Prospecção de peptídeos bioativos com potencial ......FGF - Fatores de crescimento de fibroblastos HIF-1α - Fator de hipóxia induzido HPLC - High Performance Liquid Chromatography

Universidade Federal de Ouro Preto

Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas – NUPEB

Departamento de Ciências Biológicas

Programa de Pós Graduação em Biotecnologia

Prospecção de peptídeos bioativos com potencial modulatório

sobre a atividade quimotripsina símile do proteassoma 20S

Simone Gonzaga do Carmo

Ouro Preto

2015

Universidade Federal de Ouro Preto

Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas – NUPEB

Departamento de Ciências Biológicas

Programa de Pós Graduação em Biotecnologia

Prospecção de peptídeos bioativos com potencial modulatório

sobre a atividade quimotripsina símile do proteassoma 20S

Autora: Simone Gonzaga do Carmo

Orientador: Prof. Dr. William de Castro Borges

Co-Orientador: Prof. Dr. Marcos Aurélio de Santana

Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação em

Biotecnologia do Núcleo de Pesquisas em Ciências

Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, como

parte integrante dos requisitos para obtenção do título de

Mestre em Biotecnologia, Área de concentração: Genômica e

Proteômica.

Ouro Preto

2015

Catalogação: www.sisbin.ufop.br

C287p Carmo, Simone Gonzaga.

Prospecção de peptídeos bioativos com potencial modulatório sobre a atividade

quimotripsina símile do proteassoma 20S [manuscrito] / Simone Gonzaga

Carmo. - 2015.

97f.: il.: color; grafs; tabs.

Orientador: Prof. Dr. William Castro-Borges. Coorientador: Prof. Dr. Marcos Aurélio Santana.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas - NUPEB. Departamento de Ciências Biológicas. Programa de Pós Graduação em Biotecnologia.

Área de Concentração: Genômica e Proteômica.

1. Inibidores enzimaticos proteoliticos. 2. Peptídeos. 3. Proteômica. I. Castro-Borges, William. II. Santana, Marcos Aurélio. III. Universidade Federal de Ouro Preto. IV. Titulo.

CDU: 606:577.212

Carmo, S.G. Ata Defesa

I

Carmo, S.G. Colaboradores

II

Colaboradores

Prof. Dr. Milton Hércules Guerra de Andrade

Laboratório de Biologia e Tecnologia de Micro-organismos

Carmo, S.G. Auxílio

III

Este trabalho foi realizado no Laboratório de Enzimologia e Proteômica –

ICEB/NUPEB/UFOP, com auxílio da Fundação de Amparo à Pesquisa de Minas Gerais

(FAPEMIG).

Carmo, S.G. Epígrafe

IV

“Por vezes sentimos que aquilo que fazemos não é senão uma gota de

água no mar. Mas o mar seria menor se lhe faltasse uma gota.”

Madre Teresa de Calcutá

Carmo, S.G. Agradecimentos

V

Agradecimentos

A minha mãe, por toda força, carinho, dedicação e apoio.

Obrigada por sempre acreditar em mim e sempre ter feito de tudo para

que as dificuldades se tornassem mais fáceis.

Ao meu pai e irmão pelo carinho.

A Iza, Joel, Lucas e Franciele pelo apoio que nunca me faltou.

Ao Moises pela paciência e incentivo durante todo este tempo.

Ao Prof. Dr. William de Castro Borges pela oportunidade,

orientação, disponibilidade, paciência e confiança. Obrigada por todo

ensinamento, foram muitos e importantes para meu crescimento

acadêmico.

Ao Prof. Dr. Marcos Aurélio de Santana pela co-orientação,

disponibilidade e apoio.

Ao Prof. Dr. Milton Hércules Guerra de Andrade pela

oportunidade e ajuda.

Ao técnico José Henriques Braga Fortes, pela amizade, risadas e

toda ajuda durante esses anos.

Aos colegas do LEP que se tornaram grandes amigos durante esta

caminhada. Leandro, Ananda, Gustavo, Karina, André, Thalita,

Fernanda, Sonaly e os demais que convivi, obrigada por toda

disponibilidade, auxílio, apoio, companheirismo e desabafos.

A Ananda, Leandro e Gustavo, pela grande ajuda na conclusão

deste trabalho, foi fundamental, serei sempre grata.

Ao Zorel pela ajuda e paciência.

Aos laboratórios LBTM e LBBM por permitirem o uso dos

equipamentos para realização do trabalho.

Obrigada a todos que contribuíram de alguma forma para que

este trabalho fosse concretizado.

Carmo, S.G. Índice

VI

Índice

Lista de Figuras ..................................................................................................................... IX

Lista de Tabelas .................................................................................................................... XI

Lista de Abreviaturas .......................................................................................................... XII

Resumo ................................................................................................................................. XIV

Abstract................................................................................................................................. XV

1. Introdução ............................................................................................................................ 1

1.1. Homeostase Proteica .............................................................................................. 1

1.2. Via proteolítica intracelular dependente de Ubiquitina e Proteassoma ................. 3

1.3. Proteassoma 20S .................................................................................................... 6

1.3.1. Montagem do Proteassoma............................................................................ 10

1.3.2. Partículas regulatórias ................................................................................... 11

1.3.2.1. 19S/PA700 .............................................................................................. 12

1.3.2.2. 11S/PA28 ................................................................................................ 13

1.3.2.3. PA200 ..................................................................................................... 14

1.4. Modificações pós traducionais ............................................................................. 14

1.5. Inibidores de Proteassoma.................................................................................... 16

2. Justificativa......................................................................................................................... 22

3. Objetivos ............................................................................................................................. 23

3.1. Objetivo geral ....................................................................................................... 23

3.2. Objetivos específicos ........................................................................................... 23

4. Materiais e Métodos........................................................................................................... 24

4.1. Purificação do proteassoma 20S .......................................................................... 24

4.1.1. Extração de proteínas a partir de fígados de camundongos .......................... 24

4.1.2. Cromatografia por exclusão molecular ......................................................... 25

Carmo, S.G. Índice

VII

4.1.3. Ensaios de atividade peptidásica ................................................................... 25

4.1.4. Cromatografia por afinidade .......................................................................... 26

4.1.5. Eletroforese unidimensional em gel de poliacrilamida ................................. 27

4.1.6. Dosagem de proteínas e ensaios de atividade específica ............................... 28

4.1.7. Identificação das subunidades do proteassoma 20S por espectrometria de

massas ...................................................................................................................... 28

4.2. Ensaios de modulação da atividade do proteassoma 20S a partir dos peptídeos

análogos ao PR-11 ...................................................................................................... 32

4.3. Geração de peptídeos através de tripsinólise de proteínas séricas ....................... 33


obtidos por tripsinólise de proteínas séricas................................................................ 35

4.5. Ensaios de ligação dos peptídeos trípticos ........................................................... 36

4.6. Análise Estatística ................................................................................................ 38

5. Resultados ........................................................................................................................... 39

5.1. Purificação do proteassoma 20S .......................................................................... 39

5.1.1. Primeira etapa cromatográfica: Exclusão molecular em Sephacryl S-400HR

................................................................................................................................. 39

5.1.2. Segunda etapa cromatográfica: Troca iônica em Hidroxiapatita .................. 41

5.1.3. Terceira etapa cromatográfica: Recromatografia por exclusão molecular em

Sephacryl S-400HR ................................................................................................. 43

5.1.4. Ensaio de atividade específica do proteassoma 20S ......................................... 45

5.1.5. Identificação de proteínas por espectrometria de massas .............................. 46


análogos ao PR-11 ...................................................................................................... 53

5.3. Ensaios de modulação da atividade do proteassoma 20S a partir de peptídeos

gerados por tripsinólise de proteínas séricas ............................................................... 55

5.3.1. Ensaios de ligação peptídeos trípticos e proteassoma 20S ............................ 58

6. Discussão ............................................................................................................................. 61

Carmo, S.G. Índice

VIII

7. Conclusões .......................................................................................................................... 70

8. Perspectivas ........................................................................................................................ 72

9. Referência Bibliográfica .................................................................................................... 73

10. Apêndices .......................................................................................................................... 83

10.1. Geração de peptídeos trípticos ........................................................................... 83

10.2. Tabela Suplementar ............................................................................................ 84

Carmo, S.G. Lista de Figuras

IX

Lista de Figuras

Figura 1: Esquema de degradação pela via dependente de ubiquitina e proteassoma. ................. 5

Figura 2: Estrutura do proteassoma 20S de Eucarioto e Archaea ................................................. 7

Figura 3: Apresentação de peptídeos antigênicos gerados por degradação proteassomal. ........... 9

Figura 4: Montagem do complexo proteolítico 20S.. ................................................................. 10

Figura 5: Diversidade das partículas regulatórias do complexo proteassoma 20S ..................... 12

Figura 6: Subunidades de Proteassoma 20S. ............................................................................... 16

Figura 7: Estrutura dos inibidores de proteassoma aprovados pela FDA para uso terapêutico .. 19

Figura 8: Esquema representative da purificação do proteassoma 20S ...................................... 31

Figura 9: Depleção de proteínas em ProteoMiner (BioRad) ....................................................... 34

Figura 10: Obtenção de peptídeos trípticos via tripsinólise de proteínas séricas. ....................... 37

Figura 11: Gráfico das medidas de atividade peptidásica e cromatograma de frações

enriquecidas a 280 nm ................................................................................................................. 39

Figura 12: Perfil eletroforético da fração contendo atividade proteassomal obtida por filtração

em Sephacryl S-400HR ............................................................................................................... 41

Figura 13: Perfil eletroforético das frações obtidas por eluição em Hidroxiapatita. ................... 42

Figura 14: Perfil eletroforético das frações eluídas em Sephacryl S-400 HR ............................. 44

Figura 15: Atividade quimotripsina símile específica ao longo da purificação do proteassoma

20S .............................................................................................................................................. 46

Figura 16: Dados obtidos durante a eluição em espectrômetro de massas dos peptídeos gerados

pela digestão das frações contendo atividade quimitripsina símile do proteassoma 20S e

proteínas ligadas .......................................................................................................................... 48

Figura 17: Espectro de fragmentação do peptídeo m/z: 712.39 da subunidade α5 do proteassoma

20S. ............................................................................................................................................. 52

Figura 18: Atividade quimotripsina símile residual do proteassoma 20S frente à atividade

inibitória de PR-11 e peptídeos análogos .................................................................................... 54

Figura 19: Perfil eletroforético comparativo para avaliação da capacidade do Proteominer® na

depleção de proteínas séricas ...................................................................................................... 56

Carmo, S.G. Lista de Figuras

X

Figura 20: Atividade quimotripsina simile do proteasssoma 20S murino na presença de

peptídeos séricos totais (PST) e MG-132.................................................................................... 57

Figura 21: Contagem de íons e cromatogramas obtidos nos ensaios de ligação de peptídeos

trípticos ao proteassoma 20S ....................................................................................................... 59

Figura 22: Espectro de peptídeos não ligantes (A) e ligantes de proteassoma 20S (B). ............. 60

Figura 23: SDS PAGE 10% para digestão em gel ...................................................................... 83

Carmo, S.G. Lista de Tabelas

XI

Lista de Tabelas

Tabela 1: Sequência e concentrações utilizadas de inibidores de proteassoma 20S .................. 32

Tabela 2: Concentrações utilizadas de inibidores do proteassoma 20S ..................................... 33

Tabela 3: Rendimento Proteassoma 20S ao longo da purificação ............................................. 45

Tabela 4: Identificação de subunidades constituintes do proteassoma 20S ............................... 49

Tabela 5: Identificação de proteínas co-eluídas com o proteassoma 20S .................................. 50

Carmo, S.G. Resumo

XII

Lista de Abreviaturas

ATP - Adenosina trifosfato

BCA - Bicinchoninic acid

Da - Dalton

DTT - Ditiotreitol

DUB - Subunidade desubiquitinadora

E1 - Enzimas ativadoras

E2 - Enzimas conjugadoras

E3 - Enzimas ligases

EDTA - Ethylenediamine tetraacetic acid

FDA - Food and Drugs Administration

FGF - Fatores de crescimento de fibroblastos

HIF-1α - Fator de hipóxia induzido

HPLC - High Performance Liquid Chromatography

HSP - Proteína de choque térmico

Iκβ - Inibidor da NFkβ

INF - Interferons

kDa - kilodalton

M - Molar

mM - Milimolar

mg - Miligramas

MHC I - Complexo de histocompatibilidade de classe I

NFkβ - Fator nuclear kappa β

Nm - Nanômetros

PA700 - Proteasome activator 700 kDa

PAB - Proteasome biogenesis-associated

PAC - Proteasome assembly chaperones

PBS - Phosfate buffered saline

pH - Potencial hidrogeniônico

PI 31 - Protein inhibitor of 31 kDa

PIP - Proteasome interactin proteins

Carmo, S.G. Resumo

XIII

RPN - Regulatory particle non-ATPase

RPT - Regulatory particle ATPase

SDS - Duodecil sulfato de sódio

SDS-PAGE - Eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS

TAP - Transportadores associados ao processamento de antígenos

TFA - Ácido trifluoroacético

TNF α - Fator de necrose tumoral

Tris - Tris (hidroximetil) aminometano

Ub - Ubiquitina

V - Volts

VEGF - Fator de crescimento endotelial vascular

µM - Micromolar

µg - Micrograma

µL - Microlitro

Aminoácido Abreviatura Símbolo

Alanina Ala A

Arginina Arg R

Asparagina Asn N

Aspartato Asp D

Cisteína Cys C

Fenilalanina Phe F

Glicina Gly G

Glutamato Glu E

Glutamina Gln Q

Histidina His H

Isoleucina Ile I

Leucina Leu L

Lisina Lys K

Metionina Met M

Prolina Pro P

Serina Ser S

Tirosina Tyr Y

Treonina Thr T

Triptofano Trp W

Valina Val V

Carmo, S.G. Resumo

XIV

Resumo

A busca de peptídeos bioativos com potencial capacidade de interação e modulação da

atividade proteolítica do proteassoma 20S constitui tema de grande interesse em

biologia celular. O uso de inibidores de proteassoma já vem sendo aplicado no

tratamento de doenças como o câncer, e várias moléculas encontram-se atualmente em

fase de testes clínicos. O presente trabalho teve como objetivos a purificação do

proteassoma 20S e a avaliação do potencial inibitório de peptídeos sobre a atividade

quimotripsina-símile do complexo 20S. Neste intuito duas abordagens distintas foram

utilizadas: 1) análise do potencial inibitório de moléculas análogas ao inibidor de

proteassoma PR-11, e 2) obtenção de novos alvos com capacidade de interação e

modulação da atividade proteassomal por meio de tripsinólise de proteínas séricas. Para

purificação do proteassoma 20S utilizou-se de filtração molecular e troca iônica, as

quais proporcionaram a obtenção de dois perfis distintos do complexo 20S, após análise

por eletroforese unidimensional. A confirmação das identidades das subunidades do

proteassoma e a identificação de proteínas co-eluídas foram realizadas por

espectrometria de massas. Quanto ao potencial inibitório dos análogos do PR-11, foram

selecionados os peptídeos F12, G9F12 e I9F12. Esses demonstraram eficácia nas taxas

de inibição da atividade proteolítica do proteassoma 20S com destaque para o F12 o

qual foi capaz de inibir em cerca de 70 e 53% a atividade quimotripsina símile, quando

utilizado na concentração de 0,25 e 0,125 µM respectivamente. Para a identificação de

novos alvos moduladores de atividade do proteassoma, proteínas séricas foram

digeridas com tripsina seguido de avaliação do potencial inibitório dos peptídeos

resultantes. Os ensaios de atividade demonstraram cerca de 40 e 10% de inibição

quando os peptídeos trípticos totais foram empregados nas concentrações de 50 µM e

6,25 µM, respectivamente. A identificação dos peptídeos trípticos ligantes de

proteassoma por espectrometria de massas necessitará de novas abordagens técnicas

para ligação e recuperação da fração peptídica ligada. Os resultados obtidos neste

trabalho permitiram concluir que análogos estruturais do PR-11 representam moléculas

inibidoras de alta potência e ainda que a técnica de tripsinólise sérica utilizada, é capaz

de fornecer peptídeos alternativos para modulação da atividade proteassomal.

Carmo, S.G. Abstract

XV

Abstract

The search for bioactive peptides endowed with modulatory capability over the activity

of 20S proteasomes is a subject of major interest in cell biology. Proteasome inhibitors

have been applied in the treatment of diseases such as cancer, and several new

molecules are currently under investigation. This study aimed the purification of the

20S murine proteasome and the evaluation of potential inhibitory peptides over its

chymotrypsin-like activity. To accomplish these goals two different approaches were

used: 1) analysis of the inhibitory activity of three PR-11 derivatives, and 2) generation

of new proteasome target molecules through trypsinolysis of serum proteins. 20S

proteasome purification was achieved by gel filtration and ion exchange. These

chromatographic steps resulted in two distinct and highly homogeneous 20S complexes

as judged by one-dimensional gel electrophoresis. Confirmation of the identities for

alpha and beta proteasome subunits and co-eluted proteins was made by mass

spectrometry. The inhibitory potential of three PR-11 analogs F12, G9F12 and I9F12

was then evaluated. These PR-11 derivatives proved to be efficient 20S proteasome

inhibitors highlighting that F12 was able to inhibit approximately 70 and 53% of the

chymotrypsin-like activity when used at a concentration of 0.25 and 0.125 µM

respectively. For the identification of new target modulators of proteasome activity,

serum proteins were digested with trypsin, followed by evaluation of the inhibitory

potency of the resulting peptides. Activity assays showed approximately 40 and 10%

inhibition when total tryptic peptides were used at concentrations of 50 and 6.25 µM,

respectively. The identification of such novel proteasome ligands by mass spectrometry

will require the utilization of new approaches for binding and recovering of the bound

peptide fraction. The results of this study indicate that structural analogues of PR-11

represent inhibitory molecules endowed with high potency and serum trypsinolysis may

offer alternative molecules for modulating proteasome activity.

