PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU MESTRADO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE LEITE E DERIVADOS

GISELE BOMBARDI FREITAS BARONE GASPARINI

Londrina 2018

PSICROTRÓFICOS EM LEITE CRU: EFEITO NA

QUALIDADE DO QUEIJO TIPO PROVOLONE

GISELE BOMBARDI FREITAS BARONE GASPARINI

Cidade ano

AUTOR

Dissertação apresentada à UNOPAR, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Ciência e Tecnologia de Leite e Derivados. Orientadora: Profa. Dra. Elsa Helena Walter de Santana

Londrina

2018

PSICROTRÓFICOS EM LEITE CRU: EFEITO NA QUALIDADE DO QUEIJO TIPO PROVOLONE

AUTORIZO A REPRODUÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

Dados Internacionais de catalogação na publicação (CIP) Universidade Pitágoras Unopar

Biblioteca CCBS/CCECA PIZA

Setor de Tratamento da Informação

Gasparini, Gisele Bombardi Freitas Barone

G249p Psicrotróficos em leite cru: efeito na qualidade do queijo

tipo provolone. / Gisele Bombardi Freitas Barone Gasparini.

Londrina: [s.n], 2018.

54 f.

Dissertação (Mestrado em Ciência e Tecnologia de Leite e

Derivados). Universidade Pitágoras Unopar.

Orientadora: Profa. Dra. Elsa Helena Walter de Santana.

1- Leite - Dissertação - UNOPAR 2- Termodúricos 3-

Proteólise 4- Qualidade do queijo - provolone 5-

Psicrotróficos em leite 6- Vida útil - queijo I- Santana, Elsa

Helena Walter de; orient. II- Universidade Pitágoras Unopar.

CDD 637 Andressa Fernanda Matos Bonfim - CRB 9/1643

GISELE BOMBARDI FREITAS BARONE GASPARINI

PSICROTRÓFICOS EM LEITE CRU: EFEITO NA QUALIDADE DO QUEIJO TIPO PROVOLONE

Dissertação apresentada à UNOPAR, no Mestrado em Ciência e Tecnologia de Leite

e Derivados, área e concentração em Ciência e Tecnologia de Leite e Derivados como

requisito parcial para a obtenção do título de Mestre conferido pela Banca

Examinadora composta pelos seguintes membros:

_________________________________________ Profa. Dra. Elsa Helena Walter de Santana

(Universidade Norte do Paraná)

_________________________________________ Prof. Dr. Rafael Fagnani

(Universidade Norte do Paraná)

_________________________________________ Dr. Ronaldo Tamanini

(Universidade Estadual de Londrina)

Londrina, 28 de fevereiro de 2018.

Dedico este trabalho à minha família pelo apoio

e amor incondicional, meu esposo e filhos

amados.

AGRADECIMENTOS

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

(CAPES), pelo apoio financeiro através da concessão da taxa PROSUP;

À Deus nosso Pai e Jesus nosso mestre por toda uma existência de

apoio, incentivo e proteção para que tivesse a oportunidade e força para realizar esse

grande sonho de voltar aos bancos escolares depois de muitos anos e concretizar o

mestrado;

À minha orientadora e grande mestre Dra. Elsa Helena Walter de

Santana, que com sua habilidade intelectual me conduziu e orientou com muita

disciplina todos os caminhos a serem percorridos;

Ao professor Dr. Rafael Fagnani pela orientação e ajuda na estatística

do trabalho desenvolvido;

Ao meu esposo Ricardo e filhos Maria Luiza e Ricardo, por serem tão

importantes na minha vida. Sempre ao meu lado, me incentivando e fazendo transpor

meus medos, limites e sempre acreditando no meu sonho;

Aos colegas da turma 11 do Mestrado em Ciências e Tecnologia de

Leite e Derivados da UNOPAR, Angélica, Bruno, Emely, Érika, Flávia, Liliane,

Paulyne, Rafael, Rogério, Rosana, Silvia e Vitória, pela amizade, incentivo, apoio,

ensinamentos e parceria;

À todos os professores e funcionários do programa de mestrado por

contribuirem com seus ensinamentos;

Aos colegas de laboratório, os técnicos Flávia, Sabrina e Samuel que

me socorreram nos momentos mais difíceis e cooperaram no término desse trabalho,

muito obrigada pela dedicação;

À minha querida estagiária Franciany, um anjo que entrou na minha

vida, me trazendo calma, presteza, dedicação e muita amizade, sem você todos os

dias no laboratórios teriam sido muito difícies;

Às minhas amigas de uma vida inteira Vitória e Silvia, por partilharem

anos de amizade, profissão e estudos com muito amor e carinho;

Às minhas eternas amigas Liliane e Rosana por percorrerem comigo

parte do mestrado com matérias difíceis e pesadas, me incentivando a nunca desistir

e por todas as tardes, noites e madrugadas de estudo;

Ao colega Bruno, pela paciência e por ter compartlhado seus vastos

conhecimentos;

À Indústria de laticínios Kollac e seus gestores que foram meus

grandes incentivadores, André, Laércio, Gabriel, Marcos, Kelly e tantos outros

colaboradores por todo apoio, paciência e interesse em melhorias na qualidade meus

eternos agradecimentos;

Aos gestores Lilian, Milton, Andréia, Vanderléia, Adriano, Adalto,

Flávio, Jorge, Fabiana e muitos outros por compreenderam minha ausência e por todo

o incentivo nas pesquisas;

Aos meus pais, por todo amor e por sempre me fazerem acreditar que

o trabalho honesto e os estudos com afinco são as melhores escolas da vida.

"Para ter algo que você nunca teve, é preciso fazer algo que você nunca fez!" Chico Xavier

GASPARINI, Gisele Bombardi Freitas Barone. Psicrotróficos em leite cru: efeito na qualidade do queijo tipo provolone. 2018. 54. f. Dissertação (Mestrado em Ciência e Tecnologia de Leite e Derivados) - Unidade Piza, Universidade Pitágoras Unopar, Londrina, 2018.

RESUMO

A implantação da refrigeração do leite na propriedade, o transporte a granel e a ineficiência da implantação das boas práticas de ordenha favoreceram o desenvolvimento dos psicrotróficos. Essas bactérias, a partir de populações de 105 – 106 UFC/ml produzem enzimas lipolíticas e proteolíticas termo resistentes suficientes para promover alterações físicas e sensoriais que comprometem a qualidade do leite e principalmente dos derivados. Este estudo teve o objetivo avaliar a influência da população de psicrotróficos do leite cru refrigerado nas características microbiológicas, físico químicas, índice de proteólise e textura do queijo tipo provolone ao longo da maturação de 60 dias. Foram selecionados dois tipos de matéria prima para produção de 2 lotes (20 unidades/lote) de queijo tipo provolone: tratamento 1 utilizando leite cru refrigerado com populações de 3 log UFC.mL-1 de psicrotróficos/mL, e o segundo tratamento, leite com contagens de 7 log UFC.mL-1. As análises físico químicas de gordura e umidade foram realizadas pelo método de Gerber para queijos e determinação da umidade por equipamento MB25. As mudanças proteolíticas ocorridas durante a maturação do queijo foram estudadas usando eletroforese UREA-PAGE alcalina (SDS-PAGE), determinação de Kjeldahl das frações solúveis em nitrogênio total, nitrogênio não caseico (NNC) e nitrogênio não proteico (NNP), utilizando os índices de proteólise primária e secundária. A textura foi determinada por equipamento texturômetro. Os resultados da textura do queijo produzido com matéria prima com 7 log UFC.mL-1 nos parâmetros dureza, gomosidade e mastigabilidade foram influenciados pela qualidade microbiológica do leite (p<0,01). Em relação à composição centesimal, a qualidade microbiológica do leite teve influência apenas na quantidade de gordura dos queijos, observando-se uma relação linear e negativa (p<0,01). A maior população de micro-organismos psicotrópicos influenciou nas frações αs1 e β-caseína e o tempo de maturação nas frações αs1 e γ caseína. As frações αs1-I, αs1-II não se relacionaram (p>0,05) com a qualidade do leite ou com o tempo de maturação devido o estudo realizado ser feito com queijos de até 60 dias de maturação. Conclui-se que a qualidade microbiológica da matéria prima influênciou na qualidade do queijo tipo provolone aumentando a dureza, reduzindo o teor de gordura e promovendo maior degradação das frações αs1 e β-caseína. Palavras-chave: Proteólise. Termodúricos. Vida útil.

GASPARINI, Gisele Bombardi Freitas Barone. Psicrotróficos em leite cru: efeito na qualidade do queijo tipo provolone. 2018. 54. f. Dissertação (Mestrado em Ciência e Tecnologia de Leite e Derivados) - Unidade Piza, Universidade Pitágoras Unopar, Londrina, 2018.

ABSTRACT

With the implementation of milk refrigeration on the property, the transportation in bulk and the inefficiency of the implantation of the good practices of milking favored the development of the psychrotrophic. These bacteria, from populations of 105 - 106 UFC/ mL, produce thermally resistant lipolytic and proteolytic enzymes sufficient to promote physical and sensory infections that compromise milk quality, and especially of the derivatives.The objective of this study was to evaluate the influence of the psicrotrophic population of refrigerated raw milk on the microbiological, physical, chemical, proteolytic and provolone type texture characteristics during a 60 days maturation period. Two types of raw material were selected for the production of 2 lots (20 units/lot) of provolone cheese: treatment 1 using refrigerated raw milk with populations of 3 log UFC.mL-1 of psychrotrophic/mL, and the second treatment, milk with counts of 7 log UFC.mL-1. The physical and chemical analyzes of fat and moisture were performed using the Gerber method for cheeses and moisture determination by MB25 equipment. Proteolytic changes during cheese maturation were studied using alkaline UREA-PAGE electrophoresis (SDS-PAGE), Kjeldahl determination of soluble fractions in total nitrogen, non-casein nitrogen (NNC) and non-protein nitrogen (NNP), using the primary and secondary proteolytic indicators. The texture was determined by texturometer equipment. The results of the cheese texture produced with raw material with 7 log CFU.mL-1 in the parameters of hardness, guminess and chewing were influenced by the microbiological quality of the milk (p<0.01). In relation to the centesimal composition, the microbiological quality of the milk influenced only in the amount of fat in the cheeses, with a negative linear relation (p<0.01). The largest population of psychotropic microorganisms had a influence on the αs1 and β-casein and the maturation time in the fractions αs1 and γ casein. αs1-I, αs1-II , were not related (p>0.05) to milk quality or time of maturation due to the study had been carried out with cheeses with up to 60 days of maturation. It is concluded that the microbiological quality of the raw material influences the quality of the provolone type cheese product, increasing the hardness, reducing the fat content and promoting greater degradation of the αs1 and β-casein fractions.

Key words: Proteolysis. Thermodurics. Lifespan.

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ................................................................................................ 10

2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ...................................................................... 11

2.1 MICRO–ORGANISMOS PSICROTRÓFICOS .............................................. 11

2.1.1 Psicrotróficos Termodúricos ....................................................................... 13

2.2 ENZIMAS PROTEOLÍTICAS ........................................................................ 14

2.3 PERFIL ELETROFORÉTICO ........................................................................ 16

2.4 FRAÇÕES PROTEICAS ............................................................................... 17

2.5 PROTEÓLISE PRIMÁRIA E SECUNDÁRIA ................................................. 18

2.6 QUEIJO TIPO PROVOLONE ........................................................................ 19

2.7 TEXTURA ..................................................................................................... 20

3. OBJETIVOS .................................................................................................... 22

3.1 OBJETIVO GERAL ....................................................................................... 22

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................................... 22

REFERÊNCIAS .................................................................................................. 23

4. ARTIGO .......................................................................................................... 28

5. CONCLUSÃO GERAL .................................................................................... 51

ANEXO I ............................................................................................................. 52

ANEXO II ............................................................................................................ 53

ANEXO III ........................................................................................................... 54

10

1. INTRODUÇÃO

Entre 2006 e 2013, o mercado brasileiro de queijos cresceu em

volume 9,4% ao ano, e em faturamento total 7,7% ao ano (CARVALHO; VENTURINI;

GALAN, 2015). A meta da Associação Brasileira das Indústrias de queijo (Abiq) é que

até 2020 o consumo seja de 7,5 quilos per capita, projetando para o ano de 2030

atingir a marca de 9,6 quilos de queijo por habitante, o que representa uma evolução

de 46% frente a quantidade atual de 5 quilos por pessoa em todo pais (ABIQ, 2017).

Um dos queijos mais produzidos foi o queijo tipo provolone,

caracterizado por ser de massa filada, semiduro, de textura fechada ou com poucas

olhaduras, cuja origem é a região sul da Itália (FAVATI; GALGANO; PACE, 2007).

