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AANNEEXXOOSS
2
Anexo I:
Protocolo de Extração de RNA
3
PPRROOTTOOCCOOLLOO DDEE EEXXTTRRAAÇÇÃÃOO DDEE RRNNAA TTOOTTAALL
(Otimizado pelo Dr. Celso E. Benedetti, Laboratório Nacional de Luz Síncrotron – LNLS)
1. Coletar 4mL de sangue e manter a temperatura ambiente (TA);
2. Adicionar 4mL de solução salina 0,9% (NaCl 0,9%) em tubo estéril de 15mL;
3. Depositar cuidadosamente esta mistura (8mL) sobre 6mL de Ficoll-PaqueTM Plus (Amersham
Biosciences) já aliquotados em outro tubo esteril de 15mL, de forma que as duas fases não
se misturem;
4. Centrifugar a 400xg por 30 minutos (min.) à 18oC, com a utilização de rotor tipo ângulo livre
(swinging-bucket);
5. Remover as células brancas para um novo tubo de 15mL com o auxílio de pipeta pasteur e
completar o volume do mesmo com solução salina em TA;
6. Centrifugar a 100xg por 10 min. à 18oC;
7. Descartar o sobrenadante, ressuspender o pellet em 1mL de TrizolTM (Invitrogen) e incubar
à TA por 5 min.
8. Adicionar 0,2mL de clorofórmio, agitando-se o tubo vigorosamente por 15 segundos.
9. Incubar por 3 min. em TA e centrifugar a 12000xg por 15 min. a 18oC.
10. Transferir a fase aquosa (sobrenadante) para novo tubo e adicionar 0,5mL de álcool
isopropílico 100%, deixando em TA por 10 min.
11. Centrifugar a 12000xg por 10 min a 5oC.
12. Descartar o sobrenadante e, em seguida, lavar o pellet com 1mL de etanol 75%. Desse
modo, o RNA em solução de etanol deve ser centrifugado a 7500xg por 5 min a 5oC, o
sobrenadante descartado com auxílio de pipeta e aguardar até que o pellet esteja seco.
13. Ressuspender o RNA em 30µL de água DEPC e incubar por 10 min. a 55oC. Armazenar no
freezer -80oC em pequenas alíquotas.
4
Anexo II:
Sequências, oligos e localização do trato poli-Q para as diferentes proteínas em estudo
5
II . 1. ) Gene MJD1: proteína Ataxina-3 (formas Normal e Expandida)
ORF FINDER (NCBI): NM_004993 [gi:13518018] 361 aa
59 atggagtccatcttccacgagaaacaagaaggctcactttgtgct M E S I F H E K Q E G S L C A 104 caacattgcctgaataacttattgcaaggagaatattttagccct Q H C L N N L L Q G E Y F S P 149 gtggaattatcctcaattgcacatcagctggatgaggaggagagg V E L S S I A H Q L D E E E R 194 atgagaatggcagaaggaggagttactagtgaagattatcgcacg M R M A E G G V T S E D Y R T 239 tttttacagcagccttctggaaatatggatgacagtggttttttc F L Q Q P S G N M D D S G F F 284 tctattcaggttataagcaatgccttgaaagtttggggtttagaa S I Q V I S N A L K V W G L E 329 ctaatcctgttcaacagtccagagtatcagaggctcaggatcgat L I L F N S P E Y Q R L R I D 374 cctataaatgaaagatcatttatatgcaattataaggaacactgg P I N E R S F I C N Y K E H W 419 tttacagttagaaaattaggaaaacagtggtttaacttgaattct F T V R K L G K Q W F N L N S 464 ctcttgacgggtccagaattaatatcagatacatatcttgcactt L L T G P E L I S D T Y L A L 509 ttcttggctcaattacaacaggaaggttattctatatttgtcgtt F L A Q L Q Q E G Y S I F V V 554 aagggtgatctgccagattgcgaagctgaccaactcctgcagatg K G D L P D C E A D Q L L Q M 599 attagggtccaacagatgcatcgaccaaaacttattggagaagaa I R V Q Q M H R P K L I G E E 644 ttagcacaactaaaagagcaaagagtccataaaacagacctggaa L A Q L K E Q R V H K T D L E 689 cgagtgttagaagcaaatgatggctcaggaatgttagacgaagat R V L E A N D G S G M L D E D 734 gaggaggatttgcagagggctctggcactaagtcgccaagaaatt E E D L Q R A L A L S R Q E I 779 gacatggaagatgaggaagcagatctccgcagggctattcagcta D M E D E E A D L R R A I Q L 824 agtatgcaaggtagttccagaaacatatctcaagatatgacacag S M Q G S S