PT-LMC-004 - Requisitos Gerais Para Exames Microbiologicos

Procedimento Operacional Padrão de Metodologias de Análises POP MET MIC 001

REQUISITOS GERAIS E ORIENTAÇÕES PARA EXAMES MICROBIOLÓGICOS

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REQUISITOS GERAIS E ORIENTAÇÕES PARA

EXAMES MICROBIOLÓGICOS

POP MET MIC 001

SÚMARIO




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I. REQUISITOS GERAIS E ORIENTAÇÕES PARA EXAME MICROBIOLÓGICOS..................3

1.0 OBJETIVOS E ALCANCE......................................................................................................3

2.0 INTRODUÇÃO....................................................................................................................... 3

3.0 PREMISSAS.......................................................................................................................... 4

4.0 PESSOAL............................................................................................................................. 11

5.0 APARELHOS E INSTRUMENTOS.......................................................................................13

6.0 PREPARAÇÃO DE MATERIAIS DE VIDRARIA DE LABORATÓRIO E OUTROS..............56

7.0 PREPARAÇÃO E ESTERILIZAÇÃO DE MEIOS DE CULTURA..........................................61

8.0 AMOSTRAS DE LABORATÓRIO........................................................................................61

9.0 EXAME................................................................................................................................. 65

10.0 ENUMERAÇÃO.................................................................................................................. 69

11.0 MÉTODO DE DETECÇÃO (MÉTODO QUALITATIVO)...................................................100

12.0 MÉTODOS DE CONFIRMAÇÃO......................................................................................101

13.0 RELATÓRIO DE ENSAIO................................................................................................108

14.0 VALIDAÇÃO DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS.........................................................108

15.0 GARANTIA DE QUALIDADE DOS RESULTADOS / CONTROLE DE QUALIDADE DE DESEMPENHO........................................................................................................................ 109

16.0 BIBLIOGRAFIA CONSULTADA.......................................................................................110

II. HISTÓRICO DAS REVISÕES..............................................................................................111

Anexo A.................................................................................................................................... 112

Anexo B.................................................................................................................................... 113




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I. REQUISITOS GERAIS E ORIENTAÇÕES PARA EXAME MICROBIOLÓGICOS

1.0 OBJETIVOS E ALCANCE

Abrange exame para bactérias, bolores e leveduras e pode ser usado se

suplementadas com orientação específica para príons, parasitas e vírus. Não

abrange o exame para toxinas ou outros metabólitos (aminas, por exemplo)

produzidos por microorganismos.

Esta Norma aplica-se a microbiologia de alimentos, alimentos para animais,

indústria de produção de alimentos, e ambiente de produção primária.

O objetivo desta Norma é contribuir para garantir a validade dos exames de

microbiologia de alimentos, e ajudar a garantir que as técnicas gerais usadas

para a realização desses exames são as mesmas em todos os laboratórios,

ajudar a alcançar resultados homogêneos em laboratórios diferentes, e

contribuir para a segurança do pessoal de laboratório, evitando riscos de

infecção.

2.0 INTRODUÇÃO

Ao conduzir exames microbiológicos é especialmente importante que

- apenas os microorganismos que estão presentes nas amostras sejam

isolados e contabilizados;

- os microorganismos não contaminem o meio ambiente

Para conseguir realizar isso é necessário também ter atenção à higiene

pessoal e realizar as técnicas de trabalho com certeza de eliminação de

contaminações externas, sempre que possível.

Uma vez que, nesta Norma Internacional, é possível dar apenas alguns

exemplos de precauções que devem ser tomadas durante uma análise




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microbiológica, um conhecimento profundo das técnicas microbiológicas e dos

microorganismos envolvidos é essencial. É importante que as análises sejam

realizadas com a maior precisão possível, incluindo monitoramento e registro

de aspectos que podem afetar os resultados e os cálculos do número de

microorganismos e o cálculo de incerteza de resultados.

Em ultima instância, é de responsabilidade do coordenador do laboratório de

julgar se as manipulações são seguras e se podem ser consideradas boas

práticas laboratoriais.

Um grande número de manipulações podem, por exemplo, sem intenção levar

a uma contaminação cruzada e o analista deve sempre verificar a precisão dos

resultados dados por sua técnica.

A fim de realizar as análises corretamente é necessário tomar certas

precauções ao construir e equipar o laboratório.

Certas precauções devem ser tomadas, não apenas por motivos de higiene,

mas também para garantir boa reprodutibilidade dos resultados. Não é possível

especificar todas as precauções que devem ser tomadas em todas as

circunstâncias, mas essa Norma Internacional pelo menos fornece as medidas

a serem tomadas ao preparar, esterilizar, armazenar os meios e utilizar os

equipamentos.

Se a orientação dada nessa Norma Internacional for seguida, será uma

contribuição para manter a saúde e segurança de todos. A fim de distinguir as

orientações nessa Norma Internacional, elas estão impressas em um tipo de

letra diferente (Times New Roman).

3.0 PREMISSAS

3.1 Geral

Esta cláusula dá requisitos gerais, para os princípios da concepção e

organização de um layout de laboratório de microbiologia.




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Exame das amostras estágio primário de produção (especialmente para

recepção de amostras e preparação de amostras) devem ser separadas da

análise de outras amostras para reduzir os riscos de contaminação cruzada.

3.2 Considerações sobre segurança

O projeto de laboratório deverá cumprir os requisitos de segurança que vai

depender do tipo de micro-organismo. Para este efeito, os micro-organismos

são classificados em quatro categorias de risco:

Categoria de risco 1 (nenhum risco ou muito baixo para o indivíduo e para a

comunidade).

Um micro-organismo que é improvável que causam a doença humana ou

animal.

Categoria de risco 2 (risco moderado para o risco individual e baixo para a

comunidade).

Um agente patogênico que pode causar doenças no homem ou animal, mas é

improvável que seja um perigo grave para os trabalhadores de laboratório, a

comunidade ou o ambiente. Exposições laboratoriais podem causar infecção

humana grave, mas o tratamento eficaz e medidas preventivas estão

disponíveis e o risco de propagação da infecção é limitada.

Categoria de risco 3 (alto risco para o risco individual e baixo para a

comunidade).

Um patógeno que geralmente causa doença humana ou animal grave, mas

normalmente não se espalham de um indivíduo infectado para outro.

Tratamento eficaz e medidas preventivas estão disponíveis.

Categoria de risco 4 (alto risco para o indivíduo e para a comunidade).




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Um patógeno que geralmente causa doença humana ou animal grave e que

pode ser facilmente transmitido de um indivíduo para outro, direta ou

indiretamente. Tratamento eficaz e medidas preventivas não são geralmente

disponíveis.

AVISO - Consulte a regulamentação nacional, que define a categoria de risco

de micro-organismos encontrados particularmente dentro das fronteiras do país

em questão.

3.3 Design de Laboratório

As diretrizes para a disposição de laboratório descrito abaixo cobrem exames

para a detecção de micro-organismos pertencentes à categoria de risco 1, 2 e

3 para microbiologia alimentar.

Note-se que as medidas de segurança adicionais podem ser necessárias,

dependendo da legislação local.

3.4 Áreas do Laboratório

3.4.1 Geral

O laboratório compreende áreas associadas com amostras e testes (ver 3.4.2)

e áreas em geral (Ver 3.4.3). Estas devem ser separadas.

3.4.2 Áreas associadas com amostras e testes

É considerada boa prática ter locais separados ou áreas claramente

designadas, para o seguinte:

- recebimento e armazenamento das amostras;

- preparação de amostras, em particular no caso de matérias-primas (por

exemplo, produtos em pó contendo um número elevado de micro-organismos);




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- exame das amostras (a partir da suspensão inicial), incluindo a incubação de

micro-organismos;

- manipulação de patógenos presuntivo;

- armazenamento de cepas de referência e outras cepas;

- preparação e esterilização de meios de cultura e equipamentos;

- armazenamento de meios de cultura e reagentes;

- exame de alimentos para a esterilidade;

- descontaminação;

- limpeza de vidro e outros equipamentos;

- armazenamento de produtos químicos perigosos, de preferência mantidos em

armários especialmente designados, salas ou prédios.

3.4.3 Áreas gerais

As seguintes áreas são consideradas separadas:

- entradas, corredores, escadas, elevadores;

- áreas administrativas (por exemplo, escritórios, salas de documentação, etc);

- vestiários e banheiros;

- salas de arquivo;

- lojas;

- salas de repouso.

3.5 Layout e acessórios das instalações




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3.5.1 Objetivos

O objetivo é garantir que o ambiente dentro do qual os exames microbiológicos

são realizados não afetem a confiabilidade dos resultados do teste.

Providenciar instalações de forma a evitar o risco de contaminação cruzada.

Maneiras de atingir este objetivo são, por exemplo:

a) para a construção do laboratório de acordo com o princípio do layout "não

volta";

b) a realização de procedimentos de forma sequencial utilizando as devidas

precauções para garantir o teste e integridade da amostra (por exemplo, uso de

recipientes fechados);

c) separar as atividades por tempo ou espaço.

Evitar condições extremas, tais como temperatura excessiva, poeira, umidade,

vapor, ruído, vibração, etc.

Espaço deve ser suficiente para permitir que as áreas de trabalho sejam

mantidas limpas e arrumadas. O espaço necessário deve ser proporcional ao

volume de análises e a organização interna global do laboratório. O espaço

deve ser regulado pela legislação nacional, quando existir.

3.5.2 Instalações

As instalações devem ser construídas e equipadas a fim de reduzir o risco de

contaminação por poeira e, portanto, por microorganismos (para micro-

organismos da categoria de risco 3 verificar a legislação nacional).

a) As paredes, tetos e pavimentos devem ser lisos, fácil de limpar e resistente a

detergentes e desinfetantes usados em laboratórios.

b) O piso deve ser antiderrapante.




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c) tubos suspensos de transporte de líquidos não devem cruzar as instalações

a menos que sejam hermeticamente fechados. Qualquer outra estrutura aérea

deve ser coberta ou facilmente acessível para limpeza regular.

d) Janelas e portas devem ser capazes de ser fechado quando realização dos

ensaios, a fim de minimizar correntes de ar. Além disso, devem ser construídos

de modo a evitar a formação de poeira, e assim, facilitar a sua limpeza. A

temperatura ambiente (18 ° C a 27 ° C) e qualidade do ar (conteúdo micro-

organismo, a taxa de poeira se espalhando, etc) deve ser compatível com a

realização dos testes. Um sistema de ventilação de filtro de ar de entrada e

saída de ar é recomendado para esta finalidade.

e) Um sistema de extração adequada deve ser instalado para evitar a

exposição às poeiras provenientes do manuseio de meios de cultura

desidratados, e as amostras em pó.

f) Testes que devem ser realizados em uma atmosfera de baixa contaminação,

a sala deve ser especialmente equipada com uma cabine de fluxo laminar ou

cabine de segurança biológica.

g) Se necessário, o ambiente de laboratório devem ser protegidos contra os

efeitos nocivos da radiação solar através da utilização de venezianas ou

painéis de vidro tratados adequadamente. Persianas instaladas internamente

não são adequadas, pois são de difícil limpeza e podem se tornar uma fonte de

poeira.

3.5.3 Outros pontos

Os seguintes pontos devem ser considerados:

- disponibilidade de abastecimento de água de qualidade apropriada para o uso

pretendido;

- disponibilidade de energia elétrica;



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- disponibilidade de gás (encanado ou engarrafado);

- luz adequada em cada seção do laboratório;

- superfície de bancada e móveis de laboratório fabricados em material liso,

impermeável, de fácil limpeza e desinfecção;

- mobiliário de laboratório concebido de modo a facilitar a limpeza dos pisos

(por exemplo, mobiliário móvel);

- nenhuma mobília, documentos ou outros itens que não sejam os estritamente

necessários para as atividades de teste, devem ser mantidos na área de testes;

- disponibilidade de instalações de armazenamento para armazenar

documentos usados ao manipular as amostras, meios de cultura, reagentes, e

etc;

- fornecimento de lavatórios de mão em cada sala de testes e, se necessário,

em áreas gerais, de preferência perto da porta;

- disponibilidade de uma autoclave para destruição de resíduos contaminados e

meios de cultura, a menos que um adequado sistema para a remoção de

resíduos contaminados para incineração esteja em vigor;

- fornecimento de sistemas de segurança para cobrir incêndio, emergência

elétrica e chuveiro de emergência e instalações para lavagem dos olhos;

- fornecimento de instalações de primeiros socorros.

3.6 Limpeza e desinfecção

Os seguintes pontos devem ser verificados.




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a) Os pisos, paredes, tetos, bancadas de laboratório, mobiliário e junções entre

estes devem ser submetidos a manutenção e reparação regular, a fim de evitar

rachaduras que podem atuar como uma fonte de contaminação.

b) A limpeza regular e desinfecção devem ser realizadas a fim de manter as

instalações em condições adequadas para a realização de testes. Superfícies

contaminadas ou potencialmente contaminadas devem ser descontaminadas

utilizando desinfetante conhecido por ser bactericida e fungicida.

NOTA 1 Salas e equipamentos podem ser descontaminados por fumigação

com vapor de formaldeído, se permitido pela legislação nacional.

c) Os sistemas de ventilação e seus filtros devem receber manutenção

regularmente e os filtros mudados quando necessário.

d) A qualidade microbiológica de superfícies de trabalho laboratorial,

superfícies de contato pessoal, e ar devem ser monitorados regularmente (a

frequência depende dos resultados de testes anteriores).

e) a contaminação de superfície pode ser estimado através da aplicação direta

à superfície de uma placa de contato contendo neutralizantes contra agentes

sanitizantes (por exemplo, lecitina, tiossulfato de sódio). A qualidade do ar

pode ser examinada por exposição de 15 min uma placa de Petri abertas

contendo meio de ágar não seletivo (ágar contagem por exemplo placa - PCA)

ou um Ágar seletivo adequado para o microrganismo alvo procurado (por

exemplo, ágar batata).

4.0 PESSOAL

4.1 Generalidades

Requisitos gerais sobre a competência do pessoal pode ser encontrada em

ISO / IEC 17025.

4.2 Competência




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Para cada método ou técnica, os critérios objetivos devem ser definidos para a

avaliação das competências adequadas, ambos inicialmente e em uma base

contínua.

A competência pode ser estabelecida dentro do laboratório de controle de

qualidade interno (ver 15.1.2).

4.3 Verificação de competência em curso do pessoal

Verificação de competência em curso do pessoal deve ser avaliada

regularmente com parâmetros objetivos. Isso inclui participação em programas

internos de garantia da qualidade, testes de proficiência (ver ISO / IEC Guia 43-

1), o uso de materiais de referência ou por avaliação através de testes para

enumeração de microorganismos como descrito na ISO 14461-2.

4.4 Higiene

As seguintes precauções de higiene pessoal devem ser tomadas a fim de evitar

a contaminação das amostras, meios de cultura e para evitar o risco de

infecção do pessoal. Para maiores informações ver POP MET MIC 007.

a) Usar vestuário de laboratório devidamente preso, limpo e em bom estado,

fabricados a partir de um tecido que limita os riscos de inflamabilidade. Esta

roupa não deve ser usada fora das áreas de trabalho e, possivelmente,

vestiários.

b) Usar proteção para os cabelos e barba, se necessário, para a integridade da

amostra.

c) Manter unhas limpas e de preferência curtas.

d) Lave bem as mãos em água morna, de preferência por uma torneira não-

operada manualmente, antes e depois de exames microbiológicos e

imediatamente depois de ir ao banheiro banho. Use sabão líquido ou em pó ou,




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possivelmente, um desinfetante, entregue preferencialmente por um

dispensador mantido em boas condições de limpeza. Para a secagem das

mãos, usar papel ou toalhas de pano descartáveis. Estas precauções são

aplicáveis tanto aos funcionários do laboratório quanto aos visitantes.

e) Ao trabalhar com amostras expostas, meios de cultura, e ao inocular, evitar

falar, tossir, e etc.

f) As pessoas que tenham infecções de pele ou doenças devem tomar

precauções, onde os micro-organismos podem contaminar as amostras e

invalidar os resultados.

g) Não comer ou beber no laboratório e não colocar alimentos para consumo

pessoal em refrigeradores ou freezers do laboratório.

h) Pipetagem com a boca é proibida.

5.0 APARELHOS E INSTRUMENTOS

5.1 Geral

De acordo com boas práticas de laboratório, todos os aparelhos e

equipamentos devem ser mantidos limpos e em condição de bom estado de

funcionamento. Antes do uso, o equipamento deve ser verificado como apto

para o efeito pretendido e seu desempenho monitorado durante o uso, sempre

que necessário.

Os aparelhos e dispositivos de monitorização devem ser calibrados por órgãos

de calibração rastreáveis e os controles necessários intermediários realizados,

e os procedimentos e os resultados documentados.

Equipamentos devem ser regularmente checados e mantidos para garantir a

segurança e adequação ao uso. O equipamento deve ser controlado de acordo

com as condições de trabalho e a precisão exigida para os resultados.




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A frequência de calibração e verificações de cada item do equipamento são, na

maioria dos casos, não especificadas nesta Norma, uma vez que será

determinada por cada laboratório, dependendo do tipo de equipamentos e ao

nível de atividade do laboratório, e de acordo com as instruções do fabricante.

Em um número limitado de casos, uma frequência foi especificada desde que

foi considerada essencial.

Aparelhos e equipamentos devem ser construídos e instalados para facilitar a

operação e para permitir a facilidade de manutenção, limpeza,

descontaminação e de calibração.

Quaisquer incertezas de medição indicados nesta cláusula referem-se a

aparelhos e equipamentos em causa e não para todo o método de análise.

Ao longo desta cláusula, os requisitos para a precisão de medição de

equipamentos de medição são dadas. Estes são baseados na tolerância

práticas necessárias para demonstrar o controle adequado dos equipamentos

em uso rotineiro. A precisão declarada está relacionada com a incerteza

metrológica do aparelho.

Para equipamentos de controle de temperatura, verificar a estabilidade e

homogeneidade da temperatura antes do uso inicial e depois de qualquer

reparação ou modificação que possa ter um efeito sobre o controle de

temperatura.

5.2 Cabines de segurança

5.2.1 Descrição

Uma cabine de segurança é uma estação de trabalho com o fluxo de ar laminar

horizontal ou vertical para remover poeira e outras partículas, como os

micróbios, a partir do ar.




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O número máximo tolerável de partículas por metro cúbico com um tamanho

maior ou igual a 0,5 μm representa a classe de espalhamento de poeira de

uma cabine de segurança. Para cabines usadas em microbiologia alimentar, o

número de partículas não deve exceder 4 000 por metro cúbico.

