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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
PROGRAMA DE DOUTORADO EM CIÊNCIAS AMBIENTAIS
AYSHA JUSSARA IVONILDE CARRIM
PRODUÇÃO E AVALIAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA,
ECOTOXICOLÓGICA E MICROBIOLÓGICA DE BIODIESEL
METÍLICO DE ÓLEO RESIDUAL DE FRITURA (ORF)
Orientador Prof. Dr. Nelson Roberto Antoniosi Filho
GOIÂNIA - GOIÁS
2016
221
AYSHA JUSSARA IVONILDE CARRIM
PRODUÇÃO E AVALIAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA,
ECOTOXICOLÓGICA E MICROBIOLÓGICA DE BIODIESEL
METÍLICO DE ÓLEO RESIDUAL DE FRITURA (ORF)
Tese apresentada a Universidade
Federal de Goiás, como parte das
exigências do Programa de Pós-
Graduação em Ciências Ambientais,
para a obtenção do Título de
Doutor.
Orientador Prof. Dr. Nelson Roberto
Antoniosi Filho
GOIÂNIA - GOIÁS
2016
FICHA CATALOGRÁFICA
Carrim, Aysha Jussara Ivonilde. Produção e avaliação físico-química, microbiológica e ecotoxicológica de biodiesel metílico de óleo residual de fritura (ORF) / Aysha Jussara Ivonilde
Carrim,.‐‐ Goiânia: 2016 219 p. Tese (Doutorado em Ciências Ambientais) – Universidade Federal de Goiás, Goiania, 2016. Orientador: Prof. Dr. Nelson Roberto Antoniosi Filho
1. ecotoxicologia. 2. microbiologia. 3. óleo residual de fritura. 4. produção de biodiesel. 5. transesterificação I. Título
CDU: XXX.XXX.X
Observação: A ficha catalográfica deverá ser feita conforme Código Anglo Americano (AACRZ)
e será solicitada a biblioteca após a defesa pública de tese.
220
DEDICATÓRIA
AGRADECIMENTOS
Aos meus Pais, Ivonilde Avila (in memorian) e Ahmed
Carrim (in memorian) por todo apoio, incentivo, amor,
ensinamentos e confiança. Mãe inspiradora, coruja,
amorosa, guerreira que venceu o mundo externo e
interno para me oferecer o melhor, e hoje eu
realizasse meus sonhos.
À minha avó querida e maravilhosa, Laura Ambrozini
Avila (in memorian), segunda mãe que sempre me
apoiou em tudo, carinho sem economia, amor e
demonstração de luta e vontade de viver com alegria,
fé e Deus no coração.
Às minhas filhas, Hayanne Carrim e Laura Carrim,
meus tesouros e motivação constante.
Às pessoas maravilhosas e especiais que permitiram o
término deste trabalho e a maioria das conquistas até
hoje!
Agradecimentos
À Deus, sem o qual nem a vida seria possível.
Ao Mestre Prof. Dr. Nelson Roberto Antoniosi Filho com carinho: Gratidão por
caminhar comigo este tempo todo, apoiando-me, colocando-me sobre seus
ombros, estendendo sua mão e erguendo-me principalmente naqueles dias
que eu menos gostava de viver, ensinando-me sobre as fórmulas mais básicas
até as complexas estratégias para se vencer, não apenas doando seu saber,
seu tempo precioso e disputado, criatividade, perspicácia, mas estimulando,
incentivando e valorizando o que de melhor pode haver em um aprendiz.
Poderia me responder que essa era a sua função, porém foi muito além, me fez
acreditar que vale a pena continuar, me despertando para a ciência, para a
pesquisa e para a vida. Agradeço pela confiança, apoio, amizade, exemplo
como profissional, professor, pesquisador, administrador e pai. Eternamente
grata pela oportunidade, por sua dedicação e orientações!
Ao Prof. Dr. José Daniel Gonçalves Vieira, Profa. Me. Valéria Maitan e Thaís
Maitan Vieira pelo apoio incansável, amizade, orientação e carinho.
Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Ciências Ambientais da
Universidade Federal de Goiás (CIAMB/UFG) pelos ensinamentos e apoio.
Aos professores da banca examinadora (qualificação e final) pelas
contribuições de melhoria desta tese.
Profª Drª Maria Inês Gonçalves Lelis pela convivência, amizade e apoio.
Namastê querida professora!!!
Em especial a Mestre Weine Amorim Azeredo, Mestre Rúbia Pina Luchetti
Camargo e Mestre Lucas Oliveira Gomes por todos os ensinamentos, carinho e
amizade.
Ao amigo Viniciu Fagundes Bárbara de todas as horas de alegrias e angústias,
meus sinceros agradecimentos, respeito e admiração.
Aos amigos (as) do LAMES/UFG: Adrielle Pereira Lourenço, Aldo Muro Júnior,
Aline Terra Sores, Cárita Lorenzo Santos Souza, Carolina Guimarães, Carolina
Porto Prados, Dayane Cristina da Costa, Sr. Domingos, Elieser Viégas Wendt,
Emmanuel Bezerra D‟Alesssandro, Engy Shokry Abdelsamie Shokry, Hebert
Felipe do N. Ribeiro, Ingryd Cristina de Oliveira, Jair Gonzales Marques Junior,
Julião Pereira - Raca, Kelly da Silva Bezerra, Layon da Fonseca Rodrigues,
Leonardo Alves C. Rodrigues, Lilian Ribeiro Batista, Lucas Oliveira Gomes,
Maíra Gabriela de Mendonça, Marcela Flávia Teixeira, Marlene dos Santos
Silva de Almeida, Marcos Alexandro Abreu e Silva, Maria Isabel Ribeiro Alves,
Maria Inês Gonçalves Leles, Marithizia Gonçaves Vieira, Natalia, Patrícia
Rodrigues Fernandes Metri, Nicolas Blasquez Trigo, Pedro Ivo Brandão Melo e
Franco, Rafael Silva Menezes, Roger Pereira Alves, Tatiana de Oliveira Zuppa
Neto, Willian Pereira Nonato, Yudi Magaly Córdoba Garcés, que tornaram
possível esse sonho, pelo carinho, apoio, ensinamentos, momentos de alegria
e colo naqueles mais difíceis.
Aos amigos (as) do LAMAB/UFG: Anna Paula Santos Almeida Rotta, Ariana
Alves Rodrigues, Aristides Barbosa, Bruno Franchesco Rodrigues de Oliveira,
Cláudia Castelo Branco Artiaga Kobayashi, Igor Daniel Alves Ribeiro, Profª Drª
Lara Stefânia Netto de Oliveira Leão, Leda Maria Valadão, Lia Costa Pinto
Wetzel, Marcus Vinícius Forzani de Araújo, Petain José Ferreira Neto, Raylane
Gomes, Renan Souza Soares, Thaís Maitan Vieira e Vera Lúcia da Penha, que
também ajudaram este sonho se realizar e pelos momentos maravilhosos que
passamos dentro e fora do laboratório.
À Profa. Maria Gizelda de Oliveira Tavares e Habdias de Araújo Silva e Neto
pelo apoio estrutural e ensinamentos valiosos.
Aos amigos da Tecnologia de Alimentos/UFG Anna Paula Santos Marques e
Deivis Carvalho por cederem gentilmente o padrão de curcumina, amizade e a
paciência de sempre, ao Prof. Dr. Robson Maia Geraldine pelo apoio e
incentivo durante o desenvolvimento desta pesquisa.
Ao Professor Me. Carlos Rafael Dufrayer e Lunice Dufrayer pelo apoio e
amizade, além de colaborarem incessantemente na finalização deste sonho.
À minha família maravilhosa, pela paciência, compreensão, incentivo, apoio
durante todo o tempo.
A todos os amigos e amigas que de alguma forma, com orações, carinho,
incentivo, apoiaram e me fortaleceram em todos os momentos.
Aos órgãos de apoio CNPq, CAPES, MCT, FUNAPE, UFG, pela infraestrutura
e suporte financeiro.
“Se vi mais longe foi por estar de pé sobre ombros de gigantes." (1676)
Isaac Newton (1643-1727)
RESUMO
Dentre os biocombustíveis, o biodiesel tem se destacado por ser produzido a
partir de fontes renováveis e grande variedade de matérias-primas graxas, tais
como de origem vegetal e animal, incluindo resíduos e passivos ambientais. Na
intenção de diminuir os custos do biodiesel, o mercado tem buscado utilizar
óleos e gorduras residuais (OGR), em especial óleos residuais de fritura (ORF),
como matéria-prima graxa de baixo custo. Assim, este trabalho visa conhecer
os aspectos da produção química e de segurança ecotoxicológica e
microbiológica do biodiesel de ORF. Em relação à produção de biodiesel de
ORF, observou-se que sua qualidade físico-química encontra-se adequada
para a maioria dos parâmetros analisados, tais como teor de éster, de mono-,
di- e triacilglicerídos, entretanto, parâmetros como viscosidade, índice de
acidez, teor de água e estabilidade oxidativa foram negativamente afetados.
Para melhorar a estabilidade oxidativa foram testados antioxidantes naturais,
dos quais o L-triptofano e a curcumina proporcionaram período de indução
acima de 8 horas, atuando sinergisticamente na elevação da estabilidade
oxidativa por até 30 horas. No que se refere à toxicidade do biodiesel
produzido, o organismo-teste utilizado, Artemia salina, indicou baixa toxicidade
para esse biocombustível em ambientes aquáticos salinos e salobros. Em
relação à qualidade microbiológica, foi isolada uma bactéria identificada como
Bacillus licheniformis, a qual foi capaz de produzir biossurfactante(s) e
degradar tanto o biodiesel, quanto o óleo de soja e derivados de petróleo.
Assim, o biodiesel de óleo de fritura possui baixa toxicidade em ambientes
salino e salobro e tende ser mais facilmente degradado por ação
microbiológica, o que é positivo do ponto de vista ambiental, mas negativo do
ponto de vista do armazenamento, e necessita ser misturado a outras amostras
de biodiesel de melhor qualidade para gerar um biodiesel comercial que
apresente especificações dentro do estabelecido na legislação.
Palavras-chave: ecotoxicologia, microbiologia, óleo residual de fritura,
produção de biodiesel, transesterificação.
ABSTRACT
Biodiesel has been highlighted among biofuels for producing from renewable
sources and a wide variety of grease raw materials such as plant and animal
origins, including residue and environmental liabilities. Seeking to decrease the
costs of biodiesel, the market has been using residual oils and fats, especially
frying residual oils, as low-cost grease raw material. Therefore, the objective of
this study is to understand the aspects of chemical production as well as the
ecotoxicological and microbiological safety of FRO biodiesel. We observed that
the physical, chemical quality of the FRO biodiesel production is adequate to
most of the parameters analyzed, such as content of ester, mono-, di- and tri-
acylglycerides; however, parameters such as viscosity, acidity index, water con-
tent, and oxidative stability had negative effects. In order to improve the oxida-
tive stability, we tested a few natural antioxidants among which L-tryptophan
and curcumin provided an induction period of over eight hours, acting synergis-
tically on an oxidative stability increase until 30 hours. Regarding the toxicity of
the biodiesel produced, the test organism employed, Artemia salina, indicated
low toxicity for the biofuel in saline and brackish aquatic environments. For the
microbiological quality, we isolated a bacteria identified as Bacillus licheniform-
is, which was able to produce biosurfactant (s) and degrade both biodiesel and
soil oil as well as oil by-products. Thus, frying oil biodiesel has low toxicity in
saline and brackish environments tending to be more easily degraded by a mi-
crobiological action, which is positive from the environmental point of view, but
negative for storage, requiring mixture with other better quality biodiesel sam-
ples to generate commercial biodiesel with specifications that meet the legisla-
tion.
KEYWORDS: ecotoxicology, microbiology, waste oil frying, biodiesel
production, transesterification.
i
Lista de Figuras
Figura 0.1. Consumo mundial de energia comercializada de 1990 a 2030, por
tipo de combustível. ......................................................................................... 15
Figura 0.2. Diagrama da produção catalítica de biodiesel. ............................... 16
Figura 0.3. Etapas reacionais envolvidas na transesterificação de
triacilglicerídeos. ............................................................................................... 17
Figura 0.4. Evolução da produção do biodiesel (B100) no Brasil, de 2005 a
2015. ................................................................................................................ 18
Figura 0.5. Matérias-primas usadas na produção de biodiesel no Brasil. ........ 20
Figura 1.1. Número de publicações distribuídos de acordo com o ano de
publicação. ....................................................................................................... 39
Figura 1.2. Número de publicações distribuídos de acordo com o ano de
publicação e pelos cinco compartimentos. ....................................................... 39
Figura 1.3. Total de publicações de acordo com os compartimentos. .............. 40
Figura 2.1. Itens publicados por ano para os termos Biodiesel (como tíulo) e
Bacteria (como tópico). .................................................................................... 83
Figura 2.2. Itens publicados por ano para os termos Biodiesel (como título) e
Fungi (como tópico). ......................................................................................... 84
Figura 3.1. Cromatograma dos eluatos salinos em DMSO para o biodiesel
(B100) de ORF (A) e de OSR (B) obtido por HPLC-UV/DAD a 235 nm. ........ 127
Figura 3.2. Cromatograma dos eluatos salinos em DMSO para o biodiesel
(B100) de ORF (C) e de OSR (D) obtido por HPLC-UV/DAD a 270 nm. ....... 128
Figura 4.1. Mecanismo de auto-oxidação dos lipídeos. ................................. 139
Figura 4.2. Estruturas químicas da cafeína, da curcumina e do L-triptofano. 145
Figura 5.1. Imagem no MEV de Bacillus licheniformis (x5000). ..................... 178
Figura 5.2. Curva do monitoramento do pH x tempo (dias) de Bacillus
licheniformis na presença de glucose e glicerol (10 g/L), em meio mínimo. .. 180
Figura 5.3. Crescimento microbiano (abs) x tempo (dias) do Bacillus
licheniformis na presença de glucose e glicerol (10 g/L) em meio mínimo. ... 181
Figura 5.4. Gráfico do consumo de glucose (g/L) x tempo (horas) de Bacillus
licheniformis em meio mínimo contendo glucose a 10 g/L. ............................ 181
ii
Figura 5.5. Gráfico do consumo de glicerol (g/L) x tempo (horas) de Bacillus
licheniformis em meio mínimo contendo glicerol a 10 g/L. ............................. 182
Figura 5.6. Espectro de massas para a mistura de substâncias que reduzem a
tensão superficial, produzidas por Bacillus licheniformis em meio de cultivo
glicerol. ........................................................................................................... 186
Figura 5.7. Espectro de massas para a mistura de substâncias que reduzem a
tensão superficial, produzidas por Bacillus licheniformis em meio de cultivo
glucose. .......................................................................................................... 187
iii
Lista de Tabelas
Tabela 2.1. Descritores suas combinações para cada pesquisa sobre
publicações no Web of Knowledge. ................................................................. 82
Tabela 2.2. Número total de publicações para cada parâmetro de busca no
Web of Knowledge. .......................................................................................... 85
Tabela 3.1 - Preparo das misturas entre DMSO, combustíveis e solução salina.
....................................................................................................................... 121
Tabela 3.2. Características físico-químicas das amostras de biodiesel. ........ 123
Tabela 3.3. Preparo das misturas entre DMSO, combustíveis e solução salina
na DL50. .......................................................................................................... 126
Tabela 4.1. Eficiência relativa de antioxidantes sintéticos para diferentes
biodieseis. ...................................................................................................... 140
Tabela 4.2.Características físico-químicas das amostras de biodiesel. ......... 148
Tabela 4.3.Tempo de indução para o biodiesel de ORF aditivado ou não com
curcumina, em função do tempo após a adição do antioxidante. ................... 150
Tabela 4.4.Tempo de indução para o biodiesel de ORF aditivado ou não com L-
triptofano, em função do tempo após a adição do antioxidante. .................... 152
Tabela 4.5. Percentual de aumento do período de indução para o biodiesel de
ORF aditivado com curcumina e L-triptofano com relação a estabilidade
oxidativa inicial do biodiesel de ORF (3,81 h), para a concentração nominal de
700 mg/Kg, ao longo do tempo de armazenamento. ...................................... 153
Tabela 4.6. Percentual de aumento da estabilidade oxidativa para biodiesel de
ORF aditivado com curcumina e L-triptofano em relação com o não aditivado,
para a concentração nominal de 700 mg/Kg, ao longo do tempo de
armazenamento. ............................................................................................ 154
Tabela 4.7. Tempo de indução para o biodiesel de ORF aditivado ou não com a
mistura L-triptofano/curcumina, em função do tempo de armazenamento. .... 154
Tabela 5.1. Características físico-químicas das amostras de biodiesel. ........ 177
Tabela 5.2. Identificação molecular dos isolados em biodiesel de ORF. ....... 178
Tabela 5.3. Percentual do índice de emulsificação 24 horas para cultivo de
Bacillus licheniformis em óleo diesel. ............................................................. 184
Tabela 5.4. Degradação de diferentes fontes de carbono utilizando Bacillus
licheniformis incubado a 30°C e com 24 horas de crescimento. .................... 188
iv
Tabela 5.5. Degradação de diferentes fontes de carbono utilizando Bacillus
licheniformis incubado a 30°C e com 48 horas de crescimento. .................... 188
Tabela 5.6. Degradação de diferentes fontes de carbono utilizando Bacillus
licheniformis incubado a 30°C e com 72 horas de crescimento. .................... 189
v
Lista de Abreviações
% Porcentagem
(NH4)2SO4 Sulfato de amônio
°C Grau Celsius
µL Microlitro
µm Micrometro
µmol.m2.s Micromol por metro quadrado por segundo
16S rRNA Ácido ribonucleico ribossomal subunidade 16
2-EHN Nitrato de 2-etilhexila
ABNT Associação Brasileira de Normas Técnicas
ANP Agência Nacional do Petróleo, Gás Natural e
Biocombustíveis
ASTM American Society for Testing and Materials
BEAS Células humanas epiteliais respiratórias transformadas
BHA Butil-hidroxi-anisol
BHI Caldo infuso de cérebro e coração
BHT Butil-hidroxitolueno
BOD Demanda bioquímica de oxigênio
BTEX Benzeno, tolueno, etilbenzeno, xilenos
BX Mistura de biodiesel com óleo diesel
CAPES Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
Superior
CAT Catalase
Célula T Linfócito T
CETESB/SP Companhia Ambiental do Estado de São Paulo
cm Centímetro
CMIT 5-Cloro-2-metil-4-isotiazolina-3-ona
CN Caldo nutriente
CNPE Conselho Nacional de Política Energética
VOC Compostos orgânicos voláteis
COx Óxidos de carbono
ctDNA DNA de célula livre de tumor
vi
D100 Óleo diesel puro
DCPIP 2-6-diclorofenol indofenol
DHAP Fosfato dihidroxiacetona
DL50 Dose letal mediana
DMSO Dimetilsulfóxido
DNA Ácido desoxirribonucleico (ADN)
EMS Espectrometria de massas por eletrospray
EN Norma europeia
EROD Etóxiresorufina-O-dietilase
ESI Electrospray
FAEE Ésteres etílicos de ácidos graxos
FAME Ésteres metílicos de ácidos graxos
FSA Fração Solúvel em Água
G Grama
g/L Grama por litro
G3P Gliceraldeído-3-fosfato
GA Ácido gálico
GC Cromatografia Gasosa
G-CSF Fator estimulador de colônias granulocitárias
GlcNAc N-acetilglucosamina
GPx Glutationa peroxidase
GSH Glutationa reduzida
GST Glutationa S-transferase
H Hora
HepG2 Células hepáticas
PAH ou PAH Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos
HPLC/ UPLC Cromatografia líquida de alto/ultra desempenho
HUVEC Célula endotelial de artéria e veia humana
HVO Óleo vegetal hidrotratado
Hz Hertz
ICAM-1 Molécula intercelular de adesão 1
IE5, IE24, IE96 Índice de emulsificação em 5 minutos, 24 e 96 horas
IL Interleucina
vii
IEO Índice de estabilidade oxidativa
IP-10 Interferon-gama e proteína 10
JME Biodiesel metílico de Jatropha
K2HPO4 Fosfato de potássio dibásico
Kb Kilobase
Kg Quilograma
KNO3 Nitrato de potássio
KOH Hidróxido de potássio
L Litro
Lag Fase de adaptação do crescimento microbiano
LC-DAD Cromatografia líquido com detector de arranjo de diodos
LDH Lactato desidrogenase
LII Límpido e isento de impurezas
LOQ Limite de quantificação
m/v Massa/volume
m/z Razão massa/carga
MBO 3,3‟metileno-bis (5-metiloxazolidina)
MCT Ministério da Ciência e Tecnologia
MDA Malondialdeído
MEOR Recuperação de óleo melhorada por micro-organismos
MEV Microscopia Eletrônica de Varredura
Mg Miligrama
MgSO4.7H2O Sulfato de magnésio heptahidratado
Min Minuto
MIT 2-Metilisotiazol-3(2H)-ona
mL Mililitro
Mm Milímetro
mm2/s Milímetro quadrado por segundo
Mmol Milimol
MP Material particulado
mRNA ou mARN Ácido ribonucleico mensageiro
MTT 3-(4,5-dimetiltiazol-2-II)-2,5-difeniltetrazólio
NaCl Cloreto de sódio
viii
NCBI National Center for Biotechnology Information
NH4H2PO4 Fosfato de amônio monobásico
NHBE Células epiteliais brônquicas humanas
NIR Espectroscopia por infravermelho próximo
Nm Nanômetro
NO2- Nitrito
NO3- Nitrato
NxOy/ NOx Óxidos de nitrogênio
OECD Organization for Economic Co-operation and Development
OFS Óleo de fritura de soja
OGR Óleos e gorduras residuais
OM Óleo de mamona
OP Óleo de palma
ORF Óleo Residual de Fritura
OSR Óleo de soja refinado
p.a. Para análise
PCR Reação em cadeia da polimerase
PEAD Polietileno de Alta Densidade
PG Galato de propila
PGE2 Prostaglandina E2
pH Potencial hidrogeniônico
Ppm Partes por milhão
PROBIODIESEL Programa Brasileiro de Biodiesel
Psi Libra-força por polegada quadrada
PY Pirogalol
RME Biodiesel metílico de canola (colza)
ROS Espécies reativas de oxigênio
Rpm Rotação por minuto
S Segundo
S10 Óleo Diesel com 10 ppm de enxofre
S500 Óleo Diesel com 500 ppm de enxofre
DAS Sabouraud Dextrose Agar
SOD Superóxido dismutase
ix
SOx Óxidos de enxofre
Sp Espécie
TAG Triacilgliceróis
TBHQ Terc-butil hidroquinona
THP Célula de linhagem de monócito humana
TNF-α Fator de necrose tumoral
TSA Triptona soja agar
ULSD Diesel com ultra baixo teor de enxofre
UV Ultravioleta
UV-Vis Ultravioleta-visível
v/v Volume/volume
VCAM-1 Célula de adesão vascular M-1
WKY Wistar-Kyoto
Μmol Micromol
x
Sumário
Lista de Figuras ................................................................................................... i
Lista de Tabelas ................................................................................................. iii
Lista de Abreviações .......................................................................................... v
1.Introdução ................................................................................................. 14
1.1 Aspectos gerais sobre biodiesel ...................................................... 14
1.2 O biodiesel como energia renovável alternativa .................................. 14
1.3 Tipos de reações para produção de biodiesel ..................................... 17
1.4 Uso de biodiesel no Brasil ................................................................... 18
1.5 Matérias-primas para produção de biodiesel ....................................... 19
1.6 Produção de biodiesel a partir de óleos de fritura ................................ 20
1.7 Alguns desafios para a qualidade do biodiesel .................................... 21
2. Objetivos ................................................................................................... 23
2.1 Objetivo Geral ...................................................................................... 23
2.2 Objetivos Específicos........................................................................... 24
3. Estrutura da tese ...................................................................................... 24
4. Referências Bibliográficas ...................................................................... 26
Capítulo 1 – Efeitos ecotoxicológicos do Biodiesel: Uma revisão .................... 32
RESUMO ...................................................................................................... 32
ABSTRACT ................................................................................................... 33
1. Introdução .............................................................................................. 34
2. Metodologia ............................................................................................ 37
3. Resultados e Discussão ......................................................................... 38
3.1. Compartimento atmosférico ................................................................ 40
3.2. Compartimento hídrico ........................................................................ 50
3.3. Compartimento solo ............................................................................ 55
3.4. Toxicidade oral ................................................................................... 57
3.5. Outros testes de toxicidade para biodiesel ......................................... 59
4. Conclusões ............................................................................................. 60
5. Referências Bibliográficas ...................................................................... 62
Capítulo 2 – Aspectos microbiológicos do biodiesel: uma revisão ................... 79
RESUMO ...................................................................................................... 79
ABSTRACT ................................................................................................... 80
xi
1. Introdução .............................................................................................. 81
2. Metodologia ............................................................................................ 81
3. Resultados e discussão .......................................................................... 82
3.1. Revisão da literatura ........................................................................... 86
3.1.1. Uso de micro-organismos na produção de biodiesel .................... 86
3.1.2. Degradação microbiológica de biodiesel ...................................... 90
3.1.3. Biorremediação ............................................................................ 93
4. Conclusões ............................................................................................... 98
5. Referências Bibliográficas ....................................................................... 100
Capítulo 3 - Estudo da toxicidade aguda de biodiesel e suas misturas com óleo
diesel frente a Artemia salina ......................................................................... 111
RESUMO .................................................................................................... 111
ABSTRACT ................................................................................................. 112
1. Introdução ............................................................................................... 113
2. Experimental ........................................................................................... 117
2.1 Amostragem ...................................................................................... 117
2.2 Produção das amostras de biodiesel metílico de ORF ...................... 117
2.3 Ensaios ecotoxicológicos ................................................................... 118
2.3.1 Preparo do eluato ........................................................................ 119
2.3.2 Análise cromatográfica do eluato ................................................ 120
2.3.3 Cultivo dos náuplios de Artemia salina ........................................ 120
2.3.4 Teste ecotoxicológico com Artemia salina ................................... 121
2.3.5 Cálculo da taxa de mortalidade de Artemia salina ....................... 122
3. Resultados e discussão .......................................................................... 122
4. Conclusão ............................................................................................... 129
5. Referências Bibliográficas ....................................................................... 129
Capítulo 4 - Avaliação de alguns produtos naturais como antioxidantes para
biodiesel metílico de óleos de fritura .............................................................. 136
RESUMO .................................................................................................... 136
ABSTRACT ................................................................................................. 137
1. Introdução ............................................................................................... 138
2. Experimental ........................................................................................... 146
2.1 Amostragem ...................................................................................... 146
2.2 Produção de biodiesel metílico de ORF............................................. 146
xii
2.3 Avaliação da estabilidade oxidativa ................................................... 147
3. Resultados e discussão .......................................................................... 148
4. Conclusões ............................................................................................. 155
5. Referências Bibliográficas ....................................................................... 156
Capítulo 5 - Produção de biossurfactante e biodegradação por micro-
organismos isolados de biodiesel metílico de óleo de fritura ......................... 162
RESUMO .................................................................................................... 162
ABSTRACT ................................................................................................. 163
1. Introdução ............................................................................................... 164
2. Experimental ........................................................................................... 169
2.1 Amostragem ...................................................................................... 169
2.2 Produção de biodiesel metílico de ORF............................................. 169
2.3 Isolamento de micro-organismos ...................................................... 170
2.4 Identificação dos micro-organismos isolados .................................... 170
2.5 Identificação molecular do micro-organismo ...................................... 171
2.5.1 Extração do DNA total e amplificação da região que codifica 16S
rDNA ..................................................................................................... 171
2.5.2 Purificação do produto de PCR e sequenciamento ..................... 172
2.6 Seleção preliminar para produção de biossurfactante pelo teste da
atividade hemolítica ................................................................................. 172
2.7 Determinação da curva de crescimento microbiano e do pH ............. 173
2.8 Quantificação do consumo de glucose e glicerol em meio mineral ... 173
2.9 Produção de biossurfactante ............................................................. 173
2.9.1 Teste do colapso da gota ............................................................ 174
2.9.2 Índice de emulsificação (IE5 e IE24) ........................................... 174
2.9.3 Caracterização de biosurfactantes por ESI-MS ........................... 175
2.10. Capacidade de degradação de derivados de petróleo e biodiesel . 175
3. Resultados e discussão .......................................................................... 175
3.1 Identificação do micro-organismo ...................................................... 178
3.2 Seleção preliminar para produção de biossurfactante pelo teste da
atividade hemolítica ................................................................................. 179
3.3 Determinação da curva de crescimento microbiano e do pH ............. 179
3.4 Quantificação do consumo de glucose e glicerol em meio de
mineral.......................................................................................................181
xiii
3.5 Teste do colapso da gota ................................................................... 183
3.6 Índice de emulsificação (IE5 e IE24).................................................. 183
3.7 Caracterização dos biosurfactantes produzidos por Bacillus
licheniformis ............................................................................................. 184
3.8 Capacidade de degradação de derivados de petróleo e biodiesel .... 188
4. Conclusões ............................................................................................. 190
5. Referências Bibliográficas ....................................................................... 191
CONCLUSÕES GERAIS ................................................................................ 203
ANEXO I ......................................................................................................... 205
14
1. Introdução
1.1 Aspectos gerais sobre biodiesel
Por definição, biodiesel é uma mistura de ésteres alquílicos de ácidos
graxos, normalmente derivado da reação entre matérias-primas graxas, tais
como óleos e gorduras vegetais ou animais, metanol e/ou etanol (ANP, 2014).
Sendo utilizado como biocombustível misturado ao óleo diesel, em blendas
denominadas de BX, com X sendo o percentual volumétrico de biodiesel no
óleo diesel (por exemplo, B2, B5, B7, B20...), ou na sua forma pura e
comumente denominada B100.
O crescente interesse sobre biodiesel advém da gradativa necessidade
de diversificar e ampliar as fontes de energia especialmente aquelas derivadas
de biomassa, pelo fato dessas serem renováveis e de menor impacto
ambiental.
1.2 O biodiesel como energia renovável alternativa
O uso de fontes de energia renováveis e não renováveis tornou-se ponto
de discussão na comunidade científica e econômica mundial. Recentes
discussões sobre o assunto como, por exemplo, na Conferência das Nações
Unidas sobre Desenvolvimento Sustentável (CNUDS / Rio+20), que incluiu o
uso de energias renováveis entre seus objetivos focais (UN, 2012).
Também é assinalado, entre as conclusões sobre as estratégias futuras
para a sustentabilidade energética e ambiental, a necessidade da redução da
dependência dos combustíveis fósseis e o investimento em novas tecnologias
para a produção de energias renováveis (UN, 2012).
Vale observar que a energia tem um papel-chave e pode definir o
sucesso ou fracasso das iniciativas direcionadas a um futuro sustentável,
inclusive na questão do aquecimento global e catástrofes climáticas (GEA,
2012). Apesar do petróleo, do carvão e do gás natural serem as principais
fontes de energia usadas no mundo, o uso de fontes renováveis de energia
ultrapassou o uso da energia nuclear. Estima-se que seu uso deve aumentar
nos próximos anos (Figura 0.1), sendo que o Brasil já se destaca mundialmente
15
na produção de energias renováveis, como a hidroeletricidade e a biomassa,
nas formas de etanol e biodiesel.
Figura 0.1. Consumo mundial de energia comercializada de 1990 a 2030, por
tipo de combustível.
Fonte: ANP (2015a).
Entretanto, apenas 10% da biomassa produzida no mundo é utilizada na
produção de biocombustíveis, somando 90% da contribuição total de fontes
renováveis de energia no mundo (REN21, 2015).
A biomassa rica em lipídeos é utilizada para a produção de biodiesel e
bioquerosene e a biomassa rica em carboidratos é normalmente convertida em
etanol. O lixo orgânico e outros resíduos do uso de biomassa podem ser
pirolisados e convertidos em energia térmica.
A demanda mundial de energia aumenta rapidamente (Figura 1),
causando o uso crescente ainda dos combustíveis fósseis. Entretanto, devido à
diminuição das reservas e ao aumento rápido de preços destes combustíveis,
futuramente os combustíveis renováveis poderão vir a substituí-los (Dwivedi &
Sharma, 2014).
Outro problema associado à utilização de combustíveis fósseis é a
grande emissão de poluentes como hidrocarbonetos, óxidos de carbono (COx),
de nitrogênio (NxOy) e de enxofre (SOx), aumentando a pressão para a
16
necessidade de se buscar combustíveis alternativos mais limpos (Shahid &
Jamal, 2008).
A política energética brasileira busca facilitar a introdução de
biocombustíveis como produtos economicamente viáveis, incluindo o biodiesel,
aproveitando a vantagem tributária e os subsídios. Assim, o mercado de
biocombustíveis está crescendo no Brasil com novas indústrias produtoras de
óleos vegetais assumindo a conversão industrial de biomassa graxa em
biodiesel (Bart et al, 2010; Vyas et al, 2010) por meio principalmente de
processos químicos que envolvem reações de esterificação e/ou
transesterificação (Figura 0.2).
Figura 0.2. Diagrama da produção catalítica de biodiesel.
Fonte: Adaptado de Balat & Balat (2008).
De acordo com a Lei N° 11.097 de 13 de janeiro de 2005, biodiesel é
definido como um “biocombustível derivado de biomassa renovável para uso
em motores a combustão interna com ignição por compressão ou, conforme
regulamento, para geração de outro tipo de energia, que possa substituir
parcial ou totalmente combustível de origem fóssil" (ANP, 2005).
Sob o ponto de vista químico, conforme dito anteriormente, o biodiesel é
um combustível derivado da reação de matérias-primas graxas com álcoois
como metanol ou etanol, o que gera ésteres metílicos ou etílicos de ácidos
graxos, chamados respectivamente de FAME e FAEE (do inglês Fatty Acid
Methyl Esters e Fatty Acid Ethyl Esters) (Andrade et al, 2011). Por apresentar
17
características físico-químicas similares ao óleo diesel, e tido como um
sucedâneo ao diesel, sendo assim utilizado em adição ou em substituição a
este combustível fóssil, com vantagens de ser produzido a partir de uma gama
de matérias-primas renováveis ou residuais, além do menor impacto ambiental.
1.3 Tipos de reações para produção de biodiesel
A principal reação de conversão de uma matéria-prima graxa em
biodiesel é a transesterificação, a qual quimicamente corresponde a conversão
de um éster, no caso um acilglicerídeo, em outro éster, neste caso um éster
metílico ou etílico de ácido graxo.
Em outras palavras envolve a reação entre os triacilglicerídeos e álcool,
na presença ou não de um catalisador, gerando ésteres alquílicos de ácidos
graxos e glicerol (Figura 0.3).
Figura 0.3. Etapas reacionais envolvidas na transesterificação de
triacilglicerídeos.
Fonte: Meneghetti et al. (2013).
Como vantagens deste processo cita-se o alto rendimento de conversão,
a alta velocidade de reação, a produção de um coproduto de alto interesse
comercial - o glicerol - e o baixo custo dos álcoois e catalisadores usados como
reagentes. Dentre os catalisadores homogêneos podem ser utilizados o ácido
sulfúrico, o hidróxido de sódio ou de potássio; como catalisadores
heterogêneos algumas das opções são zirconia sulfatada, óxido de magnésio,
óxido de cálcio, entre outros. Há também a possibilidade de uso de processos
18
biocatalíticos, nos quais são utilizadas enzimas, tais como as lipases. No
tocante às técnicas não convencionais essas se baseiam no uso de ultrassom,
microondas e fluídos supercríticos (Andrade et al, 2011).
1.4 Uso de biodiesel no Brasil
Embora ainda represente 80% a participação de fontes de carbono fóssil
na matriz energética brasileira (Biodieselbr, 2014), há necessidade da
exploração mais sustentável dos recursos naturais, utilizando as fontes
renováveis de energia.
Neste contexto, a Portaria n° 720, de 30 de outubro de 2002, através do
Ministério da Ciência e Tecnologia – MCT, implementada através do Programa
Brasileiro de Biodiesel – PROBIODIESEL, reforça a importância da produção
do biodiesel em detrimento da elevação dos preços do óleo diesel e sua
importação (Brasil, Conab, 2011).
A comercialização do biodiesel no país desde a publicação da Medida
Provisória 214, que foi convertida na Lei 11.097/2005 de 13/01/2005, só tem
crescido conforme observado na Figura 0.4.
Figura 0.4. Evolução da produção do biodiesel (B100) no Brasil, de 2005 a
2015.
Fonte: Adaptado de ANP (2016).
0 0,07
0,4
1,17
1,61
2,39 2,67 2,72
2,92
3,42
3,94
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015
bilh
õe
s d
e lit
ros
EVOLUÇÃO DA PRODUÇÃO DE BIODIESEL (B100) - 2005-2015
19
Atualmente, são adicionados obrigatoriamente 7% (mistura B7) de
biodiesel ao óleo diesel comercializado a qualquer consumidor, em todo o
território nacional. Com a nova legislação, contados a partir de março de 2016,
a mistura obrigatória passará para 8% (B8) em até 12 meses; 9% (B9) em até
dois anos, e 10% (B10) no período de três anos. A lei 13.263 ainda autoriza o
Conselho Nacional de Política Energética (CNPE) a elevar a mistura obrigatória
para até 15%, mediante a realização de testes em motores a diesel (BRASIL,
2016), evidenciando assim a necessidade de realização de pesquisas sobre
novas matérias-graxas para atender esta produção.
Segundo dados oficiais, as matérias-primas utilizadas para a produção
de biodiesel no país são principalmente o óleo de soja (69,6% do total) e o
sebo bovino (14,7%) (BRASIL, MME-EPE, 2013). Pelo fato da soja ser uma
commodity, seu preço é regulado pelo mercado externo, o que pode
comprometer o futuro de Programa Nacional de Produção e Uso de Biodiesel.
Assim, espera-se que o aumento gradativo na produção e consumo de
biodiesel venha a ser atendido com a disponibilidade de outros materiais
graxos, tanto de origem vegetal (comestível ou não), animal, bem como pelo
uso de biomassas residuais (Hill et al., 2006).
1.5 Matérias-primas para produção de biodiesel
No Brasil, conforme já mencionado, as matérias-primas mais utilizadas
para a produção de biodiesel são o óleo de soja, a gordura animal, bem como o
óleo de algodão e outros materiais graxos (Figura 0.5) (ANP, 2015b).
Cada matéria-prima gera biodiesel de diferentes composições químicas,
as quais respondem diretamente às características inerentes de cada fonte de
matéria graxa. Assim, uma das mais importantes características do biodiesel é
a composição de ésteres metílicos de ácidos graxos, determinada pela
composição dos ácidos graxos no material bruto utilizado na produção (Knothe,
2010).
20
Figura 0.5. Matérias-primas usadas na produção de biodiesel no Brasil.
Fonte: ANP (2015b).
Aproximadamente 95% do biodiesel produzido mundialmente utilizam
óleos vegetais comestíveis refinados como matérias-primas graxas. Há
também vários estudos tentanto viabilizar outras fontes alternativas de lipídeos
para uso na produção de biodiesel, tais como as microalgas (Ahmad et al.,
2011).
Dentre as matérias-primas alternativas destacam-se os óleos e gorduras
residuais (OGR) e em especial os óleos residuais de fritura (ORF).
1.6 Produção de biodiesel a partir de óleos de fritura
Óleos e gorduras residuais (OGR) englobam principalmente os óleos
comestíveis após processo de fritura de alimentos (ORF), que normalmente
alcança até 190°C, bem como os óleos oriundos dos esgotos sanitários
(doméstico ou industrial). Este tipo de matéria-prima pode ser destinada para a
formulação de tinta de impressão (Montenegro et al., 2013), de farinha básica
para ração animal, de massa de vidraceiro, sabão, glicerina, geração de
energia elétrica através da queima em caldeira, biodiesel (Reis et al., 2007),
óleo lubrificante ou fluido hidráulico (Pinzi et al., 2014), porém ainda uma
grande parte deste volume é descartado diretamente no esgoto ou como lixo
orgânico, provocando poluição de solos e aquíferos (São Paulo, 2007).
De uma forma geral são vários os problemas observados a partir do
descarte de ORF de maneira inadequada, tais como: custo elevado para tratar
21
o esgoto, poluição dos corpos hídricos e impermeabilização de leitos de rios, o
que pode acentuar enchentes recorrentes, além da obstrução dos
encanamentos (Santos, 2012).
Em relação à quantidade de óleos despejados em um corpo hídrico e ao
alcance de poluição cabe ressaltar que existem relatos da capacidade de um
litro de óleo graxo poluir cerca de 25 mil litros de água, onerando o sistema de
tratamento de esgotos numa faixa que pode variar de 45% a 100%, em função
do acúmulo desta substância pouco hidrossolúvel e que leva a obstrução da
rede e de galerias pluviais (São Paulo, 2007).
Por outro lado, a reciclagem de ORF pode ser bastante interessante,
uma vez que o uso do óleo de fritura como matéria-prima na produção de
biodiesel é de interesse para muitos produtores de biodiesel em função dos
preços mais baixos deste passivo ambiental, quando comparado com o óleo
graxo refinado, apesar dos problemas associados à logística e da necessidade
de um pré-tratamento do ORF antes da transesterificação alcalina (Issariyakul
& Dalai, 2014).
1.7 Alguns desafios para a qualidade do biodiesel
Independentemente da matéria-prima utilizada para a produção do
biodiesel, é importante que as especificações preconizadas por diretrizes como
as dadas pelas normas ASTM D6751 e EN 14214, bem como as Resoluções
da ANP, sejam atendidas, embora alguns parâmetros sejam afetados
independentemente da matéria-prima usada (Knothe, 2010).
As propriedades do biodiesel podem ser afetadas por diversos fatores
que incluem a tendência a oxidação, decomposição térmica, facilidade para
absorção de água, biodegradação por crescimento microbiano, exposição ao
sol ou foto-oxidação, contaminação por metais, presença ou ausência de
aditivos, entre outros fatores (Jakeria et al., 2014).
De acordo com Stombaugh et al. (2006) o biodiesel é mais suscetível à
contaminação por água do que o diesel de petróleo. A presença de água livre
no biodiesel ou em qualquer combustível pode ocasionar processos de
corrosão no sistema que entra em contato com o mesmo podendo favorer o
22
crescimento de micro-organismos deteriogênicos, dentre outros processo
degenerativos.
Além disso, ainda se observam alterações na qualidade do biodiesel ao
longo do tempo de estocagem e armazenado. O biodiesel armazenado tende a
sofrer oxidação e mudanças em outras propriedades físicas (aumento da
viscosidade, formação de resíduos ou gomas), químicas (elevação dos índices
de acidez e de peróxidos, diminuição do índice de iodo e do teor de ésteres) e
microbiológicas (biodeterioração), alteração as características dos materiais
que ficam em contato com o biodiesel e a formação de resíduos e gomas.
Quando comparado com o diesel convencional derivado de óleo cru, os
óleos e gorduras vegetais ou animais tem viscosidade mais alta (o que significa
que dificultam o bombeamento e a estocagem sem aquecimento) e são mais
instáveis (o que significa que são mais suscetíveis as degradações durante o
seu armazenamento, manuseio e uso final). Nestas circunstâncias estes
fenômenos devem ser considerados para contribuir na tecnologia de produção
e distribuição do biodiesel (He et al., 2007; Zuleta et al., 2012).
No caso do biodiesel produzido a partir de óleo de fritura estas
alterações não são diferentes, embora alguns pesquisadores afirmem que o
óleo de fritura pode apresentar alto conteúdo de ácidos graxos livres, o que
pode ser reduzido através da catálise ácida. A menor presença de compostos
insaturados, parcialmente degradados termicamente pela fritura, favorece uma
boa estabilidade oxidativa, porém apresenta diminuição das propriedades
relacionadas ao ponto de entupimento de filtro a frio, o contrário do que ocorre
com a presença de compostos insaturados.
Entretanto, tem-se observado que a estabilidade oxidativa pode diminuir
com o decorrer do tempo; característica esta que poderia ser melhorada com o
uso de aditivos antioxidantes naturais, tais como tocoferóis, esteróides e
tocotrienóis, ou antioxidante sintéticos, como os de composição fenólica ou
aminíca (Sharma et al., 2008).
De acordo com Knothe (2000) alguns fatores podem favorecer o
processo de oxidação de cadeias dos ácidos graxos presentes no biodiesel,
notadamente naqueles ricos em insaturações. Se trata de um processo
complexo que pode ser acelerado pela presença de oxigênio, luz, calor, metais
e peróxidos (presentes no início da oxidação), resultando na formação de
23
hidroperóxidos e afetando a estabilidade oxidativa do biodiesel, medida através
da determinação do índice de estabilidade oxidativa (IEO) também conhecido
como período de indução (IP) (Sharma et al., 2008).
Outra metodologia utilizada para acompanhar este processo é a
determinação do índice de peróxidos (Knothe, 2000), porém o processo
oxidativo pode ser monitorado por outras metodologias analíticas tidas com
mais precisas e rápidas, tais como a cromatografia gasosa (GC), a
cromatografia líquida de alta ou de ultra eficiência (HPLC ou UPLC), e a
espectroscopia por infravermelho próximo (NIR), que ainda, entretanto carecem
de validação para a sua aceitação pelo mercado.
Apesar das diversas alterações nas propriedades físicas e químicas do
biodiesel, o fato desse combustível ser renovável e menos poluente ao
ambiente o torna mais atrativo como combustível alternativo (Bankovic-Ilic et
al., 2012). Entre outros estudos há vários relatos relacionados com os impactos
ambientais provocados pelas emissões tóxicas liberadas para a atmosfera,
porém ainda são poucos os estudos que enfocam as avaliações
ecotoxicológicas (Müller, 2011) e a possibilidade de obtenção de novos
agentes e procedimentos de remediação ambiental a partir do biodiesel.
Pretende-se, portanto, com esta pesquisa preencher esta lacuna a fim de
viabilizar a matéria-prima considerada como resíduo para produção de
biodiesel com qualidade competitiva, como óleo de fritura.
Assim, o mercado de biodiesel busca por matérias-primas de baixo custo,
de forma a diminuir o custo final do biodiesel, já que somente o preço da
matéria-prima corresponde a cerca de 80% do preço final. Além disso, é
necessário assegurar que o biodiesel sintetizado apresente qualidade
adequada e segurança ambiental. Nesse sentido, os resíduos graxos de fritura
(ORF) aparecem como uma opção que precisa ser avaliada de maneira ampla,
de forma a garantir que essa seja uma matéria-prima com menor custo de
produção e ao uso adequado de biodiesel.
2. Objetivos
2.1 Objetivo Geral
24
O objetivo geral deste trabalho é efetuar e avaliar a produção e a
segurança ambiental de biodiesel produzido utilizando o ORF como matéria-
prima graxa, bem como efetuar a bioprospecção microbiana e avaliar a
possibilidade de usar antioxidantes naturais em substituição aos correntes.
2.2 Objetivos Específicos
Analisar a produção técnico-científica e o estado da arte acerca da
ecotoxicidade e dos aspectos microbiológicos do biodiesel.
Avaliar a toxicidade aguda de biodiesel de ORF, de óleo de soja
refinado e biodiesel comercial, utilizando como organismo-teste a
Artemia salina.
Testar a efetividade de produtos naturais como antioxidantes para
biodiesel produzido a partir de ORF.
Identificar micro-organismos isolados do biodiesel e avaliar a sua
capacidade de produção de biossurfactantes.
3. Estrutura da tese
A tese apresenta-se subdividida em cinco capítulos organizados na
forma de artigos para futura publicação científica, relacionados a seguir:
1) Efeitos ecotoxicológicos do Biodiesel: uma revisão (Capítulo 1)
2) Aspectos microbiológicos do biodiesel: uma revisão (Capítulo 2);
3) Estudo da toxicidade aguda do biodiesel de óleo de soja refinado, de fritura e
suas misturas com óleo diesel em ambiente aquático salobro ou salino
(Capítulo 3);
4) Avaliação de alguns produtos naturais como antioxidantes para biodiesel
metílico de óleos de fritura (Capítulo 4);
5) Produção de biossurfactante e biodegradação por micro-organismos
isolados de biodiesel metílico de óleo de fritura (Capítulo 5);
No primeiro capítulo foi realizada uma revisão sobre os efeitos
ecotoxicológicos de avaliação de diversos biodieseis desde 1945 até o
25
momento, sendo dividida por componentes temáticos relacionados com os
ecossistemas e indivíduos passíveis de contaminação e/ou intoxicação.
No segundo capítulo a revisão tratou de enfocar as publicações mais
relevantes sobre os aspectos microbiológicos do biodiesel em nível mundial
desde 1945 até hoje, evidenciando três temas: micro-organismos utilizados na
síntese de biodiesel, aqueles responsáveis pela degradação microbiana e, por
último, os empregados em processos de biorremediação.
O terceiro capítulo aborda a avaliação ecotoxicológica da fração salina
aquosa (eluato) de biodiesel produzido a partir de ORF utilizando a Artemia
salina, como uma ferramenta rápida, de baixo custo e fácil manipulação para
detectar de forma preliminar, o impacto deste biocombustível sobre os corpos
hídricos salobros ou salinos que eventualmente sejam contaminados,
principalmente em função da necessidade em se iniciar estudos de impactos
ambientais com aplicação futura à mistura de biodiesel ao diesel marítimo.
O quarto capítulo propõe e compara a utilização de três produtos
naturais - a curcumina, o triptofano e a cafeína - como antioxidantes de
biodieseis preparados a partir de ORF, visando garantir sua estabilidade
oxidativa durante o armazenamento.
Focou-se no quinto capítulo, o isolamento e identificação bioquímica e
molecular de micro-organismos presentes em biodiesel de ORF, bem como o
potencial de produção de biossurfactantes por parte dos micro-organismos
isolados de biodiesel de ORF, através de testes rápidos, além da investigação
utilizando espectrometria de massas. Vale observar que os biossurfactantes
são responsáveis pela aceleração do processo de degradação microbiológica
de combustíveis fósseis e de biodiesel.
26
4. Referências Bibliográficas
AHMAD, A. L.; YASIN, N. H. M.; DEREK, C. J. C.; LIM, J. K. Microalgae as a
sustainable energy source for biodiesel production: A review. Renewable and
Sustainable Energy Reviews, 15: 584-593, 2011.
ANDRADE, J.E.; PÉREZ, A.; SEBASTIAN, P. J.; EAPEN, D. A review of bio-
diesel production process. Biomass and Bioenergy, 35: 1008-1020, 2011.
ANP. AGÊNCIA NACIONAL DE PETRÓLEO, GÁS NATURAL E
BIOCOMBUSTÍVEIS, Lei N° 11.097, de 13 de janeiro de 2005. Presidência da
República, Casa Civil, Subchefia para Assuntos Jurídicos. Disponível em:
<http://www.planalto.gov.br/ccivil_03/_Ato2004-2006/2005/Lei?L11097.htm>.
Acesso em 13/07/2014.
ANP. AGÊNCIA NACIONAL DO PETRÓLEO, GÁS NATURAL E
BIOCOMBUSTÍVEIS (ANP). RESOLUÇÃO ANP Nº 45, DE 25.8.2014 - DOU
26.8.2014.
ANP. AGÊNCIA NACIONAL DO PETRÓLEO, GÁS NATURAL E
BIOCOMBUSTÍVEIS. Anuário estatístico brasileiro do petróleo, gás natural e
biocombustíveis. Rio de Janeiro: ANP, 2015a. Disponível em:
http://www.anp.gov.br/?dw=78135. Acesso em 31/03/2016.
ANP. AGÊNCIA NACIONAL DO PETRÓLEO, GÁS NATURAL E
BIOCOMBUSTÍVEIS. Boletim Mensal do Biodiesel. Dezembro de 2015b.
Disponível em: http://www.anp.gov.br/?dw=79123. Acesso em 29/02/2016.
ANP. AGÊNCIA NACIONAL DO PETRÓLEO, GÁS NATURAL E
BIOCOMBUSTÍVEIS. Boletim Mensal dos Combustíveis Renováveis. Nº 97,
Março de 2016. Disponível em:
<http://http://www.mme.gov.br/documents/1138769/1732805/Boletim+DCR+n%
C2%BA+97+-+mar%C3%A7o+de+2016.pdf/5a4bf34c-4654-4fc7-8ead-
751bb5f1641e> Acesso em 31/05/2016.
27
BALAT, M.; BALAT, H. A critical review of bio-diesel as a vehicular fuel. Energy
Conversion and Management, 49: 2727-2741, 2008.
BANKOVIC-ILIC, I. B.; STAMENKOVIC, O. S.; VELJKOVIC, V. B. Biodiesel
production from non-edible plant oils. Renewable and Sustainable Energy
Reviews, 16: 3621-3647, 2012.
BART, J. C. J.; PALMERI, N.; CAVALLARO, S. Biodiesel as a renewable
energy source. Biodiesel Science and Technology – from soil to oil. CRC Press
Taylor & Francis Group, 1-49, 2010.
BIODIESELBR Panorama energético atual e perspectivas futuras. Disponível
em: <http://www.biodieselbr.com/energia/alternativa/agro-energia.htm> Acesso
em: 15/07/2014a.
BRASIL. MME-EPN – Ministério de Minas e Energia – Empresa de Pesquisa
Energética. Balanço Energético Nacional 2013: Ano base 2012. Rio de Janeiro:
EPE, 2013 Disponível em:
<http://www.mme.gov.br/mme/galerias/arquivos/publicacoes/EM/2_-_BEN_-
_Ano_Base/1_-_BEN_Portugues_-_Inglxs_-_Completo.pdf> Acesso em:
15/07/2014.
BRASIL. Lei nº 13.033, de 24 de setembro de 2014.
Dispõe sobre a adição obrigatória de biodiesel ao óleo diesel comercializado
com o consumidor final; altera as Leis nos 9.478, de 6 de agosto de 1997, e
8.723, de 28 de outubro de 1993; revoga dispositivos da Lei no 11.097, de 13
de janeiro de 2005; e dá outras providências. 2014.
BRASIL. Projeto de Lei 3834/2015. Altera a Lei nº 13.033, de 24 de setembro
de 2014, para dispor sobre os percentuais de adição de biodiesel ao óleo diesel
comercializado no território nacional. Disponível em:
http://www.camara.gov.br/proposicoesWeb/fichadetramitacao?idProposicao=20
57821. Acesso em 03/03/2016.
28
BRASIL. LEI Nº 13.263, DE 23 DE MARÇO DE 2016. Altera a Lei nº 13.033, de
24 de setembro de 2014, para dispor sobre os percentuais de adição de
biodiesel ao óleo diesel comercializado no território nacional.
COMPANHIA NACIONAL DE ABASTECIMENTO – CONAB. Ministério da
Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Boletim sobre Conjuntura Mensal do
Biodiesel no período de março de 2011. Disponível em:
http://conab.gov.br/OlalaCMS/uploads/arquivos/11_04_11_08_45_49_conjuntur
a_biodisel_marco_2011..pdf. Acesso em 14/07/2014.
DWIVEDI, G.; SHARMA, M. P. Potential and limitation of straigh vegetable oils
as engine fuel – An Indian perspective. Renewable and Sustainable Energy
Reviews, 33: 316-322, 2014.
GEA. Global Energy Assessment – Toward a sustainable future, Cambridge
University Press, Cambridge UK and New York, NY, USA and the International
Institute for Applied Systems Analysis, Laxenburg, Austria, p. 43, 113 f., 2012.
