Proteo Ma

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PESQUISA

PROPROPROPROPROTEOMATEOMATEOMATEOMATEOMAAvanos Recentes em Tcnicas de Eletroforese Bidimensional e Espectrometria de MassaAvanos Recentes em Tcnicas de Eletroforese Bidimensional e Espectrometria de MassaAvanos Recentes em Tcnicas de Eletroforese Bidimensional e Espectrometria de MassaAvanos Recentes em Tcnicas de Eletroforese Bidimensional e Espectrometria de MassaAvanos Recentes em Tcnicas de Eletroforese Bidimensional e Espectrometria de Massa

Luciana Di CieroDoutora,Pesquisadora,[email protected]

Cludia de Mattos Bellato, Ph.DPesquisadora,[email protected]

roteoma indica asPROTEnasexpressas em um genOMAou tecido. Enquanto o geno-ma representa a soma de to-

dos os genes de um indivduo, o pro-teomanoumacaracterstica fixa deumorganismo.Oproteomaaltera comoestadodedesenvolvimento, do teci-do ou mesmo sob as condies nasquais o indivduo se encontra. Portan-to, hmuitomais protenas noproteo-ma do que genes no genoma, especi-almentepara eucaritos. Istoporquehvrias maneiras do gene expresso, oRNA total, sofrer reduo (splicing)para construir o RNA maduro. Esteento vai servir demoldepara a tradu-o de uma protena, a qual sofremodificaops-traduo.

Investigardiretamenteosprodutosdos genes uma forma de estudardoenas equalquerproblemabiolgi-co complexo. Por exemplo, para en-tender molecularmente como umaclula funciona em um indivduo do-ente e em um sadio preciso terconhecimento das protenas e de ou-tros componentes celulares que estopresentes, como eles interagem e oresultadode suas interaes.

Portanto, anlise aonvel deprote-na necessria, pois o estudo dosgenes atravs do sequenciamentodosgenes,ouseja,oestudogenmica,nopode adequadamente prever a estru-tura dinmica das protenas, uma vezque ao nvel das protenas quemui-tos dos processos deuma clula ocor-rem,ondeprocessosdedoenas inici-almente acontecem e aonde muitasdas drogas medicinais atuam. Sendoassim, protemica o mtodo direto

para identificar,quantificareestudarasmodificaesps-traducionaisdaspro-tenas em uma clula, tecido ou mes-mooragnismos.

O termo protemica foi introduzi-do em 1995 para descrever todas asprotenas que so expressas em umgenoma (Anderson et al., 1996; Wi-lkins et al., 1996). Definir todos osaspectos da protemica difcil, poisatualmente este termo mais umconceito do que uma cincia bemdefinida.

Protemica pode ser vista comoumametodologiade seleodabiolo-giamolecular, a qual temcomoobjeti-vo documentar a distribuio geral deprotenasda clula, identificar e carac-terizarprotenas individuaisde interes-se e principalmente elucidar as suasassociaes e funes. Sendo assim,protemica fundamenta-se emprinc-piosbioqumicos,biofsicosedebioin-formticaparaquantificar e identificaras protenas expressas, pois elas sealteramconformeodesenvolvimentode um organismo assim como emresposta aos fatores do ambiente (An-derson & Anderson, 1996; Celis et al.,1996; Wilkins et al., 1996; Wilkins etal., 1997).

Huma forte e sinergstica correla-o entre os estudos protemicos egenmicos uma vez que ambas reasde estudo investigam a organizaocelular ao nvel complementar, prote-nas e genes, e cada rea forneceinformao que aumenta a eficinciada outra. Por exemplo, protemicaconecta as descobertas da genmicacom o desenvolvimento das drogasque as companhias farmacuticas in-

Ilustraes cedidas pelas autoras

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Figura 1. Esquema de procedimento de eletroforese bidimensional (A)Preparao de amostra: rompimento celular seguido de extrao esolubilizao de protenas das clulas (ou tecidos) (B) Separao na pri-meira dimenso por IEF, onde as protenas so separadas pelo seu pon-to isoeltrico. (C) Separao na segunda dimenso SDS-PAGE, que sepa-ra protenas pelamassamolecular aparente. (D) colorao das protenasseparadas, resultando nummapa de pontos (spots). Digitalizao daimagem e anlise densitomtrica por programas de computador