Cabines para uso em laboratórios de microbiologia de alimentos são de quatro

tipos.

a) Cabines de segurança de Classe I possuem abertura frontal e se destinam a

proteger o operador e o meio ambiente, mas não irá proteger o produto de

contaminação externa. Aerossóis potencialmente infectados serão contidos

dentro do gabinete e preso por impactação no filtro. O ar filtrado é normalmente

descarregada para a atmosfera, se isso não for feito, o ar deve passar por dois

filtros HEPA montados em série. Eles não são recomendados para trabalhar

com patógenos de categoria de risco 3 por causa das dificuldades em manter e

garantir a proteção do operador apropriado.

b) Cabines de segurança de Classe II protegem o produto, o operador e o meio

ambiente. Eles recircular parte do ar filtrado, outra parte vai para a atmosfera e

retornam no ar de reposição através da abertura de trabalho, proporcionando

assim a proteção do operador. Eles são adequados para trabalhar com

patógenos de categoria de risco 3.

c) Fluxos laminares de saída horizontal protegem o trabalho de contaminação,

mas joga qualquer golpe de aerossol gerado para o rosto do operador.

Portanto, eles não são adequados para lidar com culturas inoculadas ou

preparação de cultura de tecidos.

d) fluxo de ar laminar vertical protege o produto através do uso de fluxo laminar

vertical de HEPA-ar filtrado. Eles também protegem o operador através do uso

de ar internamente recirculado. Eles são particularmente adequados para

proporcionar um ambiente asséptico para a manipulação de produtos estéreis e

para proteger o operador quando o manuseio de pós.




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Usar cabines de proteção para todo o trabalho que envolva a manipulação de

agentes patogênicos e pós contaminados, se necessário por regulamentação

nacional.

O uso de um queimador de gás ou incinerador fio não é recomendado em

armários de proteção. Se for necessário, o queimador de gás deve ter uma

pequena chama de modo que o fluxo de ar não seja perturbado. O uso de

material descartável (alças, pipetas, etc) é uma alternativa adequada.

5.2.2 Uso

Cabines devem ser mantidas livres de todos os equipamentos possíveis.

Colocar todo material necessário dentro da cabine antes de começar a

trabalhar para minimizar o número de movimentos do braço para dentro e fora

da abertura de trabalho. Posicionar equipamentos e materiais de forma a

minimizar a perturbação do fluxo de ar na abertura de trabalho.

Operadores devem ser adequadamente treinados para o uso correto de cabine

para garantir a sua segurança e a integridade do produto ou cultura.

5.2.3 Limpeza e desinfecção

Limpar e desinfetar a área de trabalho após o uso com desinfetante apropriado

e não corrosivo, de acordo com as instruções do fabricante. Examinar

regularmente grades, arame, pré-filtros de proteção e limpar com um pano

encharcado de desinfetante.

Para cabines de fluxo laminar, a superfície do filtro deve ser limpa regularmente

com vácuo, tomando cuidado para não danificar o meio do filtro.

Cabines de segurança devem ser fumigadas antes de trocar de filtro ou

manutenção.




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Após a limpeza dos armários, lâmpadas UV podem ser utilizadas para a

desinfecção. As lâmpadas UV devem ser regularmente limpas e substituídas

em conformidade com as instruções do fabricante.

5.2.4 Manutenção e inspeção

Usar cabine de proteção que são apropriadas para a aplicação pretendida e as

condições ambientais no laboratório.

A eficiência de uma cabine de proteção deve ser verificada por uma pessoa

qualificada, no recebimento e, posteriormente, em intervalos regulares,

conforme recomendado pelo fabricante, bem como após qualquer reparo ou

modificação.

Verificação periódica de livre de qualquer contaminação microbiana deve ser

realizada por uma verificação da superfície e das paredes da cabine.

A verificação periódica do número de presentes micro-organismos no ar deve

ser realizada durante o funcionamento dos filtros usando o equipamento usual.

Por exemplo, expor várias placas de Petri abertas contendo um meio de cultura

de ágar não-seletivo (por exemplo, PCA) em cada gabinete por 30 min. Outros

métodos podem ser usados.

5.3 Balanças e diluidores gravimétricos

5.3.1 Uso e incerteza de medição

Balanças são usadas principalmente para a pesagem da porção da amostra a

ser analisada, os componentes do ensaio, os meios de cultura e reagentes.

Além disso, eles podem ser usados para a realização de medições de líquido

de diluição por volumes em massa.

Diluidores gravimétricos são instrumentos eletrônicos constituídos de uma

balança e distribuidor de líquido programável e são utilizados durante a




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preparação de suspensões de amostra inicial; eles funcionam através da

adição de diluente a uma subamostra em uma proporção definida. A

subamostra é, então, pesada para a tolerância especificada no set do aparelho,

e o diluidor dispensa diluente suficiente para a relação necessária (por

exemplo, 9 pra 1 para diluições decimais).

Um laboratório de microbiologia de alimentos deve estar equipado com

balanças com o intervalo de incerteza necessário para pesar os diferentes

produtos.

Salvo disposição em contrário, os erros máximos admissíveis devem ser 1% ou

melhor, ao pesar as amostras de teste.

Colocar o equipamento sobre uma superfície estável e horizontal, ajustado

conforme necessário e protegido contra vibrações e vento.


Os equipamentos devem ser limpos e desinfetados após o uso ou derrame

durante a pesagem com um adequado e não corrosivo desinfetante.

5.3.3 Verificação de desempenho e calibração

O desempenho do sistema de equilíbrio deve ser regularmente verificado

durante o uso e após a limpeza com pesos de checagem e por uma pessoa

treinada. Calibração deve ser verificada em toda a gama por uma pessoa

qualificada, dependente da frequência de uso.

Pesos de checagem também podem ser verificados imediatamente após a

calibração da balança.

5,4 Homogeneizadores, liquidificadores e mixers

5.4.1 Descrição




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Este equipamento é usado para preparar a suspensão inicial da amostra de

produtos não-líquidos.

Os seguintes aparelhos podem ser utilizados:

Stomacher com sacos estéreis, possivelmente com um dispositivo de

regulação de velocidade e tempo; ou um homogeneizador rotativo

(liquidificador), a velocidade nominal de que é entre 8 000 rpm e 45 000 rpm,

com vidro esterilizável ou tigelas de metais equipados com tampas, ou um

misturador de vibração (pulsifier) com sacos estéreis, ou outro sistema de

homogeneização com eficiência equivalente.

Em certos casos, mistura manual pode ser feita usando pérolas de vidro

estéreis com diâmetro adequado (Cerca de 6 mm; ver POP MET MIC 002).

5.4.2 Uso

O tempo de funcionamento normal de um homogeneizador peristáltico é de 1

min para 3 min (ver POP MET MIC 002 para determinados alimentos).

Não use este tipo de aparelhos para determinados gêneros alimentícios, tais

como:

produtos que correm o risco de punção da bolsa (presença de nítidas, as

partículas duras ou secas);

produtos que são difíceis de homogeneizar por causa de sua textura (por

exemplo, salame).

O homogeneizador rotativo deverá funcionar por um período tal que o número

total de rotações é entre 15000 rpm e 20000 rpm. Mesmo com o mais lento

homogeneizador, este tempo não deve exceder 2,5 min.

O misturador de vibração pode ser usado para a maioria dos gêneros

alimentícios, incluindo produtos duros ou secos. O tempo de operação usual é




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0,5 min a 1 min. Se os micro-organismos são susceptíveis de serem

encontradas no fundo de estruturas coesas, a amostra deve ser cortada em

pedaços pequenos antes do processamento.

Contas de vidro podem ser usadas para a preparação, por agitação, de

suspensões iniciais de certos produtos viscosos ou espessos, em especial

determinados produtos lácteos (ver normas específicas).


Limpar e desinfetar homogeneizadores peristáltico e misturadores vibracionais

regularmente e após qualquer derrame do saco.

Para homogeneizadores rotativo, limpar e esterilizar o vidro ou tigela de metal

após cada utilização.

5.4.4 Manutenção

Inspeção e manutenção do equipamento de acordo com as instruções do

fabricante.

5.5 pHmetro

5.5.1 Descrição

Um medidor de pH é usado para medir a diferença de potencial, a uma

temperatura determinada, entre uma medição do eletrodo e uma referência, os

dois eletrodos sendo introduzidos no produto. Devem ser capazes de medir

com uma precisão de 0,05 unidades de pH e sua resolução será de 0,01

unidades de pH. O medidor de pH deve ser equipado com manual ou

compensação automática de temperatura.

NOTA: O eletrodo de medição e o eletrodo de referência normalmente são

agrupados em um sistema de eletrodos combinados.




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5.5.2 Uso

Um medidor de pH é usado para medir o valor de pH do meio de cultura e

reagentes, para verificar se o ajuste é necessário durante sua preparação e

como um controle de qualidade depois da esterilização.

Também pode ser usado para medir o valor de pH de amostras e suspensões

de amostras. O uso de um medidor de pH é discutido na área específica para

o produto a ser analisado, e em que as condições para a determinação do valor

de pH e para ajuste do valor do pH são especificados.

Ajustar o medidor de pH, conforme indicado no manual do fabricante para

medir o valor de pH em uma temperatura padronizada, por exemplo, 25 ° C.

Ler o valor de pH após a estabilização ser atingida. Registrar o valor para duas

casas decimais.

NOTA: A leitura pode ser considerada estável quando o valor de pH medido

durante um período de 5 s varia de acordo com pH não superior a 0,02

unidades. Usando eletrodos em boas condições, o equilíbrio é normalmente

alcançado dentro de 30 s.

5.5.3 Verificação e aferição

Verificar o medidor de pH de acordo com as instruções do fabricante, usando

pelo menos dois, e de preferência três padrões de soluções tampão, pelo

menos, diariamente antes do uso. Definir erros máximos admissíveis para esta

verificação, dependendo da utilização.

As soluções padrão devem ter valores de pH especificado para duas casas

decimais na temperatura de medição (em geral, pH 7,00 e pH 4,00 e / ou pH

9,00 a 25 ° C, de acordo com as instruções do fabricante).

Os padrões utilizados devem englobar o valor de pH a ser medido.




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Após a verificação do medidor de pH com as duas soluções tampão padrão

rastreáveis, o pH deve ser verificado pela uso de um terceiro tampão controle,

de, por exemplo, pH 5 ou 8.

Avaliar o medidor de pH quando as verificações derem um resultado que não

se enquadram nos erros máximos admissíveis e em acordo com as instruções

do fabricante.

Esta aferição pode ser seguida por uma calibração que permita estimativa da

incerteza de medição do medidor de pH.

5.5.4 Manutenção

Verificar e manter os eletrodos de acordo com as instruções do fabricante. É

necessário, em particular,

- o acompanhamento regular da condição dos eletrodos com relação ao

envelhecimento e sujidade, e

- o tempo de resposta e estabilidade.

Enxaguar os eletrodos com água destilada ou deionizada após cada utilização.

A fim de combater a sujidade e envelhecimento dos eletrodos, limpe-os

regularmente mais completamente de acordo com as instruções do fabricante.

Armazenar os eletrodos de acordo com as instruções do fabricante.

5.6 Autoclave

5.6.1 Descrição

Uma autoclave permite que uma temperatura de vapor saturado seja atingida

na câmara, e é usado para a destruição de micro-organismos.

A autoclave deve ser equipada com




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- pelo menos uma válvula de segurança,

- uma torneira de drenagem,

- um dispositivo de regulagem permitindo que a temperatura na câmara para

ser mantida a + 3°C da meta de temperatura (para levar em conta a incerteza

de medição associada ao termopar de medição), e

- uma sonda de temperatura ou um termopar de gravação.

Também deve ser equipado com um temporizador e registrador de

temperatura.

5.6.2 Uso

Com a esterilização a vapor, todo o ar é expulso antes do acúmulo de pressão.

Se a autoclave não estiver equipada com um dispositivo de evacuação

automática, é necessário remover o ar até que um jato de vapor contínuo seja

emitido.

Para a destruição de micro-organismos, o vapor saturado na câmara deve

estar a uma temperatura de pelo menos 121°C.

Durante o mesmo ciclo de esterilização, não use o autoclave para esterilizar o

equipamento limpo (e/ou meio cultura) e, descontaminar equipamentos usados

(e/ou meios de cultura utilizados).

É preferível usar autoclaves separadas para estes dois processos. Após

autoclavagem, todos os materiais e equipamentos devem ser resfriados dentro

da autoclave antes da remoção.

Por razões de segurança, não remova o conteúdo até que a temperatura caia

abaixo de aproximadamente 80°C.

5.6.3 Manutenção




Revisão: 00

Limpe a câmara, as vedações de drenagem do filtro e porta regularmente.

Verificar a vedação da porta de integridade. Realizar operações de drenagem e

descalcificação, se necessário, em intervalos regulares. Siga as

recomendações do fabricante.

5.6.4 Verificação e calibração

A autoclave deve ser mantida em boas condições de funcionamento e deve ser

regularmente inspecionada pelas autoridades competentes, pessoal

qualificado, e em conformidade com as instruções do fabricante.

Manter os instrumentos de monitoramento em boas condições de

funcionamento e verificá-los regularmente.

Validação inicial deve incluir estudos de desempenho para cada ciclo de

operação e cada configuração de carga usada em prática. Este processo deve

ser repetido após o reparo ou modificação significativa. Suficientes sensores de

temperatura devem ser posicionados dentro da carga para demonstrar a

penetração de calor adequado em todos os locais. Validação e revalidação

devem considerar a adequação dos tempos de aquecimento e resfriamento,

bem como a temperatura de esterilização.

Para cada carga, no mínimo, um indicador de processo deve ser incluído no

centro da carga para verificar o processo de aquecimento onde um registro

rastreável da eficiência do processo não está disponível.

5.7 Preparador de Meio

5.7.1 Descrição

Um preparador de meio é desenvolvido principalmente para a esterilização de

grandes volumes de meio (>1L). É constituído por uma caldeira, compartimento

de água e um dispositivo de agitação contínua. O equipamento deve também




Revisão: 00

ser equipado com um medidor de temperatura, medidor de pressão, timer, e

válvula de segurança.

Além disso, a unidade deve ter uma trava de segurança para impedir abertura

até que uma temperatura de <80 ° C seja alcançada.

5.7.2 Uso

Siga as instruções do fabricante em todos os momentos.

Todo o processo produtivo ocorre dentro do aparelho. Após a adição de todos

os ingredientes, eles são dissolvidos por agitação e aquecimento. Isto é

seguido pela esterilização.

5.7.3 Manutenção

Lavar o preparador e enxaguar abundantemente com água purificada entre

cada lote de meio.

5.7.4 Verificação

O preparador deve ser mantido em boas condições de funcionamento e

inspecionado regularmente por profissionais competentes, de acordo com as

instruções do fabricante.

Manter os instrumentos de monitoramento em boas condições de

funcionamento e verificar regularmente o seu desempenho.

Validação inicial deve incluir estudos de desempenho para cada ciclo de

operação e cada tamanho de carga utilizada na prática. Este processo deve ser

repetido após o reparo ou modificação significativa. Duas sondas de

temperatura, uma ao lado da sonda controle e outra adjacente a ele, devem ser

usadas para demonstrar aquecimento uniforme.

A temperatura e a duração de cada ciclo devem ser verificadas.




Revisão: 00

5.8 Estufa

5.8.1 Descrição

Uma estufa consiste de uma câmara de isolamento que permite que a

temperatura seja mantida estável e distribuída de forma uniforme, dentro do

erro máximo admissível de temperatura especificado no método de ensaio.

5.8.2 Uso

Estufas devem estar equipadas com um sistema de regulação que permite que

a temperatura ou outros parâmetros sejam mantidos estáveis ao longo do

volume inteiro de trabalho. Definir o volume de trabalho para garantir que este

é seja alcançado.

Se a temperatura ambiente é próxima ou maior do que o da incubadora, é

necessário colocar um sistema de resfriamento para a câmara.

As paredes de estufas devem ser protegidas da luz solar.

Se possível, as estufas não devem ser completamente preenchidas em uma

única operação, porque os meios de cultura terão um longo tempo para entrar

em equilíbrio da temperatura, independentemente do tipo de estufa utilizada

(por convecção forçada de ar ou de outra forma). Evitar deixar a porta aberta

por longos períodos.

Ao carregar as estufas, deve ser dada atenção à circulação de ar (ver 10.2.4).

5.8.3 Limpeza e sanitização

Limpar e higienizar regularmente as paredes internas e externas da estufa e,

se for o caso, remover o pó do sistema de ventilação.

5.8.4 Verificação




Revisão: 00

Verificar a estabilidade da temperatura e da homogeneidade da distribuição de

temperatura durante todo o volume de trabalho da estufa através do uso

simultâneo de termômetros ou termopares com conhecida precisão e faixa de

temperatura adequada.

Use as informações para definir a faixa de operação aceitável da incubadora e

a posição ideal do termômetro usado para monitorar a temperatura de trabalho.

Por exemplo, para atingir uma temperatura alvo de 37 ° C ± 1 ° C quando os

dados de um lado mostrarem um intervalo de 36,8 ° C para 37,3 ° C do outro

lado da estufa, em seguida, a faixa de operação deve ser reduzida para 36,2 °

C para 37,7 ° C, a fim de garantir que a todas as partes da estufa atinjam a

temperatura alvo de 37 ° C.

Este processo deve ser repetido após cada reparo ou modificação significativa.

A temperatura de operação deve ser verificada com um ou mais termômetros

de máxima e mínima ou termopares gravação, por exemplo.

O termopar ou termômetro de gravação utilizado para o monitoramento de

rotina da estufa deve ser fixado em uma posição definida a partir dos dados de

perfil como atingir a temperatura alvo.

Verifique a temperatura da estufa, pelo menos, a cada dia de trabalho. Para

este efeito, cada estufa deve incorporar pelo menos um dispositivo de medição

de trabalho, cuja sonda pode ser imersa em glicerol (ou outro dissipador de

calor apropriado) contida em um frasco lacrado.

Outros sistemas de verificação de desempenho equivalentes podem ser

utilizados.

5.9 Geladeira, câmaras frigoríficas

5.9.1 Descrição




Revisão: 00

Estes são câmaras que permitem o armazenamento refrigerado. Para a

conservação de amostras de alimentos para análise, a temperatura será de

3°C +2°C (erro máximo admissível), exceto para aplicações específicas.

Para outros usos, a temperatura, salvo indicação em contrário, deve ser de 5°C

+3°C.

5.9.2 Uso

A fim de evitar a contaminação cruzada, use câmaras diferentes, ou pelo

menos diferentes recipientes, para alcançar separação física, para o

armazenamento de

- meios de cultura e reagentes não inoculadas,

- amostras de teste, e

- culturas de microorganismos e meios de cultura incubados.