R N I S Q D M T Q 869 acatcaggtacaaatcttacttcagaagagcttcggaagagacga T S G T N L T S E E L R K R R 914 gaagcctactttgaaaaa cagcagcaaaagcagcaacagcagcag E A Y F E K Q Q Q K Q Q Q Q Q 959 cagcagcagcagcagggggacctatcaggacagagttcacatcca Q Q Q Q Q G D L S G Q S S H P 1004 tgtgaaaggccagccaccagttcaggagcacttgggagtgatcta C E R P A T S S G A L G S D L 1049 ggtgatgctatgagtgaagaagacatgcttcaggcagctgtgacc G D A M S E E D M L Q A A V T 1094 atgtctttagaaactgtcagaaatgatttgaaaacagaaggaaaa M S L E T V R N D L K T E G K 1139 aaataa K *
oolliiggoo ddiirreettoo
oolliiggoo rreevveerrssoo
OOlliiggoo AATTXX--33QQ--
6
II . 1.1. ) Oligos usados para a ATX-3:
- Oligos utilizados para clonagem:
ATX-3 direto ( Nde I)
5'- CA*T ATg gAg TCC ATC TTC CAC gAg -3'
ATX-3 reverso ( BamH I)
5'- ggA TCC TTA TTT TTT TCC TTC TgT TTT CAA ATC -3'
- Oligos utilizados para seleção e sequenciamento dos clones ATX-3E:
ATX-3 direto ( NdeI): 5'- CA*T ATg gAg TCC ATC TTC CAC gAg -3'
MJD25a (reverso): 5´- ggC Tgg CCT TTC ACA Tgg AT -3´
- Oligos utilizados para fragmentação da ATX-3:
ATX-3 direto ( NdeI): 5'- CA*T ATg gAg TCC ATC TTC CAC gAg -3'
ATX-3Q-
(BamHI): 5'- ggA TCC CgA gAA gCC TAC TTT gAA AAA -3'
PoliQ-D ( EcoRI): 5'- AAA gAA TTC ATg Cgg AAg AgA Cg -3’
PoliQ-R ( SalI): 5'- TTT gTC gAC TTA Tgg ATg TgA ACT CTg T -3’
Uim1F[ NdeI]: 5’- CAT ATg gAA gAT TgA ggA ggA TTT gCA -3’
Uim1R[ BamHI] : 5’- ggg ggA TCC TTC CAT gTC AAT TTC TTg gCg -3’
Uim2F[ NdeI]: 5’- CAT ATg gAT gAg gAA gCA gAT CTC CgC -3’
Uim2R[ BamHI]: 5’- ggg ggA TCC gTT TCT ggA ACT ACC TTg CAT A -3’
Uim3F[ NdeI]: 5’- CAT ATg AgT gAA gAA gAC ATg CTT CAg -3’
Uim3R[ BamHI]: 5’- ggA TCC ATC ATT TCT gAC TgT TTC TAA -3’
7
II.2.) Gene SCA7: proteína Ataxina-7 (forma Normal)
ORF FINDER (NCBI): [gi:2370154:562-3240] 892 aa
1 atgtcggagcgggccgcggatgacgtcaggggggagccgcgccgc M S E R A A D D V R G E P R R 46 gcggcggcggcggcgggcggagcagcggccgcggccgcccggcag A A A A A G G A A A A A A R Q 91 cagcagcagcagcagcagcagcagcagccgccgcctccgcagccc Q Q Q Q Q Q Q Q Q P P P P Q P 136 cagcggcagcagcacccgccaccgccgccacggcgcacacggccg Q R Q Q H P P P P P R R T R P 181 gaggacggcgggcccggcgccgcctccacctcggccgccgcaatg E D G G P G A A S T S A A A M 226 gcgacggtcggggagcgcaggcctctgcccagtcctgaagtgatg A T V G E R R P L P S P E V M 271 ctgggacagtcgtggaatctgtgggttgaggcttccaaacttcct L G Q S W N L W V E A S K L P 316 gggaaggacgggacagaattggacgaaagtttcaaggagtttggg G K D G T E L D E S F K E F G 361 aaaaaccgcgaagtcatggggctctgtcgggaagacatgccaata K N R E V M G L C R E D M P I 406 tttggtttctgtccagcccatgatgatttctacttggtggtgtgt F G F C P A H D D F Y L V V C 451 aacgactgtaatcaggttgtcaaaccgcaggcatttcaatcacat N D C N Q V V K P Q A F Q S H 496 tatgaaagaagacatagctcatccagcaagccgcctttggccgtt Y E R R H S S S S K P P L A V 541 cctcccacttcagtattttccttcttcccttctctgtccaaaagc P P T S V F S F F P S L S K S 586 aaaggaggcagtgcaagtggaagcaaccgttcttccagtggaggt K G G S A S G S N R S S S G G 631 gttcttagcgcatcctcatcaagttccaagttgttgaaatcaccc V L S A S S S S S K L L K S P 676 aaagagaaactgcagctcagggggaacaccaggccaatgcatccc K E K L Q L R G N T R P M H P 721 attcagcaaagtagagttccccatggtagaatcatgacaccctct I Q Q S R V P H G R I M T P S 766 gtgaaagtggaaaagattcatccgaaaatggatggcacactactg V K V E K I H P K M D G T L L 811 aaatctgcggtggggccaacctgtcctgctactgtgagttcctta K S A V G P T C P A T V S S L 856 gtcaagcctggccttaactgcccctcaataccaaagccaaccttg V K P G L N C P S I P K P T L 901 