vestigam. Sendo assim, protenas deuma forma geral controlam a vida e asade, ou seja, preciso entender asprotenas e comoelas operamcelular-mente para assim entender como re-gular os mecanismos da doena para

umposterior tratamento.AProtemicapodeser aplicadaem

diversas reas de interesse como porexemplona investigaodemarcado-resmoleculares emdeterminadas do-enas indicandoarespostadaclulaou

tecido a estresses externos. Atravs daprotemica pode-se fazer uma com-parao do perfil protico de umaclula cancerosa comodeuma clulasadia, oudeumaclula cancerosacujoportador est sob tratamentomdico.Vrias pesquisas j foram ou estosendo conduzidas no mundo na reada sade comooproteomado fgado,rim,eparadiferentesorganismos,comoMycobacterium tuberculosis (agentecausal da tuberculose), Plasmodiumfalciparum (agentecausaldamalria),Helycobacter pylori (agente causal dalcera egastrite).Narea agronmica,h estudos protemicos de milho, ar-roz, trigo, cana-de-acar, eucaliptoentre outras, e de organismos quecausam imapcto econmico, comoaqueleque fixanitrognioatmosfricopara as leguminosas,Rhizobium spp.,ou que causam doenas em em feijo-erio e citros comoXanthomonas spp.Aqui noBrasil, pesquisasprotemicasesto sendo realizadas com sucesso.No Estado de So Paulo, graas aoapoio da Fundao de Amparo a Pes-quisa (FAPESP), estudos protemicosestosendoconduzidosparaentendero processo da interao entre a bact-ria patognica, Xylella fastidiosa, decitros variedade laranja doce.

Tcnica aplicada aoEstudoProtemica

A eletroforese de duas dimensesem gel de poliacrilamida (2DE) emconjunto com a espectrometria demassa so as duas tecnologias maisusadasatualmenteparaanlisedepro-teoma. A primeira aplicada paraseparao, deteco e quantificaodas protenas e a espectrometria demassapara identificaodasprotenasgraas aos grandes avanos da bioin-formtica.

EletroforeseBidimensional (2DE)

A tcnica de eletroforese bidimen-sional foi introduzidanadcadade70.Entretanto foi nosltimos 10 anosqueocorreram os grandes avanos nosmtodosquepossibilitaram identificarprotenas separadas atravsde2DEdeforma sensvel, rpida e conclusiva.

Desde a introduo da tcnica de


Figura 2. Perfil da protena total (150 ug) de Xylella fastidiosa, bact-ria patognica de citros var. laranja doce. IEF ocorreu entre pH3-10 e a2DE em gel gradiente (9-18%) de poliacrilamida. Gel corado com ni-trato de prata. Projeto financiado pela FAPESP

Figura 3. Esquema de Peptide massfingerpriting (PMF) Os spots sorecortados do gel 2DE e submetidos adigesto enzmtica, geralmente usan-do-se tripsina.Os peptdeos resultan-tes so incorporados a umamatriz eidentificados por espectrometria demassa (MALDI-TOF). Amassa dospeptdios so comparadas a umbancodedadospara identificar sequnciasde amoncidos, cujasmassas previstasbatem com a massa dos peptdios ob-tidos

2DE, diversasmodificaes foram fei-tas,principalmentenaprimeiradimen-so.Utilizava-seos anflitospara esta-belecer o gradiente de pH para aseparao das protenas pelo pontoisoeltrico. Entretanto, ousodeanfli-tos com esta finalidade tem diversosproblemas incluindo a incapacidadede correr grandesquantidadesdepro-tenas necessrias para a micro se-qncia, pouca estabilidadedogradi-ente de pH durante a eletroforese efreqente falta de reprodutibilidadedos gis entre os laboratrios. O usodos gradientes de pH imobilizados(IPG) para a separao por cargas na2DE solucionou muitos dos proble-mas. Encontra-se nomercado fitas degis IPG desidratadas (Amersham Bi-osciences) feitas de uma matriz depoliacrilamida, a qual modificadacovalentemente com grupos cidos ebsicosque formamogradientedepHimobilizadoemtodaaextensodogel.Hdiversas faixasdepH,desdeampla(3-10), como faixas estreitas, comopor exemplo de 4,5-5,5 ou 7,0-11,0.Esta flexibilidadenaescolhadas faixasde pH a serem utilizadas de grandeutilidade para separar eficientementeomaiornmerodeprotenaspossvel.

