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Proteómica diferencial da polineuropatia amiloidótica ... · PDF file2.1 Fundamentos teóricos ... trabalho apostou numa abordagem proteómica comparativa entre os vários estados

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  • UNIVERSIDADE DE LISBOA

    FACULDADE DE CINCIAS

    DEPARTAMENTO DE QUMICA E BIOQUMICA

    Protemica diferencial da polineuropatia

    amiloidtica familiar: para alm da

    gentica

    Ana Cristina Ribeiro da Silva

    Mestrado em Bioqumica

    Especializao em Bioqumica Mdica

    2011

  • UNIVERSIDADE DE LISBOA

    FACULDADE DE CINCIAS

    DEPARTAMENTO DE QUMICA E BIOQUMICA

    Protemica diferencial da polineuropatia

    amiloidtica familiar: para alm da

    gentica

    Ana Cristina Ribeiro da Silva

    Mestrado em Bioqumica

    Especializao em Bioqumica Mdica

    Dissertao de Tese de Mestrado orientada por

    Doutor Carlos Cordeiro e Doutor Gonalo da Costa

    2011

  • AGRADECIMENTOS

    i

    AGRADECIMENTOS

    Gostaria de expressar a minha gratido a todos aqueles que de forma mais ou menos

    directa me acompanharam ao longo do ltimo ano num percurso de aprendizagem e

    crescimento, intelectual e pessoal.

    No posso deixar de passar um especial agradecimento Professora Ana Ponces, assim

    como ao restante Grupo de Enzimologia, por me ter acolhido no seu seio de

    investigao.

    Aos meus orientadores, Dr. Carlos Cordeiro e Dr. Gonalo da Costa, agradeo todos os

    ensinamentos e confiana em mim depositados. Foi realmente muito importante o

    acompanhamento dirio e o suporte prestado a todos os nveis, a partilha de

    experincias, discusses e opinies que me permitem crescer como cientista.

    Aos meus amigos e colegas laboratrio, em especial ao Samuel, Ricardo e Gonalo

    (Covas), , obrigada pelo apoio incondicional e por tornarem o meu dia-a-dia muito

    mais animado e divertido.

    Finalmente, minha famlia. Avs, irmo, Me e Pai. Pelo incentivo, apoio, pela

    amizade, companhia e pacincia (muita!). Por acreditarem a mim.

    O meu sincero agradecimento a todos.

  • iii

    NDICE

    AGRADECIMENTOS ........................................................................................ I

    RESUMO .................................................................................................. VII

    SUMMARY ................................................................................................. IX

    LISTA DE ABREVIATURAS E NOMENCLATURA .................................................. XIV

    LISTA DE TABELAS .................................................................................... XV

    LISTA DE FIGURAS ................................................................................... XVII

    I - INTRODUO .......................................................................................... 1

    1- Polineuropatia Amiloidtica Familiar................................................................................ 3

    1.1 Das amiloidoses Polineuropatia Amiloidtica Familiar: contexto histrico e

    epidemiologia ........................................................................................................................... 3

    1.2 Sintomatologia ................................................................................................................... 6

    2 - A PAF e a Transtirretina: do gene protena .................................................................... 7

    2.1 - O gene e a expresso de TTR ........................................................................................... 7

    2.2 A protena ........................................................................................................................... 8

    2.3 Funo da TTR ..................................................................................................................... 9

    2.4 Mutaes e amiloidogenecidade ..................................................................................... 11

    2.5 Patognese: os modelos de agregao ............................................................................ 12

    2.6 Patofisiologia: toxicidade induzida .................................................................................. 15

    2.7 A heterogeneidade fenotpica: a importncia de biomarcadores, dos estados

    assintomticos e da quantificao da TTR em circulao ..................................................... 16

    3 - A TTR e outras doenas neurodegenerativas .................................................................. 18

    3.1 Amiloidose Senil Sistmica (SSA) ..................................................................................... 18

    4 - A glicao proteica ........................................................................................................ 19

    4.1 Conceitos gerais ................................................................................................................ 20

    4.2 Os produtos de glicao ................................................................................................... 22

    4.3 O sistema dos Glioxalases ................................................................................................ 23

    4.4 A glicao proteica em doenas amilides e neurodegenerativas ................................. 25

    4.5 Glicao e a PAF ................................................................................................................ 26

    5 - O transplante heptico em PAF ..................................................................................... 27

    5.1 O transplante heptico de cadver (CLT)......................................................................... 27

    5.2 O transplante heptico sequencial (domin) (DLT) e aquisio de doena amilide .... 28

    5.3 Outros tratamentos .......................................................................................................... 29

  • iv

    II MATERIAIS E MTODOS ........................................................................ 31

    1 - Obteno das amostras de plasma humano ................................................................... 33

    1.1 Colheita ............................................................................................................................. 33

    1.2 Quantificao proteica pelo mtodo de Bradford .......................................................... 34

    2 - Electoforese desnaturante unidimensional: SDS-PAGE ................................................... 34

    2.1 Fundamentos tericos ...................................................................................................... 34

    2.2 Os gis ............................................................................................................................... 36

    2.3 Tratamento e aplicao das amostras ............................................................................. 37

    2.3.1 Amostras de plasma .................................................................................................. 37

    2.4 Corrida electrofortica ..................................................................................................... 37

    2.5 Colorao dos gis ............................................................................................................ 38

    3 - Western blotting ........................................................................................................... 38

    3.1 Fundamentos tericos ...................................................................................................... 38

    3.2 Transferncia .................................................................................................................... 39

    3.3 Bloqueio e incubao com anticorpos 1 e 2 ................................................................. 40

    3.4 Revelao .......................................................................................................................... 41

    3.5 Anlise por Phoretix 1D .................................................................................................... 41

    4 - Electroforese bidimensional .......................................................................................... 42

    4.1 Fundamentos tericos ...................................................................................................... 42

    4.2 Preparao, aplicao da amostra e focagem isoelctrica ............................................. 43

    4.3 SDS-PAGE: separao segunda dimenso ....................................................................... 44

    4.4 Anlise dos gis (Progenesis SameSpots) ........................................................................ 45

    5 - Espectrometria de massa .............................................................................................. 45

    5.1 Fundamentos tericos ...................................................................................................... 45

    5.1.1 Mtodos de ionizao ............................................................................................... 46

    5.1.1.1 MALDI ................................................................................................................. 47

    5.1.2 Analisadores de massa (AM) ..................................................................................... 48

    5.1.2.1 TOF ...................................................................................................................... 48

    5.1.2.1.1 TOF-TOF ....................................................................................................... 49

    5.1.2.2 FT-ICR .................................................................................................................. 50

    5.1.3 Detectores...............................