HE, B. B.; THOMPSON, J. C.; ROUTT, D. W.; VAN GERPEN, J. H. Moisture
absorption in biodiesel and its petro-diesel blends. Applied Engineering in
Agriculture, 23 (1): 71-76, 2007.
HILL, J.; NELSON, E.; TILMAN, D., POLASKY, S.; TIFFANY, D. Environmental,
economic, and energetic costs and benefits of biodiesel and etanol biofuels.
Proceedings of the National Academy of Sciences, 30 (103): 11206-11210,
2006. Disponível em: www.pnas.org/dgi/doi/10.1073/pnas.064600103. Acesso
em 20/07/2014.
ISSARIYALKUL, T. & DALAI, A. K. Biodiesel from vegetable oils. Renewable
and Sustainable Energy Reviews, 31: 446-471, 2014.
JAKERIA, M. R.; FAZAL, M. A.; HASEEB, A. S. M. A. Influence of different
factors on the stability of biodiesel: A review. Renewable and Sustainable
Energy Reviews, 30: 154-163, 2014.
29
KNOTHE, G. Monitoring a progressing transesterification reaction by fiber-
optic near infrared spectroscopy with correlation to 1H nuclear magnetic
resonance spectroscopy. Journal of the American Oil Chemists‟ Society, 77 (5):
489-493, 2000.
KNOTHE, G. Biodiesel: Current Trends and Properties. Topics in Catalysis, 53:
714-720, 2010.
MENEGHETTI, S. P.; MENEGHETTI, M. R.; BRITO, Y. C. A reação de
transesterificação, algumas aplicações e obtenção de biodiesel. Revista Virtual
de Química, 5: 63-73, 2013.
MONTENEGRO, M. A.; PEREIRA, R. C.; HOFMANN-GATTI, T.; MARTINS, G.
B. C.; SUAREZ, P. A. Z. Aproveitamento de óleos e gorduras residuais para
obtenção de produtos de alto valor agregado: formulação de tinta de impressão
a partir de óleo residual de fritura. Revista Virtual de Química, 5 (1): 26-37,
2013.
MÜLLER, J. B. Avaliação da toxicidade da fração solúvel em água do biodiesel,
diesel e da mistura binária diesel/biodiesel de 5% (B5). Dissertação de
Mestrado apresentada ao Programa de Pós Graduação em Engenharia
Ambiental da Universidade de Santa Catarina. Florianópolis (SC), 112 f., 2011.
PINZI, S.; LEIVA-CANDIA, D.; LÓPEZ-GARCÍA, I.; REDEL-MACÍAS, M. D.;
DORADO, M. P. Latest trends in feedstocks for biodiesel production. Biofuels,
Bioproducts and Biorefining, 8: 126-143, 2014.
REIS, M. F.P; ELLWANGER, R. M; FLECK, E. Destinação de óleos de frituras.
In: CONGRESSO BRASILEIRO DE ENGENHARIA SANITÁRIA E
AMBIENTAL, Belo Horizonte. Anais. ABES (20): 24, 2007.
REN21. Renewable Energy Policy Network for the 21st Century. Sawin, J. L.
251p. 2015. Disponível em: http://www.ren21.net/wp-
30
content/uploads/2015/07/REN12-GSR2015_Onlinebook_low1.pdf2014. Acesso
em 09/02/2016.
SANTOS, D, V. Disponibilidade e potencial de recolhimento de óleo de cozinha
usado domiciliar no Distrito Federal: uma avaliação da situação atual e
perspectivas para um aproveitamento socioambiental e sustentável.
Dissertação apresentada ao programa de Pós-Graduação Strictu Sensu em
Planejamento e Gestão Ambiental da Universidade Católica de Brasília.
Brasília/DF, 113 f., 2012.
SÃO PAULO. COMPANHIA DE SANEAMENTO BÁSICO DO ESTADO DE
SÃO PAULO. Programa de reciclagem de óleo de fritura da SABESP, 2007.
Disponível em: http://site.sabesp.com.br/uploads/file/asabesp_doctos/programa
_reciclagem_oleo_completo.pdf. Acesso em: 25/07/2014.
SHAHID, E. M.; JAMAL, Y. A review of biodiesel as vehicular fuel. Renewable
and Sustainable Energy Reviews, 12: 2484-2494, 2008.
SHARMA, Y.C.; SINGH, B.; UPADHYAY, S.N. Advancements in development
and characterization of biodiesel: A review. Fuel, 87: 2344-2373, 2008.
STOMBAUGH, T.; CROFCHECK, C.; MONTROSS, M. Biodiesel FAQ. UK
Cooperative Extension Service – University of Kentucky – College of
Agriculture. AEN-90, 2006. Disponível em
http://www2.ca.uky.edu/agc/pubs/aen/aen90/aen90.pdf Acesso em 01/07/2014.
UNITED NATIONS – UN. Synthesis of energy-related issues highlighted in
national reports of RIO+20. New York. 42 p., 2012.
VYAS, A. P.; VERMA, J. L.; SUBRAHMANYAM, N. A review on FAME
production processes. Fuel, 89: 1–9, 2010.
ZULETA, E. C.; BAENA, L.; RIOS, L. A.; CALDERÓN, J. The oxidative stability
of biodiesel and its impact on the deterioration of metallic and polymeric
31
materials: a review. Journal of Brazilian Chemistry Society, 23 (12): 2159-2175,
2012.
32
– Efeitos ecotoxicológicos do Biodiesel: Uma revisão Capítulo 1
Carrim, A.J.I.1 da Silva Junior, E.D.2; Kopp, K.A. 2; Antoniosi Filho, N.R. 1
1 Laboratório de Métodos de Extração e Separação (LAMES), Instituto de Química,
Universidade Federal de Goiás, Campus II, Samambaia, Goiânia, Goiás, Brasil,
74690-900
2 Escola de Engenharia Civil e Ambiental (EECA), Universidade Federal de Goiás,
Campus I, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, Goiás, Brasil, 74605-220
E. mail: [email protected]
RESUMO
A utilização do biodiesel vem aumentando em função da busca por novas
matrizes energéticas em substituição aos combustíveis de origem fóssil, dadas
às vantagens de ser renovável, gerar menor emissão de poluentes, haver
disponibilidade de matéria-prima e permitir a produção de energia em áreas
distantes dos centros de produção de petróleo. Apesar das vantagens citadas,
torna-se necessário conhecer os efeitos ambientais desse biocombustível
sobre os organismos que compõem os ecossistemas, o que é feito pela
ecotoxicologia. Assim, alguns estudos ecotoxicológicos têm sido realizados
visando conhecer a segurança ambiental do biodiesel, bem como suas
consequências em caso de contato com o meio ambiente. Dessa forma,
visando conhecer esses trabalhos e seu impacto sobre a área de biodiesel,
efetuou-se neste trabalho o levantamento bibliográfico, no período de 1945 até
fevereiro de 2016, acerca dos estudos ecotoxicológicos associados a biodiesel.
Observou-se que ainda são poucas as publicações referentes a essa temática,
correspondendo a um total de 75 artigos. De modo geral, a avaliação dos
ensaios ecotoxicológicos efetuados nos ambientes atmosférico, aquático, em
solo e em outras situações indicam que, de modo geral, a adição de biodiesel
ao diesel é ecotoxicologicamente favorável.
PALAVRAS-CHAVE: biocombustível, meio ambiente, organismo-teste.
33
Ecotoxicologial effects of biodiesel: a Review
ABSTRACT
The use of biodiesel has been increasing as new energy matrices come to
replace fossil fuels due to the renewable advantages and for generating lower
pollutant emissions as well as providing raw material that allow energy
production at areas distant from petroleum production centers. Despite the
advantages mentioned, it is important to know the environmental effects of this
biofuel on the organisms constituting ecosystems, which occurs through
ecotoxicology. Therefore, some ecotoxicological studies have been carried out
aiming at revealing the biodiesel environmental safety, as well as the possible
consequences in case it has contact with the environment. In this context, in
order to know these studies and impacts on the biodiesel field, we carried out a
bibliographical survey covering the period from 1945 to February 2016 on
ecotoxicological studies associated with biodiesel, which indicated that only a
few publications encompass this theme, corresponding to a total of 75 papers.
In general, the assessment of ecotoxicological tests conducted in atmospheric,
aquatic and terrestrial environments; other situations indicate that, in general,
the addition of biodiesel to diesel is ecotoxicologically favorable.
KEYWORDS: biofuels, environment, test-organism.
34
1. Introdução
A crise do petróleo na década de 1970, fez com que muitos países
buscassem a produção de combustíveis renováveis, como etanol e o biodiesel.
Além disso, as preocupações ambientais e o receio da escassez de
combustíveis de origem fóssil num futuro próximo levaram vários países a
adotar uma legislação relativa ao uso de biocombustíveis, como etanol em
adição ou em substituição à gasolina, ou biodiesel em substituição ou
complementação ao uso de óleo diesel (Mariano et al., 2010).
Diante da crise energética e ambiental da atual sociedade, somado à
dependência do petróleo e seus derivados, o uso do biodiesel derivado de
óleos e gorduras vegetais e animais vem se consolidando. Destaque que deve
ser dado a exigência ambiental de redução do teor de enxofre em óleo diesel,
que hoje no país já estabelece teor inferior a 10 ppm de enxofre no diesel. Em
contraposição a redução do teor de enxofre tende a diminuir a lubricidade do
diesel e a introdução do biodiesel tende a reverter esse quadro (Farias et al.,
2011)
Atualmente a União Europeia, em especial a Alemanha, juntamente com
os Estados Unidos, a Argentina, a Malásia e o Brasil estão entre os maiores
mercados mundiais de produção e uso de biodiesel. Tendo em vista a
capacidade energética do biodiesel, pesquisas em torno de sua utilização têm
sido desenvolvidas no mundo, principalmente no intuito de limitar a
dependência de combustíveis derivados do petróleo (Hervé et al., 2011).
Sob o ponto de vista químico o biodiesel é uma mistura de ésteres
alquilicos de ácidos graxos derivados da reação de óleos ou gorduras com
álcool, na presença de catalisadores, podendo ser produzidos a partir da
esterificação ou transesterificação de óleos ou gorduras vegetais ou animais
com o álcoois como metanol ou etanol (Janaun & Ellis, 2010). As propriedades
do biodiesel são similares ao diesel derivado do petróleo em relação à
manutenção de determinadas características, tais como mudanças de fases,
conteúdo energético e viscosidade, fatos que possibilitam sua implementação
no mercado de forma gradual na substituição do óleo diesel.
Além disso, o biodiesel pode ser produzido a partir de diversas fontes
renováveis, tais como óleos e gorduras vegetais (soja, palma, girassol,
35
algodão, amendoim, crambe, pinhão-manso, mamona, dendê, linhaça, canola,
farelo de arroz, pequi, coco, babaçu, entre outros), animais (óleo de peixe, de
frango, sebo bovino ou suino), pelo reuso de óleo e gorduras residuais (resíduo
de esgoto e óleo de frituras) e de micro-organismos (microalgas) (Zuniga et al,
2011; Pereira et al, 2012).
Atualmente, o biodiesel está disponibilizado no mercado para consumo
em misturas com o óleo diesel gerando as chamadas misturas BX, em que X
representa a proporção volumérica de biodiesel em óleo diesel. Assim têm-se
misturas B2, B3, B4, B5, B6, B7, B10, B20 etc. sendo que em alguns locais e
situações especiais, usa-se até mesmo biodiesel na forma pura (B100) (Pinto
et al., 2005; Brasil, 2014).
Vale destacar que se trata de biocombustível complementar ou
sucedâneo do óleo diesel. Além de ser obtido de fontes renováveis, tem como
vantagens a menor emissão de gases de efeito estufa e de poluentes, a menor
persistência no solo, a maior biodegrabilidade e a baixa toxicidade. Entretanto,
mesmo sendo este um produto menos impactante ao meio ambiente em
relação aos derivados do petróleo, a contaminação do ambiente ocorrido pelo
descarte inadequado ou vazamento de biodiesel pode representar um ponto
negativo da utilização desta fonte energética (Costa Neto, et al., 2000; Mudge,
2008:).
Destaca-se que os órgãos ambientais, apesar de estabelecerem valores
máximos para uma variada gama de substâncias quantificáveis em laboratório,
não conseguem, por simples intermédio de análises químicas, avaliarem de
maneira segura, consistente e sistêmica os efeitos negativos dos diversos
elementos químicos sobre os seres vivos em geral, até porque alguns deles,
mesmo estando em concentrações abaixo dos padrões preconizados pela
legislação pertinente ou dos limites de detecção das metodologias analíticas
estabelecidas, ainda assim podem apresentar certo grau de periculosidade
para os organismos mais sensíveis (Relyea & Hoverman, 2006).
O descarte inadequado de resíduos no meio ambiente, incluindo os
provenientes da utilização do biodiesel, pode acarretar em sérios problemas
para fauna, flora, bem como para os seres humanos. Assim, por serem ainda
são ainda poucos conhecidos, os estudos relacionados aos efeitos tóxicos do
36
biodiesel em seres vivos precisam ser intensificados (Leme et al., 2011;
Madden, 2011).
Os estudos dos efeitos deletérios nos seres vivos através da exposição
ao diesel e outros derivados do petróleo são mais amplamente difundidos e
comuns quando realizados em determinados organismos-testes, como
populações de minhocas. Entretanto, ainda não tem sido determinada a
influência de um ambiente contaminado com diesel ou biodiesel para com a
sobrevivência de organismos mais sensíveis. Em virtude da exposição de
determinados organismos à ação do biodiesel presente no solo, água ou ar, as
capacidades vitais destes podem estar sendo comprometidas, implicando em
desequilíbrios ecológicos em certo ambiente (Lapinskiene, Martinkus &
Rebzdaite, 2005).
De acordo com Tavares (2008), para proteção da biodiversidade faz-se
necessário conhecer a legislação vigente no país sobre os despejos de
substâncias químicas em corpos hídricos e realizar os bioensaios preconizados
pela mesma. Nesse contexto, destacam-se as análises ecotoxicológicas,
também denominadas de bioensaios, que possibilitam avaliar, dentre outros
aspectos, em qual grandeza determinada substância, independente da forma,
isolada ou de mistura, é nociva aos seres vivos (Azevedo & Chasin, 2003).
É fato que os bioensaios, por se restringirem a organismos específicos e
serem realizados sob condições experimentais específicas, ou seja, em
ambientes artificiais e controlados, impossibilitam extrapolar os resultados
diretamente ao meio natural analisado, uma vez que os sistemas ambientais
reais estão submetidos a um constante fluxo de matéria e energia. E são
regidos por uma complexa gama de processos químicos, físicos e biológicos
que interagem constantemente entre si e que podem, por isso, minimizar os
efeitos degradantes teoricamente esperados de um dado poluente sobre os
seres vivos (Connon et al., 2012).
Entretanto, os ensaios ecotoxicológicos assumem importância singular
como indicadores e ferramentas de gerenciamento ambiental, uma vez que são
capazes de fornecer respostas que possibilitam antever, por intermédio de
relações de dose versus efeito, aspectos sobre possíveis alterações
prejudiciais em que o meio natural possa estar submetido frente ao contato
com determinadas substâncias e, prováveis efeitos comportamentais ou
37
fisiológicos desses compostos químicos sobre comunidades biológicas ou
espécies (Knie & Lopes, 2004; Bürger et al., 2012; Chang et al., 2014).
Nessa perspectiva, na medida em que se mostraram capazes de
fornecer valiosas informações norteadoras para a definição de diretrizes
técnicas e de políticas públicas que prezem pela proteção, alerta e
conservação do meio natural, os testes ecotoxicológicos passaram a ser
referendados como importantes instrumentos de monitoramento e análise de
riscos ambientais potenciais e reais, principalmente àqueles associados ao uso
de compostos químicos variados (Massukado et al., 2011; Taylor, 2011).
Portanto, ao limitar, restringir ou mesmo proibir o uso de determinados
produtos que comprovadamente afetam a vida de organismos-teste utilizados
nos bioensaios, a sociedade se beneficia, pois adota medidas de proteção à
saúde pública e ao meio ambiente.
Desta forma, devido à tão importante aplicabilidade, as análises
ecotoxicológicas vêm sendo crescentemente utilizadas em nível mundial, tendo
passado, inclusive, a fazer parte de exigências legais de muitos países, tais
como Estados Unidos da América e Canadá (Macek, 1980).
Mediante a necessidade de se primar pela qualidade ambiental frente à
exposição de determinadas substâncias, como o biodiesel, faz-se necessário o
desenvolvimento de pesquisas que visem contribuir para o entendimento de
como estas substâncias, presentes no meio ambiente, podem implicar em
efeitos negativos no comportamento dos seres vivos. Neste sentido, a presente
pesquisa bibliográfica visou descrever os estudos ecotoxicológicos realizados
mediante a exposição ao biodiesel e misturas, de forma a averiguar os
possíveis impactos ambientais, por meio do levantamento das publicações
divulgadas em artigos científicos a partir de 1945 até fevereiro de 2016.
2. Metodologia
Para a presente pesquisa utilizou-se os buscadores de assuntos
avançados do Portal de Periódicos da Coordenação de Aperfeiçoamento de
Pessoal de Nível Superior (CAPES), Portal Web of Knowledge
(http://apps.webofknowledge.com), Pubmed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/
entrez), Toxline (http://toxnet.nlm.nih.gov), bem como o Google Acadêmico, no
38
período de 1945 até fevereiro de 2016.
Nestes buscadores foram pesquisados principalmente artigos científicos
que continham como assunto e palavras-chaves os seguintes termos: biofuel,
biodiesel, toxicologia, toxicology, ecotoxicology, toxicity. Essas palavras foram
selecionadas e combinadas por serem as mais comumente utilizadas nos
trabalhos quando se estuda os efeitos toxicológicos do biodiesel em
organismos-teste.
Somente foram considerados trabalhos que apresentassem em seu
conteúdo alguma relação do uso, produção e impactos ambientais do biodiesel
(puro e blendas) com os efeitos ecotoxicológicos comparados com
combustíveis fósseis.
Mediante este levantamento considerou-se as seguintes informações:
quantidade de documentos encontrados, ano de publicação e componente ou
via avaliados. Para melhorar a discussão sobre os resultados obtidos, estes
foram elencados em cinco compartimentos: atmosférico, hídrico, solos,
toxicidade oral e outros testes aplicados para biodiesel, de acordo com o
escopo de cada artigo estudado.
3. Resultados e Discussão
Através de pesquisa nas bases de dados supracitadas foram
encontradas 75 (setenta e cinco) publicações no período de 1945 a fevereiro
de 2016, porém o primeiro relato sobre o tema ocorreu a partir de 1998. Na
Figura 1.1 apresenta-se a distribuição das publicações ao longo dos anos e a
Figura 1.2 apresenta a distribuição desses artigos pelas cinco compartimentos.
Pela Figura 1.1 observa-se que o número de estudos ecotoxicológicos
relacionados a biodiesel vem aumentando, com pico de 13 publicações em
2013, mas ainda é pequeno quando comparado a outros tipos de estudo
relacionados a biodiesel, já que de 1945 a fevereiro de 2016 há apenas 75
publicações relacionando essas temáticas.
39
Figura 1.1. Número de publicações distribuídos de acordo com o ano de
publicação.
Figura 1.2. Número de publicações distribuídos de acordo com o ano de
publicação e pelos cinco compartimentos.
A Figura 1.2 indica que meio atmosférico é estudado desde 1998,
demonstrando a preocupação dos pesquisadores em avaliar em organismos-
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Ano de publicação
atmosfera
água
solo
via oral
diversos
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teste os efeitos da emissão de gases a partir da combustão de biodiesel e suas
misturas com diesel. O compartimento água começou a ser avaliado a partir de
2005, tendo seu estudo ampliado a partir de 2011. Em relação ao solo e via
oral são menos estudados, havendo ainda poucas publicações acerca de
outras temáticas, que não as outras quatro citadas.
Assim, de acordo com o tipo de compartimento investigado observou-se
uma frequência maior para o meio atmosférico que para os demais, conforme
apontado pela Figura 1.3.
Figura 1.3. Total de publicações de acordo com os compartimentos.
3.1. Compartimento atmosférico
Os estudos ecotoxicológicos neste componente foram os mais
frequentes em relação ao biodiesel e somam trinta e cinco publicações (54,7%
do total), com os ensaios biológicos variando entre metodologias in vitro e in
vivo. Para efeito de comparação, testes de caracterização física e química
compõem as publicações, porém o enfoque ressaltado corresponde aos
ensaios biológicos.
Assim, Eckl et al. (1998) analisaram material particulado (MP)
proveniente da exaustão de motores movidos à diesel e biodiesel de canola
(B100) e compararam a massa do MP, a presença de PAH e carbonilas, o
41
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atmosfera água solo via oral outrostestes
Nú
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os
Compartimentos
54,7%
26,7%
6,7% 6,7% 5,3%
41
potencial mutagênico (teste de Ames) e citotóxico/genotóxico (índice mitótico,
indução do micronúcleo, aberrações cromossômicas e trocas das cromátides
irmãs em hepatócitos cultivados) em 344 ratas expostas aos gases de
combustão. O biodiesel apresentou menor quantidade de MP e menores
efeitos tóxicos que o diesel, provavelmente pela presença de maior quantidade
de PAHs nos gases de combustão do diesel.
Para avaliação do efeito mutagênico (teste de Ames) e citotóxico
(linhagem celular de fibroblastos de pulmão de rato – L929) de material
particulado da combustão de óleo de canola, biodiesel de óleo de canola
(B100) e óleo diesel, Bünger et al. (1998) utilizaram extratos orgânicos do
material particulado de óleo diesel e de canola. O óleo diesel induziu maior
toxicidade, provavelmente pela presença de compostos policíclicos aromáticos,
em relação ao biodiesel. Ademais, o biodiesel apresentou massa de material
particulado menor que os demais.
Bünger et al. (2000a) e Krahl et al. (2001) compararam a
mutagenicidade (teste de Ames) entre diesel e biodiesel de canola, e
verificaram que o óleo diesel apresentou maior toxicidade em função dos
compostos aromáticos em sua composição. Em outro trabalho usando o
mesmo teste para avaliar mutagenicidade, compararam óleo diesel puro e óleo
diesel com baixo teor de enxofre com biodiesel de soja e de canola (B100),
correlacionando com os componentes aromáticos na fração orgânica do
material particulado.
Assim observaram menor quantidade de material particulado e
toxicidade para as amostras de biodiesel frente ao diesel. Os autores
atribuíram a mutagenicidade do óleo diesel aos compostos aromáticos
presentes, e para o biodiesel indicaram uma menor mutagenicidade
relacionada aos compostos carbonila presentes em grande concentração
(Bünger et al., 2000b). Em 2007, Bünger e colaboradores complementaram os
estudos reiterando a observação de toxicidade moderada para o biodiesel de
canola.
As emissões de gases de biodiesel de soja em concentrações diferentes
(5, 25, 50 ppm) foram avaliadas em pulmões de 30 ratos F344 expostos por
inalação durante 6 horas por dia, 5 dias por semana, durante um período de 13
semanas. Ao avaliarem os sinais clínicos (hematologia, micronúcleos na
42
medula óssea), fertilidade e toxicidade (ocular, reprodutiva, teratologia), os
autores não observaram alterações significativas, com exceção de elevação
dos macrófagos, concluindo que efeitos modestos ocorrem na situação de
maior concentração de emissão de gases (Finch et al., 2002).
Kado & Kuzmicky (2003) avaliaram o material particulado emitido pela
combustão de biodiesel de canola, soja, banha de porco e sebo bovino (B100),
frente óleo diesel puro. Os resultados de mutagenicidade (teste de Ames)
indicaram maior toxicidade para diesel. Entre as amostras de biodiesel, o de
canola se apresentou mais tóxico e o de soja com a menor toxicidade. Como
ambos possuem alto grau de insaturação nos ácidos graxos, tal toxicidade não
pôde ser correlacionada com tal característica química.
Os resultados do teste de Ames (mutagenicidade) e a observação de
elevadas quantidades de PAH e derivados nitro-PAH em material particulado
recolhido de ônibus urbano movido a diesel puro e biodiesel de canola (B20),
foram semelhantes aos relatados por Turrio-Baldassarii et al. (2004).
De acordo com os resultados do trabalho de Barnwal & Sharma (2005),
comparando a emissão de gases poluentes gerados pelas combustões de
biodiesel e de óleo diesel de petróleo, observou-se que com o biodiesel o SO2
é totalmente eliminado, a fuligem diminui em 60%, o monóxido de carbono e os
hidrocarbonetos diminuem em 50%, os hidrocarbonetos poliaromáticos são
reduzidos em mais de 70% e os outros aromáticos diminuem em 15%.
Krahl et al. (2007, 2009) complementaram o estudo avaliando a emissão
de material particulado e algumas propriedades químicas e físicas, além da
mutagenicidade (teste de Ames) de óleo de canola, biodiesel de canola, gás
derivado de combustível e petrodiesel. Os valores obtidos para as
concentrações de monóxido de carbono, hidrocarbonetos totais, material
particulado estavam dentro do limite permitido, sendo que apenas os óxidos de
nitrogênio para biodiesel estava acima do limite permitido. Em relação ao
bioensaio, o óleo de canola apresentou maior toxicidade que os demais
servindo de alerta para que outros óleos sejam avaliados, provavelmente em
função da presença de substâncias nocivas durante a decomposição dos
ésteres em alta temperatura. Em 2007, Krahl et al. complementaram a
avaliação enfatizando as altas quantidades de partículas ultrafinas e de fósforo
nos biodieseis, reiterando a mutagenicidade para as misturas.
43
A mistura de biodiesel com diesel (B20) e o biodiesel puro (B100) foram
avaliados por McCormick (2007) para averiguar a emissão de poluentes
atmosféricos e efeitos à saúde, utilizando animais. Foi constatado que, na
presença de maior volume de biodiesel, houve redução de emissão de
partículas, monóxido de carbono, hidrocarbonetos totais, além de um grupo de
compostos tóxicos como hidrocarbonetos com cadeia a partir de C1 e C12,
aldeídos e cetonas até C8 e gases de efeito estufa, Evidenciou-se assim que a
presença do biodiesel diminui as quantidades emanadas de compostos
poluentes e tóxicos.
De acordo com Liu et al. (2008) os produtos semi-voláteis demonstraram
maior toxicidade que o material particulado avaliados por teste de Microtox e 3-
(4,5-dimetiltiazol-2-II)-2,5-difeniltetrazólio (MTT), em combustão de biodiesel
metílico de palma em concentrações variadas (B0, B10, B30, B50, B75 e
B100), sendo evidenciada maior toxicidade para o diesel puro e para as
misturas com maior concentração de óleo diesel.
A partir da emissão de particulados de combustão de diesel e biodiesel
de óleo de canola e soja, em misturas B1, B2, B5, B10, B20, B100, Gagnon
(2008) avaliou a massa de particulados, o teste mutagênico (Ames) e a
presença de dioxinas. Concluiu que quanto maior a quantidade de biodiesel na
mistura, menor a toxicidade e que o efeito da dioxina em nível celular
provavelmente ocorreu pela presença do óleo diesel.
Swanson et al. (2009) utilizaram células humanas epiteliais respiratórias
transformadas BEAS-2B para testar extratos orgânicos de material particulado,
emitido por biodiesel (B100 etílico e metílico de soja), em relação ao óleo
diesel. Embora a resposta inflamatória inicie em doses menores que em diesel
(40 µg eq/mL) ainda assim consideraram baixas a citotoxicidade e a
mutagenicidade do biodiesel.
A emissão de gases produzida na queima de óleo diesel puro e biodiesel
de óleo de palma, misturados nas proporções B10, B30, B50 B75 e B100,
foram comparadas utilizando o teste citotóxico MTT (viabilidade celular) e
mutagênico (Vibrio ficheri), além da quantificação de compostos com grupos
carbonilas, tais como formaldeído, acetaldeído, acroleína, acetona. Os
resultados indicaram que existe uma correlação maior de toxicidade para o
biodiesel, principalmente para B10, porém não confirmam se as carbonilas são
44
as responsáveis por tal efeito (Liu et al., 2009). Tais resultados indicaram que a
mistura com biodiesel pode também apresentar efeitos adversos à saúde, em
função dos gases tóxicos de emissão.
Após exposição de ratos machos a combustão de diesel e misturas B3,
B50 B100 de biodiesel de soja, por 30 minutos e 1 hora, foi quantificada a
quantidade de material particulado, compostos orgânicos voláteis (VOC) e
inorgânicos, hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (PAH) e metais, além de
se efetuar a análise da medula óssea, sangue, a ocorrência de processos
inflamatórios pulmonares e cardiovasculares nos organismos-teste. Óleo diesel
e B50 apresentam maior geração de VOC, PAH, metais, monóxido de carbono
e material particulado em relação ao B100, porém o B100 se mostrou mais
tóxico que o óleo diesel, provavelmente pela geração de quantidades maiores
de óxidos de nitrogênio e material particulado, os quais foram responsáveis
pelas alterações cardiovasculares, pulmonares e inflamações sistêmicas (Brito
et al., 2010).
O experimento de Jalava et al. (2010) indica que macrófagos de ratos
testados frente às partículas eliminadas de motores movidos à diesel, biodiesel
metílico de canola e óleo vegetal de canola apresentaram resposta inflamatória
(teste citotóxico/apoptose, ciclo celular, genotóxico/teste do Cometa e
avaliação do estresse oxidativo/ROS) nas vias respiratórias e cardiovasculares
dos organismos testados. Todas as amostras testadas apresentaram atividade
toxicológica, entretanto o biodiesel metílico de canola foi o que exibiu menor
toxicidade quando comparado com óleo diesel e óleo de canola.
Kooter et al. (2011) constataram que, ao compararem o aerossol de
combustão de biodiesel de canola (B5, B10, B20 e B100) com óleo diesel e
óleo vegetal puro de canola, o biodiesel e o óleo de canola produzem menor
quantidade de material particulado, podendo ser uma boa opção como
biocombustíveis. Entretanto, em relação ao potencial tóxico, a citotoxicidade do
B100, comparado com diesel e o óleo vegetal puro, apresentou um aumento de
200%. Nessa avaliação os autores verificaram a capacidade de induzir ao
estresse oxidativo, a citotoxicidade com linhagem celular de macrófagos de
rato e a genotoxicidade (teste de Ames). Também Hemmingsen et al. (2011)
encontraram resultados similares avaliando danos em DNA (células A549),
níveis de interleucina (IL8 – em células THP-1), a expressão de ICAM-1 e
45
VCAM-1 (células endoteliais de cordão umbilical humano – HUVECs) e a
produção de espécies oxidativas (ROS).
Para comparar a citotoxicidade in vitro de material particulado de
biodiesel produzido a partir de óleo de fritura (B50 e B100) e óleo diesel com
ultra baixo teor de enxofre (ULSD), Betha et al. (2012) utilizaram linhagem de
células humanas epiteliais respiratórias, e detectaram alterações na viabilidade
celular, toxicidade celular e estresse oxidativo. O estudo demonstra que o
biodiesel produz menos material particulado, porém com maior toxicidade que
o óleo diesel ULSD, provavelmente pela presença de metais e compostos
orgânicos de diferentes classes, os quais foram detectados pelos autores.
Gerlofs-Nijland et al. (2013) avaliaram a toxicidade em células BEAS-2B
(linha celular epitelial bronquial humana SV40 transformada) e potencial
oxidativo (método do ácido ascórbico e ditiotreitol) em ambiente urbano e rural,
do material particulado emitido por veículos abastecidos com diesel (B0) e
biodiesel 50% (B50). Os autores sugerem que B0 e B50 causam risco à saúde
humana, pois emitem material particulado igualmente promotor da resposta
inflamatória e da citotoxicidade, mesmo observando que B50 teve emissão de
menos 50% de material particulado em relação a B0.
A emissão de particulados, carbonilas, hidrocarbonetos policíclicos
aromáticos e a mutagenicidade bacteriana (testes de Ames) foram avaliadas
comparando amostras de biodiesel metílico de Jatropha (JME), óleo vegetal
hidrotratado (HVO), óleo diesel e biodiesel metílico de canola (RME). Cada
amostra demonstrou vantagens e desvantagens, tais como menor produção de
NOx comparando-se o óleo diesel e as amostras de biodiesel, entretanto todas
as amostras induziram mutagenicidade bacteriana, principalmente as amostras
de JME e RME (Westphal et al., 2013; Schröder et al., 2013). Os estudos
realizados por Westphal et al. (2013) ressaltam que mais estudos
ecotoxicológicos são necessários mesmo que JME apresente vantagens sócio-
ecológicas, uma vez que não compete com a cadeia produtiva alimentar.
Steiner et al. (2013) avaliaram a toxicidade dos gases de escapamentos
de motores na combustão de óleo diesel (B0), biodiesel de canola (B20 e
B100) em períodos de exposição por 2 (duas) e 6 (seis) horas, usando células
humanas das vias respiratórias. Entre as análises foram utilizadas a avaliação
da citotoxicidade através de kit (Roche®) para quantificar a liberação
46
extracelular de proteína citosólica de lactato desidrogenase (LDH), a
quantificação da quantidade de glutationa reduzida (kit Cayman Chemical e
Pierce®), avaliação da resposta transcricional para verificar o estresse oxidativo
celular e a integridade do mRNA, a quantificação extracelular do fator de
necrose tumoral (TNF-α) e a análise de interleucina 8 (IL-8). De um modo geral
observaram que a exaustão de B20 apresentou menor resposta ao estresse
oxidativo e pró-inflamatórios, entretanto o escape de B100, conforme a duração
da exposição diminuiu o estresse oxidativo e elevou as respostas pró-
inflamatórias. B20 e B100 podem ser alternativas ecológicas consideráveis em
relação ao uso do óleo diesel.
As emissões de combustão de amostras de biodiesel de soja (B100)
produziram uma resposta inflamatória e acelerou o estresse oxidativo em
células de fígado e pulmão de ratos, em intensidade maior que a proporcionada
pelo óleo diesel puro, em função da maior emissão de componentes como
aldeídos insaturados. Shvedova et al. (2013) sugerem que mais estudos devem
ser realizados para avaliar a toxicidade de outros componentes importantes
emitidos pela combustão de biodiesel.
Yanamala et al. (2013) chegaram a mesma conclusão quando
realizaram estudos em lavado de pulmões de ratos expostos por 1 dia, 7 dias e
28 dias a material particulado de biodiesel de milho comparado com diesel com
ultra baixo teor de enxofre. Os resultados indicaram que 32 medidores
inflamatórios foram ativados ao analisarem estresse oxidativo, histopatologia,
presença de citocinas, fatores de crescimento, permeabilidade, atividade de
proteína total e lactato desidrogenase e mieloperoxidase.
Fukagawa et al. (2013) realizaram ensaios biológicos in vitro e in vivo da
emissão de material particulado em motores usando biodiesel de canola (B20)
e óleo diesel puro (B0), e constataram que as repostas nos dois sistemas se
apresentam de forma diferente e podem ser incompletas, uma vez que a
avaliação parcial das células pode não representar o sistema todo do animal e
os efeitos tóxicos. Foram avaliadas as concentrações de interleucina-6 (IL-6
mediador inflamatório induzido por interferon-gama e proteína 10 – IP-10) e o
teste do fator estimulador de colônias granulocitárias (fator G-CSF) em células
bronco alveolares de ratas. Os autores observaram que B20 produz menos
material particulado, porém com maior toxicidade que o óleo diesel puro.
47
Outro trabalho avaliou material particulado de emissão de B20 de soja e
petrodiesel, no período de 10 a 12 dias de exposição, em células epiteliais
brônquicas humanas e linha celular de macrófagos (BEAS-2B e THP-1),
concluindo que o efeito tóxico mais pronunciado foi observado em B20 (Traviss
et al., 2014).
Resultados similares para B20 foram observados por Mullins et al.
(2016) ao avaliarem viabilidade celular, apoptose e produção de citocina em
processo de combustão de biodiesel de óleo de canola (B100 e B20) e óleo
diesel puro com baixo teor de enxofre (B0). Para este estudo foi utilizado o
material de combustão de um motor movido a biodiesel de soja (B20)
comparado com o mesmo material proveniente de diesel com baixo teor de
enxofre. Bhavaraju et al. (2014) constataram in vitro o aumento na produção de
PGE2 (prostaglandina E2) em macrófagos alveolares de ratos adultos, para
ambos os combustíveis, entretanto B20 promoveu um aumento significativo na
produção de PGE2, mesmo gerando menor concentração de particulados.
Hawley et al.(2014) publicaram a primeira avaliação em células normais
epiteliais brônquicas (NHBE), obtidas por lavado de biópsia, de dois voluntários
humanos expostos em 5, 20 e 60 minutos aos gases emitidos de motores
abastecidos com óleo diesel e com biodiesel de soja (B99) com e sem o uso de
filtro para material particulado. Verificaram que ambos os combustíveis, com ou
sem o uso de filtro, produzem o mesmo nível de toxicidade, com resposta
celular similar.
Para o teste de citotoxicidade do extrato de material particulado de
diesel com ultra baixo teor de enxofre e misturas com biodiesel de óleo de
palma ou butanol (ambos 1%, 2% e 4%), Zhang & Balasubramanian (2014)
utilizaram células epiteliais alveolares humanas do tipo II da linha A549 e
constataram diminuição da viabilidade celular conforme a concentração do
extrato foi aumentada, apesar de não ter havido diferença significativa de
toxicidade entre as amostras.
De acordo com Kisin et al. (2015) a exposição a material particulado por
aspiração faringeal proveniente de biodiesel de óleo de milho (B50) e óleo
diesel puro, aspirados por ratos em períodos de 7 e 28 dias, indicou alterações
significativas em nível celular nos órgãos sexuais, tais como edema, distrofia,
estresse oxidativo, acúmulo de produtos peroxidação de lipídeos, processos
48
inflamatórios associados a infertilidade, danos ao DNA e depleção da
glutationa. Foi também verificado que B50 produziu efeitos mais adversos nas
funções reprodutivas das cobaias que o diesel.
Em um primeiro estudo humano utilizando biomarcadores novos e
estratégias proteômicas para avaliar a emissão e os efeitos de material
particulado de óleo diesel e biodiesel de soja (B75), inalados por 200 minutos,
Mehus et al. (2015) selecionaram 6 humanos adultos saudáveis, e avaliaram
urina, escarro, plasma e condições pulmonares dos voluntários. Observaram
que os combustíveis apresentaram índices semelhantes de acetaldeído,
formaldeído ou óxido de nitrogênio, porém B75 apresentou redução de dióxido
de nitrogênio, monóxido de carbono e material particulado. Os autores indicam
que os biomarcadores são eficientes para verificar o aumento de processos
inflamatórios e de estresse oxidativo, mais elevado no diesel, porém outros
estudos em blendas diferentes devem ser realizados.
Aerossóis e material particulado, incluindo extrato orgânico e partículas
ressuspensas, emitidos a partir de biodiesel metílico de canola (B7 e B30) e
óleo diesel (B0) foram analisados de forma comparativa. Os meios utilizados
foram culturas de células A549 e células de pulmão de ratos (teste genotóxico)
para analisar a formação de adutos em DNA, teste de Ames e detecção de
HAP. Os resultados indicaram que os gases emitidos, tanto por amostras de
óleo diesel quanto de biodiesel produzido com óleo de canola, exibem menos
genotoxicidade em função dos tratamentos atuais adotados, tais como filtros de
retenção de partículas e catalisadores (André, et al., 2015).
Vojtisek-Lom et al. (2015) detectaram maior quantidade de
hidrocarbonetos policíclicos aromáticos e benzo[a]pirenos em óleo diesel que
em relação ao biodiesel de canola, entretanto as quantidades encontradas
foram suficiente para ambos demonstrarem efeitos genotóxicos (ensaio
acelular – adutos de DNA e danos oxidativos ao DNA com DNA de timo de
vitela – ctDNA). Resultados similares foram encontrados para o óleo de canola
em estudos realizados por Topinka et al. (2012).
As análises de materiais particulados e gases de escape de combustão
de óleo diesel puro e biodiesel de soja (B20 e B100), em concentrações de 50,
150 e 500 µg/m3, inalados por ratos, induziram maior nível de inflamação, o
que desencadearam repostas alérgicas quando comparado ao diesel. Vale
49
observar que Gavett et al (2015), avaliando amostras de lavagem
broncoalveolares, não constataram essas mesmas respostas para o biodiesel
(B20 e B100).
Bass et al. (2015) observaram que as emissões de diesel causaram
mais lesões em nível pulmonar e as amostras de biodiesel causaram efeitos
vasculares mais agudos após estudos similares realizados em ratos Wistar-
Kyoto (WKY), expostos 4 horas por dia em 2 dias, ou por 4 semanas com
exposição por 5 dias em cada semana.
As características das emissões de particulados produzidos por biodiesel
podem variar de acordo com o tipo e condições dos motores utilizados e com a
fonte de matéria graxa empregada para produção do biodiesel. Apesar da
quantidade das emissões totais dos compostos investigados se revelarem
menor, foram identificadas algumas substâncias tais como NOx, formaldeído,
acroleína e acetona, comprovadamente muito tóxicas, além da ocorrência de
problemas associados a perda de potência do motor (Mauderly, 1998; Fontaras
et al., 2010a; Fontaras et al., 2010b; Xue et al., 2011; Agarwal, et al., 2013,
Kousoulidou et al.; 2013).
Os bioensaios têm sido avaliados com mais frequência no componente
atmosférico, uma vez que a emissão dos diversos gases gerados na
combustão do biodiesel é preocupante do ponto de vista ecotoxicológico, algo
que se extende as blendas. Assim, a presença de HAP, VOC, formaldeído e
acetaldeído são relatadas para blendas de biodiesel com óleo diesel, mesmo
que este se apresente com baixos teores de enxofre (Karavalakis et al., 2010;
Magara-Gomez et al., 2012; Rosen et al., 2014).
Ainda no que se referem ao componente atmosférico, muitos dos
trabalhos correlacionando biodiesel e ecotoxicologia visam o estudo da
citotoxicidade e da mutagenicidade, utilizando praticamente os mesmos
organismos-testes (Krull & Barros, 2012), provavelmente por estes bioensaios
serem os mais frequentes na literatura, uma vez que os diversos autores não
justificaram os motivos para a eleição da espécie. De acordo com Madden
(2015) além dos modelos animais não humanos, foram utilizadas estirpes
bacterianas para avaliação das emissões de biodiesel puro e misturado ao
biodiesel, bem como a análise de formação de aductos de DNA, porém o autor
50
afirma que até o momento existem poucos relatos sobre os efeitos
toxicológicos das emissões destes combustíveis.
Nem sempre a espécie escolhida faz parte do habitat daquela região de
estudo, pois a maioria das espécies padronizadas pelos órgãos oficiais é
exótica, sem levar em consideração o habitat natural e o comportamento do
organismo-teste naquele ambiente. Em outras áreas também se observa uma
situação similar, que é o caso dos produtos originados das indústrias
farmacêuticas, sobre os quais existem estudos insuficientes, além da
necessidade de maiores explorações para compreender as interações
tococinéticas, toxicodinâmicas, ecológicas e as consequências quantitativas
(Backhaus, 2014).
Vale ainda observar que com maior frequência o biodiesel mais
analisado foi produzido a partir de canola/colza utilizando a rota metílica. Esta
fonte é a mais utilizada na Europa e Estados Unidos para produção de
biodiesel e tem sido cada vez mais incentivada para que substitua
gradativamente os combustíveis de origem fóssil (Ajanovic, 2011; Firrisa et al.,
2013).
3.2. Compartimento hídrico
No período avaliado, foram encontrados dezenove trabalhos (26,7%),
com diferentes abordagens, espécies indicadoras e níveis tróficos, enfocando
os aspectos ecotoxicológicos do biodiesel em meio aquático.
O primeiro trabalho relatado na literatura científica acerca da
ecotoxicidade em meio aquático de biodiesel metílico, na forma de uma mistura
B4, foi publicado por Chae et al. (2005), que usou a microalga dulcícola
Chlorella vulgaris como organismo-teste dulcícola e classificou tal mistura como
sendo levemente tóxica.
Khan et al. (2007) observaram que a toxicidade do biodiesel, em
misturas B100, B50, B20 e B5, é proporcionalmente menor que a do óleo diesel
puro. Entretanto, mesmo apresentando um impacto ambiental menor sobre
organismos aquáticos em caso de derramamentos, ainda assim os efeitos
resultantes podem ser similares aos apresentados pelo óleo diesel. Foram
testadas amostras de biodiesel de óleo de fritura (B100 e B20), óleo de soja e
51
canola (B20), sendo este último com resultados de toxicidade menor que os
demais biodieseis. Os organismos teste utilizados foram truta-arco-íris
(Oncorhyncus mykiss) e a pulga d‟água (Daphnia magna) em até 96 horas.
Estudos com peixes da espécie tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus),
mediante exposição desta as diferentes concentrações de biodiesel de soja e
óleo diesel, apresentaram resultados que comprovam alterações nas respostas
biomecânicas de determinados peixes, sob as condições experimentais
testadas, indicando que tais misturas BX podem representar um risco para a
biota aquática Além disso, observou-se também que, quando misturados ao
biodiesel, alguns metabólitos tóxicos do óleo diesel foram encontrados em
concentrações levemente maiores na bile das tilápias do que nas análises dos
animais expostos quando expostos ao diesel de petróleo puro (Nogueira et al.,
2011). Concentrações de 4,6%, 10%, 22%, 46% e 100% da fração solúvel em
água de óleo diesel e misturas B5 e B100 apresentaram alterações
histopatológicas anormais em brânquias e fígado, sendo essas maiores na
presença de óleo diesel puro, provavelmente pela presença de hidrocarbonetos
(Leite et al., 2015).
De acordo com Nogueira et al. (2011), os ésteres de ácidos graxos do
biodiesel são facilmente absorvidos pelos peixes e, de certa forma, auxiliam na
absorção de substâncias tóxicas do diesel de petróleo presentes na mistura.
Leite et al. (2011), estudaram a toxicidade crônica frente a fração solúvel
de biodiesel do óleo de mamona (OM), do óleo de palma (OP) e do óleo de
fritura de soja (OFS) utilizando microalgas (Tetraselmis chuii) e ouriço do mar
(Echinometra lucunter), e verificaram que os maiores níveis de toxicidade foram
obtidos para OM, OFS e OP respectivamente, sugerindo que a presença
elevada de metanol, em até 120 dias de armazenamento, pode ter contribuído
para a toxicidade.
A citotoxicidade in vitro foi testada em linhagens de células humanas
(célula T, carcinoma hepatocelular HepG2, potencial da membrana
mitocondrial, apoptose celular) acompanhada de quantificação de PAH em
fração solúvel de biodiesel de soja (B5, B20, B50, B100) e diesel (D100). De
acordo com a dose dependente, foi observado que D100 e B5 apresentaram
maior toxicidade, provavelmente pela presença de elevada quantidade de PAH
(Leme et al., 2011)
52
Müller (2011) detectou menor toxicidade da fração solúvel em água de
biodiesel de soja (B5) em relação ao óleo diesel, através da exposição frente à
pulga d‟água (Daphnia magna), Vibrio fischeri e tilápia do Nilo (Oreochromis
niloticus) em testes de toxicidade crônica, aguda e de mutagenicidade via
análise de micronúcleo. Nas frações solúveis do diesel foi detectada a
presença de altas concentrações de BTEX (benzeno, tolueno, etil-benzeno,
xileno) e baixas concentrações de HAP
Da Cruz et al. (2012) observaram o aumento da citotoxicidade da fração
solúvel em água de biodiesel de óleo de mamona (Ricinus communis), de
biodiesel de óleo de fritura de soja e de biodiesel de óleo de palma (Elaeis
guinnensis) ao longo de 1, 60 e 120 dias. Os autores investigaram a perda na
integridade da membrana hepática lisossomal em tilápia (Oreochromis
niloticus), usando como biomarcador a fosfatase ácida, e sugeriram, após
análise de cromatografia gasosa, que a presença do metanol seja o
responsável pela toxicidade.
A mutagenicidade e a genotoxicidade da fração solúvel em água de
biodiesel de soja (B5, B20, B50, B100) e diesel (D100) foram avaliadas, por
Leme et al. (2012b), que também efetuaram a análises de ésteres de ácidos
graxos e fitoesterois do biodiesel utilizado. A toxicidade de D100 e B5 foi
relacionada à presença de HAP, entretanto nas demais concentrações também
se observou potencial tóxico, provavelmente por causa dos fitoesteróis e
fitoestrogênios, além de outros componentes residuais da transesterificação do
biodiesel de óleo de soja.
Yassine et al. (2012) avaliaram a mutagenicidade para Vibrio ficheri, em
ensaio com Microtox, das frações solúveis em água de biodiesel de soja (B0,
B20, B40, B60, B100) e concluíram que a toxicidade aguda observada após
24h de bioensaio foi causada por subprodutos da autoxidação dos ésteres
metílicos de ácidos graxos e, no caso do diesel, pelos compostos aromáticos
presentes.
Pereira et al. (2012) avaliaram a toxicidade da fração solúvel em água de
diferentes concentrações de biodiesel de soja (B100, B5, B3, B2) e
compararam com a de óleo diesel puro, utilizando microalgas marinhas. Tanto
para as misturas quanto para o diesel observaram o mesmo comportamento,
ou seja, quanto maior a quantidade de diesel, maior a toxicidade. No caso do
53
biodiesel a suposta toxicidade verificada pode ter sido pela presença do
metanol identificado na fração solúvel (87 mg/L). Para microalgas, os autores
verificaram também a ocorrência de 50% de inibição, em 96 horas, para
concentrações que variaram de 2,3 a 85,6%, obtendo que Skeletonema
costatum foi mais sensível que Nannochloropsis oculata, a qual foi mais
sensível que Tetraselmis chuii. A microalga Pseudokirchneriella subcapitata
demonstrou apresentar a menor sensibilidade ao bioensaio.
A partir da água de lavagem na purificação de biodiesel de soja
considerada como efluente industrial, Holanda et al. (2012) avaliaram a
toxicidade aguda utilizando Danio rerio e o nível de concentração de 13,14% foi
considerado muito tóxico para o organismo-teste utilizado, provavelmente pela
presença de metanol e glicerina nas amostras nas diversas diluições testadas
(100, 75, 50, 25, 10 e 5%).
Nogueira et al. (2013) avaliaram a peroxidação lipídica em peixes
Pterygoplichthys anisitsi (cascudo) expostos ao biodiesel B100, óleo diesel
puro, e as misturas B5 e B20 e constaram que apesar do biodiesel ser mais
biodegradável e a emissão de gases ser menor para a atmosfera, o aumento
da peroxidação lipídica dos peixes expostos às blendas B5 e B20 pode
representar riscos à biota aquática. As análises foram realizadas observando
as alterações bioquímicas em fígado de animais expostos por 2 e 7 dias.
Bedin (2013) comparou biodiesel etílico de diferentes oleaginosas (B5,
B20 e B100) com óleo diesel usando tilápia disposta em aquário contaminado
com os combustíveis, em 15 e 30 dias de exposição, e atestou que B5 e B20
são mais tóxicos que B100. O óleo diesel puro apresentou a maior toxicidade
provavelmente pela composição de HAP presentes. As análises evidenciaram
alterações em nível enzimático (EROD, GST, SOD, CAT e GPx –
etóxiresorufina-O-dietilase, glutationa S-transferase, superóxido dismutase,
catalase e glutationa peroxidase) em fígado e brânquias, além da peroxidação
lipídica.
O processo de esterificação metílica pode produzir substâncias com
atividade tóxica que causam danos genotóxicos em eritrócitos do peixe,
observados através da quantificação dos micronúcleos no teste do cometa
(Felício et al., 2015).
54
Oliveira (2013) via teste de Ames, também observou efeitos genotóxicos
em eritrócitos de Danio rerio, bem como influência sobre o desenvolvimento
embrionário de curimba (Prochilodus lineatus) expostos à fração solúvel de
biodiesel de óleo de soja residual de fritura testado em diferentes
concentrações.
Testes de toxicidade aguda (96 h) realizados com Daphnia magna e de
genotoxicidade de Allium cepa revelam na fração solúvel da água proveniente
do óleo residual vegetal de soja, de biodiesel (B2, B5, B3, B10, B20, B50,
B100) e diesel puro, resultaram em toxicidade maior para volumes crescentes
de diesel nas blendas, como consequência da presença de alcanos e
naftalenos no diesel (Tjarinto et al., 2014).
De acordo com Cavalcante et al. (2014) o biodiesel de óleo de girassol,
de um modo geral, pode levar as células ao estresse, provocar alterações
bioquímicas (determinação de espécies reativas de oxigênio – ROS e de
enzimas antioxidantes) e genéticas (teste do cometa), além de apresentar
efeito citotóxico em células hepáticas de Danio rerio. Os autores também
observaram que o biodiesel metílico apresenta mais toxicidade em relação ao
etílico. Para isso foram testadas as frações solúveis em diversas
concentrações.
Nogueira et al. (2015) submeteram mexilhões (Perna perna) a exposição
a concentrações de 0,01 e 0,1 ml/L de biodiesel metílico (B5) por 6, 12, 48 e
168 horas. Em seguida suas vísceras foram retiradas e avaliadas quanto às
atividades de enzimas antioxidantes (SOD – dismutase superóxido; CAT –
catalase; GPx – glutationa dismutase; GR – glutationa redutase, níveis de
glutationa (GSH) e de peroxidação). Os autores observaram que em longo
prazo o B5 pode causar alterações relevantes em guelras, glândulas digestivas
e em GSH, diminuindo a ação antioxidante destas enzimas.
Jurcak et al. (2015) avaliaram a capacidade de encontrar alimento e o
comportamento de 50 lagostas (Orconectes rusticus) frente ao petróleo bruto e
biodiesel (B100), por uma semana. Observaram que o comportamento não
mudou, contudo a capacidade de escolher o alimento foi afetada, de modo que
os combustíveis podem agir como poluentes sensoriais mascarando o odor dos
alimentos, levando ao desequilíbrio na cadeia trófica aquática.
55
Ademais, as misturas de diesel/biodiesel podem causar grandes
contaminações de águas, levando a impactos ambientais maiores, em função
da presença de substâncias tóxicas e recalcitrantes, como compostos
orgânicos voláteis e anéis aromáticos e seus derivados (Mitre et al., 2012).
Assim, o ecossistema aquático tem sido avaliado do ponto de vista da
toxicidade ambiental desde os anos de 1970, e os três básicos mais indicados
na literatura devido a sua sensibilidade é o teste utilizando algas, teste agudo
usando Daphnia e Microtox (Vibrio fischeri), crustáceos, peixes e microalgas,
além de testes genotóxicos. Neste sentido, recomenda-se que a sensibilidade,
praticidade e que vários níveis tróficos (decompositores, produtores primários e
consumidores) sejam utilizados para a avaliação da toxicidade (Römbke et al.,
2009).
3.3. Compartimento solo
O solo é meio bastante heterogêneo ambientalmente, de modo que a
deposição, acumulação nos gradientes e a distribuição de substâncias
químicas se expressem de forma altamente heterogênea. Os primeiros efeitos
da toxicidade ambiental utilizando solo datam da década de 1960, os quais
relatavam sobre os efeitos de pesticidas sobre invertebrados. Tais ensaios só
foram padronizados pela OECD (Organization for Economic Co-operation and
Development) 15 anos mais tarde (Van Gestel, 2012). Isso em parte explica
porque os trabalhos relacionados com as pesquisas sobre biodiesel em solo
são menos frequentes que em outros ambientes.