A 2DE combina duas tcnicas deseparao: a primeira separao (pri-meira dimenso) a focalizao isoe-ltrica (IEF), e a segunda dimenso(2DE) a eletroforese em gel depoliacrilamida,chamadadeSDS-PAGE.No IEF as protenas so separadas,atravs de uma alta tenso, em umgradiente de pH imobilizado em umgel de acrilamida at alcanarem aposioestacionriaondeacarga total zero. O pH no qual a protena temcarga lquidazerochamadodepontoisoeltrico (pI). Na 2DE, as protenasso separadas pelo peso molecular,atravs de uma tenso, tambm emgeldepoliacrilamidacontendoounoo detergente sulfato dodecil de sdio(SDS-PAGE).Amobilidadeeletrofor-tica seddeacordocomo tamanhodaprotena sendo restringida pelo tama-nhodoporodamatriz depoliacrilami-da, de uma forma que as protenasmigramemumavelocidadeproporci-onal ao seu tamanho. A matriz depoliacrilamida usada pode ser homo-


Figura 4. Ilustrao Esquemtica de DIGE ( adaptado de Patton, 2002) Duas amostras diferentes soderivatizadas emdois fluorforos diferentes,combinadas e submetidas a 2DE. AS protenas so detectadas em umscanner duplo a laser com filtros de excitao diferentes para gerar duasimagens separadas. As imagens so, ento sobrepostas com a ajuda de umprograma de computador, os sinais so normalizados e os spots soquantificados. As diferenas na expressodasprotenas so identificadaspela avaliao de uma imagem pseudo-colorida e os dados so compara-dos

gnea ou emgradiente. J os parme-tros eltricosusadosnacorridadepen-demdo tipoedaquantidadedeamos-tra aplicada, influenciandonaqualida-de da focalizao. Estes parmetrosdevemser cuidadosamentemonitora-dos e controlados. Em aparelhos dotipoIPGphor(AmershamBiosciences),geralmente utiliza-se uma corrente de50 uA por strip e uma voltagem quevai de 100 a 8000 (80kVh-150kVh).

Paraaplicar a tcnicade2DE(Figu-ra 1), as amostras biolgicas so, deumamaneira geral, tratadasda seguin-te forma.Primeiramente, as clulas sorompidas atravs de mtodos qumi-cos (detergentes, solventes, etc) oufsicos (homogeneizadores,monhos,french press). Seguido da rupturacelular, asprotenas sosolubilizadase

desnaturadasemumasoluoconten-dodetergentesno inicosouzwiteri-nicos, caotropes (uria, tiouria), epequenas quantidades de agentes re-dutores, como o ditiotreitol (DTT).Uma soluo comuma composta deuria (8M),CHAPS(4%),DTT(70mM),anflito (0,5 a 2%) e azul de bromofe-nol (0,005%).Aconcentraodoanf-lito deve ser determinada para cadaamostra empiricamente.

Asolubilizaodasprotenasumaetapa fundamental para o sucesso daeletroforesebidimensional. Estas solu-es devem ser otimizadas baseadanas amostrasutilizadasnoexperimen-to. Sabe-se queprotenas demembra-na so de difcil visualizao em geldevido, principalmente a dificuldadede solubiliz-las, j queousodoSDS

limitante para a 2DE. Recentementeforam disponibilizados diversos de-tergenteszwiterinicosquemelhora-ram muito o desempenho das solu-es de solubilizaopara protenashidrofbicas (Chevallet et al., 1998).Estes detergentes so sulfobetanascomcaudadecadeiageralmentecom8 a 16 carbonos. A Calbiochem co-mercializa estes detergentes com osnomes comerciais de SB 3-10, SB 3-12, ASB 14, ASB 16. Fizemos umestudo comparativo da eficincia de4 detergentes na solubilizao deprotenas de membrana de Xyllelafastidiosa(projetoProteomadeMem-branadeXyllelafastidiosa financiadopela FAPESP), e mostramos que oASB14mais eficientequandocom-parado com o SB 3-10, seguido doCHAPSeTritonX-100 (DiCieroet al.,resultados recentes).

Aps seremsubmetidas a 2DE, asprotenas so visualizadas atravs demtodosdedetecoespecficosparacada objetivo, como por exemplodetecodeprotenas totais,modifi-caesps-traducionais, etc.Amaio-ria desses mtodos se baseia emcoloraodeprotenas comcorantesou reagentes fluorescentes, ou de-tecodeprotenasmarcadas radioa-tivamentepor fluorografiaouautora-diografia.

