PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇAO EM GESTÃO AMBIENTAL-UFES

Avaliação de Avaliação de Bioindicadores de Bioindicadores de

Qualidade de águasQualidade de águas

Prof. Servio Tulio CassiniProf. Servio Tulio Cassini

Labsan - PPGEA-UFES - Labsan - PPGEA-UFES - Programa de Pós-Graduação em Engenharia Ambienta/UFES

Microbiologia de ÁguasMicrobiologia de Águas

Tipos e Usos das Águas Legislação

Metodologias Tubos Multiplos (NMP) Membrana Filtrante (MF) Substrato Cromogênico (SC)

Exemplo de Biomonitoramento de ambiente costeiro (Vitoria, E.S.)

Abastecimento Doméstico Irrigação Recreacional “Produto Comercial” Lançamentos “Reuso”

Principais Tipos e Usos Principais Tipos e Usos das Águasdas Águas

DOENÇAS DE VEICULAÇÃO DOENÇAS DE VEICULAÇÃO HÍDRICAHÍDRICA

Fonte: Efstratiou (2001)

Patógeno Infecção Água Aeromonas spp Infecções de feridas e

gastroenterites doce/marinha

Campylobacter spp Enteritis doce/marinha Candida albicans Dermatites doce/marinha Clostridium spp Botulismo, tétano, gangrena

gasosa, gastroenterites doce/marinha

Cryptosporidium spp Gastroenterites doce/marinha Escherichia coli OSH11 Gastroenterites doce/marinha Giardia spp Gastroenterites doce/marinha Pseudomonas spp Dermatite folicular, otite

externa doce/marinha

Salmonella spp Febre entérica, gastroenterite doce/marinha Shigella spp Disenteria bacilar doce/marinha Staphylococcus spp. Infeção de tecidos,

bacteremia doce/marinha

Vibrio spp Cólera, infecções de feridas estuarina/marinha Yersinia spp Gastroenterites doce/marinha

Pseudomonas

OS BIOINDICADORESOS BIOINDICADORES

Indicam a POSSIBILIDADE de ocorrência de

patógenos na amostra

Ocorrencia simultanea com patógenos com a

presença de fezes esgotos domesticos

Muito caro e trabalhoso ( talvez impossível)

avaliar diretamente TODOS os patógenos nas

amostras de águas.

Indicador Biológico IdealIndicador Biológico Ideal

Presente em todos os tipos de água Ocorrência e desaparecimento concomitante com

patogênicos Densidade populacional diretamente relacionada com o

grau de contaminação Maior sobrevida que a dos patogênicos

Ausência em água potável Fácil detecção e recuperação laboratorial Não prejudicial à pessoas e animais Manipulação segura

Bioindicadores UtilizadosBioindicadores Utilizados

• Coliformes totais

• Coliformes Termotolerantes (fecais)

• Coliforme específico: Escherichia coli

• Estreptococcus fecais (Enterococcus)

• Pseudomonas aeruginosa

• ovos de helmintos

““Coliformes”Coliformes”• Bacilos Gram-negativos não esporulados• Aeróbios ou Anaeróbios facultativos • Fermentam a lactose com produção de gás (48

h a 35oC ou 44,5 oC) • Desenvolvem colônias vermelhas com brilho

verde metálico (24 h a 35oC) em meio Endo contendo Lactose

• Apresentam atividade de B-galactosidase (enzima que desdobra a lactose ou substratos análogos tais como o ONPG desenvolvendo cor amarelada no meio)

Grupo ColiformeGrupo Coliforme

• Indicador referenciado na legislação

• Além da E. coliE. coli inclui os gêneros:– KlebsiellaKlebsiella– EnterobacterEnterobacter– CitrobacterCitrobacter

Coliformes “Ambientais”

Coliformes TermotolerantesColiformes Termotolerantes

• XI - coliformes termotolerantes: bactérias gram-negativas, em forma de bacilos, oxidase-negativas, caracterizadas pela atividade da enzima -galactosidase.

• Podem crescer em meios contendo agentes tenso-ativos e fermentar a lactose nas temperaturas de 44º - 45ºC, com produção de ácido, gás e aldeído.