Assim, no compartimento solo foram encontrados apenas cinco
publicações (6,7% do total considerado) a respeito da ecotoxicidade do
biodiesel comparado com diesel ou outros óleos vegetais, por meio do uso de
sementes e/ou medindo a atividade microbiana.
As investigações sobre o biodiesel afirmam que mesmo sendo menos
tóxico ao meio ambiente e rapidamente biodegradável, alguns componentes
como fito-estrogênios e fito-esteróis (presentes em óleo de soja) podem
contribuir para elevar a toxicidade do biodiesel, ao serem oxidados através da
exposição à radiação, luz, aquecimento, transformando-se em compostos com
efeitos biológicos controversos. Ou seja, os solos contaminados com misturas
56
de biodiesel e diesel podem promover efeitos genotóxicos/mutagênicos
induzindo câncer e mutações de pares de bases de substituição nos
organismos expostos, mesmo o biocombustível sendo considerado menos
impactante e mais sustentável do ponto de vista ambiental (Peterson & Möller,
2010).
Assim, Lapinskienè et al. (2006) avaliaram a toxicidade do biodiesel de
canola e do óleo diesel no solo, em concentrações de 1, 3, 6, 9 e 12% desses
combustíveis em solo. Em solo contaminado com biodiesel, as atividades
respiratórias dos micro-organismos e das enzimas desidrogenases cresceram
quando a concentração aumentou em 12%, porém o biodiesel se mostrou
biodegradável. Em solo contaminado com óleo diesel, essas taxas aumentaram
até a concentração de 3% e diminuíram em concentrações maiores, ficando
abaixo da atividade do solo não contaminado (controle), determinando
toxicidade do óleo diesel quando em concentração maior que 3%, o qual
também não apresentou biodegrabilidade. Como parte das conclusões,
relataram que o diesel contém mais materiais resistentes à degradação
microbiana enquanto que o biodiesel contém compostos que são mais
facilmente biotransformados.
Leme et al. (2010, 2012a) avaliaram os efeitos nocivos da contaminação
do solo com biodiesel (B100) e as blendas (B5, B20 e B50) em relação ao
diesel (D100), utilizando diferentes ensaios biológicos, e verificando o potencial
citotóxico e genotóxico de solos contaminados com estes combustíveis via
detecção de mudanças no potencial de membrana mitocondrial (células de
ovário de hamster chinês e célula T humana), reconhecimento de apoptose por
anexina V, in vitro usando kit de ensaio, por ensaio de mutagenicidade em
Salmonella e via teste com sementes de cebola (Allium cepa). O óleo diesel se
apresentou mais tóxico provavelmente pela presença de HAP. As amostras de
biodiesel e suas blendas apresentaram menor toxicidade, porém também
demonstraram poder causar impactos ambientais.
Testes toxicológicos realizados com minhocas (Eisenia foetida),
sementes de alface (Lactuca sativa) e rúcula (Eruca sativa) em período de
zero, 60, 120 e 180 dias, revelaram que biodiesel de soja (B100) apresentou
maior toxicidade que óleo de soja novo, seguido de óleo de soja de fritura. A
provável causa para o biodiesel foi dada pela presença de produtos
57
secundários de degradação e do antioxidante sintético TBHQ (terc-butil
hidroquinona a 10 mg/L) (Yassine et al., 2012).
O monitoramento da biodegradação em solo contaminado com biodiesel
de soja (B100), óleo diesel puro e petróleo, após 240 dias, foram realizados
utilizando metodologia colorimétrica com 2-6-diclorofenol indofenol (DCPIP)
para verificar a presença de Bacillus subtilis inoculado e a fitotoxicidade em
sementes de alface (Lactuca sativa). As leituras foram realizadas em 0, 60,
120, 180 e 240 dias de incubação e determinaram que o biodiesel é
rapidamente biodegradado devido à presença do éster com dois átomos de
oxigênio, os quais são biologicamente ativos. O diesel, mesmo apresentando
cadeias lineares de alcanos que facilitariam a degradação microbiológica, por
conter outros compostos mais resistentes, foi menos biodegradado que o
biodiesel. O petróleo não foi degradado neste período apresentando maior
toxicidade em relação aos outros óleos avaliados (Cruz et al., 2014).
3.4. Toxicidade oral
Esta abordagem contempla somente cinco trabalhos com ratos (6,7% do
total) muito provavelmente em função das dificuldades relacionadas com o uso
de cobaias e do tempo necessário para se realizar as avaliações, uma vez que
podem ser abrangidos estudos agudos e/ou crônicos. Observou-se que todas
as amostras testadas causam alterações severas clínicas e histológicas em
nível hepático, renal, tireóide e celular, sendo mais agravadas para os animais
tratados com diesel. De forma unânime, mesmo com a toxicidade indicada pelo
biodiesel, todas as publicações ainda sugerem que o biodiesel pode ser uma
alternativa viável, embora mais estudos sejam necessários, pois este aspecto
reflete apenas em uma parte dos efeitos produzidos.
Assim, em um estudo realizado por Poon et al. (2007) durante quatro
semanas, ratos machos receberam, por 5 dias, por via oral, doses de 500
mg/Kg/dia de biodiesel puro de óleo de soja, de óleo de peixe e de canola, e de
diesel com baixo teor de enxofre, além de um controle com óleo de milho. Os
autores observaram a ocorrência de alterações histopatológicas típicas de
nefropatia nos animais tratados com diesel, biodiesel de soja e de canola;
aumento do peso do fígado na presença de biodiesel de canola, soja e diesel;
58
alterações na tireóide para biodiesel de peixe e timo com peso diminuído
naqueles que ingeriram biodiesel de soja. O óleo diesel foi considerado o mais
tóxico e dentre as amostras de biodiesel o nível maior de toxicidade foi dado
pelo biodiesel de soja, seguido pelos de canola e peixe.
Poon et al. (2009) também observou, após 4 semanas de tratamento,
hepatomegalia e alterações histopatológicas nos rins de 77 ratos machos que
receberam 5, 50 e 500 mg/Kg de biodiesel puro de soja, canola e de fritura,
bem como diesel puro com baixo teor de enxofre. As alterações mais
agressivas foram observadas para aqueles que receberam óleo diesel, sendo
que efeitos lipídicos e o estresse oxidativo foram dependentes da matéria-
prima usada na fabricação do biodiesel.
Aksoy et al. (2012), submeteram ratos albinos de laboratório a
determinadas concentrações de diesel derivado do petróleo e biodiesel oriundo
de óleo de peixe e óleo de girassol, e demonstraram elevadas concentrações
de elementos químicos como cádmio, cobalto, cobre, crômio, nitrogênio e zinco
nos órgãos dos ratos que foram expostos via oral ao biodiesel de óleo de
girassol. Frente a estes resultados, os autores concluem que é preferível a
utilização do biodiesel produzido a partir de óleo de peixe.
Foi realizado um estudo de toxicidade oral induzida (250 e 500 mg/Kg),
com óleo diesel e biodiesel de sementes de papoula (B100) em 35 ratos
machos, sendo verificado os níveis de 17 metais em tecidos do fígado, pulmão,
rins e plasma. Após 21 dias os autores averiguaram que as concentrações
maiores de metais foram encontradas no grupo tratado com óleo diesel,
sugerindo comparativamente uma menor toxicidade para o biodiesel testado
(Aksoy & Sözbilir, 2015).
Aksoy (2015) utilizou 35 ratos machos para avaliar a toxicidade oral de
óleo de girassol (usado como controle a 250 mg/kg), óleo diesel e biodiesel de
peixe, ambos a 250 e 500 mg/kg e diluídos em óleo de girassol (1:1 v/v).
Foram mensurados os níveis de malondialdeído (MDA), glutationa reduzida
(GSH), atividade da catalase (CAT), nitrito (NO2) e nitrato (NO3). Para as
amostras de biodiesel apresentaram toxicidade, em função da peroxidação
lipídica, sendo essa inferior a apresentada pelo óleo diesel, o que confirma a
maior segurança toxicológica do biodiesel frente ao óleo diesel em estudos de
toxicidade oral.
59
3.5. Outros testes de toxicidade para biodiesel
Esse item contemplou 5,3% do total de trabalhos relacionados com o
tema, correspondente a quatro pesquisas publicadas em livros, os quais
basicamente resumiram diversos testes realizados em amostras de biodiesel e
suas misturas, comparando-os com óleo diesel.
Assim, Rodinger (1998) relatou testes variados para comparar biodiesel
de canola (B100) e óleo diesel quanto ao potencial toxicológico agudo. Os
testes realizados foram os seguintes: irritação dérmica (coelhos), irritação
ocular (coelho), toxicidade oral (rato), biodegrabilidade sobre a população
microbiana, mortalidade de Oncorhynchus mykiss (truta) e Lepomis
macrochirus (Bluegill), inibição da mobilidade em Daphnia magna, Gammarus
pulex e Lymnea peregra, crescimento em macrófitas (Lemna minor, Lemna
minuta, Lepidium sativum, Elodea canadenses e Myriophyllum spicatum,),
cianobatéricas (Microcystis aeruginosa e Anabaena spiroides), algas
(Selenastrum capricornutum, Chorella vulgaris e Nannochloris coccoides) e
perda média de peso em peixes (Gasterosteus aculeatus e Pimephales
prometas). O autor concluiu que o biodiesel é mais aceitável do ponto de vista
ambiental que o diesel, uma vez que nos testes utilizados o diesel demonstrou
alta toxicidade para a maioria, menos para pele, e, no caso de biodiesel,
observou-se apenas parcial toxicidade tais como irritação nos olhos e via
inalatória, bem como toxicidade para algas e cianobactérias.
Uma publicação bastante abrangente e detalhada em relação ao perfil
utilizado para cada teste foi apresentada no trabalho de Gateau et al. (2005)
que avaliaram biodiesel de canola, biodiesel do ácido erucico de canola,
biodiesel de girassol e biodiesel de girassol com alto teor de ácido oleico,
utilizando os seguintes testes: composição e características físico-químicas do
material particulado, emissão de vapor e solubilidade em água, teste
toxicológico oral em ratos, toxicidade da fração solúvel em água em
Bradhydanio rerio, Daphnia magna e Selenastrum capricornutum,
determinação do crescimento em Pseudomonas putida, biodegrabilidade final,
toxicidade em camarões, teste de contato com pele e olhos de coelhos. De um
modo geral, os autores observaram que as amostras testadas exibem baixa
60
toxicidade em relação ao diesel, o qual não foi testado, mas foi comparado pelo
uso de dados da literatura.
Peterson & Möller (2010) relataram um estudo contratado pela
Universidade de Idayo sobre toxicidade do biodiesel etílico e metílico de canola
(B100, B50, B20), comparando com diesel puro com baixo teor de enxofre. Os
autores observaram que nos testes realizados com Daphnia magna,
Oncorhyncus mykiss (truta arco-íris) e nos testes agudos em coelhos albinos
machos e fêmeas para verificarem a toxicidade aguda oral e dérmica (edema,
eritema, e manifestações benignas na derme), o óleo diesel demonstrou ser
mais tóxico, indicando que o biodiesel é uma alternativa menos impactantes
para o meio ambiente e para a saúde animal.
4. Conclusões
De maneira geral, o comportamento do biodiesel no meio ambiente, em
especial os efeitos provocados sobre seres vivos, é ainda pouco conhecido,
principalmente em virtude da produção de biodiesel em grande escala ser uma
tecnologia recente. Isso reflete no baixo número de publicações relevantes
encontradas sobre os aspectos toxicológicos do biodiesel, sendo de apenas 75
em 18 anos incompletos.
Observou-se assim que neste período as publicações se baseiam em
testes padronizados (United Nations, 2015), avaliando a toxicidade aguda,
crônica potencial ou a existência de bioacumulação, bem como a degradação,
de ordem biótica ou abiótica, para compostos químicos orgânicos. Essa
dinâmica promove a utilização de organismos-teste padronizados, menos que
esses não sejam representativos dos biomas afetados. No entanto, tal situação
permite a comparação do potencial toxicológico de diferentes tipos de
amostras, para um mesmo organismo-teste, permitindo a reprodução dos
testes e comparações interlaboratoriais (Costa et al, 2008).
No que se refere à toxicidade do biodiesel em emissões atmosféricas, as
emissões de diesel demonstram causar mais lesões em nível pulmonar
enquanto o biodiesel causa efeitos vasculares mais agudos. Além disso, as
emissões de combustão de amostras de biodiesel, por apresentarem maiores
quantidades de componentes como aldeídos insaturados, produziram uma
61
resposta inflamatória e aceleraram o estresse oxidativo em células de fígado e
pulmão de ratos, em intensidade maior que a proporcionada pelo óleo diesel
puro.
Apesar da quantidade das emissões totais em combustão de biodiesel
ser menor que a proporcionada pelo óleo diesel, a combustão de biodiesel
também provoca a emissão de maiores quantidades de substâncias tais como
NOx, formaldeído, acroleína e acetona, as quais são comprovadamente muito
tóxicas.
As emissões de combustão de biodiesel também têm efeito mutagênico,
o qual está correlacionado aos compostos carbonila presentes em grande
concentração nesse biocombustível. Entretanto os componentes aromáticos do
óleo diesel conferem maior potencial mutagênico aos produtos de combustão
desse combustível fóssil.
Com relação à ecotoxicidade do biodiesel em água, alguns estudos
demonstram que mesmo apresentando um impacto ambiental menor sobre
organismos aquáticos em caso de derramamentos, ainda assim os efeitos
resultantes da dispersão do biodiesel em meio aquático podem ser similares
aos apresentados pelo óleo diesel.
Situações que provavelmente contribuam pode ser a presença de
fitoesteróis e fitoestrogênios, além de outros componentes residuais da
produção do biodiesel, tal como resíduos de álcool, especialmente o metanol,
bem como de glicerol. Além disso, os ésteres do biodiesel também podem
promover uma maior absorção de algumas substâncias tóxicas presentes no
óleo diesel.
O processo de esterificação metílica também pode produzir substâncias
com atividade tóxica que causam danos embrionários e genotóxicos em
eritrócitos do peixe. Adicionalmente os estudos apontam que o biodiesel
metílico é mais tóxico à biota aquática que o biodiesel etílico.
Também a capacidade de organismos aquáticos de níveis tróficos
superiores escolherem o alimento é afetada, já que tanto o biodiesel como o
óleo diesel pode agir como poluentes sensoriais mascarando o odor dos
alimentos, levando ao desequilíbrio na cadeia trófica aquática.
Com respeito a presença de biodiesel no solo, o óleo diesel é mais
resistente à degradação microbiana, enquanto que o biodiesel é mais
62
facilmente biotransformado. As contaminações com misturas de biodiesel e
diesel podem promover efeitos genotóxicos/mutagênicos, induzindo mutações
e câncer nos organismos expostos.
Em estudos ecotoxicológicos envolvendo a ingestão oral de biodiesel e
suas misturas com diesel, observou-se que todas as amostras testadas
causam alterações clínicas severas e histológicas em nível hepático, renal,
tireóide e celular, sendo que os efeitos são cada vez mais graves a medida que
o percentual de biodiesel é diminuído na mistura com óleo diesel.
Assim, apesar dos efeitos ecotoxicológicos relatados para o biodiesel, de
modo geral sua adição ao óleo diesel é vantajosa por ser menos impactante do
ponto de vista da saúde e do meio ambiente, acelerando a biodegrabilidade do
óleo diesel, além de melhorar a lubricidade do mesmo. Implicando em um
biocombustível de maior viabilidade econômica e ambiental.
5. Referências Bibliográficas
AGARWAL, A. K.; GUPTA, T.; DIXIT, N. & SHUKLA, P. C. Assessment of toxic
potential of primary and secondary particulates/aerosols from biodiesel vis-à-vis
mineral diesel fuelled engine. Inhalation Toxicology, 26 (6): 325-332. 2013.
AJANOVIC, A. Biofuels versus food production: does biofuels production
increase food prices? Energy: 36 (4): 2070-2076. 2011.
ANDRÉ, V.; BARRAUD, C.; CAPRON, D.; PRETERRE, D.; KERAVEC, V.;
VENDEVILLE, C.; CAZIER, F.; POTTIER, D.; MORIN, J. P. & SICHEL, F.
Comparative mutagenicity and genotoxicity of particles and aerosols emitted by
the combustion of standard vs. rapeseed methyl ester supplemented bio-diesel
fuels. Impact of after treatment devices: oxidation catalyst and particulate filter.
Mutation Research, 777: 33-42. 2015.
AKSOY, L. TÜTÜNCÜ, H.; ALPER, Y. & BÜYÜKBEN, A. Bioelement Status
with Oral Administration of Fish Oil Methyl Ester and Diesel Fuel in Male Rats.
Biological Trace Element Research, 149(1): 78-85. 2012.
63
AKSOY, L. Evaluation of oxidant-antioxidant status in oral toxicity of fish oil
methyl esters and diesel fuel in male rats. Toxicology an Industrial Health, 31
(5): 442-447. 2015.
AKSOY, L. & SÖZBILIR, N. B. Trace and major elemento levels in rats after oral
administration of diesel and biodiesel derived from opium poppy (Papaver
somniferum L.) seeds. Toxicology and Industrial Health, 31 (10): 890-897. 2015.
ANDRÉ, V.; BARRAUD, C.; CAPRON, D.; PRETERRE, D.; KERAVEC, V.;
VENDEVILLE, C.; CAZIER, F.; POTTIER, D.; MORIN, J. P. & SICHEL, F.
Comparative mutagenicity and genotoxicity of particles and aerosols emitted by
the combustion of standard vs. Rapeseed methyl ester supplemented bio-diesel
fuels: impact of after treatment devices: oxidation catalyst and particulate filter.
Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, 777:
33-42. 2015.
AZEVEDO, F.A.; CHASIN, A.A.M. Bases Toxicológicas da Ecotoxicologia. São
Carlos, SP: Editora Rima. 2003.
BACKHAUS. T. Medicines, shaken and stirred: a critical review on the
ecotoxicology of pharmaceutical mistures. Philosophical Transactions of the
Royal Society B, 369: 1-11. 2014.
BARNWAL, B.K.; SHARMA, M.P. Prospects of biodiesel production from
vegetable oils in India. Renewable & Sustainable Energy Reviews, v.9, n.4,
p.368-378, 2005. Disponível em: <http://www.sciencedirect.com/science/article
/pii/S136403210400067X> Acesso em: 21/11/2012.
BASS, V. L.; SCHLADWEILER, M. C.; NYSKA, A.; THOMAS, R. F.; MILLER, D.
B.; KRANTZ, T.; KING, C.; IAN GILMOUR, M.; LEDBETTER, A. D.;
RICHARDS, J. E. & KODOVANTI, U. P. Comparative cardiopulmonar toxicity of
exhausts from soy-based biofuels and diesel in healthy and hypertensive rats.
Inhalation Toxicology, 27 (11): 545-556. 2015.
64
BEDIN, B. H. Avaliação de biomarcadores bioquímicos em tilápias
(Oreochromis niloticus) expostos a óleo diesel e biodiesel. Dissertação
apresentação ao Programa de Pós-Graduação em química, Universidade
Estadual „Júlio de Mesquita Filho‟. São José do Rio Preto/SP. 56 p. 2013.
BETHA, R.; PAVAGADHI, S.; SETHU, S.; HANDE, M. P. &
BALASUBRAMANIAN, R. Comparative in vitro cytotoxicity assessment of
airborne particulate matter emitted from stationary engine fuelled with diesel
and waste cooking oil-derived biodiesel. Atmospheric Environment, 61: 23-29.
2012.
BHAVARAJU, L.; SHANNAHAN, J.; WILLIAM, A.; McCORMICK, R.; McGEE,
J.; KODAVANTI, U. & MADDEN, M. Diesel and biodiesel exhaust particle
effects on rat alveolar macrophages with in vitro exposure. Chemosphere, 104:
126-133. 2014.
BRASIL, Lei 13.033 de 24 de setembro de 2014. Dispõe sobre a adição
obrigatória de biodiesel ao óleo diesel comercializado com o consumidor final;
altera as Leis nos 9.478, de 6 de agosto de 1997, e 8.723, de 28 de outubro de
1993; revoga dispositivos da Lei no 11.097, de 13 de janeiro de 2005; e dá
outras providências. Disponível em: <http://www.planalto.gov.br/ccivil_03/_Ato2
011-2014/2014/Lei/L13033.htm> Acesso em: 22/05/2016.
BRITO, J. M.; BELOTTI, L.; TOLEDO, A. C.; ANTONANGELO, L.; SILVA, F. S.;
ALVIM, D. S.; ANDRE, P. A.; SALDIVA, P. H. N. & RIVERO, D. H. R. Acute
cardiovascular and inflamatory toxicity induced by inhalation of diesel and
biodiesel exhaust particles. Toxicological Sciences, 116 (1): 67-78. 2010.
BÜNGER, J.; KRAHL, J.; FRANKE, H. U.; MUNACK, A. & HALLIER, E.
Mutagenic and cytotoxic effects of exhaust particulate matter of biodiesel
compared to fóssil diesel fuel. Mutation Research, 415: 13-23. 1998.
BÜNGER, J.; KRAHL, J.; BAUN, K.; SCHRÖDER, O.; MÜLLER, M.;
WESTPHAL, G.; RUHNAU, P.; SCHULZ, T. G. & HALLIER, E. Cytotoxic and
65
mutagenic effects, particle size and concentration analysis of diesel engine
emissions using biodiesel and petrol diesel as fuel. Archieves of Toxicology,
74: 490-498. 2000a.
BÜNGER, J.; MÜLLER, M.; KRAHL, J.; BAUM, K.; WEIGEL, A.; HALLER, E. &
SCHULZ, T. G. Mutagenicity of diesel exhaust particles from two fóssil and two
plant oil fuels. Mutagenesis, 15 (5): 391-397. 2000b.
BÜNGER, J.; KRAHL, J.; MUNACK, A.; RUSCHEL, Y.; SCHRÖDER, O.;
EMMERT, B.; WESTPHAL, G.; MÜLLER, M.; HALLIER, E. & BRÜNING T.
Strong mutagenic effects of diesel engine emissions using vegetable oil as fuel.
Archieves of Toxicology, 81: 599-603. 2007.
BÜNGER, J.; KRAHL, J.; SCHRÖDER, O.; SCHMIDT, L. WESTPHAL, G. A.
Potential hazards associated with combustion of bio-derived vrsus petroleum-
derived diesel fuel. Critical Reviews in Toxicology, 42 (9): 732-75-. 2012.
CAVALCANTE, D. G. S. M.; DA SILVA, N. D. G.; MARCARNI, J. C.;
MANTOVANI, M. S.; MARIN-MORALES, M. A. & MARTINEZ, C. B. R.
Cytotoxic, biochemical and genotoxic effects of biodiesel produced by different
routes on ZFL cell line. Toxicity in vitro, 28: 1117-1125. 2014.
CHAE, H. J.; YONG, K. E.; HEON, L. J. Toxicity test of biodiesel and biodiesel-
derived neopentyl polyol ester lubricant oil base using microalgae. Korean
Society for Biotechnology and Bioengineering Journal, 20: 55-59, 2005.
CHANG, Y. C.; LEE, W. J. WANG, L. C.; YANG, H. H.; CHENG, M . T.; LU, J.
H.; TSAI, Y. I. & YOUNG, L. H. Effects of waste cooking oil-based biodiesel on
the toxic organic pollutant emissions from a diesel engine. Applied Energy, 113:
631-638. 2014.
CONNON, R. E.; GEIST, J. & WERNER, I. Effect-based tools for monitoring
and predicting the ecotoxicological effects of chemicals in the aquatic
environment. Sensors, 12: 12741-12771. 2012.
66
COSTA, C. R.; OLIVI, P.; BOTTA, C. M. R. & ESPINDOLA E. R. G. A
toxicidade em ambientes aquáticos: discussão e métodos de avaliação.
Química Nova, 31(7): 1820-1830, 2008.
COSTA NETO, P. R.; ROSSI, L. F. S.; ZAGONEL, G. F. & RAMOS, L. P.
Produção de Biocombustível alternativo ao óleo diesel através da
transesterificação de óleo de soja usado em frituras. Química Nova, 23: 531-
537. 2000.
CRUZ, J. M.; TAMADA, I. S.; LOPES, P. R. M.; MONTAGNOLLI, R. N. &
BIDOIA, E. D. Biodegradation an phytotoxicity of biodiesel, diesel, and
petroleum in soil. Water, Air, Soil Pollution, 225: 1962-1970. 2014.
DA CRUZ, A. C. S.; LEITE, M. B. N. L.; RODRIGUES, L. E. A. & NASCIMENTO
R. A. Estimation of biodiesel cytotoxicity by using acid phosphatase as a
biomarker of lysosomal integrity. Bulletin of Environmental Contamination and
Toxicology, 89: 219-224. 2012.
ECKL, P. M.; LEIKERMOSER, P.; WÖGETTER, M.; PRANKL, H. & WURST, F.
Mutagenic potential of diesel and biodiesel exhausts. in Plant Oils as Fuel:
Present State of Science and Future Developments, eds. Martini, N. and Schell,
J. S., Springer, Berlin, Germany, 123-140. 1998.
FARIAS, A. C. M., DE SANTANA, J. S.; OLIVEIRA FILHO, M. F.; BARBOSA,
C. R. F. & DE MEDEIROS, J. T. N. Os combustíveis verdes do Brasil – avliação
da lubricidade do biodiesel B5 e óleos de mamona e coco. HOLOS, 27 (3): 1-
17. 2011.
FELÍCIO, A. A.; PARENTE, T. E. M.; MASCHIO, L. R.; NOGUEIRA, L.;
VENANCIO, L. P. R.; REBELO, M. F.; SCHLENK, D. & ALMEIDA, E. A.
Biochemical responses, morphometric changes, genotoxic effects and CYP1A
expression in the armored catfish Pterygoplichthys anisitsi after 15 days of
exposure to mineral diesel and biodiesel. Ecotoxicology and Environmental
Safety, 115: 26-32. 2015.
67
FIRRISA, M. T.; VAN DUREN, I. & VOINOV, A. Energy efficient for rapeseed
biodiesel production in different farming systems. Energy Efficiengy, 7: 79-95.
2014.
FINCH, G. L.; HOBBS, C. H.; BLAIR, L. F.; BARR, E. B.; HAHN, F. F.;
JARAMILLO, R. J.; KUBATKO, J. E.; MARCH, T. H.; WHITE, R. K.; KRONE, J.
R.; MÉNACHE, M. G.; NIKULA, K. J.; MAUDERLY, J. L.; VAN GERPEN, J.;
MERCEICA, M. D.; ZIELINSKA, B.; STANKOWSKI, L.; BURLING, K. &
HOWELL, S. Effects of subchronic inhalation exposure of rats to emissions from
a diesel engine burning soybean oil-derived biodiesel fuel. Inhalation
Toxicology: International Forum for Respiratory Research, 14 (10): 1017-1048.
2002.
FONTARAS, G.; KOUSOULIDOU, M.; TZAMKIOZIS, T.; PISTIKOPOULOS, P.;
NTZIACHRISTOS, L.; BAKEAS, E.; STOURNAS, S. & SAMARAS, Z. Effects of
low concentration biodiesel blends application on modern passenger cars. Part
1: feedstock impact on regulated pollutants, fuel consumption and particle
emissions. Environmental Pollution, 158: 1451-1460. 2010 (a).
FONTARAS, G.; KARAVALAKIS, G.; KOUSOULIDOU, M.; NTZIACHRISTOS,
L.; BAKEAS, E.; STOURNAS, S. & SAMARAS, Z. Effects of low concentration
biodiesel blends application on modern passenger cars. Part 2: impact on
carbonyl compound emissions. Environmental Pollution, 158: 2496-2503. 2010
(b).
FUKAGAWA, N. K.; LI, M.; POYNTER, M. E.; PALMER, B. C.; PARKER, E.;
KASUMBA, J. & HOLMÉN, B. A. Soy biodiesel and petrodiesel emissions differ
in size, chemical, composition and stimulation of inflammatory responses in
cells and animals. Environmental, Science & Technology, 47: 12496-12504.
2013.
GAGNON, M. L. Mutagenicity and dioxin-like activity of biodiesel emissions.
Thesis submitted to the Faculty of Graduate and Postdoctoral Studies in partial
fulfillment of the requirements for the M.Sc. degree in Chemical and
68
Environmental Toxicology. University of Ottawa, Canada, 123 p. 2008.
Disponível em: <https://www.ruor.uottawa.ca/bitstream/10393/27980/1/MR5088
0.PDF> Acesso em 09/02/2016.
GATEAU, P.; VAN DIEVOET, F.; BOUILLON, V.; VERMEERSCH, G.,
CLAUDE, S. & STAAT, F. Environmentally friendly properties of vegetable oil
methyl esters. Oilseeds and fats, Crops and Lipids, 12 (4): 308-313. 2005.
GAVETT, S. H.; WOOD, C. E.; WILLIAMS, M. A.; CYPHERT, J. M.; BOYKIN,
E. H.; DANIELS, M. J.; COPELAND, L. B.; KING, C.; KRANTZ, T. Q.;
RICHARDS, J. H.; ANDREWS, D. L.; JASKOT, R. H. & GILMOUR, M. I. Soy
biodiesel emissions have reduced inflammatory effects compared to diesel
emissions in healthy and allergic mice. Inhalation Toxicology, 27 (11): 533-544.
2015.
GERLOFS-NIJLAND, M. R.; TOTLANDSCAL, A. I.; TZAMKIOZIS, T.;
LESEMAN, D. L. A. C.; SAMARAS, Z.; LAG, M.; SCHWARZE, P.;
NTZIACHRISTOS, L. & CASSEE, F. R. Cell toxicity and oxidative potential of
engine exhaust particles: impact of using particulate filter of biodiesel fuel blend.
Environmental, Science & Technology, 47: 5931-5938. 2013.
HAWLEY, B.; L‟ORANGE, C.; OLSEN, D. B.; MARCHESE, A. J. & VOLCKENS,
J. Oxidative stress and aromatic hydrocarbon response of human bronchial
epithelial cells exposed to petro- or biodiesel exhaust treated with a diesel
particulate filter. Toxicological Sciences, 141 (2): 505-514. 2014.
HEMMINGSEN, J. G.; MOLLER, P.; NOJGAARD, J. K.; ROURSGAARD, M. &
LOFT S. Oxidative stress, genotoxicity, and vascular cell adhesion molecule
expression in cells exposed to particulate matter from combustion of
conventional diesel and methyl ester biodiesel blends. Environmental Science
& Technology, 45: 8545-8551. 2011.
HERVÉ, G.; AGNETA, F. & YVES D. Biofuels and world agricultural markets:
outlook for 2020 and 2050 in Economic effects of biofuel production. 129-162.
69
2011. Disponível em: <http://www.intechopen.com/books/economic-effects-of-
biofuel-production/biofuels-and-world-agricultural-markets-outlook-for-2020-
and-2050>. Acesso em 03/05/2016.
HOLANDA, J. N.; MACIEL, A. P. & SANTOS, R. L. Avaliação ecotoxicológica
da água de lavagem da purificação de biodiesel de soja metílico utilizando
Danio rerio como organism-teste. Boletim do Laboratório de Hidrobiologia, 25
(1): 13-20. 2012.
JALAVA, P.I.; TAPANAINEN, M.; KUUSPALO, K.; MARKKNANEN, A.;
HAKULINEN, P,; HAPPO, M.S.; PENNANEN, A.S.; IHALAINEN, M.; YLI-
PIRILÄ, P,; MAKKONEN, U,; TEINILÄ, K.; MÄKI-PAAKKANEN, J.; SALONEN,
R.O.; JOKINIEMI, J., HIRVONEN, M.R. Toxicological effects of emission
particles from fossil- and biodiesel-fueled diesel engine with and without
DOC/POC catalytic converter. Inhalation Toxicology, 22 (2): 48–58. 2010.
JANAUN, J. & ELLIS, N. Perspectives on biodiesel as a sustainable fuel.
Renewable and sustainable energy reviews. 14: 1312-1320. 2010.
JURCAK, A. M.; GAUTHIER, S. J. & MOORE, P. A. The effects of biodiesel and
crude oil on the foraging behavior of rusty crayfish, Orconectes rusticus.
Archives of Environmental Contamination and Toxicology, 69: 557-565. 2015.
KADO, N. Y. & KUSMICKY, P. A. Biossay analyses of particulate matter from a
diesel bus engine using various biodiesel feedstock fuels: Final report; report 3
in a series of 6. University of California, Departiment of Environmental
Toxicology Report NREL/SR-510-31463, National Renewable Energy
Laboratory, Golden, USA. 26 p. 2003.
KARAVALKIS, G.; FONTARAS, G.; AMPATZOGLOU, D.; KOUSOULIDOU, M.
STOURNAS, S.; SAMARAS, Z. & BAKEAS, E. Effects of low concentration
biodiesel blends application on modern passenger cars. Part 3: impact on PAH,
nitro-PAH, and oxy-PAH emissions. Environmental Pollution, 158: 1584-1594.
2010.
70
KHAN, N.; WARITH, M. A. & LUK, G. A comparison of acute toxicity of
biodiesel, biodiesel blends, and diesel on aquatic organisms. Air & Waste
Management Association, 57: 286-296. 2007.
KISIN, E. R.; YANAMALA, N.; FARCAS, M. T.; GUTKIN, D. W.; SHURIN, M. R.;
KAGAN, V. E.; BUGARSKI, A. D. & SHVEDOVA, A. A. Abnormalities in the
male reproductive system after exposure to diesel and biodiesel blend.
Environmental and Molecular Mutagenesis, 56: 265-276. 2015.
KNIE, J.L.W.; LOPES, E.W.B. Testes Ecotoxicológicos: métodos, técnicas e
aplicações. Florianópolis, SC: FATMA/GTZ. 2004.
KOOTER, I. M.; VAN VUGT, M. A. T. M.; JEDYNSKA, A. D.; TROMP, P. C.;
HOUTZAGER, M. M. G.; VERBEEK, R. P.; KADIJK, G.; MULDERIJ, M. &
KRUL, C. A. M. Toxicological characterization of diesel engine emissions using
biodiesel and a closed soot filter. Atmospheric Environment, 45: 1574-1580.
2011.
KOUSOULIDOU, M.; NTZICHRISTOS, L.; FONTARAS, G. & SAMARAS, Z.
Impact of biodiesel application at various blending ratios on passanger cars of
different fueling technologies. Fuel, 98: 88-94. 2013.
KRAHL, J.; BAUM, K., HACKBARTH, U.; JEBERIEN, H. E.; MUNACK, A.;
SCHÜTT, C.; SCHRÖDER, O.; WALTER, N.; BÜRGER, J.; MÜLLER, M. M. &
WEIGEL, A. Gaseous compounds, ozone precursors, particle number and
particle size distributions, and mutagenic effects due to biodiesel. Transactions
of the American Society of Agricultural Engineers, 44 (2): 179-191. 2001.
KRAHL, J.; MUNACK, A.; GROPE, N.; RUSCHEL, Y.; SCHRÖDER, O. &
BÜNGER, J. Biodiesel, rapeseed oil, gas-to-liquid, and a premium diesel fuel in
heavy duty diesel engines: endurance, emissions and health effects. Clean, 35
(5): 417-426. 2007.
71
KRAHL, J.; KNOTHE, G.; MUNACK, A.; RUSCHEL, Y.; SCHRÖDER, O.;
HALLIER, E.; WESTPHAL, G. & BÜNGER, J. Comparison of exhaust
emissions and their mutagenicity from the combustion of biodiesel, vegetable
oil, gas-to-liquid and petrodiesel fuels. Fuel, 88: 1064-1069. 2009.
KRULL, M. & BARROS, F. Key issues in aquatic ecotoxicology in Brazil: a
critical review. Journal of the Brazilian Society of Ecotoxicology 7 (2): 57-66.
2012.
LAPINSKIENE, A.; MARTINKUS, P.; REBZDAITE, V. Eco-toxicological studies
of diesel and biodiesel fuels in aerated soil. Environmental Pollution, 142: 432 -
437. 2006.
LEITE, M. B. N. L.; DE ARAÚJO, M. M. S.; NASCIMENTO, I. A.; DA CRUZ, A.
C. S.; PEREIRA, S. A. & DO NASCIMENTO, N. C. Toxicity of water-soluble
fractions of biodiesel fuels derived from castor oil, palm oil, and waste cooking
oil. Environmental Toxicology and Chemistry, 30 (4): 893-897. 2011.
LEITE, M. B. N. L; DA CRUZ, A. L.; RODRIGUES, L. E. A.; YAMASHITA, S. R.;
CARQUEJA, C. R. G. & NASCIMENTO, I. A. Comparing the toxicity of water-
soluble fractions of biodiesel, diesel and 5% biodiesel/diesel blend on
Oreochromis niloticus using histological biomarkers. Bulletin of Environmental
Contamination and Toxicology, 95: 574-581. 2015.
LEME, D. M. Avaliação da genotoxicidade e mutagenicidade de misturas
comerciais de diesel e biodiesel puras e em simulações de vazamento em água
e solo. Tese apresentada ao Instituto de Biociências de Rio Claro: SP. 204 f.
2010.
LEME, D.M.; GRUMMT, T.; HEINZE, R.; SEHR, A.; SKERSWETAT, M.; DE
MARCHI, M. R. R.; MACHADO, M. C.; OLIVEIRA, D. P.; MARIN-MORALES,
M.A. Cytotoxicity of water-soluble fraction from biodiesel and its diesel blends to
human cell lines. Ecotoxicology and Environmental Safety, 74 (8): 2148-2155.
2011.
72
LEME, D. M.; GRUMMT, T.; HEINZE, R.; SEHR, A.; RENZ, S.; REINEL, S.;
OLIVEIRA, D. P.; FERRAZ, E. R. A.; DE MARCHI, M. R. R.; MACHADO, M. C.;
ZOCOLO, G. J.; MARIN-MORALES, M.A. An overview of biodiesel soil
pollution: data based on cytotoxicity and genotoxicity assessments. Journal of
Hazardous Materials, 15: 199-200. 2012a.
LEME, D. M.; GRUMMT, T.; OLIVEIRA, D. P.; SEHR, A.; RENZ, S.; REINEL,
S.; FERRAZ, E. R. A.; DE MARCHI, M. R. R.; MACHADO, M. C.; ZOCOLO, G.
J.; MARIN-MORALES, M.A. Genotoxicity assessment of water soluble fractions
of biodiesel and its diesel blends using the Salmonella assay and the in vitro
MicroFlow® kit (Litron) assay. Chemosphere, 86: 512-520. 2012b.
LIU, Y. Y.; LIN, T. C.; WANG, Y. J. & HO, W. L. Biological toxicities of
emissions from an unmodified engine fueled with diesel and biodiesel blend.
Journal of Environmental Science and Health, Part A: Toxic/Hazardous
Substances and Environmental Engineering, 43 (14): 1735-1743. 2008.
LIU, Y. Y. & LIN, T. C. Carbonyl compounds and toxicity assessment of
emissions from a diesel engine running on biodiesels. Air & Waste Mangement
Association, 59: 163-171. 2009.
MACEK, J.K. Aquatic Toxicology: fact or fiction? In: Environmental Health
Perspectives. V. 34: 159 –163. 1980.
MADDEN, M. C.; BHAVARAJU, L. & KODAVANTI, U. P. Toxicology of biodiesel
combustion products. In Biodiesel-Quality, Emissions and By-Products, ed. G.
Montero & M. Stoytcheva, Intechweb.org, Croatia. 195-214. 2011.
MADDEN, M. C. Comparative toxicity and mutagenicity of soy-biodiesel and
petroleum-diesel emissions: overview of studies from de U.S. EPA, Research
Triangle Park, NC. Inhalation Toxicology, 27 (11): 511-514. 2015.
MAGARA-GOMEZ, K. T.; OLSON, M. R.; OKUDA, T.; WALZ, K. A. &
SCHAUER, J. J. Sensitivity of hazardous air pollutant emissions to the
73
combustion of blends of petroleum diesel and biodiesel fuel. Atmospheric
Environment, 50: 307-313. 2012.
MARIANO, A.P.; TOMASELLA, R.C.; MARTINO, C.; MORAIS, E.B.; MACIEL
FILHO, R.; SELEGHIM, M.H.R.; CONTIERO, J.; TORNISIELO, S.M.T.;
ANGELIS, D.F. Aerobic biodegradation of butanol and diesel oil blends. African
Journal of Biotechnology, 9 (42): 7094-7101. 2010.
MASSUKADO, L. M.; NUNES, M. E. T.; SCHALCH, V. Utilização do Ensaio
Ecotoxicológico para Avaliação da Qualidade do Composto Orgânico
Proveniente dos Resíduos Sólidos Domiciliares. In 26º Congresso Brasileiro de
Engenharia Sanitária e Ambiental. Anais. Porto Alegre, RS: ABES. 2011.
MAUDERLY, J. L. Health issues concerning inhalation of petroleum diesel and
biodiesel exhaust. In Plant Oils as Fuel: Present State of Science and Future
Developments, eds. Martini, N. and Schell, J. S., Springer, Berlin, Germany, pp
92-103. 1998.
McCORMICK,. R. L. The Impact of Biodiesel on Pollutant Emissions and Public
Health. Inhalation Toxicology, Vol. 19, 12: 1033-1039. 2007.
MEHUS, A. A.; REED, R. J.; LEE, V. S. T.; LITTAU, S. R.; HU,
CHENGCHENG, LUTZ, E. A. & BURGESS, J. L. Comparison of acute health
effects from exposures to diesel and biodiesel fuel emissions. Journal of
Ocupational and Environmental Medicine, 57 (7): 705-712. 2015.
MITRE, T. K.; LEÃO, M. M. D. & ALVARENGA, M. C. N. Tratamento de águas
contaminadas por diesel/biodiesel utilizando processo Fenton. Engenharia
Sanitária e Ambiental, 17 (2): 129-136. 2012.
MUDGE, S. Is the use of biofuels environmentally sound or ethical? Journal of
Environmental Monitoring, 10: 701-702. 2008.
MÜLLER, J. B. Avaliação da toxicidade da fração solúvel em água do biodiesel,
diesel e da mistura binária diesel/biodiesel de 5% (B5). Dissertação
74
apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Ambiental da
Universidade Federal de Santa Catarina. Florianópolis/SC. 112p. 2011.
MULLINS, B. J.; KICIC, A.; LING, K. M.; MEAD-HUNTER, R. & LARCOMBE, A.
N. Biodiesel exhaust-induced cytotoxicity and proinflammatory mediator
production in human airway epithelial cells. Environmental Toxicology, 31 (1):
44-57. 2016.
NOGUEIRA, L. SANCHES, A. L. M.; DA SILVA, D. G. H.; FERRIZI, V. C.;
MOREIRA, A. B. & DE ALMEIDA E. A. Biochemical biomarkers in Nile tilapia
(Oreochromis niloticus) after short-term exposure to diesel oil, pure biodiesel
and biodiesel blends. Chemosphere, 85 (1): 97-105. 2011.
NOGUEIRA, L.; DA SILVA, D. G. H.; OLIVEIRA, T. Y. K.; DA ROSA, J. M. C.;
FELÍCIO, A. A. & ALMEIDA, E. A. Biochemical responses in armored catfish
(Pterygoplichthys anisitsi) after short-term exposure to diesel oil, pure biodiesel
and biodiesel blends. Chemosphere, 93: 311-319. 2013.
NOGUEIRA, L.; GARCIA, D.; TREVISAN, R.; SANCHES, A. L. M.; ACOSTA, D.
S.; DAFRE, A. L.; OLIVEIRA, T. Y. K. & ALMEIDA, E. A. Biochemical
responses in mussels Perna perna exposed to diesel B5. Chemosphere, 134:
210-216. 2015.
OLIVEIRA, D. G. S. Toxicidade em peixes submetidos à fração solúvel do
biodiesel de oleo de soja queimado. Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Veterinárias, Universidade Federal de Lavras, 78p.
2013.
PEREIRA, C.M.P.; HOBUSS, C.B.; MACIEL, J.V.; FERREIRA, L.R.; DEL PINO,
F.B.; MESKO, M.R. 2012. Biodiesel renovável derivado de microalgas: avanços
e perspectivas tecnológicas. Química Nova, 35 (10): 2013-2018. 2012.
PEREIRA, S.A.; ARAÚJO, V. Q.; REBOUCAS, M. V.; VIEIRA, F. S. V.; DE
ALMEIDA, M. V. A.; CHINALIA, F. A. & NASCIMENTO, I. A. Toxicity of
75
biodiesel, diesel and biodiesel/diesel blends: comparative sub-lethal effects of
water-soluble fractions to microalge species. Bulletin Environmental
Contamination and Toxicology, 88: 234-238. 2012.
PETERSON, C. L. & MÖLLER, G. Biodiesel Fuels: biodegradability, biological
and chemical oxygen demand, and toxicity. In The Biodiesel Handbook, ed. G.
Knothe, K. Jürgen & J. Van Gerpen, 2nd ed., 231-246. 2010.
PINTO, A.C.; GUARIEIRO, L. L. N.; REZENDE, M. J. C.; RIBEIRO, N. M.;
TORRES, E. A.; LOPES, W.A.; PEREIRA, P. A. P. & ANDRADE, J. B.
Biodiesel: An Overview. Journal Brazilian Chemical Society, 16: 1313-1330.
2005.
POON, R.; CHU, I.; VALLI, V. E.; GRAHAM, L.; YAGMINAS, A.; HOLLEBONE,
B.; RIDEOUT, G. & FINGAS, M. Effects of three biodiesels and a low sulfur
diesel in male rats – a pilot 4-week oral study. Food and Chemical Toxicology,
45: 1830-1837. 2007.
POON, R.; VALLI, V. E., RIGDEN, M.; RIDEOUT, G. & PELLETIER, G. Short-
term oral toxicity of three biodiesels and an ultra-low sulfur diesel in male rats.
Food and Chemical Toxicology, 47: 1416-1424. 2009.
RELYEA, R. & HOVERMAN, J. Assessing the ecology in ecotoxicology: a
review synthesis in freshwater systems. Ecology Letters, 9: 1157-1171. 2006.
RODINGER, W. Toxicology and ecotoxicology of biodiesel fuel. in Plant Oils as
Fuel: Present State of Science and Future Developments, eds. Martini, N. and
Schell, J. S., Springer, Berlin, Germany, pp 161-180. 1998.
RÖMBKE, J.; MOSER, H. & MOSER, T. Overview on the results of the ring test.
In Ecotoxicological Characterization of Waste – Results and Experiences of an
International Risng Test. eds. H. Moser & J. Römbke, Springer, New York, pp.
3-26. 2009.
76
ROSEN, G.; DOLECAL, R. E.; COLVIN, M. A. & GEORGE, R. D. Preliminary
ecotoxicity assessment of generation alternative fuels in seawater.
Chemosphere, 104: 265-270. 2014.
SCHRÖDER, O.; BÜNGER, J.; MUNACK, A.; KNOTHE, G. & KRAHL, J.
Exhaust emissions and mutagenic effects of diesel fuel, biodiesel and biodiesel
blends. Fuel, 103: 414-420. 2013.
SHVEDOVA, A. A.; YANAMALA, N.; MURRAY, A. R.; KISIN, E. R.;
KHALIULLIN, T.; HATFIELD, M. K.; TKACH, A. V.; KRANTZ, Q. T.; NASH, D.;
KING, C.; GILMOUR, M. I. & GAVETT, S. H. Oxidative stress, inflammatory
biomarkers, and toxicity in mouse lung and liver after inhalation exposure to
100% biodiesel or petroleum diesel emissions. Journal Toxicology and
Environmental Health A, 76 (15): 907-921. 2013.
STEINER, S.; CZERWINSKI, J.; COMTE, P.; POPOVICHEVA, O.; KIREEVA,
E.; MÜLLER, L.; HEEB, N.; MAYER, A.; FINK, A. & ROTHEN-RUTISHAUSER,
B. Comparison of the toxicity of diesel exhaust produced by bio- and fossil
diesel combustion in human lung cells in vitro. Atmospheric Environment, 81:
380-388. 2013.
SWANSON, K. J.; KADO, N. Y.; FUNK, W. E.; PLEIL, J. D.; MADDEN, M. C. &
GHIO, A. J. Release of the pro-inflammatory markers by BEAS-2B cells
following in vitro exposure to biodiesel extracts. The Open Toxicology Journal,
3: 8-15. 2009.
TAVARES, M.G.O. Análise físico-química e ecotoxicológica de combustíveis
obtidos a partir do craqueamento termo-catalítico de polímeros. Tese
apresentada ao programa de Doutorado em Ciências Ambientais da
Universidade Federal de Goiás. 81 p. 2008.
TAYLOR, N.S. Novel Approaches to Toxicity Testing in Daphnia magna. Tese
de Doutorado. Birmingham, UK: University of Birmingham. 209 p. 2011.
77
TJARINTO, R & SALAMI, I. R. S. Toxicity test of water-soluble fractions of
waste vegetable oil-based biodiesel and biodiesel/diesel blends on Daphnia
magna and Allium cepa. Proceeding of the 3rd Applied Sciences for Technology
Innovation, 2014.
TRAVISS, N.; LI, M.; LOMBARD, M.; THELEN, B. A.; PALMER, B. C.;
POYNTER, M. E.; MOSSMAN, B. T.; HOLMÉN,B. A. & FUKAGAWA, N. K.
Petrodiesel and waste grease biodiesel (B20) emission particles at rural
recycling center: characterization and effects on lung epithelial cell and
macrophages. Air Quality, Atmosphere and Health, 7: 59-70. 2014.
TOPINKA, J.; MILCOVA, A.; SCHMUCZEROVA, J.; MAZAC, M.; PECHOUT,
M. & VOJTISEK-LOM, M. Genotoxic potential of organic extracts from particle
emissions of diesel and rapeseed oil powered engines. Toxicology Letters, 212:
11-17. 2012.
TURRIO-BALDASSARRI, L.; BATTISTELLI, C. L.; CONTI, L.; CREBELLI, R.;
DE BERARDIS, B.; IAMICLI, A. L.; GAMBINO, M. & IANNACCONE, S.
Emission comparison of urban bus engine fueled with diesel oil and „biodiesel‟
blend. Science of the Total Environment, 327: 147-162. 2004.
UNITED NATIONS. Globally Harmonized System of Classification and Labelling
of Chemical (GHS). 6th ed. New York and Geneva, 2015.
VAN GESTEL, C. A. M. Soil ecotoxicology: state of the art and future directions.
Zookeys, 176: 275-296. 2012.
VOJTISEK-LOM, M.; PECHOUT, M.; DITTRICH, L.; BERÁNEK, V.; KOTEK.;
SCHWARZ, J.; VODICKA, P.; MILCOVÁ, A.; ROSSNEROVÁ, A.; AMBROZ, A.
& TOPINKA, J. Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) and their genotoxicity
in exhaust emissions from a diesel engine during extended low-load operation
on diesel and biodiesel fuels. Atmospheric Environment, 109: 9-18. 2015.
78
XUE, J.; GRIFT, T. E. & HANSEN, A. Effect of biodiesel on engine
performances and emissions. Renewable and Sustainable Energy Reviews, 15:
1098-1116. 2011.
WESTPHAL, G.A.; KRAHL, J.; MUNACK, A.; ROSENKRANZ, N.; SCHRÖDER,
O.; SCHAAK, J.; PABST, C.; BRÜNING, T. & BÜNGER, J. Combustion of
hydrotreated vegetable oil and Jatropha methil ester in a heavy duty engine:
emissions and bacterial mutagenicity. Environmental, Science & Technology,
47: 6038-6046. 2013.
YANAMALA, N.; HATFIELD, M. K.; FARCAS, M. T.; SCHWEGLER-BERRY, D.;
HUMMER, J. A.; SHURIN, M. R.; BIRCH, M. E.; GUTKIN, D. W.; KISIN, E.;
KAGAN, V. E.; BUGARSKI, A. D. & SHVEDOVA, A. A. Biodiesel versus diesel
exposure: enhanced pulmonar inflammation, oxidative stress, and differential
morphological changes in the mouse lung. Toxicology and Applied
Pharmacology, 272: 373-383. 2013.
YASSINE, M. H.; WU, S.; SUIDAN, M. T. & VENOSA, A. D. Microtox aquatic
toxicity of petrodiesel and biodiesel blends: the role of biodiesel”s autoxidation
products. Environmental Toxicology and Chemistry, 31 (12): 2757-2762. 2012.
ZHANG, Z. H.; BALASUBRAMANIAN, R. Physicochemical and toxicological
characteristics of particulate matter emitted from a non-road diesel engine:
comparative evaluation of biodiesel-diesel and butanol-diesel blends. Journal of
Hazardous Materials, 264: 395-402. 2014.
ZUNIGA, A.D.G.; PAULA, M.M.; COIMBRA, J.S.R.; MARTINS, E.C.A.; SILVA,
D.X.; TELIS-ROMERO, J. Revisão: Propriedades físico-químicas do biodiesel.
Pesticidas: Revista de Ecotoxicologia e Meio Ambiente, Curitiba, v. 21, jan./dez.
2011.
79
– Aspectos microbiológicos do biodiesel: uma revisão Capítulo 2
Carrim, A. J. I. & Antoniosi Filho, N. R.*
Laboratório de Métodos de Extração e Separação (LAMES), Instituto de Química,
Universidade Federal de Goiás – Campus II, Samambaia, Goiânia, Goiás, Brasil,
74690-900
E. mail: [email protected]
RESUMO
Os micro-organismos têm sido utilizados em diversas áreas, revelando
aspectos benéficos, com aplicações industriais, para estudos moleculares ou
representando grandes desafios como agentes etiológicos. São considerados
ubíquos e em função da versatilidade que determinados grupos dispõem, como
bactérias, bolores e leveduras, cianobactérias e microalgas, podem ser
reconhecidos com elevado potencial para a produção de biocombustíveis
(bioetanol e biodiesel), atendendo uma demanda de fontes renováveis e
sustentáveis de energia. Esta revisão contribui com uma visão geral sobre as
publicações mais relevantes em relação à produção, deterioração durante o
armazenamento e biorremediação em caso de acidentes e derramamentos
envolvendo biodiesel. Observou-se que o número de publicações foi crescente
até 2014, entretanto observou-se que existe um indicativo de um leve declínio
no número de publicações. Mesmo frente a esta tendência, tanto os micro-
organismos aeróbios como anaeróbios exibem potencialidade reconhecida e
comprovada para fortalecer o campo em franca expansão dos biocombustíveis,
atuando com benefícios na síntese de biodiesel, e da biorremediação de
petroquímicos, ou com malefícios na formação de borras e sedimentos
principalmente no armazenamento de combustíveis.
PALAVRAS-CHAVE: biocombustível; microbiologia; remediação.
80
Microbiological aspects of biodiesel: a review
ABSTRACT
Microorganisms have been used in many areas revealing beneficial aspects
with industrial applications for molecular studies or representing great
challenges as etiological agents. They are considered ubiquitous due to the
versatility that certain groups dispose, such as bacteria, molds and yeasts,
cyanobacteria, and microalgae, known with high potential for biofuel production
(bioethanol and biodiesel), meeting a demand of renewable, sustainable energy
sources. This review contributes to a general view on the publications that are
more relevant regarding production, deterioration during storage and
bioremediation in case of accidents and spills involving biodiesel. We observed
that the amount of publications increased up to 2014, followed by a slight
decrease. Even with this tendency, both aerobic and anaerobic microorganisms
have known, proven potential to strengthen the expanding biofuels field,
bringing benefits to biodiesel synthesis and the bioremediation of
petrochemicals, or harms to the formation of dregs and sediments, especially
regarding biofuels storage.