Carregar geladeiras, chillers e câmaras frigoríficas de tal forma que a

circulação de ar adequada seja mantida e o potencial de contaminação cruzada

minimizado.

5.9.3 Verificação

Verifique a temperatura de cada câmara a cada dia de trabalho usando um

termômetro ou uma sonda instalada permanentemente. A precisão exigida do

dispositivo de monitoramento de temperatura é dependente do propósito para o

qual a unidade é utilizada.

5.9.4 Manutenção e limpeza

Realizar as seguintes operações de manutenção em intervalos regulares para

garantir a operação adequada:




Revisão: 00

- remoção da poeira das pás do motor ou do exterior de troca de calor placas;

- descongelação;

- limpeza e higienização do interior das câmaras.

5.10 Freezer e congelador

5.10.1 Descrição

Um freezer é uma câmara que permite o armazenamento de produtos

congelados. A temperatura, a menos que especificada de outra forma, deve ser

inferior a -15 ° C, de preferência abaixo de -18 ° C para as amostras de

alimentos.

Um ultra-freezer é uma câmara que permite armazenamento de produtos

ultracongelados. A temperatura, a menos que necessite contrário, deve ser

abaixo de -70 ° C.

5.10.2 Uso

5.10.2.1 Freezer

Câmaras diferentes, ou pelo menos diferentes recipientes, devem estar

disponíveis para conseguir a separação física para o armazenamento de:

- reagentes não inoculados,

- amostras para análise, e

-culturas de micro-organismos.

Carregar o freezer de tal forma que a baixa temperatura seja mantida, em

particular quando produtos descongelados são introduzidos.

5.10.2.2 Ultra-freezer




Revisão: 00

É usado no armazenamento de micro-organismos de cultura referência, e / ou

de trabalho, e reagente.

Carregar o freezer de tal forma que a baixa temperatura seja mantida, e evite a

contaminação cruzada entre micro-organismos e reagentes.

5.10.3 Verificação

Verificar a temperatura de cada câmara regularmente, usando um dispositivo

de monitorização de temperatura adequado.

5.10.4 Manutenção

Realizar regularmente as seguintes operações de manutenção:

- remoção da poeira das pás do motor e do externo de troca de calor placas (se

acessível);

- descongelação;

- limpeza e higienização do interior das câmaras.

5,11 Banho controlado termostaticamente (banho-maria)

5.11.1 Descrição

Um banho controlado termostaticamente, cheio de um líquido (água,

etilenoglicol, etc), com ou sem tampa ou equipado com outro dispositivo para

limitar a evaporação, é necessária para manter uma temperatura especificada.

Controle de temperatura é muitas vezes mais preciso do que em uma estufa

incubadora, permitindo erros máximos admissíveis de 0,5°C ou menores.

As temperaturas necessárias de trabalho e os erros máximos admissíveis são

estipulados em cada aplicação ou método. Um sistema de resfriamento é




Revisão: 00

necessário para manter uma temperatura próxima ou abaixo da temperatura

ambiente.

5.11.2 Uso

Os principais usos são os seguintes:

- incubação a uma temperatura constante de meios de cultura inoculados;

- manutenção de ágar estéril fundido durante a preparação dos meios;

- manutenção de temperatura de ágar estéril fundido para uso em métodos

específicos;

- preparação de suspensões ou soluções de amostra inicial a uma temperatura

controlada;

- tratamento térmico de suspensões de amostra inicial a uma temperatura

controlada (pasteurização, por exemplo).

Onde o controle preciso da temperatura é necessário, o banho deve ser

equipado com uma bomba de circulação de água e um sistema de regulação

de temperatura automático. Qualquer agitação do líquido não deve causar

dispersão de gotículas.

Banhos com tampa são preferíveis para o uso preciso ou altas temperaturas.

Tampas inclinadas que permitem a drenagem de condensado devem ser

usadas.

Para a incubação dos caldos inoculados, manter o nível do líquido de modo

que a parte superior do caldo fique pelo menos 2 centímetros abaixo do nível

do líquido no banho durante todo o período de incubação.

Outros recipientes devem ser colocados dentro do banho de forma que o nível

do seu conteúdo seja inferior ao do líquido.




Revisão: 00

A profundidade de imersão deve impedir a entrada de água através do

fechamento.

Dispositivos para manter a estabilidade dos recipientes podem ser necessários,

por exemplo, estantes.

Todos os recipientes devem ser secados após a remoção do banho e antes de

nova utilização.


Verificar a estabilidade e homogeneidade da temperatura em todo o banho

antes do uso inicial e depois de qualquer reparo ou modificação que tenha um

efeito sobre o controle de temperatura.

Monitorar cada banho com um dispositivo termopar, termômetro, ou gravador

de temperatura com o mínimo adequado grau de incerteza de medição (ver

5.28.2), e independente do sistema de regulação de temperatura automático.

Um display digital também pode ser usado, desde que a sua precisão e

resolução sejam verificadas.

Monitorar a temperatura do banho durante cada uso ou pelo menos

diariamente, por períodos prolongados de incubação.

5.11.4 Manutenção

Banhos devem ser preenchidos com líquido, tal como recomendado pelo

fabricante. Para a incubação das culturas, água destilada ou deionizada deve

ser preferencialmente utilizada.

Verifique regularmente o nível do líquido para garantir o correto funcionamento

do banho e imersão satisfatória de itens na banheira. O nível do líquido deve

cobrir sempre os elementos de aquecimento.




Revisão: 00

Banhos devem ser esvaziados, limpos, higienizados e reabastecidos

regularmente e com uma frequência dependendo do uso, ou depois da

ocorrência de um derrame.

5.12 Vaporizadores, incluindo banhos de água fervente

5.12.1 Descrição

Vapor de água fervente e banhos consistem de um elemento de aquecimento

cercado por água em um recipiente com uma tampa aderente. Um banho de

água fervente aquece a água a uma temperatura igual ou próxima ao ponto de

ebulição, com ou sem a produção de vapor.

5.12.2 Uso

Os principais usos são os seguintes:

-derretimento de ágar;

- preparação de meio termo lábil;

- redução da contaminação de pequenos itens de equipamentos entre o uso.

O nível seguro e adequado de água deve estar presente no recipiente para

garantir que os elementos de aquecimento estão cobertos em todos os

momentos.

Autoclave com um compartimento para liberar vapor também pode ser usado.

5.12.3 Manutenção

Mantenha vaporizadores e banhos de água fervente com água limpa.

Se necessário, descalcificação regular deve ser feita a uma frequência

dependente da dureza da água local.




Revisão: 00

5.13 Forno de esterilização

5.13.1 Descrição

Um forno de esterilização é uma câmara que é capaz de manter uma

temperatura de 160°C a 180°C para a destruição de micro-organismos pelo

calor seco.

5.13.2 Uso

Apenas os equipamentos robustos, como vidro e metal para devem ser

esterilizados no forno de esterilização, não usá-lo para artigos de plástico e

borracha.

Antes da esterilização, limpe todos os vidros e metais para serem esterilizados

no forno.

Se vidro volumétrico for esterilizado no forno de esterilização, deve-se verificar

regularmente a precisão dos volumes marcados.

A temperatura deve ser uniforme em toda a câmara. O forno deve estar

equipado com um termostato e um dispositivo de termômetro ou de gravação

de temperatura com precisão adequada.

Deve ser equipado com um indicador de tempo, ou temporizador.

Uma vez que a temperatura de funcionamento é atingida, o processo de

esterilização deve durar pelo menos 1 hora a 170°C ou uma equivalente

combinação de tempo/temperatura.

Após a esterilização, para evitar rachaduras, vidros devem ser mantidos no

forno até seu resfriamento antes da remoção.





Revisão: 00

Verificar a estabilidade e homogeneidade da temperatura durante todo o forno

antes do uso inicial e depois de qualquer reparação ou modificação que possa

ter um efeito sobre o controle de temperatura.

O forno deve estar equipado com um dispositivo termopar termômetro, ou

temperatura de gravação-calibrada de precisão adequada, que é independente

do sistema de regulação de temperatura automático. O monitoramento do

dispositivo deve ter uma resolução de 1°C, ou melhor, na temperatura do forno

utilizado.

A temperatura do forno deve ser monitorada e gravada durante cada uso.

5.13.4 Manutenção

Limpar as superfícies internas quando necessário.

5.14 Microondas

5.14.1 Descrição

Um forno de micro-ondas é um dispositivo que permite o aquecimento de itens

por energia de micro-ondas em pressão atmosférica.

5.14.2 Uso

o uso disponível do equipamento atualmente é apenas para aquecer líquidos

ou derreter meios de cultura com ágar.

ATENÇÃO - Não aqueça meios contendo componentes sensíveis ao calor

no microondas a menos que tenha sido verificado que esta forma de

aquecimento não tem nenhum efeito sobre o desempenho do meio.

Nenhuma avaliação ainda foi feita da eficiência do micro-ondas para

esterilizar meios de cultura e fornos de micro-ondas não devem ser usado

para esta finalidade.




Revisão: 00

O forno deve ser capaz de aquecer líquidos e meios de cultura de forma

controlada através de um ciclo de emissão de micro-ondas. A distribuição das

micro-ondas deve ser homogênea para evitar zonas de superaquecimento.

Fornos equipados com disco girador ou um agitador para o micro-ondas

possuem uma melhor distribuição de calor.

Não utilize o equipamento de metal, incluindo os fechos de metal. Solte tampas

de garrafas ou tampas antes do aquecimento.

Aquecimento por períodos mais longos em avaliações de baixa potência pode

dar uma melhor distribuição de calor.

ATENÇÃO - Manuseie itens aquecidos com cuidado. Conteúdo podem se

tornar superaquecidos e podem ferver para fora das garrafas ou as

garrafas podem explodir.

O ágar deve derreter em uma configuração de baixa potência (por exemplo,

ciclo de degelo), e um dissipador de calor da água (por exemplo, 50 ml a 100

ml de água em um copo de micro-ondas) são recomendados para auxiliar o

controle do processo de aquecimento.

Um tempo de espera de pelo menos 5 min é recomendada após o processo de

aquecimento antes da remoção do frasco, do forno de micro-ondas.


Tempos de aquecimento adequado e ajustes de potência devem ser

estabelecidos primeiro para os diferentes volumes de líquidos e meios de

cultura rotineiramente manuseados, para garantir um ótimo desempenho e

evitar superaquecimento de produtos sensíveis.

5.14.4 Manutenção




Revisão: 00

Limpar o forno imediatamente caso ocorra qualquer derrame, bem como em

intervalos regulares, dependendo do uso.

Selos de porta dos fornos devem ser inspecionados para verificação da

integridade e o forno checado para vazamento de radiação em intervalos

regulares.

5,15 Lavador de vidro

5.15.1 Descrição

Lavadores de vidro de laboratório são máquinas controladas eletronicamente

para lavagem geral de vidraria de laboratório, que podem ser programadas

para diferentes ciclos de lavagem e enxágue (por exemplo, água destilada ou

deionizada ou ácido).

Dispositivos para lavagem de pipetas de vidro são lavadores de vidro

projetados especialmente para limpar os orifícios estreitos de pipetas.

5.15.2 Uso

Muitos tipos de máquina de lavar vidro estão disponíveis, e estes são,

geralmente, instalados e utilizados de acordo com instruções do fabricante.


Verificar a eficácia da limpeza por inspeção visual e, em aplicações críticas,

realizar testes para assegurar que o vidro esta isento de substâncias inibidoras.

Resíduos alcalinos ou ácidos podem ser verificados por meio de uma solução

deindicador de pH, um pH dentro da faixa de 6,5 a 7,3 deve ser alcançado.

5.15.4 Manutenção




Revisão: 00

Programar manutenção regular, conforme especificado pelo fabricante, com

uma frequência adequada.

Manutenção mais frequente pode ser necessária para equipamentos muito

usados ou em áreas de águas duras.

5.16 Microscópio óptico

5.16.1 Descrição

Existem diferentes tipos de microscópio: binocular, monocular, com um sistema

de visualização por monitor, equipados com uma câmera de fluorescência, com

uma fonte de luz interna ou externa. Para exames bacteriológicos, objetivas de

10X (lente seco) a 100X (imersão em óleo e com mola turret) são usados para

obter uma ampliação total de 100 a 1000X. Microscopia de contraste de fase

também é de valor inestimável para o exame de "Preparações liquidas".

5.16.2 Uso

Configure o sistema ótico do microscópio de acordo com as instruções do

fabricante. O eixo óptico da luz da lâmpada de alta intensidade deve passar

pelo centro do condensador de sub-estágio, o deslizador e a lente objetiva pela

ocular para que aberrações esféricas e cromáticas não ocorram.

5.16.3 Manutenção

Siga as instruções do fabricante para o armazenamento, a limpeza e

manutenção. Evitar a condensação que ocorre quando a umidade é alta, pois

isso pode levar à deterioração da qualidade da lente.

Cada dia ou após o uso, remover o óleo das lentes de imersão e peças

relacionadas com o tecido da lente. Use um solvente recomendado pelo

fabricante. Regularmente remover da lente ocular a gordura causada por cílios.




Revisão: 00

O sistema óptico pode ser facilmente danificado, é desejável que a

manutenção seja feita de preferência pelo fabricante.

5.17 Bico de Bunsen ou incinerador de fio

5.17.1 Descrição

Bico de Bunsen produz uma chama nua estreita a partir de rede de gás ou

bujão. Variando a quantidade de ar misturado com o gás para controlar o grau

de calor produzido.

Incineradores de fio usam gás ou eletricidade para alcançar calor vermelho

sem uma chama para esterilizar alças ou agulhas usados para a manipulação

de culturas.

5.17.2 Uso

Um bico de bunsen é usado principalmente para a esterilização de alças de

metal e agulhas, trazendo-os ao calor vermelho e para outros pequenos itens

de equipamentos duráveis a chama - esterilizante.

O incinerador de fio é usado para esterilizar alças de metal e agulhas, e é

preferido ao manusear bactérias patogênicas, uma vez que evita respingos e

evita riscos de contaminação cruzada.

Queimadores a gás podem produzir muito calor e turbulência do ar no

laboratório.

Técnica de assepsia pode ser alcançada sem um queimador de gás, utilizando

materiais descartáveis. Em cabines de segurança biológica, o uso de

queimadores a gás deve ser evitado, pois podem interferir inaceitavelmente

com o fluxo laminar de ar. Neste caso, o uso de material descartável estéril é

recomendado.

5.17.3 Manutenção




Revisão: 00

Limpar e desinfetar regularmente bicos de bunsen e capas dos incineradores

de fio, especialmente se qualquer cultura microbiana tiver sido derramada

sobre os dispositivos.

5.18 Dispenser para meios de cultura e reagentes

5.18.1 Descrição

Um dispensador é um instrumento ou dispositivo utilizado para distribuir meios

de cultura e reagentes em tubos, frascos ou Placas de Petri. Tais dispositivos

variam de cilindros de medição simples, pipetas ou seringas manuais, até

seringas automáticas e bombas peristálticas programáveis por dispositivos

controlados eletronicamente, com uma entrega variável automática.

5.18.2 Uso

Equipamento limpo usado para distribuição de meios de cultura e reagentes

deve estar livre de substâncias inibidoras. Usar tubulação separada para meios

seletivos para minimizar o carreamento de tais substâncias.

Se a distribuição asséptica de meios de cultura estéreis e reagentes é

necessária, todas as partes do equipamento de dispensação em contato com o

produto devem ser estéreis.


A incerteza de medição do instrumento ou aparelho deve ser adequada para o

máximo de erro admissível no volume a ser dispensado, que não deve exceder

5% rotineiramente. O máximo de erro admissível em medição de volumes de

líquido de diluição usado para preparar diluições decimais é 2%.

Verifique volumes dispensados antes do uso inicial, depois, regularmente, de

acordo com um cronograma documentado, e sempre após os ajustes que

afetam o volume dispensado.




Revisão: 00

5.18.4 Limpeza e manutenção

Limpar a superfície externa do dispenser após cada utilização. Lavar e

enxáguar bem todas as partes do dispenser que entrarem em contato com o

produto e esterilizá-los se necessário para o uso em líquido estéril. Não utilizar

desinfetantes em superfícies que entrem em contato com o produto para ser

dispensado, pois podem transmitir propriedades inibidoras.

Todos os dispensadores automáticos deverão ser mantidos em boas condições

de manutenção, de acordo com as instruções do fabricante.

5.19 Vórtex

5.19.1 Descrição

Este instrumento facilita a mistura homogênea de meios líquidos (por exemplo,

diluições decimais e amostras de líquido para teste) ou suspensões de células

bacterianas em um líquido.

A mistura é alcançada por um movimento de rotação excêntrica do conteúdo

do tubo ou recipiente (produzindo um vórtex).

5.19.2 Uso

Pressione a base do tubo ou recipiente contendo o líquido a ser misturado

contra a cabeça do mixer. A velocidade de mistura é controlada pela variação

da velocidade do motor ou o ângulo de contato com a cabeça do mixer.

O operador deve assegurar que o derramamento não ocorra durante a mistura,

ajustando a velocidade quando necessário e segurando o tubo

aproximadamente um terço de seu comprimento abaixo do topo, a fim de ser

capaz de controlar melhor o tubo e, evitar que o líquido suba muito alto no tubo.

Precauções apropriadas devem ser tomadas para minimizar a libertação de

aerossóis ao abrir recipientes em agitação.




Revisão: 00


Mistura adequada é evidenciada pelo aparecimento de um vórtice em toda a

profundidade do líquido durante a operação de mistura.

5.19.4 Manutenção

Manter o equipamento limpo. Se ocorrer o derramamento, descontaminar o

equipamento usando um desinfetante de laboratório adequado.

5.20 Contador de Colônias

5.20.1 Descrição

Contador de colônias manual utiliza dispositivo de contagem acionadas por

pressão e, geralmente, dão uma indicação audível de cada contar e possuem

um visor digital da contagem geral. Elas podem ser simples dispositivos pen-

like ou podem consistir de um suporte iluminado com uma grade calibrada para

a placa e uma lente de aumento para ajudar na detecção de colônia.

Contadores de colônia eletrônicos automatizados, analisadores de

incorporadores de imagem, operam por uma combinação de sistemas de

hardware e software, incorporando o uso de uma câmera e um monitor.

5.20.2 Uso

Seguir as instruções do fabricante. Ajustar a sensibilidade de um contador

automático para garantir que todas as colônias serão contadas. Contadores

eletrônicos automatizados de colônia também exigem programação separada,

quando utilizado com diferentes tipos de agar e matrizes, e para a contagem

em spread plate e pour plate, para assegurar adequada discriminação de

colônias alvo.





Revisão: 00

Verificações devem ser feitas manualmente em uma base regular para

assegurar que as contagens precisas são obtidas utilizando um contador de

colônia.