1. Introdução

Carmo, S.G. Introdução

1

1. Introdução

1.1. Homeostase Proteica

Todas as células utilizam da ação de mecanismos diversos e coordenados que

regulam a homeostase proteica por meio de processos de síntese, degradação e

translocação no interior dos compartimentos celulares (MORIMOTO; CUERVO, 2009).

Alterações nestes mecanismos se relacionam a patogênese de doenças humanas, como

por exemplo, as doenças neurodegenerativas e câncer (BEN-NISSAN; SHARON,

2014). As proteínas constituem os componentes mais dinâmicos da célula, assim, tanto

a síntese quanto a degradação proteica estão envolvidos em diversos processos

celulares. A abundância de proteínas no meio intracelular é regulada de acordo com as

necessidades fisiológicas do meio, o que se torna essencial na manutenção da

viabilidade e funcionalidade celular (JUNG; GRUNE, 2012; MORIMOTO; CUERVO,

2009).

A proteólise é o mecanismo mais comum de degradação envolvido na

homeostase e sua falha pode afetar as funções celulares (TURK, 2006). Este processo

está envolvido no controle de qualidade celular, removendo proteínas anormais

resultantes de mutações, com problemas conformacionais ou que tenham sido

danificadas posteriormente, evitando dessa forma, o acúmulo irregular de proteínas no

interior da célula (MORIMOTO; CUERVO, 2009). Na regulação dos níveis de

proteínas intracelulares estão envolvidas as proteases, um grupo de enzimas de extrema

importância, com função catalítica realizada através da hidrólise de ligações peptídicas

(TURK, 2006).

As proteases representam cerca de 2% do total de proteínas celulares, estão

adaptadas a condições variadas em organismos complexos (TURK, 2006), desenvolvem

papéis diversos e com alto grau de especificidade aos substratos, abrangendo desde

funções digestivas à remoção de proteínas danificadas e, resultando consequentemente,

em amplas implicações biológicas e vitais (EHRMANN; CLAUSEN, 2004). Outro

princípio referente às proteases ainda, é a forma na qual são encontradas no meio

intracelular, isto é, algumas proteases se apresentam na forma de zimogênio, forma


2

precursora inativa da enzima, até que sejam convertidas em enzimas ativas por meio de

hidrólise (KOBLINSKI; AHRAM; SLOANE, 2000; TURK, 2006). Como exemplo,

tem-se a tripsina, sintetizada na forma de tripsinogênio, forma latente, a qual é ativada

pela clivagem proteolítica (EHRMANN; CLAUSEN, 2004; LAZURE, 2002).

As enzimas podem ser classificadas de acordo com a posição da ligação

peptídica a ser clivada e com o mecanismo de ação nos sítios catalíticos. Quando a

protease realiza a hidrólise nas porções C-terminal ou N-terminal, são denominadas

exopeptidases, enquanto aquelas que realizam a clivagem na região interna são

denominadas endopeptidases. Já a classificação de acordo com os sítios ativos é

dividida em cinco grupos: serino-proteases, cisteíno-proteases, treonino-proteases,

metalo-proteases e aspártico-proteases (KOBLINSKI et al., 2000; TURK, 2006).

Muitas proteases degradam o substrato de forma independente, outras,

encontram-se envolvidas em vias de degradação que necessitam de diversas etapas para

que ocorra a degradação do substrato (TURK, 2006). Dessa forma, durante a evolução,

diversas formas de degradação foram desenvolvidas, sendo o primeiro sistema de

degradação intracelular descrito, o endossômico-lisossoma, no qual as proteínas são

endocitadas e degradadas por catepsinas lisossomais (DE DUVE, 1983; DE DUVE et

al., 1955). Mais tarde, na década de 70, foi descrita uma das mais importantes rotas de

degradação, a via intracelular dependente de ubiquitina e proteassoma (UPS – Ubiquitin

Proteasome System), que pode ser encontrada tanto no citosol quanto no núcleo das

células eucarióticas. A compartimentalização desta faz com que ela seja crucial na

biologia celular, e que se diferencie em relação à via lisossomal, que por sua vez realiza

a degradação no interior de organelas (ETLINGER; GOLDBERG, 1977). A via

proteolítica é constituída pelo proteassoma 26S (~ 2,5 MDa), o qual é formado por dois

subcomplexos: o proteassoma 20S e a partícula regulatória 19S ligada as extremidades

do centro catalítico 20S (JUNG; CATALGOL; GRUNE, 2009; LOWE et al., 1995;

STADTMUELLER; HILL, 2011).


3

1.2. Via proteolítica intracelular dependente de Ubiquitina e Proteassoma

A via proteolítica mediada por ubiquitina e proteassoma é o principal sistema de

degradação dependente de ATP, exerce funções como a degradação de proteínas

inativas e controle de qualidade de proteínas recém-sintetizadas, estando assim,

envolvido na regulação do ciclo celular, expressão de genes, respostas imune e de stress,

reparo do DNA e carcinogênese (JUNG; GRUNE, 2012). Cerca de 70% a 90% das

proteínas inativas ou que não são mais necessárias no meio celular, são direcionadas a

fim de serem degradadas pela mesma (ROCK et al., 1994). Em mamíferos, o

proteassoma, que é uma protease multicatalítica constituinte da via, pode representar

1% das proteínas totais em células hepáticas e renais, e pode ainda, ser encontrado tanto

no citosol quanto no núcleo celular, no retículo endoplasmático e em associação ao

citoesqueleto (JUNG; GRUNE, 2012; PETERS, 1994).

A alta especificidade da via é resultado da utilização de um sistema de marcação

das proteínas inativadas ou mal formadas, que utiliza a ubiquitina (Ub) como

modificação pós-traducional. A ubiquitina é uma proteína constituída por 76

aminoácidos com massa de 8 kDa, altamente conservada nas diversas espécies

(KOMANDER; RAPE, 2012). O processo de ubiquitinação dos substratos alvos

envolve uma cascata de reações e ocorre por intermédio de outras três enzimas ligases

com funções de ativação, conjugação e transferência. O primeiro passo envolve a

ativação da Ub, por meio da enzima ativadora E1, a qual se liga a porção carboxila da

mesma gerando consumo de ATP. Em seguida, a molécula de Ub é transferida para o

resíduo de lisina da enzima E2 responsável pela conjugação que atua junto a enzima

ligase E3, a enzima específica do processo que tem função de reconhecimento do

substrato. Com a identificação da proteína alvo, a enzima E3 irá realizar a adição do

monômero de ubiquitina na porção N-terminal do resíduo lisina do substrato direta ou

indiretamente (DESHAIES; JOAZEIRO, 2009; MATYSKIELA; MARTIN, 2013). A

adição é feita de forma direta ou indireta ao substrato devido a existência de duas

famílias com domínios distintos de enzimas E3, sendo elas o domínio denominado E3

Ring Finger e o domínio E3 HECT (homologous to E6AP C-terminus). A E3 Ring

Finger realiza a transferência de forma direta, isto é, da E2 para o substrato. Já o

domínio E3 HECT é responsável pela adição indireta, realizando assim, uma ligação


4

intermediária com a Ub, para depois adicioná-la ao substrato (GLICKMAN;

CIECHANOVER, 2002). O processo é repetido sucessivamente, formando assim uma

cadeia de poli-ubiquitinas que serão reconhecidas no processo de degradação

(MATYSKIELA; RODRIGO-BRENNI; MORGAN, 2009).

Ao serem modificadas com uma cadeia constituída de ao menos quatro

moléculas de Ub, os substratos ubiquitinados são reconhecidos por subunidades da

partícula 19S. Em seguida, é realizada a remoção das Ub por subunidades

desubiquitinadoras (DUB) e por fim, o desenovelamento através das subunidades

ATPases (LOWE et al., 1995; STADTMUELLER; HILL, 2011). O processo de

desenovelamento é importante para que os sítios de clivagem do substrato se tornem

acessíveis ao proteassoma. Após tais processos, o substrato é direcionado ao centro

catalítico através de uma abertura presente nas extremidades do proteassoma 20S, para

que ocorra então, a degradação por meio de hidrólises sucessivas. Os produtos típicos

gerados pela degradação proteassomal são oligopeptídeos de 2 a 35 aminoácidos

(Figura 1) (BHATTACHARYYA et al., 2014; WEISSMAN; SHABEK;

CIECHANOVER, 2011).


5

Figura 1: Esquema de degradação pela via dependente de ubiquitina e proteassoma. A ubiquitina é

ativada pela enzima ativadora E1 (1), e transferida para a enzima conjugadora E2 (2), que se liga a E3

juntamente com o substrato, transferindo a ubiquitina para este (3). Sucessivas moléculas podem ser

conjugadas formando a cadeia de poliubiquitinas (4). O substrato ligado a cadeia de poliubiquitina é

reconhecido pelas subunidades do proteassoma 26S, degradado em peptídeos (5) e a cadeia de ubiquitina

é removida pela DUB e reciclada (6). Fonte: Adaptado de CIECHANOVER (2005).

Normalmente, para que a degradação ocorra através do sistema proteassomal, é

importante que as ubiquitinações de substratos ocorram por meio de conjugação da

ubiquitina via resíduos de lisina 48 (K48). Após o processo de ubiquitinação e

direcionamento do substrato ao proteassoma, as Ub são recicladas por DUBs e podem


6

ser utilizadas em um novo processo de marcação (KOMANDER; RAPE, 2012;

WEISSMAN et al., 2011). Recentemente, foi demonstrado também, que o proteassoma

é capaz de degradar proteínas de forma independente à presença de marcação por

ubiquitina. O requisito principal para este tipo de degradação é a presença de uma

região desestruturada no substrato devido a oxidação, mutação, envelhecimento ou

mesmo regiões desdobradas (ASHER et al., 2005; BEN-NISSAN; SHARON, 2014).

1.3. Proteassoma 20S

O centro catalítico da via proteassomal, proteassoma 20S, recebe tal

denominação devido ao seu coeficiente de sedimentação, sendo a nomenclatura

proposta por ARRIGO et al. (1988). O proteassoma 20S (~ 700 a 750 kDa) possui

estrutura conservada e similar entre as espécies, variando apenas entre as funções

catalíticas principais ou subunidades constitutivas. É composto por 28 subunidades com

massas variando de 20 a 30 kDa, que constituem dois anéis α com função estrutural e

dois anéis β com funções catalíticas, arranjados de forma sobreposta gerando uma

estrutura cilíndrica α-β-β-α com cerca de 100 x 160 Å (JUNG; GRUNE, 2012).

Os anéis α e β são constituídos por sete subunidades cada um, sendo codificados

um único tipo de subunidade α e um único tipo de subunidade β em Archaebacteria e

Eubacteria, enquanto em Eucariotos, as subunidades são codificadas por 14 genes

distintos (Figura 2) (KISH-TRIER; HILL, 2013). Três das sete subunidades β possuem

resíduos ativos de treonina (Thr-1) localizados na porção amino-terminal, os quais são

responsáveis pelo ataque catalítico de ligações peptídicas, já que a hidroxila da cadeia

lateral do grupo Thr-1 age como nucleófilo sobre as ligações peptídicas do substrato

(JUNG; GRUNE, 2012; LUPAS; KOSTER; BAUMEISTER, 1993). As principais

subunidades catalíticas do proteassoma 20S são β1, β2, e β5, que se associam a

atividades distintas, sendo elas: β1 semelhante à caspase, clivando ligações peptídicas

após aminoácidos ácidos, β2 associada a atividade semelhante à tripsina, clivando

ligações peptídicas após aminoácidos básicos e β5 a atividade semelhante à

quimotripsina, clivando ligações peptídicas após aminoácidos hidrofóbicos (TANAKA,

KEIJI, 2013).


7

Figura 2: Estrutura do proteassoma 20S de Eucarioto e Archaea. A figura mostra o modelo básico de

proteassoma 20S, à esquerda o proteassoma eucarioto composto por diferentes subunidades α e β,

enquanto à direita, o proteassoma procarioto, possui apenas um tipo de subunidade α e um tipo de

subunidade β. Adaptado de JUNG; GRUNE (2012).

As subunidades α, com função estrutural, possuem sequências N-terminais que

se projetam para o centro do anel, formando assim, uma rede que restringe o acesso do

substrato à cavidade interna (GALLASTEGUI; GROLL, 2010). Após o contato com o

substrato, a conformação das subunidades α é induzida, de forma a controlar e regular o

acesso do mesmo ao canal. A restrição ao canal é induzida pelas porções N-terminais

das subunidades α2, α3 e α4, porém outra forma de modulação da entrada de substratos,

são as partículas regulatórias, que requer um rearranjo das subunidades α e exercem a

especificidade no reconhecimento destes (GROLL et al., 2000; JUNG; GRUNE, 2012).

Subunidades constitutivas do proteassoma 20S podem ainda ser modificadas

através da indução dos Fatores de necrose tumoral (TNF α) e Interferons (INF γ)

(GACZYNSKA; ROCK; GOLDBERG, 1993), o que proporciona um aumento na

complexidade de sua composição (KNIEPERT; GROETTRUP, 2014). Tal indução

pode ocorrer nos proteassomas constitutivos recém sintetizados, em praticamente todos

os tecidos em resposta a estímulos específicos, tais como processos virais, fúngicos ou

infecção bacteriana. Diante da indução, a nova forma de proteassoma gerada é

denominada imunoproteassoma e este pode realizar funções na regulação da homeostase

e ciclo celular, processos metabólicos como o proteassoma constitutivo, bem como a


8

apresentação de antígenos mediada pelo complexo de histocompatibilidade de classe I

(MHC I) (LIEPE et al., 2014). Quando a indução ocorre, as subunidades β catalíticas

ativas dos proteassomas recém sintetizados são substituídas por subunidades homólogas

denominadas β1i (LMP2), β2i (MECL-1), e β5i (LMP7) que são incorporadas ao

mesmo. Em células expostas ao INF γ, a expressão das novas subunidades aumenta de

acordo com o aumento de moléculas induzidas pelo INF γ (GROETTRUP; KIRK;

BASLER, 2010; KNIEPERT; GROETTRUP, 2014). A substituição também altera a

especificidade catalítica do imunoproteassoma, onde a subunidade homóloga LMP2

favorece a clivagem de peptídeos após resíduos hidrofóbicos (atividade semelhante à

quimotripsina), o que garante os requisitos de ligação ao sítio de MHC I, que no caso de

humanos, se liga a resíduos básicos e hidrofóbicos, enquanto em camundongos, se liga

apenas em resíduos hidrofóbicos. O imunoproteassoma não é capaz de criar um grande

fluxo de ligantes de MHC I a ponto de produzir uma reposta completa e independente,

porém são capazes de produzir epítopos exclusivos que exercem papel importante no

processo. As hipóteses da utilização do imunoproteassoma pela via MHC I são de que

diferentes complexos de proteassomas produzidos em diferentes células podem produzir

diferentes peptídeos, garantindo assim o processamento dos antígenos de formas

diversas (KHAN et al., 2001).

A degradação de proteínas via proteassoma ou imunoproteassoma, libera

diversos peptídeos no citosol, mitocôndria e núcleo celular, sendo que os mesmos

podem exercer funções como a apresentação de antígenos, regulação de funções

celulares, metabolismo, transcrição gênica, sinalização celular, entre outras (FERRO;

HYSLOP; CAMARGO, 2004). Os produtos gerados por meio do imunoproteassoma,

normalmente contendo de 8 a 10 aminoácidos, penetram no lúmen do retículo

endoplasmático através de transportadores associados a processamento de antígenos

(TAP) dependentes de ATP. O peptídeo é então complexado ao MHC I e o complexo

formado, é secretado para fora da célula a fim de serem apresentados às células T CD8+

(Figura 3) (GACZYNSKA et al., 1993). Outro papel reconhecido no que se refere aos

peptídeos livres no citosol, é que estes produtos proteassomais podem ainda se tornar

substrato de outras peptidases intracelulares, já que são rapidamente reduzidos a

aminoácidos, e servem também como matéria prima para síntese de novas proteínas,

tendo em vista que muitas vezes a oferta de aminoácidos exógenos é limitante


9

(ORLOWSKI, 1993). Os peptídeos gerados pela degradação proteassomal ainda, são

capazes de se ligarem a outras proteínas e atuarem como inibidores ou ativadores de

enzimas, modulando as atividades enzimáticas por competitividade (FRUITIER-

ARNAUDIN et al., 2002).

Figura 3: Apresentação de peptídeos antigênicos gerados por degradação proteassomal. As

proteínas são degradadas pelo imunoproteassoma gerando peptídeos que serão transportados ao retículo

endoplasmático por intermédio do transportador TAP, processo no qual, ocorre dependente de hidrólise

de ATP. O peptídeo se liga ao MHC I, são transportados até a membrana celular, onde são apresentados

para as células T CD8+. Adaptado de YEWDELL; REITS; NEEFJES (2003).

Devido à sua importância, o proteassoma de diversos organismos já foram

utilizados para estudo, como por exemplo o proteassoma de Termoplasma acidophilum


10

(DAHLMANN et al., 1989), Leishmania mexicana (ROBERTSON, 1999),

Trypanossoma cruzi (DE DIEGO et al., 2001) e Schistosoma mansoni (CASTRO-

BORGES et al., 2007; GUERRA-SA et al., 2005).