O Brasil, apesar de ser um dos maiores produtores de leite do mundo

(FAO, 2013), apresenta excessiva contaminação do leite cru por micro-organismos

deteriorantes, que comprometem rapidamente a qualidade e o tempo de vida de

prateleira dos produtos lácteos (TAMANINI, 2012).

Com a implantação da refrigeração do leite na propriedade e o

transporte a granel (BRASIL, 2011) favoreceu o desenvolvimento dos psicrotróficos.

Essas bactérias, a partir de populações de 105 – 106 UFC/ml produzem enzimas

lipolíticas e proteolíticas termo resistentes suficientes para promover alterações físicas

e sensoriais que comprometem a qualidade do leite e principalmente dos derivados

(MU; DU; BAI, 2009; PINTO; MARTINS; VANETTI, 2006). Outro grupo de

deteriorantes importante são os microrganismos termodúricos, que são capazes de

resistir à pasteurização (FRANCO, LANDGRAF, 2003). No leite cru refrigerado, esses

microrganismos também podem ser psicrotróficos proteolíticos e/ou lipolíticos

(RIBEIRO JÚNIOR et al., 2014).

Desta forma, a avaliação da influência da microbiota psicrotróficas do

leite cru na qualidade microbiológica e físico-química do queijo tipo provolone é de

fundamental importância para as características sensoriais, índice de proteólise e vida

de prateleira do produto. Esses dados podem ser úteis para as indústrias, órgãos

regulamentadores conhecerem e selecionaram a matéria prima a ser beneficiada para

a fabricação dos produtos lácteos e consequentemente diminuir perdas financeiras e

tecnológicas.

11

2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

A legislação brasileira através da Instrução Normativa n. 62, de 29 de

dezembro de 2011, aprovou o regulamento técnico de identidade e qualidade do leite

cru refrigerado, fixando limites físico-químicos e microbiológicos que este produto

deve atender. Visando a melhoria da qualidade do leite, a referida normativa

estabelece, que o leite deve ser resfriado em tanques de refrigeração por expansão

direta (temperatura igual ou inferior a 4oC) ou em tanques de imersão (temperatura

igual ou inferior a 7oC), devendo ser recolhido e transportado em caminhões

isotérmicos para o laticínio em até 48 horas (BRASIL, 2011).

A principal microbiota deteriorante do leite e de produtos lácteos antes

da introdução da refrigeração, era constituída de bactérias mesófilas fermentadoras

da lactose, que causam rápida acidificação em leite não refrigerado. Com o uso da

refrigeração, associado a períodos mais longos de armazenamento, selecionou-se um

outro tipo de microbiota deterioradora, denominada psicrotrófica (ARCURI, 2003;

COUSIN, 1982; FAGUNDES et al., 2006; PINTO; MARTINS; VANETTI, 2006). Este

grupo de bactérias sintetiza enzimas termo resistentes e são capazes de se multiplicar

a temperaturas de 7oC ou menos, independentemente de sua temperatura ótima de

crescimento (FRANK et al., 1992).

Outro grupo importante de micro-organismos deteriorantes são os

micro-organismos termodúricos que podem ser psicrotróficos proteolíticos e/ou

lipolíticos, deteriorando o leite pasteurizado (RIBEIRO JÚNIOR et al., 2014). A

definição para os termodúricos de acordo com Franco e Landgraf (2003) são micro-

organismos na forma vegetativa ou na forma de esporos que sobrevivem ao processo

de pasteurização, podendo sobreviver a exposição de temperaturas consideráveis

altas. As espécies de bactérias termodúricas isoladas no leite usualmente incluem os

micrococos, grupo dos corineformes, bacilos e clostridios (APHA, 2004).

2.1 MICRO–ORGANISMOS PSICROTRÓFICOS

A maioria dos micro-organismos psicrotróficos presentes no leite cru

e produtos lácteos geralmente vem do solo, água e vegetação (SANTANA et al.,

2001). De acordo com Vallin et al. (2009) a implantação das boas práticas de ordenha

na propriedade, como sanitização adequada de equipamentos e utensílios, desprezo

12

dos três primeiros jatos de leite e eliminação da água residual dos utensílios de

ordenha são fundamentais para minimizar os riscos de contaminação durante a

produção. Esses procedimentos são capazes de reduzir a contaminação microbiana

e/ou física do leite.

Podem ser representados tanto por Gram negativos como os gêneros

Pseudomonas, Achromobacter, Aeromonas, Serratia, Alcaligenes, Chromobacterium

e Flavobacterium como por Gram positivos como Bacillus, Clostridium,

Corynebacterium, Streptococcus, Lactobacillus e Microbacterium. Devido aos

procedimentos usuais de manutenção e coleta do leite refrigerado, em dois a três dias

eles predominam na microbiota do leite cru (CROMIE, 1992; SORHAUG;

STEPANIAK, 1997).

Arcuri et al. (2008) realizaram um estudo que demonstrou que o grupo

psicrotrófico inclui uma grande variedade de gêneros bacterianos, com predominância

do gênero Pseudomonas (43%), sendo Pseudomonas fluorescens a espécie

predominante (37,6%). A frequência do gênero Pseudomonas spp. e da espécie P.

fluorescens em leite cru refrigerado foi analisada por Almeida (2014) como indicador

de qualidade e da aplicação correta de boas práticas de ordenha. Os resultados foram

contrários aos estudos até então apresentados, a porcentagem de Pseudomonas spp.

foi de 17,93%, sendo a espécie P. fluorescens apenas 3,42% deste total, não

constituindo assim a espécie predominante nas amostras analisadas. Provavelmente

existam outros psicrotróficos envolvidos na deterioração do leite cru refrigerado de

acordo com os resultados analisados.

O Ministério da Agricultura não estipula um padrão de identidade e

qualidade do leite, para a enumeração dos psicrotróficos (BRASIL, 2011). Porém

quando em condições sanitárias adequadas, os psicrotróficos presentes no leite cru,

representam menos de 10% da microbiota total, porém os micro-organismos

psicrotróficos podem ultrapassar 75% em condições higiênicas não satisfatórias

(NIELSEN, 2002).

A população de psicrotróficos no leite cru refrigerado varia com o

binômio tempo/temperatura e sua estocagem por períodos prolongados reflete

negativamente na qualidade do produto final. É desaconselhável a fabricação de

produtos a partir do leite cru refrigerado com contagem de psicrotróficos superiores a

106 UFC/mL, pois é grande a possibilidade da presença de enzimas extracelulares

termo resistentes como proteases e lipases (COUSIN; BRAMLEY, 1981; PINTO;

13

MARTINS; VANETTI, 2006).

Walstra, Wouters e Geurts (2005) afirmaram que os defeitos de sabor

começam a aparecer em quantidades superiores a 5x107 psicrotróficos por mililitro de

leite. Lipases e proteases secretadas por esses organismos são conhecidas por

provocarem alterações sensoriais no leite e derivados lácteos, causando rancidez

(IZIDORO, 2013), sabor de sabão e, ocasionalmente, sabores amargos indesejáveis

(ARCURI et al., 2008; COUSIN, 1982; JONGUE et al., 2010). Estas alterações

ocorrem devido à degradação da gordura e proteínas do leite, respectivamente

(WALSTRA; WOUTERS; GEURTS, 2005).

2.1.1 Psicrotróficos Termodúricos

Alguns micro-organismos psicrotróficos, podem ser termodúricos,

produzindo enzimas extracelulares termoestáveis que comprometem a qualidade e o

tempo de vida útil do leite pasteurizado; sua enumeração é uma ferramenta muito

importante no controle da qualidade da matéria prima e beneficiamento dos produtos

acabados (REIS et al., 2013).

Os psicrotróficos termodúricos são representados pelos gêneros

Arthrobacter, Microbacterium, Streptococcus, Corynebacterium, Clostridium e

principalmente pelo gênero Bacillus (COLLINS, 1981). Os que resistem à

pasteurização do leite com alta taxa de sobrevivência pertencem aos gêneros Bacillus,

Paenibacillus, Micrococcus e Mycobacterium e, com baixa taxa de sobrevivência

alguns Enterococcus, Streptococcus e Lactobacilluse (JAY, 2005). Ribeiro Júnior et

al. (2014) avaliaram 20 amostras de leite cru refrigerado na região norte do estado do

Paraná e encontraram média de 3,5x 103 UFC/mL de termodúricos psicrotróficos,

podendo estes micro-organismos estar diretamente relacionados à redução da vida

útil desse leite e seus derivados.

São consideradas importantes sob o ponto de vista tecnológico as

alterações associadas às contaminações de produtos lácteos com B. cereus, uma vez

que provocam uma redução do prazo de validade e o desenvolvimento de atributos

sensoriais indesejáveis (ALMEIDA; SANTOS; CARVALHO, 2000; CHEN;

COOLBEAR; DANIEL, 2004; FROMM; BOOR, 2004; REZENDE-LAGO et al., 2007;

DE JONGHE et al., 2010). Várias enzimas, como proteases, lipases e fosfolipases são

sintetizadas pelas espécies do gênero Bacillus podendo ser intra ou extracelulares

14

(CHEN; COOLBEAR; DANIEL, 2004). Nos Estados Unidos, de acordo com Meer et

al. (1991), 20% a 25% dos problemas reportados na Califórnia na primavera, de prazo

de validade dos produtos lácteos comercializados, foram relacionados com a

presença de enzimas produzidas por B. cereus e B. mycoides psicrotróficos. Existe

uma carência na literatura de dados mais atualizados referentes às perdas

econômicas causadas por B. cereus em produtos lácteos.

2.2 ENZIMAS PROTEOLÍTICAS

Segundo Muir (1996) a proteólise em leite pode ser causada por

proteases naturais deste alimento (plasmina) ou por enzimas produzidas por micro-

organismos psicrotróficos durante a estocagem sob refrigeração. Estes dois tipos de

enzimas diferem entre si pela especificidade nas proteínas do leite.

A plasmina é a principal enzima proteolítica natural do leite fresco com

baixa contagem de células somáticas e baixa contagem bacteriana e tem o

aminoácido serina como sítio ativo (NIELSEN, 2002). Em casos de leite mastítico

verifica-se um aumento na concentração de plasmina. Esta enzima é derivada do seu

precursor inativo, o plasminogênio. O leite tem quatro vezes mais plasminogênio do

que plasmina e ambos são associados à micela de caseína. Qualquer fator que

converta plasminogênio a plasmina pode ter uma influência sobre a proteína do leite,

uma vez que esta hidrolisa prontamente αs- e β-caseínas (FOX; MCSWEENEY,

1998).

No leite, as proteases liberadas pelas bactérias psicrotróficas são, em

maioria metalo-proteases, com a presença de Ca e Zn. Grande parte apresenta baixo

peso molecular, com resíduos de glicina e alanina, concentrações mínimas de

metionina, ausência de cistina e presença da alanina no grupo terminal N. Entre as

cadeias de aminoácidos, a ausência de pontes dissulfeto promove uma maior

flexibilidade na estrutura primária da enzima, conferindo grande estabilidade térmica

a estas enzimas (MITCHELL; EWINGS, 1986). Na estrutura das proteases, a

presença de Ca2+ e de Zn2+ também contribui na estabilidade destas enzimas ao calor,

com resistência à temperatura de 149ºC/7seg, similar ao tratamento UHT (BARACH;

ANAMS; SPECK, 1976).

A produção de proteases pelas bactérias é influenciada pelas

condições do ambiente. A produção de proteases por unidade de peso seco aumenta

15

com a diminuição da temperatura, enquanto que a multiplicação celular, abaixo de

20ºC, reduz com a diminuição da temperatura. Este fato suporta a hipótese de que as

bactérias psicrotróficas sintetizam maiores quantidades de enzimas a baixas

temperaturas, a fim de compensar a redução da atividade enzimática e manter sua

taxa de multiplicação celular (FAIRBAIRN; LAW, 1986).

Contagens de bactérias psicrotróficas contaminantes de leite cru

refrigerado foram isoladas e quantificadas por Arcuri et al. (2008), esses

microrganismos nas amostras coletadas variaram entre 102 e 107 (UFC) mL, sendo

verificada a predominância de bactérias psicrotróficas Gram-negativas em 81,2% das

amostras. Nos resultados deste estudo foi verificado que a maioria dos isolados

bacterianos apresentou atividade lipolítica e/ou proteolítica em temperaturas de

refrigeração, deixando evidente que estas enzimas possuem um alto potencial de

deterioração sobre leite e produtos lácteos. A deterioração do leite cru por

psicrotróficos, assim como a atividade lipolítica e proteolítica destes micro-organismos

foram avaliadas por Kumaresan, Annalvilli e Sivakumar (2007) concluindo que a

temperatura de 2°C, houve menor multiplicação bacteriana e menores atividades

lipolítica e proteolítica quando comparado ao armazenamento a 4 e 7°C, determinando

assim a temperatura de 2°C como protetora contra a multiplicação psicrotróficos.

