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Instituto Politécnico de Santarém
Escola Superior Agrária de Santarém
Pyrus communis L.: caracterização de cultivar, avaliação dos voláteis do fruto e optimização das condições de micropropagação
Dissertação
apresentada para obtenção do grau de Mestre em
Produção de Plantas Medicinais e para Fins Industriais
Susana Cristina
Fernandes Lucas
Orientadores
Ana Cristina Figueiredo
Helena Trindade
Co-Orientador
José Grego
Março 2012
INSTITUTO POLITÉCNICO DE SANTARÉM
ESCOLA SUPERIOR AGRÁRIA DE SANTARÉM
Pyrus communis L.: caracterização de cultivar, avaliação dos voláteis do fruto e optimização das condições de micropropagação
Dissertação
apresentada para obtenção do grau de Mestre em
Produção de Plantas Medicinais e para Fins Industriais
Susana Cristina
Fernandes Lucas
Orientadores
Ana Cristina Figueiredo
Helena Trindade
Co-Orientador
José Grego
Santarém
Março 2012
i
Agradecimentos
À Escola Superior Agrária de Santarém e à Faculdade de Ciências da Universidade
de Lisboa, pela disponibilidade dos meios utilizados.
Às supervisoras do estágio Dra Ana Cristina da Silva Figueiredo, Dra Maria Helena
Machado Trindade, ao orientador do estágio Eng. José A. B. Grego, pela amizade,
disponibilidade, dedicação e orientação pedagógica.
À Empresa Picos de Couto, em particular ao proprietário Sr Fernando Tavares, e ao
Dr Mário Vicente e a cedência graciosa do material vegetal.
À Universidade do Algarve em especial Professora Graça Miguel, as análises de
avaliação de actividade biológica.
À Escola Superior Agrária de Coimbra no nome da Eng. Justina Franco, as análises
de caracterização dos frutos.
Ao Eng. Rui Sousa e à Eng. Arminda Lopes, os esclarecimentos e a cedência de
referências sobre variedades regionais de pêras.
À Técnica Superior Isabel Adrega, do Ministério da Agricultura, Mar e Ordenamento
do Território, o tratamento e a cedência de dados recentes sobre a comercialização de
pêra.
À Técnica Superior Maria de Fátima R. Lopes, pela sua amizade, dedicação e apoio.
À Técnica Superior Fernanda Rebelo pelo apoio e dedicação.
À Mestre Marta Mendes o apoio laboratorial
Ao meu marido, pela paciência e colaboração.
Aos meus Pais, que me apoiaram e contribuíram para a realização desta etapa.
A todos aqueles que directa ou indirectamente colaboraram e tornaram possível a
realização deste trabalho.
Dedico este trabalho aos meus filhos, António e Mariana.
O meu obrigado,
Susana Lucas
ii
iii
“Na natureza nada se cria,
nada se perde,
tudo se transforma”
Lavoisier, Antoine Laurent (1743 – 1794)
iv
v
Lista de Abreviaturas, Siglas e Símbolos
% - Percentagem °C – Graus centrigados µA – micro Ampere µl – microlitro 2,4-D - ácido diclorofenoxiacético ABTS – Ácido 2,2'-azinobis-3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico ANOVA - análise de variâncias ANP – Associação Nacional de Produtores de Pêra Rocha AUC – Area Under Curve B - Boro BAP – Benzil Amino Purina Ca - Cálcio CaCl2 - Cloreto de cálcio CE - condutividade eléctrica CEN - Comité Europeu de Normalização CGL - Cromatografia Gás-Líquido CGL/EM - Cromatografia Gás-Líquido / Espectrometria de Massa Cl - Cloro cm - centímetro Co - Cobalto CPVO - Community Plant Variety Office CSS – Concentração de sais na solução do substrato CSV – Concentração de sais por unidade de volume de substrato CTC - Capacidade de troca catiónica Cu - Cobre Da – Densidade aparente do substrato DGPC - Direcção Geral de Protecção de Culturas DIC - Detector de Ionização de Chama DOP - Denominação de Origem Protegida DRAPCentro - Direcção Regional Agricultura e Pescas do Centro DTPA – Ácido Diamino Tretra Acético FAOSTAT – Divisão Estatistica da Food and Agriculture Organization Fe - Ferro GAE - Ácido gálhico GPS - Geo-Posicionamento por Satélite h - hora I - Iodo IAA – Ácido indol acético IBA - Ácido idol butírico INE – Instituto Nacional de Estatística IPGRI - International Plant Genetic Resources Institute IR – Índice de retenção
vi
IR - Índice de Refracção ISA - Ionen-Starke-Adjustierlosung K - Potássio Kg - quilograma kPa – quilopascal L - litro m - metro mbar – milibar mg - miligrama Mg - Magnésio min - minuto mL – microlitro mm - milimetro Mn - Manganês Mo - Molibdénio mol - Mole ms – milissegundo MS – Meio de cultura de Murashige e Skoog mV – milivolt mW – miliwatt N – Azoto NAA - Ácido naftaleno acético NaOH – Hidróxido de sódio Ni – Níquel nm - nanometro ORAC - Oxygen Radical Absorbance Capacity P - Fósforo pH – Potencial de hidrogénio rpm – rotações por minuto S - Enxofre s - segundo SO - Substrato orgânico SPSS – Statistical Package for the Social Sciences TEAC - Trolox Equivalent Antioxidant Capacity u - unidade de massa UPGMA - Agrupamento segundo a associação média UPOV - International Union for the Protection of New Varieties of Plants UV – Ultra violeta v - volume μm - micrometro
vii
Pyrus communis L.: caracterização de cultivar, avaliação dos voláteis
do fruto e optimização das condições de micropropagação
Resumo
A pereira (Pyrus communis L.) é uma espécie de elevada importância na fruticultura
Portuguesa. O presente estudo teve como objectivo micropropagar e caracterizar uma
cultivar de pereira proveniente de uma “semente do acaso” originada numa quinta em
Tábua, Portugal.
Optimizaram-se as condições de micropropagação, e dos substratos utilizados para
aclimatação, o substrato orgânico (SO) e SO + perlite revelaram-se os mais
adequados, porque deram origem a maior biomassa.
O fruto revelou um calibre médio, coloração verde, matizado raiado de vermelho. A
polpa branca, revelou-se doce, não ácida, sumarenta e de óptimo paladar.
O acetato de hexilo, o trans,trans-α-farneseno, o acetato de butilo e o ácido palmítico
foram os compostos dominantes da componente volátil da pêra em estudo, que revelou
alguma semelhança quando comparada com a da pêra Rocha. A análise da água de
decocção dos frutos revelou para a pêra em estudo uma actividade antioxidante
semelhante à da pêra Rocha.
Palavras-chave: Pyrus communis L.; micropopagação; substrato; componentes
voláteis, actividade antioxidante
viii
ix
Pyrus communis L.: Cultivar characterization, fruit volatile
coumpounds determination and optimization of micropropagation
conditions
Abstract
The common pear (Pyrus communis L.) is the second most cultivated fruit crop in
Portugal. This study goal was to micropropagate and to characterize a pear cultivar
resulting from chance seedling originated on a farm located at Tábua, Portugal.
The micropropagation conditions were optimized, and the highest ex vitro
development was observed on organic substrate (OS) and perlite + OS substrate.
The fruit showed yellow, green variegated red colour appearance, a smooth pulp
texture, sweet flavour, not acid and juicy.
Hexyl acetate, trans,trans-α-farnesene, butyl acetate and palmitic acid dominated the
volatiles of the pear under study, which were similar to those from Rocha pear. The
study of both pears decoction waters showed similar antioxidant activity between the
pear under study and Rocha pear.
