PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU MESTRADO … · A Deus, que me permitiu a inteligência, por me dar força e coragem nos momentos de desânimo. ... numa demonstração

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU MESTRADO EM

BIOCIÊNCIA ANIMAL

CARLA APARECIDA SILVA LIMA

IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS ISOLADAS DE BEZERROS COM ONFALITES, DETERMINAÇÃO DO PERFIL DE RESISTÊNCIA À ANTIMICROBIANOS E

AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA DO ÓLEO DE COPAÍBA NO TRATAMENTO DE ONFALITES

Cuiabá 2018




Dissertação apresentada à Universidade Cuiabá- UNIC, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Biociência Animal. Orientador: Prof. Dr. Marcelo Diniz dos Santos

Cuiabá 2018

FICHA CATALOGRÁFICA Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)

Nº Cutter Lima, Carla Aparecida Silva.

Identificação de bactérias isoladas de bezerros com onfalites, determinação do perfil de resistência à antimicrobianos e avaliação da eficácia do óleo de copaíba no tratamento de onfalites/ Carla Aparecida Silva Lima. – Cuiabá, 2018.

48f. Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-graduação em Biociência Animal,

Universidade de Cuiabá, ano de publicação. ―Orientador: Prof. Dr. Marcelo Diniz dos Santos.‖

1. Bezerros neonatos. 2. Onfalites. 3. Óleo de Copaíba.

CDD ou CDU




Dissertação apresentada à Universidade de Cuiabá - UNIC, Mestrado em Biociência Animal, área e concentração em Saúde Animal como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre conferida pela Banca Examinadora formada pelos professores:

BANCA EXAMINADORA

___________________________________ Prof. Dr. Marcelo Diniz dos Santos

UNIC

__________________________________ Dr. Ricardo César Tavares Carvalho

UNIC

__________________________________ Dra. Ivana Maria Póvoa Violante

UNIC

Conceito Final: ______________________

Cuiabá, 30 de Maio de 2018.

Dedico primeiramente a Deus, pois sem Ele nada seria e à minha família que tanto me apoiou na elaboração deste trabalho.

AGRADECIMENTOS

A Deus, que me permitiu a inteligência, por me dar força e coragem nos momentos

de desânimo.

Aos meus pais Dioclecio Alves de Lima e Marines Silva Lima pelo incentivo dado e

aos demais membros da minha família e amigos, que estiveram ao meu lado

durante todo este tempo.

Ao meu esposo Antônio Pereira de Siqueira Junior pelo incentivo e atenção dada

numa demonstração de amor e carinho, por entender minha ausência e cuidar do

nosso filho Matheus nos momentos de estudos.

Ao meu orientador professor Dr. Marcelo Diniz dos Santos por ter aceitado este

desafio e pela simpatia e presteza no auxílio das atividades e discussões sobre o

andamento e normatização desta dissertação.

A professora Drª Ivana Maria Póvoa Violante pela atenção, incentivo e troca de

informações em todos os momentos solicitados.

Ao Médico Veterinário professor Dr Fabio Bernardo Schein que nunca poupou ajuda

e auxílio, quando eu necessitei.

As alunas de iniciação científica Caroline e Bruna e a todos os técnicos dos

laboratórios da Universidade de Cuiabá – UNIC: Eufrazia, Carolline e Thaise que me

auxiliaram nos experimentos.

As Médicas Veterinárias Prof Msc Lívia Saab Muraro, Jessica Velasco e Rubi e o

Médico Veterinário Vitor Hugo pelo apoio dado à pesquisa.

Ao farmacêutico e professor Msc Guilherme Botelho por me auxiliar nos

experimentos.

Ao Laboratório Exame - Diagnostico e Análises Clínicas em especial a farmacêutica

Laura Moraes pelo apoio nas análises.

Aos alunos de graduação em Medicina Veterinária da UNIC Reginaldo e Adriano

pelo apoio dado à pesquisa.

À Fazenda Bom Futuro – Agrícola por terem cedido os animais para o

desenvolvimento do experimento.

Agradeço à Universidade de Cuiabá – UNIC pelo financiamento do Projeto.

―O mestre não é aquele que sempre ensina, mas quem de repente aprende.‖ Guimarães Rosa

RESUMO

As onfalopatias são processos inflamatórios e infecciosos que acometem o cordão umbilical dos animais neonatos, resultante da falta de higiene, tratamento do umbigo ou pelo comprometimento imunitário do neonato, causando diversos problemas de saúde e até morte do animal. Atualmente vem crescendo o interesse da comunidade científica no uso de plantas medicinais, buscando assim a descoberta de novos fármacos que possam produzir efeitos semelhantes ou até mais efetivos se comparados aos fármacos convencionais. A Copaifera spp. (copaíba) é uma planta que apresenta ação anti-inflamatória, anti-infecciosa e cicatrizante. Sendo assim, os objetivos deste estudo foram identificar as bactérias presentes em bezerros com onfalites, avaliar a atividade antimicrobiana do óleo de copaíba in vivo e in vitro e o perfil de resistência a antimicrobianos convencionais frente a estes microrganismos (in vitro) e a avaliação da eficácia do óleo de copaíba como anti-inflamatório e cicatrizante (in vivo). Foram utilizados 20 bezerros neonatos diagnosticados com onfalites distribuídos aleatoriamente em 4 grupos: grupo controle; grupo tratado com antibiótico, grupo tratado com pomada base contendo óleo de copaíba 10% e grupo tratado com o óleo de copaíba puro (100%). Todos os bezerros com onfalites foram acompanhados por meio de exame clínico, exames de sangue para determinação de proteínas de fase aguda e avaliação de possíveis lesões hepáticas nestes animais, coleta de secreção umbilical para isolamento, identificação e avaliação dos microrganismos frente ao óleo de copaíba, através da concentração Inibitória Mínima (CIM) e sua sensibilidade frente às seguintes drogas: Ampicilina, Ceftiofur, Enrofloxacina, Florfenicol, Gentamicina, Sulfonamidas e Tetraciclina pelo método de difusão com discos. A análise das variáveis estudadas foi interpretada por meio de análise de variância e as médias comparadas pelo Teste de Tukey. Foram isoladas 12 espécies diferentes de bactérias: Streptococcus uberis; Streptococcus bovis; Escherichia coli; Staphylococcus caseolyticus; Proteus mirabilis; Streptococcus equinus; Enterobacter aerogenes; Erwinia rhapontici; Nocardia asteroidis; Erwinia tracheiphilia; Tatumella ptyseos e Yersinia aldovae. Concluiu-se que o óleo de copaíba possui ação cicatrizante e anti-inflamatória, sendo possível observar redução do edema e lesão (in vivo), e atividade antimicrobiana (in vitro) frente aos microrganismos Yersinia aldovae e Streptococcus equinus, Tatumella ptyseos, Erwinia rhapontici, Proteus mirabilis e Staphylococcus caseolyticus isolados de bezerros neonatos com onfalites. A gentamicina foi o antibiótico testado mais eficiente frente aos agentes isolados de bezerros neonatos com onfalites.

Palavras-chave. Antibiograma. Antimicrobiano. Neonatos. Onfalopatias. Plantas Medicinais. Resistencia Bacteriana.

ABSTRACT

The omphalopathies are inflammatory and infectious processes that affect the umbilical cord of the newborns, resulting from the lack of environmental hygiene, treatment of the navel or the immune compromise of the neonate, causing diverse health problems and even death of the animal. Nowadays, the interest of the scientific community in the use of medicinal plants has increased, thus seeking the discovery of new drugs that can produce similar or even more effective effects when compared to conventional drugs. Copaifera spp. (copaíba) is a plant with anti-inflammatory, anti-infectious and healing action. Therefore, the main objective of this study was to evaluate the activity of copaiba oil in the treatment of onfalites in neonatal calves (in vivo) and its antimicrobial action in vitro. Twenty newborn calves diagnosed with onfalitis were randomly distributed in 4 groups: untreated group; group treated conventionally with antibiotic, group treated with ointment containing 10% copaiba oil and group treated with pure copaiba oil (100%). All calves with onfalites were followed up by clinical examination, blood samples were collected for the determination of acute phase proteins and evaluation of possible hepatic lesions in these animals and collection of umbilical secretion for the identification and evaluation of the microorganisms against copaiba oil, through the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and its sensitivity to the following drugs: Ampicillin, Ceftiofur, Enrofloxacin, Florfenicol, Gentamicin, Sulfonamides and Tetracycline by the disc diffusion method. The analysis of the studied variables was interpreted through analysis of variance and the means compared by the Tukey Test at 5% of probability. Twelve different species of bacteria were isolated: Streptococcus uberis; Streptococcus bovis; Escherichia coli; Staphylococcus caseolyticus; Proteus mirabilis; Streptococcus equinus; Enterobacter aerogenes; Erwinia rhapontici; Nocardia asteroidis; Erwinia tracheiphilia; Tatumella ptyseos and Yersinia aldovae. It was concluded that copaiba oil has healing and anti-inflammatory action, and it is possible to observe edema and injury reduction (in vivo), and antimicrobial activity (in vitro) against Yersinia aldovae, Streptococcus equinus, Tatumella ptyseos, Erwinia rhapontici, Proteus mirabilis and Staphylococcus caseolyticus isolated from neonatal calves with onfalites. Gentamicin was the most efficient antibiotic tested against agents isolated from neonatal calves with omphalitis. Key words. Antibiogram. Antimicrobial. Bacterial resistance. Medicinal plants. Neonates. Omphalopathies.

LISTA DE TABELAS

ARTIGO 1 – Identificação de bactérias isoladas em onfalites de

bezerros neonatos e perfil de susceptibilidade a antimicrobianos

Tabela 1 - Microrganismos identificados na secreção umbilical

coletada de bezerros com onfalite ..........................................................

34

ARTIGO 2 – Avaliação do óleo de Copaifera spp (copaíba) no tratamento de onfalites em bezerros neonatos

Tabela 1 – Concentração Inibitória Mínima - CIM (μg/mL) do óleo de

Copaífera spp. e enrofloxacino frente a bactérias isolados dos

bezerros com onfalite..............................................................................

49

Tabela 2 - Valores médios e desvios-padrão (x ± s) de parâmetros

hematológicos ........................................................................................

51

Tabela 3 - Valores médios e desvios-padrão (x ± s) das

concentrações de fibrinogênio plasmático, proteínas totais plasmáticas

e globulinas dos bezerros........................................................................

52

Tabela 4 - Média e desvio padrão (x ± s) das enzimas hepáticas dos

bezerros ..................................................................................................

53

LISTA DE FIGURAS

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Figura 1: Imagem ilustrativa da estrutura anatômica do umbigo

bovino...................................................................................................

17

Figura 2: Árvore de Copaifera spp...................................................... 23

Figura 3: Extração do óleo de Copaíba.............................................. 24

ARTIGO 1 – Identificação de bactérias isoladas em onfalites de bezerros

neonatos e perfil de susceptibilidade a antimicrobianos

Figura 1 – Perfil de resistência dos microrganismos isolados de

bezerros neonatos com onfalite .........................................................