A redução do rendimento de queijos ocorre devido as ações das

proteases que degradam as micelas de caseína, com liberação de componentes

solúveis, como polipeptídios e aminoácidos, os quais são perdidos no soro

(CARDOSO, 2006). A formação de gosto amargo por proteases ocorre mais

acentuadamente em queijos maturados uma vez que atuam durante todo o período

de maturação, representando um grande problema de qualidade nestes produtos. A

presença de proteases em leite destinado a fabricação de queijos pode causar uma

degradação parcial das β e қ-caseínas, liberando peptídeos e nitrogênio não proteico

no soro, causando uma queda no rendimento nos queijos em até 5%. Além disso,

durante a maturação de queijos macios e semiduros, estas proteases podem liberar

peptídeos de baixo peso molecular que podem causar gosto amargo nestes queijos

(FURTADO, 2005).

A ação das proteases, principalmente do gênero Pseudomonas, é

similar à da quimosina, enzima empregada na coagulação enzimática para obtenção

de queijos (PICARD et al., 1994). Segundo Sorhaug e Stepaniak (1997) queijos duros

produzidos com leite com população de psicrotróficos de 6,5- 7,5log UFC/mL podem

16

apresentar defeitos como rancidez enquanto populações entre 7,5 a 8,3 log UFC/mL,

causaram rancidez, sabor de sabão e redução de rendimento.

2.3 PERFIL ELETROFORÉTICO

Um fenômeno importante que ocorre durante a fabricação do queijo

é a proteólise, devido à ação de enzimas endógenas do leite, bem como do coalho e

de enzimas microbianas. Em queijo fresco, como mussarela, a proteólise primária é

esperada. Portanto, fragmentação de proteína enzimática pode ser uma maneira

eficaz de controlar o estado de conservação dos produtos lácteos, porque a qualidade

do produto pode ser medida a partir dos níveis de proteólise e a formação de frações

específicas (FOX, 1989; MCSWEENEY et al., 1993; GAIASCHI et al., 2000).

As proteínas da maioria dos queijos são alteradas primeiramente pela

ação de enzimas do coalho que degradam as αs1 caseína, deixando β-caseína em

grande parte inalterada (LEDFORD; O’SULLIVAN; NATH, 1966).

A análise eletroforética das caseínas na fabricação do queijo Cheddar

a partir de leite pasteurizado, indica diferenças definidas no padrão eletroforético nos

componentes de caseína. Foi observado o desaparecimento quase por completo da

fração αs1 caseína após 55 dias de maturação e a β-caseína aparece em grande parte

afetada (LEDFORD; O’SULLIVAN; NATH, 1966). Frações de αs-caseínas (αs1-CN e

αs2-CN) em queijos frescos e curados foram registradas com uma única banda,

enquanto β-CN foi detectada com duas bandas sobrepostas. A análise de SDS-PAGE

de queijos claramente mostrou que ambas as caseínas foram significativamente

degradadas durante todo o período de amadurecimento. Durante 50 dias de

maturação, as αs-caseínas residuais foram degradadas extensivamente até 15,42%

do conteúdo inicial. Simultaneamente, β-CN teve uma degradação progressiva muito

mais lenta e o nível não hidrolisado foi de 76,88% (BARAC et al., 2016).

Segundo Mayer, Rockenbauer e Mlcak (1998) as alterações em

proteínas insolúveis têm sido estudadas utilizando técnicas eletroforética, onde foi

demonstrado que β-caseína é hidrolisada muito rapidamente durante os primeiros

meses de cura, desaparecendo depois de aproximadamente um ano.

Consequentemente as Y2 e Y3-caseínas continuam a aumentar, e Y1-caseína tende a

diminuir concomitantemente, o que confirma o importante papel da plasmina na

maturação.

17

É evidente a presença das caseinas α, β e do peptído para-k-

caseínas, nas amostras de queijo, sendo este peptídeo característico em decorrência

da hidrólise da k-caseína pela ação da quimosina que hidrolisa esta proteína da região

Phe105-Met106 (EGITO et al. 2007).

Fragmentos αS1-NC foram encontrados, sugerindo uma atividade

proteolítica intensa provavelmente relacionado com as diferentes idades das coalhada

usados para a produção das amostras analisadas: quanto maior for a idade da

coalhada, maior será a presença de produtos de proteólise, como também tem sido

relatado para coalhada bovina (FACCIA et al., 2014).

2.4 FRAÇÕES PROTEICAS

As micelas de caseína no leite são altamente hidratadas (3,7 g ou 4,4

mL de água) por grama de caseína. Apresentam peso molecular da ordem de 2,5 x

108 daltons e medem de 500 a 3.000 angstroms de diâmetro, são formadas de 93%

(p/p) de caseínas em que αs1, αs2, β e κ estão nas proporções 3:1: 3:1. Os restantes

7% do peso das micelas constam de cálcio inorgânico (2,87%), fosfato (2,89%), citrato

(0,4%) e pequenas quantidades de magnésio, sódio e potássio (SCHMIDT, 1980;

ROLLEMA, 1992). As caseínas são classificadas em quatro sub-grupos: caseínas α,

β, κ e γ. As caseínas α formam uma família de proteínas com características diferentes

(αS0 a αs5). Dentro de cada grupo de caseínas aparecem ainda variantes genéticas,

como ilustra a Tabela 1 (SGARBIERI, 1996).

Tabela 1 (adaptada): Principais características físico-químicas das

caseínas do leite de vaca

Fração proteica Porcentagem no leite desnatado Peso molecular*

Caseína αS1 (αS0, αs2, αs3, αS4, αS5)

45 – 55 23.613

Caseína β 25 – 35 24.000

Caseína κ 8 – 15 19.000 Caseína - γ

γ1 γ2 γ3

3 – 7 21.000 20.500 11.800 11.500

*Peso molecular em daltons. Fonte: SGARBIERI, 1996.

18

2.5 PROTEÓLISE PRIMÁRIA E SECUNDÁRIA

Os agentes proteolíticos principais envolvidos na maturação de

queijos são:

Coagulante residual;

Enzimas naturais do leite (plasmina);

Bactérias do fermento láctico (cultivo iniciador) e suas enzimas

liberadas após lise celular;

Bactérias contaminantes, que não são do fermento láctico,

representadas pelos organismos que sobreviveram a

pasteurização do leite ou que tiveram acesso ao leite

pasteurizado ou ao coágulo durante a fabricação do queijo que

com a morte celular liberam enzimas.

Os produtos liberados após ação dos agentes proteolíticos podem ser

usados como índices de proteólise, pois a presença deles no queijo indica ação

enzimática (FOX,1989).

Desta forma têm-se os índices de extensão de maturação, conhecida

como proteólise primária e índice de profundidade da maturação chamada de

proteólise secundária.

A proteólise primária é representada pela presença de peptídeos de

peso molecular alto/intermediário que foram produzidos devido à ação do coagulante

residual, proteases do fermento e da plasmina sobre a caseína, estes peptídeos são

solúveis em pH 4,6, denominado nitrogênio não caseico (NNC), e está relacionado

com o conteúdo de nitrogênio total (NT) (WOLFSCHOON-POMBO, 1983).

A proteólise secundária é representada pela presença de peptídeos

de baixo peso molecular e aminoácidos livres que foram produzidos devido à ação de

peptidases do fermento láctico e da microbiota contaminante sobre os peptídeos de

massa molecular alta/intermediária, acumuladas durante todo processo. Esses

peptídeos menores e os aminoácidos livres são solúveis em TCA 12%, ácido que

precipita proteínas e se diferenciam dos peptídeos maiores, que são insolúveis. Assim

o índice de profundidade de maturação é medido pela dosagem de nitrogênio dos

compostos solúveis após precipitação com TCA 12%, denominado nitrogênio não

19

proteico (NNP), e está relacionado com o conteúdo de nitrogênio total (NT)

(WOLFSCHOON-POMBO, 1983).

2.6 QUEIJO TIPO PROVOLONE

O queijo tipo provolone é um dos queijos de massa filada consumidos

no Brasil, caraterizado como um queijo semiduro, de textura fechada ou com poucas

olhaduras, cuja origem é a região sul da Itália (FAVATI; GALGANO; PACE, 2007).

O experimento foi realizado com queijo tipo provolone devido ao

crescimento do consumo no Brasil, a necessidade da indústria em melhorias na

qualidade e rendimento do produto.

De acordo com o Regulamento da Inspeção Industrial e Sanitária de

Produtos de Origem Animal - RIISPOA em seu artigo 627.

Queijo tipo "Provolone curado" é o produto obtido de leite cru ou pasteurizado, enformado ou não, não prensado e devidamente maturado pelo espaço mínimo de 2 (dois) meses. Deve apresentar: Formato tendente ao esférico ou oval; Peso: 1 a 8 kg (um a oito quilogramas); Crosta: firme, lisa, resistente, destacável, cor amarelo-parda, preferentemente revestida de parafina; Consistência: dura, não elástica, quebradiça, untada, semi-seca; Textura: fechada ou apresentando poucos olhos em formato de cabeça de alfinete; Cor: branco creme, homogênea; Odor e sabor: próprios, fortes e picantes (BRASIL, 1952).

Esse decreto foi revogado em 29 de março de 2017 pelo Decreto n°

9.013, e no seu artigo 383, confere as seguintes atribuições.

Queijo provolone é o queijo obtido por meio da coagulação do leite pasteurizado com coalho ou com outras enzimas coagulantes apropriadas, complementada ou não pela ação de bactérias lácticas específicas, com a obtenção de uma massa filada, não prensada, que pode ser fresco ou maturado. O queijo provolone fresco pode apresentar pequena quantidade de manteiga na sua massa, dando lugar à variedade denominada butirro. O queijo de que se trata o caput, pode ser defumado e devem ser atendidas as características sensoriais adquiridas nesse processo. O queijo de que se trata o caput pode ser denominado caccio-cavalo, fresco ou curado, quando apresentar formato ovalado ou piriforme (BRASIL, 2017).

As etapas do processo de fabricação e as propriedades do leite

determinam o rendimento da fabricação e a composição centesimal do queijo. A

grande maioria dos queijos coagulados enzimaticamente com uso de coalhos ou

coagulantes são maturados ou curados por um período de tempo que varia de três

semanas até dois anos ou mais. Com numerosas modificações microbiológicas,

bioquímicas, físicas e químicas a maturação é uma etapa em que o queijo é mantido

20

sob determinadas condições de temperatura e umidade relativa controladas (FOX;

MCSWEENEY, 1998; FOX et al., 2004).

2.7 TEXTURA

A textura do queijo é importante porque é essa propriedade pela qual

o consumidor primeiro identifica e julga a variedade específica (LAWRENCE;

CREAMER; GILLES, 1987).

As características de textura dos queijos são determinadas pelas

propriedades estruturais combinadas da matriz proteica e dos glóbulos de gordura

presentes no meio (LOBATO-CALLEROS et al., 2007).

Segundo Szczesniak (2002), a definição de textura evoluiu a partir

dos esforços de um número de pesquisadores que afirmaram que "a textura é a

sensoriação e manifestação funcional do estrutural, através de propriedades

mecânicas e superficiais dos alimentos detectados através dos sentidos de visão,

audição, toque e cinestésica''.

A Análise Instrumental do Perfil de Textura (TPA) é aplicada com

eficiência em muitas análises de alimentos (PONS; FISZMAN, 1996). O teste simula

a ação de compressão e corte dos dentes durante a mastigação, consistindo em

aplicações sucessivas de forças (deformantes) ao corpo de prova, sendo possível,

com base neste procedimento, gerar uma curva força versus tempo, de onde são

extraídos os parâmetros texturais como dureza, coesividade, elasticidade,

mastigabilidade e gomosidade como ilustra a Tabela 2 (SZCZESNIAK, 2002).

21

Tabela 2 (adaptada): Definições de parâmetros físicos e sensoriais

para textura.

Parâmetros Físicos Sensoriais

Dureza Força necessária para

produzir certa deformação

Força necessária para

comprimir uma substância

entre os dentes

Coesividade Medida que um material pode

ser deformado antes que ele

se rompa

Grau em que uma substância é

comprimida entre os dentes

antes que ele quebre

Elasticidade Taxa em que o material

deformado volta para sua

condição não deformada

quando a força é removida

Grau em que o produto retorna

a sua forma original

Mastigabilidade Energia necessária para

mastigar um alimento sólido

para um estado de

deglutição. Um produto de

dureza, coesão e flexibilidade

Taxa constante de aplicação de

força para reduzir a

consistência adequada para

deglutir

Gomosidade Energia necessária para

desintegrar um alimento semi

sólido, para um estado pronto

para deglutir. Um produto de

baixo grau de dureza e alto

grau de coesão

Densidade que persiste em

toda a mastigação , energia

necessária para desintegrar um

alimento semi sólido a um

estado pronto para deglutir

Fonte: SZCZESNIAK, 2002.