Além disso, contadores de colônias automatizados devem ser verificados a

cada dia de utilização com uma placa de calibração contendo um conhecido

número de partículas contável ou colônias.

5.20.4 Manutenção

Manter o equipamento limpo e livre de poeira, evitar arranhar as superfícies

que são um elemento essencial do processo de contagem. Programar a

manutenção periódica de contadores eletrônicos que incorporam analisadores

de imagem como especificado pelo fabricante, em uma freqüência adequada.

5.21 Equipamento para cultura em atmosfera modificada

5.21.1 Descrição

Este pode ser um frasco que possa ser hermeticamente fechado ou qualquer

outro equipamento apropriado que permita condições de atmosfera modificada

(por exemplo, para anaerobiose) para ser mantido durante o tempo total de

incubação do meio de cultura. Outros sistemas de desempenho equivalente

tais como cabines de anaerobiose, podem ser usados.

Siga as instruções do fabricante para a instalação e manutenção.

5.21.2 Uso

A composição da atmosfera necessária pode ser obtida por meio da adição de

uma mistura de gases (por exemplo, de um cilindro de gás) após a saída do ar

do frasco, pelo deslocamento da atmosfera em uma cabine ou por qualquer

outro meio apropriado (como pacotes de gás disponível no mercado).




Revisão: 00

Em geral, incubação anaeróbica requer uma atmosfera de menos de 1% de

oxigênio, 9% a 13% de dióxido de carbono; incubação microaeróbica

(capnaeróbica) requer uma atmosfera de 5% a 7% de oxigênio e cerca de 10%

de dióxido de carbono.

Condições talvez precisem ser modificadas dependendo das exigências do

micro-organismo específico.


Coloque um indicador biológico ou químico para monitorar a natureza da

atmosfera em cada câmara durante cada uso. Crescimento da estirpe controle

ou uma mudança de cor do indicador químico verifica se as condições de

incubação apropriada foram alcançadas.

5.21.4 Manutenção

Se um catalisador é montado, deve-se regenerá-lo regularmente, em

conformidade com as instruções do fabricante. Se as válvulas estão instaladas,

limpar e lubrificar-las para garantir o funcionamento correto e substituir se

necessário.

Regularmente limpar e higienizar o equipamento.

5.22 Centrífuga

5.22.1 Descrição

Centrífugas são dispositivos operados mecânica ou eletronicamente que usam

a força centrífuga para separar partículas suspensas, incluindo micro-

organismos, a partir de fluidos.

5.22.2 Uso




Revisão: 00

Em algumas aplicações, a concentração de micro-organismos alvo é atingida

por centrifugação de amostras de líquido para promover a formação de um

deposito que pode ser ressuspendido em líquido e submetido a um exame

mais aprofundado.

Tomar as precauções necessárias para impedir a geração de aerossóis e

contaminação cruzada, pelo uso correto do equipamento e o uso de tubos de

centrifugação fechados e estéreis ou potes.


Onde a velocidade de centrifugação é crítica ou especificada no ensaio, utilizar

regularmente um indicador de velocidade e tacômetro calibrado independente,

e sempre após reparos ou modificações significativas.

5.22.4 Manutenção

Limpar e desinfetar centrífugas regularmente e após qualquer derrame

envolvendo culturas microbianas ou amostras potencialmente contaminadas.

Centrífugas devem ser sofrer manutenção regularmente.

5.23 Placa de aquecimento

5.23.1 Descrição

Placas de aquecimento são dispositivos de aquecimento controlados

termostáticamente. Alguns equipamentos incorporam sistemas de agitação

magnética.

5.23.2 Uso

Placas de aquecimento equipados com sistemas de agitação magnética são

utilizados para aquecimento de grande volumes líquidos, tais como meios.




Revisão: 00

Não use placas de aquecimento sem sistemas de agitação para a preparação

dos meios de cultura.

5.23.3 Manutenção

Limpar qualquer derrame logo que a unidade for resfriada.

5.24 Plaqueador espiral automático

5.24.1 Descrição

O plaqueador espiral automático é um equipamento que distribui um volume

predeterminado de líquido sobre a superfície de uma placa de ágar em rotação.

O braço de distribuição se move do centro do placa para a borda de fora,

formando uma Espiral de Arquimedes. O volume dispensado diminuí assim que

o dispensador de distribuição se move do centro para a borda da placa, de

modo que se forme uma relação inversa entre o volume depositado e o raio da

espiral. O volume da amostra dispensado em qualquer segmento específico é

conhecido e é constante. Uma fonte de vácuo é necessária para o

carregamento e distribuição de líquidos.

5.24.2 Uso

O equipamento é utilizado para dispensar uma amostra de líquido, uma

amostra homogeneizada ou uma diluição em uma placa de ágar adequada, a

fim de determinar a contagem de colônias. Após a incubação, as colônias se

desenvolvem ao longo das linhas onde o líquido foi depositado. O número de

colônias em uma área conhecida é contada usando uma grade de contagem

fornecido com o equipamento e a contagem calculada.

A superfície da placa de ágar usada como base deve ser reta e livre de bolhas

de ar.




Revisão: 00

As placas devem ser pré-secadas antes do uso para garantir que estão livres

do excesso de umidade.

O sistema de distribuição deve ser higienizado e lavado com água estéril antes

de cada amostra e após o uso.


Verificar o ângulo de ponta da caneta diariamente usando um vácuo para

segurar uma lamínula sobre a face da caneta. A tampa de deslizamento deve

ser paralela e a 1 mm da superfície do ágar.

O padrão de distribuição deve ser verificado por meio da supressão de tinta

lavável. O padrão espiral deve ser mais denso próximo ao centro do placa onde

a deposição começa e tornar-se cada vez menos denso, no ponto de saída da

caneta. A porção clara da placa deve ser central e com cerca de 2,0 cm de

diâmetro.

Uma verificação diária deve ser realizada para garantir que a ponta da caneta

esteja no ângulo correto para a superfície do ágar usando a tampa de

deslizamento e indicador de nível fornecido com o instrumento.

A esterilidade da placa espiral deve ser verificada por plaqueamento de água

estéril para cada série de amostras examinadas.

Uma verificação gravimétrica do volume de dispensados deve ser realizada

regularmente com água destilada. A massa obtida deve estar dentro de um

erro máximo admissível de +5% da massa esperada para o volume

dispensado.

5.24.4 Manutenção




Revisão: 00

Desinfecção da tubulação de distribuição e da caneta pode ser conseguida

através de lavagem com uma solução contendo 0,5% a 1% de cloro livre. Isto

deve ser seguido por enxágue com água destilada ou deionizada estéril.

Bloqueios podem ser evitados utilizando suspensões ou uma parcela do líquido

sobrenadante, para que todas as partículas sejam removidas antes da

colocação da suspensão da amostra.

Eventuais derrames devem ser removidos imediatamente e os equipamentos

limpos em uma base regular.

O equipamento deve ser reparado e verificado de acordo com o uso.

5.25 Destiladores, deionizadores e aparelhos de osmose reversa

5.25.1 Descrição

Estes dispositivos são usados para produzir água destilada ou deionizada/

desmineralizada com a qualidade exigida para a preparação de meios de

cultura microbiológicos ou reagentes de laboratório e para outras aplicações.

5.25.2 Uso

Instalar, autorizar e usar equipamentos em conformidade com as instruções do

fabricante, tendo em conta a localização da água de laboratório, resíduos e

serviços elétricos.


Água deve ser controlada regularmente, ou quando usada após o

armazenamento para condutividade satisfatória, e não será mais de 25 μS/cm

(equivalente a uma resistividade > 40 000Ω cm) para o preparo de meios e

reagentes.




Revisão: 00

Se a água é armazenada antes do uso ou produzida através de um trocador de

íons, controles adequados de contaminação microbiana devem ser realizados

em conformidade com o POP MET MC 001.

5.25.4 Manutenção

Destiladores devem ser limpos e descalcificados com uma freqüência

dependente da dureza da água de entrada. Deionizadores e aparelhos de

osmose reversa devem ser mantidos de acordo com as instruções do

fabricante.

5.26 Temporizadores e dispositivos de temporização (timer)

5.26.1 Descrição

Dispositivos de temporização e temporizadores integrais são instrumentos que

permitem que o período de tempo correto seja usado para muitas aplicações

no laboratório, onde a duração é especificada e crítica.

5.26.2 Uso

Timer analógico ou digital, portátil ou de bancada são usados para monitorar a

duração das operações de laboratório (Por exemplo, aplicação de manchas de

filmes microbianos, homogeneização das amostras) devem estar em boas

condições de funcionamento e capazes de alcançar a precisão exigida.

Operar timer integrado sobre equipamentos de laboratório (por exemplo,

autoclaves, centrífugas, homogeneizadores), em conformidade com as

instruções do fabricante. Estes temporizadores devem ser capazes de alcançar

a precisão exigida.





Revisão: 00

Verifique todos os temporizadores utilizados nas operações de laboratório,

onde a duração é fundamental para o resultado, com outro marcador de tempo

regularmente, e após reparos significativos.

5.26.4 Manutenção

Limpar e verificar regularmente o timer para o funcionamento correto.

Dispositivos de tempo integral devem ser verificados como parte do

procedimento de manutenção para o instrumento.

5.27 Pipetas e pipetadores

5.27.1 Descrição

Pipetas são dispositivos de vidro ou de plástico descartáveis usados para

fornecer volumes de materiais líquidos ou viscosos; pipetas graduadas

entregam volumes medidos com uma precisão que depende da especificação.

Pipetadores automáticos (mecânicos) equipados com pontas de plástico são

dispositivos que dispensam volumes fixos ou ajustáveis de líquidos,

manualmente ou por ação de pistão operado eletronicamente.

5.27.2 Uso

Descartar pipetas que estão danificadas ou quebradas.

Pipetas Pasteur estéreis ou pipetas graduadas e ponteiras devem ser

equipadas com uma ficha de lã de algodão não-absorvente para evitar

contaminação quando usado para manipular culturas microbianas.

Não executar pipetagem com a boca em instalações microbiológicas, exceto

para líquidos não-contaminados.




Revisão: 00

Bulbos usados em pipetas Pasteur ou pipetas graduadas e em ponteiras para

pipetadores automáticos devem ser do tamanho correto para evitar saída de

liquido e garantir um funcionamento eficiente.


Verificar se as pipetas graduadas entregam o volume correto, se o fabricante

não certificar a sua exatidão (veracidade e precisão).

Testar os pipetadores novos antes de entrar em uso, e em intervalos regulares,

dependendo da freqüência e natureza de uso, para confirmar que estão em

acordo com os erros máximos admissíveis definidos em norma específica.

Executar checagem gravimétrica intermediária usando água destilada ou

deionizada para garantir que os volumes dispensados permanecem dentro dos

erros máximos admissíveis.

Confira novos lotes de pipetas graduadas.

5.27.4 Manutenção

Descontaminar e limpar/ esterilizar apropriadamente pipetas não-descartáveis

e pipetadores automáticos, após cada uso.

Se os barris ou pistões de pipetadores automáticos se contaminarem em uso,

desmontá-los para descontaminação e limpeza. Após a montagem, recalibrá-

los. Quando não for possível que isso seja feito em laboratório, retornar o

pipetadores ao fabricante para a montagem e recalibração.

5.28 Termômetros e dispositivos de monitorização da temperatura,

incluindo aparelhos de registro automático

5.28.1 Descrição

Termômetros são dispositivos de mercúrio ou álcool em vidro que são usados

para monitorar temperaturas em toda a gama de atividades de laboratório.




Revisão: 00

Outros dispositivos de monitorização da temperatura incluem termômetros de

resistência de platina e os instrumentos que usam termopares para medir

temperatura e fornecer um registro visual, impresso ou eletrônico de

temperatura com variação do tempo.

Termômetros de referência e outros dispositivos de monitorização da

temperatura devem ser calibrados para padrões nacionais ou internacionais e

certificada como tal. Eles devem ser utilizados apenas como referência e não

deve ser utilizado para o monitoramento de rotina.

Termômetros de trabalho e outros dispositivos de gravação de temperatura

devem ser calibrados de forma que permita rastreabilidade a padrões nacionais

ou internacionais.

Dispositivos de precisão adequados, que estejam em conformidade com uma

especificação internacional ou nacional podem também ser usados como

termômetros de trabalho após verificação da sua performance.

5.28.2 Uso

Termômetros e outros dispositivos de monitorização da temperatura devem ser

capazes de medir a temperatura requerida por um aplicativo dentro de

determinados erros máximos admissíveis.

A incerteza de medição do dispositivo de monitoramento de temperatura deve

ser quatro vezes menor do que o alcance do erro máximo admissível solicitado.

Por exemplo, para um erro máximo permissível de +1°C, a incerteza de

medição deve ser de +0,25°C, para um erro máximo permissível de +0,5°C, a

incerteza de medição deve ser de ± 0,125°C. A incerteza de medição da

calibração do termômetro de referência também deve levar em conta a

determinação da temperatura de funcionamento.

Termômetros ou termopares colocados em incubadoras de ar devem ser

protegidos em recipientes adequados cheio de glicerol, parafina líquida ou




Revisão: 00

polipropilenoglicol para proteger contra a perda de calor quando a porta é

aberta e fornecer uma leitura estável.

Usar termômetros de imersão total com apenas o bulbo imerso.

Termômetros colocados em banhos-maria devem ser imersos na água, em

conformidade com as especificações individuais, por exemplo, imersão parcial

termômetros devem ser imersos na profundidade especificada para esse

termômetro, por exemplo, 76 mm ou 100 mm.

Não usar termômetros se a coluna de mercúrio ou álcool estiver quebrada.

Termômetros de mercúrio em vidro são frágeis e, se houver um risco de

quebra, eles devem ser colocados dentro de dispositivos de proteção que não

interferem com as medições de temperatura.

AVISO - O mercúrio é perigoso para a saúde. Remover derrames, em

conformidade com regulamentos da legislação nacional.


Termômetros de referência devem ser calibrados em todos os pontos com

padrões rastreáveis nacionalmente ou internacionalmente, antes do uso inicial

e pelo menos a cada 5 anos. Verificação intermediária de um único ponto de

calibração (por exemplo, ponto de gelo) deve ser realizada para verificar o

desempenho.

Termopar de referência deve ser totalmente calibrado com padrões rastreáveis

nacionalmente ou internacionalmente, antes do uso inicial e de acordo com

instruções do fabricante. Verificações intermediárias são efetuadas com um

termômetro de referência para verificar o desempenho.

Outros dispositivos de monitorização da temperatura (como receptores de

ondas de rádio) devem ser calibrados com padrões rastreáveis de acordo com




Revisão: 00

normas nacionais ou internacionais, em conformidade com as instruções do

fabricante.

Termômetros de trabalho e termopares devem ser verificados no ponto de gelo

e / ou com um termômetro de referência na faixa de temperatura de trabalho.

5.28.4 Manutenção

Manter termômetros e termopares em bom estado de limpeza.

Manter outros dispositivos de monitorização da temperatura de acordo com as

instruções do fabricante.

5.29 Separador imunomagnético

5.29.1 Descrição

Este equipamento é usado para separar e concentrar micro-organismos alvo

em culturas líquidas por meio de esferas paramagnéticas revestidas com um

anticorpo apropriado.

Separador manual consiste de um misturador rotativo capaz de ir de 12 RPM a

20 RPM, e um concentrador de partículas com uma barra magnética removível.

Separadores automáticos usam matrizes de barras magnéticas e suportes de

tubos. As partículas magnéticas mudam de tubo para tubo e permitem que o

processo inteiro de separação, incluindo as etapas de lavagem, possa ser

executado automaticamente em um ambiente fechado.

5.29.2 Uso e verificação

Siga as instruções do fabricante para uso e aquelas dadas em normas

específicas (por exemplo, E. coli O157).

Para o sistema manual, verificar a velocidade de rotação do misturador.




Revisão: 00

Para sistemas manuais e automatizados, verifique se o sistema é capaz de

isolar em baixos níveis o micro-organismo alvo antes de colocá-lo em uso

rotineiro.

É importante valorizar o potencial de contaminação cruzada durante os

procedimentos de separação manual e tomar as medidas adequadas para

evitar que isso aconteça.

5.29.3 Manutenção

Inspeção e manutenção do equipamento de acordo com as instruções do

fabricante.

5.30 Sistema de filtragem

O sistema de filtração utilizado deve ser como descrito no POP MET MIC 003

ITEM XII.

5.31 Outros equipamentos e software

Outro equipamento e seu software associado deverão ser capazes de alcançar

a precisão necessária e deve estar em conformidade com as especificações

relevantes para os testes em questão. Programas de calibração devem ser

estabelecidos para quantidades ou valores fundamentais em que essas

propriedades têm um efeito significativo sobre o resultado. Antes de uso

rotineiro, calibrar ou verificar o equipamento para comprovar que ele atende

aos requisitos do laboratório e está em conformidade com as especificações

padrão. Quaisquer reconfigurações ou modificações feitas pelo laboratório para

o software devem ser verificadas para garantir que o software modificado de o

resultado correto.

6.0 PREPARAÇÃO DE MATERIAIS DE VIDRARIA DE LABORATÓRIO E OUTROS

6.1 Preparação




Revisão: 00

Vidro e materiais de laboratório utilizadas em microbiologia devem ser de

projetos adequados, utilizados de forma adequada e preparados de modo a

garantir a sua limpeza e/ ou esterilidade até o momento do uso.

Deve ser projetado para evitar ou limitar o contato entre o operador e o material

infectante.

Tubos e garrafas devem ser fechados pelos meios adequados. Se necessário

vidros a serem esterilizados (pipetas, por exemplo) devem ser colocados em

recipientes especiais ou envolto em um material apropriado (papel especial,

papel alumínio, etc.) Vidraria para ser autoclavada vazia deve permitir o acesso

livre de vapor, caso contrário, a esterilização não será alcançada.

6.2 Esterilização / descontaminação

6.2.1 Geral

A temperatura e a duração da esterilização / descontaminação devem ser

registradas. Indicadores de esterilização podem ser usados para distinguir

entre materiais esterilizados e não esterilizados.

6.2.2 Esterilização por calor seco

Aquecer vidros, etc, em um forno de esterilização por pelo menos 1 hora a

170°C ou equivalente.

6.2.3 Esterilização por calor úmido (vapor)

Vapor úmido sob pressão é o método mais eficaz de esterilização de vidraria

de laboratório e materiais.

A temperatura da câmara de autoclave deve ser mantida em 121°C por pelo

menos 15 min (ver 5.6).

6.2.4 Descontaminação com compostos químicos




Revisão: 00

Use compostos químicos (por exemplo, produtos à base de cloro, álcoois,

compostos quaternários de amônio) em concentrações adequadas e por um

tempo de contato adequado.