Key words: Pyrus communis L.; micropopagation; substrates; volatile components,
antioxidant capacity
x
xi
Índice
Agradecimentos ......................................................................................................................................................... i Lista de Abreviaturas, Siglas e Símbolos .............................................................................................................. v Resumo .................................................................................................................................................................... vii Abstract ..................................................................................................................................................................... ix Índice ......................................................................................................................................................................... xi Índice de Figuras .................................................................................................................................................... xiii Índice de Tabelas .................................................................................................................................................... xv 1 – Introdução ............................................................................................................................................................ 1
1.1 – Objectivos ...................................................................................................................................................... 2 1.2 - Breve caracterização da espécie ................................................................................................................... 3
1.2.1 – Propagação vegetativa: macro e micropropagação ............................................................................. 3 1.2.1.1 - Aclimatação .................................................................................................................................... 5 1.2.1.2 – Substratos ...................................................................................................................................... 5
1.3 - Caracterização de variedades de Pyrus communis L. .................................................................................. 6 1.3.1 - Caracterização varietal .......................................................................................................................... 6 1.2.2 - Caracterização da componente volátil ................................................................................................... 8
1.2.2.1– Óleos essenciais e componente volátil .......................................................................................... 8 1.2.2.2 – Capacidade antioxidante ............................................................................................................... 9
2 – Material e Métodos ............................................................................................................................................ 11 2.1 – Material Vegetal .......................................................................................................................................... 11 2.2 - Micropropagação e aclimatação .................................................................................................................. 11
2.2.1 - Iniciação e estabelecimento ................................................................................................................. 11 2.2.2 – Multiplicação e alongamento ............................................................................................................... 11 2.2.3 – Enraizamento ...................................................................................................................................... 12 2.2.4 – Aclimatação ......................................................................................................................................... 12 2.2.5 – Análise de substratos .......................................................................................................................... 13
2.3 - Caracterização da variedade de Pyrus communis L. em estudo ................................................................ 15 2.3.1 – Caracterização fenológica ................................................................................................................... 15 2.3.2 – Caracterização dos frutos ................................................................................................................... 16
2.3.2.1 – Dureza ......................................................................................................................................... 16 2.3.2.2 – Índice de Refracção (ºBrix) ......................................................................................................... 17 2.3.2.3 – Titulação (acidez titulável) ........................................................................................................... 17
2.3.3 – Caracterização da componente volátil ................................................................................................ 17 2.3.3.1 – Material vegetal ........................................................................................................................... 17 2.3.3.2 - Isolamento da componente volátil ............................................................................................... 18 2.3.3.3 – Cromatografia Gás-Líquido ......................................................................................................... 18 2.3.3.4 – Cromatografia Gás-Líquido / Espectrometria de Massa ............................................................ 19 2.3.3.5 – Análise estatística dos resultados ............................................................................................... 19
2.3.4 – Água de decocção dos frutos.............................................................................................................. 19 2.3.4.1 – Quantificação de fenóis pelo reagente de Folin-Ciocalteu ......................................................... 20 2.3.4.2 – Trolox Equivalent Antioxidant Capacity (TEAC) ou método ABTS ............................................ 21 2.3.4.3 - Oxygen radical absorbance capacity (ORAC) ............................................................................. 21
3 - Resultados e Discussão.................................................................................................................................... 24 3.1 - Micropropagação ......................................................................................................................................... 24
3.1.1 – Estabelecimento e multiplicação ......................................................................................................... 24 3.1.2 – Enraizamento ...................................................................................................................................... 24 3.1.3 – Aclimatação ......................................................................................................................................... 26 3.1.4 – Análise de substratos .......................................................................................................................... 27
3.2 - Caracterização da variedade de Pyrus communis L. em estudo ................................................................ 28 3.2.1 – Caracterização fenológica ................................................................................................................... 28 3.2.2 – Caracterização dos frutos ................................................................................................................... 30 3.2.3 – Caracterização da componente volátil dos frutos ............................................................................... 34 3.2.4 – Avaliação da actividade antioxidante da água de decocção dos frutos ............................................. 37
4 – Conclusões e perspectivas futuras ................................................................................................................ 39 5 – Bibliografia ......................................................................................................................................................... 40
xii
xiii
Índice de Figuras
Figura 2.1 - Escala de Fleckinger (DRAPCentro, s.d.) .................................................................................................. 16
Figura 3.1 – A Gomos apicais, B Detalhe de gomo apical, C Contentor com plântulas em multiplicação, D Detalhe
do enraizamento, E Plantas em início da aclimatação, F Planta com 5 semanas de aclimatação......................... 25
Figura 3.2 – Distribuição do número e comprimento máximo (cm) das raizes com os três tratamentos. A linha a
negrito representa a mediana entre o 1º Quartil (extremo inferior da caixa e o 3º Quartil (extremo superior da
caixa). As barras inferiores e superiores representam, respectivamente o mínimo e o máximo das
distribuições. Nº 16, 18 e 23 – outliers. .................................................................................................................... 26
Figura 3.3 – Distribuição do peso fresco e seco das raízes e parte aérea com 3 tratamentos. As letras diferentes
correspondem a valores significativamente diferentes de acordo com o teste HSD de Turkey seguido das
comparações múltiplas de médias para α=0,05. Nº 2, 15,16, 24 e 27 – outliers..................................................... 27
Figura 3.4 – A Pré abrolhamento, B Abrolhamento, C Detalhe de ramo, D Detalhe de abrolhamento, E Detalhe do
botão verde, F Detalhe do botão rosa, G Detalhe sépala. ....................................................................................... 29
Figura 3.5 – H Exemplar da cultivar em estudo, I Desabrochamento, J Detalhe do desabrochamento, L Ramo
com página superior da folha, M Ramo com página inferior da folha, N Detalhe página superior da folha, O
Ramo com página inferior da folha. .......................................................................................................................... 30
Figura 3.6 – P Frutos da cultivar em estudo, Q Detalhe dos frutos. .............................................................................. 31
Figura 3.7 - R Detalhe do interior do fruto, S Detalhe da semente. ............................................................................... 32
Figura 3.8 - Dendrograma obtido por análise aglomerativa em grupos (clusters). A correlação foi seleccionada
como medida de semelhança e utilizou-se o agrupamento segundo a associação média (UPGMA) na
definição dos clusters. Para definição de códigos vide Tabela 2.1. ......................................................................... 37
xiv
xv
Índice de Tabelas
Tabela 1.1 – Pereiras regionais caracterizadas por fichas varietais (AGRO 158, 2006; Godinho e Lampreia,
2006). ........................................................................................................................................................................... 7
Tabela 2.1 - Dados relativos ao tipo de pêra analisada e condições de armazenamento. ........................................... 18
Tabela 3.1 – Média de enraizamento, número médio de raízes, comprimento da maior raiz e comprimento médio
da parte aérea. .......................................................................................................................................................... 24
Tabela 3.2 – Elementos determinados (mg.L-1) de extrato em extração aquosa 1:1½ (v/v) e em extração
CaCl2.DTPA (1:5 v/v). ............................................................................................................................................... 27
Tabela 3.3 - Datas de ocorrência dos estados fenológicos para a pêra Tavares. ........................................................ 28
Tabela 3.4 – Parâmetros de caracterização comparativos entre diferentes cultivares e a pêra Tavares. ................... 33
Tabela 3.5 - Composição química percentual da componente volátil isolada dos frutos de dois cultivares de pêra
(Pyrus communis L.), em dois anos consecutivos e mantidas em diferentes condições de armazenamento
(vide Tabela 2.1). ...................................................................................................................................................... 34
xvi
1
1 – Introdução
A inovação varietal assume grande importância no desenvolvimento e
manutenção de uma fruticultura competitiva e capaz de gerar rendimentos, sendo
a Pereira uma espécie de grande importância na fruticultura Nacional.
Com um preço médio anual, no produtor, de cerca de 69€/100 Kg, a pêra
ocupou, em 2010, a segunda posição nos frutos frescos mais produzidos em
Portugal (26%), só ultrapassado pela laranja (28%) e seguido de perto pela maçã
(24%) (INE, 2011).
