Puntos críticos en laPuntos críticos en la producción de bioetanol pa partir de madera

Dra Mary LoprettiFacultad de Ciencias y LATU

Importancia del problema

Debido al aumento de etanol como combustible, existe,la necesidad de buscar procesos de alto rendimiento ytecnología fácilmente accesibles para bajar los costos.

El uso de madera es de interés a causa de la naturalezarenovable de las materias primas y el crecienterenovable de las materias primas y el crecientedesarrollo de la industria forestal y subproductos.

Hoy día , los costos de producción pueden ser más altosque los combustibles a partir del petróleo.

En nuestro país el petróleo es la fuente principal deEn nuestro país el petróleo es la fuente principal deenergía consumida, representando actualmentealrededor del 60% del total de las fuentes primarias de

íenergía.

La dependencia del sistema energético nacionalLa dependencia del sistema energético nacionalrefuerza la decisión de tomar medidas que tiendan aatenuar esta vulnerabilidad.

Etapas del proceso

Madera Madera pretratada Azúcares Alcohol

Pretratamiento Sacarificación Fermentación

Remover lignina y sacar

tóxicos

Costos de enzimas

Sacar inhibidores, proteger por

encapsulación u tó cos e capsu ac ó uobtener cepas

adaptadas a fenoles

PretratamientoImplementación etapa deslignificación piloto ALUR

Realización del primer y segundo batch de pre tratamientop y g p–09/08/11-10/08/11: Se realiza el primer batch de 4600 kg de residuos.La inyección de vapor se realiza en camión y en bolsas “big bags”directamente.directamente.–31/08/11-01/09/11: Se realiza el segundo batch de 4300 kg de residuos.La inyección de vapor se realiza en 10 bolsas “big bags”.Para q e el calentamiento sea niforme se in ecta en tres l garesPara que el calentamiento sea uniforme se inyecta en tres lugaresdiferentes de la bolsa permaneciendo 10-15 minutos en cada punto.

Luego de la inyección de vapor las bolsas son trasladadas hasta elLuego de la inyección de vapor, las bolsas son trasladadas hasta eldepósito para su vertido sobre silo-bolsa.En el momento del vertido el residuo tiene una temperatura de 80 ºC.El residuo se deja enfriar durante toda la noche y al otro día se inoculaEl residuo se deja enfriar durante toda la noche y al otro día se inoculacon Gloeophyllum trabeum y Phanerochaete chrysosporium en unaproporción del 5% (p/p) de cada uno de ellos.

Control del procesoLa humedad del sustrato debe ser mantenida en un 60% para lo cuál serealizan controles dos veces por semana, hidratándose en caso sernecesario.La temperatura se registra 1 vez por semana.Se toman muestras al inicio y durante el proceso para relizar lasSe toman muestras al inicio y durante el proceso para relizar lassiguientes determinaciones:Materia seca, ADF, NDF, % lignina, hemicelulosa.

Optimización de las condiciones de eliminación de fenolesA cada una se le realizó el siguiente tratamiento:

1 - Se secaron las muestras en estufa a 80 ºC1. Se secaron las muestras en estufa a 80 C.2.- Se molieron utilizando una malla de 2mm.3.- Se pesaron 300 g de cada muestra en en erlenmeyer de 2000 ml.4.- Se agregó el mismo volumen de agua corregida a pH (solución deg g g g p (NaOH 63 x 10 -5 M) hasta cubrir la muestra.5.- Se dejó toda la noche a temperatura ambiente (5:00 PM a 9:00 AM).6.- Se filtró el sobrenadante y se midió la absorbancia del mismo a 254,280 310 y 354 nm280, 310 y 354 nm.7.- Se repitió el mismo proceso a cada muestra y se midió laabsorbancia a cada uno de los filtrados obtenidos de la segundaextracción.