1.3.1. Montagem do Proteassoma

A montagem do proteassoma em organismos eucariotos exige um processo

bastante regulado a fim de garantir que todas as subunidades sejam acopladas

corretamente, já que este possui subunidades com funções distintas. Os componentes

são montados e desmontados, de forma que os níveis de proteassoma aumentam em

resposta ao estresse, o que em longo prazo exige a remoção de proteínas inativas ou que

não são mais necessárias (JUNG; GRUNE, 2012). Dessa forma, o processo é

coordenado por diversas “chaperonas de montagem do proteassoma” a fim de evitar

oligomerizações inespecíficas, as mesmas são conhecidas como PAC (proteasome

assembly chaperones) no caso de humanos e Pab (proteasome biogenesis-associated)

em leveduras (MURATA; YASHIRODA; TANAKA, 2009).

Figura 4: Montagem do complexo proteolítico 20S. As subunidades α e β são unidas por meio da

mediação de chaperonas em forma dímeros e da proteína UMP1. Ao final do processo de montagem, os

complexos mediadores são degradados. Fonte: Adaptado de MURATA et al. (2009).

As chaperonas formam os heterodímeros PAC1-PAC2 e PAC3-PAC4, formas

nas quais, se encontram estáveis (MURATA et al., 2009). O primeiro está envolvido no

acoplamento do anel α, de onde é iniciada a montagem do proteassoma, e o segundo

heterodímero, envolvido no acoplamento das subunidades β. O heterodímero PAC1-


11

PAC2 liga-se as subunidades α5 e α7 inicialmente, e em seguida incorpora as demais

subunidades α, gerando o anel. Por fim, PAC3-PAC4 dá início a incorporação das

subunidades β uma a uma, iniciando pela β2, β3 e β4, gerando o complexo 13S. As

demais subunidades β são incorporadas, formando um complexo intermediário

denominado “half proteasome” proteoliticamente inativo (FRENTZEL et al., 1994;

HIRANO et al., 2005; MURATA et al., 2009).

Por intermédio do fator de maturação denominado UMP1 (Ubiqutin-mediated

proteolysis), dois complexos “half proteasome” são unidos gerando o proteassoma 20S.

Dada a formação do centro catalítico, a UMP1 é degradada como primeiro substrato do

proteassoma recém formado, em seguida, os heterodímeros PAC1-PAC2 e PAC3-PAC4

também são degradados (Figura 4) (JUNG; GRUNE, 2012).

1.3.2. Partículas regulatórias

A fim de prevenir a degradação proteica de forma descontrolada ou desregulada

no meio intracelular, um conjunto de partículas regulatórias surgiu durante a evolução,

com funções nos processos de reconhecimento e degradação dos substratos proteicos

(JUNG; GRUNE, 2012). A atividade do proteassoma 20S pode ser modulada e

determinada por interações com proteínas reguladoras. Em revisão recente, foi

demonstrado que cerca de 50% do proteassoma 20S são encontrados na forma livre,

enquanto aproximadamente 30% são associados à partícula regulatória 19S, sendo o

restante associado a outras partículas como o 11S ou PA200 (BEN-NISSAN;

SHARON, 2014). A diversidade destas moléculas é ampla, de tal forma que os vários

reguladores possuem estruturas, funções e mecanismos de ação distintos e variados

(JUNG; GRUNE, 2012; STADTMUELLER; HILL, 2011).


12

Figura 5: Diversidade das partículas regulatórias do complexo proteassoma 20S. A) Partícula

regulatória 19S ou PA700 (substratos ubiquitinados); B) 11S ou PA28αβ (imunoproteassoma); C) 11S ou

PA28γ; D) PA200. Adaptado de BOUSQUET-DUBOUCH et al. (2011).

1.3.2.1. 19S/PA700

Dentre as diversas partículas regulatórias temos a 19S, também conhecida como

PA700 (Figura 5A), que associado às extremidades do centro catalítico 20S forma o

proteassoma 26S. O 19S exerce diversas funções na regulação do proteassoma 26S,

dentre elas, coordena o processo de degradação através do reconhecimento de substratos

poliubiquitinados, removendo as Ub’s, desenovelando e translocando-os para o interior

do complexo 20S, onde serão degradados em oligopeptídeos (GLICKMAN;

CIECHANOVER, 2002; TANAKA, K., 2009).

A partícula regulatória 19S possui massa molar de aproximadamente 700 kDa, e

é dividida em dois compartimentos que são denominados “tampa” que tem como

funções principais a desubiquitinação dos substratos, e a “base”, responsável pelo

desenovelamento do substrato e abertura do canal que dará acesso ao centro catalítico

(COUX; TANAKA; GOLDBERG, 1996). O sub-complexo base é composto por 10

subunidades no total, sendo divididas entre seis subunidades ATPases (Rpt1-6) as quais

formam um anel nas extremidades das subunidades α do proteassoma 20S e quatro

subunidades não-ATPase (Rpn1 e Rpn2, Rpn10 e Rpn13). Já a tampa contém nove

subunidades não-ATPase (Rpn3, Rpn5–Rpn9, Rpn11, Rpn12, e Rpn15) (JUNG;

GRUNE, 2012).

Dentre as subunidades, destacam-se a Rpn10 e Rpn13, responsáveis pelo

reconhecimento e remoção de Ub, sendo que a Rpn10 se localiza entre a base e a tampa

e é conhecida também por estabilizar a ligação entre ambas (VERMA et al., 2002).

Ainda, as subunidades Rpt2, Rpt3 e Rpt5 são responsáveis pela abertura das


13

subunidades α do proteassoma 20S (LANDER; MARTIN; NOGALES, 2013). Após o

processo de remoção das cadeias de poli-ubiquitinas as enzimas desubiquitinadoras

(DUBs) realizam hidrólises liberando as moléculas de ubiquitina para que sejam

reaproveitadas posteriormente (GLICKMAN; CIECHANOVER, 2002).

1.3.2.2. 11S/PA28

Assim como as subunidades β1i (LMP2), β2i (MECL-1), e β5i (LMP7) são

induzidas pelo IFN-γ, a associação do proteassoma 20S a partículas regulatórias

também podem sofrer tal indução. O 11S também denominado PA28, é uma importante

partícula regulatória que possui em organismos eucariotos três diferentes isoformas α, β

e γ (RECHSTEINER; HILL, 2005), sendo que as duas primeiras, são altamente

conservadas e estão envolvidas com a produção de peptídeos ligantes de MHC I

(JUNG; GRUNE, 2012).

O PA28αβ (Figura 5B) é um complexo heteroheptamérico estável formado pelo

PA28α e PA28β, descrito pela primeira vez em células de sangue de mamíferos

(LUPAS et al., 1993), possui localização preferencialmente citoplasmática e massa

molecular aproximada de 200 kDa. O complexo se associa de forma reversível às

subunidades α do proteassoma 20S formando o imunoproteassoma cuja associação é

induzida também pelo IFN-γ (JUNG; GRUNE, 2012; SONG et al., 1996). Os

heptâmeros PA28α e PA28β isolados são instáveis, porém o PA28α foi capaz de

estimular a atividade do proteassoma 20S in vitro, ao contrário do PA28β (JUNG;

GRUNE, 2012; LI; RECHSTEINER, 2001). Esta partícula regulatória ainda é a

responsável pela origem do proteassoma híbrido, junto a partícula regulatória 19S,

possibilitando a difusão de pequenos substratos ou polipeptídeos desestruturados, uma

vez que o ativador 11S atua de forma independente de ATP (GROETTRUP et al.,

2010). Ao contrário do proteassoma 26S, o imunoproteassoma não degrada proteínas

intactas e de alta massa molecular, este exerce o papel de hidrólise apenas em moléculas

menores, o que sugere um efeito cooperativo entre o proteassoma e o

imunoproteassoma, onde por exemplo, os produtos gerados pelo proteassoma, podem

vir a ser degradados posteriomente pelo imunoproteassoma (DUBIEL et al., 1992;

GLICKMAN; CIECHANOVER, 2002).


14

Já o PA28γ (Figura 5C) possui localização nuclear e massa molecular de

aproximadamente 31 kDa. Alguns trabalhos relacionam o PA28γ ao estímulo da

atividade semelhante à tripsina (JUNG; GRUNE, 2012; REALINI et al., 1997),

enquanto outros, já o relacionam as outras três atividades proteolíticas do proteassoma

20S (WILK; CHEN; MAGNUSSON, 2000).

1.3.2.3. PA200

O PA200 (Figura 5D) presente em humanos, também conhecido como Blm10

em leveduras, é um ativador do proteassoma 20S bem conservado, semelhante em

ambas espécies, com massa molecular de aproximadamente 250 kDa. O mesmo é capaz

de formar complexos híbridos junto a outros ativadores, ligados a extremidades opostas

(SCHMIDT; FINLEY, 2014). Assim como outros ativadores, o PA200 estimula a

hidrólise de pequenos peptídeos apenas, uma vez que a passagem de proteínas íntegras

através do canal é impossibilitada (RECHSTEINER; HILL, 2005; STADTMUELLER;

HILL, 2011). Estudos vêm mostrando o envolvimento do PA200 no reparo do DNA e

de danos oxidativos, embora suas funções fisiológicas e mecanismos não sejam ainda

bem descritos (SCHMIDT; FINLEY, 2014).

1.4. Modificações pós traducionais

As modificações pós traducionais constituem um importante mecanismo

envolvido na montagem de proteassomas, diversificação funcional, modulação da

atividade proteolítica, estabilidade, tempo de meia vida, preferência do substrato e

localização celular. O avanço das tecnologias na área de proteômica tem possibilitado a

caracterização sistemática da regulação do proteassoma via modificações pós

traducionais, sendo já identificada uma ampla gama de modificações, situada em sítios

diversos e com diferentes funções. Entre as modificações já descritas para as

subunidades do proteassoma estão, por exemplo, a fosforilação, acetilação, oxidação,

glicosilação, ubiquitinação e sumorilação (SCRUGGS et al., 2012).


15

As modificações podem ocorrer de formas distintas, sendo reversíveis ou

irreversíveis. Nas modificações irreversíveis, pode ocorrer a clivagem do proteassoma

por outras proteases por exemplo. Já como exemplo de modificação reversível, uma das

mais estudadas é a fosforilação. Esta é encontrada em diversas subunidades, sendo

associada à montagem do proteassoma 26S quando associadas a Rpt6 (SATOH et al.,

2001) e α7 (BOSE et al., 2004) e à atividade catalítica quando presente nas subunidades

Rpt5 (UM et al., 2010), Rpt6 (ZHANG et al., 2007), α4 (LIU et al., 2006), α3 e α2

(FENG; LONGO; FERRIS, 2001). Outra modificação é a acetilação N-terminal das

subunidades, que em proteassoma cardíaco de camundongos demonstrou relação com a

estabilidade, função e degradação do mesmo (GOMES et al., 2006). A acetilação foi

descrita em diversas subunidades tanto do centro catalítico 20S quanto da partícula

regulatória 19S, e trabalhos que utilizaram lisados de cérebro de pacientes portadores da

Doença de Alzheimer’s sugeriram relação entre a acetilação do proteassoma com

doenças neurodegenerativas (GILLARDON et al., 2007).

Modificações do tipo O-glicosilação demonstraram inibir a atividade do

proteassoma 26S, através da regulação da atividade da subunidade Rpt2 do 19S

(ZHANG et al., 2003). As modificações oxidativas por sua vez, são prejudiciais na

função proteolítica. O aumento de modificações do tipo oxidativas presentes em

proteassoma, vem sendo relacionado a isquemias (BULTEAU et al., 2001) e

cardiomiopatias (PREDMORE et al., 2010). Em revisão por SCRUGGS et al. (2012), é

possível observar uma série de modificações pós traducionais encontradas em

proteassoma cardíaco, descritas na literatura de acordo com o sítio de ligação, bem

como suas funções e abordagem proteômica utilizada para identificação das mesmas.

Em trabalho realizado por CASTRO-BORGES et al. (2007), é mostrada a diversidade

de proteassomas encontrados a partir de extrato purificado de Schistosoma mansoni

(Figura 6A), assim como em ZONG et al. (2008), que avaliou proteassoma murino

(Figura 6B). Em ambos, foram observados uma heterogeneidade de isoformas para as

diversas subunidades, sugerindo estas serem originadas de modificações pós

traducionais (CASTRO-BORGES et al., 2007; ZONG et al., 2008).


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Figura 6: Subunidades de Proteassoma 20S. A) Diversidade estrutural do proteassoma 20S de S.

mansoni: Heterogeneidade de isoformas para as diferentes subunidades do proteassoma 20S de formas

adultas do verme; B) Diversidade estrutural do proteassoma 20S murino. Adaptado de CASTRO-BORGES

et al. (2007) e ZONG et al. (2008).

Além disso, um dos importantes mecanismos da regulação da proteólise é a

interação do proteassoma com proteínas intracelulares, as chamadas PIP (Proteasome

interactin proteins). Diversos estudos utilizando purificação e espectrometria de massas

têm sido desenvolvidos para compreender as funções e realizar um mapeamento de tais

interações (WANG; HUANG, 2008). Essas proteínas podem ser classificadas em dois

grupos: o primeiro grupo como fatores proteicos relacionados ao sistema de

ubiquitinação, e o segundo grupo como fatores auxiliares que regulam a função do

proteassoma (TANAKA, K., 2009). O desafio na identificação de moléculas que se

associam ao proteassoma refere-se à distinção entre componentes transitórios e

componentes estáveis, uma vez que o método de purificação por afinidade tradicional

pode vir a preservar interações transitórias. Em trabalho realizado utilizando o método

SILAC, o qual consiste na utilização de isótopo estável, foram encontradas cerca de 110

proteínas, as quais consistiam em proteínas de choque térmico (heat shock), histonas,

ubiquitina, fatores de elongação, entre outros ligados ao proteassoma 26S (WANG;

HUANG, 2008).

1.5. Inibidores de Proteassoma

Devido ao envolvimento do proteassoma em processos imunológicos e

fisiológicos diversos, bem como na manutenção da homeostase celular, o uso de


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inibidores de proteassoma vêm sendo empregado como potencial alvo terapêutico em

muitas patologias. Ao serem utilizados, são capazes de induzir por exemplo, a apoptose

de células tumorais, o que ocorre, devido a importância do complexo nos processos

celulares. Os inibidores vêm demonstrando eficácia no tratamento de mieloma múltiplo

e linfoma, e diversas moléculas estão sendo avaliadas para o tratamento de várias

doenças malignas (RUSCHAK et al., 2011).

Os efeitos biológicos induzidos pelo tratamento das células com inibidores do

proteossoma são diversos, e dependem do tipo de célula, nível de proliferação, natureza

e quantidade de inibidor utilizado, bem como seu tempo de exposição (GROLL;

HUBER, 2004). Exemplos do efeito do uso de inibidores podem ser destacados, como

por exemplo, na progressão do ciclo celular. Para que ocorra a progressão do ciclo

celular, é necessária a síntese e degradação de ciclinas, moléculas estas, que constituem

alvo de degradação proteassomal. Dessa forma, dado o uso de inibidores de

proteassoma, a progressão do ciclo se torna impossibilitada, uma vez que não ocorrerá

degradação de ciclinas (KING et al., 1996). Quando inibida, a proliferação de células

tumorais é comprometida, dessa forma, o uso de inibidores de proteassoma torna-se útil

em doenças dependentes da intensa divisão celular. Trabalhos que utilizaram células de

diferentes tipos de cânceres para o tratamento com o uso de inibidores, demonstraram

uma rápida apoptose, e ainda, de forma seletiva às células mutadas, o que se torna

benéfico frente a preocupação dos possíveis danos citotóxicos que o uso destes

inibidores poderiam causar em células normais (KISSELEV; GOLDBERG, 2001).

Outro exemplo ainda é a influência na atividade do p53, conhecido por

desenvolver importante papel no controle do ciclo celular, reparo do DNA e indução da

apoptose celular. Em situações de estresse, como no dano do DNA, a proteína p53

bloqueia o ciclo celular, podendo levar ao reparo ou a apoptose. Sendo esta proteína

alvo de degradação pelo proteassoma, e dada a inibição da atividade deste, ocorrerá por

sua vez, um acúmulo de p53 e consequente apoptose (PAGANO et al., 1995). A

degradação de proteínas alteradas relacionadas com o ciclo celular, desequilíbrio de

proteínas apoptóticas e pró-apoptóticas, inibição da angiogênese, reparo do DNA

também tem sido relacionadas a contribuição para o efeito de apoptose no uso de

inibidores de proteassoma em células tumorais (KISSELEV; VAN DER LINDEN;

OVERKLEEFT, 2012).


18

Os inibidores do proteassoma incluem moléculas que podem se dividir em

diferentes classes, (RUSCHAK et al., 2011), sendo elas: peptídeos aldeídicos, peptídeos

vinilsulfonas, peptídeos boronatos, peptídeos epoxicetonas, peptídeos semicarbazonas,

sirbactinas, beta-lactonas, falvonóides, triterpenóides, derivados de enxofre, derivados

de TMC-95, peptídeos naturais, pseudo-peptídeos e por fim, compostos organo-

metálicos (DE BETTIGNIES; COUX, 2010). Estes compostos se diferenciam além da

sua estrutura, na forma de interação, atuando diretamente no sítio catalítico por

competitividade ou alostericamente, e podem ainda realizar ligações dos tipos

reversíveis ou irreversíveis (RUSCHAK et al., 2011).