Também segundo o INE (2011), os dados de 2010 em Portugal revelaram que
de entre as culturas permanentes de laranja, maçã, pêra e pêssego, a pêra
ocupou, igualmente, o segundo lugar (31%), precedida pela cultura de laranja
(34%), e seguida pelas culturas de maçã (29%) e pêssego (6%). Durante o
mesmo período, a cultura da pereira ocupou cerca de 10969 ha, e a produção
estimada de pêra foi de 176870 t. No Continente, a zona Centro deteve 95% da
produção, seguida do Alentejo (3%) e Norte (2%). Lisboa e Algarve foram
responsáveis por valores <0.5% de produção de pêra. A zona centro do país é
assim a região que maior importância assume na produção de pêra, o que é
provavelmente justificado pelas óptimas condições naturais para fruticultura
exibidas por toda a região do Oeste.
A nível internacional, Portugal ocupava, em 2009, o 11º lugar no Top 20 dos
exportadores mundiais de pêra (FAOSTAT, 2009). Dados de 2011 (Adrega c.p.,
2012), revelam que 71% da exportação nacional de pêra, correspondente a cerca
de 68490 t de pêra, é direccionada para o Brasil (39%), para França (16%) e para
o Reino Unido (16%). Portugal importa cerca de 14881 t de pêra, 97% das quais
vêm de Espanha (38%), da Argentina (36%) e da África do Sul (23%) (Adrega
c.p., 2012).
De todas as espécies de pêra em produção em Portugal, a pêra Rocha é a
variedade por excelência, tendo registo de Denominação de Origem Protegida
(DOP). A sua época de produção inicia-se em meados de Agosto, estendendo-se
até ao fim de Setembro. A sua comercialização pode prolongar-se até Abril,
quando as pêras são mantidas em câmaras de atmosfera controlada (ANP, 2009).
Outras variedades regionais, como, por exemplo, a pêra de S. Bartolomeu
apresentam grande relevância em nichos de mercado próprios (Fragata, 1996;
Guiné et al., 2010).
2
Acresce a importância alimentar da pêra, fruto com elevadas concentrações de
antioxidantes (compostos fenólicos e vitamina C), em particular na epiderme onde
as concentrações são muito superiores às presentes na parte carnuda do fruto
(Sánchez, et al., 2003).
Apreciada pelo seu valor alimentar, a pêra, ou outras partes da pereira, são
igualmente utilizadas para outros fins. Os pequenos frutos das pereiras bravas
(periqueiros), mais duros que os cultivados, bem sorvados são utilizados em
compotas (Ribeiro et al., 2000), bem como a generalidade das diferentes
variedades de pêra. Muito aplicada em doçaria, é considerada uma delicada
sobremesa se cozida em calda de açúcar, ou em vinho. Com o fruto obtém-se
uma aguardente, considerada uma das mais famosas aguardentes de frutas de
Portugal.
Do ponto de vista medicinal, o infuso das folhas de pereira, simples ou
juntamente com casca de maçã, é usado como diurético e uricolítico, isto é, para
dissolver ou eliminar o ácido úrico e os cálculos renais (Feijão, 1979; Tecedeiro,
1996). A pereira brava tem também muito valor como porta-enxerto de pereira
cultivada (Ribeiro et al., 2000). A madeira de pereira é ainda apreciada para
trabalhos delicados de marcenaria.
Reconhecida a relevância da pereira em Portugal, pretendeu-se, com o
presente estudo, dar início à caracterização, e propagar, uma cultivar de pereira
proveniente de uma “semente do acaso” originada numa quinta em Tábua,
Concelho de Oliveira do Hospital, Portugal, entre 1999 e 2000. Numa avaliação
preliminar, esta cultivar apresentou-se como promissora em termos de riqueza
organoléptica e poder de conservação em pós-colheita.
1.1 – Objectivos
A valorização de variedades regionais de pereira, tendo em vista o seu registo
e plena utilização, passa por um processo de caracterização detalhada e
propagação da variedade de interesse.
Neste contexto, partindo de uma cultivar de pereira proveniente de uma
“semente do acaso”, que se mostrou promissora em termos de ulterior
comercialização, tiveram-se, neste trabalho, como objectivos:
1) Optimizar as condições de micropropagação (enraizamento dos explantes e
aclimatação das plântulas).
3
2) Caracterizar fenologicamente a cultivar em estudo, designada pêra Tavares,
3) Caracterizar morfologicamente o fruto, por avaliação de diferentes
parâmetros,
4) Isolar e caracterizar quimicamente os voláteis da pêra a caracterizar,
5) Analisar comparativamente os voláteis de pêra Rocha,
6) Avaliar o efeito da frigorificação na composição de voláteis, e
7) Determinar a actividade antioxidante das águas de decocção de ambos os
frutos.
1.2 - Breve caracterização da espécie
A pereira, Pyrus communis L., pertence à Ordem Rosales, à Família Rosaceae,
e Sub-família Pomoideae. O género Pyrus L. possui cerca de 30 espécies com
porte de arbusto ou árvore de folha caduca, pode ser encontrada em estado
natural em bosques, encostas e locais rochosos, na Europa, Ásia e no Norte de
África. Com porte que pode atingir cerca de 15 m de altura e 10 m de largura
possui folhas ovadas a elípticas, de cor verde-escuro brilhante, com cerca de
10 cm de comprimento. Os frutos podem apresentar-se de coloração verde a
amarelo (Brickell, 2003).
Pyrus communis L. (= P. communis subsp. achras Gaertn. ex Syme, P.
pyraster (L.) Baumg., P. communis subsp. pyraster (L.) Ehrh., P. communis subsp.
boreana (Roy & É.. Camus) Tourlet) é um arbusto ou árvore, de copa ampla e
irregular, cultivada sob muitas cultivares e conhecida em Portugal por pereira,
pereira-brava, pereira-comum ou catapereiro (Aedo e Aldasoro, 2010; FDP 2012).
Pyrus communis L. reúne um conjunto de formas muito variáveis em que se
tentou distinguir, sem sucesso, as formas cultivadas, de frutos maiores e mais
doces, das formas silvestres, de frutos mais pequenos e de sabor mais áspero. As
pereiras actualmente cultivadas parecem provir de cruzamentos entre P.
communis e, provavelmente, P. nivalis, P. pyrifolia (Brum. Fil) Nakai, P. pyraster
Burgsd., P. syriaca Boiss., P. salvifolia DC. e P. austriaca A. Kerner (Franco,
1984; Aedo e Aldasoro, 2010).
1.2.1 – Propagação vegetativa: macro e micropropagação
Os métodos de propagação vegetativa dividem-se em macropropagação
4
(estacaria, enxertia, mergulhia, alporquia e amontoa) e micropropagação,
podendo ser consideradas ainda outras técnicas de cultura in vitro, como a
embriogénese somática e organógenese. A propagação vegetativa permite captar
a variância genotípica, aumentando os ganhos genéticos a curto prazo em
relação à propagação por via seminal.
A micropropagação consiste na produção rápida de clones de uma planta, a
partir de uma única célula vegetal somática ou de um de tecido vegetal (explante).
A técnica de micropropagação baseia-se em métodos modernos de cultura de
tecidos vegetais in vitro. Deste modo, a micropropagação é utilizada para
multiplicar plantas jovens, produzidas pelos métodos convencionais de produção
de plantas. Pode ser utilizada para fornecer um número elevado de propagulos
destinados à plantação, clonados a partir de uma planta stock que não produza
semente ou que não responda bem à obtenção de clones por multiplicação
vegetativa convencional. Na produção de plantas geneticamente modificadas, a
micropropagação tem também um papel importante.
Na micropropagação utiliza-se meio de cultura sendo este uma formulação de
substâncias em forma sólida, líquida ou semi sólida que contêm constituintes
naturais ou sintéticas para promover a multiplicação e crescimento das plantas.
