5x10
Intens.
420 440 460 480 500 520 540 m/z
94
Apêndice 15 – Espectro no UV do biotransformado 1
Apêndice 16 – Espectro no IV (KBr) do biotransformado 1
95
Apêndice 17 – Espectro de massas (ESI-MS) do biotransformado 4
Apêndice 18 – Espectro no UV do biotransformado 4
02-Dec-2010 09:49:562203
m/z260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700 720
%
0
100
AMOSTRA_02_021110 11 (0.204) Sm (SG, 6x3.00); Sb (5,40.00 ); Cm (2:15) TOF MS ES+ 1.53e4510.3581
480.3997
512.3657
513.3709
533.3936
96
Apêndice 19 – Espectro no IV (KBr) do biotransformado 4
Apêndice 20 – Espectro de massas (ESI-MS) do biotransformado 5
02-Dec-2010 09:58:072204
m/z300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700
%
0
100
AMOSTRA_03_021110 12 (0.222) Sm (SG, 6x3.00); Sb (5,40.00 ); Cm (2:15) TOF MS ES+ 7.71e3434.3309
376.2983
346.2778
378.3040
405.3774
436.3343
542.5028437.3427
543.5035
576.4747
97
Apêndice 21 – Espectro no UV do biotransformado 5
Apêndice 22 – Espectro no IV (KBr) do biotransformado 5
98
Apêndice 23 – Espectro de RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) do produto 1
Apêndice 24 – Espectro de RMN de 13C (100 MHz, CDCl3) do produto 1
99
Apêndice 25 – Espectro DEPT (100 MHz, CDCl3) do produto 1
Apêndice 26 – Mapa de contornos HSQC (400 MHz, CDCl3) do produto 1
100
Apêndice 27 – Mapa de contornos HMBC (400 MHz, CDCl3) do produto 1
Apêndice 28 – Mapa de contornos COSY (400 MHz, CDCl3) do produto 1
101
Apêndice 29 – Mapa de contornos NOESY (400 MHz, CDCl3) do produto 1
Apêndice 30 – Espectro de massas (ESI-MS) do produto 1
02-Dec-2010 09:37:502101
m/z290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 410 420 430 440 450 460 470 480
%
0
100
AMOSTRA_01_021110 13 (0.241) Sm (SG, 6x3.00); Sb (5,40.00 ); Cm (2:14) TOF MS ES+ 3.78e4405.2026
317.1865
363.2074
319.1919
365.2056
407.2253
427.2208408.2386
102
Apêndice 31 – Espectro no UV do produto 1
Apêndice 32 – Espectro no IV (KBr) do produto 1
103
Apêndice 33 – Cromatograma do extrato de Absidia cylindrospora
Controle – 530nm
Controle – 470nm
Amostra – 530nm
Amostra – 470nm
104
Apêndice 34 – Cromatograma do extrato de Aspergillus parasiticus
Controle – 530nm
Controle – 470nm
Amostra – 530nm
Amostra – 470nm
105
Apêndice 35 – Cromatograma do extrato de Cladosporium sphaerospermum
Controle – 530nm
Controle – 470nm
Amostra – 530nm
Amostra – 470nm
106
Apêndice 36 – Cromatograma do extrato de Clonostachys rosea f catenulata
Controle – 530nm
Controle – 470nm
Amostra – 530nm
Amostra – 470nm
107
Apêndice 37 – Cromatograma do extrato de Microsporum gypseum
Controle – 530nm
Controle – 470nm
Amostra – 530nm
Amostra – 470nm
108
Apêndice 38 – Cromatograma do extrato de Mucor plumbeus
Controle – 530nm
Controle – 470nm
Amostra – 530nm
Amostra – 470nm
109
Apêndice 39 – Cromatograma do extrato de Paecilomyces lilacinus
Controle – 530nm
Controle – 470nm
Amostra – 530nm
Amostra – 470nm
110
Apêndice 40 – Cromatograma do extrato de Paecilomyces varioti
Controle – 530nm
Controle – 470nm
Amostra – 530nm
Amostra – 470nm
111
Apêndice 41 – Cromatograma do extrato de Penicillium janthinellum
Controle – 530nm
Controle – 470nm
Amostra – 530nm
Amostra – 470nm
112
Apêndice 42 – Cromatograma do extrato de Pestalotiopsis palustris
Controle – 530nm
Controle – 470nm
Amostra – 530nm
Amostra – 470nm
113
Apêndice 43 – Cromatograma do extrato de Rhizopus oryzae
Controle – 530nm
Controle – 470nm
Amostra – 530nm
Amostra – 470nm
114
Apêndice 44 – Cromatograma do extrato de Rhizopus stolonifer
Controle – 530nm
Controle – 470nm
Amostra – 530nm
Amostra – 470nm
115
Apêndice 45 – Cromatograma do extrato de Syncephalastrum racemosum
Controle – 530nm
Controle – 470nm
Amostra – 530nm
Amostra – 470nm
116
Apêndice 46 – Cromatograma do extrato de Thamnostylum sp.