KEYWORDS: biofuel; microbiology; remediation.
81
1. Introdução
Micro-organismos são responsáveis pos atividades que podem ser
benéficas ou maléficas para combustíveis e biocombustíveis. Assim, a
atividade microbiológica é responsável, por exemplo, pela conversão de
biomassa em petróleo, pela geração de enzimas que convertem óleos graxos
em biodiesel, bem como pela bioremediação de ambientes impactados por
combustíveis fósseis ou biocombustíveis. Por outro lado, os micro-organismos
podem comprometer a qualidade de um combustível, utilizando-o como fonte
de carbono, gerando substâncias indesejadas ou formando biofilme na
interface óleo-água e produzindo estruturas insolúveis, tais como borras e
sedimentos (Bücker et al., 2014; Soriano et al., 2015).
No tocante ao biodiesel, os micro-organismos têm sido objeto de
crescente investigação, já que a presença de tal microbiota pode atuar, por
exemplo: 1) na produção de matérias-primas para a produção de biodiesel 2)
na produção do biocombustível, 3) na produção de outros bioprodutos de
interesse comercial, 4) na biorremediação de ambientes impactados, 5) no
monitoramento da qualidade ambiental, 6) na compreensão de fatores que
alteram a qualidade do biocombustível, especialmente durante seu
armazenamento (Ahmad et al., 2015; Chrzanowski et al., 2012; Hawrot-Paw et
al., 2015; Xia et al., 2015).
Dentre os micro-organismos presentes nos estudos sobre biodiesel
encontram-se as bactérias, os fungos, os vírus e as microalgas. Entretanto,
como o estudo de microalgas apresenta diversas vertentes específicas e de
grande amplitude e os vírus atuam praticamente somente influenciando a
produção de matérias-primas graxas (Gao et al, 2010), optou-se nesse trabalho
por analisar e discutir a evolução dos principais estudos técnicos e científicos
acerca do biodiesel em conjunto com os fungos e bactérias, através da revisão
bibliográfica sistemática.
2. Metodologia
O levantamento dos trabalhos publicados foi realizado utilizando a base
de dados do Web of Knowledge, no período de 1945 a 15 de abril de 2016.
82
Inicialmente fez-se o levantamento e a avaliação da evolução do número
de publicações correlacionando o termo Biodiesel (como título) e Bacteria
(como tópico) e também correlacionando o termo Biodiesel (como título) e
Fungi (como tópico), e das seguintes palavras-chave e formas de busca
descritas na Tabela 2.1, interligando as palavras-chave pela opção AND. Na
seleção das publicações tomou-se o cuidado de considerar publicações
repetidas somente uma única vez.
Tabela 2.1. Descritores suas combinações para cada pesquisa sobre
publicações no Web of Knowledge.
Parâmetros
de Busca
Número da Pesquisa
1 2 3 4
Palavra-
chave
(Situação de
Busca)
Biodiesel
(Título)
Biodiesel
(Título)
Biodiesel
(Tópico)
Biodiesel
(Tópico)
Microorganism
(Títuto)
Microorganism
(Tópico)
Microorganism
(Tópico)
Microorganism
(Tópico)
- - - Biodegradation
(Tópico)
As publicações obtidas foram separadas em 3 temas, de maior
importância para o setor de produção e uso de biodiesel, a saber: 1) uso de
micro-organismos na produção de biodiesel, 2) degradação microbiológica de
biodiesel e 3) biorremediação.
Cada um dos temas foi apresentado em ordem cronológica, iniciando
preferencialmente a partir das publicações mais relevantes.
3. Resultados e discussão
Avaliando-se a evolução do número de publicações existentes desde
1945 a 15 de abril de 2016, correlacionando o termo Biodiesel (como título), e
Bacteria (como tópico), observou-se que a Web of Knowledge apresentou um
total de 336 publicações, distribuídas a partir de 1999, tal como apresentado na
Figura 2.1.
83
Figura 2.1. Itens publicados por ano para os termos Biodiesel (como tíulo) e
Bacteria (como tópico).
Fonte: Web of Knowledge (2016).
Apesar de, em 1998, Zhang et al. terem publicado estudo acerca da
biodegradabilidade de biodiesel em ambientes aquáticos, a primeira publicação
correlacionando bactérias e biodiesel apontada pelo Web of Knowledge,
divulgada em fevereiro de 1999, tratou do uso do farelo de canola resultantes
da produção de biodiesel, para a alimentação de cordeiros (McAllister et al,
1999), com parte do estudo focando a influência do uso desse coproduto da
produção de biodiesel nas bactérias do rúmem dos cordeiros.
O primeiro trabalho correlacionando a produção de biodiesel com
bactérias data de janeiro de 2001, no qual se fez a avaliação do efeito do
conteúdo de metanol e água na produção de biodiesel a partir de óleo vegetal,
com a síntese catalisada por várias lipases num sistema isento de solvente.
Tais lipases foram obtidas a partir da levedura Candida rugosa e das bactérias
Pseudomonas cepacia e Pseudomonas fluorescens (Kaieda et al., 2001).
Assim ocorreram outras duas publicações em 2001, uma em 2003 e
uma em 2004. Houve posteriormente uma crescente evolução no número de
publicações até 2014, período em que as publicações atingiram 62 itens.
Em 2015, houve uma queda para 37 artigos publicados. Tal
comportamento parece estar sendo seguido em 2016, já que passados quase
84
30,0% do corrente ano, ocorreram até o momento (abril/2016) apenas três
publicações, o que sugere um número estimado de 10 publicações para 2016.
Com respeito à evolução do número de publicações existentes desde
1945 a 15 de abril de 2016, correlacionando o termo Biodiesel (como título) e
Fungi (como tópico), a Web of Knowledge apresentou um total de 371
publicações, distribuídas, tal como para bactérias, também a partir de 1999,
(Figura 2.2).
Figura 2.2. Itens publicados por ano para os termos Biodiesel (como título) e
Fungi (como tópico).
Fonte: Web of Knowledge (2016).
Assim, em julho de 1999 foi divulgada a publicação de Shimada et al.
apresentando a conversão de óleo vegetal em biodiesel usando lipase
imobilizada da levedura Candida antarctica. Os autores alcançaram
rendimentos de conversão de óleo em biodiesel da ordem de 98,4%, com a
enzima se mantendo ativa por mais de 50 ciclos de uso, e posteriormente o
processo foi melhorado garantindo seu uso por 70 ciclos (Watanabe et al.,
2000). Como este processo pode ter custo muito elevado, Wu et al. (2003)
utilizou uma lipase de Thermomyces lanuginosus, comercialmente conhecida
como Lipozyma TL IM em alternativa a levedura supra citada, obtendo
resultados promissores para a produção de biodiesel metílico.
O número de publicações, correlacionando biodiesel e fungos,
aumentaram nos anos seguintes, com diminuição em 2004, 2007, 2012 e 2015
85
em relação aos anos imediatamente anteriores. O pico de produção
técnico/científica foi atingido em 2014, com 59 publicações. Em 2015,
ocorreram 39 publicações. E passados quase 30,0% do corrente ano,
ocorreram até o momento de realização da busca apenas sete publicações, o
que projeta um número estimado com cerca de 23 publicações para 2016.
Observou-se que tanto para fungos quanto para bactérias a maioria dos
trabalhos publicados enfoca o uso de lipases para a produção e a
bioremediação de biodiesel, bem como o estudo da biodegradação de biodiesel
pela ação desses micro-organismos.
Com respeito ao levantamento dos trabalhos publicados utilizando a
base de dados da Web of Knowledge (http://apps.webofknowledge.com/), das
palavras-chave e formas de busca descritas na Tabela 2.1, obteve-se os
resultados descritos na Tabela 2.2 para o número total de publicações.
Tabela 2.2. Número total de publicações para cada parâmetro de busca no
Web of Knowledge.
Parâmetros
de Busca
Número da Pesquisa
1 2 3 4 5
Palavra-
chave*
(Situação de
Busca)
Biodiesel
(Título)
Biodiesel
(Título)
Biodiesel
(Tópico)
Biodiesel
(Tópico)
Biodiesel
(Tópico)
Microorganism
(Títuto)
Microorganism
(Tópico)
Microorganism
(Tópico)
Microorganism
(Tópico)
Microorganism
(Tópico)
- - Production
(Tópico)
Degradation
(Tópico)
Total de
Publicações 46 1022 2721 2225 105
Assim, de forma altamente específica, a busca pela associação de
biodiesel e micro-organismos integrando o título de publicações leva a um total
de 46 artigos. Em situações menos específicas, o número de publicações vai
de 105 a 2721, havendo a necessidade de grande refinamento para distinguir
as publicações que tratam especificamente de biodiesel com bactérias e
fungos, em situações de síntese, degradação e remediação de biodiesel.
86
3.1. Revisão da literatura
3.1.1. Uso de micro-organismos na produção de biodiesel
De um modo geral, os micro-organismos produtores de lipídeos podem
ser uma alternativa relevante como fonte de matéria graxa para a produção de
biodiesel, em face da tendência para a escassez de combustíveis fósseis, do
custo em elevação dos óleos e gorduras tradicionalmente usados ou, ainda,
pelo fato de tais oleaginosas competirem com aquelas que são requeridas para
a alimentação. Assim, tem-se intensificado a busca por micro-organismos,
naturais ou geneticamente modificados, que possam se tornar uma potencial e
promissora fonte de energia no futuro, especialmente aqueles micro-
organismos que possam apresentar aplicação industrial para a cadeia
produtiva de biodiesel (Messias et al., 2011).
Neste sentido, Meng et al. (2009) apontam diversos micro-organismos
como candidatos potenciais para este emprego, tais como bactérias
(Acinetobacter calcoaceticus, Arthrobacter sp., Bacillus alcalophilus,
Rhodococcus opacus), bolores (Aspergillus oryzae, Cryptococcus albidus,
Humicola lanuginosa, Mortierella vinacea, Mortierella isabelina) e leveduras
(Candida curvata, Lipomyces starkeyi, Rhodotorula glutinis).
Na busca por matérias-primas alternativas às oleaginosas para produção
de biodiesel, Raposo et al. (2009) apontaram que as leveduras oleaginosas
Rhodosporidium toruloides e Yarrowia lipolytica apresentam-se como uma das
possíveis fontes de óleos para produção de biodiesel.
O fungo Aspergillus terreus, isolado de solo contaminado com petróleo,
produziu lipídeos com perfil de ácidos graxos com cadeia de C14 a C33 e, por
isso, pode ser utilizado nas indústrias de oleoquímicos. Tal fungo também
possui grande potencial para degradar hidrocarbonetos, incluindo os produtos
de oxidação imediata destes. Vale observar que ácidos graxos com cadeia
superior a C24 são incomuns em óleos graxos de plantas, animais e
microalgas (Kumar et al, 2010).
A levedura Lipomyces starkeyi foi capaz de sobreviver e proliferar na
presença de águas residuais de azeite, produzindo lipases e esterases
extracelular, com uma significativa produção de lipídeos, dentre alguns com a
87
prevalência de ácido oleico, o qual apresenta grande potencial de emprego
para produção de biodiesel de segunda geração, de acordo com Yousuf et al.
(2010). Argenbauer et al. (2008) também relataram que a mesma levedura
cultivada em lodo de esgoto produz quantidade considerável de ácidos graxos
que poderiam ser utilizados para produção de biodiesel.
Como fonte alternativa de matéria graxa, Zhang et al. (2011)
determinaram a viabilidade de utilizar Rhodotorula glutinis, Rhodococcus
opacus e Cryptococcus curvatus para converter N-acetilglucosamina (GlcNAc),
proveniente de resíduos de processamento de camarão, em triacilglicerídeos
para o emprego na produção de biodiesel. Dentre os micro-organismos
testados o que apresentou melhor teor de lipídeos foi Cryptococcus curvatus,
por volta de 28,4%, indicando que este resíduo pode ser aproveitado em
conjunto com os micro-organismos na obtenção de lipídeos para produção de
biodiesel.
Micro-organismos produtores de lipases apresentam potencial para a
produção de ésteres metílicos de ácidos graxos (FAME), como alternativa às
lipases comerciais, em face de seu custo elevado (Messias et al., 2011).
Ciudad et al. (2011) avaliaram a capacidade de lipases de Serratia sp.,
Myroides sp., Arthrobacter sp., Bacillus sp., Pseudomonas veroni e
Pseudomonas fluorescens catalisarem a conversão do óleo de canola à
biodiesel, bem como a tolerância celular ao metanol durante o processo de
produção de FAME.
Dheeman et al. (2011) descrevem uma lipase extracelular DS-39 isolada
de Penicillium sp. com potencial para aplicações na produção de biodiesel,
para reestruturação enzimática pela interesterificação de diferentes óleos e
gorduras, além do emprego em biodegradação de derramamentos de óleos no
meio ambiente.
Hu et al. (2012) descrevem a bactéria Rhodopseudomonas palustris
como sendo capaz de biodegradar poluentes orgânicos, além de possuir o
potencial para seu emprego na produção de bioenergia. Os autores descrevem
os mecanismos de algumas enzimas importantes para regulação da produção
dos lipídeos, as quais poderiam ser utilizadas para a produção de biodiesel.
Entre diversos micro-organismos cultivadose produtores de lipídeos,
Gao et al., (2012) identificaram e compararam seis cepas (Yarrowia lipolytica,
88
Limomyces starkeyi, Rhodosporidium toruloides, Cunninghamella blakeleana,
Mycobacterium sp. e Mortierella isabellina) quanto à composição de ácidos
graxos e qual deles o melhor, e apontaram o último isolado como promissor
para a produção microbiana de óleo, o qual produziu 35% de lipídeo.
Em 2013 Sawangkeaw et al. selecionaram diversos produtores com
conteúdo variado de lipídeos como exemplo: Candida curvata (29,0-58,0%),
Cryptococcus albidus (33,0-60,0%), Cryptococcus curvatus (25,0-46,0%),
Lipomyces starkeyi (61,0-68,0%), Rhodosporidium toruloides (58,0-68,0%),
Mucor mucedo (62,0%), Aspergillus oryzae (18,0-57,0%), Cunninghamella
echinulata (35,0-58,0%), Mortierella isabelina (50,0-55,0%), Arthrobacter sp.
(>40,0%), Acinetobacter calcoaceticus (27,0-38,0%), Rhodococcus opacus
(24,0-26,0%) e Bacillus alcalophilus (18,0-24,0%), além de microalgas.
Outros foram citados por Thevenieau & Nicaud (2013), tais como:
Rhodotorula glutinis (72,0%), Yarrowia lipolytica (36,0%), Rhizopus arrhizus
(5,07%), Mucor circinelloides (25,0%), Pythium ultimum (48,0%), Aspergillus
terreus, Pellicularia praticola, Claviceps purpúrea e Cryptococcus laurentii
(Castanha et al., 2014). O tipo de extração dos lipídeos variam desde a
extração tradicional utilizando solventes com polaridade adequada, extração
sob pressão com solvente integrado assim como novos procedimentos (Wang
et al. 2012).
Em função da necessidade de se conhecer as enzimas envolvidas nas
vias metabólicas e desvendar quais micro-organismos apresentam potencial
para a produção de biodiesel com alta eficiência e baixo custo, Lin et al. (2013)
apresentaram uma visão geral dos principais organismos empregados para a
produção de biodiesel em escala industrial, e como a engenharia genética pode
contribuir para as modificações necessárias para melhorar o desempenho de
micro-organismos como Escherichia coli, dentre outros citados no estudo.
Magdouli et al. (2014) abordaram sobre o potencial de diversos micro-
organismos heterotróficos, tais como bactérias, leveduras e bolores, que têm
capacidade de acumularem triacilgliceróis (TAG) e ácidos graxos, fundamentais
para a produção de biodiesel, além de efetuarem a abordagem sobre a
biossíntese de esteróis com aspectos bioquímicos e genéticos, assim como os
fatores abióticos que poderiam influenciar no acúmulo dos lipídeos.
89
Esta contribuição auxiliou na compreensão dos processos de regulação
metabólica para que novas matérias-primas microbiológicas sejam empregadas
para a produção de biodiesel.
Liu et al. (2014) investigaram a otimização e a cinética da etanólise via
fermentação no estado sólido para produção de biodiesel etílico por
Burkholderia cenocepacia suportado em sólido. O processo gerou biodiesel
etílico com 91,3% de rendimento O micro-organismo empregado apresentou
66,9% de sua atividade original após 288 horas de uso no processo de síntese
de biodiesel.
A levedura Metschnikowia pulcherrima foi previamente descrita no
emprego como agente de controle biológico para fungos e atividade
antimicrobiana para leveduras (Oro et al., 2014). Porém Santamauro et al.
(2014) comprovaram que, em condições de baixo custo e sem esterilização
apresentou capacidade de produzir até 40,0% de lipídeos usando glicerol como
fonte de carbono, e assim considerada com potencial aplicação na produção de
biodiesel.
Ahmad et al. (2015) indicaram que Aspergillus oryzae, Mucor plumbeus e
Rhodotorula mucilaginosa são as espécies que apresentam maior potencial
para produzir óleo como matéria-prima utilizada para produção de biodiesel,
dentre microalgas (Chlorella protothecoides e Chlorella zofingiensis), leveduras
Cryptococcus albidus, Rhodotorula mucilaginosa, Yarrowia lipolytica (Rakicka
et al., 2015) e fungos (Aspergillus oryzae e Mucor plumbeus) avaliados.
Os autores chegaram a essa conclusão baseando-se em critérios tais
como: concentração de óleo, composição de ácidos graxos, taxa de consumo
de substrato, taxa de produção e produtividade, colheita de biomassa e custos
de nutrientes.
Além desses trabalhos, há também a publicação de patentes que
descrevem o uso de micro-organismos para a produção de biodiesel, mas que
não fornecem muitos detalhes sobre os próprios micro-organismos, enfatizando
apenas a metodologia e os resultados obtidos para a síntese do
biocombustível.
90
3.1.2. Degradação microbiológica de biodiesel
A degradação de biodiesel pela presença de micro-organismos é um dos
principais problemas enfrentados pela cadeia de produção e uso de biodiesel.
Klofutar & Golob (2007), Hill & Hill (2008) e Hill & Hill (2009) apontaram que a
presença e crescimento de micro-organismos em biodiesel resultam na
formação de sedimentos, lamas e lodo, e, consequentemente, leva à
deterioração da qualidade do biocombustível, bem como a danos a tanques de
armazenagem, dutos, bombas, filtros e válvulas, provocando também
dificuldades na utilização do combustível contaminado.
Os autores supracitados também alertaram que a introdução de
biodiesel em combustíveis fósseis pode aumentar a susceptibilidade desses a
ação de micro-organismos e o critério mais importante para a prevenção de
micro-organismos em combustíveis é a ausência de água disponível/livre,
sendo que em situações nas quais os micro-organismos começam a crescer, a
adição de um biocida pode inibir o seu crescimento.
Por sua vez, Schleicher et al (2009) avaliaram a biodegradação de
biodiesel metílico de canola puro e misturado com diesel, e determinaram que
quanto maior a proporção de diesel, maior a quantidade de bactérias, sendo
que para o biodiesel observaram maior quantidade de fungos. Os autores
também observaram que a estabilidade oxidativa diminuiu rapidamente em
amostras inoculadas com micro-organismos, havendo inclusive o aumento da
turbidez em relação ao biodiesel isento de micro-organismos.
O trabalho realizado por Mariano et al (2010) avaliou a biodegradação
aeróbia de misturas de óleo diesel e butanol (5, 10, 15, 20%, v/v) comparando
com a mistura de óleo diesel/biodiesel (20%, v/v). Para isso utilizaram
Pseudomonas aeruginosa e um indicador redox (2,6-diclorofenol indofenol -
DCPIP), tanto na avaliação com solo quanto com água.
Os autores revelaram resultados inversos, uma vez que no solo a
mistura óleo diesel/biodiesel apresentou melhor biodegradação que em relação
à água. Para a mistura óleo diesel/butanol a degradação foi favorecida pela
solubilização do butanol, tornando-o mais biodisponível até um volume de 10
mL. Após esta quantidade a toxicidade do butanol inibiu o crescimento dos
micro-organismos testados.
91
De acordo com Aktas et al. (2010) micro-organismos isolados de
ambientes marinhos costeiros e com histórico diferente de exposição às
substâncias como biodiesel, hidrocarbonetos e oxigênio, foram capazes de
degradar biodiesel em um mês. Porém, os autores observaram que a
biodegradação anaeróbia em estudo foi acelerada por inóculos sulfato
redutores e metanogênicos que promoveram a corrosão em aço carbono. Os
autores ressaltaram também que para este conjunto é necessário adotar
medidas de precaução ao expor o combustível a tal estrutura metálica.
Em 2011, Sorensen et al. observaram um aumento do crescimento de
bactérias metanogênicas, redutoras de sulfato e bactérias redutoras de nitrato,
ao misturarem micro-organismos isolados de água contaminada (coletada de
tanques de armazenamento de misturas de diesel/biodiesel) com o combustível
diesel/biodiesel.
Ainda compararam com as inoculações em diesel puro. Além do
crescimento mais elevado, perceberam a presença de metano quando os
micro-organismos foram incubados com biodiesel, o que enfatiza a importância
do uso dos métodos de monitoramento microbiológico para garantir a qualidade
e segurança no armazenamento da mistura.
Bento et al., (2006) e Bücker et al. (2011) confirmaram que a
suscetibilidade do óleo diesel pode aumentar com o acréscimo de biodiesel.
Em concentrações de 5%, 10% e 20% da mistura, observaram que os fungos
Paecilomyces sp., Aspergillus fumigatus, Candida silvico e Rhodotorula sp.
degradaram a mistura a partir de 7 dias de armazenamento, implicando em
perdas econômicas para o biodiesel brasileiro.
Para controlar o crescimento microbiano em tanques de armazenamento
de combustíveis, Zimmer et al. (2013) avaliaram a eficácia de dois biocidas
(3,3‟metileno-bis (5-metiloxazolidina) (MBO) e 5-Cloro-2-metil-4-isotiazolina-3-
ona + 2-Metilisotiazol-3(2H)-ona (CMIT/MIT)) em biodiesel (B100, B7, B10) e
óleo diesel (B0), em 0, 7, 14, 21, 42 e 60 dias, utilizando micro-organismos
isolados da fase aquosa de biodiesel e suas misturas, em três concentrações
de crescimento.
Para avaliação da degradação os autores utilizaram espectroscopia por
infravermelho, e observaram que MBO controla apenas baixos níveis de
92
contaminação microbiana, enquanto que CMIT/MIT apresentou maior eficácia
em média e alta concentrações de micro-organismos.
A qualidade do combustível pode ser comprometida enquanto
armazenado devido à formação de biofilmes microbianos que se desenvolvem
na interface óleo/água, incorrendo em perdas econômicas e ambientais. Para
amenizar este problema, Bücker et al. (2014) testaram uma mistura B10 com
inóculos provenientes de lodos contaminados com diesel e incubaram com 5-
metiloxazolidina (MBO) a 100% (puro) e 50%, comparados com
concdentrações finais do controle de 1000, 500 e 0 pm, por mais de 60 dias.
Observaram que o biocida, na concentração de 500 ppm, pode controlar
efetivamente a contaminação microbiana presente em B10. Porém alguns
micro-organismos foram resistentes à ação do MBO.
O fungo Pseudallescheria boydii foi avaliado por 60 dias em meio
aquoso contendo biodiesel produzido a partir de óleo de azeitona, de soja e de
linhaça. Cazarolli et at. (2014) observaram a produção de lipase mais
acentuada em biodiesel de óleo de linhaça, porém após 15 dias, o uso de
biocida foi eficiente para controlar o fungo.
O crescimento dos esporos de Paecilomyces variotti em diferentes
concentrações foi avaliado em diesel puro e biodiesel (B7, B10, B100), após 7,
14, 21, 28, 42 e 60 dias de exposição (Gassen et al., 2015). Para a análise de
degração utilizando infravermelho foi observado que compostos de carbonila
apresentaram diminuição, porém com a possibilidade de compostos
intermediários serem formados em B7. Os resultados indicam que o acréscimo
de biodiesel pode aumentar a suscetibilidade à degradação do biocombustível.
Soriano et al. (2015) avaliaram e compararam o processo de
biodeterioração de óleo diesel, biodiesel de soja (B100), biodiesel de sebo
bovino (B100) e misturados com óleo diesel (B5), armazenados em tanques de
estocagem por um período de 42 dias. Observaram que ocorre sedimentação,
conforme a matéria-prima utilizada e o tempo de estocagem, sendo alta a
ocorrência de contaminação microbiana. A biodeterioração pode ocorrer
durante o processo de armazenamento principalmente na produção das
misturas, apesar de constatarem que o impacto da deterioração foi
relativamente baixo.
93
Com o objetivo de minimizar a contaminação durante o armazenamento
de óleo de fritura por um período longo, Leuchtle et al. (2015) avaliaram o
crescimento de micro-organismos e detectaram a presença de micro-
organismos aeróbios, sugerindo que o ambiente de estocagem favorece o
crescimento destes indivíduos.
3.1.3. Biorremediação
A biorremediação atualmente é uma metodologia muito utilizada para
realizar a descontaminação de solos impactados por hidrocarbonetos e óleos, e
pode ser aplicada principalmente devido a uma grande preocupação sobre os
efeitos de combustíveis, aditivos e biocombustíveis no meio ambiente (Robles
et al., 2015).
A presença de nutrientes inorgânicos e de carbono orgânico em conjunto
com a biomassa microbiana pode estimular a biodegradação dos
hidrocarbonetos oriundos de derramamentos de petróleo em sedimentos de
praia. Por 30 dias Obbard et al. (2004) investigaram o comportamento de
bactérias degradadoras de hidrocarbonetos que aumentaram quase 12 vezes
após este período e melhorou o desempenho de biodegradação em 170 vezes,
com a adição de ácidos graxos facilmente oxidáveis provenientes de biodiesel
puro de palma, os quais favoreceram o processo de biorremediação.
Lutz et al. (2006) evidenciaram que é seguro ambientalmente utilizar
biodieseis como combustíveis alternativos, bem como solventes ou lubrificante,
após constatarem que uma população microbiana aeróbia (Bacillus, Proteus,
Pseudomonas, Citrobacter e Enterobacter) presente em ambientes naturais
abertos é capaz de degradar biodiesel de etílico de palma.
Por outro lado, Fernandez-Alvarez et al. (2006, 2007) avaliaram a
degradação de PAH (hidrocarbonetos policíclicos aromáticos) presentes em
combustíveis fósseis acumulados em areia e rochas em um região praiana,
procedentes de um derramamento, e observaram que, mesmo com o
acréscimo de nutrientes e micro-organismos, não houve aumento significativo
da taxa de degração. Porém, ao aplicarem gradualmente biodiesel de girassol,
a bioremediação da superfície poluída ocorreu com a aceleração da
degradação do óleo residual.
94
De acordo com Suehara et al. (2007), o monitoramento da manutenção
de condições consideradas ótimas para águas residuárias, oriundas da
produção de biodiesel, pode ser realizado utilizando um método simples e
rápido de determinação de óleos, uréia e sólidos, os quais podem se ajustados
para estimular o crescimento microbiano no processo de tratamento destes
efluentes, uma vez que esta população corrobora para que o processo de
biodegradação seja efetivo.
Micro-organismos como leveduras tem capacidade de degradar solo
contaminado com biodiesel e, assim, Soares Junior et al. (2009) utilizaram
Candida viswanathii e observaram que, em concentrações diversas da mistura
biodiesel/diesel, o micro-organismo teve preferência por degradar biodiesel.
Porém, em amostras sem o inóculo, foi constatado melhor degradação do
diesel, provavelmente pela presença do antioxidante TBHQ (terc-butil-
hidroquinona), comum em biodieseis comerciais.
O consórcio bacteriano pode favorecer a biorremediação de ambientes
contaminados com diesel, biodiesel e suas misturas (B20) em condições
aeróbias ou com limitações de aeração e presença ou ausência de nitrato,
como descrito por Cyplik et al. (2011). Com interesse na biodegração destes
combustíveis, identificaram Comamonadaceae e Variovorax sp. com maior
afinidade ao biodiesel em condições aeróbias, além de demonstrarem que a
quantidade mais elevada de biodiesel pode favorecer a ação degradadora do
consórcio estudado.
Na comparação entre a biodegrabilidade de diesel e biodiesel de soja em
concentrações variadas, e seus efeitos sobre a diversidade microbiana do solo,
Silva et al. (2012) utilizaram solo da Mata Atlântica e observaram que quanto
maior a concentração de biodiesel na mistura, maior a biodegradação. Os
autores também observaram a ocorrência na mudança na comunidade
microbiana após o período de incubação, mostrando elevação no número de
micróbios heterotróficos, porém o mesmo não foi observado para B100, o que
poderia comprometer a atividade microbiana geral, uma vez que esta
comunidade foi reduzida.
Enzimas são amplamente utilizadas pela sua capacidade de catalisar
reações com alta especificidade. Produzidas por diversos micro-organismos,
elas podem ser empregadas para processos de biorremediação (Medeiros et
95
al., 2013). Como uma alternativa eficiente e de elevado potencial de
biodegradação do biodiesel, Meyer et al. (2012) identificam, através de ensaios
enzimáticos, um consórcio bacteriano composto por Bacillus megaterium,
Bacillus pumilus, Pseudomonas aeruginosa e Stenotrophomonas maltophilia
que atuaram em solos contaminados com diesel e biodiesel (B20) e suas
misturas com diesel.
Rocha et al. (2013) isolaram cepas com elevado potencial de produção
de lipase para remover óleos e graxas, na etapa de pré-tratamento de águas
residuárias provenientes da purificação do biodiesel. Dentre as cepas
selecionadas, Klebsiella oxytoca apresentou 80,0% de remoção dos óleos e
gorduras presentes no efluente, em 48 horas.
Para monitorar a biodegradação aeróbia de biodiesel metílico de soja
B100, em diversas concentrações, e diesel em ambientes aquáticos, Yassine et
al. (2013a) propuseram um modelo sobre mecanismo de cinética microbiana.
Os autores concluíram que a biodegradação é mais rápida na interface
óleo/água, com taxa de degradação maior para as cadeias longas de carbono e
menor para as ligações duplas.
Observaram também que quanto maior a concentração de biodiesel,
maior a taxa e a velocidade de degradação dos componentes aromáticos
misturados (Yassine et al., 2013b), e que o monitoramento da degradação
utilizando o modelo auxilia estimar os parâmetros e a cinética de
biodegradação em circunstâncias em que a biomassa a ser degradada seja
homogênea e com a presença de fase aquosa, situação esta que favorece o
crescimento de diversos micro-organismos e permite compreender como os
micro-organismos atuam no processo de degradação de substâncias com
baixa solubilidade em água.
Além do acréscimo de biodiesel e culturas microbianas (bactérias e
fungos), a adição de glicerol também pode favorecer a degradação de produtos
de origem fóssil. Lemos et al. (2013) utilizaram duas culturas em dois estágios
de adaptação e avaliaram a biorremediação em solos contaminados com
petróleo e derivados. Após 111 dias constataram uma alta taxa de remoção de
TPH (hidrocarbonetos totais de petróleo) ao final do processo.
Fukuda et al. (2013) estudaram a carga microbiana na água de lavagem
proveniente da produção de biodiesel, após a modificação na etapa de
96
lavagem. Detectaram a presença de Fusarium falciforme e outras espécies no
processo de degradação da água em estudo, os quais não representam risco
ambiental microbiológico em caso deste resíduo ser descartado para o meio
ambiente.
O consórcio integrado por Pseudomonas aeruginosa, Achromobacter
xylosoxidans e Ochrobactrum intermedium foi utilizado para avaliar a eficácia
da bioaumentação sucessiva e convencional e bioestimulação de B10 no solo.
Colla et al. (2014) testaram por 32 dias e variação na comunidade microbiana
de acordo com o tratamento, indicando os micro-organismos para a
degradação de hidrocarbonetos totais de petróleo e biodiesel.
Sunar et al. (2014) comprovaram a eficácia de Pseudomonas putida
como agente biodegradável em solo contaminado com biodiesel B20, assim
como Elazhari-Ali et al. (2013) que utilizaram Psedomonas spp. e observaram
que a velocidade de degradação foi maior para etanol (E10) que para biodiesel
(B20), quando acrescentados ao solo arenoso.
Mariano et al. (2008) avaliaram a biodegrabilidade solo e/ou água
contaminados com diesel e biodiesel utilizando uma metodologia de baixo
custo, o teste de DCPIP (2,6-diclorofenolindofenol). Para a avaliação da
biodegrabilidade realizada por de diferentes concentrações de diesel puro e
misturas de biodiesel de soja (B2, B5 e B20), foram utilizados três inóculos
(Pseudmonas aeruginosa LBI e dois consórcios compostos por bactérias,
fungos filamentosos e leveduras), os quais constataram que o biodiesel é mais
facilmente e mais rapidamente biodegradado que o óleo diesel.
Cruz et al., (2014) utilizaram DCPIP em conjunto com Lactuca sativa e o
acréscimo de Bacillus subtilis, os quais indicaram, após 240 dias de
monitoramento, a eficácia na biodegradação pela interação da microbiota
autóctone e o inóculo introduzido na eficaz biodegrabilidade das amostras de
biodiesel testados.
Horel et al. (2014) realizaram estudos para alcançar eficácia no processo
de biorremediação com variações de temperatura para verificar a quantidade
de inóculo e a influência das fases de crescimento de micror-organismos
isolados de substratos específicos sobre solos contaminados com diesel,
Syntroleum (combustível sintético) e biodiesel produzido com óleo de peixe. Os
autores verificaram que o aumento do inóculo não era necessário e que a fase
97
de adaptação (lag) foi encurtada, favorecendo a degradação dos derivados de
petróleo.
Borges et al. (2014), ao testarem a biodegradação de benzeno na
presença de soja, banha de porco e a partir de óleo de rícino, indicaram que a
biodegradação anaeróbia do benzeno pode ser realizada na presença de
biodiesel.
Em estudo de campo em zona de aquífero subterrâneo, conduzido por 2
anos, Ramos et al. (2013) identificaram organismos como Archaea
(Crenarchaeota e Euryarchaeota), Geobacteraceae (Geobacter e Pelobacter
spp.) e bactérias redutoras de sulfato (Desulfovibrio, Desulfomicrobium,
Desulfuromusa e Desulfuromonas) em ambiente contaminado com biodiesel
B20. A metodologia de bioestimulação fermentativa-metanogênica para
degradar benzeno, tolueno, etilbenzeno e xilenos (BTEX), bem como
hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HAPs) em água subterrânea
contaminada com biodiesel B20, foi indicada por Ramos et al. (2013, 2014)
para degradar o biocombustível, pela ação de micro-organismos como
Desulfitobacterium e Geobacter spp., os quais tem capacidade de interagir e
melhorar a viabilidade de biorremediação em locais contaminados com os
combustíveis estudados.
Assim, o biodiesel pode ser adicionado com bactérias degradantes de
petróleo e nutrientes específicos para degradar áreas com resíduos de
derramento, uma vez que estas áreas apresentam grande dificuldade para a
remoção da contaminação petroquímica. Neste sentido, Xia et al. (2015)
simularam um estudo e verificaram que quanto maior a quantidade de biodiesel
adicionada, mais efetiva foi a remoção, aumentando a atividade de
desidrogenase bacteriana, melhorando assim a biodegradação do óleo.
Kanmani et al. (2015) isolaram Staphylococcus pasteuri e Bacillus subtilis
de efluentes provenientes de fábricas de óleo de coco e produtores da enzima
lipase extracelular. Após purificação da enzima, a caracterizaram quanto à
temperatura e pH, observando um comportamento termófilo e alcalifico, além
de apresentar estabilidade frente aos solventes orgânicos miscíveis em água,
sugerindo que esta enzima isolada a partir des micro-organismos pode ter
aplicação para a produção de biodiesel e detergentes, além da aplicação na
biorremediação de áreas contaminadas com óleos e gorduras.
98
Meyer et al. (2014) obtiveram resultados similares com inóculos de
Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Pseudomonas aeruginosa e
Stenotrophomonas maltophilia em latossolos do sul do Brasil, contaminados
com biodiesel B20 e B100, utilizando atenuação natural e
bioaumentação/bioestimulação como estratégias de biorremediação.
4. Conclusões
Os resultados desta revisão demonstram que o emprego de biomassa
para a produção de biocombustíveis contribui, principalmente, para enfrentar as
dificuldades econômicas decorrentes dos preços elevados de energia e para
reduzir a emissão de gases de efeito estufa, fortalecendo uma economia
sustentável.
Como exemplo, os micro-organismos produtores de lipídeos têm sido
amplamente investigados para a produção de biodiesel, uma vez que exibem
diversas vantagens como: não estão sujeitos às mudanças climáticas;
independem do petróleo para produção de combustível; não competem com a
cadeia de sementes oleaginosas também empregadas como alimentos; são
capazes de acumular grandes quantidades de lipídeos; podem se desenvolver
em meios de baixo custo e que se constituem de coprodutos industriais de
menor valor; apresentam taxa de crescimento elevada; podem ser cultivados
em sistemas fechados; além de contribuírem para diminuir os custos de
produção de biocombustíveis.
Em estudos descritos na literatura técnico/científica foi constatado que
os biocombustíveis como biodiesel são prontamente biodegradáveis e
apresentam uma taxa de biodegradação relativamente alta no meio aquático.
Na presença de biodiesel, os micro-organismos podem promover mais
rapidamente a degradação do óleo diesel e outros derivados petroquímicos,
sendo que a utilização de determinados isolados para degradar componentes
orgânicos pode ser uma opção viável economicamente e segura do ponto de
vista ambiental.
Para os estudos conduzidos em solos contaminados, observou-se que a
biodegradação utilizando cepas isoladas ou em consórcios também pode
99
facilitar o processo uma vez que são capazes de atenuar os efeitos dos
combustíveis, independentemente da metodologia de biorremediação adotada.
Diversos micro-organismos têm crescimento altamente favorável em
combustíveis e, em conjunto com outros fatores, corroboram para a formação
de um sedimento composto por biofilme, também conchecido como borra. Este
resíduo pode ser responsável pela biodegradação, principalmente durante o
seu armazenamento, o que pode comprometer gravemente a qualidade do
combustível em partes do motor que entrar em contato com o produto
degradado.
A contaminação microbiana em petróleo e outros combustíveis têm sido
descrita há décadas, principalmente associada com a presença de água, a qual
é dificilmente controlada e pode alterar outras propriedades como a
viscosidade.
Assim a literatura demonstra que micro-organismos exibem enorme
potencial para contribuir com a cadeia de produção de biodiesel, dada a
possibilidade de serem fontes de lipases usadas como catalisadores do
processo de conversão de óleo em ésteres alquílicos de ácidos graxos. Além
disso, pela produção de biossurfactantes de baixa ou alta massa molecilar, os
micro-organismos podem remediar com eficácia as situações de impacto
ambiental pela presença de biodiesel na forma pura ou misturado a
petroquímicos, tanto em água quanto em solo.
Por outro lado, os micro-organismos podem prejudicar a qualidade do
biodiesel sintetizado pela formação de borras e/ou sedimentos, em situações
de armazenamento inadequado, o que abre um campo ainda pouco explorado
na literatura, que consiste no desenvolvimento de biocidas, principalmente
aqueles que possam também melhorar as propriedades de estabilidade
oxidativa e de fluxo a frio do biodiesel.
Dessa forma, apesar das diversas pesquisas publicadas demonstrando
que micro-organismos podem ser benéficos ou maléficos para a o biodiesel, a
grande diversidade de micro-organismos, as diversas situações ambientais e
os muitos tipos de biodiesel e suas misturas com óleo diesel justificam a
necessidade de que investigações microbiológicas e seus produtos de
publicação, ao contrário do que vem sendo evidenciado nos últimos anos,
100
venham a ser incrementados de forma a garantir sustentabilidade e segurança
para a cadeia de produção e uso de biodiesel.
5. Referências Bibliográficas
AHMAD, F. B.; ZHANG, A.; DOHERTY, W. O. & O‟HARA, I. M. A multi-criteria
analysis approach for ranking and selection of microorganisms for the
production of oils for biodiesel production. Bioresource Technology, 190: 264-
273. 2015.
AKTAS, D. F.; LEE, J. S.; LITTLE, B. J.; RAY, R. I.; DAVIDOVA; LYLES, C. N.
& SUFLITA, J. M. Anaerobic metabolism of biodiesel and its impact on metal
corrosion. Energy Fuels, 24 (5): 2924-2928. 2010.
ARGENBAUER, C.; SIEBENHOFER, M.; MITTELBACH, M. & GUEBITZ, G. M.
Conversion of sewage sludge into lipids by Lipomyces starkeyi for biodiesel
production. Bioresource Technology, 99 (8): 3051-3056. 2008.
BENTO, F. M.; CAMARGO, F.A.O.; GAYLARDE, C.C.; VISCARDI, S. L.;
MENENDEZ, A.; DARODA, R. Suscetibilidade do Óleo Diesel com 2 e 5% de
biodiesel à contaminação microbiana durante a estocagem. Revista Biodiesel,
4: 24-26. 2006.
BORGES, J. M.; DIAS, J. M. & DANKO, A. S. Influence of the anaerobic
biodegradation of diferente types of biodiesel on the natural attenuation of
benzene. Watr Air Soil Pollution, 225: 2146. 2014.
BÜCKER, F.; SANTESTEVAN, N. A.; ROESCH, L. F.; JACQUES, R. J. S.;
PERALBA, C. R.; CAMARGO, F. A. O. & BENTO, F. M. Impact of biodiesel on
biodeterioration of stored Brazillian diesel oil. International Biodeterioration &
Biodegradation, 65: 172-178. 2011.
BÜCKER, F.; BARBOSA, C. S.; QUADROS, P. D.; BUENO, M. K.; FIORI, P.;
HUANG, C. T.; FRAZZON, A. P. G.; FERRÃO, M. F.; CAMARGO, F. A. O. &
101
BENTO, F. M. Fuel biodegradation and molecular characterization of microbial
biofilms in stored diesel/biodiesel blend B10 and the effect of biocide.
International Biodeterioration & Biodegradation, 95: 346-355. Part B. 2014.
CASTANHA, R. F.; MARIANO, A. P.; DE MORAIS, L. A. S; SCRAMIN, S. &
MONTEIRO, R. T. R. Optimization of lipids production by Cryptococcus laurentii
11 using cheese whey with molasses. Brazilian Journal of Microbiology, 45 (2):
379-387. 2014.
CAZAROLLI, J. C.; GUZATTO, R.; SAMIOS, D.; PERALBA, M. C. R.;
CAVALCANTI, E. H. S. & BENTO, F. M. Susceptibility of linseed, soybean, and
olive biodiesel to growth of deteriogenic fungus Pseudallescheria boydii.
International Biodeterioration & Biodegradation, 95 (Part B): 364-372. 2014.
CHRZANOWSKI, Ɫ.; DZIADAS, M.; ⱢAWNICZAK ,Ɫ.; CYPLIK, Ɫ, BIAⱢAS, W.;
SZULC, A.; LISIECKI, P. & JELEŃ, H. Biodegradation of rhamnolipids in liquid
cultures: effect of biosurfactant dissipation on diesel fuel/B20 blend
biodegradation efficiency and bacterial community composition. Bioresource
Technology, 111: 328-335. 2012.
CIUDAD, G.; REYES, I.; AZÓCAR, L.; BRIONES, R.; JORQUERA, M. WICK, L.
Y. & NAVIA, R. Innovate approaches for effective selection of lipase-producing
microorganisms as whole cell catalysts for biodiesel production. New
Biotechnology, 28 (4): 375-381. 2011.
COLLA, T. S.; ANDREAZZA, R.; BUECKER, F.; DE SOUZA, M. M.;
TRAMONTINI, L.; PRADO, G. R.; FRAZZON, A. P.; CAMARGO, F. A. &
BENTO, F. M. Biorremediation assessment of diesel-biodiesel-contaminated
soil using an alternative bioaugmentation stratety. Environmental Science and
Pollution Research International, 21 (4): 2592-602. 2014.
CRUZ, J. M. & TAMADA, I. S. Biodegradation and phytotoxicity of biodiesel,
diesel and petroleum in soil. Water Air Soil Pollut, 225: 1962. 2014.
102
CYPLIK, P.; SCHMIDT, M.; SZULC, A.; MARECIK, R.; LISIECKI, P.;
HEIPIEPER, H. J.; OWSIANIAK, M.; VAINSHTEIN, M. & CHRZANOWSKI, Ɫ.
Bioresource Technology, 102 (6): 4347-52. 2011.
DHEEMAN, D. S.; ANTONY-BABU, S.; FRíAS, J. M. & HENEHAN, G. T. M.
Purification and characterization of an extracelular lipase from a novel strain
Penicillium sp. DS-39 (DSM 23773). Journal of Molecular Catalysis B:
Enzymatic, 72 (3-4): 256-262. 2011.
ELAZHARI-GLI, A.; SINGH, A. K.; DAVENPORT, R. J.; HEAD, I. M. &
WERNER, D. Biofuel componentes change the ecology of bacterial volatile
petroleum hydrocarbon degradation in aerobic Sandy soil. Environmental
Pollution, 173: 125-132. 2013.
FERNÁNDEZ-ALVAREZ, P.; VILA, J.; GARRIDO-FERNÁNDEZ, J. M.;
GRIFOLL, M. & LEMA, J. M. Trials of biorremediation on a beach affected by
the heavy oil spill of the Prestige. Journal of Hazardous Materials, 137 (3):
1523-31. 2006.
FERNÁNDEZ-ALVAREZ, P.; VILA, J.; GARRIDO-FERNÁNDEZ, J. M.; FEIJOO,
G. & LEMA, J. M. Evaluation of biodiesel as bioremediation agente for the
treatment of the shore affected by the heavy oil spill of the Prestige. Journal of
Hazardous Materials, 147 (3): 914-22. 2007.
FUKUDA, N.; HABE, H. & ITO, M. Biodegradation of biodiesel wash water from
a biodiesel fuel production plant. Journal of Oleo Science, 62 (7): 525-32. 2013.
GAO, S. Q.; QU, J.; CHUA, N. H. & YE, J. A new strain of Indian cassava
mosaic vírus causes a mosaic disease in the biodiesel crop Jatropha curcas.
Archives of Virology, 155 (4): 607-612. 2010.
GAO, X.; LIU, Y. & CHEN, Z. Rapid screening and cultivation of oleaginour
microorganisms. Indian Journal of Experimental Biology, 50: 282-289. 2012.
103
GASSEN, J.; BENTO, F. M.; FRAZZON, A. P. G.; FERRÃO, M. F.; MARRONI,
I. V. & SIMONETTI, A. B. Growth of Paecilomyces variotii in B0 (diesel), B100
(biodiesel) and B7 (blend), degradation and molecular detection. Brazilian
Journal of Biology, 75(3): 541-547. 2015.
HAWROT-PAW, M.; WIJATKOWSKI, A. & MIKICIUK, M. Influence of diesel and
biodieel fuel-contamination soil on microorganisms, growth and development of
plants. Plant Soil and Environment, 61 (5): 189-194. 2015.
HILL, E. C. & HILL, G. C. Microbial contamination and associate corrosion in
fuels during storage distribution and use. Advanced Materials Research, 38:
257-268. 2008.
HILL, E & HILL, G.C. Strategies for resolving problems caused by microbial
growth in terminal and retail sites handling biodiesel. In: Proceedings of the 11th
international conference on the stabilitiy, handling and use of liquid fuels,
Praghe, Czech Republic, p. 1-22. 2009.
HOREL, A. & SCHIEWER, S. Influence of inocula with prior hydrocarbon
exposure on biodegradation rates of diesel synthetic diesel, and fish-biodiesel in
soil. Chemosphere, 109: 150-156. 2014.
HU, C. W.; LIN, M. H.; HUANG, H. C.; KU, W. C.; YI, T. H.; TSAI, C. F.; CHEN,
Y. J.; SUGIYAMA, N.; ISHIHAMA, Y.; JUAN, H. R. & WU, S. H.
Phosphoproteomic analysis of Rhodopseudomonas palustris reveals the role of
pyruvate phosphate dikinase phosphorylation in lipid production. Journal of
Proteome Research, 11 (11): 5362-5375. 2012.
KANMANI, P.; KUMARESAN, K. & ARAVIND, J. Utilization of coconut oil mil
waste as a substrate for optimized lipase production, oil biodegradation and
enzyme purification studies in Staphylococcus pasteuri. Electronic Journal of
Biotechnology, 18 (1): 20-28. 2015.
104
KAIEDA, M.; SAMUKAWA, T.; KONDO, A. & FUKUDA, H. Effect of methanol
and water contents on production of biodiesel fuel from plant oil catalyzed by
various lipases in a solvent-free system. Journal of Biosciense and
Bioengineering, 91 (1): 12-15. 2001.
KLOFUTAR, B & GOLOB, J. Microorganisms in diesel and in biodiesel fuels.
Acta Chimica Slovenica. 54 (4): 744-748. 2007.
KUMAR, A. K.; VATSYAYAN, P. & GOSWAMI, P. Production of lipid and fatty
acids during growth of Aspergillus terreus on hydrocarbon substrates. Aplied
Biochemistry and Biotechnology, 160 (5): 1293-300. 2010.
LEMOS, D. A.; CARDOSO, S. L.; VIEIRA, P. A. & CARDOSO, V. L.
Bioremediation of soil contaminated with biodiesel and glycerin – results of soil
microbial adaptation through evidence contaminants removal. Chemical
Engineering Transctions, 32: 463-468. 2013.
LEUCHTLE, B.; XIE, W.; ZAMBANINI, T.; EIDEN, S.; KOCH, W.; LUCKA, K.;
ZIMMERMANN, M. & BLANK, L. M. Critical factors for microbial contamination
of domestic heating oil. Energy Fuel, 29 (10): 6394-6403. 2015.
LIN, H.; WANG, Q.; SHEN, Q.; ZHAN, J. & ZHAO, Y. Genetic engineering of
microorganisms for biodiesel production. Bioengineered, 4 (5): 292-304. 2013.
LUTZ, G.; CHAVARRÍA, M.; ARIAS, M. L. & MATA-SEGREDA, J. F. Microbial
degradation of palm (Elaeis guineenses) biodiesel. Revista de Biologia Tropical,
54 (1): 59-63. 2006.
LIU, Y.; LI, C.; WANG, S. & CHEN, W. Solid-supported microorganism of
Burkhloderia cenocepacia cultured via solid state fermentatio for biodiesel
production: optimization and kinetics. Applied Energy, 113: 713-721. 2014.
105
McALLISTER, T.A.; STANFORD, K.; WALLINS, G. L.; REANEY, M. J. T. &
CHENG, K. J. Feeding value for lambs of rapeseed meal arising from biodiesel
production. Animal Science. 68: 183-194. 1999.
MAGDOULI, S.; YAN, S.; TYAGI, R. D. & SURAMPALLI, R. Y. Heterotrophic
microorganisms: a promising source for biodiesel production. Critical Reviews in
Environmental Science and Technology, 44 (4): 416-453. 2014.
MARIANO, A. P.; TOMASELLA, R. C.; DE OLIVEIRA, L. M.; CONTIERO, J. &
DE ANGELIS, D. F. Biodegradability of diesel and biodiesel blends. African
Journal of Biotechnology, 7 (9): 1323-1328. 2008.
MARIANO, A. P.; TOMASELLA, R. C.; DI MARTINO, C.; MORAIS, E. B.;
MACIEL FILHO, R.; REGALI SELEGHIM, M. H.; CONTIERO, J.; TAUK
TORNISIELO, S. M. & DE ANGELIS, D. F. Aerobic biodegradation of butanol
and diesel oil blends. African Journal of Biotechnology, 42 (9): 7094-7101.
2010.
MEDEIROS, G. A.; GONÇAVELS, S. B.; RODRIGUES, D. S. & NETO, B. A. D.
Enzimas e líquidos iônicos: uma combinação promissora para um biodiesel
limpo. Revista Virtual de Química, 5 (1): 74-94. 2013.
MENG, X.; YANG, J.; XU, X; ZHANG, L; NIE, Q. & XIAN, M. Biodiesel
production from oleaginous microorganisms. Renewable Energy, 34: 1-5. 2009.
MESSIAS, J. M.; DA COSTA, B. Z.; DE LIMA, V. M. G.; GIESE, E. C.;
DEKKER, R. F. H. & BARBOSA, A. M. Lipases microbianas: produção,
propriedades e aplicações biotecnológicas. Semina: Ciências Exatas e
Tecnológicas, 32 (2): 213-234. 2011.
MEYER, D. D.; SANTESTEVAN, N. A.; BUECKER, F.; SALAMONI, S. P.;
ANDREAZZA, R.; DE OLIVEIRA CAMARGO, F.A. & BENTO, F. M. Capability
of a selected bactreial consortium for degrading diesel/biodiesel blends (B20):
enzyme and biosurfactant production. Journal of Environmental Science and
106
Health: Part A, Toxic/Hazardous Substances & Environmental Engineering, 47
(12): 1776-84. 2012.
MEYER, D.D.; BEKER, S. A.; BÜCKER, F.; PERALBA, M. C. R.; FRAZZON, A.
P. G.; OSTI, J. F.; ANDREAZZA, R.; CAMARGO, F. A. O. & BENTO, F. M.
Bioremediation strategies for diesel and biodiesel in oxisol from southern Brazil.
International Biodeterioration & Biodegradation, 95: 356-363. Pat B. 2014.
OBBARD, J. P.; NG, K. L. & XU, R. Bioremediation of petroleum contaminated
beach sediments: use of crud palm oil and fatty acids to enhance indigenous
biodegradation. Water, Air, and Soil Pollution, 157: 149-161. 2004.
ORO, L.; CIANI, M. & COMITINI, F. Antimicrobial activity of Metschnikowia
pulcherrima wine yeasts. Journal of Applied Microbiology, 116 (5): 1209-1217.
2014.
RAKICKA, M.; LAZAR, Z.; DULERMO, T.; FICKERS, P. & NICAUD, J. M. Lipid
production by the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica using industrial by-
products under different culture conditions. Biotechnology for Biofuels, 8: 104.
2015.
RAMOS, D. T.; DA SILAV, M. L.; CHIARANDA, H. S.; ALVARES, P. J. &
CORSEUIL, H. X. Biostimulation of anaerobic BTEX biodegradation under
fermentative methanogenic conditions at source-zone groundwater
contaminated with a biodiesel blend (B20). Biodegradation, 24 (3): 333-41.
2013.
RAMOS, D. T.; DA SILVA, M. L.; NOSSA, C. W.; ALVAREZ, P. J. &
CORSEUIL, H. X. Assessmente of microbial communities associated with
fermentative-methanogenic biodegradation of aromatic hydrocarbons in
groundwater contaminated with a biodiesel blend (B20). Biodegradation, 25 (5):
681-91. 2014.
107
RAPOSO, S.; PARDAO, J. & LIMA-COSTA, M. E. Oleaginous microorganisms
as sustainable feedstock for biodiesel production. New Biotechnology, 25(1):
276-282. 2009.
ROBLES, S. L. P.; MELO, R. C. S.; MESA, G. A. P. & GALLO, S. A. C.