Dentre os diversosmtodos paracolorao de protenas, osmais usa-dos so colorao por Azul de Coo-massie (CoomassieBlue)ecolorao

por prata, devido ao custo, facilidadede uso e compatibilidade com mto-dos de caracterizao microqumica,tais como sequncia automtica deaminocidoseespectrometriademas-sa. Coomassie Blue detecta protenascom concentrao superior a 100 ng,enquanto aprata mais sensvel queoCoomassie, podendo detectar prote-nas em concentraes de at 1 ng.

Osmtodos demarcao radioati-va baseia-se na incorporao de 3H,14C, 35S, 32P, 33P ou 125I s protenas.Apsaeletroforeseadetecodosinalpode ser feita usando-se filme paraautoradiografia ou fluorografia direta.Esses mtodos so aplicados em pro-teoma juntamente com a coloraopor Azul de Coomassie ou nitrato depratapara anlise simultneadonveis


Figura5. Ilustrao Esquemtica de ProteomaMltiplo (MP) (Adaptadode Patton, 2002) Duas amostras diferentes so submetidas a 2DE. Osgs so coradospor umatributo funcional particular, tal comoglicosilao,e digitalizados. Os gis so ento corados para protenas totais usando ocorante SYPRO Ruby e digitalizados novamente. As duas imagens soento sobrepostas com a ajuda de um progarama de computador, e osspots so quantificados. As difertenas na glicosilao e expresso de pro-tenas totais so identificadas pela anlise de imagens pseudo-coloridas ecomparao de dados. O registro do perfil de protena total com padresde glicosilao so feitos pela sobreposio das imagens

de expresso da protena total junta-mente com a taxa de sntese de prote-na, bem como fornecer regies mar-cadas para a localizao de protenas

debaixa abundncia em2DE.Emboraosmtodosdedetecopormarcaoradioativa sejam bastante sensveis equantitativos por uma maior faixa de

abundncia, eles tendem a ser maiscaros eperigosos demanipulao, elimitados a amostras que podem sermarcadosradioativamente(geralmen-te pormarcaometablica).

Mtodosdecoloraoreversa tmsido usados com menor freqnciapara a visualizao de protenas em2DE, os quais empregam cloreto depotssio, cloretos de cobre, cloretode zinco, acetato de cobalto cloretode nquel ou cloreto de zinco imida-zol. Dentre elas, as mais usadas emproteoma so cloreto de potssio,cloretodecobreecloretodezinco.Ocloreto de cobre um pouco maissensvel que o Azul de Coomassie,entretanto o cloreto de potssio menos sensvel. O mtodo que em-pregaocloretodezinco imidazol omais sensvel entre eles e pode seravaliadospordensitometria, emboraa faixa linear dinmica est restrita a10-100 ng. Os gis corados comzinco-imidazolpodemsereletrotrans-feridos (electroblotted) oueletroe-ludos (electroeluted) pela adiode um agente quelante ao tampode transferncia. Outra vantagemdeste mtodo que ele compat-vel commtodosdemicrosequnciabaseados em Edman e a digestotrptica ingelparaa identificaodospeptdeos por espectrometria demassaMALDI-TOF (matrix-assistedlaser desorption ionization time-of-flight).

A deteco de protenas por flu-orescncia em eletroforese em gel muitousadaemlaboratriosquepes-quisamproteomaem larga escala. Afaixa de deteco linear dinmicanormalmente superior aos mto-dosdecolorao.Oscorantesdispo-nveis no mercado so o Vermelhodo Nilo (Nile Red), SYPRO Verme-lho, SYPROLaranja e SYPROTange-rina. Os corantes SYPRO so fceisde serem aplicados, atravs de so-menteumaetapade coloraode30a 60 minutos sem a necessidade dedescolorao. Estes corantes detec-tampequenasquantidadesdeprote-na 4-8 ng e h metodologia paraquantificaoporanlisede imagem.