Controle – 530nm
Controle – 470nm
Amostra – 530nm
Amostra – 470nm
117
Apêndice 47 – Cromatograma do extrato de Beauveria bassiana (biotransformação da
esclerotiorina)
Controle – 530nm
Controle – 470nm
Amostra – 530nm
Amostra – 470nm
118
Apêndice 48 – Cromatograma do extrato de Beauveria bassiana (biotransformação da
1-metil-esclerotiorina)
Controle – 530nm
Controle – 470nm
Amostra – 530nm
Amostra – 470nm
119
Apêndice 49 – Cromatograma do extrato de Beauveria bassiana (biotransformação da
esclerotiorina em duas etapas)
Controle – 530nm
Controle – 470nm
Amostra – 530nm
Amostra – 470nm
120
Apêndice 50 – Cromatograma do extrato de Penicillium sclerotiorum
530nm
470nm
121
Anexo 1 – Tabela de distribuição de t student (na vertical, graus de liberdade, na
horizontal, probabilidade do teste)
GL/α 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,05 0,02 0,01 0,001
1 0,158 0,325 0,51 0,727 1 1,376 1,963 3,078 6,314 12,71 31,82 63,66 636,6
2 0,142 0,289 0,445 0,617 0,816 1,061 1,386 1,886 2,92 4,303 6,965 9,925 31,60
3 0,137 0,277 0,424 0,584 0,765 0,978 1,25 1,638 2,353 3,182 4,541 5,541 12,92
4 0,134 0,271 0,414 0,569 0,741 0,941 1,19 1,533 2,132 2,776 3,747 4,604 8,61
5 0,132 0,267 0,408 0,559 0,727 0,92 1,156 1,476 2,015 2,571 3,365 4,032 6,869
6 0,131 0,265 0,404 0,553 0,718 0,906 1,134 1,44 1,943 2,447 3,143 3,707 5,959
7 0,13 0,263 0,402 0,549 0,711 0,896 1,119 1,415 1,895 2,365 2,365 3,499 5,408
8 0,13 0,262 0,399 0,546 0,706 0,889 1,108 1,397 1,86 2,306 2,896 3,355 5,041
9 0,129 0,261 0,398 0,543 0,703 0,883 1,1 1,383 1,833 2,262 2,821 3,25 4,781
10 0,129 0,26 0,397 0,542 0,7 0,879 1,093 1,372 1,812 2,228 2,764 3,169 4,587
11 0,129 0,26 0,396 0,54 0,697 0,876 1,088 1,363 1,796 2,201 2,718 3,106 4,437
12 0,128 0,259 0,395 0,539 0,695 0,873 1,083 1,356 1,782 2,179 2,681 3,055 4,318
13 0,128 0,259 0,394 0,538 0,694 0,87 1,079 1,35 1,771 2,16 2,65 3,012 4,221
14 0,128 0,258 0,393 0,537 0,692 0,868 1,076 1,345 1,761 2,145 2,624 2,977 4,14
15 0,128 0,258 0,393 0,536 0,691 0,866 1,074 1,341 1,753 2,131 2,602 2,947 4,073
16 0,128 0,258 0,392 0,535 0,69 0,865 1,071 1,337 1,746 2,12 2,583 2,921 4,015