Os meios de cultura de tecidos possuem vários compostos tais como: sais
minerais, vitaminas, amino ácidos, reguladores de crescimento, açúcar, agar ou
Gelrite™ e água. Nos meios de cultura os sais dividem-se segundo as
necessidades das plantas em macro-elementos e micro-elementos. Dos primeiros
fazem parte o Magnésio (Mg), Cálcio (Ca), Fósforo (P), Enxofre (S), Azoto (N) e
Potássio (K). Os micro-elementos mais importantes são o Ferro (Fe), Cobre (Cu),
Cobalto (Co), Manganês (Mn), Molibdénio (Mo), Boro (B), Iodo (I), Níquel (Ni) e
Cloro (Cloro), (Kors,2010).
Os meios de cultura sólidos ou semi-sólidos normalmente são solidificados com
agar. A consistência do meio de cultura depende da concentração e qualidade de
agar utilizado, do pH, da concentração de sais e da presença de outras
substâncias como o carvão ativado, os quais interferem na gelificação
(Murashige, 1974).
Existem diversos reguladores de crescimento tais como auxinas, giberelinas,
citocininas, ácido absicico, brassinosesteróides, jasmonato e etileno e hormonas
polipeptídicas desempenhando um importante papel no desenvolvimento das
plantas bem como no seu sistema de defesa. Na micropropagação normalmente
5
utiliza-se uma combinação de citocininas e auxinas para promover a multiplicação
sendo o enraizamento promovido pelas auxinas. A auxina natural das plantas é o
ácido indol acético (IAA), mas existe um conjunto de auxinas sintetizadas tais
como o ácido diclorofenoxiacético (2,4-D) o ácido naftaleno acético (NAA) e o
ácido idol butírico (IBA), entre outras.
As auxinas estão envolvidas no processo de alongamento das células,
desenvolvimento de raízes, dominância apical, resposta à gravidade e
fototropismo, respiração, manutenção do potencial das membranas, síntese das
paredes celulares, regulação e transcrição, (Bernner, 2008).
1.2.1.1 - Aclimatação
A aclimatação é a fase que decorre em estufa de modo a preparar a plantas as
condições ex vitro, desde que se transfere a plântula da condição in vitro para
estufa, tendo por objectivo promover a autonomia da planta. Para que haja
sucesso na aclimatação, terão de ser superadas as dificuldades que as plântulas
obtidas por cultura de tecidos enfrentam quando são removidas das condições in
vitro. É um processo crítico, pois as plântulas passam de um ambiente de baixa
transpiração, dado os elevados teores de humidade presentes nos contentores in
vitro, para outro que exige maiores taxas de transpiração. Nestas situações pode
ocorrer stress hídrico. Por outro lado, a plântula terá de passar de um
metabolismo heterotrófico para outro autotrófico, sendo a disponibilidade de sais
minerais diferente da existente no meio de cultura; finalmente, a planta sai de um
estado asséptico para um meio ambiente onde existem microorganismos, ficando
sujeita ao ataque de agentes patogénicos (Grattapaglia, 1990).
1.2.1.2 – Substratos
Os substratos são materiais, naturais (minerais e orgânicos) ou artificias, onde
se desenvolvem as raízes das plantas cultivadas, na ausência de solo, em vasaria
especial (vaso), e que devem servir para suprir as suas necessidades de ar, água
e nutrientes.
Actualmente existe uma ampla gama de sistemas de cultura de plantas
frutíferas e ornamentais em vasos. Tais sistemas utilizam substratos de origem
mineral ou orgânica, natural ou sintética, cujas características diferem
6
marcadamente das do solo, não existindo um material ou uma mistura de
materiais considerada universalmente válida como substrato para todas as
espécies. O cultivo em vaso requer irrigações e fertilizações frequentes, tornando-
se necessário o conhecimento das propriedades químicas e físicas dos
substratos, por serem factores determinantes no manutenção e controlo de
qualidade das culturas. As propriedades químicas geralmente utilizadas a nível
mundial para a caracterização de um substrato são: o pH, a capacidade de troca
catiónica (CTC), a salinidade e a percentagem de matéria orgânica nele presente.
Entre as propriedades físicas mais utilizadas, destacam-se: a densidade, a
porosidade, o arejamento e a disponibilidade hídrica (volumes de água
disponíveis em diferentes potenciais de água). Para cada uma destas
propriedades, já foram estudados e definidos padrões e faixas de valores que
caracterizam as condições ideais a serem verificadas num substrato utilizado para
produção de plantas ornamentais e frutíferas em recipientes com irrigação e
fertilização ocasionais. (Bilderback et al., 1982; Conover, 1967; Kämpf, 2000;
Penningsfeld, 1983; Verrdonck e Gabriels, 1988).
1.3 - Caracterização de variedades de Pyrus communis L.
1.3.1 - Caracterização varietal
O número de variedades regionais de pereira existentes no país é muito
elevado, sendo o seu grau de conservação muito variável, e nem todas com
expressão a ponto de serem comercializadas (AGRO 158, 2006).
O trabalho de caracterização morfológica e organoléptica é moroso e
complexo, dificultado por diferentes proveniências, existência de sinonímias
(designações diferentes para a mesma variedade) e homonímias (o mesmo nome
para variedades diferentes) (AGRO 158, 2006).
A caracterização dos frutos de diferentes variedades Portuguesas de pêra,
realizado por (Natividade, 1932) é ainda hoje considerado um trabalho basilar,
sobretudo na caracterização de alguns tipos de frutos menos comuns.
(Borges,1999) compilou, sempre que possível, a par das características do fruto,
alguns caracteres sobre a respectiva árvore.
Nos mais recentes trabalhos de caracterização das variedades Portuguesas
(AGRO 158, 2006; Godinho e Lampreia, 2006), utilizaram-se os critérios da
7
International Union for the Protection of New Varieties of Plants (UPOV), do
International Plant Genetic Resources Institute (IPGRI) e do Community Plant
Variety Office (CPVO), conforme fichas elaboradas pela Direcção Geral de
Protecção de Culturas (DGPC). Os parâmetros de caracterização analisados para
a pereira incluíram, entre outros, o porte da árvore, e para o fruto, a sua forma, a
posição do maior diâmetro, a profundidade da cavidade peduncular e ocular, e a
largura da cavidade ocular (AGRO 158, 2006; Godinho e Lampreia, 2006). Dos
trabalhos de recolha e caracterização efectuados resultaram dados publicados
referentes a parte do material avaliado, Tabela 1.1.
A valorização das variedades regionais, algumas de grande tipicidade, passa
pela sua completa caracterização, por forma a reconhecer produtos diferenciados
que podem ser valorizados em nichos de mercado próprio. É de salientar que a
perfeita adaptação de algumas variedades às condições ambientais nacionais é
uma mais valia importante em termos sócio-económicos.
Tabela 1.1 – Pereiras regionais caracterizadas por fichas varietais (AGRO 158, 2006;
Godinho e Lampreia, 2006).
Fichas varietais publicadas de pereiras regionais caracterizadas
Bela de Junho Amendoa
Boticas Inverno Amendoa I
Coradinha Amendoa II
Fim de Século Amorim
Malheira Baguim
Marmela Bela de Junho
Nacional Cabaça Redonda
Pêra Cabaça Cabacinha Precoce
Pêra do Rabo Torto Carapinheira Branca
Pêra Joaquina Carapinheira Parda
Pêra Marmelo Carvalhal
Pérola Corada Parda
Rabiça Coradinha
Rosadinha de Inverno
Rugosa Dona Joaquina
São Bento Fim de Século
Malheira
Marmela
Marquezinha
Nacional
Pêra Cabaça
Pêra do Rabo Torto
Pêra Marmelo
Pérola
Pérola amarela
8
Fichas varietais publicadas de pereiras regionais caracterizadas
Pigarça
Rabiça
Rosa
Rosadinha
Rugosa
Santo António
São Bartolomeu
São Bento
São João
Sete Cotovelos
(AGRO 158, 2006) (GODINHO & LAMPREIA, 2006)
1.2.2 - Caracterização da componente volátil
Vários atributos, incluindo o aspecto, o sabor, a textura e a aspereza
determinam a qualidade do fruto. Os compostos voláteis definem o odor, e o
sabor do fruto, pelo que o estudo da sua composição pode dar um contributo
importante no reconhecimento da qualidade da pêra e na preferência do
consumidor.