22

3. OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar a influência da população de psicrotróficos do leite cru

refrigerado nas características físico-químicas, sensoriais e índice de proteólise do

queijo tipo provolone ao longo da maturação.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Determinar a população de micro-organismos psicrotróficos,

termodúricos e proteolíticos em leite cru refrigerado enviado para produção do queijo

tipo provolone maturado;

Avaliação dos parâmetros físico-químicos, e índice de proteólise do

queijo tipo provolone durante 60 dias de maturação e correlacionar com a microbiota

da matéria prima utilizada.

23

REFERÊNCIAS

ABIQ. Mercado de queijos tem alto potencial de crescimento no Brasil. 2017. Disponível em: <https://www.milkpoint.com.br/cadeia-do-leite/giro-lacteo/abiq-mercado-de-queijos-tem-alto-potencial-de-crescimento-no-brasil-105515n.aspx>. Acesso em: 04 nov. 2017. ALMEIDA, I. C.; SANTOS, E. S.; CARVALHO, E. P. Pesquisa de atividade lipolítica e/ou proteolítica em estirpes psicrotróficas de Pseudomonas spp. e Bacillus spp. Hig. Aliment., v. 14, n. 71, p. 58-60, 2000. ALMEIDA, K. M. População de Pseudomonas spp. e P. fluorescens em leite cru refrigerado. 49. f. Dissertação (Mestrado em Ciência e Tecnologia de Leite e Derivados) – Universidade Norte do Paraná, Unidade Piza, Londrina, 2014. APHA - AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION. Standard Methods for examinations of dairy products. 17. ed. Washington: AOAC, 2004. ARCURI, E. F. et al. Contagem, isolamento e caracterização de bactérias psicrotróficas contaminantes de leite cru refrigerado. Ciênc. Rural, v. 38, n. 8, p. 2250-2255, 2008. ARCURI, E. F. Influência de bactérias psicrotróficas na qualidade do leite e produtos lácteos. In: ARCURI, E. F. Diagnóstico da qualidade do leite, impacto para a indústria e a questão dos resíduos de antibióticos. Juiz de Fora: Templo, 2003. p. 105-115. BARAC, M. et al. Protein profiles and total antioxidant capacity of water soluble and insoluble protein fractions of White cow cheese at different stage of ripening. Mljekarstvo, v. 66, n. 3, p. 187-197, 2016. BARACH, J. T.; ANAMS, D. M.; SPECK, M. L. Stabilization of a psychrotrophic Pseudomonas protease by calcium against thermal inactivation in milk at ultrahigh temperature. Appl. Environ. Microbiol. v. 31, n. 6, p. 875-879,1976. BRASIL. Instrução Normativa 62 de 29 de dezembro de 2011. MAPA: Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, 2011. BRASIL. Regulamento de Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de Origem Animal (RIISPOA): Decreto n. 30.691 de 1952. MAPA: Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento,1952. BRASIL. Regulamento de Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de Origem Animal (RIISPOA): Decreto n. 9.013 de 29 de março de 2017. MAPA: Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, 2017. CARDOSO, R. R. Influência da Microbiota Psicrotrófica no Rendimento de queijo Minas frescal elaborado com leite estocado sob refrigeração. Dissertação (Mestrado em Microbiologia Agrícola) - Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG, 2006.

24

CARVALHO, M. P.; VENTURINI, C. E.; GALAN, V. B. As grandes oportunidades do mercado de queijos no Brasil. 2015. Disponível em: <http://www.milkpoint.com.br/industria/radar-tecnico/mercado/as-grandes-oportunida des-do-mercado-de-queijos-no-brasil-93301n.aspx>. Acesso em: 02 fev. 2018. CHEN, L.; COOLBEAR, T.; DANIEL, R. M. Characteristics of proteinases and lipases produced by seven Bacillus sp. isolated from milk powder production lines. Int. Dairy J., v. 14, n. 6, p. 495-504, 2004. COLLINS, E. B. Heat resistant psychrotrophic microorganisms. J. Dairy Sci., v. 64, n. 1, p. 157-160, 1981. COUSIN, M. A. Presence and activity psychrotrophic microorganisms in milk and dairy products. J. Food Prot., v. 45, p. 172, 1982. COUSIN, M. A.; BRAMLEY, A. J. The microbiology of raw milk. In: ROBINSON, R.K. Dairy microbiology of milk. London: Applied Science Publishers, 1981. p. 119-163. CROMIE, S. Psychrotrophs and their enzyme residues in cheese milk. Australian J. Dairy Technol., v. 47, p. 96-100, 1992. DE JONGHE, V. et al. Toxigenic and spoilage potential aerobic spore-formers isolated from raw milk. Int. J. Food Microbiol., v. 136, n. 3, p. 318-325, 2010. EGITO, A. S.; GIRARDET, J. M.; LAGUNA, L. E.; POIRSON C.; MOLLÉ, D.; MICLO, L.; HUMBERT, G.; GALLARD, J. L. Milk-clotting activity of enzyme estracts from sunflower and albizia seeds and specific hydrolysis of bovine κ-casein. Int. Dairy J., v. 17, p. 816-825, 2007. FACCIA, M. A. et al. Detection of αs1-1 casein in Mozzarella Fiordilatte: A possible tool to reveal the use of stored curd in cheesemaking. Food Contr., v. 42, p. 101–108, 2014. FAGUNDES, C. M. et al. Presença de Pseudomonas spp. em função de diferentes etapas da ordenha com distintos manejos higiênicos e no leite refrigerado. Ciênc. Rural, v. 36, n. 2, p. 568-572, 2006. FAIRBAIRN, D. J.; LAW, B. A. Proteinases of psychrotrophic bacteria: their production, properties, effects and control. J. Dairy Res., v. 53, n. 1, p. 139-177, 1986. FAO – FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF UNITED NATIONS. Countries by commodity. Roma: FAO, 2013. FAVATI, F.; GALGANO, F.; PACE, A. M. Shelf-life evalution of portioned Provolone cheese packaged in protective atmosphere. LWT - Food Sci. Technol., v. 40, n. 3, p. 480-488, 2007. FOX, P. F. Proteolysis during cheese manufacture and ripening. J. Dairy Sci., v. 72, n. 6, p.1379-1400, 1989.

25

FOX, P. F. et al. Cheese: chemistry, physics and microbiology. v. 1. Cambridge, Massachusetts: Elsevier Academic Press, 2004. 617 p. FOX, P. F.; MCSWEENEY, P. L. H. Dairy Chemistry and Biochemistry. 1. ed. London: Thomson Science, 1998. 478 p. FRANCO, B. D. G. M.; LANDGRAF, M. Microbiologia dos Alimentos. 2. ed. São Paulo: Atheneu, 2003.182 p. FRANK, J. F. et al. Tests for groups of microorganisms. In: MARSHALL, R. T. (Ed.) Standard methods for the examination of dairy products. 16. ed. Washington: American Public Health Association, 1992. p. 271-286. FROMM, H. I.; BOOR, K. J. Characterization of pasteurizes fluid milk shelf-life attributes. J. Food Sci., v. 69, n. 8, p. 207-214, 2004. FURTADO, M. M. Principais problemas dos queijos: causas e prevenção. São Paulo: Fonte Comunicações e Editora, 2005. 200 p. GAIASCHI, A. et al. Proteolysis of αs-Casein as a marker of Grana Padano cheese ripening. J. Dairy Sci., v. 83, n. 12, p. 2733-2739, 2000. IZIDORO, T. B. et al. Effect of psychrotrophic growth on the milk fat fraction at different temperatures of storage. J. Food Sci., v. 78, n. 4, p. 615-618, 2013. JAY, J. M. Microbiologia de Alimentos. 6. ed. Porto Alegre: Artmed, 2005. 711 p. KUMARESAN, G.; ANNALVILLI, R.; SIVAKUMAR, K. Psychrotrophic spoilage of raw milk at different temperatures of storage. J. Appl. Sci. Res., v. 3, n. 11, p. 1383-1387, 2007. LAWRENCE, R. C.; CREAMER, L. K.; GILLES, J. Texture development during cheese ripening. J. Dairy Sci., v. 70, n. 8, p. 1748-1760, 1987. LEDFORD, R. A.; O’SULLIVAN, A. C.; NATH, K. R. Residual Casein Fractions in Ripened Cheese Determined by Polyacrylamide-Gel Electrophoresis. J. Dairy Sci., v. 49, n. 9, p. 1098-1101, 1966. LOBATO-CALLEROS, C.; REYES-HERNÁNDEZA, J.; BERISTAINB, C. I.; HORNELAS-URIBEC, Y.; SÁNCHEZ-GARCÍAD, J. E.; VERNON-CARTER, E. J. Microstructure and texture of white fresh cheese made with canola oil and whey protein concentrate in partial or total replacement of milk fat. Food Res. Int. v. 40, p. 529-537, 2007. MAYER, H. K.; ROCKENBAUER, C.; MLCAL, H. Evaluation of proteolysis in Parmesan cheese using electrophoresis and HPLC. Dairy Sci. Technol., v. 78, n. 4, p. 425-438, 1998. MCSWEENEY, P. L. H. et al. Contribution of the indigenous microflora to the maturation of Cheddar cheese. Int. Dairy J., v. 3, p. 613– 634, 1993.

26

MEER, R. R. et al. Psychrotrophic Bacillus spp. in fluid milk products: a review. J. Food Prot., v. 54, n. 12, p. 969-979, 1991. MITCHELL, G. E.; EWINGS, K. N. Physicochemical properties of proteinases from selected psychrotrophic bacteria. J. Dairy Res., v. 53, n. 1, p. 97-115, 1986. MU, Z.; DU, M.; BAI, Y. Purification and properties of a heat-stable enzyme of Pseudomonas fluorescens Rm12 from raw milk. Eur. Food Res. Technol., v. 228, p. 725-734, 2009. MUIR, D. D. The shelf life of dairy products: factors influencing raw and fresh products. J. Societ. Dairy Technol., v. 49, n. 1, p. 24-32, 1996. NIELSEN, S. S. Plasmin System and Microbial Proteases in Milk: Characteristics, Roles and Relationship. J. Agric. Food Chem., v. 50, n. 22, p. 6628-6624, 2002. PICARD, C. et al. Detection of proteolysis in raw milk stored at low temperature by an inhibition ELISA. J. Dairy Res., v. 61, n. 3, p. 395-404, 1994. PINTO, C. L. O.; MARTINS, L. M.; VANETTI, M. C. D. Qualidade microbiológica de leite cru refrigerado e isolamento de bactérias psicrotróficas proteolíticas. Ciênc. Tecnol. Aliment. v. 26, n. 3, p. 645-651, 2006. PONS, M.; FISZMAN, S. M. Instrumental texture profile analysis with particular reference to gelled systems. J. Texture Stud. v. 27, n. 6, p. 597-624, 1996. REIS, K. T. M. G. et al. Qualidade Microbiológica do Leite Cru e Pasteurizado produzido no Brasil: revisão. UNOPAR Cient. Ciênc. Biol. Saúde, v. 15, n. esp., p. 411-421, 2013. REZENDE-LAGO, N. C. M. et al. Occurrence of Bacillus cereus in whole milk and enterotoxigenic potential of the isolated strains. Arq. Bras. Med. Vet. Zoot., v. 59, n. 6, p. 1563-1569, 2007. RIBEIRO JÚNIOR, J. C. et al. Micro-organismos termodúricos psicrotróficos com atividade proteolítica em leite cru refrigerado. In: SUL LEITE – SIMPÓSIO SOBRE SUSTENTABILIDADE DA PECUÁRIA LEITEIRA NA REGIÃO SUL DO BRASIL, 6., 2014, Maringá. Anais... Maringá: UEM, 2014. ROLLEMA, H. S. Casein association and micelle formation. In: FOX, P. F. (Ed.) Advanced dairy chemistry: Proteins. v. 1. London: Elsevier Applied Science, 1992. p. 61-86. SANTANA, E. H. W. et al. Contaminação do leite em diferentes pontos do processo de produção: I. microrganismos aeróbios mesófilos e psicrotróficos. Sêmina: Ciênc. Agrárias, v. 22, n. 2, p. 145-154, 2001. SCHMIDT, D. G. Colloidal aspects of casein. Neth. Milk Dairy J., v. 34, p. 42-64, 1980.

27

SGARBIERI, V. C. Proteínas em alimentos protéicos: propriedades, degradações, modificações. São Paulo: Varela, 1996. 517p. SORHAUG, T.; STEPANIAK, L. Psychrotrophs and their enzymes in milk and dairy produts: quality aspects. Trend Food Sci. technol., v. 8, n. 2, p. 35-37, 1997. SZCZESNIAK, A. S. Texture is a sensory property. Food Qual. Prefer. v. 13, n. 4, p. 215-225, 2002. TAMANINI, R. Controle de qualidade do leite UHT. 2012. 285. f. Tese (Doutorado em Ciência Animal) – Universidade Estadual de Londrina, Londrina, 2012. VALLIN, V. M. et al. Melhoria da qualidade do leite a partir da implantação de boas práticas de higiene na ordenha em 19 municípios da região central do Paraná. Sêmina ciên. Agrar. v. 30, n. 1, p. 181-188, 2009. WALSTRA, P.; WOUTERS, J. T. M.; GEURTS, T. J. Dairy science and technology. 2. ed. Boca Raton: CRC Press, 2005. WOLFSCHOON-POMBO, A. F. Índices de proteólise em alguns queijos brasileiros. Boletim do Leite, v. 51, n. 661, p. 1-8, 1983.

