Proteأ´mica de cأ©lulas ASK-2 (Atlantic Salmon Kidney 2) ´mica de...آ  kidney (ASK-2) cells infected

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  • UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS

    ESCOLA DE VETERINARIA

    Programa de Pós-graduação em Ciência Animal

    Proteômica de células ASK-2 (Atlantic Salmon Kidney 2)

    infectadas pelo vírus da anemia infecciosa do salmão

    DENILSON EDUARDO SILVA CUNHA

    Belo Horizonte

    2019

  • UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS

    ESCOLA DE VETERINARIA

    Programa de Pós-graduação em Ciência Animal

    Proteômica de células ASK-2 (Atlantic Salmon Kidney 2) infectadas pelo vírus da

    anemia infecciosa do salmão

    Orientador: Prof. Dr. Henrique César Pereira Figueiredo

    Co-orientador: Dr. Júlio César Câmara Rosa

    Belo Horizonte

    2019

    Tese apresentada ao Programa de Pós-

    graduação em Ciência Animal (área de

    concentração: Medicina Veterinária

    Preventiva) da Escola de Veterinária da

    Universidade Federal de Minas Gerais, como

    requisito parcial para obtenção do título de

    Doutor em Ciência Animal

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  • 3

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    AGRADECIMENTOS

    A Deus, por me guiar até aqui.

    Aos meus pais, Fábio e Terezinha, pelo apoio em todos os momentos.

    Aos meus irmãos, Daniel e Diana, pelo companheirismo.

    Ao Davidson, por cuidar de mim.

    Ao meu orientador, Prof. Dr. Henrique César Pereira Figueiredo, por me aceitar como

    seu aluno e por contribuir para minha formação profissional.

    Ao meu co-orientador, Dr. Júlio César Câmara Rosa, por seus ensinamentos e ajuda em

    todas as etapas do projeto, além da amizade.

    Aos diretores do Centro de Microscopia da UFMG, Prof. Dr. Wagner Nunes, Prof. Dr.

    Gregory Kitten e Profa. Dr. Elizabeth Ribeiro da Silva, pela compreensão e liberação do

    trabalho para realização das atividades do doutorado.

    Aos amigos do Laboratório de Doenças de Animais Aquáticos e do AQUACEN

    (Laboratório Oficial Central da Rede Nacional de Laboratórios do Ministério da

    Agricultura, Pecuária e Abastecimento).

    Aos amigos do Centro de Microscopia da UFMG.

    Ao Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal da Escola de Veterinária da

    UFMG.

    Ao CNPq e FAPEMIG pelo apoio financeiro.

    A todos os professores e funcionários do Departamento de Medicina Veterinária

    Preventiva da EV-UFMG

    Ao Felipe, pelas análises em bioinformática.

  • 5

    A Cristiana, pelas análises em espectrometria de massas.

    A Graciela, pelas análises em PCR em tempo real.

    A Jéssica, pela grande ajuda na formatação desta tese e artigo.

    A todos que, de alguma forma, contribuíram na elaboração, execução e conclusão desta

    tese.

  • 6

    RESUMO

    A anemia infecciosa do salmão (AIS) é uma doença do salmão do Atlântico

    cultivado causada pelo vírus da anemia infecciosa do salmão (ISAV), pertencente à

    família Orthomyxoviridae. Embora vários estudos moleculares tenham objetivado

    compreender a interação salmão-ISAV, nenhum deles concentrou sua atenção na

    dinâmica do proteoma da célula hospedeira na infecção pelo ISAV. O presente estudo

    avaliou a dinâmica do proteoma e as alterações ultraestruturais de células de rim de

    salmão do Atlântico (ASK-2) infectadas pelo ISAV em 12, 36, 60 e 84 horas pós-

    infecção por proteômica quantitativa baseada em espectrometria de massas e

    microscopia eletrônica de transmissão. Um total de 1.726 proteínas foram identificadas.

    Destas, 390 proteínas foram diferencialmente produzidas em relação ao grupo controle e

    434 foram identificadas exclusivamente em culturas de células infectadas pelo ISAV.