1.2.2.1– Óleos essenciais e componente volátil
Os óleos essenciais são os princípios odoríferos voláteis, produzidos pelas
plantas e utilizados não só pelas suas propriedades medicinais mas também pela
sua importância na indústria farmacêutica, cosmética e alimentar. Os óleos
essenciais estão entre os compostos mais valiosos produzidos pelas plantas
(Craker, 1990).
Os óleos essenciais são obtidos por destilação, hidrodestilação ou destilação
por arrastamento de vapor, de uma planta ou das suas diferentes partes, ou, no
caso do epicarpo de frutos de espécies de Citrus, por um processo mecânico,
sem envolvimento de calor (expressão) (Council of Europe, 2008). Os óleos
essenciais podem ser incluídos num conceito mais abrangente da componente
volátil da planta, que engloba compostos que podem ser isolados por terem em
comum, a capacidade de vaporizar espontaneamente, ou quando sujeitos a
processos extractivos adequados (Rubiolo, 2010).
Estudos elaborados em mais de 50 variedades de pêras permitiram identificar
mais de 300 constituintes na componente aromática, dos quais sobressaem os
álcoois (alifáticos e aromáticos), os aldeídos (alifáticos e aromáticos), as cetonas,
9
os ésteres (formatos, acetatos, propanoatos, butanoatos, pentanoatos,
hexanoatos, heptanoatos, octanoatos, nonanoatos, decanoatos, e outros C12 a
C18), os hidrocarbonetos, os terpenos, os ácidos, os compostos com enxofre,
entre outros. Os ésteres alifáticos são os componentes qualitativa- e
quantitativamente dominantes na componente aromática das pêras (Rapparini e
Predieri, 2003).
Diferentes tecnologias têm sido utilizadas na análise dos voláteis de pêra. A
comparação dos resultados é muitas vezes complicada porque a composição dos
voláteis está dependente do processo analítico utilizado (Rapparini e Predieri,
2003). A maioria dos métodos dos métodos na análise dos voláteis de pêra
envolvem os processos clássicos de isolamento de compostos voláteis: destilação
e/ou extracção por solvente. A destilação é um dos métodos mais frequentes na
extracção selectiva de voláteis de pêra e tem como vantagem a facilidade de
separação de compostos não voláteis, normalmente muito abundantes na pêra,
de outros muito voláteis (Rapparini e Predieri, 2003).
1.2.2.2 – Capacidade antioxidante
Antioxidante pode ser definido como sendo uma substância que, quando
presente em quantidades pequenas em comparação às do substrato oxidável,
impede ou atrasa significativamente a oxidação deste. Os lípidos, as proteínas, os
ácidos nucleicos, os hidratos de carbono e outras biomoléculas podem sofrer
oxidação, isto é, ser o substrato oxidável (Halliwell e Gutteridge, 1999). A
oxidação destas moléculas pode ser responsável pelo aparecimento de algumas
patologias (cataratas, doenças neuro-degenerativas, cancro, doenças
cardiovasculares, entre outras) (Pearson et al., 1999). Contudo, a oxidação
também é um problema na indústria alimentar. Por exemplo, os lípidos podem
sofrer oxidação durante os processos de processamento e armazenamento com o
consequente aparecimento da rancidez (Jadhav, 1995).
A oxidação dos substratos pode ocorrer devido à presença de radicais livres,
como por exemplo, as espécies reactivas de oxigénio (HO, O2-, COO) e as
espécies reactivas de azoto (NO, ONOO-). Contudo, as espécies reactivas de
oxigénio e os derivados oxidantes não radicalares (H2O2) estão presentes nas
células em concentrações muito baixas. As concentrações destes radicais são
“reguladas” por um equilíbrio entre a sua taxa de produção e a sua taxa de
10
eliminação através de sistemas antioxidantes, de natureza enzimática, ou não
(Beaudeux e Vasson, 2005). As principais enzimas antioxidantes intracelulares
são: superóxido dismutase, a catálase e a glutationo peroxidase. Os antioxidantes
não enzimáticos intracelulares incluem: glutationo, bilirrubina, hormonas sexuais
(estrogénios), ácido úrico, coenzima Q, melanina, melatonina, ácido ascórbico e o
ácido lipóico (Beaudeux e Vasson, 2005).
Para além dos sistemas antioxidantes intracelulares existem os sistemas
extracelulares obtidos através da alimentação. Vitamina E, vitamina C, vitamina
B2, vitamina B3, ácido fólico, carotenóides, fenóis, zinco, selénio são alguns
exemplos de antioxidantes obtidos através de uma alimentação saudável
(Roussel et al., 2005).
Uma alimentação rica em antioxidantes naturais (vitaminas e fenóis) aumenta a
capacidade antioxidante do plasma e consequentemente reduz o risco do
aparecimento de algumas doenças (Wang et al., 1996).
Os mecanismos de acção antioxidante podem ser: supressão da formação das
espécies reactivas ou por inibição das enzimas promotoras da oxidação ou por
complexação de metais ou iões metálicos envolvidos na formação do radical livre;
captação das espécies reactivas de oxigénio; e protecção do sistema de defesa
antioxidante (Hassimotto, 2005).
Os antioxidantes podem desactivar os radicais por dois mecanismos principais:
por transferência de átomos de hidrogénio e/ou por transferência de um electrão.
Ambos os mecanismos podem ocorrer em simultâneo e o mecanismo dominante
é determinado pela estrutura do antioxidante, sua solubilidade e coeficiente de
partilha (Wright et al., 2001). Na avaliação da actividade antioxidante de uma
amostra é sempre desejável, então, que se faça pelo menos dois métodos que se
baseiem naqueles dois mecanismos. O método “Trolox Equivalent Antioxidant
Capacity” (TEAC) baseia-se na transferência de um electrão ao passo que o
método “Oxygen Radical Absorbance Capacity” (ORAC) baseia na transferência
de um átomo de hidrogénio (Huang et al., 2005).
No presente trabalho a actividade antioxidante de amostras de pêra foi
analisada no sentido de avaliar a sua capacidade antioxidante. Dois métodos
foram utilizados: o método “Trolox Equivalent Antioxidant Capacity” (TEAC) e o
método “Oxygen Radical Absorbance Capacity” (ORAC).
11
2 – Material e Métodos
2.1 – Material Vegetal
O material vegetal, necessário para os diferentes ensaios, foi recolhido de uma
cultivar de pereira proveniente de uma “semente do acaso”, datado de entre 1999
e 2000. O exemplar único é propriedade da Quinta Picos do Couto, em Tábua,
Concelho de Oliveira do Hospital, Portugal, com coordenadas de Geo-
Posicionamento por Satélite (GPS): Latitude 40º 22min 53,48s Norte; Longitude 7º
56min 39,46s Oeste.
A designação adoptada para referir a pêra em estudo foi de pêra Tavares, em
referência ao proprietário da Quinta.
2.2 - Micropropagação e aclimatação
As plântulas para o estudo de aclimatação foram produzidas em laboratório (in
vitro) num processo que decorreu em três fases:
2.2.1 - Iniciação e estabelecimento
Foi utilizado tecido caulinar apical proveniente do abrolhamento de ramos do
ano anterior para a iniciação das culturas in vitro. Os explantes que foram
utilizados para a iniciação foram previamente desinfectados de forma a garantir a
assepsia das culturas. Utilizou-se uma solução desinfectante de hipoclorito de
sódio (comercial) a 50% durante 45 min., seguindo-se as lavagens em água
destilada estéril. Os explantes foram inoculados individualmente em meio de
multiplicação e repicados mensalmente.