Paraanlisedemodificaesps-traducionais sousadosmtodosdedeteco especficos para glicopro-tenas (autoradiografias coma incor-


Figura 6. Estrutura do reagente ICAT, composto de trs elementos: umgrupamento reativo tiis, que se liga resduos de cistenas reduzidas; umespaador que pode conter deutrios (reagente pesado, com os deutriosnas posies indicadas por X) ou no (reagente leve, com hidrognios nasposies indicadas por X); e um grupamento de biotina utilizado para oisolamento seletivo dos peptdios contendo cistena (marcados com ICAT)

Figura 7. Esquema do procedimento de ICAT - Os resduos de cistenareduzida das protenas em amostras a serem comparadas so rotuladosseparadamente. Em uma das amostras usada a forma isotopicamentepesada e na outra amostra a forma leve do reagente ICAT. As duas amos-tras so combinadas e digeridas com tripsina. Os peptdiosmarcados, quecontm cistena so isolados por cromatografia de afinidade e, posterior-mente analisados por espectrometria de massa para a determinao daidentidade da protena que deu origem ao peptdio e a abundncia relati-va de cada protena nas amostras sendo comparadas

porao de 3H e 14C; fluorescncia,mtododeSchiff, AzuldeAlcian, etc.),fosforilao(autoradiografiascoma in-corporao de 32P ou 33P na cultura declulas ou apsdentrode fraes sub-celularesporprotenas cinases, detec-o in gel por hidrlise alcalina desters de fosfato de serina ou treoninapreciptando-seo fosfato liberadocomclcio formandoumcomplexode fos-fomolibdato e ento visualizando-secom um corante, tal como Verde de

Metil), protelise (ensaios zimogrfi-cos, corantes fluorescentesBODIPY),nitrosilao (mtododeBiotina),meti-lao (fluorografia), ribolizao (anti-corpos especficos anti-ADP ribose).

Apsacoloraodogel,observa-seum perfil bidimensional de pontos(spots), sendoqueemcadapontohmltiplas cpias de uma protena. Aimagemdeste perfil posteriormentedocumentada atravs de programasde computador apropriados (Figura

2), como o Melanie desenvolvidopelaGenebio (Genebra, Suia), Ima-ge Master (Amersham BioSciences)e outros.

Estes programas apresentam v-rias funes, entre elas a de permitirumaanlisedaabundnciadaprote-na em cada spot atravs do volume,intensidade e rea. Diversos gis re-presentando diferentes proteomaspodem ser comparados comoobje-tivo de detectar protenas diferenci-almente expressas .

Apesar da tcnica de 2DE ter opotencialdesepararmilharesdepro-tenas e ser a tcnica mais utilizadapara anlise deproteomas, ela apre-senta algumas limitaesparaprote-nas muito cidas (pH menor que3,5) or bsicas (pH maior que 9)protenas debaixa abundncia epa-rasprotenashidrofbicas,geralmen-te presentes nas membranes celula-res. Porm, esta tcnica est sendocada vez mais aperfeioada e logolimitaes como estas deixaro deexistir. Nogeral, a 2DEummtododeseparaoeficiente,porque todasasprotenasnumaamostra so sepa-radas simultaneamente, fornecendoinformaes teis sobre pI, massamolecular, expresso e abundnciarelativaemodificaesps-traducio-nais pela alterao da mobilidadeeletrofortica.

Identificao das Protenas

Hvrias tcnicaspara identificarumaprotena, comopor exemplo, osequenciamentodaprotena atravsdadegradaoporEdman, sequenci-amentoqumico,processo imunol-gico, espectrometria demassa entreoutros.Umadas tcnicasmaisutiliza-dasparaa identificaodasprotenas a anlise do fingerprinting damassa precisa de um nmero depeptdios derivados da mesma pro-tena (Figura 3). Para tal, asprotenasde interesse so recortadas do gel,so fragmentadas (obtenodospe-pitdeos), geralmente por digestotrptica, e os fragmentos so analisa-dasnoespectrmetrodemassaMAL-DI-TOFauxiliadosporprogramasdeinformticadesenvolvidosporvriosgrupos (Pappin, 1997; Mann et al.,1993; Henzel, 1993; Yates et al.,


1993; James et al., 1993).Uma vez conhecida a sequncia

desta protena, a sua identificao geralmente feita por correlao dedados depositados em bancos acess-veis via internet, comoodaSwiss-Prot(Suia).

Tcnicas e Opes para Anlisede Proteoma Diferencial

O proteoma diferencial comparadiferentes perfis de protenas entresituaesde interesse.Oobjetivo cen-tral do proteoma diferencial melho-rar o contedo de informaes doestudo de proteoma atravs de anli-ses mltiplas. As trs principais tcni-cas usadas atualmente para anlise deproteoma diferencial so eletroforesediferencial em gel (DIGE), MultplexProteome (MP) e rotulao de prote-nas com reagentes ICAT (isotope-coded affinity tagging).