Evaluación de biocombustiles e hidrocarburos del petróleo (gasolina y diesel)
em um suelo: processo de transporte y biorremidiación. Revista EIA. Escuela
de Ingenieria de Antioquia, 12 (2): E21-E46. 2015.
ROCHA, D. C.; GOMES, B. M.; GOMES, S. D.; SENE, L. & ZENATTI, D. C.
Selection of microorganisms producer of lipase for fat removal from biodiesel
purification water. Engenharia Agrícola, 33 (2): 332-340. 2013.
SANTAMAURO, F.; WHIFFIN, F. M.; SCOTT, R. J. & CHUCK, C. J. Low-cost
lipid production by an oleaginous yeast cultured in non-sterile conditions using
model waste resource. Biotechnology for Biofuels, 7: 34. 2014.
SAWANGKEAW, R. & NGAMPRASERTSITH, S. A review of lipid-based
biomasses as feedstocks for biofuels production. Renewable Sustaible Energy
Review, 25: 97-108. 2013.
SCHLEICHER, T.; WERKMEISTER, R.; RUSS, W.; MEYER-PITTROFF, R.
Microbiological stability of biodiesel-diesel-mixtures. Bioresource Technology,
100 (2): 724-730. 2009.
SHIMADA, Y.; WATANABE, Y.; SAMUKAWA, T.; SUGIHARA, A.; NODA, H.;
FUKUDA, H. & TOMINAGA, Y. Conversion of vegetable oil to biodiesel using
immobilized Candida antarctica lipase. Journal of the American Oil Chemists‟
Society. 76 (7): 789-793. 1999.
SILVA, G. S.; MARQUES, E. L. S.; DIAS, J. C. T.; LOBO, I. P.; GROSS, E.;
BRENDEL, M.; DA CRUZ, R. S. & REZENDE, R. P. Biodegradability of soy
biodiesel in microcosmo experiments using soil from the Atlantic Rain Forest.
Applied Soil Ecology, 55: 27-35. 2012.
108
SOARES JUNIOR, J.; MARIANO, A. P. & DE ANGELIS, D. F. Biodegradation
of biodiesel/diesel blendas by Candida viswanathii. African Journal of
Biotechnology, 8 (12): 2774-2778. 2009.
SORENSEN, G.; PEDERSEN, D. V.; NORGAARD, A. K.; SORENSEN, K. B. &
NYGAARD, S. D. Microbial growth studies in biodiesel blends. Bioresource
Technology, 102 (8): 5259-64. 2011.
SORIANO, A. U.; MARTINS, L. F.; VENTURA, E. S. A.; DE LANDRA, F. H. T.
G.; VALONI, E. A.; FARIA, F. R. D.; FERREIRA, R. F.; FALLER, M. C. K.;
VALÉRIO, R. R.; LEITE, D. C. A.; DO CARMO, F. L. & PEIXOTO, R. S.
Microbiological aspects of biodiesel and biodiesel/diesel blends biodeterioration.
International Biodeterioration & Biodegradation, 99: 102-114. 2015.
SUEHARA, K-I.; OWARI, K.; KOHDA, J. & YANO, T. Rapid and simple
determination of oil and urea concentrations and solids contente to monitor
biodegradation conditions of wastewater discharged from a biodiesel fuel
production plant. Jounal of Near Infrared Spectroscopy, 15 (2): 89-96. 2007.
SUNAR, N. M.; RMPARAN, Q.; KARIM, A. T. A.; NOOR, S. F. M.; MASLAN,
M.; MUSTAFA, F. & KHALED, N. Bioremediation of biofuel-soil contaminarion
by using Pseudomonas putida. Avanced Materials Research, 845: 138-145.
2014.
THEVENIEAU, F. & NICAUD, J. M. Microorganisms as sources of oils. Oilseeds
& Fats Crops and Lipids, 20 (6): D603. 2013.
WANG, C.; CHEN, L,; RAKESH, B.; QIN, Y. & LV, R. Technologies for
extracting lipids from oleaginous microorganisms for biodiesel production.
Frontiers in Energy, 6 (3): 266-274. 2012.
WATANABE, Y.; SHIMADA, Y.; SUGIHARA, A.; NODA, H.; FUKUDA, H. &
TOMINAGA, Y. Continuous production of biodiesel fuiel from vegetable oil using
109
immobilized Candida Antarctica lipase. Journal of the American Oil Chemists‟
Society, 77 (4): 355-360. 2000.
WU, H.; ZONG, M. H.; LUO, Q. & WU, H. C. Enzymatic conversion of waste oil
to biodiesel in a solvent-free system. Preprints of Paper- American Chemical
Society, Division of Fuel Chemisty, 48 (2): 533-534. 2003.
XIA, W.X.; Y., XIA; LI., J. C.; ZHANG, D. F.; ZHOU, Q. & WANG, X. P. Studies
on crude oil removal from pebbles by the application of biodiesel. Marine
Pollution Bulletin, 91 (1): 288-294. 2015.
YASSINE, M. H.; SUIDAN, M. T. & VENOSA, A. D. Microbial kinetic model for
the degradation of poorly soluble organic materials. Water Research, 47: 1585-
1595. 2013a.
YASSINE, M. H.; WU, S.; SUIDAN, M. T. & VENOSA, A. D. Aerobic
biodegradation kinetics and mineralization of six petrodiesel/soybean-biodiesel
blends. Environmental Protection Agengy, 47 (9): 4619-4627. 2013b.
YOUSUF, A.; SANNINO, F.; ADDONIRISI, V. & PIROZZI, D. Microbial
conversion of olive oil mil wastewaters into lipids suitable for biodiesel
production. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 58 (15): 8630-8635.
2010.
ZHANG, X.; PETERSON, C. L.; REECE, D.; MÖLLER, G. & HAWS. R.
Biodegradability of biodiesel in the aquatic environment. Transctions of the
American Society of Agricultural, 41: 1423-1430. 1998.
ZHANG, G.; FRENCH, W. T.; HERNANDEZ, R.; HALL, J.; SPARKS, D. &
HOLMES, W. E. Microbial lipid production as biodiesel feedstock from N-
acetylglucosamine by oleaginus microorganisms. Chemical Technology and
Biotechnology, 86 (5): 642-650. 2011.
110
ZIMMER, A.; CAZAROLLI, J.; TEIXEIRA, R. M.; VISCARDI, S. L. C.;
CAVALCANTI, GERBASE, A. E.; FERRÃO, M. F., PIATNICKI, C. M. S. &
BENTO, F. M. Monitoring of efficacy of antimicrobial products during 60 days
storage simulation of diesel (B0), biodiesel (B100) and blends (B7 and B10).
Fuel, 112: 153-162. 2013.
111
- Estudo da toxicidade aguda de biodiesel e suas misturas com Capítulo 3
óleo diesel frente a Artemia salina
Carrim, A. J. I.1,2; Franco, P. I. B. M. 2; Vieira, T. M.1,2; Vieira, J. D. G.1, Antoniosi Filho,
N. R.2
1 Laboratório de Microbiologia Ambiental e Biotecnologia (LAMAB), Instituto de
Patologia Tropical e Saúde Pública, Campus I, Universidade Federal de Goiás,
Goiânia, Goiás, Brasil, 74605-050
2 Laboratório de Métodos de Extração e Separação (LAMES), Instituto de Química,
Universidade Federal de Goiás – Campus II, Samambaia, Goiânia, Goiás, Brasil,
74690-900
E. mail: [email protected]
RESUMO
O biodiesel é considerado um biocombustível biodegradável e de baixo impacto
ambiental. Entretanto a toxicidade do biodiesel obtido a partir de óleos
residuais de fritura tem sido pouco estudada, principalmente utilizando-se
organismos aquáticos de baixo custo e fácil manipulação e que habitem
ambientes salobros ou salinos. Assim, foi feita a avaliação da toxicidade aguda
de biodiesel de óleo residual de fritura biodiesel de óleo de soja refinado, óleo
diesel A S500 e as misturas B7 e B20 desse óleo diesel com biodiesel de óleo
de fritura residual, utilizando-se a Artemia salina como organismo-teste. Para
os eluatos salinos o organismo-teste não apresentou toxicidade, entretanto
para as amostras puras testadas com DMSO e solução salina, o nível de
toxicidade indicou que quanto maior a quantidade de óleo diesel na mistura,
maior é a toxicidade do combustível, sendo que o biodiesel de óleo de fritura
apresentou menor toxicidade que as outras amostras de biodiesel. Desta
forma, o uso de biodiesel de óleo residual de fritura pode minimizar os impactos
ambientais de derramamento desses combustíveis em meios aquáticos salinos
ou salobros, desde que o biodiesel possua baixas concentrações de
substâncias polares de baixa massa molecular.
Palavras chaves: Artemia salina, biocombustível, ecotoxicologia.
112
Acute ecotoxicological assessment of methylic biodiesel, diesel oil and
blends with regard to Artemia salina
ABSTRACT
Biodiesel is considered biodegradable and it has a low environmental impact.
However the toxicity of biodiesel derived from waste frying oils have been little
studied, especially using low cost and easy handling aquatic organisms, which
live in brackish or saline environments. Thus, it was made the evaluation of
acute toxicity of the residual frying oil biodiesel, refined soybean oil biodiesel,
diesel oil A S500 and B7 and B20 mixed with residual frying oil biodiesel, and
using Artemia salina as test organism. To the salt eluates the test organism
showed no toxicity, however for pure samples tested with DMSO and saline, the
level of toxicity was proportional to the amount of biodiesel in the biofuel
mixture. Residual frying oil biodiesel showed lower toxicity than the other
biodiesels. Therefore, the usage of waste frying oil biodiesel can minimize the
environmental impacts of an eventual spillage in saline or brackish water
environments, since biodiesel has low concentrations of polar substances of low
molecular mass.
Key words: Artemia salina, biofuel, ecotoxicology.
113
1. Introdução
O biodiesel é apontado como um combustível renovável e que apresenta
baixo impacto ambiental, dada às reduzidas emissões de particulados e óxidos
de carbono e enxofre. Apesar das vantagens no que diz respeito à poluição
atmosférica, são poucos os trabalhos que avaliam o impacto deste
biocombustível no ambiente hídrico dulcícola, e principalmente no marinho,
bem como no terrestre (Bluhm et al., 2012; Bünger et al., 2012). No caso de
derramamentos deste biocombustível, seja no armazenamento ou transporte,
este pode vir a alcançar o ecossistema aquático e o solo, causando efeitos
ainda insuficientemente avaliados (Torrezani, 2009).
Atualmente, apesar do óleo refinado de soja ser a matéria-prima base
para a produção comercial de biodiesel, o uso de óleos e gorduras residuais
(OGR), especialmente os óleos residuais de fritura (ORF), estão cada vez mais
sendo utilizados para a produção de biodiesel, dado seu baixo custo e alta
disponibilidade (Talebian-Kiakalaieh et al., 2013). Entretanto, no aspecto
químico, é possível que o biodiesel de ORF seja mais impactante ao meio
aquático que o biodiesel obtido a partir de óleos refinados, pois o processo de
fritura aumenta o teor de substâncias de maior polaridade e de maior
solubilidade em água, tais como ácidos graxos livres e hidroperóxidos, bem
como de componentes de toxicidade já conhecida, como a acroleína (Shahid &
Jamal, 2011).
Testes ecotoxicológicos são utilizados para avaliar os riscos e efeitos
tóxicos de diversas substâncias com potencial nocivo sobre os organismos ou
ecossistemas. A avaliação ecotoxicológica é uma ferramenta adequada para
estimar a qualidade e monitorar águas e solos quanto a contaminantes, mesmo
aqueles encontrados em baixas concentrações. Essas avaliações são
realizadas pela exposição de organismos representantes das cadeias tróficas
frente às concentrações das substâncias testadas, ou fatores abióticos, em
determinada escala de tempo que vai caracterizar o teste como agudo ou
crônico (Cetesb, 1991; Knie, 2004).
O primeiro trabalho relatado na literatura científica acerca da
ecotoxicidade do biodiesel metílico em meio aquático dulcícola foi publicado
por Chae et al. (2005), o qual, usando a microalga dulcícola Chlorella vulgaris
114
como organismo-teste, classificou o biodiesel como sendo levemente tóxico.
Posteriormente, Khan et al. (2007) efetuaram a avaliação da toxicidade de
biodiesel B100 e suas misturas com óleo diesel nas proporções B50, B20 e B5,
usando o peixe dulcícola Oncorhynchus mykiss (truta arco-íris) e o crustáceo
dulcícola Daphnia magna, e concluíram que embora o biodiesel e suas
misturas com diesel sejam menos tóxicos que o óleo diesel, a toxicidade do
biodiesel puro e suas misturas com diesel é ainda bastante substancial e,
consequentemente, ainda ocorrerão sérios impactos sobre os organismos
aquáticos se derramamentos ocorrerem no transporte, estocagem ou uso.
As frações solúveis em água doce das misturas de biodiesel B5 e B20
produzidos com óleo de soja, canola, óleo de fritura de peixe e sebo foram
testadas por Hollebone et al. (2008) utilizando como organismos indicadores
Daphnia magna e a bactéria bioluminescente Vibrio fischeri, sendo observado
que as amostras de biodiesel testadas apresentaram toxicidade aguda de 5 a
10 vezes menor que o óleo diesel.
Torrezani (2009), em testes de toxicidade aguda, testou a fração solúvel
de biodiesel etílico de girassol usando o peixe dulcícola Prochilodus lineatus
(papa-terra) e constatou danos genotóxicos significativos no DNA dos
eritrócitos e das brânquias.
No único trabalho existente sobre o impacto do biodiesel de óleo de
fritura em meio aquático marinho, Leite et al. (2011) avaliaram a toxicidade da
fração solúvel em água de amostras de biodiesel metílico dos óleos de
mamona, palma e de cozinha usado. Para isso utilizaram como organismos-
teste a microalga marinha Tetraselmis chuii e ouriços-do-mar, e identificaram
que das matérias-primas utilizadas, o biodiesel de óleo de cozinha usado
apresentou a menor toxicidade, tendo sido apontado que o metanol residual do
processo reacional poderia ser responsável pela toxicidade do biodiesel de
ORF em meio aquático marinho.
Nogueira et al. (2011) avaliaram biomarcadores bioquímicos
relacionados ao estresse oxidativo para o peixe dulcícola Oreochromis niloticus
(tilápia-do-Nilo) após dois e sete dias de exposição ao óleo diesel, ao biodiesel
puro (B100) e às misturas B5 e B20. A mistura B20 apresentou menos efeitos
adversos do que o diesel e a mistura B5 para a tilápia-do-Nilo, sendo sugerida
como uma mistura menos nociva em substituição ao diesel. No entanto, foi
115
observado que mesmo o B100 pode ativar respostas bioquímicas neste peixe
dulcícola, indicando que o biodiesel puro também pode representar risco para a
biota aquática.
Leme et al. (2011) avaliaram a citotoxicidade da fração solúvel em água
das misturas B5, B20, B50 e B100 (feitas com biodiesel metílico de soja e
diesel com baixo teor de enxofre) e do óleo diesel (B0) em linhagem de células
T humanas e observaram que o diesel apresentou mais efeitos deletérios que
as misturas BX testadas.
Outro estudo realizado por Leme et al. (2012a) afirmaram que os eluatos
obtidos a partir dos biodieseis metílicos de soja (B5, B20, B50 e B100) também
apresentaram efeitos genotóxicos e mutagênicos, avaliados por teste de Ames
e teste in vitro MicroFlow®. Tais efeitos foram apontados como consequência
da presença de resíduos de metanol e de fitoestrogênios e fitoesteróis.
De acordo com Cruz et al. (2012) as citotoxicidades de eluatos de
amostras de biodiesel metílico obtidos a partir de mamona, de palma e de óleo
de fritura foram determinadas pela atividade da fosfatase ácida como
biomarcador sobre a integridade lisossomal do peixe dulcícola Oreochromis
niloticus (tilápia) e concluíram que o óleo de mamona e de fritura se
apresentaram mais tóxicos em função de resíduos de metanol, indicando que o
biodiesel pode ser um combustível menos biocompatível.
Desta forma, a maioria dos estudos aponta a necessidade do metanol
estar ausente ou presente na menor quantidade possível no biodiesel, visando
assim diminuir a toxicidade deste. Apesar de tal afirmação ser realizada em
várias publicações (Leite et al., 2011; Da Cruz et al., 2012; Holanda et al.,
2012; Leite et al., 2015), há poucos estudos (Pereira et al., 2012) que avaliem o
aumento da toxicidade do biodiesel em função da concentração de metanol, de
forma a determinar o quanto este resíduo reacional influencia na toxicidade do
biodiesel.
Leme et al. (2012a, 2012b) sugerem que estudos genotóxicos/citotóxicos
com cultura de células mamárias de hamster chinês e mutagênicos com
Salmonella typhimurium apontam que os efeitos da contaminação do biodiesel,
tanto no solo como no meio aquático, podem ser influenciados pela
composição do próprio biodiesel ou das impurezas, por exemplo esteróides
livres, presentes em diversas oleaginosas, uma vez que sofrem oxidação
116
aceleradas por alta temperatura, radiação, luz e outras condições que induzem
a foto-oxidação dos fitoesteróides, elevando a toxicidade do biodiesel e suas
misturas com óleo diesel, muitas vezes citados como de baixo impacto.
Novamente, assim como para o metanol, a indicação de que os esteróides e
seus derivados são responsáveis pela toxicidade do biodiesel carece de
avaliação que monitore os teores dessas substâncias e as correlacione com a
toxicidade do biodiesel.
De acordo com Nogueira et al. (2013) a exposição aguda ao óleo diesel
puro e misturas B5, B20 e B100 pode afetar parâmetros de estresse oxidativo e
biotransformação de enzimas no peixe dulcícola Pterygoplichthys anisitisi
(cascudo), aumentando a peroxidação lipídica nas brânquias dos peixes
expostos, representando riscos para a biota aquática.
Cavalcante et al. (2014) utilizaram testes citotóxicos, bioquímicos
(espécies de oxigênio oxidativo) e genotóxicos nas células hepáticas do peixe
dulcícola Danio rerio (paulistinha) para avaliarem a fração solúvel do biodiesel
produzido tanto pela rota metílica quanto etílica e observaram que
independente da rota utilizada o biodiesel apresenta toxicidade, sendo que os
efeitos do biodiesel metílico foram mais intensos.
Assim, diversos organismos-teste têm sido utilizados na avaliação
toxicológica de biodiesel e suas misturas com óleo diesel, mas muitos ainda
sequer foram explorados. Dentre os organismos usados em testes
ecotoxicológicos destaca-se a Artemia salina, que é amplamente utilizada em
diversos tipos de diagnóstico sobre a poluição de ambientes aquáticos salinos
ou salobros e na avaliação da toxicidade de diversificadas substâncias em
função do fácil manuseio para seu cultivo e interpretação dos resultados, baixo
custo e rapidez na realização do teste (Sorgeloos et al., 1978; Azevedo &
Chasin, 2003; Nunes et al., 2006).
Entretanto, até o momento, não há relatos do uso de Artemia salina para
avaliação da toxicidade de biodiesel, o que abre uma lacuna na exploração
científica da toxicidade do biodiesel no ainda pouco explorado ambiente
compreendido por ambientes salobros ou salinos.
Assim, considerando a importância de se avaliar o uso de matérias-
primas de menor custo para a produção de biodiesel, bem como a importância
de o impacto da presença desse biocombustível em ambientes aquáticos
117
salobros ou salinos, o objetivo deste trabalho foi verificar o potencial citotóxico
agudo do biodiesel metílico (B100) produzido a partir do óleo de soja refinado
(OSR) e de óleo residual de fritura (ORF), bem como as misturas desse último
com óleo diesel A S500 (B7 e B20), utilizando náuplios do microcrustáceo
Artemia salina como organismo-teste.
2. Experimental
2.1 Amostragem
Das amostras de biodiesel testadas, uma foi doada pela Petrobrás
Distribuidora (B100). Outra amostra foi obtida por meio da esterificação ácida
seguida por transesterificação básica metílica de óleo residual de fritura
adquirido em estabelecimento comercial que funciona como restaurante e bar,
localizado no munícipio de Anápolis (Estado de Goiás - Brasil), e utilizado na
fritura de diversos alimentos por duas semanas.
Uma amostra do óleo de soja refinado (OSR) que gerou o ORF também
foi adquirida junto ao mesmo estabelecimento e também foi usado para a
produção de biodiesel metílico via transesterificação. Todas as amostras de
óleos e biodiesel foram acondicionadas em frascos de PEAD (polietileno de
alta densidade), não esterilizados.
2.2 Produção das amostras de biodiesel metílico de ORF
A amostra de ORF foi submetida à filtração simples para separação dos
resíduos de alimentos presentes. Depois, a amostra de ORF foi submetida a
uma etapa de remoção de substâncias polares, principalmente produtos de
oxidação de ácidos graxos, via extração líquido-líquido com água destilada,
seguida de destilação simples do óleo para retirada da água residual (Azeredo,
2014). Após estas etapas, a amostra de ORF foi levada a esterificação ácida e
posteriormente a transesterificação alcalina, via rota metílica, segundo
metodologia também desenvolvida por Azeredo (2014). Tal processo de
transsterificação alcalina de conversão ao biodiesel metílico também foi
aplicado à amostra de óleo de soja refinado.
118
Assim, para a produção das amostras de biodiesel metílico de ORF
utilizou-se a proporção de 1:9 de óleo e metanol p.a. e 2% (v/v) de ácido
sulfúrico como catalisador ácido. Em seguida foram colocados sob refluxo e
agitação (agitador magnético com medidor de temperatura modelo MA 085/CT)
em banho-maria a 90 °C por 3 horas. Para remoção do catalisador e de
resíduos de metanol procedeu-se a lavagem com água quente (≈ 70° C),
seguido da filtração em sulfato de sódio anidro (Vetec®).
A reação de transesterificação alcalina aplicada ao produto de
esterificação ácida do ORF e ao óleo de soja refinado foi feita em reator da
marca Marconi Modelo MA 159/150, utilizando-se a proporção de 1:12 para a
razão óleo:metanol e 1,5% (m/v) de hidróxido de potássio (Vetec®) solubilizado
inicialmente em metanol (Tedia®) para gerar uma solução de metóxido de
sódio. A solução de metóxido de potássio foi acrescentada à mistura de óleo e
metanol e levada ao reator para agitação a 1000 rpm, à 60°C, por 1 hora. Em
seguida, aguardou-se por 24 horas a separação do glicerol e, após a
separação deste, procedeu-se à neutralização do catalisador com solução
aquosa de ácido clorídrico a 0,5 mol/L e lavagem com água destilada para
retirada do ácido residual. Tal lavagem foi feita até que a fase aquosa se
tornasse límpida. Por fim, o resíduo de água e metanol foi retirado por
rotaevaporação sob pressão reduzida.
Todas as amostras de biodiesel sintetizadas em laboratório, bem como a
amostra doada pela Petrobrás, tiveram a qualidade avaliada com base em
alguns dos parâmetros de qualidade estabelecidos na Portaria ANP no 45 de
25 de agosto de 2014. As amostras de biodiesel foram usadas puras e
misturadas a óleo diesel A S500, doado pela Petrobrás, para preparo das
amostras utilizadas para preparação dos eluatos usados nos ensaios
ecotoxicológicos.
2.3 Ensaios ecotoxicológicos
Para os ensaios de ecotoxicidade utilizou-se a metodologia proposta por
Meyer et al. (1982) para o cultivo dos náuplios e as normas CETESB/SP
L5.019 (1990) e L5.021 (1991), que tratam, respectivamente, da utilização de
testes de toxicidade no controle de efluentes líquidos e da execução dos
119
ensaios ecotoxicológicos usando Artemia salina. Outra metodologia foi utilizada
para avaliar a ecotoxicidade dos biodieseis, misturas BX e do óleo diesel em
contato com DMSO (dimeltisulfóxido) e solução salina para fins de simulação
de uma situação que apresente um diluente para essas amostras apolares no
ambiente aquático salobro ou salino (Meyer et al., 1982; Baravalia et al., 2012),
tal como quando surfactantes estão presentes no meio aquático.
2.3.1 Preparo do eluato
Pelo fato do biodiesel, do óleo diesel e das misturas BX serem
praticamente insolúveis em água, o ensaio ecotoxicológico é conduzido
inserindo-se os organismos-teste em um eluato. O eluato, que no caso
corresponde à fração solúvel do biodiesel, das misturas BX ou do óleo diesel
em água (Fração Solúvel em Água - FSA), é definido pela norma ABNT
15469:2007 como sendo a “solução aquosa de uma amostra de baixa
miscibilidade em água, obtida após procedimento de extração com água”
(ABNT, 2007).
Assim, o eluato foi preparado de acordo com adaptação da norma ABNT
NBR 15469:2007, misturando-se o biodiesel de ORF, o biodiesel de soja
refinado, as misturas B7 e B20 de biodiesel de ORF com óleo diesel A S500, e
o óleo diesel A S500 com a solução salina 3,5% (m/v), em uma razão de 750
mL de cada uma das amostras de combustíveis em 250 mL de solução salina
aquosa.
Tais misturas de amostras com solução salina foram colocadas sob
agitação por 24 horas em agitador mecânico marca Marconi, modelo MA 039.
Em seguida, o material foi disposto em um funil de separação por 24 horas,
promovendo assim a completa separação da fase aquosa da fase oleosa. O
mesmo foi armazenado em frascos plásticos de PEAD e mantido sob
refrigeração, sem passara por qualquer processo de esterilização, até o
momento da realização das análises ecotoxicológicas.
120
2.3.2 Análise cromatográfica do eluato
Os eluatos foram analisados por UPLC visando identificar os
componentes do biodiesel solúveis em água. Para isso utilizou-se um
cromatógrafo da marca Agilent Technologes 1220 Infinity LC-DAD. As
amostras dos eluatos, no volume de 20 µL, foram injetadas em coluna HPLC
50 mm x 4,6 mm x 1,8 µm ZORBAX instalada em forno a 40º C, e eluídas
empregando gradiente de eluição binário, constituído por 20% de água e 80%
de acetonitrila (Solvente A) e 12,5 % de hexano, 37,5% de isopropanol e 50%
de acetonitrila (Solvente B); detector UV-Vis com DAD com velocidade de
leitura de 20 Hz (0,25 segundos); varredura de 190 a 800 nm (a cada 1 nm); e
comprimentos de ondas monitorados de 210, 235 e 270 nm. O tempo de
corrida foi de 20 min com condicionamento pós-corrida de 5 minutos.
2.3.3 Cultivo dos náuplios de Artemia salina
Os cistos de Artemia salina e o sal marinho a granel foram adquiridos
em estabelecimento comercial de aquarismo no município de Goiânia (Estado
de Goiás – Brasil).
Os náuplios de Artemia salina foram cultivados de acordo com Meyer et
al. (1982), ou seja, em solução aquosa salina 3,5% (m/v) produzida com água
pura e isenta de cloro e inserida em funil de separação de 1000 mL. A solução
salina foi aerada com o uso de uma bomba de aquário a 4,5 L/min por 10 min e
incubada em incubadora Marconi Modelo MA403 a 25°C. Fez-se a adição de
30 mg de ovos de Artemia salina, os quais foram incubados por 48 horas, com
fotoperíodo de 23 horas e 50 minutos de exposição a luz e intervalo de 10
minutos de escuro durante o cultivo, mantidos sob aeração durante todo o
processo de incubação.
Após esse período, ocorre a eclosão dos náuplios, e a aeração é
cessada. O sistema é mantido em repouso por 15 min e, após esse período, os
ovos eclodidos vão ao fundo do funil de separação, os ovos que não eclodiram
ficam na superfície da solução salina e os náuplios ficam situados na zona
intermediária da solução salina. Os ovos que eclodiram são retirados por
escoamento da solução salina que se encontra no fundo funil de separação.
121
Em seguida são colhidos os náuplios - por escoamento de cerca de 500 a 700
mL de solução salina - os quais são recolhidos em sistema de filtração simples,
usando papel de filtro comum. Os ovos que não eclodiram aderem à parede do
funil à medida que a solução salina é escoada.
Cerca de 100 mL da solução salina que atravessou o filtro é transferida
para um cálice de vidro e é usada para receber os náuplios fitrados. Os
náuplios retidos em filtro são lavados com uma pequena porção de água
destilada e transferidos para a solução contida em cálice. Por fim, dispo-se
uma fonte de luz no topo do cálice de forma a manter os náuplios suspensos
em solução. Os náuplios são assim usados nos ensaios ecotoxicológicos.
2.3.4 Teste ecotoxicológico com Artemia salina
Para os ensaios de toxicidade frente à Artemia salina realizou-se a
diluição dos eluatos (preparados conforme 2.3.1) com a solução aquosa salina
nas concentrações de 100% (eluato puro), 50%, 25%, 12,5%, 6,25% e 3,12%.
Também se fez ensaios de ecotoxicidade sem o uso dos eluatos, mas
com a mistura de volumes iguais de DMSO e ou biodiesel, ou óleo diesel ou
misturas BX (B7 ou B20), diluídos em solução salina. Para isso executou-se
ensaios preliminares com percentuais volumétricos de combustíveis variando
de 0 a 12%, tal como listado na Tabela 4.1.
Tabela 3.1 - Preparo das misturas entre DMSO, combustíveis e solução salina.
Amostra
(Percentual volumétrico de
combustível)
Volume de
DMSO
(mL)
Volume de
combustível (mL)*
Volume de solução
aquosa salina (mL)
0% (Branco) 1,20 0,00 8,80
1,5% 0,15 0,15 9,70
3,0% 0,30 0,30 9,40
6,0% 0,60 0,60 8,80
9,0% 0,90 0,90 8,20
12,0% 1,20 1,20 7,60
* Volume ou de biodiesel de ORF ou de soja refinado, ou de óleo diesel ou de mistura BX de biodiesel de ORF com óleo diesel A S500 (B7 ou B20)
122
Assim foram obtidas 30 amostras (1 branco contendo a maior
quantidade utilizada de DMSO e 5 soluções em DMSO para cada um dos 6
combustíveis), as quais foram analisadas com dez replicatas, totalizando 300
ensaios ecotoxicológicos para o ensaio em meio com DMSO. Para cada ensaio
foram utilizados 10 náuplios de Artemia salina, dispostos em tubos de ensaio,
incubados por 24 horas em incubadora tipo BOD marca Marconi Modelo
MA403, a 30°C, sob iluminação a 141,3 µmol.m2.s (Azevedo & Chasin, 2003).
A avaliação da ecotoxicidade foi feita via construção e analise da curva
de regressão da dose letal para obtenção da DL50. A DL50 significa a dose letal
capaz de produzir 50% de morte dos organismos-teste expostos em
determinada quantidade de uma substância química administrada em uma
única dose por via oral e em estudos ambientais pode ser aplicada para
substâncias químicas em ambientes aquáticos (Roberts et al, 2015).
2.3.5 Cálculo da taxa de mortalidade de Artemia salina
A contagem de náuplios vivos e mortos foi realizada após 24 horas de
incubação, utilizando uma lupa e uma fonte de luz para facilitar a contagem.
Foram considerados organismos vivos aqueles que apresentassem algum tipo
de movimento por pelo menos 10 segundos.
Para os resultados obtidos a partir das repetições foi aplicada a equação
matemática (1) abaixo para calcular a taxa percentual de mortalidade para
cada amostra de combustível:
(1)
3. Resultados e discussão
As amostras de biodiesel apresentaram as características de qualidade
apresentadas na Tabela 3.2.
Os parâmetros de controle de qualidade indicam que as diferenças
observadas para as duas amostras de biodiesel em alguns dos parâmetros
provavelmente ocorreram em função da menor qualidade da matéria-prima
123
utilizada para produção do biodiesel, uma vez que o óleo residual de fritura
sofreu exposição à alta temperatura no processo de fritura de alimentos,
corroborando para o aumento da acidez pela presença de ácidos graxos livres,
bem como com a provável presença de compostos oxigenados derivados da
oxidação dos ácidos graxos, que aumentam a interação com substâncias
polares como a água, gerando maior teor de água quando comparado com o
biodiesel de óleo de soja refinado (OSR). O elevado teor de água também
corrobora para a elevada massa específica em ambas as amostras.
Tabela 3.2. Características físico-químicas das amostras de biodiesel.
* LII = Límpido e isento de impurezas LOQ = Limite de quantificação
Além disso, a formação de produtos oxigenados (peróxidos, hidróxidos e
hidroperóxidos de ácidos graxos) também deve contribuir para o aumento da
viscosidade do biodiesel de ORF, em comparação com o OSR. Tal aumento de
viscosidade para biodiesel de óleos de fritura também foi observado por
Kleinova & Cvengros (2009).
Características de Qualidade Especificação da ANP Biodiesel
Limite Unidade OSR ORF
Aspecto LII* - LII LII
Massa Especifica 850 a 900 kg/m3 920,00 920,20
Viscosidade (40 °C) 3,0 a 6,0 mm2/s 4,4 36,2
Teor de Água ≤ 200 mg/kg 992 1352
Índice de Acidez ≤ 0,50 mg KOH/g 0,20 1,85
Na + K ≤ 5 mg/kg <LOQ 268,8
Ca + Mg ≤ 5 mg/kg <LOQ 0,8
P ≤ 10 mg/kg <LOQ <LOQ
Teor de éster ≥ 96,5 % massa 98,1 96,9
Glicerol livre ≤ 0,02 % massa 0,00 0,04
Glicerol total ≤ 0,25 % massa 0,07 0,16
Monoacilglicerídeos ≤ 0,7 % massa 0,2 0,4
Diacilglicerídeos ≤ 0,20 % massa 0,11 0,06
Triacilglicerídeos ≤ 0,20 % massa 0,19 0,04
Índice de Iodo Anotar g/100 g 44,3 53,9
Estabilidade Oxidativa ≥ 8 h 4,52 4,09
124
Apesar das análises de acilglicerídeos, glicerol livre e glicerol total,
apontarem que ambas as amostras de biodiesel apresentaram-se dentro da
especificação vigente, o procedimento de análise desses parâmetros via
cromatografia gasosa de alta resolução não permite a eluição de derivados
oxidados de acilglicerídeos, os quais, assim, não puderam ser evidenciados
nesse ensaio, de forma a permitir a confirmação apontada para a razão da alta
viscosidade do biodiesel de ORF. Dessa forma, é fundamental o
desenvolvimento e uso de métodos cromatográficos ou espectrométricos de
análise que permitam a identificação desses produtos de oxidação de ácidos
graxos, em substituição ao vigente via cromatografia gasosa, o que será
importante para garantir a qualidade do biodiesel produzido a partir de óleos e
gorduras residuais.
Ainda com relação à elevada viscosidade do biodiesel metílico de ORF
sugere-se que tal biodiesel seja sempre utilizado em misturas com outros tipos
de biodiesel, de forma com que a mistura obtida alcance os valores de
viscosidade preconizados pela legislação vigente.
Com relação ao fato das amostras de biodiesel terem apresentado baixa
estabilidade oxidativa isso se deve ao fato do óleo de soja apresentar ácidos
graxos altamente insaturados e a não adição de aditivos para melhorar seu
ponto de indução. Observou-se ainda que os teores de ésteres apresentaram-
se dentro do limite de especificação para as amostras avaliadas.
Durante o processo de fritura alguns metais, principalmente os alcalinos
terrosos, são adicionados ao óleo de cozinha, oriundo dos alimentos ou dos
utensílios utilizados (Kim et al, 2013). Entretanto, observou-se que elementos
químicos que poderiam ser transferidos da fritadeira, como ferro e alumínio,
estavam abaixo do limite de quantificação, bem como outros elementos não
foram sequer detectados, indicando que o recipiente metálico usado no
processo de fritura tem baixa influência na contaminação por metais. Além
disso, os metais sódio e potássio encontrados em elevada concentração no
biodiesel de ORF podem ser oriundos de catalisadores ou de adsorventes
utilizados para remoção de impurezas e água (Azeredo, 2014).
Com relação aos ensaios ecotoxicológicos, esses possibilitaram
mensurar os efeitos de toxicidade frente ao microcrustáceo Artemia salina,
produzidos pelos combustíveis testados quando esses entram em contato com
125
água salgada, na presença ou na ausência de um agente solubilizante como o
DMSO.
Todos os eluatos preparados em solução salina na ausência de DMSO,
até a adição de 60 g do biocombustível por litro de água salina, não
apresentaram toxicidade à Artemia salina. Assim sendo, no caso de
derramamento de biodiesel e suas misturas com diesel (B7, B20 e B100) em
água salgada na ausência de agentes solubilizantes como surfactantes, não
serão observados efeitos sobre tal biota aquática.
Por sua vez, o eluato salino preparado a partir do óleo diesel A S500 e
na ausência de DMSO apresentou mortalidade quando 82% de eluato foi
adicionado à solução salina. Este derivado de petróleo apresenta em sua
composição substâncias como PAHs (hidrocarbonetos aromáticos policíclicos),
VOC (compostos orgânicos voláteis), formaldeído e acetaldeído, além de alto
teor de enxofre (500 mg/Kg), o que pode explicar a toxicidade observada
(Karavalakis et al., 2010; Magara-gomez et al., 2012; Rosen et al., 2014).
Para os ensaios feitos na presença de DMSO, os testes preliminares
levaram a realização dos testes definitivos com as seguintes proporções de
constituintes (Tabela 3.3) nos pontos em que se obtiveram os valores de DL50
para cada combustível avaliado:
Para os ensaios feitos na presença de DMSO, observou-se que a maior
toxicidade, dada pelo menor valor de DL50, foi obtida para o óleo diesel A S500
(DL50 = 1,8%), seguida das misturas B7 (DL50 = 2,3%) e B20 (DL50 = 2,6%). As
amostras de biodiesel (B100) apresentaram menor toxicidade que a amostra de
óleo diesel e que as misturas BX, sendo que o biodiesel de óleo de fritura
(DL50 = 6,8%) apresentou-se menos tóxico que o biodiesel de óleo de soja
refinado (DL50 = 6,2%).
126
Tabela 3.3. Preparo das misturas entre DMSO, combustíveis e solução salina
na DL50.
Amostra (Percentual volumétrico
de combustível)
Volume de DMSO (mL)
Volume de combustível
(mL)*
Volume de solução aquosa salina (mL)
0% (Branco) 0,68 0,00 9,32
1,8% 0,18 0,18 9,64
2,3% 0,23 0,23 9,54
2,6% 0,26 0,26 9,48
6,2% 0,62 0,62 8,76
6,8% 0,68 0,68 8,64
* Volume ou de biodiesel de ORF ou de soja refinado, ou de óleo diesel ou de mistura BX de biodiesel de ORF com óleo diesel A S500 (B7 ou B20)
Dessa forma, o biodiesel metílico de ORF apresentou a menor
toxicidade frente à Artemia salina entre todas as amostras avaliadas na
presença de DMSO, o que indica que a provável presença minoritária de traços
de compostos oxigenados - que aumentam a viscosidade, mas não
comprometem o teor de ésteres - não aumentam a toxicidade do biodiesel de
ORF em comparação com o do biodiesel de OSR.
Neste sentido, Jurac & Zlatar (2013), baseados apenas em análises
químicas, indicaram que o biodiesel de óleo de fritura poderia apresentar maior
toxicidade pelo fato das características do processo de fritura empregar
constantemente altas temperaturas e por longos períodos, levando a formação
de aproximadamente 500 substâncias diferentes, algumas com elevada
toxicidade, tais como a acroleína e aminas heterocíclicas. Além disso, a
literatura destaca que resíduos do processo da transesterificação como
metanol, de autoxidação dos FAME (ésteres metílicos de ácidos graxos), além
de fitoesteróis e fitoestrogênios, também poderiam ser responsáveis em elevar
a toxicidade desse biodiesel (Da Cruz et al., 2012; Holanda et al., 2012; Leme
et al., 2012a/b; Yassine et al., 2012; Tjarinto et al., 2014). Desta forma, é
possível suspeitar que no biodiesel de ORF aqui produzido, tais substâncias
talvez estejam ausentes ou presentes em baixas concentrações, ou até mesmo
não sejam tão tóxicas frente à Artemia salina.
Conforme demonstrado pelos cromatogramas da Figura 4.1, obtidos por
UPLC-UV/DAD, o eluato do biodiesel de ORF em água salina com DMSO
(Figura 3.1A) apresenta ácidos graxos livres e seus produtos de oxidação que
127
eluem no início do cromatograma (eluição até 4 min e detecção a 235 nm),
sendo que tais substâncias estão ausentes no eluato de biodiesel de OSR em
água salina com DMSO (Figura 3.1B). Tal resultado corrobora com a maior
acidez observada para o biodiesel de ORF em comparação a obtida para o
biodiesel de OSR.
O eluato do biodiesel de ORF em água salina com DMSO (Figura 3.1A)
também apresentou picos na região de eluição dos triacilglicerídeos oxidados
(eluição acima de 12 min e detecção a 235 nm), classificados
hidroperóxidienos e hidroxiperoxidienos, os quais, da mesma forma que ácidos
graxos livres e seus produtos de oxidação, não foram evidenciados na amostra
de biodiesel de OSR (Figura 3.1B).
Figura 3.1. Cromatograma dos eluatos salinos em DMSO para o biodiesel
(B100) de ORF (A) e de OSR (B) obtido por HPLC-UV/DAD a 235 nm.
As análises das amostras de eluatos salinos em DMSO para o biodiesel
(B100) de ORF (Figura 3.2A) e de OSR (Figura 3.2B), obtidas por HPLC-
UV/DAD a 270 nm, evidenciaram a presença de cetodienos de ácidos graxos
A
B
128
(eluindo até 4 min) e de monoacilglicerídeos (eluindo de 6 a 10 min) no
biodiesel de ORF, os quais estão ausentes no biodiesel de OSR e que, da
mesma maneira que ácidos graxos livres e seus produtos de oxidação,
hidroperoxidienos e hidroxiperoxidienos (Morales et al., 2012a, 2012b), não são
tão tóxicos à Artemia salina.
Figura 3.2. Cromatograma dos eluatos salinos em DMSO para o biodiesel
(B100) de ORF (C) e de OSR (D) obtido por HPLC-UV/DAD a 270 nm.
Vale observar que presença de ácidos graxos oxidados,
hidroperóxidienos, hidroxiperoxidienos e de cetodienos (Morales et al., 2010,
2012) pode explicar a alta viscosidade obtida para o biodiesel de óleo de fritura
residual. Assim, apesar de alterarem negativamente a qualidade do biodiesel
de ORF, tais substâncias não prejudicam a ecotoxicidade desse
biocombustível, quando comparado a um biodiesel de óleo de soja refinado, o
qual não possui a presença de tais produtos oxidados.
A
B
129
4. Conclusão
O biodiesel obtido a partir de óleo de fritura apresentou problemas de
qualidade no que se refere a acidez, aos teores de água, sódio e potássio e,
principalmente, com relação a viscosidade, cujo aumento é justificado pela
presença de produtos de oxidação como ácidos graxos livres e oxidados,
hidroperoxidienos, hidroxiperoxidienos e cetodienos. Dessa forma, o uso
comercial desse tipo de biodiesel deve ser feito em adição a um biodiesel de
melhor qualidade, tomando-se o cuidado de acompanhar a alteração de tais
parâmetros de qualidade, de forma a não prejudicar a qualidade do produto
final.
Do ponto de vista ecotoxicológico, contrariando o previsto em algumas
publicações científicas, o biodiesel de óleo residual de fritura demonstrou ser
menos tóxico que o biodiesel de óleo de soja refinado frente a Artemia salina.
Nas misturas de biodiesel de óleo residual de fritura com óleo diesel A S500,
quanto maior o percentual de biodiesel, menos tóxica é a mistura, sendo o óleo
diesel o mais tóxico dos combustíveis testados.
Assim, a dispersão de biodiesel de óleo residual de fritura em ambiente
aquático salobro ou salino pode até mesmo causar menor impacto que o
causado por biodiesel produzido a partir de óleos refinados, o que demonstra
que tal produto pode ser utilizado com segurança ambiental até superior a
proporcionada por biodiesel produzido com o uso de óleos graxos de maior
qualidade.
5. Referências Bibliográficas
ANP. AGÊNCIA NACIONAL DO PETRÓLEO, GÁS NATURAL E
BIOCOMBUSTÍVEIS (ANP). RESOLUÇÃO ANP Nº 45, DE 25.8.2014 - DOU
26.8.2014.
ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. ABNT NBR
15469:2007. Ecotoxicologia aquática – Preservação e preparo de amostras.
Rio de Janeiro: ABNT, 2007.
130
AZEREDO, W. A. Otimização da produção de biodiesel metílico a partir de
óleos de fritura residuais (OFR). Dissertação de mestrado apresentada ao
Instituto de Química da Universidade Federal de Goiás/UFG. Goiânia (G0). 104
f., 2014.
AZEVEDO, F. A.; CHASIN, A. A. M. (coord). As bases toxicológicas da
ecotoxicologia. São Carlos (SP): Rima, 340 p., 2003.
ARAVALIA, Y.; VAGHASIYA, Y. & CHANDA, S. Brine shrimp cytotoxicity, anti-
inflammatory and analgesic properties of Woodfordia fruticosa Kurz flowers.
Iranian Journal of Pharmaceutical Research, 11 (3): 851-861. 2012.
BLUHM, K.; HEGER, S.; SEILER, T.B.; HALLARE, A. V.; SCHÄFFER, A. &
HOLLERT, H. Toxicological and ecotoxicological potencies of biodfuels used for
the transport sector – a literature review. Energy & Environmental Science, 5:
7381- 7392. 2012.
BÜNGER, J.; KRAHL, J.; SCHRÖDER, O.; SCHMIDT, L. & WESTPHAL, G. A.
Potential hazards associated with combustion of bio-derived diesel fuel. Critical
Reviews in Toxicology, 42 (9): 732-750. 2012.
CAVALCANTE, D. G. S. M.; da SILVA, N. D. G.; MARCARINI, J. C.;
MANTOVANI, M. S.; MARIN-MORALES, M. A.; MARTINEZ, C. R. Cytotoxic,
biochemical and genotoxic effects of biodiesel produced by diferente routes on
ZFL cell line. Toxicology in Vitro, 28: 1117-1125, 2014.
CETESB - COMPANHIA DE TECNOLOGIA DE SANEAMENTO AMBIENTAL.
Norma técnica L5.019: Procedimentos para utilização de testes de toxicidade
no controle de efluentes líquidos. São Paulo, 1990.
CETESB – Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental. Norma
Técnica L5.021. Água do mar – Teste de toxicidade aguda com Artemia:
método de ensaio. São Paulo, 1991.
131
CHAE, H. J.; YONG, K. E.; HEON, L. J. Toxicity test of biodiesel and biodiesel-
derived neopentyl polyol ester lubricant oil base using microalge. Korean
Society for Biotechnology and Bioengineering Journal, 20: 55-59, 2005.
CRUZ, A. C. S.; LEITE, M. B. N. L.; RODRIGUES, L. E. A.; NASCIMENTO, I. A.
Estimation of Biodiesel Cytotoxicity by Using Acid Phosphatase as a Biomarker
of Lysosomal Integrity. Bull Environmental Contamination Toxicology, 89: 219-
224, 2012.
DA CRUZ, A. C. S.; LEITE, M. B. N. L.; RODRIGUES, L. E. A. & NASCIMENTO
R. A. Estimation of biodiesel cytotoxicity by using acid phosphatase as a
biomarker of lysosomal integrity. Bulletin of Environmental Contamination and
Toxicology, 89: 219-224. 2012.
HOLANDA, J. N.; MACIEL, A. P. & SANTOS, R. L. Avaliação ecotoxicológica
da água de lavagem da purificação de biodiesel de soja metílico utilizando
Danio rerio como organism-teste. Boletim do Laboratório de Hidrobiologia, 25
(1): 13-20. 2012.
HOLLEBONE, B. P.; FIELDHOUSE, B.; LANDRIAULT, M. Aqueous Solubitlity,
Dispersibility and Tocixity of Biodiesels. International Oil Spill Conference
Proceedings: Georgia, USA, 2008 (1): 929 - 36, 2008.
JURAC, Z.; ZLATAR,V. Optimazation of raw material mixtures in the production
of biodiesel from vegetable and used frying oils regarding quality requirements
in terms of cold flow properties. Fuel Processing Technology, v. 106, p.108-
113, 2013.
KARAVALKIS, G.; FONTARAS, G.; AMPATZOGLOU, D.; KOUSOULIDOU, M.
STOURNAS, S.; SAMARAS, Z. & BAKEAS, E. Effects of low concentration
biodiesel blends application on modern passenger cars. Part 3: impact on PAH,
nitro-PAH, and oxy-PAH emissions. Environmental Pollution, 158: 1584-1594.
2010.
132
KHAN, N.; WARITH, M. A.; LUK, G. A comparison of acute toxicity of biodiesel,
biodiesel blends, and diesel on aquatic organisms. Journal of the Air & Waste
Management Association, 57(3): 286-296, 2007.
KIM, S. K.; HAN, J. Y.; HONG, S. A.; LEE, Y. W. & KIM, J. Supercritical CO2-
purification of waste cooking oil for high-yield diesel-like hydrocarbons via
catalytic hydrodeoxygenation. Fuel, 111: 510-518. 2013.
KLEINOVÁ, A. & CVENGROŠ, J. Utilization of used frying oils/fats in FAME
production. 44th International Petroleum Conference, Bratislava, Slovak
Republic, September 21-22, 2009.
KNIE, J. L. W. & LOPES, E. W. B. Testes Ecotoxicológicos: métodos, técnicas
e aplicações. Florianópolis: FATMA / GTZ, 289p, 2004.
LEITE, M. B.; de ARAÚJO, M. M.; NASCIMENTO, I. A.; da CRUZ, A. C.;
PEREIRA, S. A.; do NASCIMENTO, N. C. Toxicity of water-soluble fractions of
biodiesel fuels derived from castor oil, palm oil, and waste cooking oil.
Environmental Toxicology Chemical, 30 (4): 893-7, 2011.
LEITE, M. B. N. L; DA CRUZ, A. L.; RODRIGUES, L. E. A.; YAMASHITA, S. R.;
CARQUEJA, C. R. G. & NASCIMENTO, I. A. Comparing the toxicity of water-
soluble fractions of biodiesel, diesel and 5% biodiesel/diesel blend on
Oreochromis niloticus using histological biomarkers. Bulletin of Environmental
Contamination and Toxicology, 95: 574-581. 2015.
LEME, D. M.; GRUMMT, T.; HEINZE, R.; SEHR, A.; RENZ, S.;
SKERSWEATAT, M.; de MARCHI, M. R. R.; MACHADO, M. C.; de OLIVEIRA,
D. P. ; MARIN-MORALES, M. A. Cytotoxicity of water-soluble fraction from
biodiesel and its diesel blends to human cell lines. Ecotoxicology and
Environmental Safety, 74: 2148-2155, 2011.
LEME, D. M.; GRUMMT, T.; HEINZE, R.; SEHR, A.; RENZ, S.; REINEL, S.;
OLIVEIRA, D. P.; FERRAZ, E. R. A.; de MARCHI, M. R. R.; MACHADO, M. C.;
133
ZOCOLO, G. J.; MARIN-MORALES, M. A. An Overview of biodiesel soil
pollution: Data based on cytotoxicity and genotoxicity assessments. Journal of
Hazardous Materials, 199-200: 343-349, 2012a.
LEME, D. M.; GRUMMT, T.; OLIVEIRA, D. P.; SEHR, A.; HEINZE, R.; RENZ,
S.; REINEL, S.; FERRAZ, E. R. A.; de MARCHI, M. R. R.; MACHADO, M. C.;
ZOCOLO, G. J.; MARIN-MORALES, M. A. Genotoxicity assessment of water
soluble fractions of biodiesel and its diesel blends using the Salmonella assay
and the in vitro MicroFlow® kit (Litron) assay. Chemosphere, 86: 512-520,
2012b.
MAGARA-GOMEZ, K. T.; OLSON, M. R.; OKUDA, T.; WALZ, K. A. &
SCHAUER, J. J. Sensitivity of hazardous air pollutant emissions to the
combustion of blends of petroleum diesel and biodiesel fuel. Atmospheric
Environment, 50: 307-313. 2012.
MEYER, B. N.; FERRIGNI, N. R.; PUTNAM, J. E.; JACOBSEN, L. B.;
NICHOLS, D. E.; McLAUGHLIN, J. L. Brine Shimp: A Convenient General
Biossay for Active Plant Constituents. Planta Medicinal, 45 (5): 31-34, 1982.
MORALES, A.; DOBARGANES, M. C.; MÁRQUEZ-RUIZ, G. & VELASCO, J
Quantitation of Hydroperoxy-, Keto- and Hydroxy-Dienes During Oxidation of
FAMEs from High-Linoleic and High-Oleic Sunflower Oils. Journal of the
American Oil Chemists‟ Society, 87: 1271-1279. 2010
MORALES, A.; MARMESAT, S.; DOBARGANES, M. C.; MÁRQUEZ-RUIZ, G.
& VELASCO, J. Quantitaive analysis of hydroperoxy-keto-and hydroxyl-dienes
in refined vegetable oils. Journal of Cromatography A., 1229: 190-197. 2012a.
MORALES, A.; MARMESAT, S.; DOBARGANES, M. C.; MÁRQUEZ-RUIZ, G.
& VELASCO, J. Formation of hydroperoxy-, keto- and hydroxyl-dienes in FAME
from oils: influence of temperature and addition of α-tocopherol. Journal of the
American Oil Chemists‟ Society, 89: 675-684. 2012b.
134
NOGUEIRA, L.; SANCHES, A. L. M.; da SILVA, D. G. H.; FERRIZI, V. C.;
MOREIRA, A. B.; ALMEIDA, E. A. Biochemical biomarkers in Nile tilapia
(Oreochromis niloticus) after shor-term exposure to diesel oil, pure biodiesel
and biodiesel blends. Chemosphere, 85: 97-105, 2011.
NOGUEIRA, L.; da SILVA, D. G. H.; OLIVEIRA, T. Y. K.; da ROSA, J. M. C.;
FELÍCIO, A. A.; de ALMEIDA, E. A. Biochemical responses in armored catfish
(Pterygoplichthys anisitsi) after short-term exposure to diesel oil, pure biodiesel
and biodiesel blends. Chemosphere, 99: 311-319, 2013.
NUNES, B. S.; CARVALHO, F. D.; GUILHERMINO, L. M.; VAN STAPPEN, G.
Use of the genus Artemia in ecotoxicity testing. Environmental Pollution, 144:
453-462, 2006.
PEREIRA, S.A.; ARAÚJO, V. Q.; REBOUCAS, M. V.; VIEIRA, F. S. V.; DE
ALMEIDA, M. V. A.; CHINALIA, F. A. & NASCIMENTO, I. A. Toxicity of
biodiesel, diesel and biodiesel/diesel blends: comparative sub-lethal effects of
water-soluble fractions to microalge species. Bulletin Environmental
Contamination and Toxicology, 88: 234-238. 2012.
ROBERTS, S.M.; JAMES, R. C.; WILLIAMS, P.L. (editors). Principles of
toxicology: environmental and industrial applications. New Jersey: John Wiley &
Sons, Inc., Hoboken, third edition, 2015.
ROSEN, G.; DOLECAL, R. E.; COLVIN, M. A. & GEORGE, R. D. Preliminary
ecotoxicity assessment of generation alternative fuels in seawater.
Chemosphere, 104: 265-270. 2014.
SHAHID, E. M. & JAMAL, Y. Production of biodiesel: a technical review.
Renewable and Sustainable Energy Reviews, 15: 4732-4745. 2011.