• Além de estarem presentes em fezes humanas e de animais homeotérmicos, ocorrem em solos, plantas ou outras matrizes ambientais que não tenham sido contaminados por material fecal;

• ANTIGAMENTE E ERROONEAMENTE DENOMINADAS COLIFORMES FECAIS

O GRUPO COLIFORMEO GRUPO COLIFORME

Bactérias Entéricas: (Gram + ou -) Ex: Bactérias Entéricas: (Gram + ou -) Ex: StaphylococcusStaphylococcus aureus, aureus, Bacteroides fragilisBacteroides fragilis, e , e Enterococcus faecalisEnterococcus faecalis

EnterobacteriaceaeEnterobacteriaceae : (Gram -). Gêneros: : (Gram -). Gêneros: E.coli, Shigella, Salmonella, Enterobacter,E.coli, Shigella, Salmonella, Enterobacter,Klebsiella, Serratia, ProteusKlebsiella, Serratia, Proteus

Termotolerantes: Termotolerantes: E. coli, Klebsiella,E. coli, Klebsiella,

Enterobacter e Citrobacter.Enterobacter e Citrobacter.

E. coliE. coli

Grupo Coliforme: coliformes totais e fecais (termotolerantes)

E.coli

Resumo: Enterobactérias e Resumo: Enterobactérias e ColiformesColiformes

Enterobactérias

Coliformes Totais ou “Ambientais”

Coliformes fecais

Escherichia coli

EnterococcusEnterococcus

Bioindicador referenciado na legislação Bioindicador referenciado na legislação

CONAMA 274/2000CONAMA 274/2000

Características:Características:

• Cocos Gram (+) grupo Estreptococos Cocos Gram (+) grupo Estreptococos fecaisfecais

•Intestino de Animais homeotermicos ---Intestino de Animais homeotermicos ---> poluição fecal> poluição fecal

•> Tolerancia a ambientes marinhos> Tolerancia a ambientes marinhos

Legislação Qual. ÁguasLegislação Qual. Águas• CONAMA 20/86 CONAMA 20/86 357 17/03/2005 357 17/03/2005 Dispõe sobre a classificação dos corpos de água e diretrizes ambientais Dispõe sobre a classificação dos corpos de água e diretrizes ambientais

para o seu enquadramento, bem como estabelece as condições e padrões para o seu enquadramento, bem como estabelece as condições e padrões

de lançamento de efluentes, e dá outras providênciasde lançamento de efluentes, e dá outras providências.. • 274/2000274/2000 Dispõe sobre a qualidade das águas, em relação aos níveis estabelecidos para a Dispõe sobre a qualidade das águas, em relação aos níveis estabelecidos para a

balneabilidade, de forma a assegurar as condições necessárias à recreação de balneabilidade, de forma a assegurar as condições necessárias à recreação de contato primáriocontato primário;;

• MS 36/90 -------> 1469/2000MS 36/90 -------> 1469/2000 Especifica os requisitos de amostragem e analises de aguas de Especifica os requisitos de amostragem e analises de aguas de

abastecimento públicoabastecimento público

OMS 1993 OMS 1993 Recomendações Recomendações

Nova Legislação

PADRÕES DE BALNEABILIDADE PADRÕES DE BALNEABILIDADE RESOLUÇÃO CONAMA 274/2000RESOLUÇÃO CONAMA 274/2000

Legenda: as águas na categorias excelente, muito boa e satisfatória são assim consideradas

em 80% ou mais de um conjunto de amostras obtida em cinco semanas, no mesmo local.

* valor obtido na última amostragem

1 Padrão da Legislação CONAMA 20/86.

Parâmetro Excelente Muito Boa Satisfatória Imprópria

CT 1 1,25.103 2,5 .103 5,0.103 > 5,0.103*

CF 2,5.102 5,0.102 1,0.103 > 2,5.103*

E. coli 2,0.102 4,0.102 8,0.102 > 2,0.103*

Enterococos 25 50 1,0.102 > 4,0.102*

Categorias (NMP/100ml)

LEGISLAÇÃO DE BALNEABILIDADE NO LEGISLAÇÃO DE BALNEABILIDADE NO BRASIL E NO MUNDOBRASIL E NO MUNDO

Fonte: Adaptado de Efstratiou apud WHO/ US EPA (1999).Legenda: número de microrganismos/100ml.