A tcnica DIGE (Figura 4) usa s-ters de succinil de corantes de cianina,CY2, CY3 e CY5, que podem serempregados para rotulao fluores-centepara trspopulaes complexasde protenas antes de mistur-las eresolv-las simultaneamente na mes-ma 2DE. Recentemente, foi desenvol-vidooutroprocedimento similar usan-do corante Alexa Fluor.

O Multplex Proteome (MP) ba-seia-se na determinao paralela dosnveis de expresso de protenas bemcomo em certos atributos funcionais,tais comonveis de glicosilao, capa-cidade de ligao com drogas ou me-tabolizaodedrogas (Figura 5). Estatecnologia utiliza omesmo fluorforoparamedir protenas atravs de todosos gis nobancodedados, e empregafluorforos adicionais comdiferentesexcitaes e/ouemissomximaparaacentuar atributos funcionais especfi-cos da espcie. A vantagem destatcnica sobre aDIGEqueela dumafaixamuitomais largade informaes.

A tcnica de ICATpermite identifi-cao sistemtica das protenas numamistura complexaequantificaopre-cisa das diferenas em abundncia decada protena presente em duas oumais amostras proticas. O reagenteICAT formado por trs componen-tes funcionais: umgrupamento reativo

tiis, que seletivo para os grupa-mentos sulfidrilas das cadeias lateraisde cistenas reduzidas, um grupo deetilenoglicol quepode conter tomosde deutrio (isotopicamente pesado)ouno (isotopicamentenormal) equepossibilita realizarquantificaopreci-saporMS,eumgrupamentodebiotinaque a etiqueta de afinidade utiliza-do comobase para o isolamento sele-tivo dos peptdios contendo cistena(marcados com ICAT)deumamisturacomplexa de peptdios, atravs decromatografia de afinidadeemcolunade avidina (Figura 6).

Os resduos de cistena reduzidadas protenas nas duas amostras a se-remcomparadas so rotulados separa-damente durante o experimento. Emuma das amostras usada a formaisotopicamente pesada e na outraamostra a forma leve do reagenteICAT. As duas amostras so combina-das edigeridas com tripsina.Ospept-dios marcados, que contm cistenaso isoladosporcromatografiadeafini-dade e analisados por espectrometriademassa, determinandoassima iden-tidade da protena que deu origem aopeptdio e a abundncia relativa decadaprotenanasamostrassendocom-paradas (Figura 7) (Gygi et al., 1999).

Concluses

AProtemica veio para revolucio-nar os estudos de Genoma, uma vezqueutiliza-sede suas ferramentasparaidentificar as protenas expressas emsituaes especficas em um dadomomento naquele ambiente. A Prote-mica dinmica epermite fazer estu-dos comparativos. Os mtodos paraanliseglobaldaabundnciadeprote-nas,modificaes ps-traducionais eas mudanas nesses dois parmetroscomoa funodeumestadobiolgicoda clula ou tecido se desenvolveramutilizando-se das tcnicas de eletrofo-rese, cromatografia e espectrometriade massa como componentes-chavepara o estabelecimento de platafor-mas de estudo. As inovaes tecnol-gicasnadeteco, anliseequantifica-odeprotenas acelerou rapidamen-te o desenvolvimento da Protemicanos ltimos 4 anos. Isso, sem dvida,ocorreu devido ao foco que institui-

es privadas e pblicas deram pesquisa do Genoma ao Proteoma.No Brasil, a Protemica vem se de-senvolvendodesdeo inciodoProje-to Genoma da Xyllela fastidiosa fi-nanciadopelaFundaodeAmparoaPesquisadoEstadodeSoPaulo (FA-PESP). Diversos grupos inseridos noGenomaFuncional da FAPESPaindacontinuam trabalhandocomtcnicasprotemicas com o objetivo de ma-pear as protenas funcionais impor-tantesnoestabelecimentodadoenado amarelinhoe a sobrevivncia dabactrianaslaranjeirasvariedadedoce.Comos resultados obtidos destes es-tudos espera-se criar estratgias decontrole desta doena, a qual j temcausado srios danos citriculturapaulista.

LiteraturaConsultada

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