SORGELOOS, P.; Van Der WIELEN, PERSOONE, G. The use of Artemia
Nauplii for Toxicity Tests - A Critical Analysis. Ecotoxicology and Environmental
Safety, 2: 249-255, 1978.
135
TALEBIAN-KIAKALAIEH, A.; AMIM, N. A. S. & MAZAHERI. A review on novel
process of biodiesel production from waste cooking oil. Applie Energy, 104:
683-710. 2013.
TJARINTO, R & SALAMI, I. R. S. Toxicity test of water-soluble fractions of
waste vegetable oil-based biodiesel and biodiesel/diesel blends on Daphnia
magna and Allium cepa. Proceeding of the 3rd Applied Sciences for Technology
Innovation, 2014.
TORREZANI, N. C. Efeitos genotóxicos da fração solúvel do biodiesel para
uma espécie de peixe neotropical. Trabalho de Conclusão de Curso
licenciatura em Ciências Biológicas do Centro Universitário Filadélfia/UNIFIL.
54 f., 2009.
YASSINE, M. H.; WU, S.; SUIDAN, M. T. & VENOSA, A. D. Microtox aquatic
toxicity of petrodiesel and biodiesel blends: the role of biodiesel”s autoxidation
products. Environmental Toxicology and Chemistry, 31 (12): 2757-2762. 2012.
136
- Avaliação de alguns produtos naturais como antioxidantes Capítulo 4
para biodiesel metílico de óleos de fritura
Carrim, A. J. I.; Azeredo, W. A.; Camargo, R. P. L.; Bezerra, K. S.; Gomes, L. O.;
Antoniosi Filho, N. R.
Laboratório de Métodos de Extração e Separação (LAMES), Instituto de Química,
Universidade Federal de Goiás – Campus II, Samambaia, Goiânia, Goiás, Brasil,
74690-900
E. mail: [email protected]
RESUMO
A estabilidade oxidativa representa uma característica importante que indica a
qualidade do biodiesel concernente ao armazenamento e sua suscetibilidade à
degradação pela ação do oxigênio. Assim, este trabalho visa avaliar a eficácia
de três produtos naturais (cafeína, L-triptofano e curcumina) na melhora e
manutenção da estabilidade oxidativa de biodiesel de óleo residual de fritura
(ORF) produzido em laboratório. Os resultados apontaram que a cafeína não
apresentou efeito antioxidante e que o L-triptofano e a curcumina possuem
excelente ação antioxidante quando utilizados isoladamente, e que tal ação é
amplificada quando utilizados em conjunto, possibilitando o aumento rápido e
significativo do período de indução (de 4,91 h para 11,09 h já no início de
contato com o biodiesel), bem como o aumento da estabilidade oxidativa por
longo prazo, atingindo 30,51 h após 120 dias de armazenamento em condições
de laboratório. Dessa forma, a mistura L-triptofano e curcumina é mais efetiva
até mesmo que os antioxidantes sintéticos usados convencionalmente para
biodiesel.
Palavras chave: biodiesel metílico, curcumina, L-triptofano.
137
Evaluation of some natural products as antioxidants for frying oil´s
methylic biodiesel.
ABSTRACT
The oxidative stability is an important characteristic indicating the biodiesel
storage quality and its susceptibility to degradation by oxygen, therefore, this
paper aims at assessing the efficiency of three natural products (caffeine, L-
tryptophan and curcumin) on the improvement and maintenance of the oxidative
stability of biodiesel from frying residual oil (FRO) produced in laboratory. The
results pointed out that caffeine did not present antioxidant effect and L-
tryptophan and curcumin have excellent antioxidant action when used singly,
and that such action is enlarged when used as a set, enabling fast, significant
increase during the induction period (from 4.91 h to 11.09 h in the beginning of
the biodiesel contact), as well as a long-term increase in oxidative stability
reaching 30.51 h after 120 days of storage in laboratory conditions. Therefore,
the mixture of L-tryptophan and curcumin is even more effective than synthetic
antioxidants conventionally used for biodiesel.
Key words: curcumin, L-tryptophan, methylic biodiesel.
138
1. Introdução
A garantia da qualidade é um fator fundamental para a implementação e
consolidação de um programa de produção e uso de biodiesel. A aceitação
desse biocombustível pelo consumidor só ocorre se o mercado produtor
consegue garantir que o produto comercializado em sua forma pura (B100) ou
em misturas com o óleo diesel (BX) alcance os padrões de qualidade
preconizados pelas agências de regulação.
A estabilidade oxidativa é um dos fatores de maior importância na
produção de biodiesel, uma vez que pode drasticamente afetar a sua qualidade
com implicações sobre o seu desempenho nos sistemas de ararmaznamento e
injeção dos motores a diesel. Esta é a razão para as agências reguladoras
internacionais, produtores de biodiesel, fabricantes de motores, centros de
pesquisa e universidades ao redor do mundo investir tanto na investigação das
causas da oxidação do biodiesel e na busca por alternativas para evitá-la
(Zuleta et al., 2012).
As características que mais influenciam a qualidade do biodiesel puro ou
das misturas com óleo diesel estão relacionadas com a degradação do
biodiesel, uma vez que este é potencialmente suscetível à oxidação, em função
da presença de água, substâncias como mono- e diacilglicerídeos (compostos
intermediários provenientes da reação de transesterificação), glicerol residual
(favorece a emulsificação na presença de água), ar, radiação ultravioleta (UV),
calor, traços de metais, presença ou ausência de aditivos, peróxidos,
biodegradação ou crescimento microbiano, além de hidroperóxidos que podem
se formar no processo de oxidação, originando diversos compostos oxigenados
como aldeídos, ácidos e outros (Knothe, 2006; Leung et al., 2006, Chen & Luo,
2011; Natarajan, 2012; Jakeria, Fazal & Haseeb, 2014).
Em consequência da oxidação do biodiesel ocorrem várias alterações
nas suas propriedades físico-químicas, além de afetar os materiais que entram
em contato com o biodiesel e misturas. Parâmetros como índice de acidez,
viscosidade e índice de peróxidos tornam-se elevados e, por outro lado, os
índices de iodo e os teores de ésteres alquílicos podem diminuir. Além disso,
pode ocorrer a formação de resíduos poliméricos que causam o entupimento
139
de compenentes de válvulas, injeção, filtros e outras partes que se mantêm em
contato com o biodiesel (Zuleta et al., 2012).
Como uma alternativa para impedir ou retardar a velocidade de oxidação
é possível utilizar os antioxidantes, os quais impedem o início da auto-oxidação
(Figura 4.1). Esse processo gera radicais livres, e ainda auxiliam na remoção
destes do meio que se encontram, além de minimizar a formação de
compostos como peróxidos, aldeídos, cetonas, polímeros, ácidos carboxílicos,
oligômeros, gomas, sedimentos e dímeros gerado através da termo-oxidação
de ácidos graxos (Christoff, 2007; Kivevele et al., 2011; Silva, 2011; Fattah et
al., 2014).
Figura 4.1. Mecanismo de auto-oxidação dos lipídeos.
RH = Àcido graxo insaturado; R* = Radical livre; ROO* = Radical peróxido; ROOH =
Radical hidroperóxido.
Fonte: Ramalho & Jorge (2006).
Para alcançar a estabilidade oxidativa mínima aceitável, a indústria de
biodiesel normalmente utiliza duas estratégias: 1) efetua a mistura de um
biodiesel de baixa estabilidade oxidativa com outros que contenham maior
concentração de ácidos graxos saturados, como palma ou gordura animal, e
que, portanto, possuem maior estabilidade oxidativa, e/ou 2) adiciona
antioxidantes ao biodiesel. A primeira estratégia tem sido a mais empregada,
pois a maioria dos antioxidantes disponíveis comercialmente é de alto custo e
140
exigem o uso de altas quantidades de um produto sintético que, por
normalmente apresentar grupos polares, pode até mesmo se tornar menos
solúvel em uma mistura com óleo diesel (Jakeria et al., 2014).
Assim, considerando que em muitos países os óleos altamente
insaturados como soja e canola são a base para a produção de biodiesel, não
havendo disponibilidade de fontes ricas em ácidos graxos saturados, e que tem
aumentado o uso de óleos e gorduras residuais (OGR) como matéria-prima
graxa para a produção de biodiesel, a busca por antioxidantes de alto
desempenho vem sendo cada vez mais estudada, visando garantir a
estabilidade oxidativa do biodiesel.
Existem vários tipos de antioxidantes que podem ser adicionados ao
biodiesel para melhorar a estabilidade. A maioria corresponde a antioxidantes
sintéticos já empregados na indústria de óleos graxos, tais como pirogalol (PY),
ácido gálico (GA), propil galato (PG), butil-hidroxitolueno (BHT), butil-hidroxi-
anisol (BHA), difenilamina butilada e octilada (OBPA), 2,6-di-terc-butil-p-cresol
(DBPC) e terc-butil hidroquinona (TBHQ). Na tabela 4.1 constam alguns
exemplos de antioxidantes sintéticos e o efeito relativo para diferentes
biodieseis (Damasceno, 2011; Jakeria et al., 2014; Natarajan, 2012).
Tabela 4.1. Eficiência relativa de antioxidantes sintéticos para diferentes
biodieseis.
Tipos de biodiesel Eficiência relativa dos antioxidantes
Soja TBHQ Jatropha TBHQ > BHT > TBP > OBPA > α-T Palma TBHQ > BHT > BHA > α-Tocopherol Óleo de fritura PG > BHA > BHT > TBHQ > vitamin E Soja Ácido ferúlico > ácido caléfico Mamona BHA > PG > DBPC > TBHQ Girassol Ácido caléfico > Ácido clorogênico Coco Ácido caléfico Canola PY > PG > TBHQ > BHT Destilado de óleo de girassol TBHQ > PG > BHA > PY > BHT Óleo residual de palma PG > BHA > TBHQ > BHT > vitamina E Soja BHA_Prg > TBHQ_BHT > α-tocoferol Fonte: Jakeria et al. (2014)
Como exemplo de antioxidantes naturais tem-se os tocoferóis, os quais
são bastante consumidos pelas indústrias, além dos tocotrienóis, carotenóides,
141
compostos fenólicos e esteróis (Choe & Min, 2006; Bannwart, 2009; Del Ré &
Jorge, 2012; Pullen & Saeed, 2012).
Assim, o primeiro trabalho que descreve o uso de antioxidantes em
biodiesel foi publicado por Canakci et al. (1999) que testaram amostras
preparadas a partir de óleo de canola, de milho, de girassol, de cártamo e de
soja, utilizando butil hidroquinona terciária (TBHQ) como antioxidante, em três
concentrações diferentes (0,4%; 0,04% e 0,004%), por 90 dias e em 20 °C,
30°C e 50 °C. Neste estudo observaram ineficácia do antioxidante em 30 °C e
50 °C, porém as amostras preservadas a 20 °C apresentaram estabilidade
oxidativa acima de 6 horas, período de indução mínimo preconizado pela
legislação local à época.
Dunn (2002) conduziu o primeiro trabalho que avaliou a eficácia de um
antioxidante natural, o -tocoferol, adicionado ao biodiesel. Neste estudo
avaliou-se o efeito da oxidação sob condições aceleradas para biodiesel
comercial (B100) produzido a partir de óleo de soja acrescentado de 2000
mg/Kg de TBHQ e α-tocoferol, tendo sido constatado que ambos os
antioxidantes foram similarmente adequados, uma vez que foram obtidos
períodos de indução mínimos de 6 h. Em 2005, o mesmo autor realizou um
estudo complementar recomendando que concentrações acima de 3000 mg/Kg
de BHA ou TBHQ seriam recomendadas para melhores resultados, e que para
α-tocoferol tais quantidades seriam de no mínimo 5000 mg/kg.
Em 2003, Mushrush et al. avaliaram entre vários aspectos a estabilidade
oxidativa comparando amostras de biodiesel B10, B20 e B100 derivados de
soja e de óleo de fritura, com e sem a presença de antioxidante, e atestaram
que mesmo as amostras tendo propriedades químicas e físicas similares, o
antioxidante, de natureza não descrita pelos autores, manteve, entre outras
características, a estabilidade oxidativa.
Milttelbach & Schober (2003) mostraram a influencia de diferentes
antioxidantes naturais e sintéticos sobre a estabilidade oxidativa utilizando
biodiesel produzido a partir de óleos de colza, girassol, de fritura residual e
sebo bovino, destilados e não destilados. Utilizaram dez antioxidantes
comerciais e dez misturas de antioxidates naturais (tocoferóis) em
concentrações que variaram entre 100 e 1000 mg/Kg. Dentre os antioxidantes,
pirogalol (PY), propilgalato (PG) e terc-butil-hidroquinona (TBHQ) melhoraram
142
significativamente o período de indução das amostras de biodiesel de colza, de
óleo de fritura e de sebo bovino, enquanto que hidroxitolueno butilado (BHT)
não foi tão eficiente.
Schober & Mittelbach (2004) testaram 11 diferentes antioxidantes
fenólicos e sintéticos para melhorar a estabilidade oxidativa de biodiesel
metílico preparado a partir de óleo de colza (canola), sebo bovino e óleo de
fritura residual, e verificaram que a eficiência dos aditivos (concentração de
1000 mg/Kg) variou de acordo com a matéria-prima usada para preparar o
biodiesel, sendo de 5,13 h para o biodiesel metílico de colza (canola), 4,74 h
para o de sebo bovino e de 7,50 h para o de óleo residual de fritura.
Em 2004, Hess et al. testaram diversos antioxidantes sintéticos e
naturais (nitrato de 2-etilhexila ou 2-EHN, 2,2‟-metilenebis(6-tert-butil-4-
metilfenol, TBHQ, BHA, galato de propila, difenilamina e vitamina E), na
concentração de 10000 mg/Kg para verificar a diminuição em 4,4% da emissão
de NOx, que no caso foi obtida com BHA.
Sendizikiene et al. (2005) avaliaram a estabilidade oxidativa de biodiesel
produzido a partir de óleo de canola, linhaça, sebo e banha, acrescidos de
antioxidantes sintéticos (BHA e BHT, misturados com ácido cítrico a 20,0%),
em concentrações de 200 a 1000 mg/Kg. A concentração ideal ficou em 400
mg/kg, porém verificaram que variando também as misturas de óleo de origem
vegetal e animal, foi possível elevar o ponto de indução a até 23,2 h, sendo o
BHA mais eficiente que o BHT.
Para biodiesel etílico de óleo de girassol, Ferrari & Souza (2009)
compararam 4 amostras (uma isenta de antioxidante e outras adicionadas com
0,5% dos antioxidantes BHA, BHT e TBHQ) e confirmaram que TBHQ
proporcionou estabilidade oxidativa de 6,50 h, superior aos demais testados.
Em 2009, Rosenhaim constatou que para biodiesel etílico de óleo de
fritura de soja, descrito pela primeira vez, o BHT foi mais eficiente que o -
tocoferol, no tocante ao aumento da estabilidade oxidativa. Avaliado o
acréscimo de BHT em concentrações que variaram de 200, 500, 1000, 2000 e
2500 mg/Kg, os autores observaram que as concentrações de 2000 e 2500
mg/Kg proporcionaram estabilidade oxidativa de, respectivamente, 7,6 h e 8,5
h, comparando-se com α-tocoferol, que no máximo alcançou 2,9 h.
143
Borsato et al. (2010) utilizaram BHT, BHA e TBHQ em biodiesel metílico
de óleo de soja comercial, em concentrações de até 6,0x10-3 mol/L,
confirmando que TBHQ - puro ou em misturas binárias ou ternárias -
apresentou-se mais eficaz para aumentar a estabilidade oxidativa do biodiesel.
Em 2010, Galvão et al. demostraram que BHT é melhor que α-tocoferol,
ambos na concentração de 2000 mg/kg, para garantir 6 h de período de
indução para a estabilidade oxidativa de biodiesel metílico produzido com óleo
de mamona.
Rodrigues Filho (2010) avaliou por 180 dias a estabilidade oxidativa de
biodiesel etílico produzido a partir de algodão, acrescentados dos antioxidantes
cardanol, eugenol e BHT - todos a 2000 mg/Kg -, observando que o eugenol foi
mais efetivo, mantendo a estabilidade em 6 h.
De acordo com Damasceno (2011) o biodiesel etílico de soja aditivado
com os antioxidantes ácido caféico, ácido ferúlico e TBHQ teve a estabilidade
oxidativa mantida em níveis adequados, sendo que dentre esses o ácido
ferúlico foi o mais eficiente.
Chen & Luo (2011), usando amostras de biodiesel comercial obtido a
partir de ácidos graxos livres testaram 10 tipos de antioxidantes sintéticos e um
natural, e observaram que concentrações a partir de 100 mg/Kg podem
estabilizar a estabilidade oxidativa do biodiesel armazenado por até 6 meses,
sendo que o antioxidante PY foi o mais indicado.
Usando concentrações de 1000 mg/Kg de antioxidantes sintéticos e
comerciais, Guimarães (2011) demonstrou a eficácia relativa das substâncias
testadas (PY>BHA>PG>Baynox Plus>TBHQ>Kerobit TP 46>Baynox>BHT>
DTBHQ) em biodiesel com baixa estabilidade oxidativa (período de indução de
0,3 h), preparado a partir de óleo de fritura de soja e de sebo bovino.
O biodiesel produzido a partir de óleo de Croton megalocarpus não teve
sua estabilidade oxidativa em conformidade com os padrões de qualidade
vigentes e os antioxidantes PY, PG e BHA foram acrescentados, tendo sido
observado que BHA foi menos efetivo. Os demais antioxidantes garantiram a
conformidade do ponto de indução com a adição de 200 mg/Kg de qualquer um
dos antioxidantes testados (Kivevele et al., 2011).
Karavalakis et al. (2011) estudaram o impacto de vários antioxidantes
fenólicos sintéticos sobre a estabilidade da mistura de biodiesel (feito a partir
144
de 50% de óleo de colza, 20% de óleo de girasol e 20% de óleo de fritura) com
óleo diesel nas proporções B7, B10 e B20, confirmando que BHT E BHA são
os menos eficientes, com PG e PY apresentando melhores resultados.
Em 2012, Oliveira comparou os antioxidantes BHT, PG e PA em
biodiesel metílico de pinhão-manso (Jatropha curcas L.), nabo forrageiro
(Raphanus sativus L.) e de soja, e constatou a seguinte ordem crescente de
eficiência para concentrações de 1000 mg/Kg para pinhão-manso e nabo
forrageiro: BHT<PG<PA. Para o biodiesel de soja a ordem foi: PG<PA<BHT.
Em biodiesel metílico sintetizado a partir de óleo de soja, Santos (2013)
estudou o comportamento e eficácia dos antioxidantes comerciais BHT e ionol,
com os extraídos e derivados de biomassa, cardanol hidrogenado e cardanol
alquilado, em concentrações que variaram entre 300 e 4000 mg/kg, por até 12
meses, e constatou que os antioxidantes sintéticos a 600 mg/Kg são melhores
que os obtidos de biomassa a 4000 mg/Kg.
Castro (2013) utilizou curcumina como antioxidante em biodieseis
produzidos a partir de óleo de girassol, soja, canola, milho e coco de babaçu,
obtendo resultados que indicaram aumento no período de indução em todas as
amostras testadas e, de forma geral, evidenciou que sua solubilidade máxima
em lipídeos limita-se a 0,10%, em massa. Para o biodiesel de soja a curcumina
teve ação como antioxidante elevando a estabilidade em até 2,41 meses em
relação ao biodiesel sem a adição do antioxidante.
Da Silva (2013) realizou ensaios de estabilidade oxidativa utilizando um
antioxidante comercial (PY) e um natural, ácido gálico (AG), combinados ou
não entre si, e com 6 biocidas comerciais, em concentrações de 50, 100 e 200
mg/Kg, atingindo e mantendo o ponto de indução desejado para biodiesel
metílico produzido a partir de óleo de soja e de fritura e de canola.
Botella et al. (2014) avaliaram diferentes amostras de biodiesel metílico
de óleos de fritura de oliva, de porco, de soja, de colza, de girassol e de coco e
verificaram que o uso de catecol a 0,05% e 4-alil-2,6-dimetoxifeno a 0,01%
melhoraram a estabilidade oxidativa principalmente do biodiesel de colza e de
soja, cumprindo com as exigências da norma EN14214:2003.
Assim, conforme observado com a revisão literária sobre o tema, os
antioxidantes sintéticos normalmente apresentam maior eficácia, tendo sido
mais utilizados pelo mercado produto de biodiesel, apresentam, entretanto
145
maior custo que os antioxidantes naturais e podem trazer riscos à saúde
humana e ao meio ambiente, uma vez que podem ser comportar como
disruptores endócrinos, tal como apontado para o BHT (Cordeiro, 2013).
Ademais, estudos toxicológicos têm apontado efeitos carcinogênicos em
animais para uso de BHA e BHT (Ramalho & Jorge, 2006).
Portanto, continua a busca por antioxidantes naturais que possam ser
mais efetivos que os sintéticos para garantir a estabilidade oxidativa adequada
ao biodiesel, respeitando os limites máximos de adição de tal tipo de aditivo no
biocombustível. Especificamente no caso do Brasil, a ANP estipula, na
Resolução No 45 de 25 de agosto 2014, que um aditivo, no caso antioxidante,
pode er adicionado ao combustível em concentração que não exceda a 5.000
µL/L (0,5 % v/v).
Desta forma, visando obter antioxidantes naturais que além de serem
mais efetivos no aumento da estabilidade oxidativa do biodiesel, apresentem
também menor custo de aquisição e maior disponibilidade, neste trabalho
avaliou-se o uso de cafeína, curcumina e L-triptofano (Figura 4.2) e como
antioxidantes naturais para biodiesel de óleo residual de fritura (ORF).
Figura 4.2. Estruturas químicas da cafeína, da curcumina e do L-triptofano.
Vale observar que, até o momento, apenas Prados (2014) testou a ação
isolada de L-triptofano em biodiesel de ORF, e que a curcumina ainda não foi
testada como antioxidante para biodiesel de ORF, caracterizando esta
pesquisa como um estudo inédito para esses antioxidantes naturais, os quais
apresentam baixo custo e baixo impacto para o meio ambiente e para a saúde
humana.
146
2. Experimental
2.1 Amostragem
O óleo residual de fritura (ORF) utilizado para a produção de biodiesel foi
doado por um estabelecimento comercial que funciona como restaurante e bar,
localizado no munícipio de Anápolis (Estado de Goiás - Brasil), e foi utilizado na
fritura de diversos alimentos por duas semanas. As amostras de óleo e
biodiesel de ORF foram acondicionadas em frascos de PEAD, temperatura
ambiente e no escuro.
2.2 Produção de biodiesel metílico de ORF
A amostra de ORF foi submetida à filtração simples para separação dos
resíduos de alimentos presentes. Depois, o ORF foi submetido à extração
líquido-líquido com água destilada, seguida de destilação simples para retirada
da água residual (Azeredo, 2014). Após estas etapas, a amostra de ORF foi
levada a esterificação ácida e posteriormente a transesterificação alcalina, sob-
rota metílica, segundo metodologia também desenvolvida por Azeredo (2014).
Assim, para a produção das amostras de biodiesel metílico de ORF
utilizou-se a proporção de 1:9 de óleo e metanol P.A. (Tedia®) e 2% (v/v) de
ácido sulfúrico (Vetec®) como catalisador ácido. Em seguida foram colocados
sob-refluxo, sob agitação (agitador magnético com medidor de temperatura
modelo MA 085/CT) em banho-maria a 90 °C, por 3 horas. Para remoção do
catalisador e resíduos de metanol procedeu-se a lavagem com água quente
(± 70 °C), seguido da filtração em sulfato de sódio anidro (Vetec®).
A reação de transesterificação alcalina foi feita em reator da marca
Marconi Modelo MA 159/150, utilizando-se a proporção de 1:12 para a razão
óleo:metanol e 1,5% (m/v) de hidróxido de potássio (Vetec®) solubilizado
inicialmente em metanol P.A. (Tedia®) para gerar uma solução de metóxido de
sódio. A solução de metóxido de potássio foi acrescentada à mistura de óleo e
metanol e levada ao reator para agitação a 1000 rpm, a 60 °C, por 1 hora. Em
seguida, aguardou-se por 24 horas a separação do glicerol e, após a
separação deste, procedeu-se à neutralização do catalisador com solução
147
aquosa de ácido clorídrico a 0,5 mol/L e lavagem com água destilada para
retirada do ácido. Tal lavagem foi feita até que a fase aquosa torne-se límpida e
finalmente, o resíduo de água e metanol foi retirado através de rotaevaporação
sob pressão reduzida.
O biodiesel metílico de óleo residual de fritura sintetizado foi analisado
com base nos parâmetros estabelecidos na Portaria ANP no 45 de 25/08/2014
(anexo I).
2.3 Avaliação da estabilidade oxidativa
As substâncias testadas como antioxidantes foram o aminoácido L-
triptofano (marca Vetec® - 98,5% de pureza), a cafeína (marca Cromoline –
98,5% de pureza) e a curcumina (a partir do pó de Curcuma longa – Turmeric -
Sigma-Aldrich® – C1386-50G - 65% de pureza), em concentrações que
variaram de 100 a 1000 mg de antioxidante por quilograma de biodiesel,
adicionados diretamente ao biodiesel B100 produzido a partir de óleos de
fritura residuais.
Curcumina e cafeína tiveram suas atividades antioxidantes avaliadas
isoladamente em biodiesel, enquanto L-triptofano foi avaliado em conjunto com
os dois primeiros já que a avaliação isolada de L-triptofano em biodiesel de
ORF já foi efetuada por Prados et. al. (2012). Para a avaliação da estabilidade
oxidativa utilizou-se o equipamento Biodiesel Rancimat Metrohm, modelo 873,
conforme EN ISO 14112:2003, sendo obtidos os índices de estabilidade
oxidativa (IEO) ou período de indução (IP) em horas.
As análises foram realizadas em amostra de biodiesel de ORF
sintetizada em laboratório e isenta de antioxidantes. A estabilidade oxidativa
avaliada com e sem a adição dos antioxidantes de biodiesel foi feita em
amostra recém-sintetizada em diferentes concentrações, isoladamente e
combinando os antiodiantes entre si. Os antioxidantes foram adicionados ao
biodiesel e homogeneizados em shaker, por 10 minutos a 150 RPM. Os
ensaios foram feitos em duplicata para medição do período de indução (IP) na
temperatura de 110° C, sendo o IEO determinado a partir do ponto de inflexão
da curva de condutividade.
148
Os ensaios de estabilidade oxidativa foram feitos imediatamente após a
adição dos antioxidantes nos tempos zero, 7, 15, 30, 60, 90 e 120 dias, os
quais permaneceram acondicionados em frascos plásticos PEAD, em condição
aeróbia e protegidos da luz.
3. Resultados e discussão
O biodiesel de ORF apresentou os resultados referentes à qualidade
relatados na Tabela 4.2.
Tabela 4.2.Características físico-químicas das amostras de biodiesel.
* LII = Límpido e isento de impurezas LOQ = Limite de quantificação
O biodiesel de ORF apresentou alta viscosidade, o que pode ser
explicado pela excessiva presença de derivados oxidados de ácidos graxos
livres e ligados ao glicerol.
Características de Qualidade Especificação da ANP Valores obtidos para
Biodiesel de ORF Limite Unidade
Aspecto LII* - LII
Massa Especifica 850 a 900 kg/m3 920,20
Viscosidade (40 °C) 3,0 a 6,0 mm2/s 36,2
Teor de Água ≤ 200 mg/kg 1352
Índice de Acidez ≤ 0,50 mg KOH/g 1,85
Na + K ≤ 5 mg/kg 268,8
Ca + Mg ≤ 5 mg/kg 0,8
P ≤ 10 mg/kg <LOQ
Teor de éster ≥ 96,5 % massa 96,9
Glicerol livre ≤ 0,02 % massa 0,04
Glicerol total ≤ 0,25 % massa 0,16
Monoacilglicerídeos ≤ 0,7 % massa 0,4
Diacilglicerídeos ≤ 0,20 % massa 0,06
Triacilglicerídeos ≤ 0,20 % massa 0,04
Índice de Iodo Anotar g/100 g 53,9
Estabilidade Oxidativa ≥ 8 h 4,09
149
O elevado teor de água dissolvidal, que influencia negativamente na
massa específica, pode ser explicado pela interação desta com tais
substâncias oxidadas e também pela dificuldade operacional de remover a
água via rotaevaporação, sendo que na indústria os baixos teores de água só
são alcançados vias microaspersão à vácuo do biodiesel, algo de difícil
execução em escala laboratorial. Entretanto, do ponto de vista de avaliação
dos antioxidantes, é interessante que a amostra de biodiesel a ser testada
tenha elevado teor de água, pois esta facilita a solubilização do oxigênio,
diminuindo a estabilidade oxidativa do biocombustível e dificultando interação
do antioxidante com os ésteres apolares, caso o antioxidante contenha
agrupamentos polares, tais como as hidroxilas da curcumina, ou que
contenham funções amina ou ácido, tal como o L-triptofano.
O elevado teor de sódio e potássio é oriundo da ineficácia do processo
de lavagem do biodiesel, o qual foi propositalmente mantido dessa forma, pois
se sabe que elevados teores de metais também diminuem a estabilidade
oxidativa do biodiesel, o que, nesse caso, proporcionará com que a eficácia
dos antioxidantes seja avaliada também com respeito a esse fator.
Da mesma forma, a baixa estabilidade oxidativa inferior à mínima
estabelecida em legislação (8h) também foi desejada para permitir avaliar se a
adição dos antioxidantes pode aumentar tal valor, de forma a adequar o
biodiesel de ORF ao preconizado na legislação.
Assim, procederam-se os ensaios de adição dos antioxidantes ao
biodiesel de ORF, inicialmente com a avaliação da cafeína. Os resultados
obtidos não se apresentaram satisfatórios, uma vez que não houve alteração
no período de indução para as concentrações testadas em relação ao biodiesel
sem a adição de cafeína.
Assim, partiu-se para a avaliação da atividade antioxidante da curcumina,
sendo que a Tabela 4.3 apresenta os resultados obtidos para as amostras
preparadas com a adição desse produto natural ao biodiesel de ORF e
avaliadas nos tempos 0, 7, 15, 30, 60, 90 e 120 dias aramazenados, mantidos
em condições laboratoriais, em frascos plásticos, fora do alcance da luz e com
ambiente aeróbio comum (headspace).
Experimentalmente observou-se que a curcumina é solúvel em biodiesel
em concentrações de até 100 mg/Kg, sendo que nessa concentração nominal,
150
segundo a Tabela 4.3, tal aditivo natural se mostrou ineficiente para aumentar a
estabilidade oxidativa do biodiesel.
Tabela 4.3.Tempo de indução para o biodiesel de ORF aditivado ou não com
curcumina, em função do tempo após a adição do antioxidante.
Concentração nominal (mg/Kg) de
curcumina em biodiesel de ORF
Período de indução (h) em função do tempo de armazenamento (dias)
0 dias 7 dias 15 dias 30 dias 60 dias 90 dias 120 dias
0 3,81 3,05 1,90 0,05 0,05 0,04 0,04
100 4,67 2,75 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04
500 3,56 3,65 3,75 0,04 0,04 0,04 0,04
700 7,56 14,74 20,54 25,08 25,45 25,99 26,70
O ensaio a 500 mg/Kg demonstrou a formação de um resíduo insolúvel
que foi completamente solubilizado em 15 dias, sendo que a estabilidade
oxidativa foi mantida até esse período, mas não foi ampliada com relação ao
valor inicial, tendo decaído a partir de 30 dias de armazenamento.
Para uma amostra de biodiesel de ORF que continha curcumina na
concentração nominal de 700 mg/Kg, imediatamente após a adição do
antioxidante observou-se também a formação de um corpo de fundo de um
resíduo insolúvel que foi sendo solubilizado com o passar dos dias, estando
plenamente solúvel até o trigésimo dia após a adição de curcumina.
Para essa amostra, a estabilidade oxidativa, segundo a Tabela 5.2, foi
imediatamente elevada em torno de 98,4% (7,56 h) e ao longo de 120 dias foi
aumentado em torno de 600% (26,7 h) com relação a estabilidade oxidativa no
tempo zero sem a adição de antioxidante (3,81 h), dessa forma superando a
estabilidade oxidativa mínima de 8h estabelecida pela Resolução ANP No 45
de 25 de agosto de 2014 (anexo I), e mantendo o ponto de indução em níveis
elevados nos 120 dias de armazenamento.
Adicionalmente analisou-se tal amostra de biodiesel após 240 dias,
observando-se que a mesma apresentou período de indução de 17,2 h,
comprovando assim o potencial de uso da curcumina como antioxidante de
biodiesel em condições de saturação do biodiesel com tal antioxidante natural.
Testou-se por fim o uso da adição de curcumina na concentração
nominal de 1000 mg/Kg, mas o resíduo insolúvel formado não se dissolveu
151
completamente nessa concentração, desconsiderando-se assim a possibilidade
de uso desse antioxidante nessa concentração nominal.
Dessa forma, a curcumina demonstra ser um antioxidante natural para
biodiesel, que além de aumentar a estabilidade oxidativa do biocombustível
imediatamente após a adição do antioxidante, mantém elevada a estabilidade
oxidativa durante longo período de armazenamento. Apesar disso, esse efeito
só foi observado em concentração nominal de 700 mg/Kg, sem ser evidenciado
em concentrações inferiores.
Para tentar explicar tal comportamento é necessário compreender o
mecanismo de ação antioxidante da curcumina, o qual é bastante controverso.
Segundo Castro (2013) a maioria dos autores aponta que a atividade oxidante
é devida aos grupos de hidroxila presentes e outros apontam a participação
das duplas ligações e dos grupos carbonila, separadamente ou em conjunto,
com os grupos para-hidroxilícos.
Já Masuda et al. (2001) apontam que o efeito antioxidante da curcumina
é ainda desconhecido, mas propõem que tal efeito se dá pela formação de
estruturas de acoplamento entre as duplas ligações dos ácidos graxos e a
parte aromática da curcumina, de forma similar a uma reação de Diels-Alder
intramolecular, sendo que o produto de acoplamento não é muito estável
devido a estabilidade do anel aromático da curcumina.
Os autores ainda apontam que a reação de Diels-Alder intramolecular
pode não ocorrer, pois um substituinte alquila da dupla ligação cis de parte dos
peróxidos dos ácidos graxos pode impedir a reação, devido a um efeito
estérico.
Dessa forma, para que esses mecanismos possam ser efetivos, parece
ser necessário que a maioria ou a totalidade das duplas ligações estejam
protegidas do efeito oxidante do oxigênio, o que só é obtido com a saturação
do meio com curcumina, em concentração nominal de 700 mg/Kg.
A avaliação realizada com o L-triptofano (Tabela 4.4) demonstrou
elevação no tempo de indução, como já observado por Prados (2014). O L-
triptofano livre é um dos aminoácidos com maior atividade antioxidante
conhecida (Perez-Gonzalez et al., 2014), sendo que tal atividade é explicada
pelo fato de apresentar estrutura química que favorece seu efeito antioxidante
através da estabilização do radical e quelação do oxigênio singlete.
152
O L-triptofano interage com esse tipo de oxigênio tanto por reação
química radicalar quanto por transferência de energia com seu retorno ao
estado fundamental posteriormente. Tal característica única o qualifica como
substância de grande potencial antioxidante (Rosein et al., 2006), o que é
confirmado pois demonstra ação antioxidante já a partir da concentração
nominal de 100 mg/Kg. Porém, igualmente à curcumina, a 700 mg/Kg é que se
observa uma ação de longo prazo na adequação da atividade antioxidante.
Tabela 4.4.Tempo de indução para o biodiesel de ORF aditivado ou não com
L-triptofano, em função do tempo após a adição do antioxidante.
Concentração nominal (mg/Kg) de
L-triptofano em biodiesel de ORF
Período de indução (h) em função do tempo de armazenamento (dias)
0 dias 7 dias 15 dias 30 dias 60 dias 90 dias 120 dias
0 3,81 3,05 2,85 2,40 0,04 0,04 0,04
100 4,67 4,24 4,22 4,17 0,05 0,04 0,04
500 8,47 8,15 7,99 6,59 0,06 0,05 0,05
700 13,08 16,79 23,10 17,02 15,67 13,08 11,96
1000 16,91 18,90 25,81 20,08 17,32 14,43 12,39
A desvantagem do L-triptofano é que até mesmo na concentração
nominal de 100 mg/Kg se observou a formação de um resíduo insolúvel como
corpo de fundo, o qual, ao contrário da curcumina, não se manteve solúvel com
o passar do tempo. Assim, a solubilidade do L-triptofano é mais baixa que da
curcumina em biodiesel, o que significa que, apesar da concentração nominal
adequada ser de 700 mg/Kg, sua concentração efetiva é bem menor.
Comparando o percentual de aumento da estabilidade oxidativa do
biodiesel de ORF com relação a estabilidade oxidativa inicial do biodiesel de
ORF (3,81 h), tanto para o triptofano quanto para a curcumina (Tabela 4.5) na
concentração nominal de 700 mg/Kg, observa-se que o L-triptofano amplia em
maior intensidade a estabilidade oxidativa já no momento inicial de contato com
o biodiesel (tempo 0 horas), mantendo um crescente e superior período de
indução até 15 dias de armazenamento.
153
Tabela 4.5. Percentual de aumento do período de indução para o biodiesel de
ORF aditivado com curcumina e L-triptofano com relação a estabilidade
oxidativa inicial do biodiesel de ORF (3,81 h), para a concentração nominal de
700 mg/Kg, ao longo do tempo de armazenamento.
Antioxidante
Percentual de aumento do período de indução (%) com relação ao período de indução inicial
0 dias 7 dias 15 dias 30 dias 60 dias 90 dias 120 dias
Curcumina 98,43 286,88 439,11 558,27 567,98 582,15 600,79
L-Triptofano 243,31 340,68 506,30 346,72 311,29 243,57 213,91
Assim, no tempo inicial de contato do L-triptofano (0 dias), o período de
indução para o biodiesel de ORF foi de 3,81 h para 13,08 h com a adição de L-
triptofano, representando um aumento de 243,31% no valor do período de
indução. Em 15 dias, o valor do período de indução foi de 23,10 h, o que
representa um aumento de 506,30% com relação ao valor inicial de 3,81 h. A
partir de 30 dias os valores percentuais do aumento do período de indução com
relação a estabilidade oxidativa inicial começam a diminuir até alcançar
213,91% após 120 dias, o que ainda é bastante relevante.
Para a curcumina os valores percentuais são crescentes ao longo de
todo tempo de estudo, atingindo o ápice de 600,79% em 120 dias.
Assim tais percentuais são relevantes e comprovam a eficácia de ambos
antioxidantes naturais para biodiesel de ORF.
Tais aumentos percentuais são inclusive mais relevantes quando se
compara o percentual de aumento da estabilidade oxidativa do biodiesel de
ORF, tanto para o triptofano quanto para a curcumina na concentração nominal
de 700 mg/Kg, com relação a cada período de armazenamento (Tabela 4.6).
Nessa situação o L-triptofano proporciona aumentos percentuais que
vão de 243,31% (de 3,81 h para 13,08 h em 0 dias) a até 39.075% (de 0,04 h
para 15,67 h em 60 dias). Para a curcumina, os aumentos percentuais são
também relevantes e vão de 98,43% (de 3,81 h para 7,96 h em 0 dias) a
66.650 % (de 0,04 h para 26,70 h em 120 dias). Vale observar que os valores
aumentaram bruscamente quando o IP obtido para o biodiesel de referência se
aproximou de zero.
154
Tabela 4.6. Percentual de aumento da estabilidade oxidativa para biodiesel de
ORF aditivado com curcumina e L-triptofano em relação com o não aditivado,
para a concentração nominal de 700 mg/Kg, ao longo do tempo de
armazenamento.
Antioxidante
Percentual de aumento do período de indução (%) para cada período de armazenamento em relação ao biodiesel não aditivado
0 dias 7 dias 15 dias 30 dias 60 dias 90 dias 120 dias
Curcumina 98,43 383,28 981,05 50.060,00 50.800,00 64.875,00 66.650,00
L-Triptofano 243,31 450,49 710,53 609,17 39.075,00 32.625,00 29.800,00
Assim, de forma a aproveitar o efeito de maior aumento da estabilidade
oxidativa no início do armazenamento, causado pelo L-triptofano, com o efeito
de manutenção da estabilidade oxidativa a longos períodos de
armazenamento, causado pela curcumina, avaliou-se a atividade antioxidante
de misturas de L-triptofano e curcumina em diferentes proporções dos
antioxidantes adicionados ao biodiesel de ORF, com os resultados sendo
apresentados na Tabela 4.7.
Tabela 4.7. Tempo de indução para o biodiesel de ORF aditivado ou não com a
mistura L-triptofano/curcumina, em função do tempo de armazenamento.
Concentração nominal (mg/Kg) de
L-triptofano/curcumina em biodiesel de ORF
Período de indução (h) em função do tempo de armazenamento (dias)
0
dias
7
dias
15
dias
30
dias
60
dias
90
dias
120
dias
0/0 4,91 2,18 1,55 1,43 0,05 0,05 0,04
50/50 4,93 2,75 1,90 0,98 0,05 0,05 0,04
250/250 5,01 6,18 4,99 3,52 0,05 0,05 0,04
350/350 11,09 11,92 16,20 19,32 24,78 27,09 30,51
500/500 11,78 12,74 13,62 15,89 17,88 19,42 20,98
Observou-se que, em conjunto, os antioxidantes aumentam ainda mais a
estabilidade oxidativa, sugerindo assim a ocorrência de sinergismo entre L-
triptofano e curcumina. Na melhor condição, envolvendo concentrações
nominais de 350 mg/Kg de cada um dos antioxidantes naturais em biodiesel, a
estabilidade oxidativa do biocombustível já encontra-se adequada em 0 dias,
estando a 11,09 h, e elevando-se de forma crescente até atingir 30,51 h de
período de indução após 120 dias de armazenamento.
155
Nessa relação de concentração, ainda era possível encontrar um
pequeno resíduo insolúvel de curcumina, bem como a presença de L-triptofano
insolúvel ao final de 120 dias. Dessa forma, por questões de facilidade de
implementação e da necessidade de análise completa da qualidade do
biodiesel no setor produtivo, sugere-se que a adição da mistura antioxidante L-
triptofano/curcumina seja realizada nas usinas de produção de biodiesel, como
uma etapa adicional ao processo produtivo, realizada após a remoção de água
via microaspersão à vácuo, e caracterizada por um sistema de mistura seguido
de decantação e remoção de sólidos insolúveis.
Desta forma, os resultados obtidos apontam que a mistura de dois
antioxidantes naturais curcumina e L-triptofano consegue elevar
substancialmente o período de indução, tal como obtido com o uso de
antioxidantes sintéticos, com a vantagem de fazer algo inovador relatado
apenas para antioxidantes sintéticos usados para biodiesel, que é o aumento
da estabilidade oxidativa durante a estocagem simulada para o período de 120
dias.
4. Conclusões
Dentre os três antioxidantes testados, apenas a cafeína não apresentou
efeito antioxidante para biodiesel metílico produzido com óleo de fritura
residual.
Observou-se que a curcumina e o L-triptofano apresentam grande
potencialidade para serem utilizados como antioxidantes em biodiesel metílico
produzido a partir de óleo de fritura residual, uma vez que ambos revelaram a
capacidade de aumentar o período de indução.
O L-triptofano apresentou maior efetividade no aumento da estabilidade
oxidativa em curto prazo (até 30 dias) e a curcumina apresentando a
propriedade de relativamente menos efetiva que o L-triptofano em curto prazo,
mas ampliando com maior eficiência a estabilidade oxidativa do biodiesel de
ORF armazenado em até 120 dias.
Ficou evidenciado que curcumina e L-triptofano, quando usados em
conjunto, proporcionam melhores resultados que seu uso isolado, para o
aumento e manutenção temporal da estabilidade oxidativa, indicando que seu o
156
efeito sinérgico do uso conjunto de ambos os antioxidantes naturais
corresponde a uma excelente opção natural de aditivo antioxidante para
biodiesel metílico de óleos de fritura residuais.
Ressalta-se, entretanto que tais melhorias devem ser vinculadas em um
pós-tratamento de remoção de precipitados e de monitoramento da
estabilidade o produto ao longo do tempo após adição ao biodiesel e às suas
misturas com óleo diesel.
5. Referências Bibliográficas
ANP. AGÊNCIA NACIONAL DO PETRÓLEO, GÁS NATURAL E
BIOCOMBUSTÍVEIS (ANP). RESOLUÇÃO ANP Nº 45, DE 25.8.2014 - DOU
26.8.2014.
AZEREDO, W. A. Otimização da produção de biodiesel metílico a partir de
óleos de fritura residuais (0FR). Dissertação de mestrado apresentada ao
Instituto de Química da Universidade Federal de Goiás/UFG. Goiânia (G0). 104
f., 2014.
BANNWART, E. S. Avaliação da termo-oxidação de óleos refinados de milho
com e sem antioxidantes via propriedades térmicas, ópticas e termo-ópticas.
Dissertação apresentada ao Departamento de Física da Universidade Estadual
de Maringá. Maringá (PR), 99 p., 2009.
BORSATO, D.; ANTONIA, L. H. D.; GUEDES, C. L. B.; MAIA, E. C. R.;
FREITAS, H. R. de; MOREIRA, I.; SPACINO, K. R. Aplicação do delineamento
simplex-centroide no estudo da cinética da oxidação de biodiesel B100 em
mistura com antioxidantes sintéticos. Química Nova. 33 (8): 1726-1731, 2010.
BOTELLA, L., BIMBELA, F., MARTÍN, L., ARAUZO, J., SÁNCHEZ, J. Oxidation
stability of biodiesel fuels and blends using the Rancimat and Petrooxy
methods. Effect of 4-allyl-2,6-dimethoxyphenol and cathecol as biodiesel
additives on oxidation stability. Frontiers in Chemistry. 2 (43): 1-9, 2014.
157
CANAKCI, M.; MONYEM, A.; VAN GERPEN, J. Accelerated oxidation
processes in biodiesel. Transactions of the American Society of Agricultural
Engineer (ASAE). 42 (6): 1565-1572, 1999.
CASTRO, A. G. Estudo da influência da curcumina na estabilidade oxidativa de
biodieseis e óleos vegetais. Tese apresentada ao Instituo de Química da
Unicamp. Campinas (SP), 133 p., 2013.
CHEN, Y.H. & LUO, Y.M. Oxidation stability of biodiesel derived from free fatty
acids associated with kinetics of antioxidants. Fuel Processing Technology. 92:
1387-1393, 2011.
CHOE, E. & MIN, D. B. Mechanisms and factors for edible oil oxidation.
Comprehensive reviews in Food Science and Food Safety. 5 (4): 169-186,
2006.
CORDEIRO, A. M. T. M. Desenvolvimento de bioaditivos antioxidantes para
otimização da estabilidade oxidativa de óleos comestíveis. Tese apresentada
ao Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos da
Universidade Federal da Paraíba. João Pessoa (PB), 130 p., 2013.
CHRISTOFF, P. Produção de Biodiesel a partir do óleo de residual de fritura
comercial. Estudo de caso: Guaratuba, Litoral Paranaense. Dissertação
apresentada ao Instituto de Tecnologia para o Desenvolvimento – LACTEC e
Instituto de Engenharia do Paraná – IEP. Curitiba (PR), 82 p., 2007.
DA SILVA, G. V. Caracterização Experimental do Efeito Combinado de Aditivos
no Desempenho de Misturas Biodiesel-Óleo Diesel. Tese apresentada ao
Departamento de Engenharia Mecânica da Universidade de Brasília, Distrito
Federal, 193 p., 2013.
DAMASCENO, S. S. Avaliação da atividade antioxidante dos ácidos caféico e
ferúlico no controle da estabilidade oxidativa do biodiesel de soja. Dissertação
158
apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Química da Universidade
Federal da Paraíba. João Pessoa (PB), 96 p., 2011.
DEL RÉ, P. V. & JORGE, N. Especiarias como antioxidantes naturais:
aplicações em alimentos e implicação na saúde. Revista Brasileira de Plantas
Medicinais. 14 (2): 389-399, 2012.
DUNN, R. O. Effect of Oxidation under accelerated conditions on fuel properties
of methyl soyate (biodiesel). Journal of the American Oil Chemists‟ Society, 79
(9): 915-920, 2002.
EN 14114 Determination of oxidation stability (accelerated oxidation test).
European Committee for Standardization. Berlin, 2003.
FATTAH, I. M. R.; MASJUKI, H. H.; KALAM, M. A.; HAZRAT, M. A.; MASUM,
B. M.; IMTENAN, S.; ASHRAFUL, A. M. Effect of antioxidants on oxidation
stability of biodiesel derived from vegetable and animal based feedstocks.
Renewable and Sustainable Energy Reviews. 30: 356-370, 2014.
FERRARI, R. A. & SOUZA, W. L. Avaliação da estabilidade oxidativa de
biodiesel de óleo de girassol. Química Nova. 32 (1): 106-111, 2009.
GALVÃO, L. P. F. C.; SILVA, E. F. B.; GONDIM, A . D.; FERNANDES JUNIOR,
V. J.; ARAUJO, A. S. Estudo comparativo da influência do antioxidante na
estabiliade oxidativa do biodiesel por Termogravimetria e Petrooxy. IV
Congresso Brasileiro de Mamona e I Simpósio Internacional de Oleaginosas
Energéticas, João Pessoa, PB, p. 76-80, 2010.
GUIMARÃES, I. M. G. Antioxidantes na estabilidade oxidativa do biodiesel.
Dissertação apresentada ao Departamento de Engenharia Metalúgica e de
Materiais da Faculdade de Engenharia da Universidade do Porto. 53 p., 2011.
159
HESS, M. A.; HAAS, M. J.; FOGLIA, T. A.; MARMER, W. N. The effect of
antioxidant addition on NOx emissions from biodiesel. Preprints of Papers-
American Chemical Society, Division of Fuel Chemistry. 49 (2): 852-853, 2004.
JAKERIA, M. R.; FAZAL, M. A.; HASEEB, A. S. M. A. Influence of different
factors on the stability of biodiesel: A review. Renewable and Sustainable
Energy Reviews. 30: 154-163, 2014.
KARAVALAKIS, G.; HILARI, D.; GIVALOU, L.; KARONIS, D.; STOURNAS, S.
Storage stability and ageing effect of biodiesel blends treated with different
antioxidants. Energy. 36: 369-374, 2011.
KIVEVELE, T. T.; MBARAWA, M. M.; BERECZKY, A.; LAZA, T.; MADARASZ,
J. Impact of antioxidant additives on the oxidation stability of biodiesel produced
from Croton Megalocarpus oil. Fuel Processing Technology, 92: 1244-1248,
2011.
LEUNG, D. Y. C.; KOO, B. C. P.; GUO, Y. Degradation of biodiesel under
diferente storage conditions. Bioresource Technology, 97: 250-256, 2006.
KNOTHE, G. Estabilidade à Oxidação do Biodiesel – Revisão de Literatura. In:
Manuel do Biodiesel. Ed. Knothe, G.; Jon Van Gerpen, J. K.; Ramos, L. P. São
Paulo: Edgard Blucher, 340 p., 2006.
MASUDA, T.; MAEKAWA, T.; HIADAKA, K.; BANDO, H.; TAKEDA, Y. &
YAMAGUCHI, H. Chemical studies on antioxidant mechanism of curcumin:
Analysis of oxidative coupling products from curcumin and linoleate. Journal of
Agricultural and Food Chemistry, 49 (5): 2539-2547, 2001.
MITTELBACH, M. & SCHOBER, S. The Influence of Antioxidants on the
Oxidation Stability of Biodiesel. Journal of the American Oil Chemists‟ Society,
80 (8): 817-823, 2003.
160
MUSHRUSH, G. W.; WYNNE, J. H.; HUGHES, J. M.; BEAL, E. J.; LLOYD, C.
T. Soybean-Derived Fuel Liquids from Different Source as Blending Stocks for
Middle Distillate Ground Transportation Fuel. Industrial &. Engineering
Chemical Research, 42: 2387-2389, 2003.
NATARAJAN, E. Stability Studies of Biodiesel. International Journal of Energy
Science, 2 (4): 152-155, 2012.
OLIVEIRA, R. M. Estudo térmico e oxidativo em diferentes matrizes de
biodiesel com adição de antioxidantes. Dissertação apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Química do Centro de Ciências Exatas da Universidade
Federal do Espírito Santo. Vitória (ES). 79 f., 2012.
PEREZ-GONZALEZ, A.; MUNOZ-RUGELES, L.; ALVAREZ-IDABOY, J.R.
Tryptophan: Antioxidant or target of oxidative stress? A quantum chemistry
elucidation RSC Adv. 4, 56128– 56131, 2014.
PRADOS, C. P. Avaliação da aplicabilidade físico-química e microbiológica de
biantioxidantes para biodiesel. Tese apresentada ao Instituto de Química da
Universidade Federal de Goiás, Goiânia (GO), 106 p., 2014.
PULLEN, J. & SAEED, K. Na overview of biodiesel oxidation stability.
Renewable and Sustainable Energy Reviews. 16: 5924-5950, 2012.
RAMALHO, V. C. & JORGE, N. Antioxidantes usados em óleos, gorduras e
alimentos gordurosos. Química Nova, 29: 755-760, 2006.
RODRIGUES FILHO, M. G. Cardanol e Eugenol Modificados – Uso como
antioxidantes no controle do processo oxidativo do biodiesel etílico de algodão.
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Química da
Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa, 122 p., 2010.
161
ROSEIN, G. E.; MIYAMOTO, S.; BECHARA, E.; DI MASCIO, P. Oxidação de
proteínas por oxigênio singlete: mecanismos de dano, estratégias para
detecção e implicações biológicas. Química Nova, 29 (03): 563-568, 2006.
ROSENHAIM, R. Avaliação das Propriedades Fluído-dinâmicas e Estudo
Cinético por Calorimetria Exploratória Diferencial Pressurizada (PDSC) de
Biodiesel Etílico Derivado de Óleo de Fritura Usado. Tese apresentada ao
Centro de Ciências Exatas e da Natureza da Universidade Federal da Paraíba,
João Pessoa, 127 p., 2009.
SANTOS, F. F. P. dos. Avaliação de antioxidantes aplicados à produção de
biodiesel. Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia
Química, Fortaleza, 152 p., 2013.
SCHOBER, S. & MITTELBACH, M. The impacto of antioxidants on biodiesel
oxidation stability. European Journal Lipid Science Technology. 106: 382-389,
2004.
SENDZIKIENE, E.; MAKAREVICIENE, V.; JANULIS, P. Oxidation stability of
biodiesel fuel produced from fatty wastes. Polish Journal of Environmental
Studies. 14 (3): 335-339, 2005.
SILVA, T. A. R. da. Biodiesel de óleo residual: produção através da
transesterificação por metanólise e etanólise básica, caracterização físico-
química e otimização das condições reacionais. Tese apresentada ao
Programa Multi-institucional de Doutorado em Química da UFG/UFMS/UFU.
Uberlândia (MG), 133 p., 2011.
ZULETA, E. C.; BAENA, L.; RIOS, L. A.; CALDERÓN, J. A. The oxidative
stability of biodiesel and its impact on the deterioration of metallic and polymeric
materials: a review. Journal Brazilian Chemistry Society, 23 (12): 2159-2175,
2012.