ccttcacctggacagattctgaatggcaaagggcttcctgcaccg P S P G Q I L N G K G L P A P 946 cccactctggaaaagaaacctgaagacaattccaataataggaaa P T L E K K P E D N S N N R K 991 tttttaaataagagattatcagaaagagagtttgatcctgacatc F L N K R L S E R E F D P D I 1036 cactgtggggttattgatctcgacaccaagaagccctgcacccgg H C G V I D L D T K K P C T R 1081 tctttgacatgcaagacacattccttaacccagcgcagggctgtc S L T C K T H S L T Q R R A V 1126 cagggtagaagaaaacgatttgatgtgttattagccgagcacaaa Q G R R K R F D V L L A E H K 1171 aacaaaaccagggaaaaggaattgattcgccatccggactctcag N K T R E K E L I R H P D S Q 1216 caaccaccgcagcctctcagggacccgcatcccgcccctcctaga Q P P Q P L R D P H P A P P R 1261 acgtcacaggagccgcaccaaaaccctcacggagtgattccttcc
8
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9
II.2.) Oligos usados para a ATX-7
- Oligos utilizados para clonagem:
ATX-7 direto (Nde I): 5'- CAT ATg TCg gAg Cgg gCC gCg gAT - 3´
ATX-7 reverso (BamHI): 5'- ggA TCC TCA ggg ACg TgC CTT Tgg CTg -3´
- novos oligonucleotídeos, desenhados para a fragmentação da ATX-7 (contendo sítios
direto EcoRI e reverso NotI.)
SEN1: 5´- ggA ATT C AT gTC ggA gCg ggC CgC g -3´
ANS1: 5´- TTg Cgg CCg CTC AAg gAA gCC CTT TgC CAT TC -3´
SEN2: 5´- ggA ATT CCT TAC CTg CCC CTC AAT ACC –3´
ANS2: 5´- TTg Cgg CCg C TT AAT AgC TgA CTC CAC ATT g –3´
SEN3: 5´- ggA ATT C TC CAC ACg TAT TCC TCA CCg g –3´
ANS3: 5´- TgC ggC CgC TCA ggg ACg TgC CTT Tgg –3´
10
II.3.) Gene SCA1: proteína Ataxina-1 (forma Normal)
ORF FINDER (NCBI): NM_000332. [gi:4506792] 816 aa
936 atgaaatccaaccaagagcggagcaacgaatgcctgcctcccaag M K S N Q E R S N E C L P P K 981 aagcgcgagatccccgccaccagccggtcctccgaggagaaggcc K R E I P A T S R S S E E K A 1026 cctaccctgcccagcgacaaccaccgggtggagggcacagcatgg P T L P S D N H R V E G T A W 1071 ctcccgggcaaccctggtggccggggccacgggggcgggaggcat L P G N P G G R G H G G G R H 1116 gggccggcagggacctcggtggagcttggtttacaacagggaata G P A G T S V E L G L Q Q G I 1161 ggtttacacaaagcattgtccacagggctggactactccccgccc G L H K A L S T G L D Y S P P 1206 agcgctcccaggtctgtccccgtggccaccacgctgcctgccgcg S A P R S V P V A T T L P A A 1251 tacgccaccccgcagccagggaccccggtgtcccccgtgcagtac Y A T P Q P G T P V S P V Q Y 1296 gctcacctgccgcacaccttccagttcattgggtcctcccaatac A H L P H T F Q F I G S S Q Y 1341 agtggaacctatgccagcttcatcccatcacagctgatcccccca S G T Y A S F I P S Q L I P P 1386 accgccaaccccgtcaccagtgcagtggcctcggccgcaggggcc T A N P V T S A V A S A A G A 1431 accactccatcccagcgctcccagctggaggcctattccactctg T T P S Q R S Q L E A Y S T L 1476 ctggccaacatgggcagtctgagccagacgccgggacacaaggct L A N M G S L S Q T P G H K A 1521 gagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcatcag E Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q H Q 1566 catcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcag H Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q 1611 cagcacctcagcagggctccggggctcatcaccccggggtccccc Q H L S R A P G L I T P G S P 1656 ccaccagcccagcagaaccagtacgtccacatttccagttctccg P P A Q Q N Q Y V H I S S S P 1701 cagaacaccggccgcaccgcctctcctccggccatccccgtccac Q N T G R T A S P P A I P V H 1746 ctccacccccaccagacgatgatcccacacacgctcaccctgggg L H P H Q T M I P H T L T L G 1791 cccccctcccaggtcgtcatgcaatacgccgactccggcagccac P P S Q V V M Q Y A D S G S H 1836 tttgtccctcgggaggccaccaagaaagctgagagcagccggctg F V P R E A T K K A E S S R L 1881 cagcaggccatccaggccaaggaggtcctgaacggtgagatggag Q Q A I Q A K E V L N G E M E 1926 aagagccggcggtacggggccccgtcctcagccgacctgggcctg K S R R Y G A P S S A D L G L 1971 ggcaaggcaggcggcaagtcggttcctcacccgtacgagtccagg G K A G G K S V P H P Y E S R