Os inibidores do tipo aldeídicos são clássicos, dando origem a partir deles, a

diversos outros inibidores. O MG-132 (Z-LLL-al) é um exemplo de inibidor reversível

da subunidade β5 do proteassoma 20S, possui capacidade de entrada rápida na célula,

alta taxa de dissociação, permite que seus efeitos sejam revertidos após sua remoção,

dessa forma, é um dos inibidores mais utilizados nos estudos relativos as funções e

mecanismos do proteassoma (DE BETTIGNIES; COUX, 2010; GOLDBERG, 2012;

ROCK et al., 1994). O uso do inibidor MG-132 demonstrou papel preventivo na

transformação de formas tripomastigotas de Trypanossoma cruzi em amastigotas em

estudo realizado por GONZALEZ et al. (1996). Em Entamoeba invadens e Entamoeba

histolitica, os inibidores MG-132 e Lactocistina bloquearam o crescimento do parasito e

previniram encistação (MAKIOKA et al., 2002), assim como em Leishmania mexicana

(ROBERTSON, 1999). Após incubação de formas larvais de Schistosoma mansoni,

seguido de infecção de camundongos, o MG-132 comprometeu a transição da fase de

cercária a esquistossômulo (GUERRA-SA et al., 2005).

Dentre os inibidores competitivos tem-se o Bortezomib (Velcade), um

dipeptídeo do tipo boronato (Figura 7A) o qual se liga de forma reversível à subunidade

β5 do proteassoma 20S. O Bortezomib foi o primeiro inibidor de proteassoma aprovado

para o uso em humanos no tratamento de mieloma múltiplo e linfoma pela Food and

Drugs Administration (FDA) em 2003 (FISHER et al., 2006; RICHARDSON et al.,

2003). Seu efeito de inibição está envolvido com o rompimento da adesão celular, da

supressão da atividade do NFκβ (DEMO et al., 2007; HIDESHIMA et al., 2002) e da

inibição da angiogênese (DEMO et al., 2007; ROCCARO et al., 2006). Em 2012, outro

inibidor de proteassoma passou a ser comercializado para o tratamento da mesma


19

doença, o PR-171, conhecido como Carfilzomib (Figura 7B), um tetrapeptídeo do tipo

epoxicetona, que se liga também ao resíduo de treonina da subunidade β5 de

proteassomas constitutivos e imunoproteassomas, porém de forma irreversível (KUHN

et al., 2007; PARLATI et al., 2009). O seu uso quando comparado ao Bortezomib é

considerado mais seletivo, visto que exerce pouca ou nenhuma atividade sobre outras

proteases, além de promover o acúmulo de substratos e a apoptose de forma mais eficaz

(DEMO et al., 2007; RUSCHAK et al., 2011).

Figura 7: Estrutura dos inibidores de proteassoma aprovados pela FDA para uso terapêutico. A)

Bortezomib (Velcade); B) Carfilzomib. Adaptado de KISSELEV et al. (2012).

Ao contrário dos inibidores competitivos, existem os peptídeos com capacidade

de inibir a atividade proteassomal de forma alostérica, isto é, se ligam externamente ao

proteassoma, alterando sua conformação. Como exemplo, têm-se os peptídeos ricos em

prolina e arginina, que se ligam externamente as subunidades α do proteassoma,

desestabilizando a interação proteassoma-partícula regulatória (OSMULSKI;

GACZYNSKA, 2013).

O PR-39 é um peptídeo que atua de forma alostérica e reversível, é constituído

por 39 aminoácidos, cuja sequência possui 49% de resíduos de prolina e 24% arginina

(RRRPRPPYLPRPRPPPFFPPRLPPRIPPGFPPRFPPRFP). O peptídeo foi isolado

inicialmente do intestino de suínos para uso como agente antimicrobiano, é secretado

por macrófagos e tem efeito angiogênico e anti-inflamatório através da inibição da

degradação de HIF-1α (fator de hipóxia induzido) e Iκβ respectivamente pela via

proteassomal (GAO et al., 2000). Quando incubado com proteassoma isolado ou em

extrato de células, foi demonstrado que o PR-39 impediu a formação do proteassoma


20

26S, já que interrompe a associação da partícula regulatória 19S e do proteassoma 20S

ao interagir com a subunidade α7 deste. Ao se ligar à subunidade, altera a conformação

do complexo 20S, causando uma consequente interferência na atividade proteolítica do

mesmo. Estudos in vivo, demonstraram efeitos anti-inflamatórios dado o uso do

peptídeo no bloqueio da degradação do fator Iκβ, inibidor da atividade de NFkβ. O Iκβ é

alvo da via proteassomal, e sua degradação permite que o fator NFkβ seja ativado,

desencadeando assim, uma série de transcrição de genes, com funções de codificar

moléculas como citocinas, fatores de crescimento e moléculas de adesão que

contribuem para proliferação celular. Dessa forma, a inibição da degradação do fator,

impede o desencadeamento de tais moléculas, reduzindo assim, o estado inflamatório.

Já a angiogênese tem como um de seus desencadeadores, o HIF-1α, que exerce papel

essencial na resposta adaptativa das células em situações de hipóxia, através do controle

da expressão de moléculas como o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e

fatores de crescimento de fibroblastos (FGF). A inibição de degradação do HIF-1α,

aumenta os níveis de VEGF e FGF, os quais apresentam importantes funções

relacionadas à angiogênese (GAO et al., 2000; LI et al., 2000)

Com o intuito de avaliar a região do peptídeo PR-39 responsável pela inibição

do proteassoma, foi constatado que a sequência correspondente aos 11 aminoácidos N-

terminais do PR-39, denominada PR-11, confere capacidade de inibitória sobre a

atividade do proteassoma (GACZYNSKA et al., 2003; LI et al., 2000). Da mesma

forma, foi avaliado em trabalho realizado por ANBANANDAM et al. (2008), a

capacidade inibitória de diversos análogos do PR-11, através de modificações em

aminoácidos específicos do peptídeo. Obteve-se que o PR-11 requer pelo menos dois

resíduos de arginina ou prolina carregados positivamente na região N-terminal e a

presença de resíduos hidrofóbicos na região C-terminal, para possibilitar a interação

com a subunidade α7 e ocorrência de consequente inibição do proteassoma 20S. Dentre

os análogos testados, obteve-se uma capacidade inibitória maior que o PR-11 quando

utilizados os peptídeos W12 (RRRPRPPYLPRW) e o A8W12 (RRRPRPPALPRW).

Assim, os inibidores alostéricos vem ganhando atenção como candidatos a

fármacos inibidores de proteassoma, isto porque exibem vantagens sobre os inibidores

competitivos, uma vez que oferecem uma ampla gama de ações que interferem com a

proteólise. Dentre suas vantagens estão a maior especificidade, menor propensão a


21

induzir resistência, capacidade de alterar a conformação estrutural do proteassoma a fim

de impedir o acoplamento de partículas regulatórias, além da possibilidade de obter-se

análogos com grau de inibição satisfatório (RUSCHAK et al., 2011).

O uso de inibidores de proteassoma vem sendo associado ao tratamento de

tumores bem como ao tratamento de doenças auto-imunes, uma vez que células T

necessitam de imunoproteassomas para atuarem em um ambiente pró-inflamatório. O

tratamento de camundongos com o inibidor específico para subunidade β5i, o ONX-

0914, demonstrou efeito de prevenção no desenvolvimento ou progressão de artrite,

lúpus e encefalite auto-imune em modelos experimentais (KISSELEV; GROETTRUP,

2014). Além destes compostos, encontram-se atualmente em fase I de teste, os

inibidores Marizomib, também denominado NPI-0052, um potente inibidor que afeta as

atividades das três subunidades β catalíticas, e o MLN9708, um segundo composto, que

age inibindo a subunidade β5 do proteassoma, está sendo testado em pacientes com

câncer. Ambos têm demonstrado ocasionar um acúmulo de proteínas ubiquitinadas e

apoptose de células de tumorais (WEATHINGTON; MALLAMPALLI, 2014).

A identificação de moléculas ligantes e inibidoras de proteassoma torna-se de

grande importância, dada sua influência de forma positiva ou negativa sobre as taxas de

degradação dos substratos diversos pelo complexo proteolítico e seu envolvimento nos

processos celulares e patogênicos.

2. Justificativa

Carmo, S.G. Justificativa

22

2. Justificativa

O proteassoma é constituinte de uma das principais vias de degradação que

contribuem para a homeostase celular, e dada sua influência na regulação de uma série

de funções, o mesmo tem sido considerado um alvo potencial na terapêutica de diversas

patologias. Assim, a busca de peptídeos bioativos com atividade intrínseca sobre este

complexo proteolítico é de grande interesse na pesquisa básica. Trabalhos vêm

demonstrando a utilização de peptídeos diversos na modulação e inibição da atividade

proteassomal. Em estudos realizados por Anbanandam et al., 2008, foi demonstrado que

análogos à porção N-terminal do peptídeo natural PR-39, inibem fortemente o

proteassoma 20S humano. Sabendo que o PR-11, peptídeo composto pelos 11

aminoácidos terminais do PR-39, requer resíduos de arginina ou prolina carregados

positivamente na região N-terminal e resíduos hidrofóbicos na região C-terminal, para

possibilitar a ocorrência de inibição do proteassoma 20S, modificações sutis são capazes

de alterar seu potencial inibitório. O uso de triptofano por exemplo, na região N-

terminal do PR-11, aumentou significativamente a capacidade inibitória do peptídeo.

Assim, a avaliação da capacidade inibitória de novas moléculas derivadas destes

análogos, por modificações estruturais, torna-se relevante, uma vez que as atividades

inibitórias observadas para o proteassoma podem se diferenciar quando utilizadas

estruturas distintas. Tal avaliação de análogos vem sendo mostrada na literatura e

estudada pelo grupo de pesquisa do Laboratório de Enzimologia e Proteômica, onde

diversos peptídeos análogos foram sintetizados previamente e utilizados neste trabalho.

Além de modificações estruturais em peptídeo com capacidade inibitória já conhecida, a

descoberta de novos alvos inibidores por meio da utilização de técnica que possibilite

grande variedade de peptídeos candidatos, é também ponto importante. Como técnica

para geração de peptídeos diversos, este trabalho propõe o uso de tripsinólise de

proteínas séricas, uma vez que a variedade de proteínas contidas no plasma é

considerável, e pode fornecer peptídeos alvos com capacidade de interação e modulação

de atividade do proteassoma 20S.

3. Objetivos

Carmo, S.G. Objetivos

23

3. Objetivos

3.1. Objetivo geral

O objetivo geral do trabalho consiste na avaliação da capacidade inibitória e de

modulação da atividade do proteassoma 20S murino por meio de ensaios de atividade

peptidásica de peptídeos análogos do PR-11 e peptídeos gerados por tripsinólise de

proteínas séricas.

3.2. Objetivos específicos

A) Purificar o proteassoma 20S alto grau de homogeneidade, a partir de fígados de

camundongos Balb/c;

B) Avaliar a capacidade inibitória dos peptídeos F12, I9F12 e G9F12, análogos do PR-

11, sobre a atividade quimotripsina símile do proteassoma 20S;

C) Gerar peptídeos diversos por meio de tripsinólise plasmática de soro fetal bovino;

D) Avaliar a capacidade de modulação de atividade dos peptídeos trípticos sob o

proteassoma 20S;

E) Avaliar e identificar por espectrometria de massas os peptídeos com capacidade de

interação ao proteassoma 20S.

4. Materiais e Métodos

Carmo, S.G. Materiais e Métodos

24

4. Materiais e Métodos

O trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética no uso Animal da UFOP (CEUA-

UFOP), catalogado sob o número de protocolo 2014/43.

A metodologia do trabalho será descrita em partes separadas, sendo a primeira

referente a purificação do proteassoma 20S, a segunda pertinente a avaliação da

capacidade inibitória dos peptídeos peptídeos análogos ao PR-11, e a última sobre a

geração de peptídeos por meio de tripsinólise de proteínas séricas e avaliação do

potencial de interação e modulação destes peptídeos sobre a atividade proteassomal.

4.1. Purificação do proteassoma 20S

4.1.1. Extração de proteínas a partir de fígados de camundongos

O protocolo para extração de proteínas bem como o protocolo para purificação

do proteassoma 20S, foram modificados de acordo com as metodologias utilizadas por

Abramova, 2004 e Castro-Borges, 2007.

Para obtenção de fígados a serem utilizados como fonte proteica, dez animais

com aproximadamente 10 semanas de idade, foram obtidos no Centro de Ciência

Animal da Universidade Federal de Ouro Preto. Os mesmos foram sacrificados após

administração da associação de anestésico e relaxante muscular por via intraperitoneal

(Cloridrato de Quetamina 160 mg/kg e Cloridrato de Xilazina 40 mg/kg). Os fígados

foram perfundidos com solução Salina Citratada (Cloreto de sódio 0,85%, Citrato de

sódio 0,75%) para remoção de sangue. Os órgãos foram lavados em tampão fosfato

salino (PBS) 0,1 M pH 7,4 e homogeneizados em tubo Potter por cerca de 10 minutos

em banho de gelo, na presença de tampão A (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, Ditiotreitol

(DTT) 1 mM, MgCl2 5 mM e 250 mM de Sacarose) contendo 1x Coquetel Inibidor de

Proteases (Sigma-Aldrich). O homogenato foi centrifugado inicialmente a 2000 x g por

15 minutos para remoção de debris celulares, em seguida a 6000 x g por 30 minutos

para remoção de mitocôndrias e finalmente a 46000 x g durante 2 horas para


25

clarificação do extrato. As centrifugações foram realizadas em Centrifuga Sorvall RC

5C a uma temperatura de 4°C.

Após a sequência de centrifugações, o sobrenadante foi recuperado e precipitado

inicialmente em sulfato de amônio na faixa de 0 a 40%, sendo a precipitação dividida

em três etapas: adição de sal sob agitação lenta e constante, manutenção do extrato em

repouso, e centrifugação a 16000 x g (Centrifuga Sorvall RC 5C). Cada uma destas

etapas teve a duração de 20 minutos. O precipitado foi descartado, e as proteínas

solúveis precipitadas com Sulfato de Amônio na faixa de 40 a 70% seguindo as mesmas

etapas descritas anteriormente. Ao final da precipitação, o sobrenadante foi descartado,

e o precipitado ressuspenso em 1 mL de Tampão B (Tris-HCl 20 mM pH 7,5, NaCl 250

mM, DTT 1 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 5 mM e Glicerol 10%).

4.1.2. Cromatografia por exclusão molecular

A cromatografia por exclusão molecular foi montada em suporte de dimensões

1,2 cm x 71 cm, utilizando resina Sephacryl S-400HR (GE Healthcare). A mesma foi

acoplada em HPLC (Akta Explorer GE Healthcare), e equilibrada em Tampão B. Cerca

de 40 mg de proteínas obtidas do homogenato foram submetidas a separação. A eluição

ocorreu sob fluxo constante de 12 mL/hora, foram coletadas frações de 2 mL e as

mesmas foram avaliadas em Espectrofotômetro (Shimadzu UV-1601) em comprimento

de onda 280 nm.

4.1.3. Ensaios de atividade peptidásica

Ao final da primeira etapa cromatográfica, ensaio de atividade peptidásica

utilizando substrato específico Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC (Sigma-Aldrich) para

quimotripsina foi realizado, a fim de detectar a presença de proteassoma nas frações

enriquecidas. Assim, três condições distintas foram avaliadas, sendo elas:

a) Atividade quimotripsina símile na presença de substrato;

b) Atividade quimotripsina símile na presença de substrato + Dodecil sulfato de

sódio (SDS) 0,02% (Sigma-Aldrich);


26

c) Atividade quimotripsina símile na presença de substrato + MG-132 10 µM

(Enzo Life Sciences).

Para isso, alíquotas de 10 µL das frações foram pré-incubadas durante 15

minutos junto ao tampão de reação Tris-HCl 50 mM pH 7,5, DTT 20 mM, MgCl2 5 mM

na temperatura de 37ºC. Após a incubação, o substrato foi então adicionado para a

concentração final de 25 µM em volume final de 125 µL. A reação ocorreu por 1 hora e

as leituras foram realizadas em fluorímetro de placa Victor X (Perkinelmer) nos

comprimentos de onda 405 nm (excitação) e 460 nm (emissão).

A avaliação da atividade de frações contendo proteassoma se deu através do

aumento de atividade quimotripsina símile apresentada por aquelas na presença de

substrato + SDS 0,02%, ao mesmo tempo que apresentaram forte inibição da atividade

na presença de substrato + MG-132 10 µM. Dessa forma, as frações que seguiram este

padrão, foram reunidas a fim de serem submetidas a nova etapa cromatográfica.

4.1.4. Cromatografia por afinidade

A segunda etapa cromatográfica se deu por afinidade e interação iônica em

coluna de Hidroxiapatita (Bio-Rad) de dimensões 1,6 cm x 5 cm. A mesma foi acoplada

a HPLC (Akta Explorer GE Healthcare) e equilibrada em Tampão 40 mM Fosfato de

Potássio pH 7,5 contendo DTT 1 mM, MgCl2 5 mM e Glicerol 10%. A concentração de

MgCl2 nas amostras reunidas contendo atividade proteassomal foi ajustada para 10 mM.

Utilizou-se ainda, o mesmo tampão para remoção das proteínas não ligadas. As frações

foram monitoradas por leitura em Espectrofotômetro (Shimadzu UV-1601) em

comprimento de onda 280 nm. Após remoção das proteínas não ligadas, iniciou-se um

gradiente crescente até 400 mM de Fosfato de Potássio pH 7,5 durante 50 minutos, onde

frações de 2 mL foram coletadas sob fluxo de 1 mL/min. As frações proteicas foram

avaliadas quanto a presença de proteassoma e quanto ao grau de pureza em gel de

poliacrilamida 12%.