Assegurar que os resíduos químicos não afetará a recuperação de micro-

organismos.

6.3 Equipamentos e materiais descartáveis

Equipamentos e materiais descartáveis podem ser usados em vez de

equipamentos e materiais reutilizáveis (vidro, placas de Petri, pipetas, frascos,

tubos, alças, espalhadores, etc), se as especificações forem semelhantes.

É aconselhável verificar se tal equipamento é adequado para uso em

microbiologia (em especial no que diz respeito à sua esterilidade) e que o

material não contém substâncias que inibem o crescimento de micro-

organismos.

6.4 Armazenamento de objetos de vidro limpo e materiais

Proteger os vidros limpos e materiais contra a poeira durante o

armazenamento, em condições que irá manter a sua limpeza.

6.5 Gerenciamento de objetos de vidro esterilizado e materiais

Armazenar vidro e materiais em condições que garantam que eles

permaneçam estéreis. Armazenar equipamento de uso único, de acordo com

as instruções do fabricante, sem qualquer deterioração da embalagem.

Armazenar equipamentos de preparo de laboratório em condições limpas.

Quando o equipamento esterilizado é destinado para microbiologia, coloque

uma data de validade (ou data de fabricação) em cada pacote.

6.6 Uso de descontaminação e desinfecção




Revisão: 00

6.6.1 Descontaminação de equipamentos descartáveis

Descontaminar material descartável antes da sua eliminação.

Além dos métodos descritos nesta cláusula, a incineração pode ser usada. Se

houver um incinerador no local, descontaminação e descarte podem ser

realizados em uma única operação.

6.6.2 Descontaminação de artigos de vidro e materiais antes da sua

utilização

Em geral, a esterilização dos equipamentos deve ser feito por calor úmido (ver

6.2.3) ou calor seco (ver 6.2.2).

Em certas situações (por exemplo, amostragem de campo), descontaminação

química pode ser apropriada. Após o tratamento, os equipamentos devem estar

livres de substâncias inibidoras.

6.6.3 Descontaminação de artigos de vidro e materiais após o uso

Materiais para descontaminação e eliminação devem ser colocados em

recipientes, por exemplo, sacos de plástico autoclavável. Autoclavagem é o

método preferido para todos os processos de descontaminação (pelo menos 30

min a 121°C). A autoclave deve ser carregada de uma maneira que favoreça a

penetração do calor para a carga (por exemplo, sem excesso de embalagem) e

tendo o cuidado de soltar tampas / abrir sacos.

Método alternativo, que não a autoclave, pode ser usado se for permitido pelos

regulamentos nacionais.

Autoclave todos os equipamentos que tenham estado em contato com culturas

microbiológicas (meios de cultura sólidos ou líquidos), incluindo frascos

reutilizáveis antes de serem lavados.




Revisão: 00

Durante o exame, descontaminação por imersão em desinfetante preparada

recentemente use a diluição para equipamentos pequenos e equipamentos

resistentes à corrosão (pipetas, por exemplo).

Use pipetas Pasteur apenas uma vez.

A maioria dos desinfetantes (ver Anexo A) possuem alguns efeitos tóxicos. Use

luvas e óculos de proteção quando manusear desinfetante concentrado.

6.7 Gestão de resíduos

O descarte correto de material contaminado não afeta diretamente a qualidade

da análise da amostra, mas é uma questão de gestão de laboratório.

Deve estar de acordo com normas nacionais ambientais, de saúde e de

segurança.

Um sistema para a identificação e separação de materiais contaminados e

suas embalagens devem ser estabelecidos

- para lixo não contaminado (por exemplo, amostras de alimentos não

inoculadas) que pode ser descartado no lixo em geral,

- bisturis, agulhas, facas, vidro quebrado,

-material contaminado para autoclavagem e reciclagem, e

- material contaminado para autoclave e eliminação, ou para eliminação

somente se o material for ser incinerado (ver, No entanto, os requisitos

especiais para o risco de categoria 3 micro-organismos abaixo).

Incineração de materiais contaminados e seus recipientes devem ser

realizados em conformidade com a legislação nacional ambiental, de saúde e

de segurança.




Revisão: 00

Materiais contaminados com micro-organismos de categoria risco de 3 e seus

recipientes devem ser autoclavados antes de serem incinerados.

6.8 Lavagem

Lavar equipamentos reutilizáveis somente depois de ter sido

descontaminados. Após a lavagem, enxágüe todo o equipamento com água

deionizada.

Equipamentos especializados podem ser usados para facilitar as operações de

limpeza (por exemplo, uma máquina de lavar pipeta, máquina de lavar louça,

através de ultra-som).

Após a lavagem, equipamentos reutilizáveis devem estar livres de resíduos que

possam afetar o crescimento subseqüente de micro-organismos.

7.0 PREPARAÇÃO E ESTERILIZAÇÃO DE MEIOS DE CULTURA

Preparar e esterilizar meios de cultura, de acordo com as instruções do POP

MET MC 001.

8.0 AMOSTRAS DE LABORATÓRIO

8.1 Amostragem

8.1.1 Geral

Embora extremamente importante para a interpretação dos resultados,

amostragem e planos de amostragem não são uma parte desta Norma. É

importante que o laboratório receba uma amostra representativa do lote do

produto que não tenha sido danificada ou alterada durante o transporte e

armazenamento.

A amostra deve ser protegida contra a contaminação pelo ar esterno, o

recipiente da amostra, os dispositivos de amostragem usados e o manuseio

inadequado. Um recipiente da amostra não deve ter mais de três quartos do




Revisão: 00

produto, a fim de evitar vazamentos e para permitir uma boa mistura da

amostra no laboratório.

Identificar amostras de forma clara e completa, e gravar a informação da

amostra.

Freqüentemente, a temperatura no momento da coleta e após o recebimento é

útil para o laboratório para a interpretação de resultados.

A amostra deverá ser apresentada na embalagem original, sem abrir.

Se o produto é volumoso ou em um recipiente grande demais para o envio para

o laboratório, transferir uma parcela da amostra assepticamente para um

recipiente estéril.

O recipiente da amostra estéril deve ser aberto apenas no tempo suficiente

para permitir que a amostra seja transferida e fechada imediatamente depois.

8.1.2 Plano de amostragem

O laboratório não realiza a amostragem dos produtos.

8.2 Transporte

O modo de transporte das amostras para o laboratório deve assegurar que eles

são mantidos em condições que irá minimizar qualquer alteração no número de

microorganismos presentes.

Entregar amostras para o laboratório imediatamente com as condições de

armazenamento original mantida tanto quanto possível.

A amostra deve ser acondicionada de modo a que a ruptura ou derrame seja

evitado.

O rótulo do produto deve indicar se a refrigeração é necessária.




Revisão: 00

Amostras que não exigem refrigeração ou congelamento podem ser

acondicionadas em um recipiente que use material de embalagem adequado

para evitar a quebra.

Não use gelo solto, pois isso pode causar contaminação do produto, se houver

quebra de recipiente ou vazamentos.

Salvo disposição em contrário ao POP MET MIC 002 as seguintes

temperaturas durante transporte são recomendadas:

- produtos estáveis: temperatura ambiente (abaixo de 40°C);

- produtos congelados ou ultracongelados: abaixo de -15°C, de preferência

abaixo de -18°C;

- outros produtos não estáveis à temperatura ambiente: 1°C a 8°C;

- amostras de swab: ver ISO 17604.

Quando não há condições especificadas, é recomendável que as partes

envolvidas concordem com a duração e a temperatura de transporte.

8.3 Recebimento

Verificar as condições das amostras no recebimento.

Se sua condição não é satisfatória ou se as amostras são insuficientes, o

laboratório deve recusar amostras.

Em circunstâncias especiais, podem ser testados, após discussão e acordo

com o cliente.

No entanto, o relatório de ensaio deve incluir reservas sobre a validade dos

resultados.




Revisão: 00

Documentar as amostras admitidas no laboratório de tal maneira que o seu

progresso até o momento da elaboração do relatório de ensaio possa ser

monitorado. A identidade e codificação das amostras e os registros devem

assegurar rastreabilidade em todas as fases no laboratório.

Se necessário, as superfícies externas das embalagens podem ser

desinfetadas com um desinfetante apropriado.

Verifique os recipientes de amostra para defeitos físicos evidentes.

Observe as seguintes informações:

- data (e hora, se for o caso) de recepção;

- detalhes da amostragem (data de amostragem e do tempo, se a condição de

amostra relevante e conhecida);

- nome do cliente e endereço.

Após a recepção de amostras perecíveis, registrar a temperatura de transporte

ou a temperatura de uma amostra simulada incluída para este fim.

Examine as amostras o mais rapidamente possível após a recepção, de

preferência no prazo de 24 h, ou conforme acordado entre as partes.

Para produtos altamente perecíveis (como crustáceos), os testes devem

começar no prazo de 24 h de amostragem. Para produtos perecíveis (tais como

peixes, leite cru), o teste deve começar dentro de 36 h.

Se os prazos dos testes mencionados acima não puderem ser respeitados, as

amostras podem ser congeladas a abaixo de -15 ° C, de preferência -18 ° C,

desde que tenha sido demonstrado que a recuperação do micro-organismo

alvo(s) não é significativamente prejudicada.

8.4 Armazenamento




Revisão: 00

Armazene as amostras à espera do ensaio em condições que irá minimizar

qualquer alteração no número de micro-organismos presentes.

As temperaturas de armazenamento seguintes são recomendadas:

- produtos estáveis: temperatura ambiente (18 °C a 27 °C);

- produtos congelados ou ultracongelados: abaixo de -15 °C, de preferência

abaixo de -18 °C;

- outros produtos não estáveis à temperatura ambiente, incluindo alimentos

estragados: 3 °C 2 °C (ver POP MET MIC 002);

- amostras de swab: ver ISO 17604.

8.5 Porção de teste

8.5.1 Regras específicas para a tomada de porções para ensaio

Referem-se ao POP MET MIC 002 responsável pelas regras específicas da

retirada da porção de ensaio e preparação da suspensão e homogeneização

inicial.

8.5.2 Conservação e destruição de amostras de laboratório

Exceto em casos especiais, manter as amostras de laboratório até que todos

os resultados tenham sido obtidos, ou por mais tempo, se necessário, embalá-

las em um recipiente estéril (por exemplo, um saco plástico) e armazená-los

em sua temperatura de armazenamento original.

Produtos perecíveis devem ser congelados.

NOTA: Não é normalmente aceita a prática de retestar as amostras, devido a

possíveis mudanças no status microbiano.




Revisão: 00

9.0 EXAME

9.1 Precauções de higiene durante a análise

Para evitar a contaminação do meio ambiente e das porções de teste,

manipular produtos em pó (desidratados) em uma sala ou área separada, ou

em uma cabine de segurança biológica.

Antes de abrir amostras comuns, passe álcool 70% (em volume) (ou outro

produto equivalente) ao redor do ponto de abertura previsto e deixe evaporar.

Antes de abrir embalagens esterilizadas, mergulhe a área a ser aberta em uma

solução contendo de 100 ppm a 200 ppm de cloro livre (ou outro esterilizante

adequado) por menos 10 min para destruir micro-organismos que possam

contaminar a amostra.

Qualquer instrumento utilizado para abrir a embalagem e retirar a totalidade ou

parte da amostra (abridor de latas, tesoura, colher, pinças, pipetas, etc) devem

ser esterilizados.

A área de trabalho adjacente deve ser limpa com um desinfetante apropriado

antes do início dos testes.

As mãos devem ser lavadas imediatamente antes de começar os testes e

novamente durante os testes se forem contaminadas.

Todos os instrumentos utilizados devem ser esterilizados e protegidos da

exposição à contaminação antes e durante o uso.

Todos os instrumentos e ferramentas utilizadas devem ser colocados em um

recipiente adequado para posterior eliminação ou esterilização.

Tomar precauções para que o trabalho seja realizado, na medida do possível,

sob condições assépticas. Por exemplo:




Revisão: 00

a) certificar-se que a área de trabalho seja limpa, que todas as possíveis fontes

de contaminação sejam removidas ou reduzidas ao mínimo e que não haja

correntes de ar (ou seja, que as portas e janelas estejam fechadas), e evitar a

movimentação desnecessária de pessoal durante o exame;

b) antes e depois do trabalho, descontaminar a superfície de trabalho com um

desinfetante apropriado;

c) antes de começar, certifique-se que tudo que é necessário para a realização

do trabalho (e apenas isso) esteja disponível;

d) realizar o trabalho sem demora;

e) separar as atividades por tempo ou local em "limpa" e "suja" (isto é

particularmente importante com alto risco amostras, como carne crua e ovos

crus);

f) usar equipamentos descartáveis;

g) se todo o conteúdo de um maço de pipetas descartáveis, placas de Petri,

etc, não for utilizado durante o curso de um exame, certificar-se que a

embalagem está bem fechada após remoção do número apropriado de

unidades;

h) limpar imediatamente qualquer derramamento, por meio de almofadas de

algodão ou qualquer outro material apropriado impregnado com 70% (em

volume) de álcool ou qualquer outro desinfetante apropriado1), em seguida,

limpar e desinfetar a superfície de trabalho antes de continuar;

i) usar cabine de segurança para o manuseio de produtos susceptíveis de

conter bactérias patogênicas, se recomendado por regulamentação nacional;




Revisão: 00

j) ao remover uma pipeta estéril de uma embalagem, não permita que a ponta

toque a superfície externa das pipetas restantes, pois tais superfícies estão

sujeitas à contaminação;

k) não permitir a pipeta tocar as bordas ou gargalos de garrafas de diluição.

1) Quando outros desinfetantes alem do álcool 70% (em volume) são usados,

os tempos de contato apropriado, de acordo com a instruções do fabricante,

são necessários para a desinfecção eficaz.

Os aerossóis são uma das principais causas de contaminação ambiental e de

infecção. Aerossóis podem ser formados por exemplo:

- ao abrir placas de Petri, tubos e frascos;

- quando se utilizar shakers, seringas, centrífugas, etc;

- ao esvaziar pipetas;

- ao esterilizar alças de inoculação ou agulhas;

- quando abrir ampolas contendo culturas liofilizadas.

Sua formação deve, portanto, minimizada.

9.2 Preparação da suspensão inicial e diluições

9.2.1 Geral

Prepare a suspensão inicial e diluições, de acordo com a parte relacionada no

POP MET MIC 002. O tempo que decorre entre o final da preparação da

suspensão inicial e o momento em que o inóculo entra em contato com o meio

de cultura não deve exceder 45 minutos, a não ser especificamente

mencionado em normas internacionais pertinentes.




Revisão: 00

A suspensão inicial e as etapas de diluições podem ser seguidas por uma

etapa de enriquecimento, conforme descrito em normas específicas.

9.2.2 Concentração

9.2.2.1 Centrifugação ou filtração por membranas

Se for necessária a contagem de números baixos de micro-organismos, a

enumeração pode ser melhorada, tanto em termos de sensibilidade e precisão,

através da introdução de um teste de concentração de porção. Esta

concentração pode ser obtida por centrifugação ou filtração por membranas.

Se estiver usando a centrifugação, ressuspender o depósito centrifugado em

um volume conhecido de diluente e continuar a análise.

Para cada combinação (alimentos mais micro-organismo) considerar, realizar

um estudo prévio para demonstrar quando se deve fazer teste de concentração

de porção.

A filtrabilidade de suspensões de alimentos deve ser avaliada.

O desempenho do método global, em termos de sensibilidade, seletividade,

linearidade e repetibilidade, devem ser verificados.

Se o nível de contaminação é desconhecido, o método padrão (sem filtração)

deve ser conduzido em paralelo.

9.2.2.2 Imunosseparação

Se os números baixos de micro-organismos alvo estão presentes na amostra,

separação e concentração de micro-organismos podem ser alcançadas com

esferas imunomagnéticas revestidas com anticorpos específicos.

Espalhe as esferas, juntamente com os micro-organismos alvo capturado,

diretamente no meio sólido específico em acordo com as normas específicas.




Revisão: 00

No entanto, verifique se as esferas imunomagnéticas revestidas com os

anticorpos específicos utilizados para esta etapa de concentração são

adequadas, como mostrado por estudos de avaliação publicado na literatura

científica internacional, de preferência relacionados com microbiologia

alimentar.

10.0 ENUMERAÇÃO

10.1 Geral

Ao avaliar a qualidade microbiológica e/ou segurança de alimentos e alimentos

para animais, muitas vezes saber se os micro-organismos estão presentes não

é suficiente para. Na maioria dos casos, o aspecto quantitativo é igualmente

importante, o que traz a necessidade de enumerar micro-organismos. Isto pode

ser conseguido de várias maneiras: através de exame direto (microscopia),

através da inoculação em meio sólido ou líquido, por citometria de fluxo, por

reação em cadeia da polimerase em tempo real, etc. No entanto, esta Norma

só cobre enumeração em meios sólidos e líquidos.

Enumeração em meios sólidos se baseia na capacidade de muitos micro-

organismos para produzir colônias no interior ou na superfície de ágar, que

pode ser reconhecido como tal a olho nu ou com o auxílio de uma lupa simples.

No entanto, se a matriz contém muitas partículas que podem interferir com a

detecção de colônias, ou se o nível de bactérias é muito baixo, este princípio

não pode ser utilizado sem antes se separar os micro-organismos alvos da

matriz (por exemplo, por filtração ou imunosseparação). Nesses casos,

enumeração com meios líquidos é muitas vezes uma alternativa mais

adequada.

10.2 Enumeração usando um meio sólido

10.2.1 Geral




Revisão: 00

Placa de Petri deve ser rotulada com o número da amostra, diluição, data e

qualquer outra informação desejada.

Diluições devem ser selecionadas para garantir que as placas obtenham o

número apropriado de colônias (ver 10.3.1) e elimine qualquer possibilidade de

propriedades inibidoras.

Usar uma pipeta estéril para transferências de cada diluição, salvo se trabalhar

a partir da maior diluição para a menor diluição.

10.2.2 Número de placas de Petri por diluição

Para as técnicas de enumeração em microbiologia alimentar, duas placas

devem ser utilizadas de acordo com o POP MET MIC 003 ITEM XII.

10.2.3 Técnica de pour plate

10.2.3.1 Geral

Retirar os volumes definidos da diluição a ser examinada, tocando a ponta da

pipeta contra o lado do tubo para remover o excesso de líquido que aderirem

ao exterior. Levante a tampa da placa de Petri estéril apenas alto o suficiente

para inserir a pipeta, em seguida, dispensar o conteúdo. Despeje agar fundido

a 44°C a 47°C em cada placa de Petri 2). Evite derramar o meio fundido

diretamente sobre o inóculo. Imediatamente misture o meio derretida e o

inóculo cuidadosamente de modo a obter uma distribuição homogênea dos

micro-organismos dentro do meio. Permitia o esfriamento e solidificação,

colocando a placa de Petri sobre uma superfície fria horizontal (o tempo de

solidificação do Agar não pode exceder 10 minutos).