36

ARTIGO 2 – Avaliação do óleo de Copaifera spp (copaíba) no

tratamento de onfalites em bezerros neonatos

Figura 1: Identificação dos animais com brincos................................ 43

Figura 2: Pomada contendo óleo de copaíba 10%............................. 44

Figura 3: Esquema da placa utilizada na diluição do óleo de

Copaifera spp.......................................................................................

46

Figura 4: Animal (6) que recebeu tratamento com pomada contendo

óleo de copaíba 10%...........................................................................

54

Figura 5: Animal (12) que recebeu tratamento com óleo puro........... 55

Figura 6: Animal (11) que recebeu tratamento convencional com

Enrofloxacino.......................................................................................

55

LISTA DE ABREVIATURAS

ALP Fosfatase alcalina

AST Aspartato aminotransferase

ATCC American Type Culture Collection

BHI Brain Heart Infusion

CLSI/NCCLS Clinical and Laboratory Standards Institute

CIM Concentração Inibitória Mínima

DMSO Dimetilsulfóxido

EDTA Ácido etilenodiaminotetracético

FA Fosfatase Alcalina

g Grama

GGT Gamaglutamiltransferase

GC Grupo controle

IM Intramuscular

Kg Quilograma

Mg Miligrama

mL Mililitro

SAEG Sistema de Análise Estatística e Genética

UFC Unidade de formação de colônias

μg Micrograma

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO.................................................................................... 15

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .............................................................. 17

2.1 INFECÇÕES UMBILICAIS EM NEONATOS ..................................... 17

2.2 IMUNIDADE PASSIVA COLOSTRAL EM BOVINOS ........................ 19

2.3 AVALIAÇÃO LABORATORIAL .......................................................... 20

2.4 PREVENÇÃO E TRATAMENTO DE ONFALITES ............................ 21

2.5 USO DE PLANTAS MEDICINAIS....................................................... 22

2.6 COPAIFERA SPP. ............................................................................. 22

REFERÊNCIAS .................................................................................. 25

3. OBJETIVOS ....................................................................................... 28

3.1 OBJETIVO GERAL.............................................................................. 28

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS................................................................ 28

4 ARTIGO 1

ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DAS BACTÉRIAS

PRESENTES EM ONFALITES DE BEZERROS NEONATOS E

SUSCEPTIBILIDADE A ANTIMICROBIANOS...................................

29

RESUMO............................................................................................. 29

ABSTRACT ........................................................................................ 30

INTRODUÇÃO ................................................................................... 31

MATERIAL E MÉTODOS ................................................................... 32

RESULTADOS E DISCUSSÃO......................................................... 33

CONCLUSÕES .................................................................................. 36

REFERÊNCIAS .................................................................................. 37

5 ARTIGO 2

AVALIAÇÃO DO ÓLEO DE Copaifera spp (COPAÍBA) NO

TRATAMENTO DE ONFALITES EM BEZERROS NEONATOS........

39

RESUMO ............................................................................................ 39

ABSTRACT ........................................................................................ 40

INTRODUÇÃO ................................................................................... 41

MATERIAL E MÉTODOS ................................................................... 43

RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................... 48

CONCLUSÕES.................................................................................... 56

REFERÊNCIAS .................................................................................. 57

6 CONCLUSÕES GERAIS .................................................................... 60

15

1 INTRODUÇÃO

O estado de Mato Grosso tem como base econômica o seu potencial

agropecuário e atualmente possui o maior rebanho bovino do país com 30.230

milhões de cabeças (INDEA, 2017).

A mortalidade de bezerros representa importante causa de prejuízos

econômicos, principalmente na produção leiteira. O maior índice de mortalidade de

bovinos ocorre na fase de cria, devido a maior vulnerabilidade dos bezerros,

principalmente no primeiro mês de vida (FARIA et al., 2013; RADOSTITS et al.,

2002; SEINO, 2014).

As afecções umbilicais são consideradas as principais doenças do período

neonatal em bezerros leiteiros e de corte, com incidência de 28 a 42%, gerando

grandes perdas econômicas, pois diminuem o ganho de peso, geram custos com

medicamentos e assistência Médica Veterinária, retardam o crescimento e

promovem depreciação da carcaça dos bezerros, podendo levar à morte do animal

(FARIA et al., 2013; REIS et al., 2009; SEINO, 2014). Estudos apontam que estas

onfalopatias são responsáveis por aproximadamente 10% de mortalidade em

bezerros nos primeiros meses de vida, resultantes da falta de higiene, de cuidados

gerais e de tratamento do umbigo no momento do nascimento e na primeira semana

de vida (SEINO, 2014).

Atualmente há grande interesse da comunidade científica no uso de plantas

medicinais, resultando em diversos estudos relacionados aos seus compostos ativos

(G DELH et al., 2013). O uso de plantas na terapia é conduzido pelo potencial que

as mesmas possuem em produzir efeitos semelhantes ou até mais efetivos quando

comparados aos fármacos convencionais, além de serem bem aceitas,

especialmente em países em desenvolvimento (NETO et al., 2014; SRIVASTAVA et

al., 2005).

O Brasil é detentor da maior biodiversidade do mundo e possui uma fonte

riquíssima de matéria-prima para a produção de medicamentos, contudo, apenas

1% do mercado fitoterápico no país é voltado para o setor veterinário, observando

carência de pesquisas nesta área. Há interesse da indústria veterinária em inovar o

setor, oferecendo produtos que sejam mais eficazes e que apresentem menores

efeitos colaterais, como forma de proporcionar bem-estar e qualidade de vida para

16

os animais e que estejam associados a um baixo custo de produção (ARAÚJO et al.,

2013).

Copaifera spp., popularmente conhecido como ''copaíba'' é uma grande

árvore predominante nas regiões Centro-Oeste e Norte, principalmente nos estados

de Mato Grosso, Amazonas e Pará (PIERI et al., 2009). Seu óleo-resina, obtido

através de pequenos cortes na casca do caule da planta, é um remédio popular

utilizado na sua forma natural como um agente anti-inflamatório, anti-infeccioso e

cicatrizante para o tratamento de várias afecções, tais como dores de garganta,

infecções urinárias, pulmonares, úlceras e feridas, podendo ser administrado por via

oral ou por aplicação tópica (BASILE et al., 1988; PAIVA et al., 2004; PIERI et al.,

2009). Segundo Mendonça e Onofre (2009) apud Ferreira (1999); Leite (2001) o óleo

de copaíba vem sendo utilizado há séculos por povos indígenas na cura do umbigo

dos recém-nascidos para evitar as afecções tetânicas e auxiliar no processo de

cicatrização.

Apesar da constante busca na Medicina Veterinária por terapias alternativas

e efetivas, até o momento não foram encontradas publicações disponíveis na

literatura sobre o uso do óleo de copaíba no tratamento de onfalites em bezerros

neonatos. Assim, o objetivo deste estudo foi isolar e identificar as bactérias

presentes em bezerros com onfalites, avaliar a atividade antimicrobiana do óleo de

copaíba in vivo e in vitro e o perfil de resistência a antimicrobianos convencionais

frente a estes microrganismos (in vitro) e a eficácia do óleo de copaíba como anti-

inflamatório e cicatrizante (in vivo).

17

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 INFECÇÕES UMBILICAIS EM NEONATOS

Os animais neonatos apresentam deficiências imunológicas, uma vez que

quase não possuem imunidade humoral e a imunidade celular não está

suficientemente determinada (LeBLANC et al., 1992). Assim, deve-se ter muito

cuidado com os recém-nascidos, pois eles são susceptíveis a várias doenças e

muitas vezes a demora na identificação das mesmas, pode ocasionar sérios riscos à

saúde do animal (LeBLANC et al., 1992; RADOSTITS et al., 2002).

O cordão umbilical (Figura 1) durante a vida fetal é a via de comunicação

entre o feto e a mãe levando sangue materno rico em nutrientes e oxigênio, e

eliminando os catabólitos do feto. Após o nascimento perde totalmente sua função, e

em poucos dias as veias e as artérias utilizadas na comunicação materno-fetal

fecham-se e os músculos dessa região unem-se, constituindo uma massa muscular

(FARIA et al., 2013). Até a cicatrização total, o umbigo é uma porta de entrada para

vários agentes causadores de diversas enfermidades, e caso o umbigo não seja

adequadamente curado, pode infeccionar e provocar onfalite, onfaloflebite,

onfaloarterite ou infecção do úraco impedindo a cicatrização e facilitando a

ascendência de microrganismos (FARIA et al., 2013; FENGER, 2000; RADOSTITS

et al., 2002).

Figura 1: Imagem ilustrativa da estrutura anatômica do umbigo bovino

Fonte: http://www.rehagro.com.br/uploads/imagens/estrutura_anatomica_do_umbigo.jpg

http://www.rehagro.com.br/uploads/imagens/estrutura_anatomica_do_umbigo.jpg

18

A onfalite, onfaloflebite, onfaloarterite ou infecção do úraco acarretam

inflamação e muitas vezes acompanhadas de infecção e são resultantes da falta de

higiene, de cuidados gerais e de tratamento do umbigo no momento do nascimento

e nos dias seguintes (RADOSTITS et al., 2002).

A onfalite é comum em bezerros com dois a cinco dias de idade, onde ocorre

inflamação das partes externas do umbigo que aumenta de volume, torna-se

doloroso à palpação e pode estar obstruído ou drenar material purulento através de

fístula. O bezerro pode apresentar toxemia aguda com sinais clínicos característicos,

como: depressão, baixa ingestão de alimento e quadro febril (RADOSTITS et al.,

2002).

Já onfaloflebite é o processo inflamatório que acomete o cordão umbilical dos

animais neonatos, podendo surgir grandes abscessos ao longo do trajeto da veia

umbilical que se disseminam para o fígado (abscessos hepáticos). O umbigo

costuma estar dilatado, contém secreção purulenta e em alguns casos não

apresenta aumento de volume externo (apenas observado com palpação profunda

do abdome). Os principais sinais clínicos são: bezerros inativos, inapetentes, não se

desenvolvem e pouco febril. É necessário laparotomia exploratória e extirpação do

abscesso (FENGER, 2000; RADOSTITS et al., 2002).

A onfaloarterite é a inflamação das artérias umbilicais, causa abscessos ao

longo do trajeto das artérias umbilicais, desde o umbigo até as artérias ilíacas

externas. Os sinais clínicos são semelhantes aos da onfaloflebite, porém há

ausência de resposta à terapia com antibióticos e geralmente o animal necessita de

intervenção cirúrgica (RADOSTITS et al., 2002).

Na infecção do úraco, uraquite, o umbigo do animal apresenta-se

intumescido e drenando secreção purulenta, com possibilidade de disseminação

para bexiga, ocasionando cistite (RADOSTITS et al., 2002).

Os patógenos mais comuns nas onfalopatias são a Escherichia coli,

Streptococcus zooepidemicus, Clostridium spp., Proteus spp., Staphylococcus spp e

Actinomyces pyogenes (FARIA et al., 2013; RADOSTITS et al., 2002).

Todas essas infecções geralmente progridem para áreas além do umbigo e

como consequências as onfalopatias geram complicações secundárias com

prejuízos econômicos, alto custo com medicamentos e assistência veterinária, além

do retardo no crescimento, depreciação da carcaça e até mesmo óbitos dos animais,

19

dependendo da patogenicidade do microrganismo ou do estado imunitário do

neonato (ASSIS-BRASIL et al., 2013; FARIA et al., 2013; RADOSTITS et al., 2002).