28

4. ARTIGO

PSICROTRÓFICOS NO LEITE CRU: EFEITO NA QUALIDADE DO QUEIJO TIPO

PROVOLONE

RESUMO

A implantação da refrigeração do leite na propriedade, o transporte a granel e a ineficiência da implantação das boas práticas de ordenha favoreceram o desenvolvimento dos psicrotróficos. Essas bactérias, a partir de populações de 105 – 106 UFC/ml produzem enzimas lipolíticas e proteolíticas termo resistentes suficientes para promover alterações físicas e sensoriais que comprometem a qualidade do leite e principalmente dos derivados. Este estudo teve o objetivo avaliar a influência da população de psicrotróficos do leite cru refrigerado nas características microbiológicas, físico químicas, índice de proteólise e textura do queijo tipo provolone ao longo da maturação de 60 dias. Foram selecionados dois tipos de matéria prima para produção de 2 lotes (20 unidades/lote) de queijo tipo provolone: tratamento 1 utilizando leite cru refrigerado com populações de 3 log UFC.mL-1 de psicrotróficos/mL, e o segundo tratamento, leite com contagens de 7 log UFC.mL-1. As análises físico químicas de gordura e umidade foram realizadas pelo método de Gerber para queijos e determinação da umidade por equipamento MB25. As mudanças proteolíticas ocorridas durante a maturação do queijo foram estudadas usando eletroforese UREA-PAGE alcalina (SDS-PAGE), determinação de Kjeldahl das frações solúveis em nitrogênio total, nitrogênio não caseico (NNC) e nitrogênio não proteico (NNP), utilizando os índices de proteólise primária e secundária. A textura foi determinada por equipamento texturômetro. Os resultados da textura do queijo produzido com matéria prima com 7 log UFC.mL-1 nos parâmetros dureza, gomosidade e mastigabilidade foram influenciados pela qualidade microbiológica do leite (p<0,01). Em relação à composição centesimal, a qualidade microbiológica do leite teve influência apenas na quantidade de gordura dos queijos, observando-se uma relação linear e negativa (p<0,01). A maior população de micro-organismos psicotrópicos influenciou nas frações αs1 e β-caseína e o tempo de maturação nas frações αs1 e γ caseína. As frações αs1-I, αs1-II não se relacionaram (p>0,05) com a qualidade do leite ou com o tempo de maturação devido o estudo realizado ser feito com queijos de até 60 dias de maturação. Conclui-se que a qualidade microbiológica da matéria prima influênciou na qualidade do queijo tipo provolone aumentando a dureza, reduzindo o teor de gordura e promovendo maior degradação das frações αs1 e β-caseína. Palavras-chave: Proteólise. Termodúricos. Vida útil.

29

ABSTRACT With the implementation of milk refrigeration on the property, the transportation in bulk and the inefficiency of the implantation of the good practices of milking favored the development of the psychrotrophic. These bacteria, from populations of 105 - 106 UFC/ mL, produce thermally resistant lipolytic and proteolytic enzymes sufficient to promote physical and sensory infections that compromise milk quality, and especially of the derivatives.The objective of this study was to evaluate the influence of the psicrotrophic population of refrigerated raw milk on the microbiological, physical, chemical, proteolytic and provolone type texture characteristics during a 60 days maturation period. Two types of raw material were selected for the production of 2 lots (20 units/lot) of provolone cheese: treatment 1 using refrigerated raw milk with populations of 3 log UFC.mL-1 of psychrotrophic/mL, and the second treatment, milk with counts of 7 log UFC.mL-1. The physical and chemical analyzes of fat and moisture were performed using the Gerber method for cheeses and moisture determination by MB25 equipment. Proteolytic changes during cheese maturation were studied using alkaline UREA-PAGE electrophoresis (SDS-PAGE), Kjeldahl determination of soluble fractions in total nitrogen, non-casein nitrogen (NNC) and non-protein nitrogen (NNP), using the primary and secondary proteolytic indicators. The texture was determined by texturometer equipment. The results of the cheese texture produced with raw material with 7 log CFU.mL-1 in the parameters of hardness, guminess and chewing were influenced by the microbiological quality of the milk (p<0.01). In relation to the centesimal composition, the microbiological quality of the milk influenced only in the amount of fat in the cheeses, with a negative linear relation (p<0.01). The largest population of psychotropic microorganisms had a influence on the αs1 and β-casein and the maturation time in the fractions αs1 and γ casein. αs1-I, αs1-II , were not related (p>0.05) to milk quality or time of maturation due to the study had been carried out with cheeses with up to 60 days of maturation. It is concluded that the microbiological quality of the raw material influences the quality of the provolone type cheese product, increasing the hardness, reducing the fat content and promoting greater degradation of the αs1 and β-casein fractions.

Key words: Proteolysis. Thermodurics. Lifespan.

30

1. INTRODUÇÃO

Entre 2006 e 2013, o mercado brasileiro de queijos cresceu em

volume 9,4% ao ano, e em faturamento total 7,7% ao ano (CARVALHO; VENTURINI;

GALAN, 2015). A meta da Associação Brasileira das Indústrias de queijo (Abiq) é que

até 2020 o consumo seja de 7,5 quilos per capita, projetando para o ano de 2030

atingir a marca de 9,6 quilos de queijo por habitante, o que representa uma evolução

de 46% frente a quantidade atual de 5 quilos por pessoa em todo pais (ABIQ, 2017).

O queijo tipo provolone é um dos queijos de massa filada consumidos

no Brasil, caracterizado como um queijo semiduro, de textura fechada ou com poucas

olhaduras, cuja origem é a região sul da Itália (FAVATI; GALGANO; PACE, 2007).

O Brasil, apesar de ser um dos maiores produtores de leite do mundo

(FAO, 2013) apresenta excessiva contaminação do leite cru por micro-organismos

deteriorantes, que comprometem rapidamente a qualidade e o tempo de vida de

prateleira dos produtos lácteos (TAMANINI, 2012).

Com a implantação da refrigeração do leite na propriedade, o

transporte a granel e a ineficiência da implantação das boas práticas de ordenha

(BRASIL, 2011) favoreceu o desenvolvimento dos psicrotróficos. Essas bactérias, a

partir de populações de 105 – 106 UFC/ml produzem enzimas lipolíticas e proteolíticas

termo resistentes suficientes para promover alterações físicas e sensoriais que

comprometem a qualidade do leite e principalmente dos derivados (MU; DU; BAI,

2009; PINTO; MARTINS; VANETTI, 2006). Outro grupo de deteriorantes importante

são os microrganismos termodúricos, que são capazes de resistir à pasteurização

(FRANCO; LANDGRAF, 2003). No leite cru refrigerado, esses microrganismos

também podem ser psicrotróficos proteolíticos e/ou lipolíticos (RIBEIRO JÚNIOR et

al., 2014). Os principais microrganismos responsáveis pela deterioração e

instabilidade de queijos Mussarela são os coliformes totais e termotolerantes

(CANTONI et al., 2006) e psicrotróficos proteolíticos (BARUZZI et al., 2012). A

excessiva ação proteolítica resulta em problemas de fatiamento e perda progressiva

da elasticidade (KINDSTEDT et al., 1993). A textura do queijo é influenciada pela

composição química inicial do queijo e pelas condições de processamento utilizadas

durante a fabricação (REN et al., 2013). Um controle adequado dos parâmetros que

afetam a textura é muito importante, pois, além de influenciar diretamente na

qualidade e satisfação do consumidor, esses parâmetros podem influenciar na

31

produção desde queijos mais macios até queijos mais duros para diferentes tipos de

consumos e de mercados consumidores (PIAZZON-GOMES et al., 2010).

Desta forma, a avaliação da influência da microbiota psicrotrófica do

leite cru na qualidade microbiológica e físico química do queijo tipo provolone é de

fundamental importância para as características sensoriais, índice de proteólise e vida

de prateleira do produto. Esses dados podem ser úteis para as indústrias e órgãos

regulamentadores conhecerem e selecionaram a matéria prima a ser beneficiada para

a fabricação dos produtos lácteos e consequentemente diminuir perdas financeiras e

tecnológicas.

2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1 Obtenção da matéria prima

Os queijos tipo provolone foram produzidos em condições industriais

a partir de dois tipos de matéria prima: (tratamento 1) leite cru refrigerado com

população de psicrotróficos de 3 log UFC.mL-1, (tratamento 2) contagens de 7 log

UFC.mL-1 de psicrotrófico/mL. Para cada tratamento foram produzidas 20 unidades

de queijo de 500 gramas a partir de aproximadamente 200 litros de leite cru

refrigerado. Para cada tratamento foram produzidas 20 unidades de queijo de 500

gramas a partir de aproximadamente 200 litros de leite cru refrigerado

As análises físico químicas de rotina da matéria prima de acordo com

a IN 62/2011 (BRASIL, 2011), foram: Temperatura, Alizarol, Acidez Dornic,

Crioscopia, Densidade a 15ºC, % de Gordura, Extrato Seco Total e Desengordurado,

Proteína, Resíduos de Antibiótico, CMT, Redutase, Amido, Neutralizantes da Acidez,

Cloretos, Urina, Peróxido de Hidrogênio, Álcool Etílico, Hipoclorito, Sacarose e

Formol. Uma alíquota de cada tratamento (200 mL) foi encaminhada para análises

microbiológicas ao laboratório de Mestrado de Ciência e Tecnologia de Leite e

Derivados, Universidade Norte do Paraná. Todo o ensaio foi repetido três vezes.

32

2.2 Análises microbiológicas

Do leite cru refrigerado utilizado para produção dos queijos, foi

pesquisada a população de bactérias psicrotróficas, psicrotróficas proteolíticas,

psicrotróficas termodúricas e mesófilas. As análises microbiológicas foram realizadas

em duplicata, diluídas a partir de alíquotas de 25 mL de cada amostra em recipiente

estéril contendo 225 mL de solução salina a 0,85%, seguido de posterior

homogeneização e diluições decimais, com o mesmo diluente (BRASIL, 2003). As

diluições foram inoculadas em meio de cultura Ágar Contagem Padrão (PCA) e em

Ágar Leite a 10% (Himedia, Mumbai, Índia). Os resultados foram expressos em

Unidade Formadoras de Colônia (UFC/mL).

2.2.1 Avaliação da População de Psicrotróficos

O meio de cultura Ágar Contagem Padrão (PCA) (Himedia, Mumbai,

Índia) foi usado para a contagem total de micro-organismos psicrotróficos. Nas placas

com o meio, foram adicionados 100 µL das diluições de cada amostra seguida de

semeadura em superfície e incubação em BOD na temperatura de 21°C por 25 horas

(OLIVEIRA; PARMELLE, 1976).

2.2.2 Avaliação da População dos Psicrotróficos Proteolíticos

Foi determinada a população proteolítica, através da semeadura de

100 µL das diluições selecionadas em Ágar Leite a 10% (Himedia, Mumbai, Índia). AS

colônias positivas apresentaram ao seu redor um halo transparente, as amostras

foram incubadas a 21ºC ± 1ºC por 72 horas (LAIRD et al., 2004).

2.2.3 Avaliação da População dos Psicrotróficos Termodúricos

Para enumeração dos micro-organismos termodúricos 5 mL de cada

amostra de leite cru foram adicionadas a um tubo de ensaio estéril com tampa de

rosca para o tratamento térmico (62,8 ± 0,5ºC) em banho-maria por 30 minutos, que

foram contados a partir do momento em que um tubo controle com um termômetro

atingiu a temperatura preconizada. Imediatamente após o tratamento térmico, os

33

tubos foram imersos em banho de gelo até atingirem a temperatura de 10ºC (FRANK;

YOUSSEF, 2004). Para pesquisa de psicrotróficos termodúricos, foi semeado 100 µL

das diluições selecionadas em PCA a 21°C por 25 horas (OLIVEIRA; PARMELLE,

1976)

2.2.4 Avaliação da População dos Mesófilos

Para enumeração dos micro-organismos mesófilos foi utilizado

(PetrifilmTM AC) incubando as amostras a 35° C/48 h

2.3 Produção de queijo tipo provolone

A partir da matéria prima com diferentes populações de psicrotróficos,

foram utilizados 200 litros de leite padrozinado (3% gordura ± 0,2%) para cada

tratamento, clarificado e pasteurizado a 72°C-75°C/15 a 20 segundos, o leite foi

posteriormente resfriado a 33-35°C e enviado para os tanques de fabricação de queijo.