27

4.1.5. Eletroforese unidimensional em gel de poliacrilamida

Para avaliação das frações, foram utilizados géis de separação 12% e géis de

concentração 5% em condições desnaturantes, segundo o método descrito por Laemmli,

1970. Os géis foram confeccionados utilizando as soluções tampão Tris-HCl 1,5 M pH

8,8 para os géis de separação e Tris-HCl 0.5 M pH 6,8 para os géis de concentração,

acrilamida 29%, Bis-Acrilamida 1%, solução SDS 10%, solução Persulfato de Amônio

10%, TEMED e água ultra pura (q.s.p. 10 mL).

Alíquotas de 20 µL das frações eluídas foram diluídas em Tampão de Amostra

(Tris-HCl 125 mM pH 6,8, SDS 4%, Glicerol 20% e Azul de Bromofenol 0,002%) na

proporção 1:1, e as proteínas desnaturadas em água fervente durante cinco minutos.

Após o preparo das amostras, estas foram submetidas a eletroforese sob corrente

constante de 20 mA por gel, na presença de Tampão de Corrida (Tris 25 mM pH 7,5,

Glicina 190 mM e SDS 0,1%), durante o tempo necessário para separação das proteínas

de acordo com a massa molecular. Utilizou-se ainda, como padrão de massa molecular

o Molecular Weight Marker Kit (Sigma Aldrich).

Após a eletroforese, os géis foram corados pelo método de prata, sendo

inicialmente fixados em Etanol 40%, Ácido Acético 7% overnight. Após a fixação,

realizou-se a sensibilização em solução Etanol 30%, Acetato de Sódio 6,8%, Tiossulfato

de Sódio 0,2% por 30 minutos e por fim, a coloração com solução Nitrato de Prata

0,25% durante 20 minutos ao abrigo da luz. O excesso de solução foi removido com

lavagem em água ultra pura realizada por 3 vezes de 5 minutos, e a revelação se deu em

solução Carbonato de Sódio 2,5%, Formaldeído 5% durante o tempo necessário para

visualização das bandas proteicas.

As frações que apresentaram perfil característico de bandas enriquecidas entre

20-30 kDa, indicativas da presença de proteassoma, foram reunidas e transferidas para

membrana de celulose cut-off 12000 Da (Sigma) e imerso em sacarose até redução do

volume (~ 1 mL) para que pudessem ser submetidas a nova etapa cromatográfica. Em

seguida, o pool foi aplicado em Sephacryl S-400HR (GE Healthcare), e ao final da

eluição, foram realizados ensaios de atividade peptidásica quimotripsina símile e

eletroforese. Tanto a cromatografia, ensaios de atividade e eletroforese foram realizados

conforme descrito anteriormente.


28

4.1.6. Dosagem de proteínas e ensaios de atividade específica

Ao final da purificação, alíquotas provenientes de cada uma das etapas foram

dialisadas em Tampão 20S (Tris-HCl 25 mM pH 7,5, DTT 1 mM, Glicerol 5%) e as

dosagens de proteínas determinadas por meio da utilização do kit BCA Protein Assay

(Pierce). As dosagens foram realizadas seguindo as recomendações do fabricante. Dessa

forma, 25 µL de amostra foram utilizados e acrescidos de 200 µL dos reagentes A e B

(50 : 1). A reação foi incubada a 37°C durante 30 minutos, e a leitura foi realizada a 570

nm em leitor de Elisa. As concentrações das frações foram obtidas de acordo com a

curva padrão de BSA.

Para o ensaio de atividade específica quimotripsina símile, foram realizados

ensaios conforme descrito no item 4.1.3 na presença de substrato específico para

quimotripsina.

4.1.7. Identificação das subunidades do proteassoma 20S por espectrometria de

massas

A) Digestão de proteínas em solução

Ao final das etapas cromatográficas, as frações obtidas foram então, submetidas

a espectrometria de massas para confirmação das identidades das subunidades do

proteassoma bem como de proteínas que estariam supostamente ligadas a ele. Dessa

forma, cerca de 5 µg de cada uma das frações finais foram digeridas em solução para

identificação. Ambas foram reduzidas em DTT 2 mM à 56°C durante 15 minutos e

alquiladas em solução de Iodoacetamida 4,5 mM por mais 15 minutos à temperatura

ambiente e ao abrigo da luz. As amostras foram diluídas 2,5 vezes em água ultra pura e

a solução de NH4HCO3 ajustada para 100 mM. A digestão das proteínas ocorreu durante

18 horas na presença de Tripsina (Promega) na proporção 1:25 (enzima:proteína), a qual

foi mantida a 37°C.

A reação foi interrompida com a acidificação da amostra por meio da adição de

ácido acético glacial ultra puro 4% (J. T. Baker). Os peptídeos foram purificados via


29

extração em fase sólida, utilizando coluna C18-E (55 µm, Phenomenex), seguindo as

etapas:

a) Higienização da coluna em 50% Acetonitrila, 0.1% Ácido Fórmico;

b) Equilíbrio da coluna em 0,1% Ácido Fórmico;

c) Aplicação de peptídeos e remoção da fração não ligada com 0,1% Ácido

Fórmico;

d) Eluição dos peptídeos em 50% Acetonitrila, 0,1% Ácido Fórmico.

O volume foi reduzido em speedvac (Thermo) durante o tempo necessário para

concentração total dos peptídeos. Ao final do processo, os peptídeos foram

ressuspendidos em Ácido Trifluoroacético (TFA) 0,1%.

B) Análise por espectrometria de massas

Cerca de cinco µL da solução contendo os peptídeos foram injetados utilizando

o sistema UHPLC UltiMate® 3000 (Thermo Scientific, Bremen, Alemanha) equipado

com coluna Nano-Trap Acclaim PepMap100 C18 (75 µm i.d. × 2 cm, 3 µm, 100 Å;

Thermo Scientific) e coluna capilar Acclaim PepMap100 C18 RSLC (75 µm i.d. × 15

cm, 2 µm, 100 Å; Thermo Scientific). Os peptídeos retidos na coluna guarda foram

lavados durante 3 minutos com 2% Acetonitrila, 0,05% TFA, a uma vazão de 5 µL/min

previamente à passagem do fluxo pela coluna capilar. A separação dos peptídeos foi

realizada a temperatura de 40°C utilizando gradiente de combinação de solventes, sendo

eles:

- A (0.1% Ácido Fórmico);

- B (80% Acetonitrila, 0,1% Ácido Fórmico).

O gradiente foi iniciado com 4% de solvente B e foi aumentado para 55% em 60

minutos, alcançando 90% em 80 minutos e sendo mantido dessa forma por 10 minutos.

Ao final do gradiente, retornou-se às condições iniciais na qual B permaneceu em 4%

durante 10 minutos. O sistema nanoUHPLC interfaceado com o instrumento Q-Exactive

(Thermo Scientific, Bremen, Alemanha) através da fonte Nanospray Flex Ion (Thermo


30

Scientific), possibilitou a análise por espectrometria de massas dos peptídeos eluídos. A

fonte equipada com emitter de aço-inixidável nano-bore (150µm o.d. × 30µm i.d.,

Proxeon, Thermo Scientific), operou sob voltagem de 1,9 kV, no modo positivo e

temperatura de 250°C. A varredura no modo scan foi realizada à uma resolução de

70.000 com tempo máximo de injeção de 100 ms e acúmulo de íons no valor de 3×106.

Os 12 íons mais intensos monitorados na faixa de 300-2.000 m/z, com carga ≥ 2 foram

isolados em uma faixa de 2 m/z antes de serem fragmentados via higher-energy

collisional dissociation (HCD), com energia de colisão normalizada em 30 V. Os

espectros MS/MS foram adquiridos com resolução de 17.500, tempo máximo de injeção

de 150 ms e acúmulo de íons no valor de 2×105 íons. O tempo de exclusão utilizado foi

de 60 segundos.

C) Processamento dos Dados

Os espectros de massas foram submetidos à busca em banco de dados utilizando

o software Proteome Discoverer (versão 1.4, Thermo Scientific). O workflow

selecionado utilizou o sistema de busca SequestHT e Event detector. Os parâmetros de

busca incluíram:

A) enzima: tripsina/P;

B) número máximo de sítio de clivagem perdidos: 2;

C) carbamidometilação (C);

D) oxidação de metionina e acetilação N-terminal, como modificações

dinâmicas;

E) tolerância de massa de 10 ppm para íons parentais e de 0,1 Da para MS/MS.

A busca foi realizada utilizando o banco de dados de Mus musculus do provedor

UniProt, contendo 25.124 sequências e 14.663.781 resíduos. Foram consideradas como

identificadas apenas as proteínas com a presença de pelo menos um peptídeo de alta

confiabilidade.

O processo de purificação do proteassoma 20S é ilustrado na Figura 8.


31

Figura 8: Esquema representative da purificação do proteassoma 20S


32


análogos ao PR-11

Para avaliação do efeito de modulação da atividade quimotripsina símile do

proteassoma 20S, foram utilizados MG-132, o peptídeo PR-11 e três análogos

estruturais de PR-11 previamente sintetizados pelo grupo de pesquisa do Laboratório de

Enzimologia e Proteômica da UFOP. Os peptídeos, a sequência de cada um deles e as

diferentes concentrações utilizadas, podem ser observados na Tabela 1.

Tabela 1: Sequência e concentrações utilizadas de inibidores de proteassoma 20S

Peptídeos Sequência Concentrações (µM)

PR-11 RRRPRPPYLPR 0,675 1,25 2,5 5 10 20 40

F-12 RRRPRPPYLPRF 0,675 1,25 2,5 5 10 20 40

I9F12 RRRPRPPYIPRF 0,675 1,25 2,5 5 10 20 40

G9F12 RRRPRPPYGPRF 0,675 1,25 2,5 5 10 20 40

MG-132 ZLLLV 0,675 1,25 2,5 5 10 20 40

Os ensaios de atividade quimotripsina símile de todos os peptídeos foram

realizados na presença de substrato Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC (Sigma-Aldrich)

conforme descrito no item 4.1.3. Foram utilizados como controles comparativos o

ensaio na presença do substrato específico 1,25 mM, substrato 1,25 mM + MG-132 e

substrato 1,25 mM + PR-11.

As leituras foram realizadas a cada 15 minutos em fluorímetro de placa Victor X

(PerkinElmer). Ao final das leituras os resultados foram avaliados de acordo com os

diferentes inibidores nas dosagens utilizadas. Diante dos resultados, um segundo ensaio

utilizando concentrações menores dos peptídeos F-12, G9F12 e PR-11 foi realizado,

conforme descrito na Tabela 2.


33

Tabela 2: Concentrações utilizadas de inibidores do proteassoma 20S

Peptídeos Concentração (µM)

PR-11 0,125 0,25 0,5 1,0 2,0

F-12 0,125 0,25 0,5 1,0 2,0

G9F12 0,125 0,25 0,5 1,0 2,0

4.3. Geração de peptídeos através de tripsinólise de proteínas séricas

Para geração de peptídeos diversos a serem testados frente a modulação de

atividade bem como ligação do proteassoma 20S, foi utilizado soro fetal bovino

comercial. A dosagem do soro foi determinada por meio do kit BCA Protein Assay

(Pierce) conforme descrito no item 4.1.6. Dessa forma, as proteínas do soro (50 µg/µL)

foram normalizadas para manter uma homogeneidade na composição com o uso de

biblioteca combinatorial (ProteoMiner™ Protein Enrichment Kit - BioRad), seguindo

as recomendações do fabricante. Para isso, a amostra foi adicionada à resina e incubada

por 2 horas a temperatura ambiente. Em seguida, foram realizadas centrifugações de 30

segundos a 1000 x g para remoção de proteínas não ligadas. A amostra foi eluída em

condições adstringentes por meio de solução SDS 4%, DTT 25 mM. O esquema com as

etapas que envolvem a normalização pode ser observado na Figura 9.


34

Figura 9: Depleção de proteínas em ProteoMiner (BioRad). Adaptado: Boletim técnico da BioRad –

ProteoMiner Protein Enrichment Technology.

Após a normalização em ProteoMiner, a amostra obtida foi submetida a

eletroforese em gel SDS-PAGE 12% para quantificação em software Quantity-One

(BioRad) e avaliação do grau de depleção das proteínas abundantes por meio do perfil

eletroforético. Dada a depleção e quantificação, 25 µg de proteínas foram submetidas a

uma nova eletroforese em gel SDS PAGE 10% durante cerca de 10 minutos, tempo

necessário para que todas proteínas penetrassem no gel. Tal acompanhamento foi feito

utilizando padrão de peso molecular pré-corado (Sigma).

O gel foi corado com Coomassie Coloidal G-250 para visualização das bandas a

serem excisadas. Para isso, inicialmente o gel foi imerso em solução de Ácido

Ortofosfórico 2%, Etanol 30% e mantida overnight. A segunda etapa, consistiu da

lavagem do gel em solução Ácido Ortofosfórico 2% por 3 vezes durante 10 minutos, e

em seguida, o mesmo foi equilibrado em solução contendo Ácido Ortofosfórico 2%,

Etanol 18%, Sulfato de Amônio 15% durante 30 minutos. Por fim, a coloração se deu

em solução Ácido Ortofosfórico 2%, Etanol 18%, Sulfato de Amônio 15% e Coomassie

Coloidal G-250 2% durante 24 horas.


35

Após a coloração e visualização das bandas proteicas, as mesmas foram

excisadas e mantidas a 37° C, em solução descorante (40% Metanol, 7% Ácido

Acético), até a descoloração completa para início da digestão de proteína em gel. Foram

adicionados às bandas DTT 50 mM e incubadas a 65°C por 30 minutos. O DTT foi

removido, e adicionado então, Iodoacetamida 100 mM, sendo este mantido ao abrigo da

luz por 1 hora. As bandas foram lavadas por 3 vezes de 20 minutos com solução

NH4HCO3 20 mM, Acetonitrila 50% e o excesso removido em SpeedVac. Em seguida,

0,5 µg de tripsina foram adicionadas e incubadas a temperatura ambiente por 20

minutos. O excesso foi removido, os géis acrescidos de tampão NH4HCO3 20 mM e

incubados novamente por cerca de 18 horas a 37° C. O sobrenadante foi recuperado e

para extração dos peptídeos do interior do gel, foram adicionados 50 µL de Ácido

Trifluoracético 0,1%, Acetonitrila 50%, sendo mantidos por 30 minutos em temperatura

ambiente. Este último foi recuperado e unido ao primeiro, e foram concentrados

novamente em SpeedVac. Ao final do processo, os peptídeos foram ressuspendidos em

TFA 0,1%, e verificados os peptídeos gerados pela tripsinólise em espectrômetro de

massas.


obtidos por tripsinólise de proteínas séricas

Para avaliação do efeito modulatório da atividade do proteassoma 20S a partir

dos peptídeos gerados, foram avaliadas as atividades quimotripsina símile na presença

de substrato Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC e dos peptídeos em concentrações de 50 e 6,25

µM, sendo considerada a massa média de 1500 g dos peptídeos trípticos para realização

dos cálculos de molaridade. A reação se deu conforme descrito no item 4.1.3. Foram

utilizados como controles comparativos o ensaio na presença do substrato 1,25mM e

substrato 1,25mM + MG-132 10 µM.


36

4.5. Ensaios de ligação dos peptídeos trípticos

Após os ensaios de atividade, um novo ensaio para avaliar a possível interação

dos peptídeos com o proteassoma 20S foi realizado. Para isso, uma alíquota de 600 µL

da fração de proteassoma foi dialisado em Tampão 20S e concentrada em Vivaspin

(Cut-off 3000 Da - GE Healthcare) para o volume final de 100 µL. Os peptídeos foram

adicionados em concentrações de 60 µM e 30 µM e incubados a 37°C durante 30

minutos. Para remoção dos peptídeos não ligados, foi feita utilizada solução tampão

Tris-HCL 1 mM pH 7,5. Em seguida, a fim de romper as interações existentes, foi

realizada alteração de pH, com a utilização de tampão Glicina 100 mM pH 3,0. Ao

final do ensaio, as frações referentes aos peptídeos não ligados e eluições foram

submetidas a purificação em coluna C-18E conforme descrito no item 4.1.7.(A), para

análise dos peptídeos ligantes em espectrômetro de massas.


37

Figura 10: Obtenção de peptídeos trípticos via tripsinólise de proteínas séricas.


38

4.6. Análise Estatística

A análise estatística foi realizada utilizando o software Graph Pad Prism 5.0

para Windows. Utilizou-se análise de variância bi-variada (Two-way) com pós-teste

Bonferroni, para avaliação das diferenças significativas entre as atividades peptidásicas

e atividades residuais do proteassoma 20S frente ao uso dos inibidores análogos e o PR-

11, bem como o MG-132 e os peptídeos gerados pela tripsinólise de proteínas séricas. O

nível de significância utilizada foi de p < 0,05.

5. Resultados

Carmo, S.G. Resultados

39

5. Resultados

5.1. Purificação do proteassoma 20S

5.1.1. Primeira etapa cromatográfica: Exclusão molecular em Sephacryl S-400HR

A fim de identificar as frações enriquecidas com o proteassoma 20S, obtidas por

meio da cromatografia por exclusão molecular descrita no item 4.1.2, foram coletadas

frações de 2 mL, as quais foram monitoradas a 280 nm, a faixa de frações na qual

estavam presentes proteínas. Dessa forma, pode-se notar na Figura 11, a detecção de

maior presença de proteínas entre as frações 25 a 54, as quais foram avaliadas quanto a

atividade quimotripsina símile. Para isso, três condições distintas foram utilizadas, o que

possibilitou a identificação das frações com atividade quimotripsina-símile indicativa de

presença de proteassoma entre as frações 26 e 34.