2.2 IMUNIDADE PASSIVA COLOSTRAL EM BOVINOS

Diferentemente de outros mamíferos, placenta nos bovinos interpõe uma

barreira entre o sistema imune da mãe e feto, impossibilitando a passagem das

imunoglobulinas (Ig) durante o período gestacional, desta forma, a imunidade

passiva é conferida ao neonato nas primeiras horas de vida pela ingestão do

colostro (GARCIA et al., 2012; GOMES et al., 2017; RADOSTITS et al., 2002;

ROCHA et al. 2015).

A ingestão do colostro nas primeiras 8 horas de vida dos neonatos ruminantes

são fundamentais para a sobrevivência e a saúde dos animais, pois assegura a

imunidade e reduzem morbidade e mortalidade da maioria das doenças infecciosas,

incluindo septicemia, diarreia, doença respiratória e onfalite (BESSER; GAY, 1994;

GOMES et al., 2017; RADOSTITS et al., 2002; RENGIFO et al., 2010), além de

ocasionar alterações importantes no perfil bioquímico de bezerros jovens que deve

ser considerada na avaliação hematológica dos animais (ROCHA et al., 2015),

podendo interferir nos resultados hematológicos especialmente no volume globular

(VG), leucometria global (LG), proteínas plasmáticas totais (PPT), que geralmente

são influenciados pela absorção do colostro, onde as falhas de manejo podem

resultar em hemoconcentração (valores elevados de PPT e LG), baixos valores de

VG, fibrinogênio (FB), concentração de hemoglobina (Hb) e hematimetria (He)

(RENGIFO et al., 2010).

Aquisição de anticorpos maternos por bezerros recém-nascidos pode ser

afetada pelo tempo entre nascimento e primeira mamada, qualidade da mamada e

pela concentração das imunoglobulinas absorvidas e a influência do colostro se

estende até a fase adulta do animal (ROCHA, 2015). A absorção de anticorpos é

maior nas primeiras horas de vida, começando a reduzir após 36 horas do

nascimento onde os neonatos começam a responder ativamente aos desafios

ambientais e produzirem seus anticorpos (PAULETTI et al., 2003).

20

2.3 AVALIAÇÃO LABORATORIAL

A avaliação clínica dos neonatos é fundamental para diagnósticos,

prognósticos e tratamento de doenças, porém, muitas vezes, além do exame físico,

conhecimento da fisiologia dos órgãos ou sistemas acometidos, patologia das

enfermidades, é necessário exame auxiliar para confirmar ou elucidar diagnósticos

(BENESI et al., 2012).

Avaliação laboratorial dos teores de proteínas do plasma e soro sanguíneo é

parte integrante dos exames hematológicos e bioquímicos em animais e costuma

fornecer informações importantes que podem ser úteis para limitar a lista de

doenças que devem ser investigadas e em alguns casos, indicar doenças

específicas como onfalite (THRALL et al., 2006).

Albumina e globulinas são os dois principais tipos de proteínas do plasma,

onde a albumina é sintetizada no fígado e metabolizada nos tecidos é uma

importante proteína transportadora de ácidos graxos livres, ácidos biliares,

bilirrubina, cálcio, hormônios e medicamentos. Já as globulinas são classificadas em

alfa, beta e gamaglobulina e abrangem diversos tipos de moléculas de anticorpos,

outras proteínas que atuam no sistema imune, fatores de coagulação, enzimas e

proteínas transportadoras de lipídeos, vitaminas, hormônios, hemoglobina

extracelular e íons metálicos (THRALL et al., 2006).

Fibrinogênio (globulina) é uma importante proteína plasmática que participa

do processo de coagulação sanguínea e na resposta inflamatória. É encontrado em

exsudatos que se polimeriza nos tecidos extravasculares, formando fibrina que

juntamente com seus produtos, desempenham outras ações como quimiotaxia e a

formação de coágulos de sangue. A fibrina também forma uma estrutura para

migração de fibroblastos e células endoteliais durante os primeiros estágios da

cicatrização de feridas (THRALL et al., 2006; ZACHARY; McGAVIN, 2013).

Fosfatase alcalina (ALP) é uma enzima de indução sintetizada no fígado, nos

osteoblastos, nos epitélios intestinal e renal e na placenta. Em casos de doença

hepatobiliar gera aumento da atividade sérica de ALP (THRALL et al., 2006).

Gamaglutamiltransferase (GGT) é sintetizada por quase todos os tecidos

corporais, com maior concentração no pâncreas e rins, contudo a maior parte da

GGT sérica é oriunda do fígado. É considerada uma enzima de indução e em casos

21

de lesões hepáticas gera aumento imediato da atividade sérica de GGT (THRALL et

al., 2006).

Nas onfalopatias podem ocorrer danos hepáticos sendo observados através

do aumento da dosagem das enzimas ALP e GGT, pois em bezerros recém-

nascidos, este órgão está ligado diretamente ao umbigo do animal (SEINO, 2014;

THRALL et al., 2006).

2.4 PREVENÇÃO E TRATAMENTO DE ONFALITES

Um bom manejo sanitário, higiene durante o nascimento, ingestão do colostro

são grandes aliados para evitar as infecções e miíases umbilicais (REIS, 2017).

Com o objetivo de prevenir as onfalopatias, deve-se realizar a desinfecção do

umbigo dos recém-nascidos com agentes dessecantes e desinfetantes como

solução de iodo a 10% ou álcool iodado, desidratando o coto umbilical e fechando-o

para entrada de microrganismos (FARIA, 2014; GOMES et al., 2017; RADOSTITS et

al., 2002; REIS, 2017). A aplicação de clorexidina também é eficiente na prevenção,

reduzindo o número de microrganismos (RADOSTITS et al., 2002).

Já o tratamento das infecções umbilicais é realizado com antissépticos e

antimicrobianos, tais como Ampicilina, Ceftiofur, Enrofloxacina, Florfenicol,

Gentamicina, Sulfonamidas e Tetraciclina, em alguns casos pode ser necessário

realizar cirurgia, para extirpação completa das estruturas acometidas (FARIA, 2014;

GOMES et al., 2017; RADOSTITS et al., 2002). O cuidado e tratamento precoce com

antimicrobianos evitam o desenvolvimento de abscessos, necessidade de cirurgia e

aumenta às chances de cura (REIS, 2017).

Dentre os antibióticos citados, o enrofloxacino atualmente tem sido bastante

usado na prática veterinária é um quimioterápico antibacteriano, derivado do ácido

quinoloncarboxílico pertencente à classe das fluorquinolonas, sua ação é

caracterizada pela inibição da DNA girase, enzima fundamental na replicação do

DNA bacteriano, provocando transtornos funcionais e resultando na destruição da

bactéria, possui espectro de ação à agentes Gram positivos e Gram negativos,

sendo muito recomendada para o tratamento de infecções causadas por diversos

patógenos em diferentes espécies animais, bem como no homem (FORESTI, 2015;

LANGONI et al., 2000, REIS, 2017).

22

2.5 USO DE PLANTAS MEDICINAIS

A utilização de plantas medicinais é uma prática antiga, onde o homem

buscava na natureza recursos para melhorar sua condição de vida. Esta prática é

empregada até hoje, tanto na medicina popular quanto no desenvolvimento de

fármacos, produzidos pela indústria farmacêutica para o tratamento de diversas

doenças (GARCIA; YAMAGUCHI, 2012; MONTES, 2009). De acordo com a

Organização Mundial de Saúde (OMS), cerca de 80% da população mundial,

principalmente nos países em desenvolvimento, utilizam as plantas como principal

recurso terapêutico devido à falta de acesso aos medicamentos sintéticos

(MASSON, 2011), muitas vezes este é o único recurso terapêutico existente para

diversas comunidades e grupos étnicos, principalmente em regiões mais pobres

(MONTES, 2009).

Observa-se no interesse pelo uso de plantas medicinais para o tratamento de

animais de produção, esporte ou de companhia (ARAÚJO, 2013), onde os

consumidores têm procurado produtos obtidos de forma ecologicamente correta,

diminuindo assim o impacto ambiental, minimizando a produção de resíduos nos

alimentos e intoxicações de animais e pessoas, além de reduzir os custos e

resistência a antibióticos (OLIVEIRA, 2009).

O Brasil, conhecido mundialmente por possuir a maior reserva florestal

diversificada do planeta, é considerado um viveiro de plantas medicinais, utilizadas

no tratamento e cura de diversos sintomas e doenças (MASSON, 2011). Entre as

inúmeras espécies vegetais de interesse medicinal, estão as plantas: Ilex

paraguariensis (mate), Myroxylon balsamum (bálsamo de Tolu), Paullinia cupana

(guaraná), Psidium guajava (guava), Spilanthes acmella (jambu), Tabebuia sp.

(lapacho), Uncaria tomentosa (unha-de-gato) e Copaifera sp.(copaíba) (BRASIL,

2012; MASSON, 2011).

2.6 COPAIFERA spp.

As copaibeiras (Figura 2) são árvores de grande porte da família das

Leguminosae-Caesalpinoideae, do gênero Copaífera spp. (Copaíba), de crescimento

lento, alcançando de 25 a 40 metros de altura, podendo viver até 400 anos, com

mais de 72 espécies é comum nas regiões norte, Sudeste e Centro-Oeste do Brasil,

com mais mais de 20 espécies: Copaifera officinalis, Copaifera reticulata Ducke,

23

Copaifera multijuga Hayne; Copaifera confertiflora, Copaifera langsdorffii; Copaifera

cariacea e Copaifera cearensis Huber ex Ducke são as mais encontradas no país

(GARCIA e YAMAGUCHI, 2012; GIESBRECHT, 2011; MASSON, 2011; NOGUEIRA,

2012; PIERI et al., 2009; SILVA, 2012). São conhecidas popularmente como

copaíba, copaibeira, pau-de-óleo, copaúva, copai, copaibarana e óleo de copaíba ou

bálsamo (PIERI et al., 2009).

Figura 2: Árvore de Copaifera spp

Fonte: http://www.oleobeneficios.com.br

O óleo-resina de copaíba é um exsudato vegetal constituído por ácidos

resinosos e rico em diterpenos e sesquiterpenos, obtido por meio de pequenos

cortes na casca do caule da planta (Figura 3) (PIERI et al., 2009). Considerado um

remédio popular utilizado na sua forma natural como agente anti-inflamatório, anti-

infeccioso e cicatrizante para o tratamento de várias afecções, tais como dores de

garganta, infecções urinárias e pulmonares, úlceras e feridas, podendo ser

http://www.oleobeneficios.com.br/

24

administrado por via oral ou por aplicação tópica (BASILE et al., 1988; PAIVA et al.,

2004; VEIGA et al., 2007).

Entre as propriedades medicinais do óleo de copaíba destacam-se a atividade

anti-inflamatória, antimicrobiana e cicatrizante; atividade citoprotetora sobre a

mucosa gástrica, atividade antitumoral, atividade antinociceptiva periférica e central,

ação diurética, laxante, antitetânica e antisséptica do aparelho urinário (GARCIA;

YAMAGUCHI, 2012).