IDENTIFICACION Abs 280 nm (Dilución 1/2)

Abs 280 nm (Dilución 1/4)

(1/8)

Concentración(g/l)

Concentración (g/l)

(1/8)

Pila 1 – 4/10 (al azar)Primer extracción

5.000 4.8029 0,96 7,68

Pil 1 4/10 ( l ) 4 8029 1 8181 0 35 2 8Pila 1 - 4/10 (al azar) Segunda extracción

4.8029 1.8181 0,35 2,8

Pila 1 - 4/10 (con crec. Fúngico)

5.0000 4.8029 0,96 7,68

Primer extracción

Pila 1 - 4/10 (con crec. Fúngico) Segunda extracción

4.8029 1.2574 0,24 1,92

Pila 2 - 4/10 Primer extracción

4.8029 1.9729 0,39 3,12

Pila 2 - 4/10 Segunda extracción

2,9395 0.7325 0,13 1,04

Pila 3 - 4/10 (Blanco)Primer extracción

5.000 1.2591 0,24 1,92

Pila 3 - 4/10 (Blanco)Segunda extracción

4.3269 0.9915 0,19 1,52Segunda extracción

IDENTIFICACION Abs 280 nm

(Dilución

Abs 280 nm (Dilución 1/4) (1/8)

Concentración(g/l)

Concentración (g/l)

1/2)Pila 1 - 25/10 Primer extracción

5.000 4.8029 0,96 7,68

Pila 1 - 25/10 4.8029 2.7328 0,54 4,32Pila 1 25/10 Segunda extracción

4.8029 2.7328 0,54 4,32

Pila 2 - 25/10 Primer extracción

4.8029 3.2281 0,65 5,2

Pila 2 - 25/10 Segunda extracción

4.8029 1.5744 0,30 2,4

Pila 3 - 25/10 5 000 1 5903 0 31 2 48Pila 3 - 25/10 Primer extracción

5.000 1.5903 0,31 2,48

Pila 3 - 25/10 Segunda extracción

4.5027 1.1404 0,22 1,76Segunda extracción

Pila 4 – 25/10Primer extracción

4.8029 1.9567 0,38 3,04

Pila 4 – 25 /10Segunda extracción

4.0267 1.0017 0,19 1,52

SacarificaciónSacarificación ácida

Se colocaron 10g de sustrato molido en un balón de 250ml y seadicionaron 100ml de agua destilada y 4% (v/v) de ácido sulfúricoconcentrado (98%). Se colocó el balón a reflujo por 4 horas a 100ºC.concentrado (98%). Se colocó el balón a reflujo por 4 horas a 100 C.

Tiempo (hs)

Azúcares reductores (g/l)( ) (g )

0 0,158

4 15 344 15,34

COSTO TOTAL para producir 1kg de azúcar: U$S 0,9p p g $ ,

Sacarificación enzimática + ácida

Sacarificación enzimática

Los ensayos se realizaron en matraces de 250ml a los cuales se lesadicionó 10% de sustrato molido sin pretratar y 15 gramos decelulasa (750FPU/g de sustrato húmedo) en un volumen total de100ml.Los matraces se incubaron a 50ºC en shaker a 130rpm.Se mantuvo la incubación por 24 horas y luego se realizó lasacarificación ácidasacarificación ácida.

Sacarificación ácida

Se traspasó el material obtenido luego de la sacarificación a unbalón de 250ml y se adicionó 4% (v/v) de ácido sulfúrico concentrado(98%). Se colocó el balón a reflujo por 4 horas a 100ºC.

A úTiempo (hs)

Azúcares reductores

(g/l)

0 0 1580 0,158

24 2,89

Final sacarificación

ácida20,65

COSTO TOTAL para producir 1kg de azúcar: U$S 1.14

Enzimática

Estudio con diferentes concentraciones de enzima

Se realizaron sacarificaciones al 1,1 % de sustrato seco (m/v) enmatraces Erlenmayer de 125 ml, cada uno conteniendo 50 ml dey ,buffer acetato de sodio 0,1 M (pH=4,8).

Las concentraciones de enzima utilizadas fueron: 16, 32,5, 65, 130 yy195 kFPU (filter paper unit) por gramo de sustrato seco.

Se incubó en shaker (Labnet I5311-DS) a una temperatura de 50 °Cy 125 rpm.

Se tomaron muestras cada 24 horas para analizar los azúcaresreductores por la técnica de DNS.