11
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12
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II.3.1.)Oligos e estratégias usadas para a ATX-1:
A) Oligos usados para amplificar a região de 750pb do gene COM a poliQ:
� Direto Nde I: 5’- CCA CAT ATg AAA TCC AAC CAA gAg C -3’
� Reverso Xho I: 5’- AAA CTC gAg CTA CTg gAA ATg Tgg ACg TAC T -3’
B) Oligos usados para amplificar a região de 1750 pb SEM o trato poliQ:
� Direto Nde I: 5'- TTT CAT ATg CCA CAT TTC CAg TTC TCC -3' � Reverso Xho I: 5'- AAA CTC gAg CTA CTT gCC TAC -3'
Disposição dos oligos e tamanho dos fragmentos:
� �
� �
PPooll ii QQ 2451pb
0 pb
750 pb
1750 pb
13
C) Oligos e estratégia usados para amplificar o fragmento íntegro do gene:
���� oligo reverso5 : 5´- ATC TCA CCg TTC Agg ACC T -3´ 1 2
���� Oligos para sequenciamento:
F1 (568 a 586) TM= 53oC %GC= 47,4
5’- CAT TCA gAC CAC ACA CAg T -3’
F2 (1025 a 1045) TM= 59,7oC %GC= 47,3
5’- gAg CTA AAg AAg gTg gAA gAC -3’
���� Oligo direto 2 [NdeI] (Tm: 58 oC)
5’- TTT CAT ATg CAC ATT TCC AgT TCT CCg C -3’
���� Oligo reverso 1 [XhoI] (Tm: 58 oC)
5’- AAA CTC GAg CTA CTT gCC TAC ATT AgA CC -3’
0 2451 pb
5 3
4 PPooll ii QQ
Porção COM o poliQ (750pb)
Porção COM poliQ (986 pb)
Porção SEM a poliQ (1750 pb)
14
� Oligos do Lab. DGM
- Direto (F_SCA1): 5’- CAA CAT ggg CAg TCT gAg -3’
- Reverso (R_SCA1): 5’- AAC Tgg AAA TgT ggA CgT AC -3’
���� Neste tipo de clonagem, teremos a his-tag apenas n a porção N-terminal da proteína:
-Direto ( NdeI): 5’- CCA CAT ATg AAA TCC AAC CAA gAg C -3’
-Reverso ( XhoI): 5’- AAA CTC gAg CTA CTg gAA ATg Tgg ACg TAC T -3’
II.3 .2.) (próxima página)
15
16
II.4.) Gene SCA2: proteína Ataxina-2 (forma Normal)
ORF FINDER (NCBI): U70323.. [gi:1679683] 1312 aa
163 atgcgctcagcggccgcagctcctcggagtcccgcggtggccacc M R S A A A A P R S P A V A T 208 gagtctcgccgcttcgccgcagccaggtggcccgggtggcgctcg E S R R F A A A R W P G W R S 253 ctccagcggccggcgcggcggagcgggcggggcggcggtggcgcg L Q R P A R R S G R G G G G A 298 gccccgggaccgtatccctccgccgcccctcccccgcccggcccc A P G P Y P S A A P P P P G P 343 ggcccccctccctcccggcagagctcgcctccctccgcctcagac G P P P S R Q S S P P S A S D 388 tgttttggtagcaacggcaacggcggcggcgcgtttcggcccggc C F G S N G N G G G A F R P G 433 tcccggcggctccttggtctcggcgggcctccccgccccttcgtc S R R L L G L G G P P R P F V 478 gtcgtccttctccccctcgccagcccgggcgcccctccggccgcg V V L L P L A S P G A P P A A 523 ccaacccgcgcctccccgctcggcgcccgtgcgtccccgccgcgt P T R A S P L G A R A S P P R 568 tccggcgtctccttggcgcgcccggctcccggctgtccccgcccg S G V S L A R P A P G C P R P 613 gcgtgcgagccggtgtatgggcccctcaccatgtcgctgaagccc A C E P V Y G P L T M S L K P 658 cagcagcagcagcagcagcagcagcaacagcagcagcagcaacag Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q 703 cagcagcagcagcagcagcagccgccgcccgcggctgccaatgtc Q Q Q Q Q Q Q P P P A A A N V 748 cgcaagcccggcggcagcggccttctagcgtcgcccgccgccgcg R K P G G S G L L A S P A A A 793 ccttcgccgtcctcgtcctcggtctcctcgtcctcggccacggct P S P S S S S V S S S S A T A 838 ccctcctcggtggtcgcggcgacctccggcggcgggaggcccggc P S S V V A A T S G G G R P G 883 ctgggcagaggtcgaaacagtaacaaaggactgcctcagtctacg L G R G R N S N K G L P Q S T 928 atttcttttgatggaatctatgcaaatatgaggatggttcatata I S F D G I Y A N M R M V H I 973 cttacatcagttgttggctccaaatgtgaagtacaagtgaaaaat L T S V V G S K C E V Q V K N 1018 ggaggtatatatgaaggagtttttaaaacttacagtccgaagtgt G G I Y E G V F K T Y S P K C 1063 gatttggtacttgatgccgcacatgagaaaagtacagaatccagt D L V L D A A H E K S T E S S 1108 tcggggccgaaacgtgaagaaataatggagagtattttgttcaaa S G P K R E E I M E S I L F K