País C. Fecais E. coli EnterococosUSA EPA (mar) 35USA EPA (água doce) - 126 33Canadá (água doce) - 200 -Canadá (mar) - - 35Venezuela 1000 200 -(mandatório) 5000 400 -França 200 500 -Brasil (mar) 2500 2000 400Brasil (água doce) 2500 2000 -

Cuidados na coletaCuidados na coleta

• Colher a amostra em recipiente esterilizado

• Até 4/5 da capacidade do frasco

• Água com cloro: 0,1 ml de tiossulfato a 10%

• Água bruta que contenha metais pesados: 0,3 ml EDTA a 15%

METODOLOGIAS MAIS UTILIZADAS PARA METODOLOGIAS MAIS UTILIZADAS PARA REALIZAÇÃO DOS TESTES MICROBIOLÓGICOSREALIZAÇÃO DOS TESTES MICROBIOLÓGICOS

Tubos Múltiplos

Membrana Filtrante

Substrato Cromogênico

Tubos Múltiplos (NMP)Tubos Múltiplos (NMP)(Procedimento p/ 5 ou 10 Tubos)

Inocular tubos com Caldo Lauril Triptose

24±2 hrs @35 ± 0.5º C

Gás/ácido=Positivo Sem gás / ácido=Negativo

Transfere p/ Caldo Verde BrilhanteIncubar 48 ±hrs/35 º C

Incubar mais 24 hr (48±3 hr total)

Gás/ácido

Sem gás=NegativoConfirmativoConfirmativo

Gás=Positivo Sem gás=Negativo

PresuntivoPresuntivo

Continua com ensaio completo

Fermentação Caldo Lauril Triptose

Formação de Gás

Tubos Múltiplos - NMP

Diagnóstico:

Coliforme positivo para

2 tubos

Confirmação: Fermentação com Caldo Verde Brilhante Lactose

- + +

Gás

NMP: teste confirmativo

Metodologia da Membrana Metodologia da Membrana Filtrante (MF)Filtrante (MF)

Suportes de filtração de polissulfona, vidro e aço de 47 mmmanifold de PVC e bomba vácuo

Como funciona a Como funciona a membrana filtrantemembrana filtrante

AtípicasAtípicas

Caldo m- Endo / Coliformes Totais

Típicas (Brilho metálico)Típicas (Brilho metálico)

Meio m-FC para detecção de Coliformes fecais

Metodologia com Substrato Metodologia com Substrato Cromogênico / FluorogênicoCromogênico / Fluorogênico

• Baseia-se na utilização de substratos análogos à lactose (glicopiranosídeos) processados somente por Escherichia coli.

• Exemplos: ONPG: Orto Nitrofenil galactopiranosídeo e MUG: Metil-Umbeliferone Galactopiranosídeo

• Ferramenta poderosa para indentificação de Escherichia coli (teste confirmativo)

• Baseia-se na utilização de substratos análogos à lactose (glicopiranosídeos) processados somente por Escherichia coli.

• Exemplos: ONPG: Orto Nitrofenil galactopiranosídeo e MUG: Metil-Umbeliferone Galactopiranosídeo

• Ferramenta poderosa para indentificação de Escherichia coli (teste confirmativo)

Detecção de Coliformes em Amostras De ÁguasDetecção de Coliformes em Amostras De ÁguasDetecção de Coliformes em Amostras De ÁguasDetecção de Coliformes em Amostras De Águas

Detecção de E. coliem Agar Nutriente com MUG

Teste P/ATeste P/A

Adição do meio com substrato à amostra

Incubação por 24 h. Resultados

Incolor: Negativo;

Amarelo Coliforme total +;

Azul Coliforme E. coli +

Teste QuantitativoTeste Quantitativo1

2

3

4 Mesmas placas amarelas submetidas a luz ultra-violeta

(UV)

Resultado Azul Ecoli

Se (-) e amarelo C. Total

Negativo amarelo e positivo azul

anomalo (impossível)

5

6

Tabelas de NMP

Resultados em numeros/100 ml

Resultados de Resultados de Biomonitoramento Biomonitoramento da Praia de Camburida Praia de Camburi

Vitoria - ESVitoria - ESProjeto Labsan-FACITEC 2000-2001Projeto Labsan-FACITEC 2000-2001

Bioindicadcadores Bioindicadcadores UtilizadosUtilizados

Coliformes Totais

Coliformes Fecais

E. Coli

Enterococus

Candida (Levedura) --> areia

MATERIAL & MÉTODOS:MATERIAL & MÉTODOS:

9, 9A

2, 2A e 2B

1, 1A e 1B

ÁREA DE ESTUDO: PRAIA DE CAMBURI/

VITÓRIA/ES.

Fonte: www.pmv.es.gov

METODOLOGIASMETODOLOGIAS

Análises bacteriológicas segundo APHA (1995):

CF meio A1,

CT e E.coli Colilert®,

Enterococos Enterolert®,

Candida meio BIGGY.