Figura 3: Extração do óleo de Copaíba

Fonte: https://www.google.com.br/url

O costume sertanejo de aplicá-lo no corte do umbigo dos recém-nascidos

para evitar as afecções tetânicas, veio dos índios que além de usar para esse fim,

onde aplicavam no umbigo de recém-nascidos para curar o ―mal-de-umbigo‖,

também a utilizavam na cicatrização de ferimentos cutâneos, após observarem que

animais feridos, esfregavam-se no tronco das copaibeiras para cicatrizarem seus

ferimentos (GIESBRECHT, 2011; SILVA, 2012).

https://www.google.com.br/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=images&cd=&cad=rja&uact=8&ved=2ahUKEwjj6LHftuXaAhXKgpAKHUzHBFYQjRx6BAgBEAU&url=https://globoplay.globo.com/v/1142843/&psig=AOvVaw0r_kQt0C2vEUyl6bTrd0Yy&ust=1525295411567648

25

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28

3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Isolar e identificar as bactérias presentes em bezerros com onfalites, avaliar o

perfil de resistência a antimicrobianos convencionais e avaliar a eficácia do óleo de

copaíba.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Isolar e identificar as bactérias presentes nos bezerros neonatos com

onfalites.

Avaliar a resistência e sensibilidade das bactérias presentes nos bezerros

neonatos com onfalites frente a diversos antibióticos utilizados no tratamento

de onfalites.

Avaliar a atividade antimicrobiana in vitro do óleo de copaíba frente aos

patógenos isolados.

Avaliar a atividade anti-inflamatória e cicatrizante in vivo do óleo de copaíba

nos bezerros neonatos com onfalites.

Determinar e avaliar as proteínas de fase aguda que caracterizam os

processos inflamatórios: Proteína sérica total, albumina e fibrinogênio nos

bezerros neonatos.

Avaliar a ocorrência de lesão hepática por meio da dosagem das enzimas

Fosfatase Alcalina e Gamaglutamiltransferase em bezerros neonatos.

29

4 ARTIGO 1

IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS ISOLADAS EM ONFALITES DE BEZERROS

NEONATOS E PERFIL DE SUCEPTIBILIDADE A ANTIMICROBIANOS

Identification of bacteria isolated on omphalitis of neonatal calves and antimicrobial susceptibility profile

RESUMO

LIMA, C.A.S. Identificação de bactérias isoladas em onfalites de bezerros neonatos e perfil de suceptibilidade a antimicrobianos. 2018. Dissertação (Mestrado em Biocência Animal) – Universidade de Cuiabá, Cuiabá, 2018.

As onfalites são processos inflamatórios e infecciosos que acometem o cordão umbilical dos animais neonatos. Uso indiscriminado de antibióticos tem gerando falhas de tratamento, aumento do custo da terapia e prolongamento do tempo de recuperação, além do aumento da morbilidade e mortalidade de animais com onfalites. Neste contexto, este estudo teve como objetivo identificar e avaliar o perfil de resistência das bactérias isoladas de 20 bezerros neonatos com onfalites frente a 7 antibióticos: Ampicilina, Ceftiofur, Enrofloxacina, Florfenicol, Gentamicina, Sulfonamidas e Tetraciclina, comumente utilizados no campo. Amostra da secreção umbilical de cada animal foi coletada utilizando swab estéril inserido no orifício umbilical e acondicionado em tubos contendo meio BHI devidamente identificados. A sensibilidade antimicrobiana foi realizada pelo método de difusão em placas com discos. Foram isoladas 13 espécies diferentes de bactérias: Streptococcus uberis; Streptococcus bovis; Escherichia coli; Staphylococcus caseolyticus; Proteus mirabilis; Streptococcus equinus; Enterobacter aerogenes; Erwinia rhapontici; Nocardia asteroidis;Yersinia pestis; Erwinia tracheiphilia; Tatumella ptyseos e Yersinia aldovae. Dentre os antibióticos avaliados, a gentamicina foi o mais eficiente frente aos agentes isolados de bezerros neonatos com onfalites. Palavras-chave. Antibiograma. Onfalopatias. Resistência Bacteriana.

30

ABSTRACT

LIMA, C.A.S

Identification of bacteria isolated on omphalitis of neonatal calves and antimicrobial susceptibility profile. 2018. Dissertation (Master Animal Bioscience) - University of Cuiabá, Cuiabá, 2018.

The omphalitis are inflammatory and infectious processes that affect the umbilical cord of the newborns. Indiscriminate use of antibiotics has led to treatment failures, increased cost of therapy and prolonged recovery time, as well as increased morbidity and mortality of animals with omphalitis. In this context, this study aimed to identify and evaluate the resistance profile of bacteria isolated from 20 calves with neonatal omphalitis and 7 antibiotics: Ampicillin, Ceftiofur, Enrofloxacin, Florfenicol, Gentamicin, Sulfonamides and Tetracycline, commonly used in the field. Sample of the umbilical secretion of each animal was collected using sterile swab inserted into the umbilical bore and packed into tubes containing appropriately identified BHI medium. Antimicrobial susceptibility was determined by disc diffusion method. Thirteen different species of bacteria were isolated: Streptococcus uberis; Streptococcus bovis; Escherichia coli; Staphylococcus caseolyticus; Proteus mirabilis; Streptococcus equinus; Enterobacter aerogenes; Erwinia rhapontici; Nocardia asteroidis; Yersinia pestis; Erwinia tracheiphilia; Tatumella ptyseos and Yersinia aldovae. Among the antibiotics evaluated, gentamicin was the most efficient against isolated agents of neonatal calves with omphalitis. Key words. Antibiograma. Bacterial resistance. Omphalopathies.

31

INTRODUÇÃO

O cordão umbilical, durante a vida fetal, é a via de comunicação entre o feto e

a mãe levando sangue materno, rico em nutrientes e oxigênio e eliminando os

catabólitos do feto. Após o nascimento perde totalmente sua função, e em poucos

dias as veias e as artérias umbilicais utilizadas na comunicação materno-fetal

fecham-se e os músculos dessa região unem-se, constituindo uma massa muscular

(FARIA, 2014; RADOSTITS et al., 2002; SEINO, 2014).

Os animais neonatos apresentam deficiências imunológicas, uma vez que

quase não possuem imunidade humoral e a imunidade celular não está

suficientemente determinada (GUERRA et al., 2017; LeBLANC et al., 1992), pois a

placenta nos bovinos, diferentemente de outros mamíferos, interpõem uma barreira

entre o sistema imune da mãe e feto, impossibilitando a passagem das

imunoglobulinas (Ig) durante o período gestacional, desta forma, a imunidade

passiva é conferida ao neonato nas primeiras horas de vida pela ingestão do

colostro (GOMES et al., 2017; ROCHA et al., 2015) e essa transferência materna da

imunidade é fundamental para os animais, fornecendo ao neonato bovino

anticorpos, células do sistema imunológico e diversos elementos essenciais à sua

sobrevivência (GUERRA et al., 2017).

Após o nascimento, o umbigo pode ser porta de entrada para vários agentes

causadores de diversas enfermidades, podendo infeccionar e provocar onfalite,

impedindo a cicatrização e facilitando a ascendência de microrganismos (FARIA,

2014). O maior índice de mortalidade de bovinos ocorre na fase de cria, devido a

maior vulnerabilidade dos bezerros, principalmente no primeiro mês de vida,

representando importante causa de prejuízos econômicos (ASSIS-BRASIL et al.,

2013; FARIA et al., 2013; RADOSTITS et al., 2002; SEINO, 2014).

As onfalopatias são processos inflamatórios e infecciosos que acomete o

cordão umbilical dos animais neonatos e dependendo do local acometido é

classificada como onfalite, onfaloflebite, onfaloarterite ou infecção do úraco

(RADOSTITS et al., 2002). Os agentes patogênicos mais comuns são a Escherichia

coli, Streptococcus zooepidemicus, Clostridium spp., Proteus spp., Staphylococcus

spp e Actinomyces pyogenes (FENGER, 2000; RADOSTITS et al., 2002).

A Onfalite é comum em bezerros com dois a cinco dias de idade, onde ocorre

inflamação das partes externas do umbigo que aumenta de volume, torna-se

32

doloroso à palpação, obstruído ou drenando material purulento através de fístula e o

bezerro pode apresentar toxemia aguda com sinais clínicos característicos, como:

depressão, não mama normalmente e apresenta-se febril (RADOSTITS et al., 2002).

A resistência aos antimicrobianos é um dos grandes problemas de saúde

pública, causado pela evolução das bactérias, mutação espontânea e recombinação

de genes em consequência ao uso desenfreado de antibiótico sem orientação e

acompanhamento, gerando falhas de tratamento, aumento do custo da terapia e

prolongamento do tempo de recuperação, além do aumento da morbidade e

mortalidade (CRUZ et al., 2012; LOUREIRO et al., 2016).

Considerando que onfalopatias podem acarretar mortalidade em bezerros e

que o uso irracional de antibióticos tem gerado resistência, este estudo teve como

objetivo isolar, identificar bactérias patogênicas presentes em bezerros neonatos

com onfalite e determinar o perfil de resistência frente aos antimicrobianos:

ampicilina, ceftiofur, enrofloxacina, florfenicol, gentamicina, sulfonamidas e

tetraciclina.

MATERIAL E MÉTODOS

O estudo foi realizado na Fazenda Agropecuária Bom Futuro/Agrícola,

localizada no município de Cuiabá–MT e nos laboratórios da Universidade de

Cuiabá. Esta pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética no Uso de Animais -

CEUA/UNIC, com protocolo número 013/2016.

As amostras foram coletadas de 20 bezerros neonatos de ambos os sexos,

Tricross (Nelore x Aberdeen angus x Braford), com idade média de 30 dias,

diagnosticados clinicamente com onfalites.

Os bezerros foram identificados com brinco na orelha, pesados e contidos

para realizar a tricotomia dos pelos do umbigo, as escaras quando presentes foram

removidas e parte da secreção foi drenada para eliminar possíveis contaminantes

ambientais. Em seguida, uma amostra da secreção umbilical de cada animal foi

coletada utilizando swab estéril inserido no orifício umbilical e acondicionado em

tubos devidamente identificado com o número do bezerro, contendo meio Brain

Heart Infusion (BHI, BD®).

Todas as amostras coletadas foram acondicionadas em caixa isotérmica a

4ºC imediatamente e encaminhadas ao Laboratório de Microbiologia da

33

Universidade de Cuiabá - UNIC para realização do isolamento, identificação dos

microrganismos e antibiograma.

O isolamento primário dos microrganismos foi realizado em ágar sangue e

ágar MacConkey. Para a identificação bacteriana, as colônias isoladas foram

avaliadas quanto à morfologia (tamanho, cor, brilho, forma e presença de hemólise),

em seguida as células bacterianas foram avaliadas quanto às suas características

morfotintorias (coloração, forma e arranjo) utilizando o método de Gram como

técnica de coloração padrão. A identificação das espécies foi realizada através da

prova bioquímica, observando as transformações químicas que ocorrem num

determinado substrato, açúcares e aminoácidos, pela ação das enzimas de um dado

microrganismo, conforme Holt et al. (1994); Quinn (1994).

