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Purificação e caracterização do anticorpo anti-DRG11 Alunas: •Cristina Pinto •Diana Trigo

Purificação e caracterização do anticorpo anti-DRG11 Alunas: Cristina Pinto Diana Trigo

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Page 1: Purificação e caracterização do anticorpo anti-DRG11 Alunas: Cristina Pinto Diana Trigo

Purificação e caracterização do

anticorpo anti-DRG11

Alunas:•Cristina Pinto•Diana Trigo

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Sistema Nociceptivo

Injury

Peripheral Nerve

Dorsal Root

Ganglion Dorsal Horn

Lateral Thalamus

Somatosensory Cortex

percepção do estímulo

condução do estímulo

processamento da resposta

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DRG11: papel na nocicepção• Identificação do local de

expressão da proteína DRG11 por hibridação com RNAm

• Observação do fenótipo de ratinhos knockout [Chen et al, 2001]

Importância da proteína DRG11

no desenvolvimento

do sistema nociceptivo

Gentilmente cedido pela Prof. Sandra Rebelo

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DRG11, factor de transcrição com 30 DRG11, factor de transcrição com 30 kDa da família das proteínas kDa da família das proteínas homeodomainhomeodomain

11 263263HomeodomainHomeodomain

DNA bindingDNA binding

OAROAR

Interacção Proteína-proteínaInteracção Proteína-proteína

Anti-drg11Anti-drg11

OAROAR

Interacção Proteína-proteínaInteracção Proteína-proteína

Anti-drg11Anti-drg11

Glutationa S-transferaseGlutationa S-transferase

GSTGST

Proteína Recombinante (46kDa)Proteína Recombinante (46kDa)

103103

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•Obtenção dos anticorpos anti DRG11

Proteína de fusão GST-DRG11 (C-terminal)

Soro

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Purificação e caracterização do anticorpo:

SoroPurificação dos anticorpos por Cromatografia de Afinidade

Doseamento de IgG anti-DRG11

Imunoblotting

Imunofluorescência

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Cromatografia de AfinidadeLavagens da resina desefarose + GST-DRG11

Incubação da resina com soro “overnight”

Separação do sobrenadante

Montagem da Coluna

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Cromatografia de Afinidade

Eluição por adição de solução de Glicina a pH 2,3

Recolha de 10 amostras com bomba peristáltica

Neutralização com Tris a pH 8,5

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Doseamento Proteico: Método de Bradford

• Princípio: o reagente de Bradford (corante de azul de Coomassie em àcido fosfórico) liga-se covalentemente às proteínas , numa reacção acompanhada de alteração da cor do reagente em meio ácido. [Bradford MM (1976)]

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Doseamento Proteico:• Determinação da recta padrão:

– Prepararam-se 5 amostras com diferentes concentrações de “bovine serum albumin”(BSA) e reagente de Bradford

– Mediram-se as respectivas absorvâncias num espectrofotómetro a 595nm

– Traçou-se a curva de calibração

Recta Padrão

y = 33,895x - 14,067

R2 = 0,9846

05

10152025

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

Absorvância

Qu

anti

dad

e B

SA

(u

g)

Gráfico 1

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Doseamento Proteico:

• Preparar 10 eppendorfs com:– cada amostra do

anticorpo purificado– água– reagente de Bradford

• Medir as absorvâncias

• Determinar as concentrações das amostras a partir da equação da recta padrão

imunopurificação anti-drg11

0

200

400

600

800

1000

0 2 4 6 8 10 12

fracções

Qu

anti

dad

e (u

g)

Gráfico 2

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Western Blotting:Montagem da cassete (sistema vertical)

Colocou-se 5µg de proteína de fusão em cada um dos poços

Electroforese

Montagem da cassete de blotting

Transferência das proteínas para a membrana de nitrocelulose

Revelação com Ponceau S

Cortou-se a membrana às tiras (1 tira para cada fracção)

kDa

97

5645

36

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Imunoblotting Bloqueio em solução de leite em pó

Incubação com o anticorpo primário (anti-DRG11 de cada fracção )

Incubação com o anticorpo secundário conjugado com Fosfátase Alcalina (AP)

Revelação com NBT + BCIP (substratos da AP)

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1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Conclusão:•Verificou-se a ligação do anticorpo à proteína de fusão através do aparecimento de um precipitado de cor azul, produto da actividade da AP.

•Nas fracções que possuíam uma maior quantidade de anticorpo verificou-se um sinal mais intenso.

imunopurificação anti-drg11

0

200

400

600

800

1000

0 2 4 6 8 10 12

fracções

Qu

anti

dad

e (u

g)

Gráfico 2

Imunoblotting

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• Conclusão: O anticorpo encontrava-se funcional, apesar

de ter sido sujeito a condições agressivas aquando da sua purificação.

• O anticorpo revelou-se funcional para proteínas desnaturadas, contudo havia

necessidade de testar a sua actividade em relação a proteínas nativas in loco.

Imunofluorescência

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Imunofluorescência

• Usaram-se cortes transversais da região do fígado de embriões de ratinhos com 18dias normais e “knockout”.

• Procedimento:– bloqueio com soro de cabra;– incubação com anti-DRG11 (1/200) da fracção 3;– incubação com anticorpo secundário (anti-rabbit)

conjugado com fluorocromo vermelho (Alexa 594);– observação dos locais de expressão da proteína

usando microscopia confocal;

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Imunofluorescência• A proteína apresentou como locais

de expressão o corno dorsal da medula espinhal e gânglios raquidianos, estruturas envolvidas no processamento de estímulos nóxicos.

+/+ -/-

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• Concluiu-se que os anticorpos estavam funcionais para futuros trabalhos de investigação.

NOTA: Os anticorpos já foram utilizados em experiências realizadas pelo orientador.

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Bibliografia:

• Alberts B. et al., Molecular Biology of the Cell, 4th edition, Garland Science

• Bradford MM (1976).Anal Biochem. 72: 248-54. • Chen et al (2001).Neuron.31:59-53• http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/

protein.html• http://www.mpibpc.gwdg.dc/abtcilungcn/140/confo

cal/main.html• http://www.roche.appliedscience.com• www.bioscience.com• www4.amerishambioscience.com

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Agradecimentos:

• Prof Doutor Carlos Reguenga• Serviço de Histologia e Embriologia

de Abel Salazar • Drª. Sandra Rebelo