17 0,128 0,257 0,392 0,534 0,689 0,863 1,069 1,333 1,74 2,11 2,567 2,898 3,965
18 0,127 0,257 0,392 0,534 0,688 0,862 1,067 1,33 1,734 2,101 2,552 2,878 3,922
19 0,127 0,257 0,391 0,533 0,688 0,861 1,066 1,328 1,729 2,093 2,539 2,861 3,883
20 0,127 0,257 0,391 0,533 0,687 0,86 1,064 1,325 1,725 2,086 2,528 2,845 3,85
21 0,127 0,257 0,391 0,532 0,686 0,859 1,063 1,323 1,721 2,08 2,518 2,831 3,819
22 0,127 0,256 0,39 0,532 0,686 0,858 1,061 1,321 1,717 2,074 2,508 2,819 3,792
23 0,127 0,256 0,39 0,532 0,685 0,858 1,06 1,319 1,714 2,069 2,5 2,807 3,767
24 0,127 0,256 0,39 0,531 0,685 0,857 1,059 1,318 1,711 2,064 2,492 2,797 3,745
25 0,127 0,256 0,39 0,531 0,684 0,856 1,058 1,316 1,708 2,06 2,485 2,787 3,726
26 0,127 0,256 0,39 0,531 0,684 0,856 1,058 1,315 1,706 2,056 2,479 2,779 3,707
27 0,127 0,256 0,389 0,531 0,684 0,856 1,057 1,314 1,703 2,052 2,473 2,771 3,69
28 0,127 0,256 0,389 0,53 0,683 0,856 1,056 1,313 1,701 2,048 2,467 2,763 3,674
29 0,127 0,256 0,389 0,53 0,683 0,854 1,055 1,311 1,699 2,045 2,462 2,756 3,659
30 0,127 0,256 0,389 0,53 0,683 0,854 1,055 1,31 1,697 2,042 2,457 2,75 3,646
40 0,126 0,255 0,388 0,529 0,681 0,851 1,05 1,303 1,684 2,021 2,423 2,704 3,551
60 0,126 0,254 0,387 0,527 0,679 0,848 1,046 1,296 1,671 2 2,39 2,66 3,46
120 0,126 0,254 0,386 0,526 0,677 0,845 1,041 1,289 1,658 1,98 2,358 2,617 3,373
∞ 0,126 0,253 0,385 0,524 0,674 0,842 1,036 1,282 1,645 1,96 2,326 2,576 3,291
122
Anexo 2 – Informações obtidas a partir dos espectros de RMN de 1H e de 13C, sub-
espectro DEPT e mapa de contornos HSQC para a isocromofilona VI
Numeração Grupo σc (ppm) σH (ppm) JH (Hz)
1 CH-O 152,63 7,93 -
3 C-O 158,11 - -
4 CH 106,38 6,65 -
4a C 138,67 - -
5 C-Cl 110,81 - -
6 C=O 185,97 - -
7 C-O 84,58 - -
8 C=O 191,78 - -
8a C 114,57 - -
9 CH 115,68 6,08 d, 15,6
10 CH 142,86 7,06 d, 16,0
11 C 131,97 - -
12 CH 148,84 5,70 d, 10,0
13 CH 35,13 2,49 m
14 CH2 30,06 1,37 m
15 CH3 11,94 0,87 t, 5,2; 7,6
16 CH3 20,18 1,01 d, 6,8
17 CH3 12,35 1,85 -
18 CH3 22,53 1,57 -
19 C=O 170,10 - -
20 CH3 20,06 2,17 -
21 CH2 55,5 4,02 t, 4,8; 4,7
22 CH2 60,8 3,92 t, 4,8; 4,8