14,016,018,020,0

4 06,08,0

10,012,0

AR

(g/l)

0,02,04,0

0 20 40 60 80

Tiempo (hs)

16 kFPU/g sustrato seco 32,5 kFPU/g sustrato seco

65 kFPU/g sustrato seco 130 kFPU/g sustrato seco

195 kFPU/g sustrato seco

KFPU/g sustrato seco

Costo para producir 1kg de azúcar (U$S)

Litros OH/ toneladas de sustrato seco

16 2884,6 15,0

32 5 2884 6 30 032,5 2884,6 30,0

65 4945,1 35,0

130 4858,3 71,1

195 7417,6 69,9, ,

Enzima Cellic

119 50 00000 380 02

L de alcohol/ tonelada de madera

Costo para producir 1kg de azúcar (U$S)

Costo para el ensayo en chico

(U$S)% sac.Producción de AR

a las 72hs (g/l)% sustrato seco

119 50 00000 380 02

L de alcohol/ tonelada de madera

Costo para producir 1kg de azúcar (U$S)

Costo para el ensayo en chico

(U$S)% sac.Producción de AR

a las 72hs (g/l)% sustrato seco

2637 60 00107 860 50

588,50,000517,351,10

553,60,000216,541,05

617,30,00011,710,11

317,40,00000,850,05

119,50,00000,380,02

1,1

2637 60 00107 860 50

588,50,000517,351,10

553,60,000216,541,05

617,30,00011,710,11

317,40,00000,850,05

119,50,00000,380,02

1,1

598 40 001017 642 23

27,10,00048,361,06

714,40,00022,050,26

68,50,00011,730,22

46,60,00011,120,14

2,3

2637,60,00107,860,50

598 40 001017 642 23

27,10,00048,361,06

714,40,00022,050,26

68,50,00011,730,22

46,60,00011,120,14

2,3

2637,60,00107,860,50

404,90,000812,102,80

224,50,00046,631,53

133,80,00023,910,91

82,90,00012,510,58

4,2

2637,40,00217,921,00

598,40,001017,642,23

404,90,000812,102,80

224,50,00046,631,53

133,80,00023,910,91

82,90,00012,510,58

4,2

2637,40,00217,921,00

598,40,001017,642,23

195,30,00065,551,78

143,60,00034,131,33

151,60,00024,521,45

5 7

1029,60,004130,677,10

657,60,002119,424,50

,,,,

195,30,00065,551,78

143,60,00034,131,33

151,60,00024,521,45

5 7

1029,60,004130,677,10

657,60,002119,424,50

,,,,

222,30,00046,552,60

82,90,00022,521,00

4422,60,006213,104,20

836,00,003124,807,95

316,30,00129,423,025,7

222,30,00046,552,60

82,90,00022,521,00

4422,60,006213,104,20

836,00,003124,807,95

316,30,00129,423,025,7

1855,90,00825,292,10

1925,50,00415,802,30

229,00,00166,552,60

811,70,00082,521,007,1

1855,90,00825,292,10

1925,50,00415,802,30

229,00,00166,552,60

811,70,00082,521,007,1

FermentaciónDetoxificación

Se colocaron 40 litros de agua destilada, 2kg de sustrato húmedo y 400g decelulasa china en el reactor.La temperatura se llevó a 50ºC. El ensayo duró 72 horas y al finalizar se transfirióel sobrenadante a una paila para concentrarlo. La concentración se llevó a caboel sobrenadante a una paila para concentrarlo. La concentración se llevó a caboen una paila abierta a 100ºC por 2 horas.Utilizando el sacarificado concentrado se realizaron las siguientesfermentaciones:

Detoxificando: La detoxificación se realizó en un baño a 30ºC agregando hidróxido deDetoxificando: La detoxificación se realizó en un baño a 30ºC agregando hidróxido decalcio al sacarificado hasta alcanzar un pH de 10-11. Se agita durante 60 minutos yluego se agrega ácido sulfúrico para bajar el pH a 6. Luego se centrifuga para removerlas sales precipitadas. Para realizar la fermentación, en un matraz de 500ml se colocaron315ml del sacarificado concentrado detoxificado, 500mg/l de sulfato de amonio y 35ml deinóculo (Kluyveromyces). Se incubó en estufa (BLINDER FD53) a 40ºC por 24 horas yluego se realizó la determinación de azúcares reductores y de alcohol.