A susceptibilidade antimicrobiana foi realizada em meio Muller Hinton, pelo

método de difusão em placas com discos de antimicrobianos (BAUER; KIRBY;

SHERRIS, 1966; CLSI/NCCLS, 2017; ISENBERG, 1992; KONEMAN et al., 2010;

VANDEPITTE et al., 1994). Os antibióticos testados foram Ampicilina, Ceftiofur,

Enrofloxacina, Florfenicol, Gentamicina, Sulfonamidas e Tetraciclina.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A identificação microbiana das amostras analisadas permitiu o agrupamento

dos microrganismos isolados em 12 espécies diferentes conforme discriminadas na

Tabela 1. Alguns animais apresentaram infecções mistas (mais de uma bactéria

isolada), sendo isolados em 12 amostras mais de um tipo bacteriano. Justificando o

total de 33 bactérias isoladas em 20 amostras analisadas. Segundo Radostits et al.

(2002) as onfalopatias infecciosas geralmente apresentam uma flora polibacteriana e

quase sempre microrganismo Gram-negativos estão envolvidos. Dados de Reis

(2017) e Rengifo et al. (2006) descrevem isolamentos de um único microrganismo e

de infecções mistas, com três ou mais agentes isolados em seu estudo.

Quanto à classificação segundo a coloração de Gram das bactérias isoladas,

58,3% (7/12) bactérias eram Gram-negativas e 41,7% (5/12) eram bactérias Gram-

positivas. Resultados semelhantes ao de Reis (2017), onde 65,51% dos

microrganismos isolados de secreções de umbigos de bezerros eram Gram-

negativas.

34

Tabela 1 - Microrganismos identificados na secreção umbilical coletada de bezerros com onfalite

Animal Microrganismos f %

6; 7; 8; 13; 16 e 18 Streptococcus uberis 6 18,18

1; 6; 10; 16 e 17 Streptococcus bovis 5 15,15

8; 9; 11; 12 e 14 Escherichia coli 5 15,15

4; 7; 18 e 20 Staphylococcus caseolyticus 4 12,12

4; 5; 13 e 15 Proteus mirabilis 4 12,12

10 e 18 Streptococcus equinus 2 6,06

19 e 20 Enterobacter aerogenes 2 6,06

2 Erwinia rhapontici 1 3,03

2 Nocardia asteroidis 1 3,03

3 Erwinia tracheiphilia 1 3,03

9 Tatumella ptyseos 1 3,03

11 Yersinia aldovae 1 3,03

TOTAL 33 100

f = frequência

Os microrganismos encontrados nesta pesquisa pertencem a microbiota

destes animais ou estão presentes no solo, água e vegetais, e desta forma, reforça a

necessidade de realizar a cura do umbigo de recém-nascidos e a importância da

ingestão do colostro para evitar que estes microrganismos causem onfalites, de

acordo com Reis (2017) os achados microbiológicos podem ser influenciados pelas

condições ambientais e de manejo, transferência de imunidade passiva colostral,

animais isolados ou em confinamentos, entre outros.

Foi observado que as bactérias do gênero Streptococcus spp. (39,5%),

Escherichia spp. (15,2%), Staphylococcus spp. (12,1%) e Proteus spp. (12,1%)

foram de maior frequência, destas Streptococcus uberis, Streptococcus bovis,

Escherichia coli, Staphylococcus caseolyticus e Proteus mirabilis foram às espécies

mais comuns. Desta forma, os microrganismos isolados de bezerros neonatos deste

estudo são correspondentes aos gêneros microbianos mais descritos pela literatura

como agentes causadores de onfalites. Conforme relatado por Fenger (2000);

Radostits et al. (2002) que a Escherichia coli, Streptococcus zooepidemicus, Proteus

spp. e Staphylococcus spp., são microrganismos associados as onfalites, além do

Clostridium spp. e Actinomyces pyogenes que não foram isolados no presente

estudo.

35

Em um estudo sobre etiologia de infecções do umbigo, Rengifo et al. (2006)

relataram que a E. coli foi o microrganismo de maior frequência, assim como Bacillus

spp, Enterobacter spp., Micrococcus spp., Staphylococcus spp., Estafilococos

coagulase-negativos (ECN), Serratia marcescens, Citrobacter freundii, Klebsiella

pneumoniae e leveduras, todos estes não foram isolados na pesquisa.

Reis (2017) em seu estudo de correlação dos agentes microbianos isolados a

partir da secreção do umbigo e de amostras de sangue de bezerros com onfalite,

identificou que as bactérias do gênero Escherichia spp., Streptococcus spp.,

Klebsiella spp. e Proteus spp. foram os mais frequentes isolados, sendo E. coli e

Streptococcus uberis as espécies mais comuns associadas a onfalite, condizente

com os resultados do presente estudo.

A identificação destes microrganismos evidencia a carência de adoção de

boas práticas de higiene e cura do umbigo dos bezerros após o nascimento, além da

não permanência dos animais com suas mães e correta ingestão do colostro

(SEINO, 2014).

O antibiograma demonstrou resistência dos agentes isolados frente aos

diferentes antimicrobianos testados, observando que a maioria dos microrganismos

apresentou resistência a sulfanamidas (72,73%), ampicilina (60,61%), Ceftiofur

(27,27%) e tetraciclina (15,15%) (Figura 1). Resultados semelhantes foram

encontrados por REIS (2017), onde 100% e 33% dos microrganismos isolados de

amostras de sangue bezerros apresentaram resistência ao ceftiofur e tetraciclinas,

respectivamente, e microrganismos isolados em amostras de umbigos de bezerros

também se mostraram resistentes a ampicilina e tetraciclina, e sensíveis ao ceftiofur,

exceto a sulfanamida que não foi testado por este autor.

Verificou-se que a Gentamicina foi mais eficiente entre os antibióticos

testados (Figura 1), pois 100% dos microrganismos isolados foram sensíveis à

mesma, além do Florfenicol e Enrofloxacino, possivelmente por serem utilizados

raramente no campo. Resultados obtidos por Reis (2017) também demonstrou 100%

de sensibilidade deste antimicrobiano frente a microrganismos isolados de amostras

de sangue de bezerros e 95,24% quanto testado frente a microrganismos isolados

de em amostras de secreção de umbigo, reforçando os resultados encontrados.

Esse elevado grau de resistência se deve ao uso constante e muitas vezes

indevido na rotina da clínica veterinária, gerando aumento da resistência bacteriana

aos mesmos (REIS, 2017).

36

Figura 1 – Perfil de resistência dos microrganismos isolados de bezerros neonatos com onfalite

Os resultados do presente estudo reforçam que o uso de antibióticos gera

resistência que podem trazer sérios riscos à saúde da população, visto que reduz as

opções de fármacos efetivos para o tratamento de infecções e elevam as taxas de

morbidade e mortalidade, tanto de animais quanto em seres humanos (COSTA;

SILVA JUNIOR, 2017). Desta forma ressalta-se a importância da realização de

testes de cultura e antibiograma para auxiliar na escolha do tratamento correto

(ZIMERMANN e ARAÚJO, 2017).

CONCLUSÕES

As bactérias do gênero Streptococcus spp., Staphylococcus spp, Escherichia

coli, e Proteus mirabilis foram os microrganismos predominantes em bezerros

neonatos com onfalite.

A utilização indiscriminada e indevida de antibióticos acarreta resistência em

bactérias presentes em bezerros neonatos com onfalites, que podem comprometer a

saúde animal e humana.

Gentamicina, Florfenicol e Enrofloxacino foram os antibióticos testados mais

eficientes em ação antimicrobiana frente aos agentes isolados de bezerros neonatos

com onfalite.

010203040506070

80

90

100

19 8

2 1 22

5

13 25

31 32 33 11

28

Resistente Intermediário Sensível

37

REFERÊNCIAS

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39

5 ARTIGO 2

AVALIAÇÃO DO ÓLEO DE Copaifera spp (COPAÍBA) NO TRATAMENTO DE ONFALITES EM BEZERROS NEONATOS

EVALUATION OF Copaifera spp (COPAÍBA) OIL IN THE TREATMENT OF

OMPHALITIS IN NEONATE CALVES

RESUMO

LIMA, C.A.S. Avaliação do óleo de Copaifera spp (copaíba) no tratamento de onfalites em bezerros neonatos. 2018. Dissertação (Mestrado em Biociência Animal) – Universidade de Cuiabá, Cuiabá, 2018.

As onfalopatias são processos inflamatórios e infecciosos que acometem o cordão umbilical dos animais neonatos, resultante da falta de higiene ambiental, de tratamento inadequado do umbigo ou pelo comprometimento imunitário do neonato, causando diversos problemas de saúde e até morte do animal. Atualmente vem crescendo o interesse da comunidade científica no uso de plantas medicinais, buscando assim a descoberta de novos fármacos que possam produzir efeitos semelhantes ou até mais efetivos se comparados aos fármacos convencionais. A Copaifera spp. (copaíba) é uma planta da flora brasileira bastante utilizada por apresentar ação anti-inflamatória, anti-infecciosa e cicatrizante. Este estudo teve como objetivos avaliar a atividade do óleo de copaíba no tratamento de onfalites em bezerros neonatos (in vivo) e sua ação antimicrobiana in vitro. Foram utilizados 20 bezerros neonatos diagnosticados com onfalites, distribuídos aleatoriamente em quatro grupos: grupo sem tratamento; grupo tratado com antibiótico, grupo tratado com pomada base contendo óleo de copaíba 10% e grupo tratado com o óleo de copaíba puro (100%). Todos os bezerros com onfalites foram acompanhados por meio de exame clínico, além de coleta de amostras de sangue para determinação de proteínas de fase aguda e avaliação de possíveis lesões hepáticas nestes animais. A análise das variáveis estudadas foi interpretada por meio de análise de variância e as médias comparadas pelo Teste de Tukey a 5% de probabilidade. Concluiu-se que o óleo de copaíba possui ação cicatrizante e anti-inflamatória (in vivo) e antimicrobiana (in vitro) frente aos microrganismos Yersinia aldovae, Streptococcus equinus, Tatumella ptyseos, Erwinia rhapontici, Proteus mirabilis e Staphylococcus caseolyticus isolados de bezerros neonatos com onfalite. Palavras-chave. Compostos ativos. Efeito antimicrobiano. Onfalopatias. Planta medicinal.

40

ABSTRACT

LIMA, C.A.S. Evaluation of Copaifera spp (copaíba) oil in the treatment of omphalitis in neonatal calves. 2018. Dissertation (Master Animal Bioscience) - University of Cuiabá, Cuiabá, 2018.