2.2.2 – Multiplicação e alongamento
As culturas foram submetidas a um processo de proliferação in vitro: meio ½
MS (Murashige e Skoog, 1962); 3% de sacarose; 0,8% agar; 2,2 µM BAP +
0,5 µM IBA; fotoperíodo 16 h luz com intensidade de 32 µEm-2s-1com uma
temperatura de 23 ± 2ºC e repicagens de 5 em 5 semanas. Foram utilizados
contentores “Combiness”® com filtros XXL.
12
2.2.3 – Enraizamento
O enraizamento in vitro foi efectuado em meio ½ MS, 2% sacarose, 0,8% agar,
sem hormonas. Os explantes foram individualizados e colocados a enraizar após
imersão numa solução 1 mM IBA durante 5 s, depois incubados 5 dias na
escuridão e em seguida transferidos para a luz, nas mesmas condições das
culturas em multiplicação. Foram colocados 9 explantes por contentor e os
ensaios foram levantados após 5 semanas. Os ensaios foram repetidos ao longo
de 3 meses, tendo-se avaliado a percentagem de enraizamento, número de
raízes por explante, comprimento da maior raiz e comprimento da parte aérea,
determinando-se a média e o desvio padrão.
2.2.4 – Aclimatação
A aclimatação fez-se em estufa de vidro com refrigeração por ventilação
dinâmica de painel húmido e bancada aquecida a 25ºC (temperatura constante).
A estufa estava equipada com um sistema de pulverização de água na bancada
de modo a permitir um humedecimento constante das plantas. De forma a inibir a
dormência de Inverno e a consequente abscisão foliar, as plântulas foram sujeitas
a um fotoperíodo de dias longos (16 h luz) com recurso a ampliação de período
de iluminação natural usando lâmpadas de sódio pressurizado (400 W – SON/T)
com uma irradiância de 2000 mW.m-2 (N.V.Philips’Gloeilampenpenfabrieken,
1977).
Avaliou-se a percentagem de sobrevivência, número de raízes por plântula,
comprimento da maior raiz e comprimento da parte aérea, determinando-se ainda
o peso fresco e seco antes e 4 semanas após a aclimatação. Os valores foram
tratados em SPSS (2009).
Os dados foram tratados usando a aplicação “PASW Statistics” (SPSS, versão
18). Para determinar se as diferenças amostrais observadas nos valores médios
das variáveis das diferentes cultivares, sugerem diferenças entre as respectivas
populações, ou se são apenas variações casuais que podem ser esperadas entre
amostras aleatórias da mesma população, recorreu-se a técnicas de inferência
estatística paramétrica, dado que as variáveis consideradas provêm de
populações com distribuição normal e variâncias homogéneas. Para testar a
13
normalidade utilizou-se o teste de Shapiro-Wilk e para testar a homogeneidade
das variâncias o teste de Levene (Marôco, 2010).
A comparação de médias para as populações/substratos em estudo, fez-se por
análise de variâncias (ANOVA) (Fisher, 1936). Calculou-se a probabilidade de
significância (valor-p) para a estatística de teste e considerou-se um nível de
significância α = 0,05. Regra de decisão: rejeitar H0 se, ao nível de significância α,
F ≥ f1-α; (K-1,N-K) i.e. rejeitar H0 se valor - p ≤ α. Para as médias significativamente
diferentes comparou-se K médias, duas a duas, isto é. fez-se uma comparação
múltipla de médias usando o “teste post-hoc” Tukey. As diferenças significativas
para um intervalo de confiança de 95% estão marcadas com letras diferentes.
Fez-se a análise do desenvolvimento radicular e da parte aérea: número e
comprimento máximo das raízes das raízes; peso fresco e seco das raízes e parte
aérea (Folhas e caules).
2.2.5 – Análise de substratos
Foi testado o efeito do uso de diferentes substratos na aclimatação ex vitro de
plantas micropropagadas. As plantas foram conduzidas em estufa de vidro com
bancada aquecida a 25ºC (temperatura constante) e com sistema de pulverização
de água de modo a permitir um humedecimento constante das plantas. Usaram-
se três tipos de substrato: Substrato orgânico (SO); SO + perlite (½ + ½ , v/v) e
Perlite.
Fez-se a análise do desenvolvimento radicular e da parte aérea: número e
comprimento das raízes; peso fresco e seco das raízes e parte aérea. A avaliação
química do substrato “SO” foi feita por extracção aquosa [Grego e Rebelo (2011),
método Sonneveld e Voogt (2009) modificado] e por cloreto de cálcio + DTPA
(extracção CAT), [Grego e Rebelo, 2011, método CEN/TL 223 modificado (CEN),
2007]. Usou-se a extracção aquosa para: NO3; P; K; Ca; Mg e Na. Para os
micronutrientes Fe, Mn, Zn e Cu, usou-se a extracção CAT (Sonneveld e Voogt,
2009).
A – Extracção aquosa – modo operatório.
Colocou-se substrato numa forma metálica com altura – 11,28 cm e diâmetro –
5,3 cm e compactou-se a 10 kPa. Retirou-se uma porção de 100 mL e fez-se a
extracção com água destilada em frasco de plástico na relação de 1:1½ (v/v).
14
Agitou-se durante 1 h, seguidamente filtrou-se com papel de filtro de filtração
rápida. No filtrado procedeu-se às leituras de pH, condutividade eléctrica (C.E.)
(ms.cm-1) e azoto nítrico (mg.L-1).
A leitura de pH foi feita por electrometria e o doseamento por eléctrodo
combinado de prata/cloreto de prata. A C.E. foi feita por electrometria e o
doseamento por sonda de condutividade. A determinação do azoto nítrico (mg.L-1)
efectuou-se por método electrométrico, com utilização de eléctrodo selectivo do
ião nitrato. Procedeu-se ao traçado da curva padrão em “Microsoft Excel” com as
concentrações de 6200, 62, 6,2 e 0,62 mg.L-1 em solução aquosa, registando-se
em abcissas as concentrações de azoto nítrico (escala logarítmica) e em
ordenadas (escala linear) os valores das leituras potenciométricas (mV). A força
iónica é corrigida pela adição de solução ISA (Ionen-Starke-Adjustierlosung) para
inibição de interferências, devidas por exemplo aos ácidos orgânicos.
B – Extracção por cloreto de cálcio (CaCl2) + DTPA (Extracção CAT)
Colocou-se o substrato em forma tronco-cilíndrica com h – 11,28 cm e Ø –
5,3 cm e compactou-se a 0,9 kPa. Retirou-se um volume de 50 mL e fez-se a
extracção em frasco de plástico com o extractante: CaCl2 (0,01 mol.L-1 + DTPA a
0,002 mol.L-1, na relação 1: 5 (v/v). Agitou-se durante uma hora e a seguir filtrou-
se com papel de filtração rápida.
Filtrou-se de novo o extracto (A e B) com papel de filtro quantitativo e de
filtração lenta, retirou-se uma alíquota de extracto para balão de 25 ml e fez-se as
leituras de acordo com as rectas de calibração, para os elementos a determinar:
Ca, Mg, K, Na, Cu, Fe, Zn, Mn e P. A partir das soluções padrão a 100 mg.L-1 de
Ca, Mg, K, Na, Cu, Fe, Zn e Mn, procedeu-se às respectivas diluições, em matriz
aquosa ou cloreto de cálcio (CaCl2) + DTPA e adicionou-se um inibidor de
interferências. As concentrações dos padrões para execução das respectivas
curvas de calibração são: Ca – 0; 5; 10 e 15 mg.L-1; Mg – 0; 0,5; 1,0; e 1,5 mg.L-1;
K – 0; 2; 4 e 6 mg.L-1; Na – 0; 1; 2 e 3 mg.L-1; Cu – 0; 0,5; 1,0; 2,5; 5,0; 10,0 e
15,0 mg.L-1; Fe – 0,0; 0,5; 1,0; 2,5; 5,0; 10,0 e 15 mg.L-1; Zn – 0,0; 0,2; 0,5; 0,75;
1,0, 2,0 e 3,0 mg.L-1; Mn – 0,0; 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 6,0 e 9 mg.L-1.