17
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18
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19
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II.4.1.) Oligos usados para a ATX-2
Direto ( Kpn I): 5’- AAA ggT ACC ACC ATg CgC TCA gCg gCC g -3’
Reverso ( Xba I): 5’- CCT CTA gA g ACA ACT gCT gTT ggT ggT ggg -3’
20
Anexo III:
Vetores
21
III.1.) Mapa do vetor de clonagem pGEM T Easy Vector System
Muito conveniente para clonagem de produtos de PCR. Apresenta a conveniencia de reconhecimento
dos sitios para Eco RI e Not I flanqueando o sitio de inserção para facilitar a remoção do inserto. Os
promotores de RNA polimerase T7 e SP6 flanqueiam o sitio multiplo de clonagem (MCS) na região
codificante α-peptide para β-galactosidase. A inativação do α-peptide permite aos clones
recombinantes serem identificados diretamente como colonias brancas, enquanto que as colonias azuis
não apresentam inserto. A origem de replicação f1 premite o preparo de ssDNA.
22
III.2) Mapa do vetor de expressão pET-28a.
O sistema pET (Novagen) é um dos mais usados para expressão de proteínas em E. coli. Os genes alvos
são clonados sob fortes sinais de transcrição e tradução do bacteriófago T7. O vetor possui caudas C e
N-terminais de trombina, T7 e His, o que facilita a purificação da proteína recombinante por
cromatografia de afinidade. As enzimas de restrição que cortam o vetor apenas uma vez e suas
respectivas posições estão indicadas no mapa. Informações mais detalhadas podem ser encontradas no
site http://www.novagen.com/SharedImages/TechnicalLiterature/7_tb055.pdf
23
III.3) Mapa do vetor pRARE.
O vetor pRARE (Novagen) contém o gene de resistência ao cloranfenicol (Cam), o replicon (P15A
ori) e os tRNa correspondentes a codons raros em E. coli (setas em azul) e pode conter os genes que
codificam a lisozima T7 (LysS) ou o repressor lac (lacI)
24
Anexo IV:
Protocolos para Obtenção de Células Competentes, Transformação por “heat shock”,
PCR direto de colônias e Linhagens de E. coli
25
IV.1. ) Preparo das células competentes:
1. Inocular uma colônia isolada de E. coli em 3mL de meio SOC (Sambrook & Russel, 2001) e
adicionar antibiotico especifico, caso necessário;
2. Crescer o pré-inóculo a 37oC por ~16h a 270 rpm;
3. Diluir o pré-inóculo 1:1000 em 50mL de meio SOC;
4. Crescer a cultura de 50mL a 37oC / 270 rpm até atingir uma O.D.600 de 0,4-0,6;
5. Resfriar a cultura imediatamente em banho de gelo. A partir deste passo manter as células sempre
em banho de gelo;
6. Transferir a cultura resfriada para tubos de centrífuga estéreis, também resfriados e centrifugar a
8.000 rpm por 10 min a 4oC e descartar o sobrenadante;
7. Ressuspender as células com 50mL de TFB1 GELADO (em banho de gelo);
8. Incubar em gelo por 40 minutos
9. Centrifugar a 6.000 rpm por 10 min a 4oC em frasco pré-resfriado em banho de gelo e descartar o
sobrenadante;
10. Ressuspender as células gentilmente em 10mL de TFB2 GELADO (em banho de gelo);
11. Aliquotar 100µL de células em eppendorfs pré-resfriados em banho de gelo e congelar em nitrogênio
líquido imediatamente;