The omphalopathies are inflammatory and infectious processes that affect the umbilical cord of the newborns, resulting from the lack of environmental hygiene, inadequate treatment of the navel or the immune compromise of the neonate, causing several health problems and even death of the animal. Nowadays, the interest of the scientific community in the use of medicinal plants has increased, thus seeking the discovery of new drugs that can produce similar or even more effective effects when compared to conventional drugs. Copaifera spp. (copaíba) is a plant of the Brazilian flora widely used for presenting anti-inflammatory, anti-infectious and healing action. The objective of this study was to evaluate the activity of copaíba oil in the treatment of omphalitis in neonatal calves (in vivo) and its antimicrobial action in vitro, using 20 neonatal calves diagnosed with omphalitis, distributed in four groups: untreated group, antibiotic treated group, ointment treated group containing 10% copaiba oil; and group treated with pure copaiba oil (100%).. All calves with omphalitis were followed up by clinical examination, blood samples were collected for the determination of acute phase proteins and evaluation of possible hepatic lesions in these animals. The analysis of the studied variables was interpreted through analysis of variance and the means compared by the Tukey test at 5% of probability. It was concluded that copaiba oil has healing and anti-inflammatory action (in vivo) and antimicrobial (in vitro) against the microorganisms Yersinia aldovae, Streptococcus equinus, Tatumella ptyseos, Erwinia rhapontici, Proteus mirabilis and Staphylococcus caseolyticus isolated from neonatal calves with omphalitis. Key words. Active compounds. Antimicrobial effect. Medicinal plant. Omphalopathies.

41

INTRODUÇÃO

O estado de Mato Grosso tem como base econômica o seu potencial

agropecuário e atualmente possui o maior rebanho bovino do país com 30.230

milhões de cabeças (INDEA, 2017).

A mortalidade de bezerros representa importante causa de prejuízos

econômicos, principalmente na produção leiteira. O maior índice de mortalidade de

bovinos ocorre na fase de cria, devido a maior vulnerabilidade dos bezerros,

principalmente no primeiro mês de vida (FARIA et al., 2013; RADOSTITS et al.,

2002; SEINO, 2014).

As afecções umbilicais são consideradas as principais doenças do período

neonatal em bezerros leiteiros e de corte, com incidência de 28 a 42,2%, gerando

grandes perdas econômicas, pois diminuem o ganho de peso, geram custos com

medicamentos e assistência Médica Veterinária, retardam o crescimento e

promovem depreciação da carcaça dos bezerros, podendo levar à morte do animal

(FARIA et al., 2013; REIS et al., 2009; SEINO, 2014). Estudos apontam que estas

onfalopatias são responsáveis por aproximadamente 10% de mortalidade em

bezerros nos primeiros meses de vida, resultantes da falta de higiene ambiental, de

cuidados gerais e de tratamento do umbigo no momento do nascimento e nos dias

seguintes (SEINO, 2014).

Atualmente há grande interesse da comunidade científica no uso de plantas

medicinais, resultando em diversos estudos relacionados aos seus compostos ativos

(GADELHA et al., 2013). O uso de plantas na terapia é conduzido pelo potencial que

as mesmas possuem em produzir efeitos semelhantes ou até mais efetivos quando

comparados aos fármacos convencionais, além de serem bem aceitas,

especialmente em países em desenvolvimento (NETO et al., 2014; SRIVASTAVA et

al., 2005).

O Brasil é detentor da maior biodiversidade do mundo e possui uma fonte

riquíssima de matéria-prima para a produção de medicamentos. Contudo apenas 1%

do mercado fitoterápico no país é voltado para o setor veterinário, observando-se

carência de pesquisas nesta área. Há interesse da indústria veterinária em inovar o

setor, oferecendo produtos que sejam mais eficazes e que apresentem menores

efeitos colaterais, como forma de proporcionar bem-estar e qualidade de vida para

42

os animais e que estejam associados a um baixo custo de produção (ARAÚJO et al.,

2013; OLIVEIRA et al., 2009).

A Copaifera spp., popularmente conhecido como ''copaíba'' é uma grande

árvore predominante nas regiões Centro-Oeste e Norte, principalmente nos estados

de Mato Grosso, Amazonas e Pará (PIERI et al., 2009). Seu óleo-resina, obtido

através de pequenos cortes na casca do caule da planta, é um remédio popular

utilizado na sua forma natural como um agente anti-inflamatório, anti-infeccioso e

cicatrizante para o tratamento de várias afecções, tais como dores de garganta,

infecções urinárias, pulmonares, úlceras e feridas, podendo ser administrado por via

oral ou por aplicação tópica (BASILE et al., 1988; MONTES et al., 2009; NOGUEIRA

et al., 2012; PAIVA et al., 2004; PIERI et al., 2009). Segundo Mendonça e Onofre

(2009) apud Ferreira (1999); Leite (2001) o óleo de copaíba é usado há séculos por

povos indígenas na cura do umbigo dos recém-nascidos para evitar as afecções

tetânicas e auxiliar no processo de cicatrização.

Apesar da constante busca na medicina veterinária por terapias alternativas e

efetivas, até o momento não foram encontradas publicações disponíveis na literatura

sobre o uso do óleo de copaíba no tratamento de onfalites em bezerros neonatos.

Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar a atividade do óleo de copaíba no

tratamento de onfalites em bezerros neonatos (in vivo) e sua ação antimicrobiana in

vitro.

43

MATERIAL E MÉTODOS

Grupos de animais experimentais

O estudo foi realizado na Fazenda Agropecuária Bom Futuro/Agrícola,

localizada no município de Cuiabá–MT e no Hospital Veterinário da Universidade de

Cuiabá. Esta pesquisa foi aprovada pela Comitê de Ética no Uso de Animais -

CEUA/UNIC, com protocolo número 013/2016.

Foram utilizados no presente estudo 20 bezerros neonatos diagnosticados

com onfalites, de ambos os sexos, Tricross (Nelore x Aberdeen angus x Braford),

com idade média de 30 dias e peso médio 45kg, identificados com brinco, conforme

demonstrado na Figura 1, e distribuídos aleatoriamente em quatro grupos

experimentais de 5 animais cada.

Figura 1: Identificação dos animais com brincos

Fonte: Arquivo pessoal

Grupo 1 (G1) ou grupo controle: bezerros neonatos com sinais clínicos de

onfalite que não receberam tratamento.

Grupo 2 (G2): bezerros neonatos com sinais clínicos de onfalite que

receberam tratamento tópico com pomada base contendo óleo de copaíba 10%, em

uma aplicação diária por 7 dias consecutivos.

44


receberam tratamento tópico com o óleo de copaíba puro (100%), em uma aplicação

diária por 7 dias consecutivos.


receberam tratamento convencional com antibiótico comumente utilizado na

propriedade, à base de enrofloxacino (2,5 mg/kg), com aplicação via intramuscular a

cada 48 horas (Dia 0 e 2), perfazendo duas aplicações.

Formulação da pomada contendo óleo de copaíba

O óleo-resina de Copaifera spp. utilizado foi obtido da marca Distriol®,

contendo 500 mL de óleo in natura para uso tópico. O óleo de copaíba foi testado in

vivo nas concentrações de 100% e de 10% veiculado em uma base de pomada

contendo 80% de vaselina e 20% de glicerina (Figura 2). Esta formulação foi

desenvolvida com base no estudo realizado por Masson (2011) que testou esta

preparação em úlceras cutâneas em orelha de coelho, com aplicações tópicas

diárias, por 21 dias, resultando em atividade antimicrobiana in vitro e in vivo, além de

significativa atividade cicatrizante do óleo de copaíba.

Figura 2: Pomada contendo óleo de copaíba 10%

Fonte: Arquivo pessoal

45

Coleta, isolamento e identificação das bactérias que causam onfalites

Antes de iniciar os tratamentos, foi coletada uma amostra da secreção

umbilical de cada animal diagnosticado com onfalite (Grupos 1, 2, 3 e 4), utilizando

swab estéril inserido no orifício umbilical e acondicionado em tubos devidamente

identificado com o número do bezerro, contendo meio BHI (Brain Heart Infusion -

BD®). Todas as amostras coletadas foram acondicionadas em caixa isotérmica a

4ºC imediatamente após a coleta e encaminhadas ao laboratório para realização do

cultivo e identificação dos microrganismos envolvidos no processo infeccioso.

O isolamento e identificação dos microrganismos foram realizados conforme

Bergey’s Manual of Determinate Bacteriology (HOLT et al., 1994; QUINN, 1994).

Avaliação da atividade antimicrobiana in vitro do óleo de copaíba

Para avaliação da atividade antimicrobiana do óleo de Copaifera spp. in vitro,

foi utilizada a técnica Concentração Inibitória Mínima (CIM) preconizada pelo manual

Clinical and Laboratory Standards Institute - CLSI/NCCLS (2017) - Methods for

Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically com o

objetivo de definir a menor concentração de óleo capaz de inibir o crescimento

bacteriano.

Após o isolamento e identificação dos microrganismos, foi preparado o

inóculo a uma concentração de 3 x 102 UFC/mL, a partir de uma suspensão a 0,5

McFarland (ou 108 UFC/ml). Cada cepa foi inoculada em 9 mL de solução fisiológica

de modo a se obter uma concentração de 1,5 x 108 UFC/mL (0,5 MacFarland), que

foi diluído para 3 x 102 UFC/mL, conforme descrito na CLSI/NCCLS (2017).

Para a diluição do tratamento foi utilizado uma solução da substância teste

diluída a 20.000 µg/mL em dimetilsulfóxido (DMSO) e como padrão, enrofloxacino

(Chemitril®) 10 µL de enrofloxacino diluído em caldo Mueller-Hinton. A partir desta

solução foram preparadas as diluições seriadas da substância teste para o ensaio,

conforme demonstrado na Figura 3 (CLSI/NCCLS, 2017; OSTROSKY et al., 2008).

46

Figura 3: Esquema da placa utilizada na diluição do óleo de Copaifera spp.

Coluna 1: meio + amostra; colunas 2 a 9 diluições do óleo de copaíba; na coluna 10 o enrofloxacino; na coluna 11 foi utilizado o controle de crescimento (CC) e na coluna 12 o controle de esterilidade (CE).

Todos os ensaios foram realizados em triplicata, com determinação do

controle de crescimento (CC) contendo meio de cultura e inóculo e controle

esterilidade (CE) com apenas meio de cultura e solução fisiológica.

As placas foram incubadas a 36±1 ºC durante o período preconizado para

cada cepa bacteriana (24h – 72h). Passado este período, aplicou-se 30 µL

resazurina sódica 0,01% em cada poço e aguardou-se uma hora para realizar a

leitura em espectrofotômetro em comprimento de onda 450nm (ARAUJO; LONGO,

2016; CLSI/NCCLS, 2017).