Análise de Candida com MF Cartelas do teste Colilert

1,E+001,E+011,E+021,E+03

1,E+041,E+051,E+06

1 1A 1B 2 2A 2B 9 9APontos de Coleta

NM

P E

. co

li/1

00m

l ou

100g

de

arei

a se

ca

Verão Outono Inverno Primavera

1,E+001,E+011,E+021,E+031,E+041,E+051,E+06

1 1A 1B 2 2A 2B 9 9APontos de Coleta

NM

P C

F /1

00 m

l ou

100g

de

arei

a se

ca

Verão Outono Inverno Primavera

1,E+00

1,E+01

1,E+02

1,E+03

1,E+04

1,E+05

1,E+06

1 1A 1B 2 2A 2B 9 9APontos de Coleta

NM

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T/1

00 m

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Verão Outono Inverno Primavera

1,E+001,E+011,E+021,E+03

1,E+041,E+051,E+06

1 1A 1B 2 2A 2B 9 9APontos de Coleta

NM

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tero

coco

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100g

de

arei

a se

ca

Verão Outono Inverno Primavera

Coliformes FecaisColiformes Totais

E.coli Enterococos

Médias Geométricas dos Bioindicadores

1,E+001,E+011,E+021,E+031,E+041,E+051,E+06

1 1A 1B 2 2A 2B 9 9APontos de Coleta

NM

P

Ent

eroc

ocos

/100

ml o

u 10

0g d

e ar

eia

seca

Sem. 1 Sem. 2 Sem. 3 Sem. 4 Sem. 5 Média

1,E+001,E+011,E+021,E+031,E+041,E+051,E+06

1 1A 1B 2 2A 2B 9 9APontos de Coleta

NM

P

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/100

ml o

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seca

Sem. 1 Sem. 2 Sem. 3 Sem. 4 Sem. 5 Média

1,E+001,E+011,E+021,E+031,E+041,E+051,E+06

1 1A 1B 2 2A 2B 9 9APontos de Coleta

NM

P

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/100

ml o

u 10

0g d

e ar

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seca

Sem. 1 Sem. 2 Sem. 3 Sem. 4 Sem. 5 Média

1,E+001,E+011,E+021,E+031,E+041,E+051,E+06

1 1A 1B 2 2A 2B 9 9APontos de Coleta

NM

P

Ent

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ml o

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0g d

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seca

Sem. 1 Sem. 2 Sem. 3 Sem. 4 Sem. 5 Média

Enterococos/Verão Enterococos/Outono

Enterococos/Inverno Enterococos/Primavera

Amostragens realizadas na praia de Camburi durante as estações do ano em cinco semanas consecutivas, classificação quanto as categorias de própria (na água: Excelente, Muito Boa e Satisfatória) e impropria para água e areia de acordo com a Resolução CONAMA e Limite Proposto em Portugal respectivamente.

Legenda: V(verão), O (outono), I (inverno), P (primavera); I (impróprio), P (próprio), E (excelente), S (satisfatório), MB (muito boa)

Pontos V O I P V O I P V O I P V O I P

1 I I I S I I S S I I S E I I I I

1A P P P P P P P P SP SP SP SP SP SP SP SP

1B P P P P P P P P SP SP SP SP SP SP SP SP

2 I I I MB I S S S I I I E I I I I

2A P P P P P P P P SP SP SP SP SP SP SP SP

2B P P P P P P P P SP SP SP SP SP SP SP SP

9 I I I I I I I I I I I I I I I I

9A P P P P P P P P SP SP SP SP SP SP SP SP

E.coli Coliformes Totais EnterococosColiformes Fecais

COMPARAÇÃO ENTRE INDICADORES

Amostragens na praia de Camburi durante as estações do ano, em cinco semanas de monitoramento para a levedura do gênero Candida de acordo com o Limite Proposto em Portugal.

Legenda: O (outono), I (inverno), P (primavera), P (próprio). Os números representam a frequencia em que o ponto amostrado ficou impróprio em cada estação do ano.

Ponto O I P1A 1 1 31B 1 P 22A P P P2B 1 P 19A 5 5 4

Candida

Agradecimentos:Agradecimentos:

• UFES (CT-DHS)• Laboratório de Saneamento CT-DHS• Microbiologistas “tipo coliformes”• e... Sua paciência

• M. Obrigado