162
- Produção de biossurfactante e biodegradação por micro-Capítulo 5
organismos isolados de biodiesel metílico de óleo de fritura
Carrim, A. J. I.1,2; Vieira, T. M.1,2; Rodrigues, A. A1.; Soares, R. S. 1; Vieira, J. D. G.1,
Antoniosi Filho, N. R.2
1 Laboratório de Microbiologia Ambiental e Biotecnologia (LAMAB), Instituto de
Patologia Tropical e Saúde Pública, Campus I, Universidade Federal de Goiás,
Goiânia, Goiás, Brasil, 74605-050
2 Laboratório de Métodos de Extração e Separação (LAMES), Instituto de Química,
Universidade Federal de Goiás – Campus II, Samambaia, Goiânia, Goiás, Brasil,
74690-900
E. mail: [email protected]
RESUMO
Os biossurfactantes têm grande importância e aplicações em várias áres como
biorremediação, indústrias de alimentos, têxteis, farmacêutica, aplicações
biotecnológicas, entre outras, além de sua ação deteriogênica principalmente
sobre os combustíveis. Dessa forma, esse trabalho teve como objetivo isolar
micro-organismos presentes em biodiesel metílico de óleo de soja residual de
fritura (ORF) e avaliar a capacidade desses micro-organismos produzirem
biossurfactantes e de atuarem na degradação de biodiesel metílico de ORF
(B100), de biodiesel metílico comercial (B100 e B5), de óleo refinado de soja,
de óleo diesel (S500 e S10) e de óleos lubrificantes 5W30, 10W40 e 15W40,
em condições de armazenamento simulado. Foi isolada a bactéria Bacillus
liqueniformis, a qual apresentou capacidade de produzir biossurfactante e de
degradação da maioria dos óleos e derivados de petróleo. Na avaliação do
crescimento deste isolado utilizou-de glicerol e glucose como fontes de
carbono, sendo que sua preferência foi pelo maior consumo de glucose.
Palavras chaves: bactérias, biorremediação, colapso da gota, óleo diesel, óleo
lubrificante.
163
Biosurfactant production and degradation by microorganisms present in
frying oil based methyl biodiesel
ABSTRACT
Biosurfactants have many applications in several areas such as bioremediation,
food, textile, pharmaceutical, biotechnological industries, among others, in
addition to its deteriogenic action, especially on fuels. In this context, the
objective of this paper was to isolate the microorganisms present in methyl
biodiesel from frying residual oil and assess their capacity to produce
biosurfactants and act on the degradation of FRO methyl biodiesel (B100),
commercial methyl biodiesel (B100 and B5), refined soybean oil, diesel oil
(S500 and S10) as well as lubricating oils 5W30, 10W40 and 15W40, under
simulated storage conditions. We isolated the bacteria Bacillus liqueniformis,
which proved able to produce biosurfactant and to degrade most of the oils and
oil by-products; its assessment used glycerol and glucose as carbon sources,
with preference for glucose consumption.
Key words: bacteria, bioremediation, drop collapse, diesel oil, lubricating oil.
164
1. Introdução
Surfactantes naturais são de origem microbiana, extracelulares ou
associados às membranas. Trata-se de subprodutos metabólicos de bactérias,
fungos e leveduras com grande variedade de aplicações, principalmente em
relação aos surfactantes sintéticos, estruturalmente possuem baixa massa
molecular e características anfipáticas, pois exibem porções hidrofílicas
aniônicas ou catiônicas, e hidrofóbicas que são frequentemente
hidrocarbonetos. (Hausmann & Syldatk, 2015).
Os biossurfactantes atuam reduzindo a tensão superficial, auxiliando na
solubilização ou emulsificação de agentes derivados de petróleo, nas indústrias
têxteis, cosméticas, detergentes, biorremediação, agricultura, remoção de
metais, mineração, alimentos, efluentes oleosos, além de outras aplicações
biotecnológicas (Parkinson, 1985; Pacwa-Plociniczak, et al., 2011; Bharali, et
al., 2014; De Morais et al, 2015).
Quando comparados aos surfactantes sintéticos, os biossurfactantes se
destacam por apresentar vantagens evidentes como alta biodegrabilidade,
baixa toxicidade, alta especificidade, estabilidade térmica, atividade sob
condições extremas, variação de salinidade e de pH. Podem apresentar ainda
atividade anti-corrosiva, anti-biofilme, antimicrobiana e antitumoral (Mukherjee
et al., 2006; Lawniczak, et al., 2013; Sachdev & Cameotra, 2013).
Na natureza os biossurfactantes são produzidos por micro-organismos
em diversos ambientes incluindo solo, água, resíduos e superfícies foliares
(Burch et al., 2011). Quando isolados, a seleção de micro-organismos
produtores de emulsificantes permite, por exemplo, obter novos metabólitos
importantes para emprego em biorremediação, tais como os utilizados para
recuperação microbiana avançada de petróleo (MEOR – microbial enhanced oil
recovery) (Gudiña et al., 2012).
No que se refere a combustíveis, sabe-se produção de biossurfactantes
é uma via importante da biorremediação, pois promove a dispersão em solo ou
a solubilização em água de poluentes apolares como combustíveis, o que
facilita a ação de micro-organismos capazes de degradar tais poluentes.
Neste sentido, sabe-se que a que a biodegrabilidade do petróleo é de
alta complexidade em função de sua complexa composição química que inclui
165
a presença de hidrocarbonetos saturados, insaturados, aromáticos, etc. Por
outro lado, no que se efere ao biodiesel, este tem composição química menos
complexa e sua degrabilidade é mais rápida que a do petróleo, inclusive com a
participação de micro-organismos deteriogênicos, em sua maioria aeróbia, que
para recuperarem a energia química, produzem enzimas e biossurfactantes
(Sharma et al., 2008).
Assim, a degradação do biodiesel é mais favorável e mais rápida que a
de derivados fósseis (Saharan et al., 2011), sendo que uma das vias de
degradação é a conversão dos ésteres alquílicos de ácidos graxos em ácidos
graxos livres (Vieira et al., 2006).
Assim, os micro-organismos que atuam em biorremediação produzem
biossurfactantes, os quais são geralmente classificados segundo sua
composição química e origem microbiana. Dessa forma temos aqueles com
composição química originada de glicolipídeos, lipopeptídeos, polissacarídeos,
proteicos complexos, lipopolissacarídeos, fosfolipídeos, ácidos graxos e
lipídeos neutros. Dentre os mais conhecidos estão os ramnolipídeos e as
surfactina, destacando também a massetolida A, a syringagactina, a liquesina,
a itaurina, os trealolipídeos, os soforolipídeos, o ácido espiculispórico e a
fosfati-diletanolamina. Entre os comerciais destacam o emulsan, alasan,
biodispersan, liposan em manoproteína. (Van Hamme et al., 2006; Burch et al.,
2010; Pacwa-Plociniczak, et al., 2011; Musale & Thakar, 2015).
Dentre os micro-organismos produtores de biossurfactantes os mais
conhecidos são Pseudomonas sp., Rhodococcus sp., Bacillus sp., Artrhobacter
sp., Nocardia sp., Corynebacterium sp., Penicilium spiculisporum,
Acinetobacter sp., Candida lipolytica, Saccharomyces cerevisae, Burkholderia
sp. e Renibacterium sp. (Pacwa-Plociniczak, et al., 2011; Kumari, et al., 2012;
Lan et al., 2015).
No que se refere a micro-organismos presentes em biodiesel e que são
produtores de biossurfactantes, Owsianiak et al. (2009) avaliaram, por sete
dias, a ação degradativa de um consórcio microbiano (Pseudomonas
alcaligenes, Ochrobactrum intermedium, Sphingobacterium sp., Pseudomonas
putida, Klebsiella oxytoca, Chryseobacterium sp. e Stenotrophomonas
maltophilia) sobre a mistura de diesel e biodiesel metílico de soja suplementada
e outra não com ramnolipídeos, e observaram que a fração suplementada foi
166
mais facilmente deteriorada, inferindo que a presença de ramnolipídeos torna
mais eficiente a degradação do biodiesel e sua mistura com diesel.
Diversas espécies de bactérias são capazes de produzir
biossurfactantes conhecidos como ramnolipídeos e soforolipídeos, os quais
têm sido amplamente estudados para aplicações na detergência sobre petróleo
e biodiesel (Nguyen & Sabatini, 2011).
Os micro-organismos mais estudados como produtores de
ramnolipídeos são os do gênero Pseudomonas, dentre estes diversas estirpes,
como P. aeruginosa, são capazes de produzir biossurfactantes com elevada
estabilidade, boas propriedades emulsionantes, utilizando como principal fonte
de carbono o glicerol, principalmente o glicerol residual proveniente da
produção de biodiesel (Sousa et al., 2014), além de outras fontes graxas como
óleo de Nim, óleo de Karanja e óleo de Jatropha (Pratap et al., 2011).
O glicerol bruto é considerado um subproduto na cadeia de produção do
biodiesel, cujo mercado está saturado, porém o mesmo como ser utilizado
como fonte para obter biossurfactantes com elevada eficiência de
emulsificação promovendo a degradação do petróleo, com custo reduzido, a
partir de resíduos industriais e subprodutos, diminuindo os impactos ambientais
e agregrando valor à produção do biodiesel. Como exemplo, De Faria et al.
(2011) e Santos et al. (2014) demonstraram ao investigar a produção de
surfactina a partir do Bacillus subtilis LSFM-05 usando glicerol oriundo de uma
usina de biodiesel de soja. Para o glicerol proveniente da produção de biodiesel
metílico de óleo de peixe, Moshtagh et al. (2014) utilizaram Bacillus subtilis (de
Sousa et al., 2014a/b; dos Santos et al., 2016) e Rhodococcus erythropolis e
comprovaram que os biodispersantes produzidos demonstraram capacidade de
minimizar os impactos por derramamento de óleos.
Rooney et al., (2009) estudaram micro-organismos isolados de solo
coletado em uma usina de produção de biodiesel de soja, capazes de produzir
ramnolipídeos e foram identificados como Acinetobacter calcoaceticus,
Enterobacter asburiae, Enterobacter hormaechei, Pantoea stewartii e
Pseudomonas aeruginosa (De Sousa et al., 2011) usando glicerol como única
fonte de carbono, em função do baixo custo e ampla disponibilidade. Por outro
se trata de cepas consideradas patogênicas que podem estar envolvidas no
processo de produção dos biofilmes.
167
Outro isolado foi avaliado usando glicerol residual da produção de
biodiesel, como fonte de carbono para verificar a formação de emulsão e
capacidade de estabilizar de um polissacarídeo extracelular (EPS) produzido
por Pseudomonas oleovorans. Neste caso a cepa apresentou capacidade de
estabilizar emulsões água/óleo, com boa viscosidade, sugerindo que pode ser
usado para produtos na indústria alimentícia (Freitas et al., 2009).
Com aplicações diretas para degradar misturas diesel/biodiesel, diversos
estudos têm sido realizados utilizando consórcios bacterianos ou cepas
isoladas capazes de produzir biossurfactantes, além de apresentarem maior
eficiência em relação aos surfactantes sintéticos (Saimmai et al., 2012) podem
ser isolados de substratos residuais como fonte de carbono renovável e de
baixo custo, tais como Bacillus subtilis que produzem surfactina, as
demonstram estabilidade com vários hidrocarbonetos, óleo de soja, querosene
e N-hexadecano (De Sousa et al., 2012).
Meyer et al. (2012) selecionaram as bactérias Bacillus megaterium,
Bacillus pumilus, Pseudomonas aeruginosa, e Stenotrophomonas maltophilia e
testaram em misturas com diesel/biodiesel (B20). O consórcio exibiu elevado
potencial de biodegradação como alternativa de bioaumentação em solos
contaminados com esses combustíveis.
Chrzanowski et al. (2012) obtiveram resultados similares usando culturas
líquídas, sob aeração, contendo nitrato e nitrito, na presença do consórcio
contendo Achromobacter sp., Alcaligenes sp., Citrobacter sp.,
Comamonadaceae, Sphingobacterium sp., Pseudomonas sp. e Variovorax sp.,
isolados de solo contaminado com óleo, e utilizando como fonte principal de
carbono óleo diesel. Confirmam que a preferência durante a degradação é pelo
biodiesel, e que a presença do biossurfactante não interfere na atividade
microbiana, em casos suplementação com ramnolipídeos.
Outros isolados como acima, tais como Pseudomonas aeruginosa
(Pereira et al., 2013; Bharali et al., 2014; Deepika et al., 2016), Bacillus sp.
(Khondee et al., 2015), Bacillus thurigiensis (Deepak & Jayapradha, 2015),
Bacillus subtilis (de Sousa et al., 2014a, 2014b) Kocuria sp., Microbacterium
sp., Ochrobactrum sp., Brevibacillus sp., Bacillus pumilus, Brevibacillus agri e
Nocardia farcinica (Kumar et al., 2012), Acinetobacter calcoaceticus IMV B-
7241, Rhodococcus erythropolis IMV Ac-5017 e Nocardia vaccinii VMI (Pirog et
168
al., 2015) também foram descritos como potencial produtores de
biossurfactantes.
Além das bactérias, leveduras podem ser utilizadas para produção de
biossurfactantes. Assim, Trichosporon mycotoxinivorans CLA2 foi isolada de
efluentes de laticínios e apresentou capacidade para emulsionar diferentes
substratos hidrofóbicos como única fonte de carbono, incluindo resíduos de
refinarias de petróleo e de usinas de biodiesel (Monteiro et al., 2012). Utilizando
glicerol bruto oriundo da produção de biodiesel como única fonte de carbono
para crescimento e produção do biotensoativo, observou-se que Yarrowia
lipolytica possui capacidade de produzir biossurfactante (Fontes et al., 2012).
Entretanto, é importante observar que não há relatos na literatura acerca
da produção de biossurfactantes a partir de micro-organismos isolados de
biodiesel metílico de óleo de fritura residual.
A produção de biossurfactantes pode ser avaliada por testes rápidos e
de baixo custo através da atividade hemolítica, avaliação da fonte de carbono
para o crescimento microbiano, teste do colapso da gota e índice de
emulsificação. Estes métodos para detectar a produção de biossurfactantes
são preliminares, simples e eficientes (Carrillo et al., 1996; Youssef et al, 2004;
Pereira et al., 2013).
Assim, a produção de biossurfactantes e o reconhecimento dos micro-
organismos que os produzem em grande quantidade e que executam a
biorremediação de combustíveis é um importante tema de caráter ambiental,
especialmente para combustíveis cuja produção industrial vem se acentuando
e cujos mecanismos de degradação ainda sejam pouco conhecidos.
Dessa forma, esse trabalho teve como objetivo identificar micro-
organismos isolados de biodiesel de óleo de residual de fritura e verificar a
capacidade de degrabilidade e de produção de biossurfactante dos isolados.
169
2. Experimental
2.1 Amostragem
O óleo residual de fritura (ORF) utilizado para a produção de biodiesel foi
adquirido em um estabelecimento comercial que funciona como restaurante e
bar, localizado no munícipio de Anápolis (Goiás - Brasil), e foi utilizado na
fritura de diversos alimentos durante duas semanas. Todas as amostras de
óleos e biodiesel foram acondicionadas em frascos de polietileno de alta
densidade (PEAD).
2.2 Produção de biodiesel metílico de ORF
A amostra de ORF foi submetida à filtração simples para separação dos
resíduos de alimentos presentes. Após a filtração, foi realizada uma etapa de
extração líquido-líquido com água destilada, seguida de destilação simples do
ORF para retirada da água residual. Após estas etapas, a amostra de ORF foi
levada a esterificação ácida e posteriormente a transesterificação alcalina,
ambas sob rota metílica (Azeredo, 2014).
Para a produção de biodiesel metílico de ORF utilizou-se a proporção de
1:9 de óleo e metanol p.a. e 2% (v/v) de ácido sulfúrico como catalisador ácido.
Em seguida foram colocados em refluxo, sob agitação via agitador magnético
com medidor de temperatura modelo MA 085/CT, em banho-maria a 90 °C, por
3 horas. Ao final desta etapa o catalisador e os resíduos de metanol foram
removidos pela lavagem com água quente (≈ 70 °C), seguido da filtração em
sulfato de sódio anidro (Vetec®). O biodiesel obtido foi então submetido a
transesterificação alcalina.
A reação de transesterificação alcalina foi realizada em reator da marca
Marconi Modelo MA 159/150, utilizando-se a proporção de 1:12 para a razão
óleo:metanol e 1,5% (m/v) de hidróxido de potássio (Vetec®) solubilizado
inicialmente em metanol (Tedia®) para gerar uma solução de metóxido de
sódio. A solução de metóxido de potássio foi acrescentada à mistura de óleo e
metanol e levada ao reator para agitação sob rotação de 1000 rpm, à 60 °C,
por 1 hora. Em seguida, aguardou-se por 24 horas a separação do glicerol e,
170
após a separação deste, procedeu-se à neutralização do catalisador com
solução aquosa de ácido clorídrico a 0,5 mol/L e lavagem com água destilada
para retirada do ácido remanescente. Tal lavagem foi feita até que a fase
aquosa tornou-se límpida e, finalmente, o resíduo de água e metanol foi
retirado através de rotaevaporação sob pressão reduzida.
Todas as amostras de biodiesel sintetizadas em laboratório tiveram sua
qualidade avaliada com base nos parâmetros estabelecidos na Portaria ANP no
45 de 25 de agosto de 2014.
2.3 Isolamento de micro-organismos
O biodiesel com óleo de fritura foi utilizado, imediatamente após sua
produção, para isolamento de micro-organismos contaminantes. O isolamento
foi feito de acordo com a norma ASTM D6974-09, optando-se pela filtração à
vácuo, em duplicata, em meio TSA (Tryptone Soy Agar) para bactérias, e meio
SDA (Sabouraud Dextrose Agar) para fungos, incubados por 48 horas a 35°C e
5 dias a 25ºC, respectivamente.
Os micro-organismos, após purificação, foram isolados cultivados em
caldo BHI (Brain Heart Infusion) e armazenados em glicerol 20% em freezer à -
20°C para a realização dos testes posteriores.
2.4 Identificação dos micro-organismos isolados
Para a identificação do micro-organismo isolado, inicialmente foi
cultivado em caldo nutriente (CN) e submetido a caracterização morfo-tintorial
pela técnica de coloração de Gram. Paralelamente, o isolado foi também
crescido em meio mineral, a pH 7,0, composto por: NaCl 5,0 g/L; K2HPO4 1,0
g/L; NH4H2PO4 1,0 g/L; (NH4)2SO4 1,0 g/L; MgSO4.7H2O 0,2 g/L; KNO3 3,0 g/L
e extrato de levedura 0,1 g/L, com duas fontes de carbono diferentes (glucose
e glicerol), na concentração final de 1% (v/v) (Cunha & Leite, 2000). Tal meio
de cultivo mineral foi utilizado no processo de produção de biossurfactantes.
O micro-organismo isolado foi caracterizado por Microscopia Eletrônica
de Varredura (MEV) com o Microscópio Eletrônico de Varredura, marva Jeol,
171
modelo JSM–6610, equipado com EDS Thermo Scientific NSS Spectral
Imaging.
2.5 Identificação molecular do micro-organismo
2.5.1 Extração do DNA total e amplificação da região que codifica 16S
rDNA
Para a extração, amplificação e purificação do DNA, o isolado foi
crescido em meio NB por 24 horas, sob agitação em shaker, a 130 rpm e 30°C.
A extração do DNA genômico foi realizada segundo metodologia descrita por
de Van Soolingen et al. (1994) com adaptações. A integridade e concentração
do DNA extraído foram verificadas em gel de agarose 1% corado com EZ-
vision, sendo o material extraído armazenado em freezer à -20°C.
A amplificação da região de DNA codificada para 16S rRNA foi realizada
por reação em cadeia da polimerase (PCR), com os iniciadores de
oligonucleotídeos 27f (5‟-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3‟) e 1541r (5‟-
AAGGAGGTGATCCAGCC-3‟), de acordo com o protocolo modificado de
Weisburg et al., (1991) e de Oliveira et al., (2012). A reação foi realizada com
um volume final de 50 μL para a amplificação, sendo 35,5 μL de água ultra
pura, 5 μL de solução tampão 10X para a enzima polimerase Taq (CenBiot),
1,5 μL de cloreto de magnésio a 50 mmol/L (CenBiot®), 1 μL de cada solução
de oligonucleotideo iniciador (10 μmol/L) (Biosource®), 4 μL da solução de
dNTP (2,5 mmol/L) (Ludwig Biotec®), 1 μL of enzima polimerase Taq (5U)
(CenBiot®) e 1 μL de DNA extraído.
A reação de amplificação da mistura foi conduzida em termociclador
BIO-RAD, modelo T100™ Themal Cycler, constituída de amplificação inicial por
desnaturação (94°C por 3 min), seguidos de 30 ciclos com desnaturação (94°C
por 1 min), anelação (55°C por 30 s), extensão (72°C por 30 s) e extensão final
(72°C por 10 min), conforme Garcia (2006). Os produtos amplificados foram
analisados em gel de agarose 1,2%, usando-se o marcador molecular 1 kb
Sharp DNA Marker (RBC) para o DNA molde.
172
2.5.2 Purificação do produto de PCR e sequenciamento
Os produtos de PCR obtidos foram purificados utilizando-se kit ExoSAP-
IT PCR. O sequenciamento dos produtos de PCR purificados foram conduzidos
na plataforma ABI 3130xl (Applied Biosystems), utilizando-se os seguintes
oligonucleotídeos iniciadores 27F, 1541R, 926F (5′-AAA CTY AAA KGA ATT
GAC GG-3′), 530F (5'-TGA CTG ACT GAG TGC CAG CMG CCG CGG-3');
519R (5‟–GTN TTA CNG CGG CKG CTG –3‟) e 907R (5‟–GTN TTA CNG CGG
CKG CTG –3‟) (KIM et al, 2011).
A análise da qualidade e o assembly das seis sequências obtidas para
cada isolado foram realizadas utilizando-se o software CodonCode Aligner. As
sequências geradas foram comparadas com as depositadas do banco de
dados GenBank do NCBI (National Center for Biotechnology Information)
utilizando a ferramenta BLASTn.
2.6 Seleção preliminar para produção de biossurfactante pelo teste da
atividade hemolítica
Micro-organismos produtores de biossurfactantes podem produzir
enzimas extracelulares bacteriolíticas e causar lise dos eritrócitos, em meios
hidrofílicos como ágar sangue, tais como hemolisina e muramidases. Este teste
é considerado um método primário para selecionar estes produtores (Youssef
et al., 2004).
Os isolados foram cultivados em caldo BHI (Mulligan et al., 1984) e
transferido para placa de Petri contendo ágar sangue (5% de sangue de
carneiro desfibrinado) utilizando-se um multi-inoculador de Steer (15 pinos) e
incubado à 30°C, por 24 a 48 horas.
A positividade foi observada por meio da formação de halo de
transparência ao redor da colônia, o qual foi medido e expresso em mm,
indicando preliminarmente a capacidade de produção de biossurfactante, que
posteriomentes foi cultivado e avaliado a partir do crescimento em meio mineral
(Mulligan et al., 1984; Carrillo et al., 1996).
173
2.7 Determinação da curva de crescimento microbiano e do pH
Para a determinação do crescimento dos micro-organismos, os micro-
organismos selecionados via teste preliminar para produção de
biossurfactantes foram transferidos para o meio mineral, com fontes de
carbono diferentes (glucose e glicerol), e cultivados sob agitação a 130 rpm, a
30°C (Burch et al., 2011).
Alíquotas de 10 mL foram coletadas a cada 24 horas por 7 dias. O
crescimento foi determinado em espectrofotômetro GE Healthcare, modelo
Ultrospec® 2100pro com arranjos de diodos para realização das leituras em
absorbância das amostras, utilizando-se cubetas de quartzo a 600 nm e
caminho óptico de 1 cm.
O pH foi determinado no sobrenadante de cada amostra coletada,
usando potenciômetro Digimed modelo DM-22, após centrifugação do micro-
organismo cultivado em meio mineral em centrífuga EBA20, marca Hettich
Zentrifugen, a 5.000 g por 5 minutos.
2.8 Quantificação do consumo de glucose e glicerol em meio mineral
O consumo de glucose e glicerol foram determinados nos sobrenadantes
obtidos, conforme descrito no item 2.4, utilizando kits enzimáticos da marca
Doles® específicos para quantificação espectrofotométrica de glucose (Glucox
500) e glicerol (Triglicérides líquido enzimático), de modo a verificar qual a
preferência da fonte de carbono do isolado.
2.9 Produção de biossurfactante
A produção de biossurfactante foi determinada via metodologia adaptada
de Cunha & Leite (2000) com duas fontes de carbono diferentes (glucose e
glicerol), cada qual a 1% (v/v). Os frascos foram agitados por 7 dias, agitados a
130 rpm e a 30°C (Burch et al., 2011). Amostras foram coletadas de 24 em 24
h e centrifugadas como descritas no item 2.4, com o sobrenadante sendo
utilizado nos teste de colapso da gota e Índice de Emulsificação (IE).
174
2.9.1 Teste do colapso da gota
Esta avaliação tem caráter qualitativo, podendo ser realizado em caldo
ou meio sólido (Burch et al., 2010). O teste foi realizado em placas de
poliestireno contendo 96 poços (12,7 cm x 8,5 cm x 8 mm), aos quais foram
adicionados 1,8 μL de óleo 10W40 e, após 24 h, foram adicionadas 2 μL dos
sobrenadantes centrifugados a partir do cultivo. Os testes foram feitos triplicata,
para cada fonte de carbono utilizada. Para efeito de comparação utilizou-se o
Tween 80 para o teste positivo e água destilada para o teste negativo (Boudour
& Miller-Maier, 1998; Youssef et al., 2004).
.
2.9.2 Índice de emulsificação (IE5 e IE24)
Este ensaio é um indicativo da estabilidade da emulsão formada pelo
contato do biossurfactante com o agente que se pretende emulsificar, tais
como combustíveis, de forma a aumentar a biodisponibilidade e a degradação
desses agentes pelos micro-organismos (Sneha et al, 2012). Cada método
utilizado, apesar de ter vantagens e desvantagens, corrobora para a seleção
rápida de diversos micro-organismos como bactérias e fungos capazes de
produzirem biossurfactante, além de permitir sua quantificação (Walter, et al.,
2010; Bezerra, et al., 2012).
A estabilidade do biossurfactante produzido foi determinada pelo IE5 e
IE24. Para esta determinação partes iguais (2,0 mL) de óleo diesel e do
sobrenadante foram misturadas e agitadas por 2 minutos em vórtex. Em
seguida os frascos foram deixados em repouso por 5 minutos e 24 horas. Na
sequência o tamanho das camadas de óleo diesel tipo A e sobrenadante foram
medidas em milimetros e o IE determinado.
Os índices de emulsificação são avaliados pela medida da altura da
camada emulsificada (mm) dividida pela altura total da coluna do líquido (mm),
com o resultado sendo multiplicado por 100 para se calcular a porcentagem
dos índices (Cooper et al., 1987). Os experimentos foram realizados em
duplicata.
175
2.9.3 Caracterização de biosurfactantes por ESI-MS
Um equipamento triplo quadrupolo de massas tandem com sistema Q-
trap 3200 QTRAP® System (ABSCIEX, USA) foi utilizado na análise de
determinação dos biosurfactantes produzidos pelos isolados. As amostras
foram adquiridas no modo íon negativo, utilizando Electrospray (ESI) como
fonte de ionização. A voltagem aplicada ao capilar foi de -3,5 kV, a voltagem
aplicada para dessovaltação do gás foi de 40 V, tendo sido aplicada uma
temperatura de 100 °C na fonte de ionização. Como gás de colisão foi utilizado
Nitrogênio a 60 psi. As amostras de biosurfactantes foram diluídas em
metanol:água (1:1) em soluções a 1 ppm, as quais foram injetadas diretamente
no espectrômetro de massas com o auxílio de uma bomba seringa
automatizada à vazão constante de 50 µL/min. Foi realizado experimento no
modo Full Scan–trap (EMS) aplicando-se 30 eV de energia de colisão, na faixa
de varredura espectral de m/z 100-1500.
2.10. Capacidade de degradação de derivados de petróleo e biodiesel
Para avaliação da capacidade de degradação de derivados de petróleo e
biodiesel pelos micro-organismos isolados do biodiesel metílico de ORF,
utilizou-se a metodologia adaptada de Vieira et al. (2007). Os isolados foram
crescidos como no item 2.4, por 72 h a 30 °C e 130 rpm. Em seguida os
isolados foram testados em placas de poliestireno com a adição de 20 µL dos
micro-organismos crescidos, 168 µL de meio mínimo, 12 µL de DCPIP e 2 µL
de derivados de petróleo e biodiesel. As placas de poliestireno foram incubadas
a 30 °C e as leituras realizadas em 24, 48 e 72 h. Os controles positivos foram
feitos em meio adicionado de glucose como fonte única de carbono, e os
negativos sem a adição de fonte de carbono.
3. Resultados e discussão
A Tabela 5.1 apresenta as características físico-químicas do biodiesel
metílico obtido a partir de ORF, o qual apresentou teor de água muito acima do
limite máximo permitido pela legislação (ANP, 2014), o que eleva a massa
176
específica. Isso ocorreu possivelmente em função das etapas de extração
líquido-líquido para produção do biodiesel, e da dificuldade de se remover água
em rotaevaporador.
Vale observar, entretanto, que a presença de elevada quantidade de
água no biodiesel permite simular as condições de condensação em tanques
de armazenamento de biodiesel, pois favorece o crescimento microbiano.
Também foi observado um teor de glicerol acima do especificado na legislação,
o que indica dificuldade de remoção deste usando as etapas de purificação do
biodiesel produzido.
Como reflexo de uma deficiente etapa de purificação, obteve-se também
um elevado teor de sódio no biodiesel de ORF. A presença de sódio é oriunda
do catalisador utilizado na etapa de transesterificação metílica, podendo
também ser proveniente do sulfato de sódio usado na purificação do biodiesel.
A alta viscosidade deve ser derivada da presença de oxicompostos
formados na etapa de fritura do óleo, os quais podem estar ainda presentes no
biodiesel produzido.
177
Tabela 5.1. Características físico-químicas das amostras de biodiesel.
* LII = Límpido e isento de impurezas LOQ = Limite de quantificação
A baixa estabilidade oxidativa deriva do óleo usado para produção do
biodiesel ser de soja, a qual possui grandes quantidades dos ácidos linoleico e
linolênico (Antoniosi Filho, 1995), os quais são altamente susceptíveis a
oxidação (Souza et al. 2013). De acordo com Knothe (2000) a presença de
alguns fatores podem favorecer o processo de oxidação de cadeias dos ácidos
graxos que, embora complexo, pode ser acelerado pela presença de oxigênio,
luz, calor, metais e peróxidos (presentes no início da oxidação), resultando na
formação de hidroperóxidos e afetando a estabilidade oxidativa do biodiesel
(Sharma et al., 2008).
No que diz respeito aos teores de éster, glicerol ligado, mono-, di- e
triacilglicerídeos o biodiesel de ORF demonstrou estar adequado ao
especificado pela legislação.
Características de Qualidade Especificação da ANP Valores obtidos para
Biodiesel de ORF Limite Unidade
Aspecto LII* - LII
Massa Especifica 850 a 900 kg/m3 910,50
Viscosidade (40 °C) 3,0 a 6,0 mm2/s 36,2
Teor de Água ≤ 200 mg/kg 1890
Índice de Acidez ≤ 0,50 mg KOH/g 1,46
Na + K ≤ 5 mg/kg 154,30
Ca + Mg ≤ 5 mg/kg 0,5
P ≤ 10 mg/kg <LOQ
Teor de éster ≥ 96,5 % massa 97,5
Glicerol livre ≤ 0,02 % massa 0,04
Glicerol total ≤ 0,25 % massa 0,10
Monoacilglicerídeos ≤ 0,7 % massa 0,5
Diacilglicerídeos ≤ 0,20 % massa 0,08
Triacilglicerídeos ≤ 0,20 % massa 0,06
Índice de Iodo Anotar g/100 g 41,5
Estabilidade Oxidativa ≥ 8 h 5,87
178
3.1 Identificação do micro-organismo
Utilizando-se da norma ASTM D6974-09 (2013) foi isolada uma bactéria
a partir do biodiesel de ORF produzido, não sendo verificada a presença de
fungos. A bactéria isolada apresentou característica tintorial de gram-positiva e
morfológica de bastonete (Figura 5.1). Foi identificada molecularmente (Tabela
5.2) como Bacillus licheniformis, com 99% de identidade.
Tabela 5.2. Identificação molecular dos isolados em biodiesel de ORF.
Isolado Espécie mais próxima Tamanho
do contig e-value Identidade
Número de
acesso
B1 Bacillus licheniformis 1303 0.0 99% B9MMRXKV015
A presença de água pode contribuir para o crescimento dos micro-
organismos, principalmente em fases de armazenamento (He et al., 2007;
Fregolente et al., 2012) sendo que, mesmo tendo sido feita a análise
microbiológica imediatamente após à produção do biodiesel, foi isolada uma
bactéria identificada como Bacillus licheniformis (Figura 5.1).
Figura 5.1. Imagem no MEV de Bacillus licheniformis (x5000).
O Bacillus licheniformis pode sobreviver a temperaturas elevadas,
podendo então ser oriundo do ORF ou de contaminação ambiental. Vale
observar que a capacidade do Bacillus licheniformis crescer em meios
179
contendo glicerol proveniente de biodiesel já foi anteriormente evidenciada por
Poleto (2014), o qual demonstrou que tal processo gera hidrogênio como um
dos subprodutos de fermentação.
3.2 Seleção preliminar para produção de biossurfactante pelo teste da
atividade hemolítica
A hemólise de sangue de carneiro é a metodologia de seleção rápida de
produtores de biossurfactante, sendo que Bacillus licheniformis demonstrou a
capacidade de hemolisar o ágar sangue de carneiro a 5% após 24 horas de
incubação, o que indica que possue potencial para a produção de
biossurfactantes.
Assim, as substâncias produzidas pelo isolado contribuiram com a
atividade hemolítica na lise das membranas dos eritrócitos disponibilizando seu
conteúdo citoplasmático, principalmente o ferro, importante para o crescimento
microbiano (Bicca et al. 1999; Lin 1996), além de ser indicativo de uma
substância segura industrialmente, uma vez que esta espécie não apresenta
potencial citotóxico e é capaz de produzir outras substâncias hemolíticas como
protease (serinas, metais, serinas metais, serinas alcalinas ou naturais), α-
amilase, aminopeptidase e β-lactamase (Pedersen et al., 2002; Schulz et al.,
2005; Paladino, 2008).
3.3 Determinação da curva de crescimento microbiano e do pH
As variações dos valores de pH no crescimento de Bacillus licheniformis
foi observado durante 7 dias de incubação (Figura 5.2).
180
Figura 5.2. Curva do monitoramento do pH x tempo (dias) de Bacillus
licheniformis na presença de glucose e glicerol (10 g/L), em meio mínimo.
Observou-se uma variação de pH, de 7,00 para 5,02 em glicerol, e de
7,00 para 5,28 em glucose. Valores de pH entre 5 e 8, com ótimo entre 6 e 7,
foram observados por Amodu et al. (2014) e Dadrasnia & Ismail (2015) como
sendo os ideais para producão de biossurfactantes por Bacillus licheniformis,
utilizando resíduos sólidos agroindustriais. Assim os valores de pH observados
se encontram na faixa sugerida como ideal para a produção de
biossurfactantes. Por outro lado, tem sido apontado que tal dimuição de pH
facilita o processo de corrosão anódica (reação parcial de oxidação) por parte
dos micro-organismos aeróbios presentes (McFarlane, 2009), favorecendo
também a produção de sedimentos e biofilme que podem representar risco no
armazenamento de biodiesel.
Para Bacillus licheniformis o crescimento microbiano (Figura 5.3)
apresentou aumento na presença de glucose, alcançando a taxa máxima no
segundo dia. Para a fonte de carbono com glicerol o micro-organismo
apresentou o maior taxa de crescimento no quarto dia. O consumo mais rápido
da glucose pode ter sido favorecido provavelmente por sua estrutura ser mais
simples, facilitando seu metabolismo como fonte de carbono em relação ao
glicerol (De Sousa et al., 2012).
4,5
5
5,5
6
6,5
7
7,5
0 1 2 3 4 5 6 7
Glucose
Glicerol
Tempo (dias)
pH
181
Figura 5.3. Crescimento microbiano (abs) x tempo (dias) do Bacillus
licheniformis na presença de glucose e glicerol (10 g/L) em meio mínimo.
3.4 Quantificação do consumo de glucose e glicerol em meio de mineral
Em meio mineral, após 7 dias de avaliação, 13,03% da glucose (Figura
5.4) e 55,53% do glicerol (Figura 5.5) foram consumidos pelo Bacillus
licheniformis, indicando maior preferência deste para consumo de glicerol.
Figura 5.4. Gráfico do consumo de glucose (g/L) x tempo (horas) de Bacillus
licheniformis em meio mínimo contendo glucose a 10 g/L.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0 1 2 3 4 5 6 7
glucose
glicerol
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
5,5
6
0 1 2 3 4 5 6 7
Co
nc
en
tra
çã
o:
g/L
Tempo (dias)
Consumo de glucose
Tempo (dias)
ABS
182
Figura 5.5. Gráfico do consumo de glicerol (g/L) x tempo (horas) de Bacillus
licheniformis em meio mínimo contendo glicerol a 10 g/L.
Esta preferência pelo consumo de glicerol é interessante uma vez que
se trata de um coproduto na produção do biodiesel, o qual pode ser empregado
como substrato de baixo custo e alta disponibilidade para produção de
biossurfactantes em grande escala, de forma renovável e com baixo custo,
visando seu emprego em biorremediação.
Do ponto de vista metabólico, a glucose sofre degradação na via
glicolítica até a formação dos compostos intermediários, tal como um dos
principais precursores do carboidrato, a glicose 6-fosfato. A glucose também
pode sofrer oxidação e ser convertida a piruvato via glicólise, no processo de
produção de lipídeos. O piruvato por sua vez pode ser convertido a acetil-CoA
e, em seguida, ao unir-se ao oxaloacetato, ocorrerá a produção de malonil-CoA
e ácido graxo, dando início à síntese de lipídeos. (Fontes, et al., 2008).
Por sua vez, o glicerol é caracteristicamente transportado para célula por
difusão facilitada através de difusão facilitada, e é rapidamente convertido para
glicerol-3-fosfato na presença de glicerol quinase e subsequentemente oxidado
para fosfato dihidroxiacetona (DHAP), na via glicolítica intermediária, pela
enzima glicerol fosfato desidrogenase. DHAP é enzimaticamente transformada
no seu isômero gliceraldeído-3-fosfato (G3P) e ambos podem ser convertidos
para glucose, através da gliconeogênese, o qual vai compor a estrutura do
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 1 2 3 4 5 6 7
Co
nc
en
tra
çã
o:
g/L
Tempo (dias)
Consumo de glicerol
183
biossurfactante ou ser dierecionado para o crescimento celular (Santos et al.,
2014).
Alternativamente, G3P pode ser convertido em piruvato pela
subsequente conversão para acetil-CoA, a qual é a principal precursora da
biossíntese dos ácidos graxos (Santos et al., 2014). Dessa forma, a produção
de biossurfactante passa pela produção de glucose, a qual pode vir tanto do
uso da própria glucose quanto de glicerol como fonte de carbono para o micro-
organismo.
A molécula de biossurfactante tem característica anfifílica e assim, para
sua formação, pode utilizar substratos hidrofílicos para compor a porção polar,
e hidrófoba para formar a porção hidrocarbônica. De acordo com a principal
fonte de carbono disponível no meio de cultivo as vias metabólicas podem
variar na síntese de precursores. Como mencionado, na síntese microbiana, a
glucose ou o glicerol, como exemplos de substratos hidrofílicos, são
degradados na via glicolítica até formar intermediários como a glicose 6-fosfato,
a qual pode estar presente na estrutura hidrofílica do biossurfactante. Com a
presença de um hidrocarboneto como fonte de carbono, o metabolismo
microbiano utiliza a via lipolítica ou a gliconeogênese, para a produção de
ácidos graxos ou glicosídeos (Amaral et al., 2010).
3.5 Teste do colapso da gota
Este teste é de fácil execução permitindo a determinação de forma
qualitativa da capacidade do micro-organismo em produzir o biossurfactante, a
partir de várias fontes de carbono. O isolado testado apresentou colapso
positivo quando cultivado em ambos os meios minerais com fonte de glucose e
com glicerol, indicando que o micro-organismo é capaz de produzir
biossurfactante a partir dessas fontes de carbono.
3.6 Índice de emulsificação (IE5 e IE24)
De acordo com a Tabela 5.3 os resultados para os isolados demonstram
um aumento do índice de emulsificação medido em 24 horas (IE 24), para as
duas fontes de carbono, quando se considera do primeiro para o sétimo dia de
184
crescimento do cultivo, tanto na presença de glucose quanto de glicerol.
Alternativamente, o ensaio foi prolongado por 96 horas (IE 96), não sendo
observadas alterações no índice de emulsificação, o que sugere que a que a
emulsão formada entre biossurfactante e o óleo diesel é estável por um longo
período, tal como observado por Barros et al. (2008) para Bacillus subtilis.
Tabela 5.3. Percentual do índice de emulsificação 24 horas para cultivo de
Bacillus licheniformis em óleo diesel.
Fonte de carbono IE 24 (%)
1º dia crescimento 7º dia crescimento
Glicerol 12,0 63,2
Glucose 8,0 47,3
De acordo com Bento et al. (2008) valores de IE 24 acima de 50% são
considerados como característicos de bons produtores de biossurfactante.
Portanto o isolado de Bacillus licheniformis pode ser considerado de grande
capacidade de produção de biossurfactante quando glicerol é usado como
fonte de carbono.
3.7 Caracterização dos biosurfactantes produzidos por Bacillus
licheniformis
A análise por espectrometria de massas com eletronspray no modo de
ionização negativo de biosurfactantes produzidos por Bacillus licheniformis está
descrita na literatura científica (Yakimov et al., 1999; Pecci et al., 2010), sendo
relatado que os espectros de massas gerados apresentaram fragmentos
predominantes com razão massa/carga (m/z) superior a 1000 (Slivinski, 2012),
os quais são característicos da presença de biossurfactantes tais como
surfactina, iturina, fengicina, liquesina e seus homólogos.
Neste sentido, tanto para o meio de cultivo contendo glicerol quanto em
glucose não foram detectadas as formações de tais biossurfactantes de alta
massa molecular. Assim, para o meio de cultivo contendo glicerol (Figura 5.6)
os fragmentos predominantes foram os m/z 226,7 (100%), m/z 446,9 (90,4%),
185
m/z 286,6 (75,6%), m/z 310,8 (73,2%), m/z 250,7 (64,8%) e m/z 728,7 (100%);
e para o meio de cultivo contendo glucose (Figura 5.7) destacaram-se os
possíveis íons moleculares desprotonados [M-H]- com m/z 119,7 (100%), m/z
214,9 (98%) e m/z 154,6 (44%).
Isso indica que os biossurfactantes produzidos pelo Bacillus licheniformis
isolado de biodiesel não correspondem aos mesmos já tradicionalmente
identificados por outros autores. Assim, é possível que o Bacillus licheniformis
utilizado neste trabalho apresente genes que codifiquem para a produção de
biossurfactantes de menores massas moleculares, diferentemente dos
apresentados em outros trabalhos (Yakimov et al., 1999; Pecci et al., 2010).
Além disso, o meio de cultivo também influencia na produção de
substâncias tensoativas, as quais podem ser peptídeos, ácidos graxos,
fosfolípideos e biosurfactantes de baixa massa molecular (Vijayakumar &
Saaravanan, 2015).
186
Figura 5.6. Espectro de massas para a mistura de substâncias que reduzem a tensão superficial, produzidas por Bacillus
licheniformis em meio de cultivo glicerol.
Glicerol
187
Figura 5.7. Espectro de massas para a mistura de substâncias que reduzem a tensão superficial, produzidas por Bacillus
licheniformis em meio de cultivo glucose.
188
3.8 Capacidade de degradação de derivados de petróleo e biodiesel
Os resultados referentes ao crescimento do micro-organismo em 24 h (Tabela
5.4), 48 h (Tabela 5.5) e 72 h (Tabela 5.6) indicam quais hidrocarbonetos o micro-
organismo isolado possue potencial para degradar, o que contribui para
compreender os processos de biorremediação e/ou biodeterioração dos derivados
de petróleo.
Por outro lado, a presença deste micro-organismo nas etapas de produção e
posteriormente na armazenagem do biodiesel, pode favorecer a deterioração e
formação de borras e/ou sedimentos, os quais levam ao entupimento e mau
funcionamento das partes mecânicas que entram em contato com o combustível. A
degradação pode ocorrer em função da presença de micro-organismos capazes de
formarem biofilme, favorecidos pela formação de micelas e de emulsão pelo
biossurfactante, que também permitem a colonização de consórcios microbianos
deteriogênicos.
Tabela 5.4. Degradação de diferentes fontes de carbono utilizando Bacillus
licheniformis incubado a 30°C e com 24 horas de crescimento.
Fontes de
Carbono CP
DS
500
DS
10
G
C B5
B100
COM
B100
ORF 5W30 10W40 15W40 OSR CN
Degradação + - - + + + + - + + + -
CP = controle positivo; DS500 = óleo diesel S500; DS10 = óleo diesel S10; GC = gasolina comum tipo C contendo 25% de etanol (v/v); B5 = mistura B5 comercial; B100 COM= biodiesel metílico comercial de soja e sebo bovino; B100 ORF = biodiesel metílico de ORF; 5W30, 10W40 e 15W40 = lubrificantes sintéticos; OSR = óleo de soja refinado; CN= controle negativo.
Tabela 5.5. Degradação de diferentes fontes de carbono utilizando Bacillus
licheniformis incubado a 30°C e com 48 horas de crescimento.
Fontes de
Carbono CP
DS
500
DS
10
G
C B5
B100
COM
B100
ORF 5W30 10W40 15W40 OSR CN
Degradação + - - + + + + - + + + -
CP = controle positivo; DS500 = óleo diesel S500; DS10 = óleo diesel S10; GC = gasolina comum tipo C contendo 25% de etanol (v/v); B5 = mistura B5 comercial; B100 COM= biodiesel metílico comercial de soja e sebo bovino; B100 ORF = biodiesel metílico de ORF; 5W30, 10W40 e 15W40 = lubrificantes sintéticos; OSR = óleo de soja refinado; CN= controle negativo.
189
Tabela 5.6. Degradação de diferentes fontes de carbono utilizando Bacillus
licheniformis incubado a 30°C e com 72 horas de crescimento.
Fontes de
Carbono CP
DS
500
DS
10
G
C B5
B100
COM
B100
ORF 5W30 10W40 15W40 OSR CN
Degradação + - + + + + + - + + + -
CP = controle positivo; DS500 = óleo diesel S500; DS10 = óleo diesel S10; GC = gasolina comum tipo C contendo 25% de etanol (v/v); B5 = mistura B5 comercial; B100 COM= biodiesel metílico comercial de soja e sebo bovino; B100 ORF = biodiesel metílico de ORF; 5W30, 10W40 e 15W40 = lubrificantes sintéticos; OSR = óleo de soja refinado; CN= controle negativo.
O isolado Bacillus licheniformis não degradou os óleos diesel S500 e o óleo
lubrificante 5W30 em até 72 horas. Neste sentido sugere-se que as fontes não
degradadas até 72 horas necessitem de um tempo maior de contato para que a
degradação ocorra, uma vez que outros experimentos exibem a completa
degradação de 14 dias a 4 semanas (Sebiomo, et al., 2010; Thenmozhi, et al., 2011;
Dadrasnia & Agamuthu, 2013; Dadrasnia & Ismail, 2015).
A não degradação de óleo diesel S500 pode estar relacionada a algum efeito
de inativação da atividade do micro-organismo pelo enxofre presente em elevada
concentração nesse combustível fóssil (Gaylarde, 1999). A ação inibitória do enxofre
é corroborada pelo fato do óleo diesel S10, com menor teor de enxofre, ter sido
degradado após 72 horas de cultivo.
Por sua vez, de acordo com Seabra (2008), alguns óleos lubrificantes
possuem em sua composição substâncias aromáticas - como o acenafteno (C12H10)
– que apresentam baixa taxa de degradação quando comparado com outros
derivados de petróleo. A grande maioria destes óleos é composta por grandes
cadeias de hidrocarbonetos saturados e alguns aditivos. Os principais componentes
do óleo base podem ser os alcanos cíclicos e estes, por sua vez, são reconhecidos
como substâncias recalcitrantes durante a degradação microbiana (Thenmozhi et al.,
2011).
Bactérias do gênero Bacillus caracteristicamente produzem biossurfactanes e
podem empregar diferentes mecanismos para degradarem os hidrocarbonetos,
facilitando a transferência dos contaminantes para a fase aquosa através da
interação com os de natureza solúvel e elevando a disponibilidade e solubilidade dos
hidrocarbonetos, bem como reduzindo a tensão superficial e favorecendo o contato
190
da superfície das células bacterianas com os substratos hidrofóbicos (Ayed et al.,
2015; Dadrasnia & Ismail, 2015).
Assim, todas as demais fontes de carbono - que incluem gasolina comum tipo
C, mistura B5 comercial, biodiesel metílico comercial de soja e sebo bovino,
biodiesel metílico de ORF, os lubrificantes sintéticos 10W40 e 15W40 e o óleo de
soja refinado - foram degradados em até 24 horas de crescimento microbiano, o que
indica que tal micro-organismo pode ser uma excelente opção para uso em
biorremediação, mas ao mesmo tempo consistir em um problema para o
armazenamento de biodiesel a curto prazo.
4. Conclusões
Os testes realizados sugerem que o isolado de biodidesel metílico produzido a
partir de óleo residual de fritura, identificado como Bacillus licheniformis, produz
biossurfactantes de menor massa molecular, uma vez que apresentou hemólise
desde o teste preliminar, sendo positivo para colapso da gota e produção de
emulsão, apresentando índice de emulsificação significativo em 24 h (IE24), o qual
foi superior a 50%.
Desta forma, o Bacillus licheniformis demonstrou ser capaz de degradar uma
grande variedade de produtos petroquímicos e biocombustíveis, em especial o
biodiesel e sua mistura com diesel. Assim, tal micro-organismo apresenta potencial
para o uso em processos de remediação ambiental, mas representa um problema
para o armazenamento de biodiesel e suas misturas com diesel, mesmo em curto
prazo.
Ademais, é importante observar que a produção de Bacillus licheniformis para
uso em remediação ambiental pode ser feita utilizando glicerol como fonte de
carbono, já que tal micro-organismo apresentou crescimento superior nesse
coproduto da produção de biodiesel do que em glucose, indicando que a produção
de biossurfactantes a partir desse micro-organismo pode ser mais uma atividade
comercial para as usinas de biodiesel.
191
5. Referências Bibliográficas
AMARAL, P. F. F.; COELHO, M. A. Z.; MARRUCHO, I. M. J. & COUTINHO, J. A. P.
Biosurfactantes from yeasts: characteristics, production and aplication. In:
Biosurfactants. Ed. R. Sen. Landes Bioscience and Springer+Business Media, New
York. pp. 236-249. 2010.
AMERICAN SOCIETY FOR TESTING AND MATERIALS (ASTM). Standard D6974-
09. Standard Practice for Enumeration of Viable Bacteria and Fungi in Liquid Fuel-
Filtration and Culture Prodcedure. ASTM, 2013.
AMODU, O. S.; NTWAMPE, S. K. OJUMU, T. V. Emulsificarion of hydrocarbons by
biosurfactant: exclusive use of agrowaste. Biosurfactants & emulsions, BioResources
9 (2): 3508-3525. 2014.
ANP. AGÊNCIA NACIONAL DO PETRÓLEO, GÁS NATURAL E
BIOCOMBUSTÍVEIS (ANP). RESOLUÇÃO ANP Nº 45, DE 25.8.2014 - DOU
26.8.2014.
ANTONIOSI FILHO, N. R. Análise de óleos e gorduras vegetais utilizando métodos
cromatográficos de alta resolução e métodos computacionais. Tese apresentada ao
Instituto de Química de São Carlos da Universidade de São Paulo/UFSCar. São
Carlos/SP. 339 f., 1995.
AYED, B.H.; JEMIL, N.; MAALEJ, H.; BAYOUDH, A.; HMIDET, N.; NASRI, M.
Enhancement of solubilization and biodegradation of diesel oil by biosurfactant from
Bacillus amyloliquefaciens AN6. International Biodeterioration & Biodegradation, 99:
8-14. 2015.
AZEREDO, W. A. Otimização da produção de biodiesel metílico a partir de óleos de
fritura residuais (OFR). Dissertação de mestrado apresentada ao Instituto de
Química da Universidade Federal de Goiás/UFG. Goiânia/GO. 104 f., 2014.
192
BARROS, F. F. C.; QUADROS, C. P. & PASTORE, G. M. Propriedades
emulsificantes e estabilidade do biossurfactante produzido por Bacillus subtilis em
manipueira. Ciência e Tecnologia de Alimentos, 28(4): 979-985. 2008.
BENTO, F. M.; CAMARGO, F. A. O. & GAYLARDE, C. C. Biossurfactantes. In:
Microbiologia Ambiental. Ed I. S. Melo & J. L. de Azevedo. Embrapa, Jaguariúna/SP.
pp 151-184. 2008.
BEZERRA, M. S.; HOLANDA, V. C. D.; AMORIM; J. A.; MACEDO, G. R. & SANTOS,
E. S. Produção de biotensioativo utilizando Pseudomonas aeruginosa (P.A) e
resíduo agroindustrial (manipueira) como substrato. Holos, 28 (1): 14-27. 2012.
BHARALI, P. SINGH, S. P.; DUTTA, N.; GOGOI, S.; BORA, L. C.; DEBNATH, P. &
KONWAR, B. K. Biodiesel derived waste glycerol as na economic substrate for
biosurfactant production using indigenous Pseudomonas aeruginosa. Royal Society
of Chemistry Advances, 73 (4): 38698-38706. 2014.
BICCA, E. C.; FLECK, L. C. & AYUB, M. A. Z. Production of biosurfactant by
hydrocarbon degrading Rhodococcus ruber and Rhodococcus erythropolis. Revista
de Microbiologia, 30 (8): 231-236. 1999.
BODOUR, A. A. & MILLER-MAIER, R. Application of a modified drop-collapse
technique quantitation and screening of biosurfactant-producing microorganisms.
Journal of Microbiological Methods, 32 (3): 273-280. 1998.
BURCH, A. Y.; SHIMADA, B. K.; BROWNE, P. J. & LINDOW, S. E. Novel high-
throughput detection method to assess bacterial surfactant production. Applied and
Environmental Microbiology, 76: 5363-5372. 2010.
BURCH, A. Y.; BROWNE, P. J.; DUNLAP, C. A.; PRICE, N. P. & LINDOW, S. E.
Comparison of biosurfactant detection methods reveals hydrophobic surfactants and
contact-regulated production. Environmental Microbiology, 131 (10): 2681-2691.
2011.
193
CARRILLO, P. G.; MARDARAZ, S. I.; PITTA-ALVAREZ & GIULIETTI, A. M. Isolation
and selection of biosurfactant-producing bacteria. World Journal of Microbiology and
Biotechnology, 12 (1): 82-84. 1996.