Figura 11: Gráfico das medidas de atividade peptidásica e cromatograma de frações enriquecidas a

280 nm. UAF: Unidade arbitrária de fluorescência; AQS: Atividade quimotripsina símile, AQS + SDS

0.02%: Atividade quimotripsina símile + SDS 0.02%; AQS + MG-132 10 µM: Atividade quimotripsina

símile + MG-132 10 µM.

Nas condições estabelecidas, a determinação da presença do proteassoma se deu

quando ocorreu aumento da atividade na presença de SDS 0,02%, ao mesmo tempo em

que se observou inibição de cerca de 96% da atividade quimotripsina símile, quando


40

comparados à condição controle, que por sua vez, utilizou-se apenas proteassoma e

substrato específico. As frações com estas características foram reunidas, e junto a

fração precipitada em (NH4)2SO4 na faixa de 40 a 70% foram submetidas à eletroforese.

O perfil obtido na Figura 12 demonstrou a exclusão de uma variedade de bandas

proteicas nas frações ativas quando comparado ao perfil eletroforético do extrato inicial.


41

Figura 12: Perfil eletroforético da fração contendo atividade proteassomal obtida por filtração em

Sephacryl S-400HR. A) Fração 40-70% (NH4)2SO4; B) Pool ativo eluído em Sephacryl S-400HR. Mr:

massa relativa em kDa. Coloração por prata.

5.1.2. Segunda etapa cromatográfica: Troca iônica em Hidroxiapatita

As frações ativas provenientes da eluição em Sephacryl S-400HR, foram

submetidas a cromatografia em coluna de Hidroxiapatita conforme descrito em 4.1.4.

Após a remoção total das proteínas não ligadas à coluna, foi iniciado um gradiente

crescente de tampão fosfato de potássio que variou de 40 mM a 400 mM, durante o

tempo de 50 minutos e coletadas frações de 2 mL. A Figura 13 mostra o perfil de fração


42

não ligada à coluna e a fração contendo bandas proteicas de 20 a 30 kDa, características

às subunidades do proteassoma 20S.

Figura 13: Perfil eletroforético das frações obtidas por eluição em Hidroxiapatita. FNL: Fração não

ligada; FL: Fração ligada. Mr: Massa relativa em kDa. Coloração com prata.

Ao observar o conteúdo em destaque no retângulo vermelho, é possível notar

inicialmente a ausência de bandas proteicas compatíveis com as das subunidades α e β

do proteassoma 20S na FNL, enquanto no segundo perfil referente a FL, é possível

observar a presença de bandas proteicas entre 20 e 30 kDa. As bandas proteicas

presentes na faixa citada são compatíveis com as massas moleculares das subunidades


43

do proteassoma 20S e com o perfil que foi obtido em trabalho realizado por CASTRO-

BORGES et al. (2007) e (SAVULESCU et al., 2011). O perfil demonstrado foi obtido

nas frações compreendidas entre 12 e 16, o que corresponde ao intervalo do gradiente

entre 126 mM e 155 mM de tampão fosfato de potássio, fornecendo um volume de

amostra de 10 mL. Essas frações foram reunidas e concentradas em sacarose, e

realizada nova cromatografia em coluna de exclusão molecular, a fim de obter um maior

grau de enriquecimento do proteassoma 20S.

5.1.3. Terceira etapa cromatográfica: Recromatografia por exclusão molecular em

Sephacryl S-400HR

A recromatografia em exclusão molecular foi realizada nas mesmas condições

descritas inicialmente no item 4.1.2. Ao final da eluição, o perfil das frações obtidas foi

analisado em SDS-PAGE 12%, sendo aplicadas alíquotas de 35 µL das frações, onde é

possível notar na Figura 14, a obtenção de dois perfis distintos.


44

Figura 14: Perfil eletroforético das frações eluídas em Sephacryl S-400 HR. A) Perfil contendo

bandas proteicas características de subunidades α e β do proteassoma 20S; B) Perfil contendo bandas

proteicas características de subunidades α e β do proteassoma 20S + bandas com alta massa molecular.

Mr: Massa relativa em kDa. Coloração por prata.

Em ambos os perfis demonstrados em A e B, observa-se a existência de bandas

proteicas entre 20 e 30 kDa assim como na Figura 13 (FL), remetendo a um perfil

semelhante as subunidades α e β constituintes de proteassoma. Avaliando os perfis

separadamente, pode ser notado em A, a ausência de bandas proteicas referentes a

proteínas de alta massa molecular, enquanto em B, destacadas pelas setas vermelhas, é

possível observar o surgimento de bandas proteicas co-eluídas com o proteassoma 20S

que podem sugerir proteínas ligantes de proteassoma. Dessa forma, ambas as amostras


45

foram submetidas a análise em espectrômetro de massas a fim de confirmar as

identidades das subunidades do proteassoma 20S e identificar as proteínas co-eluídas

com o proteassoma. Os resultados da análise são demonstrados no tópico 5.1.5.

5.1.4. Ensaio de atividade específica do proteassoma 20S

Ao final da purificação, as frações obtidas em cada etapa foram dialisadas em

Tampão 20S para que pudessem ser dosadas utilizando kit BCA Protein Assay (Pierce) e

realizados ensaios de atividade peptidásica quimotripsina símile a fim de avaliar a

atividade específica obtida em cada fração. Na Tabela 3 podemos observar a dosagem e

quantidade total de proteínas ao longo da purificação, bem como o fold obtido de forma

satisfatória. As etapas de purificação utilizadas forneceram um rendimento final de

cerca de 1,07%, uma vez que proporcionaram proteassoma 20S com alto grau de

enriquecimento.

Tabela 3: Rendimento Proteassoma 20S ao longo da purificação

Fração Concentração

(mg/mL)

Atividade

específica

Fold

purificação

Volume

(mL)

Proteína

total (mg)

Total 7 142843 1,0 40 280

(NH4)2SO4 40 – 70% 24,4 613930 4,3 4.5 109,8

Sephacryl 1 0,6 3443298 24,1 54 32,4

Hidroxiapatita 0,5 5140029 36,0 12 6

Sephacryl 2 0,3 6722003 47,1 10 3

Na Figura 15 são demonstradas as atividades quimotripsina símile específicas

obtidas ao longo da purificação. Como pode ser notado, a atividade quimotripsina símile

proteassomal foi aumentada ao final de cada etapa de purificação, demonstrando o

enriquecimento do mesmo, uma vez que são removidas outras proteínas do extrato.


46

Figura 15: Atividade quimotripsina símile específica ao longo da purificação do proteassoma 20S.

UAF/mg x 60 minutos: unidade arbitrária de fluorescência/ mg de proteína em 60 minutos. Média +/- erro

padrão.

5.1.5. Identificação de proteínas por espectrometria de massas

Para confirmação das identidades das subunidades constituintes do proteassoma,

bem como identificação das proteínas de alta massa apresentadas no perfil eletroforético

(Figura 14), foi realizada digestão em solução das amostras conforme descrito no item

4.1.7. A caracterização foi feita por meio de espectrômetro de massas (Thermo

Scientific) em gradiente de 80 minutos. Os dados obtidos através dos espectros foram

analisados utilizando o software Proteome Discoverer (versão 1.4, Thermo Scientific) e

banco de dados de Mus musculus.

Avaliando a contagem total de íons na Figura 16, é possível observar uma

distribuição uniforme dos peptídeos ao longo do gradiente de Acetonitrila, o que

possibilitou uma identificação mais efetiva, devida a redução de peptídeos co-eluídos.

Tal fato é comprovado pelo perfil a 214 nm, onde percebe-se a definição dos picos.


47

Todas as proteínas identificadas apresentaram homologia com Mus musculus e estão

dispostas nas Tabelas 4 e 5.


48

Figura 16: Dados obtidos durante a eluição em espectrômetro de massas dos peptídeos gerados pela digestão das frações contendo atividade quimitripsina

símile do proteassoma 20S e proteínas ligadas. A) Cromatograma a 214 nm; B) Contagem total de íons.


49

Tabela 4: Identificação de subunidades constituintes do proteassoma 20S

Nº Acesso Anotação Mr (kDa) % Cobertura Peptídeos únicos *[M+H]+(Da) Carga **ΔM (ppm)

Q9Z2U1 Proteasome subunit alpha type-5 26.4 17.01

AIGSASEGAQSSLQEVYHK 1961.94211 +3 -7.27

LFQVEYAIEAIK 1423.78069 +2 -1.77

GVNTFSPEGR 1063.51482 +2 -1.82

P99026 Proteasome subunit beta type-4 29.1 13.26

FDGGVVIAADMLGSYGSLAR 1998.98979 +2 -2.8

EVLEKQPVLSQTEAR 1726.93657 +2 1.79

QPVLSQTEAR 1128.59966 +2 -1.02

Q9Z2U0 Proteasome subunit alpha type-7 27.8 11.69 LTVEDPVTVEYITR 1634.85588 +2 -4.75

NYTDDAIETDDLTIK 1726.79595 +2 -3.71

Q9QUM9 Proteasome subunit alpha type-6 27.4 10.98 ILTEAEIDAHLVALAERD 1979.03899 +2 -2.79

LYQVEYAFK 1160.58904 +2 -8.29

O70435 Proteasome subunit alpha type-3 28.4 10.20 AVENSSTAIGIR 1217.64446 +2 -3.32

SLADIAREEASNFR 1578.77263 +2 -9.19

Q9R1P1 Proteasome subunit beta type-3 22.9 8.78 LYIGLAGLATDVQTVAQR 1889.04119 +2 -4.23

O09061 Proteasome subunit beta type-1 26.4 7.50 DVFISAAERDVYTGDALR 1997.98734 +3 -2.73

P49722 Proteasome subunit alpha type-2 25.9 5.98 GYSFSLTTFSPSGK 1478.70867 +2 -5.12

O55234 Proteasome subunit beta type-5 28.5 5.30 ATAGAYIASQTVK 1280.68059 +2 -3.09

ATAGAYIASQTVKK 1408.78008 +2 0.40

P70195 Proteasome subunit beta type-7 29.9 5.05 ATEGMVVADKNcSK 1509.70195 +2 -1.14

Q9R1P3 Proteasome subunit beta type-2 22.9 3.98 RNLADcLR 1017.52526 +2 -0.61

Q60692 Proteasome subunit beta type-6 25.4 3.78 DGSSGGVIR 847.42558 +2 -1.52


50

Tabela 5: Identificação de proteínas co-eluídas com o proteassoma 20S

Nº Acesso Anotação Mr (kDa) % Cobertura Peptídeos únicos *MH+(Da) Carga **ΔM

(ppm) P01942 Hemoglobin subunit alpha 15.1 10.56 IGGHGAEYGAEALER 1529.73186 +2 -1.64

P15105 Glutamine synthetase 42.1 8.58 VQAMYIWVDGTGEGLR 1794.87175 +2 -7.06

TcLLNETGDEPFQYKN 1928.87029 +2 0.39

P02088 Hemoglobin subunit beta-1 15.8 8.16 VVAGVATALAHK 1136.68144 +2 2.43

Q9EPL4 Methyltransferase-like protein 9 36.4 6.60 SLYVNmTSGPGGPAAAAGGGK 1878.91033 +2 4.67

O09173 Homogentisate 1,2-dioxygenase 49.9 6.52 SLRPGVAIADFVIFPPR 1855.05210 +3 -3.71

DFLIPVAWYEDR 1523.75127 +2 -1.12

P21107-2 Isoform 2 of Tropomyosin alpha-3 chain 29.0 6.05 SLYVNmTSGPGGPAAAAGGGK 1770.89971 +2 4.67

P00329 Alcohol dehydrogenase 1 39.7 4.27 KFPLDPLITHVLPFEK 1894.07682 +3 -3.67

O35490 Betaine--homocysteine S-methyltransferase 1 45.0 3.93 iSVmGGEQAATVLATVAR 1861.94768 +2 2.25

Q3ULD5 Methylcrotonoyl-CoA carboxylase beta chain 61.3 3.20 SLYVNmTSGPGGPAAAAGGGK 1831.96245 +2 4.67

Q8C985 Neurexin-3-beta 62.3 3.17 QLTIFNTQAQIAIGGKDK 1946.06548 +2 -2.65

Q8BWT1 3-ketoacyl-CoA thiolase 41.8 2.52 ITAHLVHELR 1188.68022 +2 -3.86

Q9CPY7-2 Isoform 2 of Cytosol aminopeptidase 52.7 2.46 TIQVDNTDAEGR 1318.62309 +3 -0.24

Q9D5D8 Chromodomain Y-like protein 2 56.1 1.79 QAGASKLLR 943.56798 +2 -0.44

Q6V3W6 Coiled-coil domain-containing protein lobo

homolog 103.2 1.26 LSQSSVESNPR 1203.60771 +2 9.36

P11499 Heat shock protein HSP 90-beta 83.2 1.24 YIDQEELNK 1151.55412 +2 -3.31

Q80SU7 Interferon-induced very large GTPase 1 280.6 0.58 eKAQTVMALLEEYK 1694.87638 +3 5.52

* MH+: massa do íon; ** ΔM: diferença entre a massa real e a massa encontrada.


51

Na Tabela 4 foram identificadas as subunidades do proteassoma 20S, presente

em ambas as amostras, enquanto na Tabela 5, são demonstradas as identidades das

proteínas co-eluídas com o mesmo, como por exemplo a HSP90, conhecida por ser uma

proteína ligante do proteassoma, bem como outras proteínas de alta massa molecular, o

que corrobora com as bandas proteicas presentes no perfil obtido na Figura 14 (B).

Abaixo, na Figura 17 pode ser observado o espectro de fragmentação obtido

durante a análise em espectrômetro de massas, referente ao peptídeo m/z = 712,39 de

carga +2 da subunidade a subunidade α5 do proteassoma 20S. Por meio do espectro de

massas do peptídeo de sequência LFQVEYAIEAIK, da subunidade α5 do proteassoma

20S, observa-se que foram identificados tanto resíduos que formam a série y quanto a

série b. No total, a análise demonstrou 17% de cobertura para a subunidade α5 do

proteassoma 20S.


52

Figura 17: Espectro de fragmentação do peptídeo m/z: 712.39 da subunidade α5 do proteassoma 20S. Carga: +2Da, MH+: 1423,78 Da, RT: 36,84 min, sendo

M/Z: massa/carga, MH+: massa do íon e RT: tempo de retenção.

y₉⁺

1035.56860

y₁₀²⁺-H₂O, y₅⁺

573.36749

b₁₀²⁺-NH₃

574.24622

y₆⁺

644.39642

y₈⁺

936.49847

y₇⁺

807.46027

y₆²⁺-NH₃, y₃⁺-NH₃

314.17001

y₈²⁺-NH₃, y₄⁺

460.27551

b₂⁺

261.15875

y₁⁺

147.11209

200 400 600 800 1000 1200 1400

m/z

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

Inte

nsity [co

un

ts] (1

0^6

)

Pre+H, Precursor, Precursor-H₂O, Precursor-H₂O-NH₃, Precursor-NH₃, Pre-H y, y-H₂O, y-NH₃

b, b-H₂O, b-NH₃

Extracted from: C:\Users\Administrator\Documents\RAW data & Search Results\Simone\26092014\proteassoma+bandas_altas.raw #10022 RT: 36.84 FTMS, [email protected], z=+2, Mono m/z=712.39398 Da, MH+=1423.78069 Da, Match Tol.=0.1 Da


53


análogos ao PR-11

Obtido o proteassoma purificado, o mesmo foi submetido a ensaios de atividade

junto ao PR-11 e análogos a fim de avaliar o potencial de modulação dos peptídeos nas

diversas concentrações estabelecidas. Para isso, o proteassoma foi incubado junto aos

peptídeos em diferentes concentrações durante 15 minutos a temperatura de 37°C, e em

seguida, foram adicionados o substrato específico para avaliação da atividade

peptidásica conforme item 4.1.3. Para este ensaio, foram realizadas triplicatas e a leitura

foi realizada após 1 hora de reação. O efeito dos peptídeos sobre a atividade residual do

proteassoma 20S pode ser observado na Figura 18.


54

Figura 18: Atividade quimotripsina símile residual do proteassoma 20S frente à atividade inibitória

de PR-11 e peptídeos análogos. A) Os peptídeos foram avaliados nas diversas concentrações

estabelecidas inicialmente; B) Os peptídeos PR-11, F12 e G9F12 foram avaliados em baixas

concentrações. As linhas em vermelho demonstram o IC50 do F12 comparado ao PR-11

Os peptídeos F12 e G9F12 apresentaram maior efeito inibitório que o PR-11

demonstrado em A, dessa forma, optou-se por avaliar estes peptídeos em concentrações

menores, como mostrado em B. Assim, pode ser notada em B, a maior capacidade

inibitória do F12 quando comparado ao PR-11, uma vez que o IC50 demonstrado pelas


55

linhas vermelhas, isto é, a quantidade de peptídeos necessários para inibir 50% da

atividade do complexo, foi menor em F12 quando comparado ao PR-11. As diferenças

significativas foram apresentadas nas concentrações de 0,25 e 0,125 µM que inibiram

70 e 53% da atividade respectivamente, enquanto o PR-11 inibiu cerca de 50% da

atividade na concentração de 0,25 µM e 25% na concentração 0,125 µM (p<0,05). Para

as demais concentrações e peptídeos avaliados, não houve diferença significativa

quando comparados às taxas de inibição causada pelo PR-11, o que mostra, que tais

estruturas análogas, possuem potencial inibitório tão eficaz quanto ao PR-11.