Depois de retirar agar temperado do banho-maria, seque a garrafa com uma

toalha limpa para evitar a água de contaminar as placas. Evite derramar o meio

do lado de fora da embalagem ou no interior da tampa da placa quando vazar.




Revisão: 00

Isto pode exigir que se segure a garrafa em uma posição quase horizontal, ou

evitando o ajuste da garrafa entre os passos derramamento.

Se existir a possibilidade da presença de colônias invasoras que façam

espalhamento (por exemplo, Proteus spp.). Está previsto que a placa a ser

examinada, possa ser coberta com ágar não nutritivo estéril ou Ágar idêntico ao

meio de cultura utilizado no teste 3), para evitar ou minimizar o espalhamento.

2) Geralmente 18 a 20 ml de Ágar em 90 milímetros placas de Petri, para obter

pelo menos 3 mm de espessura.

3) Geralmente 5 ml de Ágar em 90 milímetros placas de Petri.

10.2.4 Inoculação em superfície

10.2.4.1 Geral

Métodos de plaqueamento projetado para produzir apenas colônias de

superfície em placas de Agar têm certas vantagens sobre o método de placa

derramar. A morfologia de colônias de superfície é facilmente observada,

melhorando a habilidade do analista para distinguir entre diferentes tipos de

colônia.

Micro-organismos não são expostos ao calor do meio Ágar derretido, de modo

contagens mais altas podem ser obtidas.

Usar placas com pelo menos 3 mm de espessura do meio de Ágar, com

superfície lisa, e livres de bolhas de ar e umidade na superfície.

Para facilitar a disseminação uniforme, a superfície do Ágar solidificado deve

ser seca em conformidade com o POP MET MC 001 de forma que o inóculo

seja absorvido dentro de 15 min.

10.2.4.2 Método Spread-plate com alça de Drigalski




Revisão: 00

Usando uma pipeta estéril, transferir o inóculo (geralmente 0,1ml ou 0,5ml) da

amostra teste líquida ou da suspensão inicial, no caso de outras amostras para

a placa de ágar (90 mm ou 140 mm de diâmetro, respectivamente). Repetir

este passo para a diluição decimal seguinte (as colônias para serem contadas,

deverão, estar presente em uma etapa de diluição de 10-1, no caso de material

da amostra de líquida e 10-2, no caso de amostra de outro material) e, se

necessário, repetir o procedimento para outras diluições decimais.

Se for necessário para detectar baixas contagens microbianas no caso de

certos produtos, o limite de detecção pode ser aumentado em um fator de 10,

analisando 1,0 ml da amostra no caso de produtos líquidos e 1,0 ml da

suspensão inicial no caso de outros produtos. Para esse fim, 1,0 ml do inóculo

é espalhado ou sobre a superfície de uma placa de Petri grande (140 mm de

diâmetro) ou sobre as superfícies de três pequenos placas de Petri (90 mm de

diâmetro).

Usando uma alça de Drigalski feita de vidro, plástico ou aço (por exemplo feito

de um bastão de vidro e em forma um taco de hóquei sobre 3,5 mm de

diâmetro e 20 cm de comprimento, dobrados em ângulo reto em cerca de 3 cm

de um lado e achatado nas extremidades por aquecimento), espalhar o inóculo

o mais rápido possível uniformemente sobre a superfície do ágar sem tocar as

paredes laterais da placa de Petri. Permitir que o inóculo seja absorvido na

placa com as tampas no lugar por cerca de 15 min à temperatura ambiente.

Em certos casos (como indicado em normas internacionais pertinentes), o

inóculo pode ser depositado em uma membrana, e espalhada em seguida,

como descrito anteriormente.

10.2.4.3 Método do plaqueamento em Spiral

10.2.4.3.1 Geral




Revisão: 00

O método do plaqueamento em espiral para determinar o nível de micro-

organismos foi testado em ensaios interlaboratoriais com leite, produtos lácteos

e outros tipos de alimentos.

O equipamento utilizado – o plaqueador espiral automático - é descrito em

5.24.

10.2.4.3.2 Preparação da placa de ágar

Um dispensador automático com um sistema de entrega estéril é recomendado

para a preparação de placas de ágar, para garantir que as placas estão

niveladas.

Despeje a mesma quantidade de Ágar em todas as placas para que a mesma

altura do ágar seja dispensada a fim de manter o ângulo de contato correto.

Alternativamente, preparados de placas de ágar pronto para uso podem ser

usadas.

10.2.4.3.3 Processo de plaqueamento e contagem

Descontaminar a ponta da caneta e tubos puxando primeiro uma solução de

hipoclorito de sódio (ver 5.24.4) e depois água esterilizada através do sistema,

antes de tirar a amostra líquida para a caneta.

Colocar uma placa previamente derramada com ágar, na plataforma giratória

inferior a caneta. A amostra é diferencialmente dispersada conforme a ponta da

caneta passa na superfície da placa de ágar rotativo. Remover a placa

inoculada e devolver a caneta para sua posição inicial. Descontaminar a caneta

e carregar para a inoculação de uma outra placa.

Após a incubação, colocar a grade de contagem da placa espiral central no

lugar. Use a regra de 20 contagens para determinar a contagem. Escolher

qualquer fatia e começar a contar as colônias a partir da borda externa do




Revisão: 00

primeiro segmento em direção ao centro, até que 20 colônias sejam contadas.

Completar através da contagem de colônias remanescentes na segmento a

partir da vigésima colônia. Contar uma área correspondente no lado oposto da

placa e dividir o número de colônias contadas em ambos os lados pelo volume

de amostra depositada nestas duas áreas. O volume de amostra associado a

cada parte da grade de contagem é dado no manual operacional que

acompanha cada plater espiral.

10.2.5 Incubação

Salvo recomendação contrária em normas específicas, inverter imediatamente

as placas após a inoculação, e colocá-las rapidamente na estufa incubadora à

temperatura adequada. Se a desidratação excessiva ocorrer (por exemplo, em

55 ° C ou em caso de forte circulação de ar), enrole os placas vagamente em

sacos plásticos antes da incubação ou usar qualquer sistema similar de

eficiência equivalente.

Durante o período de incubação, pequenas variações na temperatura de

incubação podem ser inevitáveis e é aceitável, por exemplo, durante as

operações usuais de carga ou descarga da estufa incubadora, mas é

importante que esses períodos sejam mantidos a um mínimo possível. A

duração destas variações deve ser monitorada para garantir que elas não

tenham um efeito significativo sobre o resultado.

NOTA: Em certos casos, pode ser útil para armazenar placas inoculadas em

3°C ± 2°C para usar em comparação com placas inoculadas e incubadas na

contagem, a fim de evitar confundir as partículas do produto a ser examinado

com colônias. A lupa binocular também pode ser usada para distinguir

partículas do produto das colônias.

Em determinadas circunstâncias, pode ser desejável para a organização do

trabalho no laboratório refrigerar as placas inoculadas por um período máximo




Revisão: 00

de 24 horas antes da incubação. Se isso for feito, o laboratório deve assegurar

que essa prática não afete a contagem resultante.

Geralmente, placas de Petri não devem ser empilhadas em mais de seis placas

para incubação aeróbica e devem ser separadas umas das outras e das

paredes da incubadora pelo menos 25 mm. No entanto, pilhas maiores com

menos espaçamento pode ser aceitável em incubadoras equipadas com

sistemas de circulação de ar, neste caso, a distribuição de temperatura deve

ser verificada.

Após a incubação, as placas normalmente devem ser examinadas

imediatamente. Podem, no entanto, ser armazenadas, salvo descrito em

normas específicas, por até 48 h na geladeira. Armazenamento refrigerado por

períodos mais longos só é aceitável se tiver sido demonstrado que não têm

efeito sobre os números, à aparência ou a confirmação posterior das colônias.

Com certos meios contendo corantes indicadores, placas podem ser

refrigeradas para equilibrar a temperatura ambiente antes de se examinar, para

garantir que a cor correta tenha sido recuperada.

10.3 Cálculo e expressão dos resultados obtidos com meios sólidos

10.3.1 Contagem de colônias

Após o período de incubação indicado na norma específica, a contagem de

colônias (colônias total, colônias típicas ou colônias presuntivas) para cada

placa contendo menos de 300 colônias (ou qualquer outro número indicado na

norma específica).

Ao contar colônias típicas ou presuntivas, a descrição das colônias é a indicada

no padrão específico.

Em certos casos, pode ser difícil contar as colônias (por exemplo, quando os

micro-organismos espalhados estão presentes). Considerar colônias

espalhadas como colônias individuais. Se menos de um quarto da placa estiver




Revisão: 00

coberto por espalhamento, contar as colônias na parte não afetada do placa e

calcular o número dele para toda a placa. Deduzir por extrapolação o número

teórico que deve corresponder à placa inteira. Se mais de um quarto estiver

coberto, descarte a contagem. Considerar colônias espalhadas como uma

colônia.

Nas diferentes modalidades de cálculo dado em 10.3.2, contagens tiradas das

placas que não contenham colônias, deverão ser feitas onde essas placas

foram mantidas.

Quando um plaqueador espiral automático tiver sendo usado, a contagem de

colônias é como descrito em 10.2.4.3.3.

10.3.2 Expressão dos resultados

10.3.2.1 Geral

10.3.2.1.1 Os casos de que trata este subitem são casos gerais:

- inoculação de uma placa de Petri 90 mm de diâmetro por diluição;

- número máximo de contagem para as colônias totais presentes: 300 por

placa;

- número máximo total de colônias (típicas e atípicas) em uma placa, em uma

contagem de colônias típicas ou presuntivas: de preferencialmente 300 por

placa;

- número máximo de contagem de colônias típicas ou presuntivas: 150 por

placa;

- número de colônias inoculadas presuntivas para identificação ou confirmação

(ver 10.3.2.3): em geral 5 em cada placa.

Estes números são definidos nas normas específicas.




Revisão: 00

Quando as placas com um diâmetro diferente de 90 milímetros são usadas, o

número máximo de colônias deve ser aumentado ou diminuído em proporção à

área da superfície dos placas (ou membranas).

10.3.2.1.2 Os métodos de cálculo apresentados a seguir são para os casos que

ocorrem mais freqüentemente quando os testes são realizadas de acordo com

boas práticas de laboratório. Casos especiais podem acontecer

ocasionalmente (por exemplo, a relação dos fatores de diluição usada para

duas diluições sucessivas pode ser muito diferente), e é, portanto, necessário

que os resultados de contagem obtidos sejam analisados e interpretados por

um qualificado microbiologista e, se necessário, rejeitado.

10.3.2.2 Método de cálculo: caso geral (contagem de colônias total ou

colônias típicas)

Para um resultado ser considerado válido, é geralmente necessário contar as

colônias em pelo menos uma placa contendo pelo menos 10 colônias [colônias

total, colônias típicas ou colônias em conformidade com critérios de

identificação (Ver 10.3.2.3)].

Calcular o número N de micro-organismos presentes na amostra de teste como

uma média ponderada de duas diluições sucessivas através da Equação (1):

Onde,

é a soma das colônias contadas com duas placas retidas a partir de duas

diluições sucessivas, sendo que pelo menos uma das quais contenham um

mínimo de 10 colônias;

V é o volume de inóculo colocado em cada placa, em mililitros;




Revisão: 00

d é a diluição correspondente à diluição primeiro retido [d= 1 é quando o

produto retido for um líquido não diluído (Amostra)].

Arredondar o resultado calculado para dois algarismos significativos. Ao fazer

isso, se a terceira figura for inferior a 5, não modificar a figura anterior, se a

terceira figura for maior ou igual a 5, aumente uma unidade do número anterior.

Expressar o resultado de preferência com um número entre 1,0 e 9,9

multiplicado pela potência de 10 adequada, ou um número inteiro com dois

algarismos significativos.

Exprimir o resultado com o número N de micro-organismos por mililitro

(produtos líquidos) ou por grama (outros produtos).

EXEMPLO

Contagem produziu os seguintes resultados:

a primeira diluição reteve (10-2): 168 colônias;

a segunda diluição reteve (10-3): 14 colônias.

Arredondando o resultado especificado acima, o número de micro-organismos

é 17000 ou 1,7 x 104 por mililitro ou por grama de produto.

10.3.2.3 Método de cálculo: após a identificação

Quando o método utilizado requer a identificação, um determinado número A

(geralmente 5) de colônias presuntivas devem ser identificadas a partir de cada

um das placas retidas para a contagem de colônias. Após a identificação,




Revisão: 00

calcular, para cada uma das placas, o número α de colônias em conformidade

com os critérios de identificação, através da Equação (2):

onde

b é o número de colônias em conformidade com critérios de identificação entre

as colônias identificadas A;

C é o número total de colônias presuntivo contou com o placa.

Arredondar o resultado calculado para o número inteiro mais próximo. Ao fazer

isso, se a primeira figura após o ponto decimal for inferior a 5, não modificar a

figura anterior, se a primeira figura depois do ponto decimal for maior ou igual a

5, aumentar a figura anterior em uma unidade.

Calcular o número N de micro-organismos identificados presentes na amostra

de teste, substituindo por na equação dada em 10.3.2.2.

Arredondar o resultado, conforme especificado em 10.3.2.2.

Expressar o resultado, conforme especificado no 10.3.2.2.

EXEMPLO




Teste das colônias selecionadas foi realizado:




Revisão: 00

- das 66 colônias, 8 colônias foram testadas, 6 dos quais cumpriu com os

critérios, α= 50;

- das 4 colônias, todas as 4 cumpriram os critérios, α= 4.

Arredondar o resultado, conforme especificado em 10.3.2.2, o número de

micro-organismos é 49000 ou 4,9 x 104 por mililitro ou por grama do produto.

10.3.2.4 Método de cálculo: baixas contagens

10.3.2.4.1 caso quando uma placa (amostra ou suspensão inicial ou

primeira diluição) contém menos de 10 colônias

Contagens de 10, até o limite (prática) superior de cada método estão na faixa

de precisão ideal. Precisão diminui rapidamente à medida que o número de

colônias diminui abaixo de 10, no entanto. Dependendo da finalidade do teste,

um limite inferior de determinação pode ser definido como a seguir para

contagem inferior a 10.

A definição de limite de determinação é: concentração média mais baixa de

partículas x por porção analítica onde o padrão da incerteza relativa esperada,

é igual a um valor especificado (RSD)". RSD é o desvio-padrão relativo, que é

calculado dividindo-se a estimativa do desvio padrão s de uma população a

partir de uma amostra por dessa amostra. Em vez de RSD, símbolo o w será

usado para o desvio padrão relativo. Assim,

No caso de uma distribuição de Poisson, x é calculada pela equação:




Revisão: 00

Se w é fixado em 50% para o limite de precisão relativa aceitável (o que parece

ser razoável em microbiologia), o limite inferior de determinação será o número

de colônias dadas por:

Assim, os resultados com base na contagem de menos de quatro deve ser

tratada como mera detecção da presença do micro-organismo.

Resumindo:

Se a placa tiver menos de 10 colônias, mas, pelo menos, 4, calcular o resultado

como dado, no caso geral (10.3.2.2), e relatá-lo como número x estimado de

micro-organismos por mililitro (produtos líquidos) ou por grama (outros

produtos).

Se o total for de 3 a1, a precisão do resultado é muito baixa e o resultado

deverá ser reportado como:

"Os micro-organismos estão presentes, mas menos do que (4 x d) por grama

ou ml".

10.3.2.4.2 Caso onde a placa (amostra ou suspensão inicial ou primeira

diluição) não contém colônias

Se a placa que contém a amostra do teste (produtos líquidos) ou a suspensão

inicial (outros produtos) ou a primeira diluição inoculada ou retida não contém

quaisquer colônias, o relatório do resultado é dado da seguinte forma:

"Inferior a 1/d micro-organismos por mililitro" (produtos líquidos) ou "menos de

1/d micro-organismos por grama"(Outros produtos)




Revisão: 00

onde d é o fator de diluição da suspensão inicial ou da primeira diluição

inoculada ou retida (d= 100= 1 onde a amostra de teste inoculada diretamente

do produto líquido é retida).

10.3.2.4.3 Casos especiais

10.3.2.4.3.1 Geral

Estes casos dizem respeito à contagem de colônias típicas ou presuntivas.

10.3.2.4.3.2 Caso 1

Se o número de colônias típicas e atípicas para a placa tiver uma primeira

diluição d1 maior do que 300 (ou qualquer outro número indicado na norma

específica), com colônias típicas visíveis ou colônias confirmadas, e se, o placa

contendo o d2 diluição subsequente possuir menos de 300 colônias (ou

qualquer outro número indicado na norma específica), e nenhuma colônia típica

visível ou confirmada, relatar o resultado da seguinte forma:

"Menor que 1/d2 e maior que 1/d1 micro-organismos por mililitro" (produtos

líquidos) ou "menor que 1/d2 e maior que 1/d1 micro-organismos por grama

"(outros produtos), onde d1 e d2 são os fatores de diluição correspondente à

diluição d1 e d2.

EXEMPLO


- a primeira diluição reteve (10-2): mais de 300 colônias no placa, com colônias

típicas ou confirmadas presente;

- a segunda diluição reteve (10-3): 33 colônias, sem colônias típicas ou

confirmadas presente.




Revisão: 00

O resultado, expresso em micro-organismos, é menor que 1000 e maior que

100 por mililitro ou por grama de produto.

10.3.2.4.3.3 Caso 2

Se o número de colônias típicas e atípicas na placa, tiver uma primeira diluição

d1 maior do que 300 (ou qualquer outro número acima do indicado na norma

específica), com colônias típicas visíveis ou colônias confirmadas, e se a placa

d2 contendo a diluição subsequente tiver menos de 300 colônias (ou qualquer

outro número indicado na norma específica) ou nenhuma colônia típica visível

ou confirmada, o relatório do resultado é dado da seguinte forma:

"Menor que 1/d2 micro-organismos por mililitro" (produtos líquidos), ou menor

que 1/d2 micro-organismos por grama" (Outros produtos)

onde d2é o fator de diluição correspondente à diluição d2.

EXEMPLO


- a primeira diluição reteve (10-2): mais de 300 colônias no placa, sem colônias

típicas ou confirmadas presente;

- a segunda diluição reteve (10-3): 33 colônias, sem colônias típicas ou

confirmadas presente;

O resultado, expresso em micro-organismos, é inferior a 1000 por mililitro ou

por grama de produto.