Procedeu-se à diluição do extracto aquoso, de modo a obter leituras dentro dos
limites de linearidade dos elementos. Doseamento das concentrações por
espectrofotometria de absorção atómica.
Na matriz aquosa procedeu-se à determinação de Fósforo (P), por
15
espectrofotometria de absorção molecular, de visível, tendo por base uma curva
de calibração com as concentrações de 0, 20, 40, 80, 120, 160, 200 mg.L-1 de P.
Procedeu-se à diluição do extracto aquoso, de modo a obter leituras dentro do
intervalo da concentração dos padrões e utilizou-se uma solução de molibdato de
amónio/ácido ascórbico para desenvolvimento da cor.
As concentrações dos sais nas soluções extractantes foram convertidas em
concentrações de sais na solução do substrato (concentrações de sais na fase
aquosa do substrato) à capacidade de retenção para a água. Esta representação
oferece a vantagem de comparar a composição química da solução do substrato
e a composição das soluções nutritivas que possam ser aplicadas em fertirrega
nos substratos.
A conversão é feita utilizando a fórmula de Dartigues,1980.
CSS = (1,27 + da2) X [ CSV]
Em que: CSS – Concentração de sais na solução do substrato. Da – densidade
aparente do substrato. CSV – Concentração de sais por unidade de volume de
substrato. Para a determinação da salinidade total a partir da condutividade
eléctrica (CE) considerou-se um valor ponderal médio de 1 ms.cm-1 = 0,8 g de
sais dissolvidos por litro.
2.3 - Caracterização da variedade de Pyrus communis L. em estudo
2.3.1 – Caracterização fenológica
A observação dos estados fenológicos foi realizada no pomar de ocorrência da
pereira Tavares a caracterizar, por registo das datas de ocorrência de cada
estado fenológico, utilizando como referência a escala de Fleckinger
(DRAPCentro, s.d.), Figura 2.1.
16
Figura 2.1 - Escala de Fleckinger (DRAPCentro, s.d.)
2.3.2 – Caracterização dos frutos
2.3.2.1 – Dureza
A dureza, ou firmeza, da pêra foi medida em kg/cm2 com um penetrómetro
digital de bancada, com ponteira de 8 mm. Com auxílio de um descascador
apropriado, retirou-se um pouco da epiderme e polpa superficial em quatro pontos
equidistantes de cada fruto, de forma a tornar a superfície plana, no local a ser
perfurado pelo êmbolo do penetrómetro. O teste foi efectuado quatro vezes por
fruto, em quatro frutos de calibres distintos. O valor apresentado corresponde à
média das dezasseis determinações realizadas.
17
2.3.2.2 – Índice de Refracção (ºBrix)
O Índice de Refracção (IR), ou teor de sólidos solúveis, expresso em ºBrix, foi
determinado com recurso a um Refractómetro digital Aago. Após calibração,
foram colocadas algumas gotas de sumo sobre o leitor do aparelho. O teste foi
efectuado quatro vezes por fruto, a partir dos mesmos frutos utilizados para a
determinação da dureza. Foi ainda realizada uma determinação adicional, com o
sumo conjunto obtido dos quatro frutos utilizados na determinação da acidez
titulável. O IR apresentado corresponde à média das cinco determinações
realizadas.
2.3.2.3 – Titulação (acidez titulável)
Para a determinação da acidez titulável obteve-se, com recurso a uma
centrifugadora, o sumo dos mesmos quatro frutos da amostragem do IR. Após
homogeneizar e filtrar a amostra, foram adicionadas 3 gotas fenolftaleína a 10 ml
de sumo. De seguida utilizou-se o método de titulação com hidróxido de sódio
(NaOH) a 0,1 N a fim de neutralizar os ácidos existentes no sumo. O ponto de
neutralização foi determinado quando a cor da solução mudou para tonalidade
rosa devido à presença da fenolftaleína. A determinação foi realizada em
duplicado.
O ácido málico é um dos ácidos orgânicos mais abundantes na pêra. O valor
de acidez, expresso em ácido málico (g/l), obteve-se multiplicando o volume gasto
de NaOH (em mL) por 0,67. O valor apresentado corresponde à média das duas
determinações realizadas.
2.3.3 – Caracterização da componente volátil
2.3.3.1 – Material vegetal
Nos diferentes ensaios de estudo da componente volátil foram avaliadas,
comparativamente, a pêra Tavares e a pêra Rocha, de acordo com a amostragem
referida no Tabela 2.1.
18
Tabela 2.1 - Dados relativos ao tipo de pêra analisada e condições de armazenamento.
Amostra Data de Condições Data de P.E. Rendimento Código
Colheita Extracção (%, v/p.f.)
Pêra Tavares Agosto /
2010
Câmara 6ºC, 4 meses Novembro / 2010 H <0.05 T_C_10
Agosto /
2011
Câmara 6ºC, 2 meses Setembro / 2011 H <0.05 T_C_11
Agosto /
2011
Câmara 6ºC, 2 meses + Frigorífico,
1 mês a 4ºC
Outubro / 2011 H <0.05 T_CF_11
Pêra Rocha Agosto /
2010
Pêra de Agricultura Biológica* Novembro / 2010 H <0.05 R_10
Agosto /
2011
Câmara 6ºC, 2 meses Setembro / 2011 H <0.05 R_C_11
Agosto /
2011
Câmara 6ºC, 2 meses + Frigorífico,
1 mês a 4ºC
Outubro / 2011 H <0.05 R_CF_11
*adquirida numa Superfície Comercial; P.E.: Processo de extracção, por Hidrodestilação (H).
2.3.3.2 - Isolamento da componente volátil
A componente volátil (óleo essencial) foi isolada por hidrodestilação, durante
3 h, num aparelho do tipo Clevenger (Council of Europe, 2007), com uma
velocidade de destilação de 3 ml/min. As amostras de óleo essencial foram
armazenadas a -20ºC até análise.
2.3.3.3 – Cromatografia Gás-Líquido
As análises de Cromatografia Gás-Líquido (CGL) foram efectuadas num
cromatógrafo Clarus 400 equipado com dois Detectores de Ionização de Chama
(DIC), um sistema de tratamento de dados e um injector, no qual foram instaladas
duas colunas de polaridade diferente: DB-1 de sílica fundida, de fase imobilizada
de metilsilicone, (30 m x 0,25 mm d.i., espessura de filme 0,25μm; J & W Scientific
Inc.) e DB-17HT de sílica fundida (30 m x 0,25 mm d.i., espessura de filme
0,25μm; J & W Scientific Inc.). A temperatura do forno foi programada de 45°C a
175°C, com incrementos de 3°C/min, e subsequentemente a 15°C/min até 300°C.
Atingidos os 300°C a temperatura foi mantida isotérmica durante 10 min.
Temperatura do injector e dos detectores, 290°C e 280°C, respectivamente. Gás
de arrastamento, hidrogénio, ajustado para uma velocidade linear de 30cm/s.
Relação de repartição de fluxo, 1:50. A composição percentual dos óleos foi
determinada pela integração das áreas dos picos sem utilização de factores de
19
correcção. Os valores apresentados correspondem ao valor médio de duas
injecções.