Foi adicionado ao leite os seguintes ingredientes: cultura

Streptococcus thermophilus STO86 (Sacco, Campinas, Brasil) na proporção de 5

gramas para 2 litros de leite pasteurizado, aquecido a 35°C, cloreto de cálcio (30

mL/100 litros) diluído em 2 litros de água, coagulante líquido (5 mL/100 litros) e corante

natural urucum (1 mL/100 litros de leite). A coalhada foi cortada, dessorada e após

atingir o ponto de filagem, medido por pHmetro, pH: 4,9, a massa foi picada, filada,

moldada em equipamento filadeira e moldadeira (Medinox, Medianeira, Brasil), por

vapor indireto com água a 65° a 70°C e moldagem em blocos cilíndricos cônicos. As

peças (500 gramas) foram enformadas manualmente e levadas para a câmara fria (5-

7°C) de salga (22%), tratadas com clorexidina por imersão durante 8 horas. Depois

da salga, as peças foram penduradas para secar em câmara fria (4°C) com umidade

de 60% e embaladas em redes plásticas por 24 horas. A defumação foi realizada com

fumaça de cedrilho de eucalipto por 2 horas, com temperatura máxima de 50°C. Após

a defumação as peças foram lavadas com água potável, as redes plásticas foram

retiradas e as peças embaladas em sacos plásticos termoencolhíveis e mantidas a

4°C em câmara de estocagem até o momento de sua análise (Anexo I).

34

2.4 Análises físico químicas e microbiológicas do queijo

As análises físico-químicas foram realizadas em triplicata após a

produção (tempo zero), com 30 e 60 dias de maturação. Para determinação do teor

de gordura utilizou-se o método de Gerber para queijos (BRASIL, 2006) e para

umidade, o equipamento termogravimétrico MB25 (OHAUS, NJ, USA), conforme

orientação do fabricante.

Para confirmação da inocuidade dos queijos, foram pesquisados

coliformes totais e Escherichia coli em duplicata com 60 dias de maturação. As

amostras foram inoculadas em placas PetrifilmTM EC (3M, MINNESOTA, USA)

incubando as amostras a 35°C/48 horas com os resultados de contagem expressos

em UFC/g da amostra.

2.5 Proteólise

A proteólise dos queijos foi monitorada no tempo zero após a

produção; com 30 e 60 dias de maturação, através da determinação dos teores de

nitrogênio total, pelo método micro Kjeldahl (AOAC, 1995). O NNP foi avaliado a partir

do filtrado após precipitação do queijo pela adição de ácido tricloroacético (TCA 24 %)

e o NNC foi avaliado a partir do filtrado após precipitação do queijo ao ponto isoelétrico

da caseína (pH 4,6) com utilização do método macro Kjeldahl (AOAC, 1995).

O índice de proteólise primária foi determinado a partir da relação

NNC (Nitrogênio não caseico) /NT (Nitrogênio Total) e o de proteólise secundária pelo

NNP (Nitrogênio não proteico) /NT.

Foram utilizadas as seguintes equações:

1) %NNC = 1,4007 x (Va - Vb) x N x fc x 2 x 0,994 / pa

Onde:

Va= volume de titulante gasto p/ titular a amostra

Vb= volume de titulante gasto p/ titular o branco

N = normalidade do HCl fc = fator de correção do HCl utilizado

pa= peso de amostra, em gramas

0,994 = correção do volume de precipitado, considerando leite

integral.

Proteólise primária = NNC/NT x 100

35

2) %NNP = V.N.Fc. 1,4008x20 / pa. Pb

Onde:

V, fc, N = HCl utilizado na titulação.

pa e pb = peso das alíquotas, em g.

20 = diluição

Proteólise secundária = NNP/NT x 100

As análises foram realizadas em triplicata, de acordo com Bynum e

Barbano (1985).

2.6 Análise de perfil de textura

O perfil de textura foi obtido por teste de dupla compressão das

amostras de queijo, processado em analisador de textura, Texture Analyser CT3

(Brookfield Engineering Labs, Middleboro, EUA) e probe cilíndrico com largura (25

mm) comprimento (40 mm) e profundidade (10 mm). As condições utilizadas nos

ensaios foram: Análise do Perfil de Textura (TPA); velocidade de pré teste, teste e pós

teste de 2, 1 ,4,5 mm/s, respectivamente. Cada peça foi cortada em cubos com

dimensões de 1,5 x 2,0 x 2,5 (altura x largura x comprimento) e avaliou-se em

quintuplicata. Os parâmetros determinados foram dureza, coesividade, gomosidade,

elasticidade e mastigabilidade. Os dados foram coletados através de software Texture

CT V1 4 BUILD 17 (Brookfield Engineering Labs).

2.7 Tratamento das amostras para Aplicação em Eletroforese em queijo pelo método

Urea – Page Alcalino, adaptado de CREAMER (1991)

As amostras de queijo ralado (0,20 g) foram pesadas, adicionados

10,0 mL de solução tampão, pH 8,4, homogeneizados e centrifugadas por 10 minutos

a 10.000 G. Em casos de queijos com elevado teor de gordura, recomenda-se aquecer

o tubo em banho-maria 35 – 40ºC por 3 minutos antes da centrifugação (LEDFORD

et al., 1966). Foi coletado 1000 μl da fase líquida, adicionado 60 μl de solução de azul

de bromofenol 0,1% e 50 μl de 2-mercaptoetanol. Após a desnaturação, 10 μL foram

pipetados individualmente com aplicação no gel de acrilamida conforme instruções do

fabricante. Procedeu-se, então, à migração molecular pelo método UREA-PAGE

adaptado de CREAMER (1991). Os géis de empilhamento (pH 8,8) e de separação

36

(pH 8,8) foram preparados com concentrações de 4% e 12% de acrilamida,

respectivamente. Estabeleceram-se ainda, as medidas de 5,5 cm de altura para o gel

de separação por 0,1 cm de espessura. Com o intuito de se obter melhor

polimerização e nivelamento, adicionou-se 500 μL de água ultra-pura sobre o gel de

separação. Ambos os géis obtiveram polimerização completa quando incubados a 37

ºC por 45 min. Além das amostras, 10 μL de um padrão para proteínas (Precision Plus

Protein Unstained, Bio-Rad), cujos valores conhecidos de pesos moleculares (250,

150, 100, 75, 50, 37, 25, 20, 15 e 10 kDa), foram pipetados em ambas as 24

extremidades de cada gel. Para delimitar precisamente o peso molecular da α-LA e

da ASB, utilizou-se a diluição destas proteínas comerciais (Sigma-Altrich).

Em cuba vertical para eletroforese e fonte de tensão PowerPacTM

Basic Power Supply (Bio-Rad laboratories inc., USA), procedeu-se a migração das

moléculas em tampão para migração (pH 8,8) a tensão de 150 Volts (V) e corrente de

20 MiliAmperes (mA), compreendendo o tempo médio de migração de 100 minutos.

Com o término da migração molecular, o gel foi enxaguado em água

ultra-pura e imerso em solução corante: Comassie Brilliant Blue R-250, Álcool Metílico

40% (v/v), Ácido Ácético 7% (v/v) e água ultra-pura. A etapa de coloração foi feita sob

agitação (45 rpm) pelo tempo de 4h. Após a coloração, o gel foi enxaguado com água

mili-Q e imerso em solução descorante contendo Álcool Metílico 40% (v/v), Ácido

Acético 7% (v/v) e água ultra-pura e submetido à 60 rpm por 30 min. A etapa de

descoloração foi concluída transferindo-se o gel para outra solução contendo Álcool

Metílico 5% (v/v), Ácido Acético 7% (v/v) e água mili-Q pelo período de 12h. Os géis

eram armazenados nessa mesma solução, adicionada de 1 % de glicerol. A

fotodocumentação dos géis foi feita com equipamento Transiluminator (Loccus

biotecnologia) e o processamento das imagens foi realizado pelo software L-PIX

IMAGE HE Release 1.4 (Loccus biotecnologia). A avaliação qualitativa foi determinada

com a utilização do software BioNumerics 7.5 (APLIED MATHS, Belgium). A

quantificação das frações proteicas foi processada pelo software LabImage 1D 4.1

(Kapeplan).

2.8 Cálculo de sólidos totais

O cálculo de sólidos totais dos queijos utilizou a metodologia descrita

por Furtado (2005), de acordo com a seguinte equação:

37

R (g ST/L) = P x ST x 100 V

Onde:

R: rendimento

L: litros de leite

P: quilos de queijos obtidos

ST: porcentagem de extrato seco total dos queijos

V: volume do leite utilizado

Extrato seco total= (100 - Umidade)

2.9 Cálculo de rentabilidade

O rendimento dos queijos foi calculado utilizando a fórmula:

R = L

P

Onde:

R: rendimento

L: litros de leite

P: quilos de queijos obtidos

2.10 Análise estatística

Para avaliar a influência da qualidade do leite sobre a textura do queijo

provolone, os resultados foram avaliados por regressão múltipla em um desenho

experimental 22 em função da dureza, da coesividade, da elasticidade, da gomosidade

e da mastigabilidade. Os fatores independentes foram a carga microbiológica, com

dois níveis (3 log UFC.mL-1 e 7 log UFC.mL-1); e o tempo de maturação, com dois

níveis (30 e 60 dias). Como as análises foram feitas em quintuplicata, o desenho

totalizou 120 corridas para cada variável da textura.

Para avaliar a influência da qualidade do leite sobre a composição

centesimal do queijo provolone e proteólise, os resultados também foram avaliados

por regressão múltipla, porém em um desenho experimental 2x3 em função da

umidade, porcentagem de gordura, nitrogênio total, proteólise primária e secundária.

Os fatores independentes foram a carga microbiológica, com (3 log UFC.mL-1 e 7 log

38

UFC.mL-1); e o tempo de maturação, com três níveis (0, 30 e 60 dias). Como as

análises foram feitas em triplicata, o desenho totalizou 108 corridas para cada variável

centesimal.

Em ambos delineamentos o efeito dos fatores foi avaliado por ANOVA

com significância de 5% no programa Statistica 13.0 (Statsoft).

Para avaliar a influência da qualidade do leite sobre as frações

proteicas do queijo tipo provolone os resultados foram avaliados por regressão

múltipla em um desenho experimental 2x3 em função das porcentagens das gama-

caseínas, β -caseínas, αs1-caseínas, αs1-caseínas I e αs1-caseínas II. Os fatores

independentes foram a carga microbiológica de micro-organismos psicrotróficos, com

dois níveis (3 log UFC.mL-1 e 7 log UFC.mL-1); e o tempo de maturação, com três

níveis (0, 30 e 60 dias). O desenho totalizou 18 corridas para cada fração proteica

avaliada.

O efeito dos fatores foi avaliado por ANOVA com significância de 5%

no programa Statistica 13.0 (Statsoft).

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados das análises físico químicas e das contagens de micro-

organismos indicadores de qualidade pesquisados nas amostras de leite enviadas

para produção dos queijos, obtidos no tratamento 1 e 2, são apresentados na Tabela

1 e 2.

39

Tabela 1: Resultados das análises físico químicas das amostras de

leite enviadas para produção de queijo tipo provolone das três produções

(agosto/setembro/outubro) 2017.

Análises Físico Químicas Média*

Tratamento 1 Tratamento 2

Temperatura C° 4°C 4°C

Allizarol 78 º GL Estável Estável

Acidez Dornic g, ácido lático /100 ml 15°D 15°D

Índice Crioscópico Hortvet (ºH) 0,535 0,537

Densidade relativa a 15/15ºC g/mL 1,3130 1,3220

Gordura(%) 3,42 3,69

Extrato Seco Total(%) 12,08 12,62

Extrato Seco Des.g/100 g 8,66 8,93

Proteína g/100 g 3,41 3,51

Resíduos de antibiótico Negativo Negativo

CMT Negativo Negativo

Redutase 240 minutos 30 minutos

Amido Negativo Negativo

Neutralizantes da Acidez Negativo Negativo

Cloretos Negativo Negativo

Urina Negativo Negativo

Peróxido de Hidrogênio Negativo Negativo

Álcool Etílico Negativo Negativo

Hipoclorito Negativo Negativo

Sacarose Negativo Negativo

Formol Negativo Negativo

*Média 3 produções.

40

Tabela 2: Média (log) de micro-organismos indicadores de qualidade

em amostras de leite enviadas para produção de queijo tipo provolone das três

produções (agosto/setembro/outubro) 2017.

Micro-organismos Média* (log UFC.mL-1)

Tratamento 1 Tratamento 2

Psicrotróficos 3,12 7,16 Psicrotróficos Proteolíticos 2,73 6,95 PsicrotróficosTermodúricos 4,00 4,50 Mesófilos 3,38 6,78

*Média 3 produções.