Para comparar se realizó una fermentación igual a la anterior pero sin detoxificar.

Fermentación Alcohol (º)

No detoxificado 0,08

Detoxificado 0,06

La detoxificación no logró mejorar la fermentación.

EncapsulaciónTipo de fermentación Diferencia de azúcar

reductorGrados de alcohol

K. marxianus esferas quitosano en YPD 2 g/l 0.9º

K. marxianus esferas de quitosano en YPD + Polifenoles

3 g/l 0.8

K. marxianus esferas de quitosano en YPD + xilano hidrolizado

4 g/l 0.7

K. marxianus esferas de PVA en YPD 2 g/l 0.9º

K. marxianus esferas de PVA en YPD + polifenoles

3 g/l 0.8

K. marxianus esferas de PVA en YPD+ xilanos hidrolizados

3 g/l 0.9

K. marxianus esferas de Alginato en YPD 1 g/l 0.9º

K. marxianus esferas de alginato en YPD + polifenoles hidrolizados

4 g/l 0.5

K. marxianus esferas de alginato en YPD + 6 g/l 0.4K. marxianus esferas de alginato en YPD xilanos hidrolizados

6 g/l 0.4

La fermentación alcoholica con Kluyveromyces libre presenta unadisminución en el rendimiento del 50 y 75% cuando se trabaja cony jinhibidores fenólicos e inhibidores de xylano respectivamente.

Kluyveromyces encapsulado en alginato presenta una disminución delrendimiento del 50 y 60% respectivamente.

Kluyveromyces encapsulado en quitosano presenta una disminución delrendimiento del 25 y 30% respectivamente.

Kluyveromyces encapsulado en PVA presenta una disminución deldi i t d l 20 10% ti trendimiento del 20 y 10% respectivamente.

Cá l d l h l li i íli i i t d Cápsulas de quitosano con crecimiento de Kluyveromyces en microscopia SEM

Cápsulas de alcohol polivinílico con crecimiento de Kluyveromyces en microscopia SEM

Cápsulas de alginato con crecimiento de Kluyveromyces en microscopia SEM

Obtención de mutante

1º Inducción de mutación por radiación p2º Dosis letal 503º Selección por tolerancia a alcoholes, p ,concentración de azucar y tolerancia a fenoles

CepasCepas

SacSV-10: cepa mutante de SaccharomycesSacSV 10: cepa mutante de Saccharomyces cerevisiae M522 obtenida por gamma irradiación en el laboratorio de Bioquímica y Biotecnología del CIN-Facultad de Ciencias. La cepa se encuentra mantenida liofilizada y congelada a 80 °C y 20 °Ccongelada a -80 C y -20 C. Saccharomyces cerevisiae M522: cepa de banco ATCCbanco ATCC.

Curva de sobrevida en función de la dosis de radiación

20406080

100120

% d

e pl

aca

con

crec

imie

nto

SaccharomycesM522

00 20 40 60

Tiempo de exposición a la radiación (horas)

2

2,5m

)

0,5

1

1,5

Abs

(660

nm

0

0,5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10myc

es M

522

Temperatura extrema50ºCYPD (blanco óptimo)

Sacch

aromy

Cepas

YPD (40g/L)

YPD + 10% alcohol

SFS de M522

Inoculación de la levadura a las 48 hs.Celulasa comercial Samsun.63 % rendimiento

SFS de SacSV-10

Inoculación de la levadura a las 48 hs.Celulasa comercial Samsun.66 % de rendimiento

ConclusionesConclusiones

Según los resultados obtenidos la SFS permite aumentar de manera considerable la cantidad de azúcar fermentada, hasta un 50 % más.Las levaduras utilizadas M522 y la mutante SacSV-10 no sufren inhibición por los

ibl f l l diposibles fenoles presentes en el medio a concentraciones de madera de 10 g/L.