5.3. Ensaios de modulação da atividade do proteassoma 20S a partir de peptídeos

gerados por tripsinólise de proteínas séricas

Para obtenção de uma diversidade de peptídeos a serem avaliados, utilizamos

uma abordagem alternativa para geração de peptídeos potenciais ligantes de

proteassoma 20S, por meio da tripsinólise de proteínas séricas, uma vez que a

complexidade de proteínas presentes no plasma é considerável. Inicialmente, para

garantir a homogeneidade de proteínas a serem digeridas, as mesmas foram submetidas

a biblioteca combinatorial (ProteoMiner™ Protein Enrichment Kit - BioRad). Ao final

do processo, alíquotas das amostras iniciais e eluídas foram aplicadas em gel SDS-

PAGE 12% e corado em Coomassie Coloidal G-250. A técnica permitiu a depleção de

moléculas abundante e enriquecimento daquelas presentes em menor concentração,

como pode ser observado na Figura 19.


56

Figura 19: Perfil eletroforético comparativo para avaliação da capacidade do Proteominer® na

depleção de proteínas séricas. A) Fração inicial; B) Fração após depleção, onde nota-se a diminuição de

abundância de albumina sérica ( ~66 kDa) na fração; C) Fração não ligada.

Por meio da técnica, foi possível observar a depleção de grande parte da

albumina sérica da amostra eluída, o que gerou a obtenção de amostra com maior

homogeneidade em sua constituição. Dessa forma, a fração eluída (B), foi submetida a

eletroforese em SDS-PAGE 10% durante cerca de 10 minutos para realização de

digestão em gel. Seguinte a digestão das proteínas, os peptídeos resultantes foram

avaliados em espectrômetro de massas, onde detectou-se 426 peptídeos. Foi realizada a

avaliação do potencial de modulação destes peptídeos a partir de concentração 5 vezes

maior que aquela utilizada para o MG-132, ou seja, 50 µM e em concentração menor

que o MG-132, de 6,25 µM. Assim como o PR-11 e análogos, o proteassoma 20S

purificado foi incubado junto aos peptídeos, durante 15 minutos a 37°C, e em seguida,


57

foi adicionado o substrato específico para quimotripsina. Foram realizadas leituras a

cada 30 minutos, e as atividades obtidas de acordo com o tempo podem ser observadas

na Figura 20.

Figura 20: Atividade quimotripsina simile do proteasssoma 20S murino na presença de peptídeos

séricos totais (PST) e MG-132. A) Atividades quimotripsina símile na presença de peptídeos; B)

Atividade residual do proteassoma 20S na utilização dos peptídeos trípticos. Média +/- erro padrão.


58

Em A foram avaliadas as atividades quimotripsina símile na presença de

peptídeos em concentrações estabelecidas, onde pode ser observado efeito inibitório,

enquanto em B, é demonstrada a atividade residual do proteassoma 20S na utilização

dos peptídeos trípticos. Ao observar o resultado obtido, percebe-se uma inibição dose-

dependente nas concentrações avaliadas. A ação inibitória com diferença significativa

se deu na concentração de 50 µM a partir de 120 minutos de hidrólise do peptídeo

fluorogênico (p<0,05).

5.3.1. Ensaios de ligação peptídeos trípticos e proteassoma 20S

Verificada a modulação por parte dos peptídeos, foram realizados ensaios de

ligação dos peptídeos e proteassoma 20S. Dessa forma, os peptídeos foram incubados

junto ao proteassoma 20S e posteriormente, os peptídeos não ligados foram removidos

com sucessivas lavagens. Após a remoção, foi realizada alteração de pH do meio com o

uso de tampão Glicina pH 3,0, de modo a possibilitar o rompimento das interações entre

os peptídeos e o proteassoma, ocasionando assim, a recuperação dos peptídeos para

análise. Dessa forma, tanto os peptídeos ligantes e não ligantes obtidos ao final do

ensaio, foram purificados em C-18 e submetidos a espectrometria de massas, os dados

obtidos podem ser observados nas figuras 21 e 22. Os resultados apresentados não

possibilitaram a demonstração de quantidades detectáveis de peptídeos ligados ao

proteassoma 20S. Por outro lado, a presença de polímeros observada na região

compreendida entre m/z 200 a 700, provavelmente oriundos dos filtros utilizados para

recuperação dos peptídeos ligantes, pode ter ocasionado supressão significativa de íons

dificultando a detecção de possíveis peptídeos trípticos moduladores da atividade

quimotripsina símile do proteassoma 20S.


59

Figura 21: Contagem de íons e cromatogramas obtidos nos ensaios de ligação de peptídeos trípticos ao proteassoma 20S. A contagem de íons obtida durante

a análise dos peptídeos não ligantes (A) e de peptídeos ligantes de proteassoma (B). Em C e D, podem ser observadas as leituras em 214 nm dos peptídeos não

ligantes e ligantes respectivamente.


60

Figura 22: Espectro de peptídeos não ligantes (A) e ligantes de proteassoma 20S (B).

6. Discussão

Carmo, S.G. Discussão

61

6. Discussão

Dada a importância do proteassoma como constituinte da via de degradação

envolvida em diversos processos celulares, o entendimento de seu funcionamento,

regulação, bem como a descoberta de alvos inibidores, são de grande relevância para

que novos alvos terapêuticos possam vir a serem desenvolvidos (KISSELEV et al.,

2012; RUSCHAK et al., 2011). Neste sentido, nosso trabalho objetivou a purificação

do proteassoma 20S para avaliação do potencial modulatório de moléculas análogas ao

inibidor PR-11, bem como a prospecção de novas moléculas inibitórias obtidas por

tripsinólise sérica.

A primeira abordagem consistiu na purificação do proteassoma 20S, iniciada a

partir de extrato proteico obtido do homogenato de fígado de camundongo Balb/c,

submetido a três etapas cromatográficas, as quais foram baseadas em estudos prévios

(BREGUEZ, 2012; CASTRO-BORGES et al., 2007). A etapa inicial consistiu do

fracionamento do homogenato em coluna de filtração molecular. O princípio desta

técnica baseia-se na separação de moléculas de acordo com a massa molecular. As

frações enriquecidas com o proteassoma 20S foram identificadas com base em ensaio de

atividade quimotripsina símile monitorado na presença de MG-132 e ativação por SDS.

Agentes caotrópicos como SDS, provavelmente ocasionam o rompimento de

interações entre as várias proteínas ligantes do proteassoma, e/ou por meio da

desnaturação de extremidades das subunidades α do proteassoma 20S (COUX et al.,

1996). Em ambos os casos, o SDS atua facilitando o acesso e a difusão do substrato alvo

ao centro catalítico do proteassoma 20S, aumentando consequentemente, as taxas de

hidrólise da protease (SHIBATANI; WARD, 1995). A fim de utilizar um padrão de

comparação inibitório para o ensaio, foi utilizado o MG-132, inibidor de proteassoma

frequentemente escolhido em estudos devido ao fato de ser potente e de baixo custo.

Este age inicialmente no sítio com atividade quimotripsina símile, mas em altas

concentrações, exerce também efeito inibidor sobre o sítio caspase-símile. Como pode

ser observado na Figura 11, foi obtida inibição da atividade quimotripsina símile ao

longo de todas as frações avaliadas, o que se deve a presença do grupo funcional aldeído

do MG-132, que é altamente reativo e possui elevada afinidade por diversas proteases,

exercendo efeito inibitório sobre estas (GOLDBERG, 2012). Porém, ao avaliar em


62

conjunto as três condições utilizadas, isto é, a atividade quimotripsina símile na

presença de SDS 0,02% que seria ativada, na presença de MG-132 10 µM que seria

inibida e a condição controle, observou-se que entre as frações 26 e 34, ocorreu a

inibição de cerca de 96% da atividade pelo MG-132, e o aumento da mesma pelo SDS

0,02% quando comparadas a condição controle. Tais resultados indicam claramente a

presença de atividade quimotripsina símile do proteassoma na faixa de frações citada.

O intervalo das frações compreendidas na faixa de 26 a 34 obtidas na

cromatografia por exclusão molecular foi então submetido ao segundo método de

purificação que consistiu no uso da coluna de Hidroxiapatita. A resina utilizada nesta

etapa possui grande capacidade de adsorção de proteínas, e os grupos funcionais

distribuídos regularmente pela matriz são constituídos de íons cálcio carregados

positivamente e grupos fosfatos carregados negativamente (BIO-RAD, 2007). Dessa

forma, a resina é capaz de isolar tanto por afinidade de ligação ao cálcio, quanto por

meio de troca catiônica quando a interação se dá pelo grupo fosfato. O cálcio possui

afinidade pelos grupos carboxila das proteínas e repele os grupos amino, enquanto a

troca catiônica ocorre quando estes grupamentos amino de proteínas interagem

ionicamente com os fosfatos, ao mesmo tempo em que repelem os grupos carboxilas,

por sua vez, a interação grupamento amino-fosfato é interrompida com a adição de sais

neutros (CUMMINGS; SNYDER; BRISACK, 2009). Como o proteassoma é uma

proteína de caráter ácido e ainda apresenta subunidades capazes de serem modificadas

por fosforilação (DREWS, 2007) o mecanismo de ligação de proteassomas a essa

coluna provavelmente ocorre a partir de interação por afinidade aos íons cálcio. Dessa

forma, são diversos os trabalhos que utilizaram a Hidroxiapatita durante o processo de

purificação de proteassomas de diferentes organismos (BECK et al., 2014; CASTRO-

BORGES et al., 2007; FRANZETTI et al., 2002; KANAYAMA et al., 1992;

MINAMI et al., 2000; NAGY et al., 1998; SAVULESCU et al., 2011).

As frações obtidas ao longo da eluição em Hidroxiapatita foram analisadas por

SDS-PAGE a fim de identificar as frações contendo proteassoma 20S e avaliar o grau

de enriquecimento obtido até o momento. O perfil obtido após coloração com prata,

permitiu a visualização das bandas proteicas condizentes com a massa molecular das

subunidades constituintes do proteassoma (Figura 13). Trabalhos que utilizaram

diferentes organismos como Schistosoma mansoni (CASTRO-BORGES et al., 2007) e


63

Xenopus (SAVULESCU et al., 2011) tendo a Hidroxiapatita como método de

enriquecimento do proteassoma 20S, apresentaram perfis de bandas proteicas

condizentes com o perfil obtido neste trabalho.

Com o intuito de obter uma fração mais homogênea de proteassomas 20S optou-

se por realizar uma recromatografia em exclusão molecular. Ao final da purificação,

ensaios de atividade quimotripsina símile das frações contendo proteassoma 20S foram

realizados para determinação de atividade específica e grau de enriquecimento obtido

em cada etapa. A recromatografia por exclusão molecular foi satisfatória, uma vez que

se obteve aumento da atividade específica após este procedimento. Além disso, foram

obtidos dois perfis distintos de proteassoma 20S, um diferindo do outro pela presença de

bandas proteicas de alta massa molecular no perfil eletroforético 1D (Figura 14).

Considerando que estas proteínas se mantiveram presentes até o momento final da

purificação, uma hipótese levantada durante o estudo, seria a possível interação destas

moléculas e sua relação como moduladoras alostéricas do proteassoma. Assim como as

modificações pós traducionais e complexos moduladores, diversas proteínas associam-

se ao proteassoma a fim de regular sua atividade (WANG; HUANG, 2008). Tais

proteínas podem influenciar no processo de reconhecimento de substratos

poliubiquitinados, desubiquitinação e desnaturação de substratos alvos (SCRUGGS et

al., 2012). Dessa forma, utilizou-se de espectrometria de massas para identificação das

proteínas presentes na amostra.

Durante a eluição dos peptídeos gerados pela digestão das frações contendo

atividade quimitripsina símile do proteassoma 20S em espectrômetro de massas, obteve-

se uma distribuição uniforme dos peptídeos ao longo do gradiente, o que possibilitou

uma identificação mais eficaz. A identificação de íons de série y e b, cujos fragmentos

são referentes ao rompimento de ligações peptídicas, é um importante dado, uma vez

que a confirmação destes íons se dá por complementariedade. Todas as proteínas

identificadas (Tabelas 4 e 5) apresentaram homologia com aquelas presentes em banco

de dados de Mus musculus, o qual foi utilizado para busca.

Dentre as identificações, obteve-se a presença de HSPs (Heat shock proteins),

proteínas estas, já conhecidas por se ligarem ao proteassoma exercendo efeito

modulatório sob sua atividade proteolítica (BOZAYKUT; OZER; KARADEMIR, 2014;

LANNEAU et al., 2010). As HSPs são chaperonas moleculares, encontradas em todas


64

as células e classificadas normalmente de acordo com a massa molecular. São

consideradas fatores de estresse e são rapidamente induzidas em resposta a fatores

diversos como aumento de temperatura, drogas citotóxicas, irradiação UV e

metabolismo celular. Possuem ainda importante papel na conformação e maturação de

vários fatores de transcrição e proteínas. No caso das HSP 70 e HSP 90, quando ocorre

a presença de uma proteína mal enovelada ou com perda da função, estas são

responsáveis por determinar se as mesmas serão reparadas ou degradadas pelo sistema

ubiquitina proteassoma. Dessa forma, quando o re-enovelamento não é mais possível, os

substratos são direcionados para a degradação, contudo, frente a inibição da atividade

proteassomal, um aumento na expressão das HSPs é ocasionado, uma vez que há

necessidade na prevenção do acúmulo de agregados proteicos e proteínas danificadas

(BOZAYKUT et al., 2014). Assim, a associação direta ou indireta dessas HSPs com o

proteassoma para garantir o controle de qualidade das proteínas é importante

mecanismo celular (LANNEAU et al., 2010). Em diversos trabalhos que objetivaram a

purificação do proteassoma 20S utilizando-se de exclusão molecular, foram encontradas

HSPs co-eluídas junto ao complexo (BOUSQUET-DUBOUCH et al., 2009; CASTRO-

BORGES et al., 2007; KAUTTO et al., 2009; MONTEL et al., 1999).

Dentre as demais proteínas co-eluídas com o proteassoma, foram identificadas

proteínas alvos de degradação pela via proteassomal, como a subunidade α da

Hemoglobina, Glutamina Sintetase, Tropomiosina, Enzima Alcool Desidrogenase

(ADH), Betaína-homocisteína S-metil Transferase e 3-Cetoacil-CoA Tiolase.

KAUTTO et al. (2009), realizaram a purificação de proteassomas 26S de Trichoderma

resei por meio de cromatografias de troca iônica e exclusão molecular e identificou por

espectrometria de massas, proteínas co-eluídas como a Actina, Fatores de Iniciação α3 e

α4, Fatores de Elongação γ1 e HSPs. BOUSQUET-DUBOUCH et al. (2009),

demonstraram por espectrometria de massas 322 proteínas associadas ao proteassoma

de camundongos que recebiam álcool cronicamente, enquanto nos animais controles,

foram encontradas 495. Dentre elas, a Carbamoil Fosfato Sintetase, Tubulinas, Fatores

de Elongação, Miosina, Citocromo P450, HSPs, Tropomiosina, entre outras. No

presente trabalho para a maioria das proteínas identificadas, não há relatos na literatura

de possíveis interações com o proteassoma. Entretanto, não se descarta a possibilidade


65

dessas moléculas representarem novos ligantes do proteassoma 20S, com possível

capacidade moduladora de atividade.

A inibição do proteassoma tem sido considerada ferramenta promissora na

biologia celular em estudos que visam elucidar as funções celulares diversas. Vale

ressaltar a busca para o desenvolvimento de peptídeos inibidores como agentes

antitumorais após o emprego do Bortezomib para o tratamento do mieloma múltiplo.

Atendendo a um dos objetivos específicos do trabalho, avaliou-se a capacidade

inibitória de análogos do peptídeo PR-11. Esse peptídeo liga-se a subunidade α7,

alterando a conformação do proteassoma, e consequentemente, inibindo sua atividade e

modificando dessa forma a expressão de fatores da via do NFκβ, o que faz com que

lesões sejam reduzidas em estados inflamatórios (ANBANANDAM et al., 2008).

Em estudos que utilizaram PR-39 e sequências parciais do PR-11, como o PR-8

e PR-5, a fim de definir a região envolvida na interação com o proteassoma foi

observado grande efeito inibitório por parte dos peptídeos PR-39 e PR-11, ao contrário

dos peptídeos menores, que exerceram pouco efeito, presumindo-se que estes atuaram

como substratos do proteassoma. Além disso, foi observado que análogos com

modificações na região N-terminal, não exerceram atividade inibitória sobre o

proteassoma 20S (GACZYNSKA et al., 2003). Sabendo da sequência responsável pela

modulação da atividade proteassomal, tornou-se de interesse a busca por estruturas

análogas que pudessem interferir com a mesma em proporções diversas para uso de

acordo com o interesse e necessidade.

Em trabalho prévio realizado pelo grupo de pesquisa (BREGUEZ, 2012), foram

sintetizados diversos peptídeos análogos ao PR-11, os quais sofreram modificações em

sua região C-terminal, uma vez, que a região N-terminal é a de maior influência sobre a

atividade proteolítica do proteassoma (ANBANANDAM et al., 2008). Dando

continuidade a investigação sobre os análogos em diferentes concentrações, foram

selecionados três peptídeos os quais foram empregados no estudo. A escolha dos

análogos foi baseada na semelhança estrutural entre ambos, uma vez que nestes três

peptídeos, as modificações consistiam na introdução de um resíduo de Fenilalanina (F)

ao final da cadeia, sendo que em dois deles, G9F12 e I9F12, foram realizadas

substituições de um resíduo de Leucina por Glicina (G) e Isoleucina (I) respectivamente

na posição 9. Ambos os peptídeos obtiveram um grau de pureza satisfatório ao final da


66

síntese e tiveram suas identidades confirmadas por espectrometria de massas. Estes

peptídeos foram analisados previamente quanto à capacidade inibitória na concentração

de 1 µM frente à atividade quimotripsina símile de preparações enriquecidas de

proteassoma 20S humano, murino e de vermes adultos de Schistosoma mansoni. As

capacidades inibitórias de todos os peptídeos foram similares à do PR-11 e não

apresentaram diferenças significativas (BREGUEZ, 2012).