CHRZANOWSKI, Ɫ.; DZIADAS, M.; ⱢAWNICZAK ,Ɫ.; CYPLIK, Ɫ, BIAⱢAS, W.;
SZULC, A.; LISIECKI, P. & JELEŃ, H. Biodegradation of rhamnolipids in liquid
cultures: effect of biosurfactant dissipation on diesel fuel/B20 blend biodegradation
efficiency and bacterial community composition. Bioresource Technology, 111: 328-
335. 2012.
COOPER, D. G. & GOLDENBERG, B. G. Surface-active agents from two Bacillus
species. Applied and Environmental Microbiology, 53: 224-229. 1987.
CUNHA, C. D. & LEITE, S. G. F. Gasoline biodegradation in different soil
microcosms. Brazilian Journal of Microbiology, 31: 45-49. 2000.
DADRASNIA, A. & AGAMUTHU, P. Dynamics of diesel fuel degradation in
contaminated soil using organic wastes. International Journal of
Environmental Science and Technology, 10 (4): 769-778. 2013.
DADRASNIA, A. & ISMAIL, S. Biosurfactant produciton by Bacillus salmalaya for
lubricating oil solubization and biodegradation. International Journal of Environmental
Research and Public Health, 12: 9848-9863. 2015.
DE FARIA, A. F.; TEODORO-MARTINEZ, D. S.; DE OLIVEIRA BARBOSA, G. N.;
VAZ, B. G.; SILVA, I. S.; GARCIA, J. S.; TÓTOLA, M. R.; EBERLIN, M. N.;
GROSSMAN, M.; ALVES, O. L. & DURRANT, L. R. Production and strutural
characterization of surfactin (C-14/Leu(7)) produced by Bacillus subtilis isolate LSFM-
05 grown on raw glycerol from the biodiesel industry. Process Biochemistry, 46 (10):
1951-1957. 2011.
DE MORAIS, K. A. D.; SOARES, R. S.; ARAÚJO, M. V. F.; DE OLIVEIRA, B. R. R. &
VIEIRA, J. D. G. Produçao de biossurfactante por Bacillus sp. em meio mínimo
contendo glucose. Enciclopédia Biofera, 11 (22): 3084-3094. 2015.
194
DE OLIVEIRA, N. C.; RODRIGUES, A. A.; ALVES, M. I. R.; ANTONIOSI FILHO, N.
R.; SADOYAMA, G. & VIEIRA, J. D. G. Endophytic bactéria with potencial for
bioremediation petroleym hydrocarbons and derivatives. African Journal of
Biotechnology, 11 (12): 2977-2984. 2012.
DE SOUSA, J. R.; DA COSTA CORREIA, J. A.; DE ALMEIDA, J. G. L.;
RODRIGUES, S.; PESSOA, O. D. L.; MELO, V. M. M. & GONÇALVES, L. R. B.
Evaluation of a co-product of biodiesel production as carbono source in the
production of biosurfactant by P. aeruginosa MSIC02. Process Biochemistry, 46 (9):
1831-1839. 2011.
DE SOUSA, M.; MELO, V. M. M.; RODRIGUES, S. & SANT‟ANA, H. B. Screening of
biosurfactant-producing Bacillus strains using glycerol from the biodiesel synthesis as
main carbono source. Bioprocess and Biosystems Engineering, 35 (6): 897-906.
2012.
DE SOUSA, M.; DANTAS, I. T.; NOGUEIRA FELIX, A. K.; DE SANT‟ANA, H. B.;
MELO, V. M. M. & GONÇALVES, L. R. B. Crude glycerol from biodiesel industry as
substrate for biosurfactant production by Bacillus subtilis ATCC 6633. Brazilian
Archives of Biolgy and Technology, 57 (2): 295-301. 2014a.
DE SOUSA, M.; DANTAS, I. T.; FEITOSA, F. X.; ALENCAR, A. E. V.; SOARES, S.
A.; MELO, V. M. M.; GONÇALVES, L. R. B. & SANT‟ANA, H. B. Performance of a
biosurfactant produced by Bacillus subtilis LAMI005 on the formation of
oil/biosurfactant/water emulsion: study of the phase behaviour of emulsified systems.
Brazilian Journal of Chemical Engineering, 31 (3): 613-623. 2014b.
DOS SANTOS, B. F.; PONEZI, A. N. & FRATTINI FILETI, A. M. Stratety for waste
management in the production and application of biosurfactant through surface
response methodology. Clean Technologies and Environmental Policy, 18 (3): 787-
795. 2016.
195
DEEPAK, R. & JAYAPRADHA, R. Lipopeptide biosurfactant from Bacillus
thurigiensis pak2310: a potential antagonista against Fusarium oxysporum. Journal
de Mycologie Medicale, 25 (1): E15-E24. 2015.
DEEPIKA, K. V.; KALAM, S.; SRIDHAR, P. R.; PODILE, A. R. & BRAMHACHARI, P.
V. Optimization of rhamnolipid biosurfactant production by mangrove sediment
bacterium Pseudomonas aeruginosa KDV-HR42 using response surfasse
methodology. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, 5: 38-47. 2016.
FREITAS, F.; ALVES, V. D.; CARVALHEIRA, M.; COSTA, N.; OLIVERIA, R. & REIS,
M. A. M. Emulsifying behaviour and rheological properties of the extracelular
polysaccharide produced by Pseudomonas oleovorans grown on glycerol byproduct.
Carbohydrate Polymers, 78: 549-556. 2009.
FONTES, G. C.; AMARAL, P. F. F. & COELHO, M. A. Z. Produção de
biossurfactantes por levedura. Química Nova, 31(8): 2091-2099. 2008.
FONTES, G. C.; RAMOS, N. M.; AMARAL, P. F. F. NELE, M. & COELHO, M. A. Z.
Renewable resources for biosurfactant production by Yarrowia lipolytica. Brazilian
Journal of Chemical Engineering, 29 (3): 483-493. 2012.
FREGOLENTE, P. B. L.; FREGOLENTE, L. V. & MACIEL, M. R. W. Water content in
biodiesel, diesel, and biodiesel-diesel blends. Journal of Chemical & Engineering
Data, 57: 1817-1821. 2012.
GAYLARDE, C. C.; BENTO, F. M. & KELLEY, J. Microbial contamination of stored
hydrocarbon fuels and its control. Revista de Microbiologia, 30: 01-10. 1999.
GUDIÑA, E. J.; PEREIRA, J. F. B.; RODRIGUES, L. R.; COUTINHO, J. A. P. &
TEIXEIRA, J. A. Isolation and study of microorganisms from oil samples for
application in Microbial Enhanced Oil Recovery. International Biodeterioration &
Biodegradation, 68: 56-64. 2012.
196
HAUSMANN, R. & SYLDATK, C. Types and classification of microbial surfactants. In
Biosurfactants. Production and Utilization-Processes, Technologies, and Economics.
Ed. N. Kosaric & F. Vardar-Sukan, CRC Press, Taylor & Francis Group, New York. P.
3-18. 2015.
HE, B. B.; THOMPSON, J. C.; ROUTT, D. W. & VAN GERPEN, J. H. Moisture
absorption in biodiesel and its petro-diesel blends. Applied Engineering in
Agriculture, 23 (1): 71-76. 2007.
KHONDEE, N.; TATHONG, S.; PINYAKONG, O.; MÜLLER, R.;
SOONGLERDSONGPHA, S.; RUANGCHAINIKOM, C.; TONGCUMPOU, C. &
LUEPROMCHAI, E. Lipopeptide biosurfactant production by chitosan-immobilized
Bacillus sp. GY19 and their recovery by foam fractionation. Biochemical Engineering
Journal, 93: 47-54. 2015.
KIM, M.; MORRISON, M. & Yu, Z. Evaluation of different partial 16S rRna gene
sequence analysis of microbiomes. Journal of Microbiological Methods, 84: 81-87.
2011.
KNOTHE, G. Monitoring a progressing transesterification reaction by fiber-optic
near infrared spectroscopy with correlation to 1H nuclear magnetic resonance
spectroscopy. Journal of the American Oil Chemists‟ Society, 77 (5): 489-493, 2000.
KUMAR, C. G.; MAMIDYALA, S. K.; SUJITHA, P.; MULUKA, H. & AKKENAPALLY,
S. Evaluation of critical nutritional parameters and their significance in the production
of rhamnolipid biosurfactants from Pseudomonas aeruginosa BS-161R.
Biotechnology Progress, 28 (6): 1507-1516. 2012.
KUMARI, B.; SINGH, S. N. & SINGH, D. P. Characterization of two biosurfactant
producing strains in crude oil degradation. Process Biochemistry, 47: 2463-2471.
2012.
197
LAN, G.; FAN, W.; LIU, Y.; CHEN, C. LI, G.; LIU, Y. & YIN, X. Rhamnolipid
production from waste cooking oil using Pseudomonas SWP-4. Biochemical
Engineering Journal, 101: 44-54. 2015.
LAWNICZAK, L.; MARECIK, R. & CHRZANOWSKI, L. Contributions of
biosurfacatants to natural or induced bioremediation. Applied Microbiology and
Biotechnology, 97: 2327-2339. 2013.
LIN, S. C. Biosurfactants: recente advances. Journal Chemistry Tecnology and
Biotechnology, 66: 109-120. 1996.
McFARLANE, E. Problems caused by microbes and treatment strategies.
Downstream petroleum microbiology – an industry perspective. In: Applied
Microbiology and Molecular Biology in Oilfield Systems. Ed. C. Whitby & T. L.
Skovhus. Springer Science+Business. New York, USA. pp. 159-167. 2009.
MEYER, D. D.; SANTESTEVAN, N. A.; BUECKER, F.; SALAMONI, S. P.;
ANDREAZZA, R.; DE OLIVEIRA CAMARGO, F.A. & BENTO, F. M. Capability of a
selected bactreial consortium for degrading diesel/biodiesel blends (B20): enzyme
and biosurfactant production. Journal of Environmental Science and Health: Part A,
Toxic/Hazardous Substances & Environmental Engineering, 47 (12): 1776-84. 2012.
MONTEIRO, A. S.; DOMINGUES, V. S.; SOUZA, M. V. D.; LULA, I.; GONÇALVES,
D. B.; DE SIQUEIRA, E. P. & DOS SANTOS, V. L. Bioconversion of biodiesel
refinery waste in the bioemulsifier by Trichosporon mycotoxinivorans CLA2.
Biotechnology for Biofuels, 5: 29. 2012.
MOSHTAGH, B. & HAWBOLDT, K. Production of biodispersants for oil spill
remediation in harsh Environmental using glycerol from the conversion of fish oil to
biodiesel. Oceans Conference, St Johns, Canada. 2014.
MUKHERJEE, S.; DAS P. & SEN, R. Towards comercial production of microbial
surfactants. Trends in Biotechnology, 24 (11): 509-515. 2006.
198
MULLIGAN, C. N., COOPER, D. G. & NEUFELD, R. J. Selection of microbes
producing biosurfactants in media without hydrocarbons. Journal of Fermentation
Technology, 62: 311-314. 1984.
MUSALE, V. & THAKAR, S. B. Review: biosurfactant and hydrocarbon degradation.
Research Journal of Life Sciences, Bioinformatics, Pharmaceutical and Chemical
Sciences, 1 (1): 1-25. 2015.
NGUYEN, T. T. & SABATINI, D. A. Characterization and emulsification properties of
rhamnolipid and sophorolipid biosurfactant and their applications. International
Journal of Molecular Sciences, 12 (2): 1232-44. 2011.
OWSIANIAK, M. CHRZANOWSKI, L., SZULC, A.; STANIEWSKI, J.;
OLSZANOWSKI, A.; OLEJNIK-SCHMIDT, A. K. & HEIPIEPER, H. J. Biodegradation
of diesel/biodiesel blends by a consortium of hydrocarbon degraders: effect of the
type of blend and the addition of biosurfactants. Bioresource Technology, 100 (3):
1497-1500. 2009.
PACWA-PLOCINICZAK, M.; PLAZA, G. A.; PIOTROWSKA-SEGET, Z. &
CAMEOTRA, S. S. Environmental applications of biosurfactants: recent advances.
International Journal of Molecular Sciences, 12: 633-654. 2011.
PALADINO, F. Estudo da síntese de enzimas por Bacillus licheniformis E-44 em
meio formulado à base de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar.
Dissertação de mestrado apresentada à Escola de Engenharia de Lorena da
Universidade de São Paulo/USP. Lorena/SP. 74 f. 2008.
PARKINSON, M. Bio-surfactants. Biotechnology Advances, 3: 65-83. 1985.
PECCI, Y.; RIVARDO, F.; MARTINOTTI, M. G. & ALLEGRONE, G. LC/ESI-MS/MS
characterization of lipopeptide biosurfactants produced by the Bacillus licheniformis
V9T14 strain. Journal Mass Spectrometry, 45: 772-778. 2010.
199
PEDERSEN, P. B.; BJØRNVAD, M. E.; RASMUSSEN, M. D. & PEDERSEN, J. N.
Cytotoxic potencial of industrial strains of Bacillus sp. Regulatory Toxicology and
Pharmacology, 36: 155-161. 2002.
PEREIRA, A. G.; PACHECO, G. J.; TAVARES, L. F.; NEVES, B. C.;
KRONEMBERGER, F. A.; REIS, R. S. & FREIRE, D. M. G. Optimization of
biosurfactant production using waste from biodiesel industry in a new membrane
assisted bioreactor. Process Biochemistry, 48 (9): 1271-1278. 2013.
PIROG, T.; SHULYAKOVA, M.; SOFILKANYCH, A.; SHEVCHUK, T. &
MASCHCHENKO, O. Biosurfactant synthesis by Rhodococcus rythropolis IMV Ac-
5017, Acinetobacter calcoaceticus IMV B-7241 and Nocardia vaccinii IMV B-7405 on
byproduct of biodiesel production. Food and Bioproducts Processing, 93: 11-18.
2015.
PRATAP, A.; WADEKAR, S. & KALE, S. Non-traditional oils as never feedstock for
rhamnolipids production by Pseudomonas aeruginosa (ATCC 10145). Journal of the
American Oil Chemists‟ Society, 88: 1935-1943. 2011.
POLETO, L. Isolamento e identificação de microrganismos produtores de
hidrogêncio a partir de glicerol residual. Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Biotecnologia da Universidade de Caxias do Sul. Caxias do
Sul/RS. 134 f., 2014.
ROONEY, A. P.; PRICE, N. P. J.; RAY, K. J. & KUO, T-M. Isolation and
characterization of rhaminolipid-producing bacterial strains from a biodiesel facility.
Federation of European Microbiological Societies (FEMS) Microbiology Letters, 295:
82-87. 2009.
SACHDEV, D. P. & CAMEOTRA, S. S. Biosurfactants in agriculture. Applied
Microbiology and Biotechnology, 97 (3): 1005-1016. 2013.
200
SAHARAN, B. S.; SAHU, R. K. & SHARMA, D. A review on biosurfactants:
fermentation, current developments and perspectives. Genetic Engineering and
Biotechonology Journal, 14: 1-18. 2011.
SAIMMAI, A.; RUKADEE, O.; SOBHON, V. & MANEERAT, S. Biosurfactant
production by Bacillus subtilis TD4 and Pseudomonas aeruginosa SU7 grown on
crude glycerol obtained from biodiesel production plant as sole carbono source.
Journal of Scientific and Industrial Research, 71 (6): 396-406. 2012.
SANTOS, B. F.; PONEZI, A. N. & FILETI, A. M. F. Strategy of using waste for
biosurfactant production through fermentation by Bacillus subtilis. International
Conference on Biomass, 37: 727-732. 2014.
SEABRA, P. N. Biorremediação de Solos Contaminados por Petróleo e Derivados.
In: Microbiologia Ambiental. Ed I. S. Melo, J. L. Azevedo. Embrapa Meio Ambiente,
p. 547-570. 2008.
SEBIOMO, A.; BANKOLE, S. A. & AWOSANYA, A. O. Determination of the ability of
microorganisms isolated from mechanic soil to utilize lubricating oil as carbono
source. African Journal of Microbiology Research, 4 (21): 2257-2264. 2010.
SHARMA, Y.C.; SINGH, B. & UPADHYAY, S. N. Advancements in development and
characterization of biodiesel: a review. Fuel, 87: 2355-2373. 2008.
SCHULZ, D.; BONELLI, R. R. & BATISTA, C. R. V. Bacteriocinas e enzimas
produzidas por Bacillus spp. para conservação e processamento de alimentos.
Alimentos e Nutrição, 16 (4): 403-411. 2005.
SLIVINSKI, C. T. Produção de surfactina por Bacillus pumilus UFPEDA 448 em
fermentação em estado sólido utiizando bagaço de cana e okara como substrato.
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências – Bioquímica.
Universidade Federal do Paraná, Curitiva/PR, 141 fl. 2012.
201
SNEHA, K. S.; PADMAPRIYA, B. & RAJESWARI, T. Isolation and screening of
biosurfactants produced by Pseudomonas aeruginosa from oil spilled soils.
International Journal of Pharmaceutical and Biological Archieve, 3 (2): 321-325.
2012.
SOUSA, J. R.; DA COSTA CORREIA, J. A.; LIMA DE ALMEIDA, J. G.;
RODRIGUES, S.; PESSOA, O. D. L. & MELO, V. M. M. Evaluation of a co-product of
biodiesel production as carbon source in the production of biosurfactant by P.
aeruginosa MSICO2. Process Biochemistry, 46 (9): 1831-1839. 2011.
SOUSA, J. R.; DA COSTA CORREIA, J. A.; MELO, V. M. M.; GONÇALVES, L. R. B.
& CRUZ, A. J. G. Cinética e caracterização de ramnolipídeos produzidos por
Pseudomonas aeruginosa MSICO2 utilizando glicerol como fonte de carbono.
Química Nova, 37 (3): 431-441. 2014.
SOUZA, F. H. N.; MAIA, F. J. N.; MAZZETTO, S. E.; NASCIMENTO, T. L.; DE
ANDRADE, N. C.; DE OLIVEIRA, A. L. N. F. & RIOS, M. A. S. Oxidative stability of
soybean biodiesel in mixture with antioxidants by thermogravimetry and rancimat
method. Chemical and Biochemical Engineering Quarterly, 27 (3): 327-334. 2013.
THENMOZHI, R.; NAGASATHYA, A. & THAJUDDIN, N. Studies on biodegradation
of used engine oil by consortium cultures. Advances in Environmental Biology, 5 (6):
1051-1057. 2011.
VAN HAMME, J. D.; SINGH, A. & WARD, O. P. Physciological aspects. Part 1 in a
series of papers devoted to surfactants in microbiology and biotechnology. 24 (6):
604-620. 2006.
VAN SOOLINGEN, D., DE HAAS, P. E., HERMANS, P. W., VAN EMBDEN, J. D.
DNA fingerprinting of Mycobacterium tuberculosis. Methods Enzymology, 235: 196-
205. 1994.
VIEIRA, T. M.; SILVA, E. P.; ANTONIOSI FILHO, N. R.; VIEIRA, J. D. G.
Determinação e quantificação da degradação bacteriana de biodiesel de óleo de
202
palma. In: CONGRESSO DA REDE BRASILEIRA DE TECNOLOGIA DE
BIODIESEL, Brasília (DF), p.218-223. 2006.
VIEIRA, T. M.; LIMA, M. F.; PEIXOTO, R. M.; VIEIRA, J. D. G. Utilização de 2,6-
Diclorofenol-Indofenol (Dcpip) em teste rápido de caracterização de potenciais
biodegradadores de biodiesel. Cd dos Anais Do II Congresso da Rede Brasileira de
Tecnologia do Biodiesel. 1-5 p. 2007.
VIJAYAKUMAR, S. & SARAVANAN, V. Biosurfactants-Types, Sources And
Applications. Research Journal of Microbiology, 10 (5): 181-192. 2015.
WALTER, V.; SYLDATK, C. & HAUSMANN, R. Screening concepts for the isolation
of biosurfactant producing microorganisms. In: Biosurfactants. Ed. R. Sen. Landes
Bioscience and Springer+Business Media, New York. pp. 01-13. 2010.
WEISBURG, W. G.; BARNS, S. M.; PELLETIER, D. A. & GENE-TRAK, D. J. L. 16S
ribossomal DNA amplification for phylogenetic study. Journal of Bacteriology, 173 (2):
697-703. 1991.
YAKIMOV, M. M.; ABRAHAM, W. R.; MEYER, H.; GIULIANO, L. & GOLYSHIN, P. N.
Structural characterization of lichenysin A components by fast atom bombardment
tandem mass spectrometry. Biochimica et Biophysica Acta, 1438: 273-280. 1999.
YOUSSEF, N. H.; DUNCAN, K. E.; NAGLE, D. P.; SAVAGE, K. N.; KNAPP, R. M.;
MACLNERNEY, M. J.; J. Comparison of methods to detect biosurfactant production
by diverse microorganisms. Microbiology Methods, 56: 339-347. 2004.
203
CONCLUSÕES GERAIS
Os objetivos propostos para a realização desta tese foram alcançados, uma
vez que os estudos permitiram conhecer e sugerir algumas alternativas de cunho
tecnológico para incentivar o desenvolvimeto e aperfeiçoar a viabilidade da cadeia
de produção de biodiesel a partir de óleo de fritura.
Durante o trabalho foi possível utilizar uma metodologia otimizada
desenvolvida recentemente usando a esterificação ácida e transesterificação
alcalina para a produção de biodiesel metílico a partir de óleo de fritura, que embora
alguns aspectos estivessem fora dos limites permitidos pela legislação nacional, tais
como alto teor de água, viscosidade, acidez e teor de metais como sódio e potássio,
em função da presença de produtos de oxidação como ácidos graxos livres e
oxidados, hidroxiperóxidienos e cetodienos, verificou-se claramente a elevação da
qualidade do biodiesel produzido no que tange parâmetros como estabilidade
oxidativa através do uso de aditivos naturais como L-triptofano e curcumina.
Mesmo os parâmetros anteriores se encontrarem fora dos limites permitidos,
não foram capazes de interferir na ação antioxidante da curcumina mesmo por um
período de até 120 dias. O ponto de indução foi elevado muito além de 8 horas,
chegando até 26,70 horas na presenção de curcumina, 11,96 horas para L-triptofano
(ambos na concentração nominal de 700 mg/Kg) e de 20,98 horas para a mistura de
500 mg/Kg de cada um dos antioxidantes utilizados, indicando que a estabilidade
oxidativa pode ser mantida por até 120 dias, período muito acima do limite mínimo
que a legislação brasileira preconiza.
Observou-se que um comportamento sinérgico entre a curcumina e o L-
triptofano, os quais puderam expressar um resultado mais eficiente para a
estabilidade oxidativa do biodiesel de ORF armazenado em longo prazo, além da
possiblidade de se utilizar aditivos naturais os quais podem ter impacto ambiental
menor que os aditivos sintéticos utilizados até o momento para o biodiesel comercial,
como sugerido pela literatura.
Sobre os aspectos ecotoxicológicos existem relativamente poucas
publicações desde 1945, e em se tratando dos combustíveis alternativos questões
vinculadas à cadeia produtiva, regulamentação e os aspectos ambientais tais como
as potencialidades toxicológicas em curto e longo prazo e de sustentabilidade são
muito mais questionadas, embora suas vantagens superem as dos combustíveis
204
fósseis. Fica evidenciado a importância de se explorar mais as características
tóxicas deste biocombustível uma vez que os estudos disponíveis podem ser
insuficientes para compreender totalmente o potencial de contaminação nos
ecossistemas.
Em relação ao aspecto ecotoxicológico, observou-se que o biodiesel de óleo
residual de fritura demonstrou ser menos tóxico que o biodiesel de óleo de soja
refinado frente à Artemia salina. Nas misturas de biodiesel de óleo residual de fritura
(B7 e B20) com óleo diesel A S500, quanto maior o percentual de biodiesel, menos
tóxica é a mistura, sendo o óleo diesel o mais tóxico dos combustíveis testados.
Portanto, o efeito tóxico frente ao organismo teste utilizado representando o
ambiente aquático salobro ou salino apresentou menor impacto que o biodiesel
produzido a partir de óleos refinados, o que demonstra que tal produto pode ser
utilizado com segurança ambiental até superior a proporcionada por biodiesel
produzido com o uso de óleos graxos de maior qualidade.
Do ponto de vista microbiológico o biodiesel recém-preparado apresenta uma
população bacteriana reduzida, porém com potencial para deteriorar o biodiesel
produzido a partir de óleo de fritura, principalmente na fase de armazenamento. Isso
pode ocorrer devido a capacidade do Bacillus licheniformis de produzir
biossurfactantes, os quais contribuem para ação deteriogênica do biodiesel.
Assim, conclui-se que as pesquisas efetuadas permitiram avaliar as
características físicas, químicas, ecotoxicológicas e microbiológicas de biodiesel
metílico de ORF e verificar os aspectos relevantes para melhorar efetivamente a
qualidade do mesmo utilizando um passivo ambiental, o óleo de fritura, o qual pode
se comportar nos ecossistemas com grande impacto, além de favorecer a
incorporação de uma alternativa viável de matéria graxa na cadeia produtiva do
biodiesel, fortalecendo a produção de energia renovável com qualidade.
205
ANEXO I
Resolução ANP Nº 45, de 25/8/2014 - DOU 26/8/2014
Esatabelece a especificação do biodiesel contida no Regulamento Técnico ANP nº
3/2014 e as obrigações quanto ao controle da qualidade a serem atendidas pelos
diversos agentes econômicos que comercializam o produto em todo o território
nacional.
Disponível em
http://nxt.anp.gov.br/nxt/gateway.dll/leg/resolucoes_anp/2014/agosto/ranp%2045%2
0-%202014.xml
(Acesso em 28/03/2016)
206
RESOLUÇÃO ANP Nº 45, DE 25.8.2014 - DOU 26.8.2014
A DIRETORA-GERAL da AGÊNCIA NACIONAL DO PETRÓLEO, GÁS NATURAL E BIOCOMBUSTÍVEIS - ANP, no uso das atribuições legais, tendo em vista as disposições da Lei nº 9.478, de 06 de agosto de 1997, e suas alterações, e com base na Resolução de Diretoria nº 854, de 13 de agosto de 2014;
Considerando o interesse para o País em apresentar sucedâneos para o óleo diesel;
Considerando a Lei nº 11.097, de 13 de janeiro de 2005, que define o biodiesel como um combustível derivado de biomassa renovável para uso em motores a combustão interna com ignição por compressão, que possa substituir parcial ou totalmente o óleo diesel de origem fóssil;
Considerando as diretrizes emanadas do Conselho Nacional de Política Energética - CNPE, quanto à produção e ao percentual de biodiesel no óleo diesel a ser comercializado;
Considerando o disposto no inciso XVIII, art. 8º da Lei nº 9.478, de 6 de agosto de 1997, alterada pela Lei nº 11.097, de 13 de janeiro de 2005, que estabelece a atribuição da ANP em especificar a qualidade do biodiesel, e
Considerando a Lei 12.490, de 16 de setembro de 2011 que, acrescenta e dá nova redação a dispositivos previstos na Lei nº 9.478/1997, além de ampliar a competência da ANP para toda a Indústria de Biocombustíveis, definida como o conjunto de atividades econômicas relacionadas com produção, importação, exportação, transferência, transporte, armazenagem, comercialização, distribuição, avaliação de conformidade e certificação da qualidade de biocombustíveis,
Resolve:
Seção I
Das Disposições Preliminares
Art. 1º Ficam estabelecidas, por meio da presente Resolução, a especificação do biodiesel contida no Regulamento Técnico ANP nº 3/2014 e as obrigações quanto ao controle da qualidade a serem atendidas pelos diversos agentes econômicos que comercializam o produto em todo o território nacional.
Parágrafo único. Fica vedada a comercialização de biodiesel que não se enquadre na especificação contida no Regulamento Técnico ANP, parte integrante desta Resolução.
Seção II
Das Definições
Art. 2º Para efeitos desta Resolução, definem-se:
I - Biodiesel: combustível composto de alquil ésteres de ácidos carboxílicos de cadeia longa, produzido a partir da transesterificação e/ou esterificação de matérias graxas, de gorduras de origem vegetal ou animal, e que atenda a especificação contida no Regulamento Técnico, parte integrante desta Resolução.
II - Óleo diesel A: combustível de uso rodoviário e não rodoviário, destinado a veículos e equipamentos dotados de motores do ciclo Diesel e produzido por processos de refino de petróleo e processamento de gás natural, sem adição de biodiesel.
207
III - Óleo diesel B: óleo diesel A que contém biodiesel no teor estabelecido pela legislação vigente.
IV - Óleo diesel BX: óleo diesel A que contém biodiesel no teor superior ao estabelecido pela legislação vigente em proporção definida (X%) quando autorizado o uso específico ou experimental conforme regulamentação da ANP.
V - Produtor: pessoa jurídica ou consórcios autorizados pela ANP a exercerem a atividade de produção e comercialização de biodiesel.
VI - Distribuidor: pessoa jurídica autorizada pela ANP ao exercício da atividade de distribuição de combustíveis líquidos derivados de petróleo, biocombustíveis e outros combustíveis automotivos especificados ou autorizados pela ANP.
VII - Revendedor: pessoa jurídica autorizada pela ANP para o exercício da atividade de revenda varejista que consiste na comercialização de combustível automotivo em estabelecimento denominado posto revendedor.
VIII - Transportador-Revendedor-Retalhista (TRR): pessoa jurídica autorizada pela ANP para o exercício das atividades de transporte e revenda retalhista de combustíveis, de óleos lubrificantes e graxas envasados, óleo diesel B e óleo diesel BX.
IX - Importador: empresa autorizada pela ANP para o exercício da atividade de importação.
X - Exportador: empresa autorizada pela ANP para o exercício da atividade de exportação.
XI - Refinaria: pessoa jurídica autorizada pela ANP para o exercício da atividade de refino de petróleo.
XII - Adquirente: pessoa jurídica autorizada pela ANP, responsável pela aquisição e armazenamento de biodiesel, para garantir o estoque regulatório necessário a fim de assegurar o abastecimento nacional de biodiesel.
XIII - Boletim de Análise: documento da qualidade emitido por laboratório cadastrado na ANP de acordo com a Resolução ANP nº 06, de 05 de fevereiro de 2014, ou outra que venha substituí-la, com informação(ões) e resultado(s) do(s) ensaio(s) realizado(s), conforme Regulamento Técnico, parte integrante desta Resolução.
XIV - Certificado da Qualidade: documento da qualidade emitido por Produtor, Adquirente e Importador que comprove o atendimento do produto comercializado à especificação da ANP, com todos os requisitos constantes do Artigo 5º, § 6º, da presente Resolução.
XV - Volume Certificado: quantidade segregada de produto em um único tanque, caracterizada por Certificado da Qualidade.
XVI - Firma inspetora: pessoa jurídica credenciada pela ANP, para realização de atividades de controle da qualidade na importação e exportação de derivados de petróleo, e biocombustíveis, de adição de marcador aos Produtos de Marcação Compulsória (PMC) indicados pela ANP, e de adição de corante ao etanol anidro combustível, conforme legislação vigente.
XVII - Aditivo: produto que contém componentes ativos, com ou sem fluido carreador ou diluente, que confere aos combustíveis propriedades benéficas ou que oferece ao veículo algum tipo de benefício, destinado a ser adicionado ao combustível em concentração que não exceda a 5.000 µL/L (0,5 % v/v);.
208
XVIII - Componente ativo: composto químico ou combinação de compostos químicos responsável pelas propriedades benéficas do aditivo.
XIX - Diluente: veículo no qual o componente ativo do aditivo é diluído, com a finalidade de facilitar sua mistura com o combustível ou seu bombeamento e movimentação.
XX - Terminal de carregamento: local de carregamento do produto, no país de origem.
Seção III
Da Comercialização
Art. 3º O biodiesel só poderá ser comercializado pelos Produtores, Distribuidores, Refinarias, Adquirentes, Importadores e Exportadores de biodiesel autorizados pela ANP.
§ 1º Somente os Distribuidores e as Refinarias autorizados pela ANP poderão realizar a mistura óleo diesel A/biodiesel para efetivar sua comercialização.
§ 2º É vedada a comercialização de biodiesel pelo Produtor ou Refinaria ou Adquirente ou Distribuidor ou Importador para Revendedor ou Transportador-Revendedor-Retalhista.
Art. 4º O Distribuidor e o Adquirente deverão recusar o recebimento do produto caso constatem qualquer não-conformidade presente no Certificado da Qualidade ou após realização de análise de amostra representativa. Tal não-conformidade deverá ser comunicada à ANP por meio de endereço eletrônico disponibilizado no sítio http://www.anp.gov.br, no prazo máximo de 48 (quarenta e oito) horas, considerando-se somente os dias úteis, e informando:
I - Data da ocorrência;
II - Número e data de emissão da Nota Fiscal e;
III - CNPJ do emitente da Nota Fiscal.
Seção IV
Da Certificação do Biodiesel
Art. 5º O Produtor, o Adquirente e o Importador ficam obrigados a garantir a qualidade do biodiesel a ser comercializado em todo o território nacional e a emitir o Certificado da Qualidade de amostra representativa, cujos resultados deverão atender aos limites estabelecidos da especificação constante no Regulamento Técnico ANP, parte integrante desta Resolução.
§ 1º O produto somente poderá ser liberado para a comercialização após a sua certificação, com a emissão do respectivo Certificado da Qualidade, que deverá acompanhar o produto.
§ 2º As análises constantes do Certificado da Qualidade só poderão ser realizadas em laboratório próprio do Produtor, do Adquirente ou outro(s) contratado(s) por estes, o(s) qual(is) deverá(ão) ser cadastrado(s) pela ANP conforme Resolução ANP nº 06, de 05 de fevereiro de 2014, ou outra que venha a substituí-la.
§ 3º No caso de certificação do biodiesel utilizando laboratório próprio e contratado, o Produtor e o Adquirente deverão emitir Certificado da Qualidade único, agrupando todos os resultados constantes do(s) Boletim(ns) de Análise que tenham
209
recebido do(s) laboratório(s) cadastrado(s) pela ANP. Esse Certificado deverá indicar o(s) laboratório(s) responsável(is) por cada ensaio.
§ 4º Caso o produto não seja comercializado no prazo máximo de 1 (um) mês, a partir da data de certificação constante do Certificado da Qualidade, a característica massa específica a 20 ºC deverá ser novamente analisada:
I - Se a diferença encontrada com relação à massa específica a 20 ºC do Certificado da Qualidade for inferior a 3,0 kg/m³, deverão ser novamente avaliados o teor de água, o índice de acidez e a estabilidade à oxidação a 110 ºC.
II - Se a diferença for superior a 3,0 kg/m³, deverá ser realizada a recertificação completa segundo esta Resolução.
§ 5º No caso da importação de biodiesel, a análise de amostra representativa e a emissão do Certificado da Qualidade deverão ser realizadas por Firma Inspetora, contratada pelo Importador, atestando que o produto atende ao Regulamento Técnico ANP, parte integrante desta Resolução.
I - A Firma Inspetora deverá ser cadastrada na ANP ou poderá contratar laboratório cadastrado junto à ANP para emissão do Boletim de Análise.
II - A Firma Inspetora ficará obrigada a apresentar os Boletins de Análise emitidos pelo(s) laboratório(s) contratado(s), caso seja solicitado pela ANP.
§ 6º O Certificado da Qualidade referente ao produto comercializado deverá conter:
I - os resultados das análises dos parâmetros especificados, com indicação dos métodos empregados e os respectivos limites constantes da especificação, conforme Regulamento Técnico ANP, parte integrante desta Resolução;
II - o tanque de origem e a identificação do lacre da amostra-testemunha, previsto no art. 6º deste regulamento;
III - a data de produção do biodiesel;
IV - o material graxo e o álcool utilizado para obtenção do biodiesel;
a) Caso seja usado mais de um tipo de material graxo, devem ser informadas suas respectivas proporções;
V - a identificação do aditivo utilizado na fase de produção, quando for o caso, cabendo classificar o tipo;
a) Após a aditivação, o biodiesel deverá permanecer de acordo com a sua especificação técnica.
VI - identificação própria por meio de numeração sequencial anual, inclusive no caso de cópia emitida eletronicamente;
VII - assinatura do químico responsável pela qualidade do produto na empresa, com indicação legível de seu nome e número de inscrição no Conselho Regional de Química;
VIII - indicação do laboratório cadastrado na ANP responsável por cada ensaio efetuado e da identificação de cada Boletim de Análise utilizado para compor o respectivo Certificado da Qualidade.
§ 7º Em qualquer situação, o Boletim de Análise deverá ser emitido por laboratório cadastrado conforme as regras estabelecidas na Resolução ANP nº 06 de 05 de fevereiro de 2014, ou regulamentação superveniente que venha a substituí-la.
210
§ 8º O Boletim de Análise deverá ser firmado pelo químico responsável pelos ensaios laboratoriais efetuados, com indicação legível de seu nome e número da inscrição no órgão de classe.
§ 9º Para documentos emitidos eletronicamente, é obrigatória a assinatura digital, efetivada mediante utilização de certificado digital válido, de propriedade do responsável pela assinatura do Certificado da Qualidade ou do Boletim de Análise.
§ 10º O Produtor, o Adquirente e a Firma Inspetora somente poderão utilizar o Boletim da Análise como Certificado da Qualidade quando o mesmo for emitido por laboratório próprio, cadastrado na ANP, e contemplar todas as características necessárias à certificação do produto.
Art. 6º Deverão ser mantidas pelo Produtor, Adquirente e Importador, em local protegido de luminosidade e de aquecimento, duas amostras-testemunha de 1 (um) litro cada, representativas do Volume Certificado, devidamente identificadas com o número do Certificado da Qualidade e de seu respectivo lacre.
§ 1º Cada amostra-testemunha deverá ser armazenada em recipiente de cor âmbar de 1 (um) litro de capacidade, com batoque e tampa plástica.
§ 2º O recipiente indicado no § 1º deste artigo deverá ser lacrado, com lacre de numeração controlada, que deixe evidências no caso de violação.
§ 3º Deverão ficar à disposição da ANP para qualquer verificação julgada necessária:
I - as amostras-testemunha, pelo prazo mínimo de 1 mês, a contar da data de saída do produto das instalações do Produtor, Adquirente e Importador;
II - o Certificado da Qualidade, acompanhado dos originais dos Boletins de Análise utilizados na sua composição, quando for o caso, pelo prazo mínimo de 12 meses, a contar da data de saída do produto das instalações do Produtor, Importador e Adquirente.
§ 4º O Certificado da Qualidade deverá ser obrigatoriamente rastreável às suas respectivas amostras-testemunha e Boletins de Análise.
Art. 7º O Produtor, o Importador e o Adquirente deverão enviar mensalmente à ANP, até o 15º (décimo quinto) dia do mês subseqüente à comercialização do produto, todas as informações constantes dos Certificados da Qualidade emitidos no mês de referência e respectivos Volumes Certificados, por meio de endereço eletrônico disponibilizado no sítio http://www.anp.gov.br.
§ 1º O Adquirente só deverá enviar as informações citadas no caput deste artigo no caso em que este armazenar o produto em instalação própria ou por ele contratado. No caso em que o produto adquirido pelo Adquirente ficar armazenado em instalação do produtor de biodiesel, a certificação deverá ser feita pelo Produtor.
§ 2º Os agentes citados no caput deste artigo deverão enviar os dados, em formato eletrônico, segundo orientações de preenchimento disponibilizadas no sítio da ANP http://www.anp.gov.br.
§ 3º Quando não houver comercialização de biodiesel em um determinado mês, o Produtor e o Adquirente deverão obrigatoriamente comunicar à ANP por meio de endereço eletrônico disponibilizado no sítiohttp://www.anp.gov.br.
§ 4º No caso da importação do biodiesel, quando houver comercialização do produto, o Importador ficará obrigado a enviar o formulário eletrônico citado no § 1º deste artigo.
211
Seção V
Dos Documentos Fiscais
Art. 8º A documentação fiscal e o Documento Auxiliar da Nota Fiscal Eletrônica (DANFE) emitidos por Produtor, Adquirente e Importador, para fins de entrega e referentes às operações de comercialização do produto, deverão indicar o número do Certificado da Qualidade e do lacre da amostra-testemunha correspondentes ao produto.
Parágrafo único. O produto, ao ser transportado, deverá ser acompanhado de cópia legível do respectivo Certificado da Qualidade, atestando que o produto comercializado atende a especificação estabelecida no Regulamento Técnico, parte constante desta Resolução.
Seção VI
Das Disposições Finais
Art. 9º O não atendimento às regras estabelecidas na presente Resolução sujeita os infratores às sanções administrativas previstas na Lei nº 9.847, de 26 de outubro de 1999, e no Decreto nº 2.953, de 28 de janeiro de 1999, sem prejuízo das penalidades de natureza civil e penal.
Art. 10. Os casos não contemplados nesta Resolução serão analisados pela Diretoria da ANP.
Art. 11. Esta Resolução entra em vigor na data de sua publicação no Diário Oficial da União.
Art. 12. Fica revogada a Resolução ANP nº 14 de 11 de maio de 2012.
MAGDA MARIA DE REGINA CHAMBRIARD
ANEXO
REGULAMENTO TÉCNICO ANP Nº 3/2014
1. Objetivo
Este Regulamento Técnico aplica-se ao biodiesel nacional ou importado e estabelece a sua especificação.
2. Normas Aplicáveis
A determinação das características do biodiesel deverá ser feita mediante o emprego das normas da Associação Brasileira de Normas Técnicas (ABNT), das normas internacionais da "American Society for Testing and Materials" (ASTM), da "International Organization for Standardization" (ISO) e do "Comité Européen de Normalisation" (CEN).
Os dados de repetibilidade e de reprodutibilidade fornecidos nos métodos relacionados neste Regulamento devem ser usados somente como guia para aceitação das determinações em duplicata do ensaio e não devem ser considerados como tolerância aplicada aos limites especificados neste Regulamento.
A análise do produto deverá ser realizada em amostra representativa obtida segundo os métodos ABNT NBR 14883 - Petróleo e produtos de petróleo - Amostragem manual, ASTM D 4057 - Practice for Manual Sampling of Petroleum
212
and Petroleum Products ou ISO 5555 - Animal and vegetable fats and oils - Sampling.
As características constantes da Tabela I de Especificação do Biodiesel deverão ser determinadas de acordo com a publicação mais recente dos seguintes métodos de ensaio, com exceção ao método proposto pela norma EN 12662, para o qual deve ser utilizada a versão de 1998 ou 2008:
(Nota)
213
2.1. Métodos ABNT
MÉTODO TÍTULO
NBR 6294 Óleos lubrificantes e aditivos - Determinação de cinza sulfatada
NBR 7148 Petróleo e produtos de petróleo - Determinação da massa específica, densidade relativa e ºAPI - Método do densímetro
NBR 10441 Produtos de petróleo - Líquidos transparentes e opacos - Determinação da viscosidade cinemática e cálculo da viscosidade dinâmica
NBR 14065 Destilados de petróleo e óleos viscosos - Determinação da massa específica e da densidade relativa pelo densímetro digital.
NBR 14359 Produtos de petróleo - Determinação da corrosividade - Método da lâmina de cobre
NBR 14448 Produtos de petróleo - Determinação do índice de acidez pelo método de titulação potenciométrica
NBR 14598 Produtos de petróleo - Determinação do ponto de fulgor pelo aparelho de vaso fechado Pensky-Martens
NBR 14747 Óleo Diesel - Determinação do ponto de entupimento de filtro a frio
NBR 15342 Biodiesel - Determinação de monoglicerídeos e diglicerídeos em biodiesel de mamona por cromatografia gasosa
NBR 15343 Biodiesel - Determinação da concentração de metanol e/ou etanol por cromatografia gasosa
NBR 15344 Biodiesel - Determinação de glicerina total e do teor de triglicerídeos em biodiesel
NBR 15553 Produtos derivados de óleos e gorduras - Ésteres metílicos/etílicos de ácidos graxos - Determinação dos teores de cálcio, magnésio, sódio, fósforo e potássio por espectrometria de emissão ótica com plasma indutivamente acoplado (ICP-OES)
NBR 15554 Produtos derivados de óleos e gorduras - Ésteres metílicos/etílicos de ácidos graxos - Determinação do teor de sódio por espectrometria de absorção atômica
NBR 15555 Produtos derivados de óleos e gorduras - Ésteres metílicos/etílicos de ácidos graxos - Determinação do teor de potássio por espectrometria de absorção atômica
NBR 15556 Produtos derivados de óleos e gorduras - Ésteres metílicos/etílicos de ácidos graxos - Determinação do teor de sódio, potássio, magnésio e cálcio por espectrometria de absorção atômica
NBR 15764 Biodiesel - Determinação do teor total de ésteres por cromatografia gasosa
NBR 15771 Biodiesel - Determinação de glicerina livre - Método Volumétrico
NBR 15867 Biodiesel - Determinação do teor de enxofre por espectrometria de emissão ótica com plasma indutivamente acoplado (ICP-OES)
NBR 15908 Biodiesel - Determinação da glicerina livre, monoglicerídeos, diglicerídeos, triglicerídeos e glicerina total por cromatografia gasosa
NBR 15995 Biodiesel - Determinação da contaminação total
214
2.2. Métodos ASTM
MÉTODO TÍTULO
ASTM D93 Flash point by Pensky-Martens closed cup tester
ASTM D130 Corrosiveness to copper from petroleum products by copper strip test
ASTM D445 Kinematic viscosity of transparent and opaque liquids (and calculation of dynamic viscosity
ASTM D613 Cetane number of Diesel fuel oil
ASTM D664 Acid number of petroleum products by potentiometric titration
ASTM D874 Sulfated ash from lubricating oils and additives
ASTM D1298 Density, relative density (specific gravity) or API gravity of crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer
ASTM D4052 Density and relative density of liquids by digital density meter
ASTM D4951 Determination of additive elements in lubricating oils by inductively coupled plasma atomic emission spectrometry
ASTM D5453 Determination of total sulfur in light hydrocarbons, spark ignition engine fuel, diesel engine fuel, and engine oil by ultraviolet fluorescence
ASTM D6304 Determination of water in petroleum products, lubricating oils, and additives by coulometric Karl Fisher titration
ASTM D6371 Cold filter plugging point of Diesel and heating fuels
ASTM D6584 Determination of total monoglyceride, total diglyceride, total triglyceride, and free and total glycerin in B-100 biodiesel methyl esters by gas chromatography
ASTM D6890 Determination of ignition delay and derived cetane number (DCN) of Diesel fuel oils by combustion in a constant volume chamber
2.3. Métodos EN/ISO
MÉTODO TÍTULO
EN 116 Determination of cold filter plugging point
EN ISO 2160 Petroleum products - Corrosiveness to copper - Copper strip test
EN ISO 3104 Petroleum products - Transparent and opaque liquids - Determination of kinematic viscosity and calculation of dynamic viscosity
EN ISO 3675 Crude petroleum and liquid petroleum products - Laboratory determination of density - Hydrometer method
EN ISO 3679 Determination of flash point - Rapid equilibrium closed cup method
EN ISO 3987 Petroleum products - Lubricating oils and additives - Determination of sulfated ash
EN ISO 5165 Diesel fuels - Determination of the ignition quality of diesel fuels - Cetane engine method
EN ISO 12185 Crude petroleum and liquid petroleum products. Oscillating U-tube method
215
EN 12662 Liquid Petroleum Products - Determination of contamination in middle distillates
EN ISO 12937 Petroleum Products - Determination of water - Coulometric Karl Fischer titration method
EN 14103 Fat and oil derivatives - Fatty acid methyl esters (FAME) - Determination of ester and linolenic acid methyl ester contents
EN 14104 Fat and oil derivatives - Fatty acid methyl esters (FAME) - Determination of acid value
EN 14105 Fat and oil derivatives - Fatty acid methyl esters (FAME) - Determination of free and total glycerol and mono-, di- and triglyceride content - (Reference Method)
EN 14106 Fat and oil derivatives - Fatty acid methyl esters (FAME) - Determination of free glycerol content
EN 14107 Fat and oil derivatives - Fatty acid methyl esters (FAME) - Determination of phosphorous content by inductively coupled plasma (ICP) emission spectrometry
EN 14108 Fat and oil derivatives - Fatty acid methyl esters (FAME) - Determination of sodium content by atomic absorption spectrometry
EN 14109 Fat and oil derivatives -Fatty acid methyl esters (FAME) - Determination of potassium content by atomic absorption spectrometry
EN 14110 Fat and oil derivatives - Fatty acid methyl esters (FAME) - Determination of methanol content
EN 14111 Fat and oil derivatives - Fatty acid methyl esters (FAME) - Determination of iodine value
EN 14112 Fat and oil derivatives - Fatty acid methyl esters (FAME) - Determination of oxidation stability (accelerated oxidation test)
EN 14538 Fat and oil derivatives - Fatty acid methyl esters (FAME) - Determination of Ca, K, Mg and Na content by optical emission spectral analysis with inductively coupled plasma (ICP-OES)
EN 15751 Fat and oil derivatives - Fatty acid methyl esters (FAME) and blends with diesel fuel. Determination of oxidation stability by accelerated oxidation method
EN 16294 Petroleum Products And Fat And Oil Derivatives - Determination of Phosphorus Content In Fatty Acid Methyl Esters (Fame) - Optical Emission Spectral Analysis With Inductively Coupled Plasma (ICP OES)
EN ISO 20846 Petroleum Products - Determination of sulfur content of automotive fuels - Ultraviolet fluorescence method
EN ISO 20884 Petroleum Products -Determination of sulfur content of automotive fuels - Wavelength-dispersive X -ray fluorescence spectrometry
216
Tabela I - Especificação do Biodiesel
CARACTERÍSTICA UNIDADE LIMITE MÉTODO
ABNT NBR ASTM D EN/ISO
Aspecto - LII (1) (2) - - -
Massa específica a 20º C kg/m³ 850 a 900 7148
14065
1298
4052
EN ISO 3675
EN ISO 12185
Viscosidade Cinemática a 40ºC mm²/s 3,0 a 6,0 10441 445 EN ISO 3104
Teor de água, máx. mg/kg 200,0 (3) - 6304 EN ISO 12937
Contaminação Total, máx. (13) mg/kg 24 15995 - EN12662 (5)
(Nota)
Ponto de fulgor, mín. (4) ºC 100,0 14598 93 EN ISO 3679
Teor de éster, mín % massa 96,5 15764 - EN 14103 (5)
Cinzas sulfatadas, máx. (6) % massa 0,020 6294 874 EN ISO 3987
Enxofre total, máx. mg/kg 10 15867 5453 EN ISO 20846
EN ISO 20884
Sódio + Potássio, máx. mg/kg 5 15554
15555
15553
15556
- EN 14108 (5)
EN 14109 (5)
EN 14538 (5)
Cálcio + Magnésio, máx. mg/kg 5 15553
15556
- EN 14538 (5)
Fósforo, máx. (7) mg/kg 10 15553 4951 EN 14107 (5)
EN 16294 (5)
Corrosividade ao cobre, 3h a 50 ºC máx.(6) - 1 14359 130 EN ISO 2160
Número Cetano (6) - Anotar - 613
6890 (8)
EN ISO 5165
217
Ponto de entupimento de filtro a frio, máx. ºC (9) 14747 6371 EN 116
Índice de acidez, máx. mg KOH/g 0,50 14448
-
664
-
EN 14104 (5)
Glicerol livre, máx. % massa 0,02 15771
15908 (5)
-
6584 (5)
-
EN 14105 (5)
EN 14106 (5)
Glicerol total, máx. (10) % massa 0,25 15344
15908 (5)
6584 (5)
-
EN 14105 (5)
Monoacilglicerol, máx. % massa 0,7 15342 (5)
15344
15908 (5)
6584 (5) EN 14105 (5)
Diacilglicerol, máx. % massa 0,20 15342 (5)
15344
15908 (5)
6584 (5) EN 14105 (5)
Triacilglicerol, máx. % massa 0,20 15342 (5)
15344
15908 (5)
6584 (5) EN 14105 (5)
Metanol e/ou Etanol, máx. % massa 0,20 15343 - EN 14110 (5)
Índice de Iodo g/100g Anotar - - EN 14111 (5)
Estabilidade à oxidação a 110ºC, mín. (11) h 6 (12) - - EN 14112 (5)
EN 15751 (5)
218
Nota:
(1) Límpido e isento de impurezas, com anotação da temperatura de ensaio. Em caso de disputa, o produto só poderá ser considerado como não especificado no Aspecto, caso os parâmetros teor de água e/ou contaminação total estejam não conformes.
(2) Para efeito de fiscalização, nas autuações por não conformidade no Aspecto, deverão ser realizadas as análises de teor de água e contaminação total. O produto será reprovado caso pelo menos um desses dois últimos parâmetros esteja fora de especificação.
(3) Para efeito de fiscalização, nas autuações por não conformidade, será admitida variação de +50 mg/kg no limite do teor de água no biodiesel para o produtor e de +150 mg/kg para o distribuidor.
(4) Quando a análise de ponto de fulgor resultar em valor superior a 130ºC, fica dispensada a análise de teor de metanol ou etanol.
(5) Os métodos referenciados demandam validação para os materiais graxos não previstos no método e rota de produção etílica.
(6) Estas características devem ser analisadas em conjunto com as demais constantes da Tabela de Especificação a cada trimestre civil. Os resultados devem ser enviados à ANP pelo Produtor de biodiesel, tomando uma amostra do biodiesel comercializado no trimestre e, em caso de neste período haver mudança de tipo de material graxo, o Produtor deverá analisar número de amostras correspondente ao número de tipos de materiais graxos utilizados.
(7) Em caso de disputa, deve ser utilizado o método EN 14107 como referência.
(8) O método ASTM D6890 poderá ser utilizado como método alternativo para determinação do número de cetano.
(9) Limites conforme Tabela II. Para os estados não contemplados na Tabela o ponto de entupimento a frio permanecerá 19ºC.
(10) Poderá ser determinado pelos métodos ABNT NBR 15908, ABNT NBR 15344, ASTM D6584 ou EN14105, sendo aplicável o limite de 0,25% em massa. Para biodiesel oriundo de material graxo predominantemente láurico, deve ser utilizado método ABNT NBR 15908 ou ABNT NBR 15344, sendo aplicável o limite de 0,30% em massa.
(11) O limite estabelecido deverá ser atendido em toda a cadeia de abastecimento do combustível.
(12) A estabilidade à oxidação a 110 ºC terá seu limite mínimo de 8 horas, a partir de 1º de novembro de 2014.
(13) Deverá ser utilizada somente a versão da norma de 1998 ou 2008 (EN 12662:1998 ou EN 12662:2008)
(Nota)
219
Tabela II - Ponto de Entupimento de Filtro a Frio
UNIDADES DA
FEDERAÇÃO
LIMITE MÁXIMO, ºC
Jan Fev Mar Abr Mai Jun Jul Ago Set Out Nov Dez
SP-MG-MS 14 14 14 12 8 8 8 8 8 12 14 14
GO/DF-MT-ES-RJ
14 14 14 14 10 10 10 10 10 14 14 14
PR–SC-RS 14 14 14 10 5 5 5 5 5 10 14 14
![Microsoft Power Point Programa De Pesquisa Em Rede Bio Vale]D1 Oils](https://img.document.onl/doc/110x75/5570b73dd8b42a4f6e8b4af5/microsoft-power-point-programa-de-pesquisa-em-rede-bio-valed1-oils.jpg)