Analise bioquímica e hematológica

Foram coletadas amostras de sangue de todos os animais do estudo

(tratados e não tratados) no dia zero (D0), antes do início dos tratamentos e nos dias

4, 7 e 11 subsequentes (D4, D7 e D11) para determinação do proteinograma sérico

e avaliação das enzimas hepáticas e evolução do processo infeccioso. Essas

amostras de sangue foram colhidas assepticamente por punção na veia jugular

externa, utilizando-se sistema vacutainer, em tubos de vidro siliconizados de 10 mL,

sem anticoagulantes e mantidas à temperatura ambiente para facilitar a retração do

coágulo. A seguir centrifugadas, a 1.000g, durante 15 minutos. Os soros sanguíneos

obtidos para determinação da Proteína Sérica Total e albumina foram mantidos e

conservados em freezer a menos 20° C até a realização das provas de acordo com

a metodologia descrita na literatura (JAIN, 1993; LAEMMLI, 1970; SIMPLÍCIO et al.,

Enrofloxacino

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A Meio+amostra 1000µg/mL 500µg/mL 250µg/mL 125µg/mL 62,5µg/mL 31,25µg/mL 15,625µg/mL 7,8125µg/mL 10 µg/mLControle

pos i tivo

Controle

esteri l idade

B Meio+amostra 1000µg/mL 500µg/mL 250µg/mL 125µg/mL 62,5µg/mL 31,25µg/mL 15,625µg/mL 7,8125µg/mL 5µg/mLControle

pos i tivo

Controle

esteri l idade

C Meio+amostra 1000µg/mL 500µg/mL 250µg/mL 125µg/mL 62,5µg/mL 31,25µg/mL 15,625µg/mL 7,8125µg/mL 2,5µg/mLControle

pos i tivo

Controle

esteri l idade

D 1,25µg/mLControle

pos i tivo

Controle

esteri l idade

E 0,625µg/mLControle

pos i tivo

Controle

esteri l idade

F 0,3125µg/mLControle

pos i tivo

Controle

esteri l idade

G 0,15625µg/mLControle

pos i tivo

Controle

esteri l idade

H 0,078125µg/mLControle

pos i tivo

Controle

esteri l idade

Óleo de Copaifera

47

2013). Já para as análises hematológicas (hemograma e fibrinogênio) foram

adotados os mesmos procedimentos e analisadas imediatamente após a coleta,

utilizando tubos de colheita contendo anticoagulante EDTA (ácido

etilenodiaminotetracético).

Avaliação da atividade antimicrobiana, anti-inflamatória e cicatrizante in vivo

do óleo de copaíba

Todos os bezerros foram acompanhados por meio de exame clínico para

observação das características da região umbilical, quanto ao tempo de involução,

melhora do processo inflamatório e de cicatrização do umbigo nos dias 4, 7 e 11.

Análise Estatística

A análise das variáveis estudadas foi interpretada por meio de análise de

variância no programa Sistema de Análise Estatística e Genética - SAEG

(Universidade Federal de Viçosa, 1997) e as médias comparadas pelo Teste de

Tukey a 5% de probabilidade.

48

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Formulação contendo Óleo de Copaíba

A pomada contendo óleo de copaíba apresentou boa adesão à lesão e não

houve sinal de irritação ou intolerância ao produto, resultado este que também foi

observado por Masson (2011).

Coleta, isolamento e identificação de bactérias causadoras de onfalite

Dos 20 animais diagnosticados com onfalite foi observado crescimento

microbiano em 100% das amostras, sendo possível isolar 12 espécies

microrganismos: 18,2% de Streptococcus uberis (6/20); 15,2% de Streptococcus

bovis (5/20); 15,2% de Escherichia coli (5/20); 12,1% de Staphylococcus

caseolyticus (4/20); 12,1% de Proteus mirabilis (4/20); 6,1% de Streptococcus

equinus (2/20); 6,1% de Enterobacter aerogenes (2/20); 3% de Erwinia rhapontici

(1/20); 3% de Nocardia asteroidis (1/20); 3 % de Erwinia tracheiphilia (1/20); 3% de

Tatumella ptyseos (1/20) e 3% de Yersinia aldovae (1/20).

Foram encontradas infecções mistas, com 2 a 3 agentes isolados,

corroborando com o descrito na literatura no que se refere a uma microbiota

bacteriana mista presente nos casos de onfalite. Radostits et al. (2002) apontaram

que as onfalopatias infecciosas geralmente apresentam uma flora polibacteriana e

quase sempre microrganismos Gram-negativos estão envolvidos. Resultados

semelhantes também foram descritos por Reis (2017) e Rengifo et al. (2006) que

obtiveram isolamentos de um único microrganismo (Estafilococos coagulase

negativos e E. coli), bem como infecções mistas com três ou mais agentes isolados.

Quanto à classificação segundo a coloração de Gram das bactérias isoladas,

58,3% (7/12) bactérias são Gram-negativas e 41,7% (5/12) bactérias Gram-positivas,

resultados estes, semelhantes ao encontrado por Reis (2017), onde 65,51% das

bactérias isoladas de secreções de umbigo eram Gram-negativas.

49

Avaliação da atividade antimicrobiana in vitro do óleo de copaíba

O óleo de copaíba apresentou atividade antimicrobiana, sendo capaz de inibir

o crescimento Yersinia aldovae e Streptococcus equinus nas concentrações de 50 e

25%, respectivamente. Tatumella ptyseos, Erwinia rhapontici, Proteus mirabilis e

Staphylococcus caseolyticus foram sensíveis à ação do óleo, apresentado CIM

abaixo de 125 μg/mL, conforme concentrações representadas na Tabela 1. Ziech et

al. (2010), demonstraram que o óleo-resina de C. reticulata exerce atividade

antimicrobiana in vitro e in vivo frente a cepas formadoras de placa dental em cães

(Streptococcus salivarius - CDC 262, Streptococcus pyogenes -ATCC 19615 e

Enterococcus faecalis - ATCC 19433). Masson et al. (2013) comprovaram ação

antimicrobiana do óleo-resina da C. langsdorffi quando testado contra

microrganismos Staphylococcus aureus (ATCC 6538), Streptococcus pyogenes

(ATCC 19615) e Enterococcus faecalis (ATCC 10541).

Tabela 1 – Concentração Inibitória Mínima - CIM (μg/mL) do óleo de Copaífera spp. e enrofloxacino frente a bactérias isolados dos bezerros com onfalite Microrganismos

[ ] óleo de Copaífera

(μg/mL) [ ] Enrofloxacino

(μg/mL)

Yersinia aldovae 1000 0,079

Streptococcus equinus 250 0,079

Tatumella ptyseos 125 0,079

Erwinia rhapontici 62,5 0,079

Proteus mirabilis 31,25 0,079

Staphylococcus caseolyticus 31,25 0,079

Enterobacter aerogenes Inativo 0,079

Erwinia tracheiphilia Inativo 0,079

Escherichia coli Inativo 0,079

Nocardia asteroidis Inativo 0,079

Streptococcus uberis Inativo 0,079

Streptococcus bovis Inativo 0,079

[ ] - Concentração

Em relação Enterobacter aerogenes, Erwinia tracheiphilia e Escherichia coli, o

óleo de copaíba foi inativo, por se tratar de bactérias Gram-negativas cuja estrutura

de parede favorece uma maior resistência justificando assim os resultados

encontrados (KONEMAN et al., 2008).

50

Nocardia asteroidis, Streptococcus bovis e Streptococcus uberis também

apresentaram resistência ao óleo de copaíba. Piere et al. (2012) que testou o óleo

para bactérias do biofilme dental de cães, também encontrou Streptococcus ssp.

resistentes. Não foram encontrados na literatura estudos da ação do óleo frente à

Nocardia asteroidis.

Em estudos com óleos de Copaifera spp. frente a bactérias isoladas de leite

de vacas com mastite realizados por Faria et al. (2017) mostrou que a atividade

antimicrobiana do óleo essencial foi inativa para E. coli, resultado semelhante ao

observado neste estudo. Já Mendonça; Onofre (2008) mostraram que o óleo de

copaíba apresentou inibição para E. coli (ATCC 25922). Os resultados diferentes

entre os trabalhos encontrados e o presente estudo podem estar relacionados à

composição diferente dos óleos, pois foram utilizadas diferentes espécies do gênero

Copaifera, além de ser isolados clínicos.

Todos os microrganismos testados apresentaram CIM de 0,079 μg/mL para o

enrofloxacino. Resultados semelhantes à Smaniotto et al. (2016) onde o

enrofloxacino apresentou elevado grau de sensibilidade em relação a diversos

microrganismos isolados de amostras de leite, diarreia, raspados de pele e swabs de

ouvido de bovinos. Langoni et al. (2000) que avaliaram enrofloxacino (Baytril®) no

tratamento da mastite bovina estafilocócica mostrou que 72% das amostras foram

sensíveis à enrofloxacina, reforçando os resultados do presente estudo.

Analise bioquímica hematológica

Os resultados com valores médios e desvios-padrão do eritrograma e

leucograma estão dispostos na Tabela 2. Observou-se que todos os animais do

estudo apresentaram total de eritrócitos, concentração de hemoglobina e

hematócrito, mantendo valores no intervalo de referência considerado normal para a

espécie bovina, de acordo com os valores de referência para eritrograma

preconizados por Benesi et al. (2012) e Radostitis et al. (2002), podendo afirmar que

estes animais não apresentavam anemias antes e durante o tratamento.

51

Tabela 2 - Valores médios e desvios-padrão (x ± s) de parâmetros hematológicos

Eritrócitos

Valor de Referência: 5 -10 x10

6/mm

3

D0 (x10

6/mm

3)

D7 (x10

6/mm

3)

G1 6,8 ± 0,99 7,1 ± 0,96 NS

G2 7,6 ± 1,65 8,5 ± 1,16 NS

G3 7,5 ± 0,74 6,9 ± 0,55 NS

G4 8,2 ± 1,86 8,9 ± 1,75 NS

Hemoglobina (g/dL)

Valor de Referência: 8 – 15 g/dL D0 D7

G1 10,0 ± 1,17 10,7 ± 0,64 NS

G2 9,8 ± 1,36 10,8 ± 0,51 NS

G3 9,6 ± 1,01 9,2 ± 0,42 NS

G4 10 ± 1,88 10,9 ± 1,27 NS

Hematócrito

Valor de Referência: 24 – 46% D0 D7

G1 31,02 ± 3,66 32,54± 2,33 NS

G2 31,56 ± 4,62 34 82 ± 1,91 NS

G3 30,22 ± 3,31 29,1 ± 2,16 NS

G4 31,8 ± 6,46 34,74 ± 4,33 NS

Leucócitos

Valor de Referência: 4.000 – 12.000/mm

3

D0 D7

G1 9940 ± 3152,5 9900 ± 3089,5 NS

G2 9860 ± 1934,7 9120 ± 1649,9 NS

G3 11120 ± 4557 9240 ± 2833,4 NS

G4 11300 ± 2017,5 10640 ± 2833 NS

Neutrófilos segmentados

Valor de Referência: 600 – 5400 x 103/mm

3

D0 D7

G1 4713 ± 1051,5 5175 ± 2500,6 NS

G2 5497 ± 2689,0 5167 ± 1492,9 NS

G3 6471 ± 5654,9 4770 ± 2246,1 NS

G4 5724 ± 1425,1 4933 ± 1764,5 NS

Linfócitos

Valor de Referência: 1800 - 9000 x 103/mm

3

D0 D7

G1 5054,8 ± 1559,8 4457,2 ± 1148,2 NS

G2 4085,4 ± 1060,8 3807,6 ± 843,5 NS

G3 4263 ± 1976,5 4694,4 ± 1878,8 NS

G4 5316 ± 1752,1 5607,2 ± 1992,9 NS

NS

Não significativo (P>0,05) Legenda: G1: Sem tratamento; G2: Grupo tratado com óleo de copaíba a 10%; G3: Grupo tratado com óleo de copaíba 100% e G4: Grupo tratado com enrofloxacino. D0: antes de iniciar tratamento. D7: 7 dias após o início do tratamento.