Ao avaliar o potencial inibitório nas diferentes concentrações estabelecidas

(Figura 18), observa-se que as taxas de inibição dos peptídeos modificados são

semelhantes às obtidas para o peptídeo PR-11, exceto pelo fato de os peptídeos F12 e

G9F12 apresentarem um potencial inibitório maior que o PR-11. Esse resultado motivou

novos testes de cinética de inibição para F12 e G9F12 em concentrações menores.

Nessa segunda análise, notou-se que o F12 apresentou menor IC50 que o PR-11, o que

se refere que a quantidade de F12 necessária para inibir 50% da atividade proteassomal

é menor que a quantidade de PR-11 necessária, sendo assim, a capacidade de inibição

do F12 foi maior que a capacidade do PR-11, apresentado diferenças significativas nas

concentrações de 0,25 e 0,125 µM (p<0,05). Para os demais, não houve diferenças

significativas, o que mostra que tais análogos possuem potencial inibitório semelhante

ao PR-11.

Na literatura, são descritos análogos do PR-11 como G9 (RRRPRPPYGPR),

W12 (RRRPRPPYLPRW) e F8W12 (RRRPRPPFLPRW), os quais representam

moléculas de maior capacidade inibitória quando comparada ao PR-11. Tais estruturas

consistiram em modificações sutis, onde foram mantidas as regiões identificadas como

requisito para inibição do proteassoma por meio da interação com a subunidade α7, ou

seja, foram mantidos pelo menos dois resíduos de arginina carregados positivamente na

região N-terminal e resíduos hidrofóbicos na região C-terminal. ANBANANDAM et al.

(2008) avaliaram ainda estruturas com modificações na região N-terminal de forma não

conservativa ao PR-11, onde observaram que não houve inibição da atividade

proteassomal, porém quando a modificação foi realizada de forma conservativa os

resultados foram satisfatórios. Outras modificações testadas, consistiram na substituição

de Tirosina na posição 8, a qual possui importantes características na conformação do

PR-11 devido a sua hidrofobicidade e presença de anel aromático. Este resíduo foi


67

substituído por Fenilalanina e Glutamina, onde ambos demonstraram aumento na

capacidade inibitória (ANBANANDAM et al., 2008; GAO et al., 2000).

Além dos análogos de PR-11 são encontrados na literatura, peptídeos ricos em

prolina, o que reforça a importância do estudo de moléculas análogas de inibidores, uma

vez que apresentam como domínio ativo a região rica em prolina. As estruturas análogas

ao PR-11 assemelham-se a estrutura do inibidor endógeno PI 31, devido a presença de

prolinas na porção C-terminal. Este age como inibidor seletivo do proteassoma

impedindo a ligação do complexo heptamérico PA28 αβ ao centro catalítico, também

por meio da interação com subunidades α do proteassoma. No caso do PI 31, foi

demostrado por meio de modificações, que a porção rica em prolina presente na região

C-terminal, define a atividade da molécula (MCCUTCHEN-MALONEY et al., 2000).

Estes trabalhos mostram a relevância na busca de estruturas análogas, com pequenas

modificações em sua cadeia, uma vez que estas podem vir a apresentar potenciais de

inibição e regulação distintos.

Outra estratégia utilizada para a prospecção de novas moléculas inibidoras

consistiu na busca de peptídeos trípticos com capacidade de modulação da atividade

proteassomal. A maioria dos inibidores de proteassoma consiste de peptídeos curtos

modificados com grupo eletrofílico, que interagem com o C-terminal de resíduos

treonina catalíticos dessa protease. Como exposto anteriormente, os peptídeos inibidores

de proteassoma distinguem-se em diversas classes, sendo os mais comumente utilizados

os peptídeos aldeídicos, boronatos e epoxicetonas (DOWNEY et al., 2015;

GOLDBERG, 2012).

A fim de se obter uma variedade de peptídeos a serem testados frente a atividade

do proteassoma, utilizamos a tripsinólise de proteínas de soro fetal bovino, com base na

complexidade proteica que estaria disponível para originar diversidade estrutural de

peptídeos. Além disso, a digestão por meio de tripsina possibilitou a obtenção de

peptídeos com tamanho médio similar aos inibidores de proteassoma já conhecidos.

Entretanto, ao se utilizar o soro como fonte de proteínas, uma maior concentração de

peptídeos provenientes de proteínas presentes em maior abundância seriam gerados, o

que poderia dificultar possíveis interações de peptídeos presentes em baixos níveis com

o proteassoma 20S. Com o intuito de garantir homogeneidade de proteínas presentes na


68

amostra, optou-se pela utilização da técnica de depleção para uma melhor

representatividade do proteoma total sérico, anteriormente à etapa de tripsinólise.

A utilização de uma biblioteca combinatorial de hexapeptídeos propiciou com

que cada proteína sérica se ligasse a um hexapeptídeo específico até a saturação dos

sítios ligantes. Desse modo, as proteínas abundantes foram removidas, enquanto que as

proteínas de baixa abundância foram concentradas, possibilitando assim, um equilíbrio

entre a diversidade proteica contida na amostra. Nota-se que após a depleção, proteínas

abundantes do soro como albumina apresentaram níveis reduzidos enquanto outras de

menor massa molecular apareceram evidentes no gel 1D (Figura 19), o que demonstra a

eficácia da técnica, uma vez que foi obtido com a mesma, a depleção de algumas

proteínas e consequente enriquecimento de outras.

Após a depleção de proteínas abundantes e enriquecimento de proteínas com

menor massa, foram gerados os peptídeos trípticos e ensaios de atividade foram

realizados nas concentrações estabelecidas, seguindo protocolos descritos

anteriormente. A análise dos resultados obtidos (Figura 20), mostra que ocorreu inibição

da atividade quimotripsina símile do proteassoma 20S nas concentrações de 50 e 6,25

µM de peptídeos totais. Atividade inibitória com diferença significativa ocorreu a partir

de 120 minutos de hidrólise do peptídeo fluorogênico utilizando-se de peptídeos totais

na concentração de 50 µM (p<0,05). Acredita-se que efeitos diversos dose dependente

possam ocorrer, uma vez que peptídeos diferentes podem se ligar a sítios múltiplos no

proteassoma 20S.

Dentre várias classes de peptídeos estudados, são diversos os mecanismos de

ação e as concentrações com capacidade inibitória. O inibidor específico de

imunoproteassoma IPSI-001, por exemplo, se liga preferencialmente as subunidades

β1i. Essa molécula induziu acúmulo de conjugados ubiquitina-proteína, proteínas pró-

apoptóticas, ocasionando apoptose celular em modelos de cânceres hematológicos

(KUHN et al., 2009). Os peptídeos do tipo aldeídico realizam uma ligação lenta ao sítio

catalítico e além disso, a dissociação pode se dar de forma rápida por oxidações, o que

resulta em inibição de curta duração e possível resistência, porém sua vantagem, é o fato

de serem de fácil penetração celular. Já os peptídeos boronatos são mais potentes e

seletivos que os aldeídicos, e embora sejam reversíveis, o rompimento da ligação pode

levar horas e apresentam a vantagem de não serem inativados por oxidações e nem


69

serem transportados para fora das células (PELLOM; SHANKER, 2012). Derivados de

TMC-95, peptídeo cíclico de Apiospora montagne, é um inibidor potente da atividade

quimotripsína símile, que age de forma competitiva. As epoxicetonas são peptídeos que

possuem alta afinidade pelo proteassoma, em consequência à formação do derivado

morfolina durante o processo de inibição (KISSELEV; GOLDBERG, 2001).

A última análise consistiu na identificação de possíveis peptídeos ligantes ao

proteassoma, incubando-se o mesmo com os peptídeos trípticos obtidos por digestão de

amostra sérica depletada. Após a remoção dos peptídeos não ligantes por sucessivas

lavagens, realizou-se alteração de pH para a recuperação dos peptídeos com capacidade

de se ligar ao proteassoma 20S. Os peptídeos eluídos foram então submetidos à análise

por espectrometria de massas. Os resultados obtidos para essa análise não foram

conclusivos uma vez que os peptídeos trípticos ligantes do proteassoma 20S podem

estar presentes em baixíssimas concentrações. Mesmo considerando-se a alta

sensibilidade do analisador de massas utilizado, outros interferentes presentes na

preparação podem ainda ter dificultado a identificação dos peptídeos. Métodos

alternativos de ensaios de ligação ao proteassoma e recuperação dos ligantes serão

futuramente padronizados no laboratório.

7. Conclusões

Carmo, S.G. Conclusões

70

7. Conclusões

- A purificação do proteassoma 20S demonstrou a obtenção de duas subpopulações do

complexo com alta atividade quimotripsina símile;

- A análise por espectrometria de massas, possibilitou a confirmação do enriquecimento

a partir da identificação de subunidades α e β obtida do proteassoma 20S. A

identificação de proteínas de alta massa molecular eluídas junto ao mesmo corrobora

com o perfil apresentado por eletroforese;

- Os testes de inibição da atividade quimotripsina símile do proteassoma 20S,

confirmaram eficácia dos peptídeos análogos ao PR-11: I9F12, G9F12 e F12.

Particularmente, o análogo F12 apresentou maior capacidade inibitória que o PR-11.

Nossos resultados indicaram que mudanças sutis na estrutura de moléculas já

conhecidas podem melhorar o potencial inibitório e contribuir para a proposição de

moléculas a serem utilizadas em menor dose;

- A utilização da biblioteca combinatorial foi de grande importância, uma vez que

demonstrou depleção de proteínas séricas abundantes e contribui para obtenção de

maior diversidade dos peptídeos trípticos.

- Os peptídeos séricos totais gerados exerceram capacidade de modulação de atividade

quimotripsína símile do proteassoma 20S, e portanto podem representar novas

moléculas inibidoras deste complexo.

Carmo, S.G. Conclusões

71

8. Perspectivas

Carmo, S.G. Perspectivas

72

8. Perspectivas

Considerando os resultados e conclusões obtidos, pretende-se:

- Padronizar novos ensaios de ligação e recuperação de peptídeos trípticos ligantes do

proteasssoma 20S de modo a facilitar a identificação dos mesmos por espectrometria de

massas;

- Selecionar e sintetizar em larga escala os peptídeos trípticos identificados com

capacidade inibitória do proteassoma 20S;

- Realizar testes in vitro para determinação de permeabilidade celular dos peptídeos de

interesse.

9. Referências Bibliográficas

Carmo, S.G. Referências Bibliográficas

73

9. Referências Bibliográficas

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10. Apêndices

Carmo, S.G. Apêndices

83

10. Apêndices

10.1. Geração de peptídeos trípticos

Figura 23: SDS PAGE 10% para digestão em gel. A) Padrão de massa molecular; B) Fração

proteica.

Conforme descrito no item 4.3, 25 µg de proteínas foram submetidas a

eletroforese em gel SDS PAGE 10% durante o tempo necessário para que todas

proteínas penetrassem no gel. O acompanhamento da migração foi realizado por meio

da utilização de padrão de massa molecular pré-corado (Sigma). A seta em vermelho

aponta a banda referente a 100 kDa, a qual foi considerada para interrupção da

eletroforese. Em seguida, o gel foi corado com Coomassie Coloidal G-250 para

visualização das bandas a serem excisadas.


84

10.2. Tabela Suplementar

Tabela Suplementar 1: Identificação de subunidades constituintes do proteassoma 20S

Nº Acesso % Cobertura Peptídeos únicos *MH+(Da) Carga **ΔM

(ppm) Mr (kDa) Score Proteínas Area Aas RT pI

Proteasome subunit alpha type-5

Q9Z2U1 17.01 AIGSASEGAQSSLQEVYHK 1961.94211 3 -7.27

26.4 9.03 1 704011917.5 241 18.6 4.79

LFQVEYAIEAIK 1423.78069 2 -1.77

GVNTFSPEGR 1063.51482 2 -1.82

Proteasome subunit beta type-4

P99026 13.26 FDGGVVIAADMLGSYGSLAR 1998.98979 2 -2.8

29.1 9.62 1 190371708.708333 264 42.7 5.64

EVLEKQPVLSQTEAR 1726.93657 2 1.79

QPVLSQTEAR 1128.59966 2 -1.02


Q9Z2U0 11.69 LTVEDPVTVEYITR 1634.85588 2 -4.75 27.8 7.41 2 866880532 248 31.7 8.46

NYTDDAIETDDLTIK 1726.79595 2 -3.71


Q9QUM9 10.98 ILTEAEIDAHLVALAERD 1979.03899 2 -2.79 27.4 6.65 1 93216037 246 36.8 6.76

LYQVEYAFK 1160.58904 2 -8.29


O70435 10.2 AVENSSTAIGIR 1217.64446 2 -3.32 28.4 6.09 1 419496507.515625 255 15.4 5.44

SLADIAREEASNFR 1578.77263 2 -9.19


Q9R1P1 8.78 LYIGLAGLATDVQTVAQR 1889.04119 2 -4.23 22.9 7.02 1 444932789.5 205 40.1 6.55


O09061 7.5 DVFISAAERDVYTGDALR 1997.98734 3 -2.73 26.4 4.79 1 124827478 240 32.8 7.81


P49722 5.98 GYSFSLTTFSPSGK 1478.70867 2 -5.12 25.9 3.12 1 473302745 234 32.7 7.43


85




O55234 5.3 ATAGAYIASQTVK 1280.68059 2 -3.09 28.5 6.62 1 198570016.9375 264 15.8 7.02

ATAGAYIASQTVKK 1408.78008 2 0.4


P70195 5.05 ATEGMVVADKNcSK 1509.70195 2 -1.14 29.9 2.32 1 12039216.109375 277 11.8 7.99


Q9R1P3 3.98 RNLADcLR 1017.52526 2 -0.61 22.9 2.76 1 244612558.5 201 13.8 7.02


Q60692 3.78 DGSSGGVIR 847.42558 2 -1.52 25.4 2.76 1 81313128.625 238 11.5 5.11


86

Tabela Suplementar 2: Identificação de proteínas co-elúidas junto ao proteassoma 20S


(ppm) Mr (kDa) Score Proteínas Area Aas RT pI Calc

Hemoglobin subunit alpha

P01942 10.56 IGGHGAEYGAEALER 1529.73186 2 -1.64 15.1 6,5 1 472381308.3 142 15,98 8,22

Glutamine synthetase

P15105 8.58 VQAMYIWVDGTGEGLR 1794.87175 2 -7.06 42.1 8,43 1 45272534.5 373 36,22 7,08

TcLLNETGDEPFQYKN 1928.87029 2 0.39

Hemoglobin subunit beta-1

P02088 8.16 VVAGVATALAHK 1136.68144 2 2.43 15.8 3,76 2 82178473.375 147 14,93 7,65

Methyltransferase-like protein 9

Q9EPL4 6.6 SLYVNmTSGPGGPAAAAGGGK 1878.91033 2 4.67 36.4 2,96 1 318 33,91 6,68

Homogentisate 1,2-dioxygenase

O09173 6.52 SLRPGVAIADFVIFPPR 1855.05210 3 -3.71 49.9 6.46 1 219073370.09375 445 39.1 7.24

DFLIPVAWYEDR 1523.75127 2 -1.12

Isoform 2 of Tropomyosin alpha-3 chain

P21107-2 6.05 SLYVNmTSGPGGPAAAAGGGK 1770.89971 2 4.67 29 2.57 1 11806769.875 248 14.9 4.78

Alcohol dehydrogenase 1

P00329 4.27 KFPLDPLITHVLPFEK 1894.07682 3 -3.67 39.7 3.16 1 80673502.5 375 37.7 8.1

Betaine--homocysteine S-methyltransferase 1

O35490 3.93 iSVmGGEQAATVLATVAR 1861.94768 2 2.25 45 3.25 1 80673502.5 407 45.9 7.89

Methylcrotonoyl-CoA carboxylase beta chain

Q3ULD5 3.2 SLYVNmTSGPGGPAAAAGGGK 1831.96245 2 4.67 61.3 2.97 1 563 36.4 8

Neurexin-3-beta

Q8C985 3.17 QLTIFNTQAQIAIGGKDK 1946.06548 2 -2.65 62.3 2.96 3 784657452 567 4.07 9.36

3-ketoacyl-CoA thiolase

Q8BWT1 2.52 ITAHLVHELR 1188.68022 2 -3.86 41.8 2.37 1 40320658.75 397 14.1 8.09

Isoform 2 of Cytosol aminopeptidase

Q9CPY7-2 2.46 TIQVDNTDAEGR 1318.62309 3 -0.24 52.7 3.38 2 60258815.84375 488 13.3 7.03


87



Chromodomain Y-like protein 2

Q9D5D8 1.79 QAGASKLLR 943.56798 2 -0.44 56.1 2.63 1 153732471.5 503 15.9 8.65

Coiled-coil domain-containing protein lobo homolog

Q6V3W6 1.26 LSQSSVESNPR 1203.60771 2 9.36 103.2 2.37 1 47966085.71875 876 14.8 5.38

Heat shock protein HSP 90-beta

P11499 1.24 YIDQEELNK 1151.55412 2 -3.31 83.2 2.35 2 132354930 724 14.2 5.03

Interferon-induced very large GTPase 1

Q80SU7 0.58 eKAQTVMALLEEYK 1694.87638 3 5.52 280.6 3.03 1 152881855 2427 16 6.57