    Os resultados revelaram que as alterações nos níveis de expressão das proteínas

    celulares aumentam durante a infecção viral, onde a maioria das proteínas foi regulada

    negativamente. A análise de bioinformática mostrou que proteínas diferencialmente

    produzidas estão envolvidas em vários processos biológicos, como regulação da

    expressão gênica e da resposta imune, denotando que as atividades intracelulares foram

    alteradas pela infecção viral. Diversas proteínas identificadas já foram estudadas como

    fatores celulares relevantes para a replicação viral, atuando desde a entrada do vírus na

    célula até o seu brotamento, especialmente para o vírus influenza, outro membro da

    família Orthomyxoviridae. Os achados por microscopia eletrônica confirmaram algumas

    alterações descritas em estudos anteriores e também descrevem novas alterações na

    célula. O proteoma da célula ASK-2 se mostrou distinto para cada tempo de coleta,

    altamente dinâmico e com tendência de redução progressiva das proteínas celulares

    (host shutoff).Os resultados permitiram inferir novos aspectos da biologia do ISAV.

    Palavras-chaves: proteoma, HDMS, isavirus, Salmo salar

  • 7

    ABSTRACT

    Infectious salmon anemia (ISA) is a disease of farmed Atlantic salmon caused

    by the aquatic orthomyxovirus infectious salmon anemia virus (ISAV). Although

    several molecular studies have aimed to understand salmon-ISAV interaction, none of

    them has focused their attention upon the viral and host cell proteomes dynamics. We

    studied the dynamics of the proteome and ultrastructural changes of Atlantic salmon

    kidney (ASK-2) cells infected with ISAV up to 12, 36, 60 and 84 hours post infection

    by mass spectrometry based quantitative proteomics and transmission electron

    microscopy. A total of 1.726 proteins were identified. From these, 390 proteins were

    differentially expressed in relation of control group and 434 were identified exclusively

    in ISAV-infected cell cultures. Our data revealed that changes in salmon protein

    expression levels increase during viral infection, where, most proteins were

    significantly down-regulated. Bioinformatics analysis showed that differentially

    expressed proteins are involved in several biological processes, such as gene expression

    and immune response, suggesting that intracellular activities were changed upon viral

    infection. Through literature review, many of the proteins identified here have already

    been studied as host factors relevant for viral replication, acting from the entrance of the

    virus in the cell until its budding, especially for influenza virus. Our findings by

    electron microscopy confirmed some changes described in previous studies and also

    brought new changes in the cell. For the first time we are able to describe changes of the

    cellular proteome of the ASK-2 cells overtime, revealing dynamic regulation processes

    and provides evidence that ISAV infection has impact on the cell status at protein level.

    Keywords: proteome, HDMS, isavirus, Salmo salar.

  • 8

    LISTA DE FIGURAS

    Figura 1. Micrografia eletrônica de transmissão de uma célula cultivada (linhagem

    celular SHK-1) infectada com vírus da anemia infecciosa do salmão (ISAV)

    .........................................................................................................................................16

    Figura 2. Representação esquemática do ciclo de replicação do ISAV.........................19

    Figura 3. Sinais clínicos e patológicos da ISA no salmão do Atlântico, infecção

    experimental....................................................................................................................20

    Figura 4. Delineamento experimental............................................................................38

    Figura 5. Imagens de microscopia de células ASK2 infectadas com ISAV (Norwegian

    Glesvaer/2/90).................................................................................................................47

    Figura 6. Principais alterações ultraestruturais observadas em células ASK-2 infectadas

    com o ISAV ao longo do tempo por microscopia eletrônica de transmissão

    (MET)..............................................................................................................................49

    Figura 7. Análise de componentes principais para determinar a estrutura e variância dos

    dados de espectrometria de massa de grupos ISAV infectados (ASK_ISAV) e de grupos

    controle (ASK_CC) durante o curso da infecção (12, 36, 60 e 84 hpi) e suas réplicas

    biológicas (R1, R2 e R3).................................................................................................50

    Figura 8. Total de proteínas identificadas nas culturas controles e nas culturas

    infectadas pelo ISAV durante o curso da infecção representado pelo diagrama de

    Venn.................................................................................................................................52

  • 9

    Figura9. Proteínas totais identificadas exclusivamente em culturas de células ASK-2

    em diferentes tempos pós-infecção e suas intersecções..................................................53

    Figura 10. Total de proteínas diferencialmente produz