12. Estocar as alíquotas a –80oC.
Meio e soluções para preparação de células competentes pelo método de “heat shock”
TFB1 TFB2 Meio SOB
KOAc 0,03 M (2,94 g/l) MOPS pH 7,0 0,010 M (02,04 g/l) Triptona 20,0 g/l
MnCl2 0,05 M (9,90 g/l) CaCl2 0,1 M (11,03 g/l) Extrato de levedura 05,0 g/l
KCl 0,10 M (7,46 g/l) KCl 0,010 M (00,75 g/l) NaCl 05,0 g/l
CaCl2 0,1 M (1,47 g/l) Glicerol 20%
Glicerol 15%
Esterilizar por filtração e estocar a 4oC
Esterilizar por filtração e estocar a 4oC Autoclavar*
* - no momento do uso adicionar 5mL de MgCl2 2M estéril (19g de MgCl2 em 90mL de H2O Milli-Q e
autoclavar por 20’) para cada 1L de meio.
Meio SOC: Após preparar o meio SOB, adicione 20mL de glicose 1M estéril para cada 1L de
meio.
26
IV.2.) Transformação de E. coli pelo Método de “heat shock”:
1. Retirar as céls competentes do –80oC e descongelar em gelo por 5’
2. Adicionar a ligação/DNA (aproximadamente 10µL – 1µg/µL) às céls. competentes
3. Incubar em gelo por 20’-30’
4. Incubar a 42oC por 90” e, em seguida, transferir para gelo por 2’
5. Adicionar 900µL de meio SOC e incubar a 37oC por 1h, sob agitação
6. Plaquear e levar a estufa ON a 37oC
27
IV.3.) PCR de colônias de bactérias
Colônias brancas frescas (no máximo 24h após a transformação), isoladas, são selecionadas ao
acaso das placas. A verificação da presença do fragmento clonado dentro de um vetor pode ser feita por
meio da PCR. Os primers utilizados na reação podem ser oligos que reconhecem seqüências do fago
M13 presentes na maioria dos vetores de clonagem, como por exemplo:
Oligo direto (M13 universal ou -20): 5'-CgACgTTgTAAA ACgACggCCAgT-3'
Oligo direto (M13 -40): 5'-gTTTTCCCAgTCACgAC-3'
Oligo reverso (M13 R): 5'-CAggAAACAgCTATgAC-3'
Podem ser usados, também, oligos de T7, dependendo do vetor (família pET). Estes iniciadores
anelam-se em regiões imediatamente adjacentes ao sítio múltiplo de clonagem do vetor. Podem ser
usados igualmente iniciadores específicos para o fragmento que está sendo clonado. O oligo direto
sintetiza a fita negativa (extremidade 3' do cDNA) e o reverso sintetiza a fita positiva (extremidade 5' do
cDNA).
As colônias isoladas da placa de transformação (utilizando-se um palito estéril) são “lavadas”
diretamente em tubo tipo eppendorf contendo 20µL de H2O milliQ estéril. Em seguida, o palito deve ser
depositado em um tubo de ensaio estéril contendo 2mL de meio LB líquido, suplementado com o
antibiótico adequado (quando necessário), que é então incubado por 16 horas a 37°C sob agitação
constante de 200 rpm para preparo de culturas permanentes e/ou minipreps.
As colônias que foram inseridas nos tubos contendo 20µL de H2O milliQ estéril, devem ser
incubadas a 95oC por 5 min e, em seguida, centrifugadas por 5 min. a 14000rpm, aplicando-se 2µL como
molde na reação de PCR.
Após a reação, a amplificação ou não do fragmento clonado em cada clone é verificada por
eletroforese do produto da PCR em gel de agarose 1% corado com brometo de etídio usado na
concentração final de 0,1µg/mL.