O leite utilizado no tratamento 1 para produção de queijo provolone

apresentou qualidade satisfatória, diferentemente do leite utilizado no tratamento 2

com contagens de 7 log UFC.mL-1 para psicrotróficos e psicrotróficos proteolíticos. O

número de psicrotróficos superou o de mesófilos, sendo os psicrotróficos os

indicadores de contaminação no leite cru refrigerado. Deve-se evitar a incidência e

incorporação deste grupo de micro-organismos no leite cru, pois a refrigeração a 4 °C

não inibe o crescimento, havendo necessidade da implementação das boas práticas

em todo o processo produtivo (SANTOS et al., 2013).

Quanto ao perfil de textura do queijo produzido com matéria prima

com 7 log UFC.mL-1, a dureza, a gomosidade e a mastigabilidade foram influenciadas

pela qualidade microbiológica do leite (p<0,01). Dessa forma, notou-se uma relação

linear e positiva entre a carga microbiológica e essas três variáveis, ou seja, quanto

maior a quantidade de micro-organismos, maiores os valores de dureza, gomosidade

e mastigabilidade.

Apesar da qualidade do leite ser suficiente por si só para influenciar

esses parâmetros de textura, também foi detectado interação (p<0,02) entre a

qualidade do leite e o tempo de maturação (Figura 2). Dessa forma aos 60 dias de

maturação as alterações na textura foram mais intensas nos queijos feitos com leite

com maior população de psicrotróficos (7 log UFC.mL-1) (Tabela 2). Porém, a

maturação sozinha não foi suficiente para aumentar os valores de dureza,

gomosidade e de mastigabilidade.

Mais da metade das variações na gomosidade foram associadas à

qualidade microbiológica do leite e à maturação (R2=0,51) e essas duas variáveis

juntas também foram responsáveis por cerca de 30% nas variações da dureza

(R2=0,37) e da mastigabilidade (R2=0,28) (Anexo II). As diferenças na textura podem

41

ser encontradas entre queijos de um mesmo lote, particularmente em queijos moles.

A textura de queijos, embora seja reconhecida como um atributo sensorial que exerce

influência sobre a aceitação pelos consumidores, não tem sido extensivamente

estudada. Isto se deve ao fato dos queijos apresentarem-se como um produto

heterogêneo, que difere na composição, condições empregadas na fabricação,

armazenamento, características sensoriais e atributos físicos (ADDA; GRIPON;

VASSAL, 1982; MACFIE, 1990).

Os queijos do tratamento 1, apresentaram no parâmetro dureza, uma

média de 27,31% na maturação de 30 dias e 25,32% com 60 dias, em decorrência do

enfraquecimento da matriz proteica do queijo pela ação do coagulante residual e de

enzimas de origem microbiana, provocando aumento da proteólise (AYYASH; SHAH,

2011). Os queijos do tratamento 2, apresentaram no parâmetro dureza alteração

significativa com médias 37,8% na maturação de 30 dias e 44,93% com 60 dias

(Anexo II). Segundo Do Valle et al. (2004) em seus estudos com queijo mussarela, no

teste de perfil de textura, observou que à medida que houve diminuição do teor de

gordura, houve um aumento no parâmetro de dureza. Esta evolução na diminuição da

gordura pode ser relacionada à proliferação das bactérias psicrotróficas lipolíticas, as

quais produzem enzimas lipolíticas responsáveis em hidrolisar triacilgliceróis com

liberação de ácidos graxos livres e glicerol (HOLLAND, et al. 2005).

A gomosidade, foi alterada no tratamento 2 ao longo de 60 dias, com

médias de 23,9% para 30 dias de maturação e 29,01% com 60 dias de maturação,

assim como a mastigabilidade. Ambas estão relacionadas com a dureza, Do Valle et

al. (2004) e Banks (2004), citam que a coesividade, gomosidade e mastigabilidade no

queijo mussarela, aumentaram em função da diminuição da gordura e o queijo

cheddar com baixo teor de gordura foi percebido como sendo seco, excessivamente

firme e difícil de mastigar.

A coesividade e a elasticidade não tiveram influência da população

dos micro-organismos e do tempo de maturação. Nos dias 30 e 60, os valores não

diferiram significativamente entre os tratamentos. Furtado (2016) estudando o queijo

mussarela, calcula que o ponto ideal de proteólise, cerca de 8% a 10% de nitrogênio

total do queijo estivesse sob forma de nitrogênio solúvel em solução citrada com pH

4,6; é fundamental para manter as propriedades funcionais do queijo, como

elasticidade e derretibilidade, valores, acima de 20% de nitrogênio solúvel agravariam

os problemas de elasticidade e separação de gordura. No presente estudo os valores

42

encontrados nos 2 tratamentos, foram de até 10% de nitrogênio solúvel em solução

citrada com pH 4,6, confirmando o não comprometimento da elasticidade no queijo.

O queijo provolone não mostrou redução significativa (p<0,05) na

elasticidade com o passar do tempo, e com a carga microbiológica nos dois

tratamentos.

Figura 1: Dureza, gomosidade e mastigabilidade de queijo provolone

em função da qualidade microbiológica do leite e do tempo de maturação.

Em relação à composição centesimal, a qualidade microbiológica do

leite teve influência apenas na quantidade de gordura dos queijos, observando-se uma

relação linear e negativa (p<0,01). Dessa forma, queijos fabricados com matéria prima

com 7 log UFC.mL-1 leite foram associados a menores porcentagens de gordura.

Apesar dessa condição ser significativa, a força de associação entre essas variáveis

foi considerada fraca (R2=0,18), sendo que menos de 20% das variações ocorridas na

gordura foram associadas à qualidade do leite durante a maturação. Em média,

queijos feitos com leite com alta carga microbiológica tiveram 2% menos de gordura.

Stofer e Hicks (1983) e Cromie (1992) relatam que o rendimento de queijos pode ser

reduzido em função da atividade de enzimas lipolíticas sobre os triacilglicerídeos com

consequente liberação de ácidos graxos no soro e aumento das perdas de gorduras.

Hicks et al. (1982) concluíram que a redução no rendimento resultou tanto na

degradação lipolítica como proteolítica do leite cru e estas corresponderam a 45% e

55% da perda de matéria seca, respectivamente.

A rentabilidade dos queijos produzidos com matéria prima com 3 log

UFC.mL-1 e 7 log UFC.mL-1 foi de 9,66 litros e 9,96 litros de leite para cada kg de

queijo. De acordo com Furtado (2016), a rentabilidade é muito difícil de ser medida

43

com precisão, depende de muitos fatores como gordura, caseína, tipo de coalho, teor

de umidade, processo de filagem utilizado na indústria e determinação do peso exato

dos queijos antes da salga, cita que um rendimento na faixa de 9,5 a 10,5 litros de

leite por kg de queijo deve ser considerado normal.

Por sua vez, a maturação por si só influenciou a umidade (p<0,01), a

porcentagem de gordura (p=0,01), o nitrogênio total (p<0,01) e a proteólise secundária

(p<0,01) (Anexo III).

Ao analisar a proteólise primária e secundária, a população de

psicrotróficos não influenciou os índices de nitrogênio não proteico (NNP) e nitrogênio

não caseico (NNC). O índice de extensão proteolítica (IEP), proteólise primária está

relacionado com as proteinases naturais do leite e do agente coagulante, que

degradam as proteínas em peptídeos de alto peso molecular, grandes micelas de

caseína são clivadas em peptídeos, solubilizando a caseína. Quanto maior a

proteólise primária, mais peptídeos solúveis serão liberados da caseína, sendo para-

κ-caseína e glicomacropeptideos os mais importantes (FOX, 1989).

No decorrer da maturação a média do índice de profundidade

proteolítica (IPP), proteólise secundária teve o nível mais elevado estatisticamente no

último dia de análise, pelo acúmulo de aminoácidos provenientes da hidrólise de

peptídeos pelas proteases de origem microbiana (FURTADO, 2005) (Anexo III)

(Figura 2).

Figura 2: Valores médios e desvio padrão da composição centesimal

de queijos provolones aos 0, 30 e 60 dias de maturação.

44

Porém, ao analisarmos o perfil eletroforético, a maior população de

micro-organismos influenciou estatisticamente nas frações αs1 e β-caseína e o tempo

de maturação nas frações αs1 e γ- caseínas.

A fração αs1 caseína foi influenciada tanto pela qualidade

microbiológica do leite quanto pelo tempo de maturação (p<0,01). Esses dois fatores

não dependem um do outro para exercerem seus efeitos nas quantidades de αs1-

caseínas, observando-se uma relação linear para ambos. Porém, positiva para a

qualidade do leite e negativa para o tempo de maturação. Assim, quanto maior as

contagens microbiológicas do leite, maiores as quantidades de αs1-caseínas;

enquanto maior o tempo de maturação, menor a quantidade dessa fração proteica

(Figura 3c). Segundo Mayer; Rockembauer; Mlcak (1998), αs1-caseína é a principal

proteína a sofrer proteólise nos primeiros estágios de maturação decorrentes da

adição das culturas lácteas, formando as frações de αs1-I-caseína e αs1-II-caseína.

Barac et al. (2016), registraram frações de αs -caseínas (αs1- e αs2-caseínas) em

queijos frescos e curados com uma única banda, enquanto β-caseínas foi detectada

com duas bandas sobrepostas. Durante 50 dias de maturação, as αs-caseínas

residuais foram degradadas extensivamente até 15,42% do conteúdo inicial.

Simultaneamente, β-caseínas teve uma degradação progressiva muito mais lenta

(BARAC et al., 2016).

A quantidade de β- caseína foi influenciada (p<0,05) pela qualidade

microbiológica do leite, observando-se uma relação linear e negativa

independentemente do tempo de maturação do queijo provolone (Figura 3b). As

caseínas β representam 30-35% do total das caseínas e é constituída de um membro

principal com no mínimo sete variantes genéticas (SGARBIERI, 2005). Alguns

trabalhos citam que a proteólise primária é medida pelo aparecimento das frações αs1

e β-caseinas, respectivamente, a cadeia de αs1-caseínas tem muitas regiões

susceptíveis à ação da quimosina (CREAMER; RICHARDSON, 1974). Ledford et al.

(1966), indicaram diferenças definidas no padrão eletroforético nos componentes de

caseína na análise eletroforética na fabricação do queijo Cheddar. Foi observado o

desaparecimento quase por completo da fração αs1-caseína após 55 dias de

maturação e a β-caseína aparece em grande parte afetada, αs1 –caseína é o maior

componente encontado no leite de vaca e as mudança de textura do queijo, ocorre

devido a degradação do restante da αs1- caseinas , durante um grande período de

maturação (CREAMER; OLSON,1982).

45

No estudo realizado a γ- caseína foi influenciada (p<0,05) pelo tempo

de maturação, observando-se uma relação linear e positiva independentemente da

qualidade microbiológica do leite utilizado, quanto maior o tempo de maturação, maior

a quantidade dessa fração proteica (Figura 3a).

As γ-caseínas são os principais produtos da hidrólise da β-caseína

pela ação da protease plasmina, naturalmente contida no leite integral, ou seja, haverá

um decréscimo na intensidade da banda de β-caseína e consequente aumento nas

bandas de γ-caseínas, conforme se aumenta o período de maturação (MAYER;

ROCKEMBAUER, 1998).

As frações αs1-I, e αs1-II, não se relacionaram (p>0,05) com a

qualidade do leite ou com o tempo de maturação devido o estudo realizado ser feito

com queijos de até 60 dias de maturação.

Figura 3: Frações proteicas de queijo provolone em função da

qualidade microbiológica do leite e do tempo de maturação.

Para a produção dos queijos utilizou-se a cultura Streptococcus

thermophilus, que apresenta baixa atividade proteolítica (HASSAN; FRANK, 2001),

com baixa degradação da matriz caseínica, não influenciando na proteólise observada

nesse estudo. Segundo Furtado (2016) é importante utilizar um bom coagulante e

controlar bem os parâmetros de temperatura na filagem, para que na massa fiquem

resíduos suficientes de suas enzimas, que atuam na necessária degradação da

massa e melhoria das propriedades funcionais do queijo. Silva et al. (2006) avaliaram

o efeito da adição de Streptococcus thermophilus como cultura adjunta e verificaram

que os índices de profundidade e extensão da maturação foram menores,

confirmando que as alterações do queijo foram pequenas durante o armazenamento

46

quando comparadas com os demais estudos, mantendo as características desejáveis

por maior período de maturação.

Os queijos produzidos foram analisados quanto a população de

coliformes totais e termo tolerantes, com resultados < 10 UFC/g, atendendo aos

parâmetros determinados pela Portaria n° 146 do MAPA (BRASIL, 1996).

Figura 4: Eletroforese UREA-PAGE do queijo tipo provolone em

função da qualidade microbiológica do leite e do tempo de maturação.