10.3.2.5 Método de cálculo: casos especiais

10.3.2.5.1 Quando o número de colônias contadas (colônias total, colônias

típicas ou colônias presuntivas) é superior a 300 (ou qualquer outro número

indicado em norma específica) para a placa contendo uma primeira diluição d1,




Revisão: 00

com um número de colônias (colônias totais, colônias típicas ou colônias em

conformidade com critérios de identificação) menor que 10 para a placa

contendo a diluição d2 subsequente:

- se os números de colônias para a placa contem a diluição d1 dentro do

intervalo de 334 a 300 (a parte superior do intervalo de confiança para uma

média ponderada igual a 300), use o método de cálculo para casos em geral

(ver 10.3.2.2);

- se os números de colônias para a placa contem a diluição d1 maior do que

334 (o limite superior do intervalo de confiança para uma média ponderada

igual a 300), apenas levar em conta o resultado da contagem de diluição d2 e

calcular uma contagem estimada (ver 10.3.2.4), exceto, quando um máximo de

300 for definido para a contagem de colônias, se esta contagem estimada for

inferior a 8 (limite inferior do intervalo de confiança para uma média ponderada

igual a 10), uma vez que a diferença entre as duas diluições é então

inaceitável.

Os números correspondentes aos intervalos de confiança devem ser

adaptados para o número máximo indicado para a contagem de colônias.

EXEMPLO1




Usar o método de cálculo para os casos em geral, usando as duas placas

retidas com diferentes diluições.

EXEMPLO 2





Revisão: 00

a primeira diluição reteve (10-2): mais de 334 colônias no placa;


Assinalar uma contagem estimada com base nas colônias contadas no placa

para a diluição 10-3.

EXEMPLO 2

Contagem (quando um número máximo de 300 foi fixado para a contagem de

colônias) produziu os seguintes resultados:

- a primeira diluição reteve (10-2): mais de 334 colônias no placa;

- a segunda diluição reteve (10-3): 7 colônias.

O resultado desta contagem é inaceitável.

EXEMPLO 4

Contagem (quando um número máximo de 150 foi fixado para a contagem de

colônias) produziu os seguintes resultados:

- a primeira diluição reteve (10-2): mais de 167 colônias na placa (limite superior

do intervalo de confiança com uma média ponderada média igual a 150);

- a segunda diluição reteve (10-3): 7 colônias.

Assinalar uma contagem estimada com base em colônias contadas na placa

para a diluição 10-3.

10.3.2.5.2 Quando a contagem de colônias (colônias totais, colônias típicas ou

colônias presuntivas) para cada uma das placas, para todas as diluições

inoculadas produz um número superior a 300 (ou qualquer outro número

indicado na norma específica), o relatório do resultado é dado seguinte forma:




Revisão: 00

"Maior que 300/d" (no caso das colônias total ou colônias típicas) ou "maior que

" (no caso de colônias confirmadas), expressa em micro-organismos por

mililitro (produtos líquidos) ou micro-organismos por grama (outros produtos)

onde

d é a diluição da última diluição inoculada;

b é o número de colônias em conformidade com critérios de identificação entre

as colônias presuntivas A.

10.3.2.5.3 Quando o placa que contém a última diluição inoculada tiver mais de

10 colônias e menos de 300 (ou qualquer outro número indicado na norma

específica) colônias (colônias total, colônias típicas ou colônias presuntivas),

calcular o N número de micro-organismos presentes usando a Equação (4):

onde

c é o número de colônias contadas na placa;

V é o volume do inóculo utilizado em cada placa, em mililitros;

d é a diluição correspondente à diluição retida.

Arredondar o resultado, conforme especificado em 10.3.2.2.

Expressar o resultado com o número N de micro-organismos por mililitro

(produtos líquidos) ou por grama (outros produtos).

EXEMPLO





Revisão: 00

- na última diluição inoculada (10-4): 120 colônias.

Assim

Arredondando o resultado, conforme especificado em 10.3.2.2, o número N 'de

micro-organismos é 1200000, ou 1,2x 106 por mililitro ou por grama do produto.

10.3.2.6 Incerteza de medição

Ver ISO/TS 19036 para determinações quantitativas.

10.4 Enumeração de bolores e leveduras

10.4.1 Geral

Bolores e leveduras geralmente devem ser enumerados seja por uma técnica

de pour-plate, que facilita a enumeração ou por uma técnica spread-plate que

fornece a máxima exposição das células ao oxigênio atmosférico e evita o

estresse de calor do agar derretido. Placas de ágar vertidas devem ser secas

antes de serem inoculadas conforme POP MET MC 001.

Alguns bolores e leveduras podem ser infecciosos ou podem provocar reações

alérgicas, às vezes até mesmo em indivíduos saudáveis. Assim, é importante

estar razoavelmente cauteloso ao trabalhar com eles. Idealmente, as placas

devem ser mantidas em incubadoras, não em uma sala aberta. Tampas das

placas devem ser removidas o mais raramente possível, normalmente apenas

para fins essenciais, tais como a preparação de uma lamina para exame

microscópico. Agulhas esterilizadas pelo calor devem ser resfriadas antes de

fazer transferências, para evitar dispersão de conídios e outras células.

Bancadas de trabalho e as incubadoras devem ser desinfetadas

rotineiramente.




Revisão: 00

Placas de Petri devem ser incubadas em posição vertical e não devem ser

manipuladas até que as placas estejam prontas para serem contadas, o

movimento pode resultar na liberação de conídios ou esporos e subseqüente

desenvolvimento de colônias de satélite, dando uma superestimativa da

população.

10.4.2 Contagem de colónias de bolores e leveduras

Placas com 10 a150 colônias são geralmente contadas. Se a micoflora consiste

principalmente de fungos, selecione placas contendo as contagens na faixa de

menor população; se a micoflora consiste principalmente de leveduras, placas

que contenham até o limite superior podem ser selecionadas para a contagem.

Se a identidade das colônias estiver duvidosa, examinar em microscópio pelo

menos cinco colônias por amostra para confirmar que bactérias não estão

presentes.

10.5 Enumeração usando um meio líquido

10.5.1 Princípio

Porções de teste são inoculadas em um meio líquido que é projetado para

suportar o crescimento de um determinado micro-organismo ou um grupo de

micro-organismos, e muitas vezes inibem a proliferação de micro-organismos

não-alvo.

Para determinar se o crescimento dos micro-organismos-alvo tenha ocorrido,

vários critérios podem ser usados, por exemplo, detecção visual de turbidez,

produção de gás, mudanças de cor, posterior isolamento dos micro-organismos

em um ágar seletivo. A composição do meio de crescimento e os critérios para

distinguir entre um resultado positivo e um negativo são definidos nas normas

correspondentes.




Revisão: 00

Usando essa abordagem, apenas um valor qualitativo pode ser atribuído a

cada porção de teste, ou seja, o resultado é ou positivo ou negativo. Para obter

uma estimativa da quantidade de micro-organismos que está presente, é

necessário examinar várias porções de ensaio e os procedimentos estatísticos

para determinar o número mais provável (NMP).

10.5.2 Inoculação

10.5.2.1 Geral

Se um meio de crescimento seletivo é usado, a adição da amostra de ensaio

não deve reduzir as suas propriedades seletivas (permitindo assim o

crescimento de micro-organismos não-alvo). Na maioria das normas padrões

informações sobre a compatibilidade de uma determinada matriz e do meio

líquido é descrita no âmbito, mas cuidados devem ser tomados com matrizes

como especiarias, cacau, caldo de carne, etc, pois podem conter substâncias

inibidoras de crescimento, que exigem a adição de compostos neutralizantes, o

uso de uma quantidade maior de fatores de diluição, filtração, centrifugação ou

separação imunomagnética para separar o micro-organismo alvo a partir da

matriz, mesmo que isso nem sempre seja especificado nas normas

correspondentes. Incompatibilidade também pode ser devido à composição

biológica da matriz: amostras ambientais altamente contaminadas, produtos

fermentados ou produtos com bactérias probióticas, obviamente representam

um desafio maior para a análise do microbiologista do que as amostras que

contêm somente muito poucos micro-organismos. Para essas matrizes

problemáticas, experimentos com micro-organismos representativos devem ser

realizados para verificar se o método é realmente compatível com a matriz.

10.5.2.2 Procedimento

Salvo disposição em contrário das normas correspondentes, volumes inferior

ou igual a 1ml da porção teste são normalmente adicionados cinco a dez vezes

ao volume de um único meio com concentração simples. Volumes entre 1ml e




Revisão: 00

100ml são normalmente adicionados a volumes iguais de meios com dupla

concentração.

Para volumes maiores que 100 ml, meios mais concentrados podem ser

usados. Para fins especiais, meios estéreis desidratados podem ser dissolvidos

a frio (ou pré-aquecidos a 30°C) da amostra a ser analisada.

Salvo disposição em contrário, o tempo entre preparar a primeira diluição de

uma amostra e inoculação do último tubo, placa de vários poços, ou frasco

devem ser inferior a 15 minutos.

Uma nova pipeta estéril deve ser utilizada para cada diluição.

10.5.3 Escolha do sistema de inoculação

A essência do método NMP é que a diluição de uma amostra a um grau tal que

inóculos, às vezes, mas nem sempre contêm micro-organismos viáveis. O

"resultado", isto é, o número de inóculos produzindo crescimento em cada

diluição, dará uma estimativa da concentração inicial de bactérias na amostra.

A fim de obter estimativas sobre uma ampla gama de concentrações possíveis,

microbiologistas usam diluições em série, incubando vários tubos (ou placas,

etc) em cada diluição. O número mais provável (NMP) de micro-organismos

presentes na amostra original, e a precisão da estimativa, pode ser calculada

por procedimentos estatísticos sobre a base do número de tubos positivos e

negativos observados após a incubação.

Fazer a escolha das várias configurações disponíveis de NMP de acordo com

- o número esperado de micro-organismos na amostra em estudo,

- requisitos regulamentares,

- a precisão necessária, e

- quaisquer outras considerações práticas.




Revisão: 00

A incerteza de medição depende do número de positivo nas porções teste

observadas, semelhante a incerteza de medição em contagem do número de

colônias, que depende do número de colônias em uma placa. A incerteza de

medição aumenta à medida que uma função da raiz quadrada do número de

tubos utilizados aumenta. O número de tubos tem que ser quadruplicado para

reduzir pela metade a incerteza de medição. Quando os sistemas usam apenas

alguns tubos de replicação, a incerteza de medição é baixa.

Dependendo do seu tamanho, porções de teste podem ser inoculadas em

tubos ou frascos contendo a quantidade necessária do meio líquido. Para

porções de teste pequenas, placas com vários poços também podem ser

usadas.

10.5.3.1 Sistema único de diluição

Quando a concentração de micro-organismos esperado é pequena ou varia

apenas moderadamente, o mais adequado é o sistema de inoculação em uma

série única de porções de ensaio igual. Onde a relação esperada entre o

número máximo e mínimo de micro-organismos é menor que 25, dez porções

de teste em paralelo é a menor número esperado de funcionar; com 50 tubos

paralelos, uma relação de 200 é o limite. Exemplos de sistema único de

diluição NMPs são indicados no anexo B, Tabelas B.1 a B.4.

10.5.3.2 Sistema Múltiplo de diluição

Quando a concentração de micro-organismos na amostra é desconhecida, ou

se suspeita de haver grande variação, pode ser necessário inocular tubos em

série de várias diluições. Inocular um número suficiente de diluições para

garantir um sistema com resultados positivos e negativos. O número de

diluições também depende do método de cálculo utilizado para estimar o valor

do NMP. Se tabelas forem usadas, então os resultados de três diluições devem

estar disponíveis, e as configurações dos sistemas são restritas aos




Revisão: 00

disponíveis em tabelas. Com programas de computador, o número de diluições

e tubos paralelos é irrestrito.

10.5.3.3 Sistema de diluição simétrica

O sistema NMP simétrico mais comumente aplicado utiliza três ou cinco tubos

paralelos por diluição. A precisão obtida com este sistema diminui rapidamente

com o menor número de tubos por diluição. Os resultados de três tubos de

design são pouco mais do que indicações da ordem de grandeza da

concentração. Se maior precisão for necessária, recomenda-se que cinco ou

mais tubos paralelos sejam escolhidos. Exemplos de NMP de três tubos e um

NMP de cinco tubos são indicados no anexo B, Tabelas B.5 e B.7,

respectivamente.

10.5.3.4 Sistema de diluição não-simétrica

Em um sistema de diluição não-simétrica, os diferentes níveis de diluição não

têm o mesmo número de tubos. Usar esses sistemas apenas para calcular o

número de micro-organismos dentro de uma faixa bem definida. Para

exemplos, consulte o POP MET MIC 003 ITEM XII.

10.5.4 Incubação

Incubar os tubos, frascos ou garrafas inoculados em uma estufa incubadora ou

em banho-maria. Coloque placas de vários poços, em uma estufa incubadora.

Escolher a duração e a temperatura de incubação após a referência de um

método específico, pois dependem do microrganismo ou grupo de micro-

organismos procurado.

Para alguns micro-organismos, um processo de incubação de dois estágios

e/ou uma etapa de confirmação pode ser necessária.

Pesquisar em normas específicas para obter detalhes.




Revisão: 00

10.5.5 Interpretação dos resultados

Os critérios que distinguem resultados positivos de negativos variam de acordo

com cada micro-organismo ou grupo de micro-organismos e são definidos nas

normas correspondentes. Usando estes critérios, contar e registrar o número

de resultados positivos obtidos em todos os testes derivados de uma amostra.

10.5.6 Determinação dos valores NMP

Há três possibilidades diferentes para determinar o valor do NMP: cálculo com

fórmulas matemáticas, consulta das tabelas de NMP, ou utilização de

programas de computador específico. Desde que sejam baseados nas mesmas

considerações estatísticas, eles são igualmente válidos. Estes três métodos

são detalhados a seguir.

10.5.6.1 Fórmulas matemáticas

10.5.6.1.1 Fórmula aproximada para todos os casos

Os valores aproximados de NMP para qualquer número de diluições e tubos

paralelos são derivados da aplicação da seguinte equação (adaptado da

referência [36]):

onde

Zp é o número de tubos positivos;

mr é a massa de referência da amostra, em gramas;

ms é a massa total, em gramas, da amostra em todos os tubos com as reações

negativas;




Revisão: 00

mt é a massa total, em gramas, da amostra em todos os tubos.

NMP é expresso por massa de referência da amostra em gramas (geralmente

1 g, por vezes 100 g).

10.5.6.1.2 Solução "exata" para uma série de tubos

O valor do NMP para uma única série de tubos é derivado da seguinte fórmula:

onde


mm é a massa, em gramas, da amostra em cada tubo da série;

ln é o logaritmo natural;

n é o número de tubos na série;

zp é o número de tubos com uma reação positiva.

10.5.6.1.3 Precisão estimada em ensaios de diluição simples

Os limites de confiança de 95% da estimativa NMP podem ser calculados

aproximadamente através da equação:

onde




Revisão: 00

x é o limite de confiança superior ou inferior a 95%;


mm é a massa, em gramas, da amostra em cada tubo da série;

ln é o logaritmo natural;

n é o número de tubos na série;

zn é o número de tubos com uma reação negativa.

O sinal positivo é conectado com o limite inferior e o sinal de menos com o

limite superior. A aproximação não é muito bom quando a maioria dos tubos

são negativos (estéril), mas melhora quando a proporção de tubos positivos

aumenta.

10.5.6.1.4 Precisão estimada em ensaios de diluição múltipla simétrica

O padrão de incerteza log10 de um sistema de NMP de diluição múltipla

simétrica pode ser obtido pela equação aproximada de Cochran:

onde

SE é o erro padrão de log10NMP;

f é o fator de diluição entre diluições consecutivas (principalmente 10);

n é o número de tubos por diluição.

Os limites superior e inferior do grau confiança de 95% podem ser

conseguidos, respectivamente, multiplicando e dividindo a estimativa NMP pelo




Revisão: 00

antilogaritmo de 2x SE. Esse procedimento tende a exagerar o limite de

confiança superior.

10.5.6.2 Tabelas de NMP

10.5.6.2.1 Tabelas para sistemas diluição simples

Tabelas B.1 a B.4 (Anexo B) fornecem os valores de NMP e os intervalos de

confiança de 95% por porção de teste para 10, 15, 20 e 25 tubos paralelos

[cada tubo é inoculado com a mesma diluição (simples)].

Para expressar o resultado por massa de amostra de referência (ou o volume

de amostras de líquido), multiplique o NMP e os 95%d os valores-limite pela

razão (massa de referência) / (massa toma de ensaio). Não multiplicar o

padrão logarítmico

Incerteza. A massa de referência em microbiologia alimentar é geralmente 1g.

A massa tomada no ensaio corresponde à quantidade de amostra (em gramas)

que está presente no volume usado para inocular os tubos, por exemplo, 0,1g

se 1ml do homogeneizado 10-1 foi utilizado.

EXEMPLO

Vinte tubos de caldo de dupla concentração foram inoculados com 5 ml

alíquotas de uma amostra de dez vezes diluída (0,1 g / ml). Após a incubação,

16 dos tubos apresentaram crescimento visível. Qual foi a densidade mais

provável de bactérias (organismos por grama) na amostra? Tabela B.3 dá 1,61

como o número mais provável de organismos por tubo, com um limite inferior

de 95% de 0,93 e um limite superior de 95% de 2,77.

Cada tubo recebeu uma porção teste de 5 ml, o que corresponde a 0,5 g de

amostra. Portanto, o número mais provável de micro-organismos em 1 grama

de amostra é dada por:




Revisão: 00

NMP= /g = 3,2/g

com o intervalo de confiança de 95%, variando de

limite inferior de 95% = /g= 1,9/ g;

limite superior de 95% /g = 5,5/g

10.5.6.2.2 Tabelas para sistemas de diluição múltiplas: três diluições

sucessivas

Com sistemas simétricos, é comum a prática do uso de três diluições

sucessivas com três ou (Tabela B.5) ou cinco (Tabela B.7) repetições.

Registrar o número de resultados positivos para cada conjunto de tubos e, a

partir da tabela de NMP para o sistema de inoculação utilizada, leia o número

mais provável de micro-organismos presentes no volume de referência da

amostra.

Algumas combinações de tubos positivos são mais prováveis do que outras.

Por exemplo, uma combinação de resultados positivos 0, 0, 3 é muito menos

provável de ocorrer do que a combinação 3, 2, 1. Para quantificar esta

probabilidade, todas as combinações de resultados positivos têm sido

atribuídas a uma categoria, variando de 0 a 3. A categoria de resultado 1 é um

resultado com maior probabilidade, enquanto que uma categoria de resultado 3

é rara e não pode ser reproduzido facilmente. Os piores casos são de categoria

0 resultados, que devem ser considerados com grande suspeita. Supondo-se

que os resultados da análise estiverem corretos, seria de esperar que 95% das

combinações observadas cairiam na categoria 1, 4% na categoria 2, 0,9% na




Revisão: 00

categoria 3 e apenas 0,1% na categoria 0. Categorias são mais bem explicadas

na Tabela B.6.