28
IV.4.) Linhagens de E.coli usadas para expressão das proteínas recombinantes:
BL21(DE3)
BL21 é a linhagem mais usada e apresenta a vantagem de ser deficiente nas proteases lon e ompT.
As linhagens classificadas como DE3 são lisogênicas para o profago λ que contem uma T7 RNA
polimerase que é induzida por IPTG. Assim, a designação DE3 indica que o hospedeiro é um lisógeno de
λDE3, e, desse modo carrega uma cópia cromossomica do gene T7 RNA polimerase sob controle do
promotor lacUV5.
É adequada para expressão de proteínas não tóxicas
A tabela a seguir apresenta detalhes das outras linhagens utilizadas neste projeto, como características
principais, genótipo e resistência a antibióticos.
linhagem características Antibiótico
BL21(DE3)pLysS
- mesmas características que a BL21(DE3). Adicionalmente, carrega o plasmídeo pLysS
que produz a lisozima T7 que é um inibidor natural da T7 RNA polymerase e usada para
suprimir a expressão basal da T7 RNA polimerase antes da indução e, desse modo,
estabilizar os recombinantes que codificam proteínas que afetem o crescimento e
viabilidade celular
- adequada para a expressão de proteínas tóxicas, mas pode também ser usada para
proteínas não-tóxicas
genótipo: E. coli B F- dcm ompT hsdS(rB- mB-) gal λ (DE3) [pLysS Camr]
Cloranfenicol
[34ug/mL]
BL21(DE3)pLysE
- mesmas características que a anterior, só que, neste caso carrega o plasmídeo pLysE
que codifica o gene da lisozima T7 e produz maiores quantidades desta enzima do que a
pLysS
- fornece maior controle sobre a transcrição
genótipo: E. coli B F- ompT hsdS(rB- mB-) gal λ (DE3) [pLysE Camr]
Cloranfenicol
[34ug/mL]
C41(DE3) e
C43(DE3)
- derivadas da BL21(DE3) e obtidas por meio de mutações espontâneas não
caracterizadas seguida de seleção fenotípica baseada na sobreviência após indução de
expressão de proteína recombinante tóxica.
genótipos:
E. coli B F dcm ompT hsdS (rB mB) gal λ (DE3) e contendo ao menos uma mutação não
caracterizada, no caso da C41(DE3)
E. coli B F dcm ompT hsdS (rB mB) gal λ (DE3) e contendo ao menos duas mutações não
caracterizadas, no caso da C43(DE3) que é derivada da C41
-
30
Rosetta(DE3)
- derivada da célula Turner, que é uma linhagem especial que apresenta mutantes de
deleção de lacYZ de BL21 (indução por IPTG)
- designada para melhoria da expressão de proteínas de eucariotos que contenham codons
raramente usados em E. coli pois supre tRNAs para os codons AUA, AGG, AGA, CUA, CCC,
GGA à partir de seus próprios promotores
Genótipo:
E. coli T F- ompT hsdSB (rb- mB-) gal dcm lacY1 (DE3) [pRARE6 Camr]
Cloranfenicol
[34ug/mL]
BL21(DE3)RIL
- características semelhantes a BL21(DE3)
- esta linhagem carrega cópias extra dos tRNA genes argU, ileY e leuW. Os tRNAs
codificados para esses genes reconhecem os codons AGA/AGG (arginina), AUA
(isoleucina) e CUA (leucina), respectivamente.
- adequada para organismos com genoma rico em AT
- adequada para a expressão de proteínas extremamente tóxicas
Genótipo:
E. coli B F– ompT hsdS(rB– mB–) dcm+ Tetr gal λ(DE3) endA Hte [argU ile YleuW Camr]
Cloranfenicol
[34ug/mL]
BL21(DE3)RP
- características semelhantes a BL21(DE3)
- esta linhagem carrega cópias extra dos tRNA genes argU e proL. Os tRNAs codificados para
esses genes reconhecem os codons AGA/AGG (arginina) e CCC (prolina)
- adequada para organismos com genoma rico em GC
- adequada para a expressão de proteínas extremamente tóxicas
Genótipo:
E. coli B F– ompT hsdS(rB– mB–) dcm+ Tetr gal λ(DE3) endA Hte [argU proL Camr]
Cloranfenicol
[34ug/mL]
Anexo V:
Relatório SAXS
32
Anexo VI:
Análises in silico:
33
VI.1. Análise de codons raros
34
VI.2. “ProtParam tools”
35
VI.3.Análise de estrutura secundária
36
Anexo VII:
Desdobramentos do projeto original:
37
SSuubb--PPrroojjeettoo:: AAnnááll iissee eessttrruuttuurraall ddaa AATTXX--33 eemm ssoolluuççããoo uutt ii ll iizzaannddoo eessppaallhhaammeennttoo ddee
rraaiiooss--XX ddee bbaaiixxoo âânngguulloo (projeto realizado em colaboração com a Profa. Dra. Iris
Torriani do IF-UNICAMP e do LNLS).