Fonte: Dados da pesquisa (2017). *T1 (Tratamento 1): 0, 30 e 60 dias de maturação, **T2 (Tratamento 2): 0, 30 e 60 dias de maturação.

4. CONCLUSÃO

A maior população dos micro-organismos psicrotróficos contribuiu

para o aumento do parâmetro da dureza dos queijos, reduziu o teor de gordura e

aumentou a degradação das frações αs1 e β-caseína

O tempo de maturação foi associado a menor degradação da fração

αs1-caseína e maior degradação da fração γ-caseína, influenciou a umidade, a

porcentagem de gordura, o nitrogênio total e a proteólise secundária.

A qualidade microbiológica da matéria prima influencia na qualidade

do produto queijo tipo provolone.

47

REFERÊNCIAS

ABIQ. Mercado de queijos tem alto potencial de crescimento no Brasil. 2017. Disponível em: <https://www.milkpoint.com.br/cadeia-do-leite/giro-lacteo/abiq-merca do-de-queijos-tem-alto-potencial-de-crescimento-no-brasil-105515n.aspx>. Acesso em: 04 nov. 2017. ADDA, J.; GRIPON, J. C.; VASSAL, L. The chemistry of flavour and texture generation in cheese. Food Chem., v. 9, p. 115-129, 1982. AOAC - ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official method of analysis. 15. ed. Washington: AOAC, 1995. AYYASH, M. M., SHAH, N. P. The effect of substitution of NaCl with KCl on chemical composition and functional properties of low-moisture Mozzarella cheese. J. Dairy Sci., v. 94, p. 3761–3768, 2011. BANKS, J. M. The technology of low-fat cheese manufacture. Int. J. Dairy Technol., v. 57, p. 199–207, 2004. BARAC, M. et al. Protein profiles and total antioxidant capacity of water soluble and insoluble protein fractions of White cow cheese at different stage of ripening. Mljekarstvo, v. 66, n. 3, p.187-197, 2016. BARUZZI, F.; LAGONIGRO, R.; QUINTIERI, L.; MOREA, M; CAPUTO, L. Occurrence of non-lactic acid bacteria populations involved in protein hydrolysis of coldstored high moisture Mozzarella cheese. Food Microbiology, v. 30, p. 37–44, 2012. BRASIL. Instrução Normativa 62 de 26 de agosto de 2003: Métodos analíticos oficiais para análises microbiológicas para controle de produtos de origem animal e água. MAPA: Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, 2003. BRASIL. Instrução Normativa 68 de 12 de dezembro de 2006: Métodos analíticos oficiais físico-químicos para controle de leite e produtos lácteos. MAPA: Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, 2006. BRASIL. Instrução Normativa 62 de 29 de dezembro de 2011. MAPA: Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, 2011. BRASIL. Portaria n. 146 de 07 de março de 1996: Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade do Queijo. MAPA: Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, 1996. BYNUM, D. G.; BARBANO, D. M. Whole milk reverse osmosis retentates for cheddar cheese manufacturing: chemical changes during ageing. J. Dairy Sci., v. 68, n. 1, p. 1-10, 1985. CANTONI, C.; SONCINI, G.; MILESI, S.; COCOLIN, L.; IACUMIN, L.; COMI, G. Colorazioni anomale e rigonfiamento di formaggi fusi e mozzarelle. Ind Aliment - Italy,

48

v. 45, p. 276–281, 2006. CARVALHO, M. P.; VENTURINI, C. E.; GALAN, V. B. As grandes oportunidades do mercado de queijos no Brasil, 2015. Disponível em: http://www.milkpoint.com. br/industria/radar-tecnico/mercado/as-grandes-oportunidades-do-mercado-de-queijos-no-brasil-93301n.aspx. Acesso em: 02 fev. 2018. CREAMER, L. K. Electrophoresis of cheese. Chemical methods for evaluating proteolysis in cheese maturation. Bull. Int. Dairy Fed., v. 261, p. 14-28, 1991. CREAMER, L. K; OLSON, N. F. Rheological evaluation of maturing Cheddar cheese. J. Food Sci., v. 47, n. 2, p. 631-636, 1982. CREAMER, L. K.; RICHARDSON, B. C. ldentification of the primary degradation product of αs1-caseina in Cheddar cheese. N. Z. J. Dairy Sci. Technol., v. 9, p. 9-13. 1974. CROMIE, S. Psychrotrophs and their enzyme residues in cheese milk. Aust. J. Dairy Technol., v. 47, p. 96-100, 1992. DO VALLE, J. L. E. et al. Influência do teor de gordura nas propriedades funcionais do queijo tipo mozarela. Ciênc. Tecnol. Aliment, v. 24, n. 4, p. 669-673, 2004. FAO – FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF UNITED NATIONS. Countries by commodity. Roma: FAO, 2013. FAVATI, F.; GALGANO, F.; PACE, A. M. Shelf-life evalution of portioned Provolone cheese packaged in protective atmosphere. LWT – Food Sci. Technol., v. 40, n. 3, p. 480-488, 2007. FOX, P. F. Proteolysis during cheese manufacture and ripening. J. Dairy Sci., v. 72, n. 6, p.1379-1400, 1989. FRANCO, B. D. G. M.; LANDGRAF, M. Microbiologia dos Alimentos. 2. ed. São Paulo: Atheneu, 2003.182p. FRANK, J.F.; YOUSEF, A.E. Test for groups of microrganisms. In: WEHR, H.M.; FRANK, J.K (Eds.) Standard Methods for the Examination of Dairy Products. 17 ed. Washington: APHA, 2004. p.239-242. FURTADO, M. M. Mussarela: fabricação & funcionalidade. São Paulo: Fonte Setembro Editora, 2016. 247p. FURTADO, M. M. Principais problemas dos queijos: causas e prevenção. São Paulo: Fonte Comunicações e Editora, 2005. 200p. HASSAN, A. N.; FRANK, J. F. Starter cultures and their use. In: MARTH, E. H.; STEELE, J. L. Applied Dairy Microbiology. 2 ed. New York: Marcel Decker, 2001.

49

HICKS, C. L. et al. Psychrotrophic bacteria reduce cheese yield. J. Food Prot., v. 45, n. 4, p. 331-334, 1982. HOLLAND, R. et al. Esterases of lactic acid bactéria and cheese flavour: milk fat hidrolysis, alcoholysis and esterification. Int. Dairy J., v. 15, n. 6-9, p. 711-718, 2005. KINDSTEDT, P. S. Effect of manufacturing factors, composition and proteolysis on the functional characteristics of mozzarella cheese. Crit. Rev. Food Sci. Nutr., v. 33, p.167-187, 1993. LAIRD, D. T.; et al. Microbiological Count Methods. In: WEHR, H.M.; FRANK, J.F. (ed.) Standard Methods for the Examination of Dairy Products. 17 ed., Washington, D.C.: American Public Health Association, 2004. p.153-186. LEDFORD, R. A. et al. Residual Casein Fractions in Ripened Cheese Determined by Polyacrylamide-Gel Electrophoresis. J. Dairy Sci., v. 49, n. 9, p. 1098-1101, 1966. MACFIE, H. J. H. Assessment of the sensory properties of food. Nutr. Rev., v. 48, n. 2, p. 87-93, 1990. MAYER, H. K.; ROCKENBAUER, C.; MLCAK, H.; MAYER, H. K. Original article Evaluation of proteolysis in Parmesan cheese using electrophoresis and HPLC*. Lait, v. 78, p. 425–438, 1998. MU, Z.; DU, M.; BAI, Y. Purification and properties of a heat-stable enzyme of Pseudomonas fluorescens Rm12 from raw milk. Eur. Food Res. Technol., v. 228, p. 725-734, 2009. OLIVEIRA, J. S.; PARMELEE, C. E. Rapid enumeration of psychrothrophic bacteria in raw and pasteurized milk. J. Milk Food Tecnol., v. 39, p. 269-272, 1976. PIAZZON-GOMES, J.; PRUDÊNCIO, S. H.; SILVA, R. S. S. F. Queijo tipo minas frescal com derivados de soja: características físicas, químicas e sensoriais. Ciênc. Tecnol. Aliment., v. 30, supl.1, p. 77-85, 2010. PINTO, C. L. O.; MARTINS, L. M.; VANETTI, M. C. D. Qualidade microbiológica de leite cru refrigerado e isolamento de bactérias psicrotróficas proteolíticas. Ciênc. Tecnol. Aliment., v. 26, n. 3, p. 645-651, 2006. REN, D.; CHEN, B.; CHEN, Y.; MIAO, S.; LIU, J. The effects of k-casein polymorphism on the texture and functional properties of mozzarella cheese. Int. Dairy J., v. 31, p. 65-69, 2013. RIBEIRO JÚNIOR, J.C.; et al. Micro-organismos termodúricos psicrotróficos com atividade proteolítica em leite cru refrigerado. In: SUL LEITE – SIMPÓSIO SOBRE SUSTENTABILIDADE DA PECUÁRIA LEITEIRA NA REGIÃO SUL DO BRASIL, 6., 2014, Maringá. Anais... Maringá: UEM, 2014.

50

SANTOS, A. S.; PIRES, C. V.; SANTOS, J. M.; COSTA SOBRINHO, P. S. Growth of psychrotrophic microorganisms in refrigerated raw milk. Alim. Nutr. = Braz. J. Food Nutr., v. 24, n. 3, p. 297-300, 2013. SGARBIERI, V C. Revisão: Propriedades estruturais e físico-químicas das proteínas do leite. Braz. J. Food Tecnol., v. 8, n. 1, p.43-56, 2005. SILVA, C. R. B., NABUCO, A. C., MORETTI B. R., PENNA, A. L. B. Efeito da adição de Streptococcus thermophilus como cultura adjunta na maturação e caracterização físico-química e sensorial de queijo Prato. Rev. Inst. Adolfo Lutz, v. 65, n. 3, p. 199-203, 2006. STOFER, W.; HICKS, C. L. Pernicious psychrophiles - their effect on cheese yield and composition. Cultured dairy products journal, 1983. TAMANINI, R. Controle de qualidade do leite UHT. 2012. 285. f. Tese (Doutorado em Ciência Animal) – Universidade Estadual de Londrina, Londrina, 2012.

51

5. CONCLUSÃO GERAL

A maior população dos micro-organismos psicrotróficos contribuiu

para o aumento do parâmetro da dureza dos queijos, reduziu o teor de gordura e

aumentou a degradação das frações αs1 e β-caseína

O tempo de maturação foi associado a menor degradação da fração

αs1-caseína e maior degradação da fração γ-caseína, influenciou a umidade, a

porcentagem de gordura, o nitrogênio total e a proteólise secundária.

A qualidade microbiológica da matéria prima influencia na qualidade

do produto queijo tipo provolone

52

ANEXO I

Fluxograma de produção do queijo tipo provolone maturado

(Diagrama operacional).

Fonte: Dados da pesquisa (2017).

53

ANEXO II

Valores médios e desvio padrão da textura de queijos provolones

agrupados conforme a qualidade do leite usado na sua fabricação, aos 30 e 60 dias

de maturação.

Tratamento 1 Tratamento 2

30 dias 60 dias 30 dias 60 dias

Dureza (N) 27,31±8,14 25,32±14,93 37,81±8,33 44,93±9,35

Coesividade 9,36±4,49 7,90±0,42 8,79±2,55 9,19±4,34 Elasticidade(mm) 0,88±1,36 0,62±0,07 0,64±0,03 0,64±0,04 Gomosidade(N) 16,6±6,11 14,3±7,32 23,9±4,87 29,1±5,04 Mastigabilidade(mJ) 159±89 114±59 199±39 263±128

Os dados são apresentados como média ± desvio padrão.

54

ANEXO III

Valores médios e desvio padrão composição centesimal de queijos

provolones agrupados conforme a qualidade microbiológica do leite usado na sua

fabricação, aos 0, 30 e 60 dias de maturação.

Tratamento 1 Tratamento 2

0 dias 30 dias 60 dias 0 dias 30 dias 60 dias

Umidade (%) 42,88± 1,71

42,26± 0,71

42,77± 0,81

42,74± 0,85

42,53± 1,02

43,46± 0,82

Gordura (%) 29,83± 2,28

29,00± 2,79

31,78± 3,62

42,74± 0,85

27,00± 1,02

28,56± 0,82

N total (%) 3,57± 0,24

3,55± 0,25

4,47± 1,28

3,90± 0,17

3,74± 0,09

4,61± 3,97

Proteólise 1ª (%) 13,18± 14,71

12,83± 12,32

10,27± 7,97

12,55± 12,88

12,24± 11,27

9,72± 8,46

Proteólise 2ª (%) 4,58± 4,53

6,10± 7,77

9,96± 6,76

3,15± 3,27

6,93± 8,45

8,86± 6,40

Os dados são apresentados como média ± desvio padrão.