No caso em que mais de três diluições são feitas, a seleção da combinação

"direta" de três diluições consecutivas nem sempre é muito clara. No entanto,

isso pode ser feito facilmente pela gravação de todas as possíveis

combinações de tubos positivos e lendo a categoria correspondente na Tabela

B.5.

A partir daí, aplicar as seguintes regras:

1) Selecione a combinação de três diluições consecutivas com uma categoria 1

de perfil para obter o índice de NMP. Se mais de uma combinação de perfil de

categoria 1 tiver sido obtida, use a que apresentar o maior numero de tubos

positivos.

2) Se nenhuma combinação de perfil de categoria 1 estiver disponível, usar

uma de perfil de categoria 2. Se mais de uma combinação de perfil de

categoria 2 for obtido, use a que apresentar o maior numero de tubos positivos.

3) ) Se nenhuma combinação de perfil de categoria 2 estiver disponível, usar

uma de perfil de categoria 3. Se mais de uma combinação de perfil de

categoria 3 for obtido, use a que apresentar o maior numero de tubos positivos.

Alguns exemplos são mostrados na Tabela 1.

Tabela 1 - Exemplos de seleção de resultados positivos para o cálculo do MPN




Revisão: 00

10.5.6.3 Programas de computador

Os programas de computador mais versáteis não representam nenhuma

restrição sobre o número de diluições e tubos paralelos ou simetria do sistema

de NMP. MPN Assay Analyzer é um programa disponível gratuitamente com

base em um programa anterior.

10.5.7 Expressão dos resultados

Do índice NMP lido na tabela B.5 [de acordo com a combinação de três (ou

cinco) diluições consecutivas retida], determinar o numero de micro-organismos

mais prováveis no volume referido.

Resultados do relatório como o número mais provável de micro-organismos (ou

grupo específico de micro-organismos) por grama ou mililitro. A massa ou o

volume de referência pode ser diferente de g ou ml (por exemplo, 100 g ou 100

ml).

11 Método de detecção (método qualitativo)

11.1 Geral




Revisão: 00

Um método de detecção é um método que determina a presença ou ausência

de micro-organismos em uma determinada quantidade de produto.

11.2 Princípio

Salvo disposição em contrário de norma internacional especifica, misturar

(produtos líquidos) ou homogeneizar (outros produtos) uma quantidade P do

produto a ser examinado com 9 x P ml ou 9 x P g de um caldo eletivo e/ou

seletivo.

Para facilitar a recuperação de micro-organismos estressados em alimentos, as

amostras são geralmente pré-enriquecidas em um caldo não-seletivo seguido

de enriquecimento seletivo e isolamento em meios agar seletivos / diferenciais.

O uso de dois diferentes caldos de enriquecimento, bem como de dois ou mais

meios de ágar seletivo, aumentam a sensibilidade do método.

Após a incubação, espalhar com uma alçada obtida do caldo seletivo sobre a

superfície de um meio agar seletivo de tal forma a obter colônias isoladas.

Salvo disposição em contrário, os caldos de enriquecimento incubados só

podem ser refrigerados após a avaliação do impacto de sistemas de

refrigeração nos resultados e somente se claramente estipulado no resultado

do teste.

Um número (geralmente cinco por placa de ágar) das colônias obtidas após a

incubação são, então, identificadas com técnicas adequadas de confirmação.

A seleção de colônias para confirmação deverá abranger representativamente

colônias tipicamente suspeitas.

11.3 Incerteza de medição

A estimativa da incerteza de medição de determinações qualitativa está sendo

investigada pela ISO/TC 34/SC 9.




Revisão: 00

12 Métodos de confirmação

12.1 Geral

Utilizar apenas culturas puras para confirmação bioquímica e sorológica.

Os testes de confirmação de referência são descritos nas normas específicas.

Como uma alternativa aos testes bioquímicos descritos nessas normas

específicas, os métodos de confirmação descritos nesta cláusula (bioquímicos,

sondas de DNA) podem ser utilizados nas condições descritas na cláusula,

salvo disposição em contrário as normas específicas.

12.2 Preparação de uma cultura pura

Começar a preparação de uma cultura pura pela seleção de uma única colônia

em um meio agar. Então inocular a colônia selecionada em meio de ágar não-

seletivo. Após a incubação, selecione uma colônia bem isolada para

posteriores testes de confirmação. Repita a operação se necessário.

Se possível, os testes de confirmação deverão ser feitos usando células de

uma única colônia. Se houver material insuficiente em uma colônia, ele deve

primeiro ser repicadas em um meio líquido ou em um meio inclinado ágar, após

o qual a subcultura pode ser utilizada para os testes a serem realizados.

12,3 Teste de Gram (técnica de Hucker modificada)

12.3.1 Geral

Esta forma de coloração de células bacterianas permite a descrição da

morfologia da bactéria e sua classificação em dois grupos em função de serem

ou não capazes de reter a coloração de cristal violeta (Gram +) nas condições

de ensaio. Esta divisão resulta principalmente de diferenças na estrutura da

parede da célula dos dois grupos e se correlaciona com outras diferenças

importantes entre os dois grupos.




Revisão: 00

A alternativa satisfatória à coloração de Gram é o uso de solução de hidróxido

de potássio 3% (KOH). Uma alçada do crescimento bacteriano é agitada em 2

gotas de solução de KOH. Bactérias gram-negativas farão com que a solução

tornar-se muito viscosa e mucóide em 30 segundos, com formação de um filete

da seguinte mistura na alça, quando levantada.

Há uma série de maneiras de conduzir um teste de Gram, mas todos seguem

as sequências abaixo.

12.3.2 Soluções

12.3.2.1 Geral

Soluções disponíveis no mercado podem ser utilizados.

Neste caso, siga as recomendações do fabricante.

12.3.2.2 Solução de cristal de violeta

12.3.2.2.1 Composição

Cristal violeta 2,0 g

Etanol (95%) 20 ml

Oxalato de amônio (C2H8N2O4) 0,8 g

água 80 ml

12.3.2.2.2 Preparação

Dissolver o cristal violeta no etanol, e o oxalato de amônio na água destilada.

Misturar as duas soluções e manter a mistura em repouso por 24 h antes do

uso.

12.3.2.3 Solução de iodo




Revisão: 00


1,0 g de iodo

Iodeto de potássio (KI) 2,0 g

água 100 ml


Dissolver o iodeto de potássio em 10 ml de água e adicionar o iodo em frações.

Após dissolução, completar o 100 ml em um balão volumétrico.

12.3.2.4 Solução de safranina


Safranina 0,25 g

Etanol (95%) 10 ml

água 100 ml


Dissolver o safranina no etanol, em seguida, misturar com a água destilada.

12.3.3 Técnica de Gram

Depois de fixar uma alçada de bactérias numa lâmina de microscópio com a

chama, preparada a partir de uma cultura 18 a 24 horas ou quando o caldo

estiver turvo, cobrir o filme com o cristal violeta. Deixar reagir por 1 min.

Delicadamente lavar com água a lamina inclinada por alguns segundos.

Cubrir a lâmina com a solução de iodo. Deixar reagir por 1 min.




Revisão: 00

Delicadamente lavar com água a lamina inclinada por alguns segundos.

Despeje delicadamente e de forma contínua um filme de etanol (95%) sobre a

rampa inclinada durante um período não superior a 30 s até que nenhuma cor

violeta saia da lamina.

Delicadamente lavar com água a lamina inclinada para eliminar o etanol. Cubra

a lâmina com uma solução de safranina por 10 segundos. Delicadamente lavar

com água a lamina inclinada.

Secar a lamina.

12.3.4 Interpretação

Colocar uma gota de óleo de petróleo na lamina, e examinar na objetiva de alta

potência de um microscópio. As células bacterianas que aparecem em azul ou

violeta são denominadas Gram-positivas (+ Gram), aquelas que são cor de

rosa, ou cor vermelha escura são denominadas Gram-negaivas (- Gram).

Para uma cultura pura de certos tipos de bactérias, tanto as células Gram-

positivas e Gram-negativas podem ser obtidas no mesmo campo do

microscópio.

NOTA Quantidade muito densa de células pode dar uma resposta incomum.

12.4 Uso de galerias bioquímicas para identificação

Galerias bioquímicas disponíveis podem ser usadas para identificação de

colônias isoladas.

Verificar se as galerias são adequadas, através de estudos de avaliação

publicados em revistas de literatura científicas internacionais, de preferência

relacionados à microbiologia de alimentos4. Esta verificação é especialmente

importante se o fabricante não tem validação de dados sobre as galerias.




Revisão: 00

O laboratório deve obter um certificado de controle para cada lote, com

indicação das estirpes de ensaio.

O fabricante deve especificar também as cepas de controle que o laboratório

pode usar para verificar a preservação do desempenho das galerias.

As galerias devem incluir, no mínimo, os testes bioquímicos descritos nas

normas específicas ou ser complementadas por outros testes.

12.5 Uso de sondas nucléicas para a identificação

Sondas nucléicas podem ser utilizadas para identificação de colônias isoladas.

No entanto, deve-se verificar se as sondas nucléicas utilizadas para a

confirmação são adequadas, como mostradas por estudos de avaliação

publicados em literatura científica internacional, de preferência relativa à

microbiologia de alimentos. Esta verificação é especialmente importante se o

fabricante não tem dados de validação das sondas.

O laboratório deve obter um certificado de controle para cada lote, com

indicação das estirpes de ensaio.

O fabricante deve especificar também as cepas controle que o laboratório pode

usar para verificar a manutenção do desempenho da sonda.

4) Os pedidos de informação devem ser dirigidos para o centro de referência

nacional, regional ou internacional indicado para cada micro-organismo.

12.6 Métodos sorológicos

12.6.1 Geral

Quando confirmação sorológica é necessária, realizá-la após a identificação

bioquímica das colônias isoladas.




Revisão: 00

12.6.2 Testes de aglutinação em laminas

Reações antígeno-anticorpo causam nas células bacterianas agregação e

formação massas floculantes ou densos grânulos. No caso das bactérias da

família Enterobacteriaceae, a reação entre o antígeno "H" (flagelar) e seu

antissoro homólogo resulta em um amontoado floculante, enquanto que a

reação envolvendo o antígeno "O" (somático) resulta em uma mais densa

aglomeração granular.

Antes de aglutinação com anti-soros, um teste deve ser realizado para

determinar se as células bacterianas aglutinam em solução de 3% de cloreto

de sódio. Se as células bacterianas aglutinarem, a cepa é autoaglutinante e

não deve ser aglutinada com anti-soros.

Anti-soros disponíveis comercialmente são de dois tipos: anti-soros polivalentes

que reagem com micro-organismos de um determinado gênero ou com grupos

de sorovares e que são adequados para triagem preliminar, e anticorpos

monoclonais específicos, cuja utilização permite a identificação de um sorovar

especifico.

O laboratório deve obter um certificado de controle para cada lote de anti-

soros, com indicação das cepas testes.

Verifique se os testes de aglutinação são adequados, como mostrado por

estudos de avaliação publicado em literatura científica internacional, de

preferência relacionados à microbiologia de alimentos5.

Ao usar os reagentes, adequados controles positivos e negativos devem ser

usados.

12.6.3 Teste de aglutinação de látex




Revisão: 00

Um método mais rápido está disponível comercialmente, empregando

partículas de látex revestidas com grupos de anticorpos específicos. O

antígeno no extrato é testado contra uma série de látex reagentes.

Verifique se os testes de aglutinação em látex são adequados, como mostrado

por estudos de avaliação publicados em literatura científica internacional, de

preferência relacionados à microbiologia de alimentos. O laboratório deve obter

um certificado de controle para cada lote, com indicação das cepas testes.

Ao usar os reagentes, adequados controles positivos e negativos devem ser

usados. Os pedidos de informação devem ser dirigidos para o centro de

referência nacional, regional ou internacional indicado para cada

microorganismo.

13.0 RELATÓRIO DE ENSAIO

O relatório deve especificar o método utilizado, se necessário a temperatura de

incubação, e os resultados obtidos. Deve também mencionar todos os detalhes

operacionais não especificadas nesta Norma, bem como aqueles considerados

como opcional, juntamente com os detalhes de quaisquer incidentes que

possam ter influenciado os resultados.

Constar também no relatório de ensaio se mais testes devem ser realizados

por um laboratório de referência, ou, e se esses testes foram realizados, quais

foram os resultados.

O relatório de ensaio deve incluir todas as informações necessárias para a

identificação completa da amostra. Também é apropriado incluir todas as

informações necessárias para a interpretação dos resultados do teste.

Se necessário, a medida de incerteza, deve ser incluída no relatório de ensaio.

14.0 VALIDAÇÃO DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS

14.1 Validação de métodos de referência




Revisão: 00

A validação de métodos de referência está sendo investigada pela ISO/TC

34/SC 9.

14.2 Validação de métodos alternativos

A ISO 16140 orienta para o protocolo técnico de validação de métodos

alternativos comparados com métodos de referência.

14.3 Validação de métodos internos

A validação de métodos internos está sendo investigada pela ISO/TC 34/SC 9.

15.0 GARANTIA DE QUALIDADE DOS RESULTADOS / CONTROLE DE QUALIDADE DE DESEMPENHO

15.1 Controle de qualidade interno

15.1.1 Controle de qualidade interno é composto por todos os procedimentos

realizados por um laboratório para a contínua avaliação do seu trabalho. O

objetivo principal é garantir a consistência dos resultados no dia-a-dia e a sua

conformidade com critérios bem definidos.

15.1.2 Um programa de verificações periódicas é necessário para demonstrar

que a variabilidade (entre os analistas, entre equipamentos ou entre materiais)

está sob controle. Todos os testes incluídos no escopo de atividade do

laboratório precisam ser protegidos.

O programa deve envolver:

- o uso de amostras fortificadas, com níveis variáveis de contaminação,

incluindo a cepa alvo e flora contaminante;

- o uso de amostras naturalmente contaminadas a partir de uma gama de

matrizes;




Revisão: 00

- o uso de materiais de referência (incluindo materiais para ensaios de

proficiência);

- testes de replicação;

- replicação de testes de avaliação.

O intervalo entre essas verificações é influenciado pela natureza dos ensaios

efetuados pelo laboratório e a freqüência na qual os testes são realizados.

Recomenda-se que, sempre que possível, os testes devem incorporar

controles para monitorização do desempenho.

15.1.3 Em casos especiais, um laboratório pode realizar um teste específico

raro. É reconhecido que, em tais casos, um programa de controle de qualidade

interno em curso pode ser inadequado e que pode ser mais adequado realizar

em paralelo com o teste um esquema para demonstrar desempenho

satisfatório.

15.2 Cepas de referência

Manutenção de cepas de referência de acordo com o POP MET MC 001.

15.3 Avaliação externa da qualidade (ensaios de proficiência)

Laboratórios devem participar regularmente em programas de ensaios de

proficiência que são relevantes para o seu âmbito de atividade.

Deve ser dada preferência aos programas de ensaios de proficiência que

utilizem matrizes adequadas.

Laboratórios devem usar avaliação externa da qualidade não só para avaliar

tendência de laboratório, mas também para verificar a validade do seu sistema

de qualidade como um todo.




Revisão: 00

16.0 BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

ISO 7218:2007. Microbiology of food and animal feeding stuffs – General

requirements and guidance for microbiological examinations.

II. HISTÓRICO DAS REVISÕES

REVISÃO DESCRIÇÃO DATA00 Emissão inicial 02.07.2012




Revisão: 00




Revisão: 00

Anexo A

Informativo




Revisão: 00

Anexo B

(Normativo)

Determinação do número mais provável (NMP)

Tabela B.1 - valores de NMP por porção de ensaio e limites de confiança de 95% para uma série de 10 tubos.

Tabela B.2 – Valores de NMP por porção de ensaio e limites de confiança de 95% para uma série de 15 tubos.




Revisão: 00

Tabela B.3 - Valores de NMP por porção de ensaio e limites de confiança de 95% para uma série de 20 tubos.




Revisão: 00

Tabela B.4 - Valores de NMP por porção de ensaio e limites de confiança de 95% para uma série de 25 tubos.




Revisão: 00

Tabela B.5 - índices e limites de confiança (95%) de NMP, quando três porções de ensaio de 1g (ml), três de 0,1g (ml) e três de 0,01g (ml) são usados.

a fonte: Referência: De Man, J.C. MPN tables (corrected), Eur. J. Appl. Biotechnol. 1983, 17, pp. 301-5.b Veja a Tabela B.6.c os limites de confiança apresentados nesta tabela são destinados apenas para fornecer uma idéia da influência das variações estatísticas nos resultados.Haverá sempre também outras fontes de variação, que pode às vezes ser ainda mais importante.




Revisão: 00

Tabela B.6 - Explicação de categorias de resultados

categoriaa Definição1 Quando o número de bactérias na amostra é igual ao NMP encontrado, o

resultado é aquele que têm a maior chance de ser obtido. Há no máximo apenas 5% de chance de se obter um resultado que menos provável do que mínimo provável nesta categoria.

2 Quando o número de bactérias na amostra é igual ao NMP encontrado, o resultado é um daqueles que têm menos chance de ser obtido, que o minimo provável na categoria 1, mas não há, no máximo, 1% de chance de se obter um resultado que é menos provável do que mínimo provável nesta categoria.

3 Quando o número de bactérias na amostra é igual ao NMP encontrado, o resultado é um daqueles que têm menos chance de ser obtido, que o minimo provável na categoria 2, mas não há, no máximo, 0,1% de chance de se obter um resultado que é menos provável do que mínimo provável nesta categoria.

0 Quando o número de bactérias na amostra é igual ao NMP encontrado, o resultado é um daqueles que têm menos chance de ser obtido, que o minimo provável na categoria 3. Há apenas 0,1% de chance de obter um resultado, nesta categoria, sem que nada esteja errado.

a Antes de iniciar um teste, ele deve ser decidido qual a categoria será aceitável, ou seja, apenas 1, 1 e 2 ou mesmo 1, 2 e 3. Quando o decisão a ser tomada com base no resultado é de grande importância, apenas a categoria 1, ou no máximo 1 e 2, os resultados devem ser aceitos. Resultados da categoria 0 devem ser considerados com grande suspeita.

Tabela B.7 - Valores de NMP por grama de amostra com limites de confiança de 95% (Quando tomada cinco porções teste de 1 g, cinco de 0,1 g e cinco de 0,01g)




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PT-LMC-004 - Requisitos Gerais Para Exames Microbiologicos