Os experimentos de espalhamento de raios X estão sendo realizadas na linha de luz D11-SAS do
LNLS em várias configurações para obter o intervalo angular mais adequado para análise das curvas de
Intensidade x vetor de espalhamento q (q = 4π senθ/λ, onde 2θ é o ângulo de espalhamento e λ o
comprimento de onda da radiação utilizada). As amostras em solução para várias concentrações da
proteína serão expostas a radiação de 8.33 KeV (que corresponde a um λ = 1.488 Å), usando um porta
amostras de 1 mm de espessura com temperatura controlada, mantendo a amostra a 10°C. O detector a
ser usado será o sensível à posição unidimensional. Diversas medidas em concentrações diferentes
permitirão o controle da monodispesidade da amostra e possível efeitos de agregação. Serão realizadas
exposições do solvente (buffer) para correção de cada um dos espectros obtidos com a proteína, e
medidas com albumina com o objetivo de calcular o peso molecular da ataxina-3 por métodos de
comparação.
O tratamento de dados será feito usando o software TRAT1D (Oliveira et al., 1997) disponível na
linha de SAXS do LNLS. A análise das curvas de espalhamento permitirá a obtenção do raio de giro das
moléculas usando a aproximação de Guinier. Uma análise mais criteriosa pode ser feita usando o
programa de cálculo GNOM (Svergun, 1991) que alem do raio de giro, permite obter a função de
distribuição de distâncias intramoleculares P(r) e a dimensão máxima da proteína, mostrando assim a
forma que ela adota em solução.
O cálculo de uma “função envelope” tridimensional obtida a partir dos dados de espalhamento
poderá ser feito dependendo da qualidade dos dados, usando programas especialmente desenvolvidos
para esse fim (Stuhrmann, 1970). Até o momento dispomos de resultados obtidos para a ATX-3 normal
fusionada com His-tag e estamos aguardando os resultados obtidos pelas medições da ATX-3 na forma
expandida. Pretendemos obter amostras da ATX-3 normal sem a cauda de histidina para que sejam
analisadas e, desse modo, complementar os dados para publicação. Pretendemos também dar
continuidade ao projeto analisando as demais proteínas deste projeto.
SSuubb--PPrroojjeettoo ddee BBiiooiinnffoorrmmáátt iiccaa (realizado em colaboração com A EMBRAPA
Bioinformática, Campinas - Grupo coordenado pelo Prof. Dr. Goran Neshich)
A sequencia das proteinas ATX-3, ATX-1, ATX-7 e ATX-2 estão sendo utilizadas para a buscar
sequencias homólogas aos respectivos genes no banco de dados GenBank com o programa BLASTx,
considerando-se apenas scores superiores a 200.
Sequencias de trato de 10 a 80 glutaminas estão sendo, também, utilizadas para buscar por
sequencias depositadas no GenBank que contenham tratos de poliQ, para tal foi utilizado o programa
BLASTx, e foram considerados scores acima de 80.
38
Até o momento, os resultados de BLASTx com as proteinas inteiras não revelaram homologias
com quaisquer outra sequencia do banco de dados GenBank, ja o BLASTx feito com o trato de poliGln
identificou as sequencias: gi|1729824|, gi|33286444|, gi|6166008|, gi|28828398|, gi|28924534|,
gi|18376358|, gi|28828398|, gi|27367908|, gi|23480318|, que apresentam poliGln nas sequencias de seus
gene, tornando-os alvos interessantes para estudos de homologia e função. Neste momento, esses
resultados preliminares estão sendo verificados individualmente.
OOUUTTRROOSS ddeessddoobbrraammeennttoo ddaa cclloonnaaggeemm ddaa AATTXX--33 normal e expandida em nosso
laboratório foram:
- a possibilidade de utilizar tais clones em outros projetos, desses podemos citar o projeto de doutorado
apoiado pelo FAPESP (processo FAPESP nr. 02/07752-3) “Caracterização de proteínas que interagem
com a Ataxina-3 em sua forma normal e mutante através do Yeast Two-Hybrid system” (tal projeto conta
com a colaboração do Prof. Dr. Jorg Kobarg do LNLS);
- projeto colaborativo com a Profa. Dra. Anita Marsaioli do IQ-UNICAMP com o objetivo de caracterizar
ligantes da ATX 3 de baixo peso molecular (processo FAPESP nr. 03/00670-4).