52

Em relação ao leucograma (contagem de leucócitos, neutrófilos segmentados

e linfócitos), antes e no final do tratamento (Tabela 2), pode-se observar um

comportamento de pequenas variações, sem demonstração de diferenças

significativas (P>0,05) entre os grupos. De acordo com a literatura, os ruminantes

com inflamação aguda, conseguem recompor seus valores hematológicos

rapidamente (3-5 dias), justificando a normalidade dos resultados apesar do

processo inflamatório presente (JAIN, 1993).

A análise da concentração do fibrinogênio plasmático (Tabela 3) não

demonstrou diferença (P>0,05) entre os animais do grupo sadio, tratados e não

tratados. Resultados semelhantes foram encontrados por Simplício et al. (2013)

onde o fibrinogênio não foi sensível em seu estudo com bezerros com onfaloflebite,

já em animais adultos, vacas com mastite, apresentaram importante elevação do

fibrinogênio, essa diferença na resposta está relacionada a imunidade adquirida,

visto que em neonatos encontra-se em formação (JAIN, 1993; RADOSTITS et al.,

2002).

Tabela 3 - Valores médios e desvios-padrão (x ± s) das concentrações de Fibrinogênio plasmático, proteínas totais plasmáticas e globulinas dos bezerros

FIBRINOGENIO

Valor de Referência: 300 - 700 mg/dL

D0 D7

G1 520 ± 109,55 560 ± 328,64 NS

G2 560 ± 260,76 640 ± 167,33 NS

G3 320 ± 178,89 700 ± 387,30 NS

G4 440 ± 260,77 720 ± 228,04 NS

PROTEÍNAS TOTAIS

Valor de Referência: 7,0 - 8,5 g/dL

D0 D7

G1 7,32 ± 0,65 7,46 ± 0,86 NS

G2 6,76 ± 0,33 6,60 ± 0,55 NS

G3 6,60 ± 0,83 6,26 ± 1,02 NS

G4 6,84 ± 0,57 6,86 ± 0,93 NS

GLOBULINAS

Valor de Referência: 2,5 - 4,1 g/dL

D0 D7

G1 5,16 ± 0,73 5,14 ± 0,55 NS

G2 4,60 ± 0,45 3,90 ± 0,58 NS

G3 4,56 ± 0,96 3,94 ± 1,46 NS

G4 5,12 ± 0,84 4,18 ± 0,80 NS

NS

Não significativo (P>0,05) Legenda: G1: Sem tratamento; G2: Grupo tratado com óleo de copaíba a 10%; G3: Grupo tratado com óleo de copaíba 100% e G4: Grupo tratado com enrofloxacino. D0: antes de iniciar tratamento. D7: 7 dias após o início do tratamento.

53

Observou-se que a concentração sérica de proteína total e globulinas dos

bovinos doentes não diferiu significativamente (P>0,05). Esses resultados podem

estar relacionados ao fato dos animais serem neonatos e ainda a resposta de defesa

atuante ser via imunidade passiva. Além de outros fatores que possam ter interferido

como local que esses animais estavam, barreira (pele dos animais), altura da

pastagem, entre outros.

Tabela 4 - Média e desvio padrão (x ± s) das enzimas hepáticas dos bezerros

AST

Valor de Referência: 48 – 100 UI/L

D0 D7

G1 73,26 ± 22,55 59,68 ± 18,36 NS

G2 52,34 ± 12,28 60,72 ± 21,44 NS

G3 55,46 ± 17,22 41,86 ± 12,84 NS

G4 62,82 ± 22,53 61,76 ± 18,65 NS

FA

Valor de Referência: 0 - 488 UI/L D0 D7

G1 331,60 ± 155,86 556,80 ± 236,26 NS

G2 431,12 ± 298,15 561,80 ± 189,46 NS

G3 648,00 ± 489,17 382,80 ± 151,62 NS

G4 729,20 ± 236,12 541,60 ± 228,65 NS

GGT

Valor de Referência: 20 – 48 UI/L D0 D7

G1 188,54 ± 141,22 100,52 ± 61,96 NS

G2 277,44 ± 272,70 54,68 ± 24,47 NS

G3 317,64 ± 272,25 90,32 ± 63,87 NS

G4 255,42 ± 290,50 64,86 ± 34,10 NS

ALBUMINA

Valor de Referência: 2,7 – 4,3 g/dL

D0 D7

G1 2,16 ± 0,20 2,32 ± 0,62 NS

G2 2,16 ± 0,38 2,7 ± 0,50 NS

G3 2,04 ± 0,20 2,32 ± 0,48 NS

G4 1,72 ± 0,60 2,68 ± 0,44 NS

NS

Não significativo (P>0,05) Legenda: G1: Sem tratamento; G2: Grupo tratado com óleo de copaíba a 10%; G3: Grupo tratado com óleo de copaíba 100% e G4: Grupo tratado com enrofloxacino. D0: antes de iniciar tratamento. D7: 7 dias após o início do tratamento. AST: Aspartato aminotransferase; FA: Fosfatase Alcalina; GGT: gamaglutamiltransferase.

54

Estudos apontam que hemograma, fibrinogênio, albumina, globulinas e

proteínas totais são influenciados pela ingestão e absorção do colostro, justificando

os resultados dentro dos níveis de referência, mesmo em animais não tratados,

sendo a idade um importante fator a ser considerado (POLÓ, 2013; SIMPLÍCIO et

al., 2013; THRALL et al., 2006).

Analisando as dosagens das enzimas FA e GGT (Tabela 4), foi possível

verificar o comprometimento hepático nos animais de todos os grupos, corroborando

com a literatura que afirma que as afecções do cordão umbilical estão entre os

maiores causadores de danos hepáticos, visto que o fígado está ligado diretamente

no umbigo de recém-nascidos (SEINO, 2014).

Avaliação da atividade antimicrobiana, anti-inflamatória e cicatrizante in vivo

do óleo de copaíba

Após avaliação macroscópica da lesão antes e após tratamento, foi possível

visualizar redução do edema e retração das bordas da lesão nos grupos G2 e G3,

grupo tratado com pomada contendo óleo de copaíba a 10% e grupo composto com

animais tratado com óleo de copaíba puro (100%), conforme ilustrado nas Figuras 4

e 5. Estes resultados corroboram com os encontrados por Masson (2011) que testou

o óleo resina de copaíba em úlcera cutânea na região dorsal de ratos e em orelha de

coelhos, no qual o óleo de copaíba a 10% promoveu melhor cicatrização,

estimulando a contração e fibroplasia, acelerou a reepitelização e estimulou a

colagênese.

Figura 4: Animal (6) que recebeu tratamento com pomada contendo óleo de copaíba 10%

Fonte: Arquivo pessoal D0: Início tratamento D11: 11 dias após o início do tratamento

55

Figura 5: Animal (12) que recebeu tratamento com óleo puro

Fonte: Arquivo pessoal D0: inicio tratamento D11: 11 dias após o início do tratamento

Em relação aos resultados do G3, grupo tratado com óleo de copaíba 100%,

fora discordante de Masson (2011) onde esta forma de aplicação se mostrou irritante

ocasionando grave agressão tecidual na úlcera cutânea em orelha de coelhos, não

ocorrendo no umbigo dos bezerros no presente estudo.

Todos os animais do grupo que receberam tratamento com o antibiótico

enrofloxacino (G4) apresentaram melhora clínica, conforme demonstrado na Figura

6, porém ainda apresentavam secreção purulenta no dia 11, sendo necessário

refazer corretamente o tratamento. Isso pode ter ocorrido em função da posologia

utilizada, visto que os funcionários desta fazenda utilizam a padronização de

2,5mg/kg a cada 48 horas para tratamento dos animais, independente da patologia e

posologia indicada para os casos de onfalites é de 2,5mg/kg a cada 24 horas

(CHEMITRIL®, 2016).

Figura 6: Animal (11) que recebeu tratamento convencional com Enrofloxacino

Fonte: Arquivo pessoal D0: inicio tratamento D11: 11 dias após o início do tratamento

56

Embora fosse visualizado melhora clínica em todos os animais de ambos os

grupos, estes animais não estavam curados, necessitando de tratamento em

conjunto com antibióticos após o término dos experimentos (D11).

CONCLUSÕES

De acordo com os achados macroscópico, a aplicação tópica de óleo de

copaíba 100% e pomada a 10% no umbigo de bezerros com onfalites beneficiou o

processo de cicatrização, reduzindo o volume e as bordas da lesão, além de reduzir

secreção purulenta, possivelmente ação cicatrizante e anti-inflamatória, sugerindo

estudos histológicos para sua comprovação.

O óleo de copaíba apresentou atividade antimicrobiana in vitro frente aos

microrganismos Yersinia aldovae, Streptococcus equinus, Tatumella ptyseos,

Erwinia rhapontici, Proteus mirabilis e Staphylococcus caseolyticus isolados de

bezerros neonatos com onfalite.

Sugere que novos estudos sejam realizados buscando forma farmacêutica de

fácil aplicação, visando um novo medicamento fitoterápico para a medicina

veterinária, tendo em vista ação apresentado pelo óleo de Copaifera spp.

Através dos exames hematológicos, foi possível verificar o comprometimento

hepático nos animais de todos os grupos antes e após realizar o tratamento.

57

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60

CONCLUSÕES GERAIS

As bactérias do gênero Streptococcus spp., Staphylococcus spp, Escherichia

coli, e Proteus mirabilis foram os microrganismos predominantes em bezerros

neonatos com onfalite.

A utilização indiscriminada e indevida de antibióticos acarreta resistência em

bactérias presentes em bezerros neonatos com onfalites, que podem comprometer a

saúde animal e humana.

Gentamicina, Florfenicol e Enrofloxacino foram os antibióticos testados mais

eficientes em ação antimicrobiana frente aos agentes isolados de bezerros neonatos

com onfalite.

De acordo com os achados macroscópico, a aplicação tópica de óleo de

copaíba 100% e pomada a 10% no umbigo de bezerros com onfalites beneficiou o

processo de cicatrização, reduzindo o volume e as bordas da lesão, além de reduzir

secreção purulenta, possivelmente ação cicatrizante e anti-inflamatória sugerindo

estudos histológicos para sua comprovação.

O óleo de copaíba apresentou atividade antimicrobiana in vitro frente aos

microrganismos Yersinia aldovae, Streptococcus equinus, Tatumella ptyseos,

Erwinia rhapontici, Proteus mirabilis e Staphylococcus caseolyticus isolados de

bezerros neonatos com onfalite.

Sugere que novos estudos sejam realizados buscando forma farmacêutica de

fácil aplicação, visando um novo medicamento fitoterápico para a Medicina

Veterinária, tendo em vista ação apresentada pelo óleo de Copaifera spp.

Através dos exames hematológicos, foi possível verificar o comprometimento

hepático nos animais de todos os grupos antes e após realizar o tratamento.

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PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU MESTRADO … · A Deus, que me permitiu a inteligência, por me dar força e coragem nos momentos de desânimo. ... numa demonstração