2.3.3.4 – Cromatografia Gás-Líquido / Espectrometria de Massa
Nas análises de Cromatografia Gás-Líquido / Espectrometria de Massa
(CGL/EM) utilizou-se um Clarus 600 equipado com uma coluna de sílica fundida
DB-1 (30 m x 0,25 mm d.i., espessura de filme 0,25μm; J & W Scientific Inc.)
ligado a um Perkin-Elmer Turbomass Clarus 600T (versão de programa 4.1). A
temperatura do forno foi programada de 45 a 175˚C, com incrementos de 3˚C/min,
e subsequentemente a 15˚C/min até 300˚C. Atingidos os 300˚C a temperatura foi
mantida isotérmica durante 10 min; temperatura da linha de transferência, 280˚C;
temperatura da câmara de ionização, 220˚C; gás de arrastamento, hélio, ajustado
para uma velocidade linear de 30 cm/s; relação de repartição de fluxo, 1:40;
energia de ionização, 70 eV; corrente de ionização, 60 µA; gama de massas, 40-
300 u; tempo de varrimento, 1 s.
A identidade dos compostos foi determinada por comparação dos seus índices
de retenção, em relação aos dos n-alcanos C8-C24 e espectros de massa, com os
de padrões comerciais e compostos de referência presentes em óleos existentes
no laboratório e por comparação com uma biblioteca de espectros de massa
desenvolvida no laboratório.
2.3.3.5 – Análise estatística dos resultados
A composição percentual dos voláteis foi ainda utilizada na determinação da
relação entre as diferentes amostras, pela análise de cluster, usando o programa
NTSYS (Rohlf, 1992). A correlação foi seleccionada como medida de semelhança
e utilizou-se o agrupamento segundo a associação média (UPGMA) na definição
dos clusters. O grau de correlação foi avaliado de acordo com Pestana e Gageiro
(2000) em: muito elevado com uma correlação entre 0.9 e 1, elevado, entre 0.7 e
0.89, moderado, entre 0.4 e 0.69, baixo, entre 0.2 e 0.39 e muito baixo se <0.2.
2.3.4 – Água de decocção dos frutos
As águas de decocção, obtidas após destilação dos frutos de pêra Tavares e
de pêra Rocha, e sob a forma de extractos liofilizados, foram utilizadas na
20
determinação do conteúdo em fenóis totais e na avaliação da actividade
antioxidante. Para obtenção dos extractos liofilizados, as águas de decocção
foram congeladas durante 24 h, após o que foram colocadas num liofilizador
Alpha I-5 (Christ) a uma pressão de 10-1mbar, a -42°C, durante 3 dias.
2.3.4.1 – Quantificação de fenóis pelo reagente de Folin-Ciocalteu
A quantificação dos fenóis totais é geralmente feita por este método que se
baseia no número de grupos fenólicos ou noutros potenciais grupos oxidáveis
presentes nos compostos da amostra. A natureza química do reagente de Folin-
Ciocalteu não é conhecida exactamente, mas crê-se que contenha hetero-
polifosfotungstatos-molibdatos. Sequências de reacções de redução reversíveis
envolvendo um ou dois electrões, originam espécies azuis, muito possivelmente
(FenóisMoW11O40)-4. Crê-se que o Mo é mais fácil de ser reduzido no complexo e
as reacções de transferência do electrão ocorrem entre os agentes redutores e o
Mo(VI) + e- → Mo(V).Os compostos fenólicos só reagem com o reagente de Folin-
Ciocalteu em meio básico. Esta é a razão pela qual é necessário adicionar
carbonato de sódio para que a solução fique com um pH próximo de 10. A este
pH forma-se o anião fenolato a partir do composto fenólico, por perda do protão.
O ião fenolato é capaz de reduzir o reagente de Folin-Ciocalteu, formando-se
compostos azuis. Estes são independentes da estrutura dos compostos fenólicos
(Huang et al., 2005).
Para a determinação dos fenóis totais foi necessário preparar uma solução de
Folin-Ciocalteau (Merck) numa proporção de 1:10 (1 ml do reagente Folin-
Ciocalteau em 10 ml de etanol a 75%), uma solução aquosa de carbonato de
sódio (Pronolab) (75 g/100 ml) e diluir as amostras numa diluição apropriada.
Adicionou-se 0,8 ml da solução de carbonato de sódio, 0,2 ml da amostra
diluída e 1 ml da solução de Folin (1:10). Homogeneizou-se a mistura num vórtex
e deixou-se repousar durante 30 min à temperatura ambiente e ao abrigo da luz.
Ao fim de 30 min centrifugou-se a mistura (5000 rpm) durante 5 min e fez-se a
leitura da absorvância por espectrofotometria UV-Visível num espectrofotómetro
Ultrospect 1100 pro a um comprimento de onda de 765 nm.
O conteúdo fenólico total foi estimado a partir de uma curva padrão de ácido
gálhico e os resultados expressos em mg de ácido gálhico equivalente por 100
gramas de amostra fresca [mg GAE / 100 g (p.f.)].
21
2.3.4.2 – Trolox Equivalent Antioxidant Capacity (TEAC) ou método ABTS
Neste método utiliza-se um oxidante, o ABTS•-, que se forma por oxidação do
ácido 2,2’-azinobis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) (ABTS2-) por acção do
persulfato de potássio (Reet al.,1999). Este método consiste em determinar a
redução do radical ABTS•-, resultante da oxidação do ABTS por adição de uma
amostra contendo antioxidantes. A quantidade de ABTS•- consumido é
determinada pela reação deste com os fenóis existentes na amostra. O ABTS•-
absorve na região dos 600-750 nm, podendo ser facilmente determinado por
espectrofotometria. Na ausência de compostos fenólicos, o ABTS é estável, no
entanto, reage facilmente com uma espécie dadora de eletrões, sendo então
convertido na forma incolor de ABTS2- (Huang et. al., 2005).
Preparou-se previamente uma solução ABTS – ácido 2,2'-azinobis-3-
etilbenzotiazolina-6-sulfónico (FlukaAnalytical), misturando em partes iguais (v:v)
de solução ABTS 7,0 mM e de solução de persulfato de potássio 2,47 mM (Acros
Organics). Esta reagiu por 12-16 h, em temperatura ambiente e ausência de luz.
Após formado o radical ABTS•- adicionou-se etanol à solução até se obter um
valor de absorvância de 0,700 a 0,800 a 735 nm (a diluição pode ser feita até 1/50
em etanol a 96%). O radical é estável sobre esta forma por mais ou menos dois
dias quando guardado no escuro a uma temperatura ambiente.
A determinação da absorvância das amostras foi realizada em temperatura
ambiente, após 6 min de reação, por espectrofotometria (Shimadzus
pectrophotometer 160-UV). Numa cuvette colocou-se 990 µl de ABTS leu-se a
735 nm e registou-se o seu valor e colocou-se 10 µl da amostra, agitou-se e
esperou-se 6 min, leu-se outra vez e registou-se o seu valor. Procedeu-se de
igual modo na preparação dos padrões, substituindo os 10 µl de amostra por 10 µl
de padrão.
2.3.4.3 - Oxygen radical absorbance capacity (ORAC)
Neste ensaio mede-se a capacidade antioxidante ou a capacidade de
absorvância dos radicais peroxilo presentes nas amostras. Neste método há uma
fonte controlável que produz os radicais peroxilo, geralmente, a termo-
decomposição do composto α,α’- azodiisobutiramidina, 2HCl (AAPH):
22
R-N=N-R + O2→ N2 + 2ROO•.
Uma forma simples de quantificar a actividade antioxidante consiste na
utilização de um espectrofluorímetro, medindo a diminuição da fluorescência nos
comprimentos de onda de excitação e de emissão de 485 nm e 528 nm,
respectivamente:
ROO•+ substância fluorescente (fluoresceína) → ROOH + fluoresceína oxidada
(sem fluorescência).
A determinação do poder antioxidante pelo método ORAC baseia-se na medida
da redução da concentração de um substrato oxidável (Fluoresceína) ao longo do
tempo, de acordo com Chandrase kara et. al. (2011).
A determinação do ORAC realizou-se usando uma placa de 96 micropoços,
preta e estéril (VWR) que se colocou a incubar num Synergy™ 4 Multi-detection
Microplate Reader, com um comprimento de onda de excitação em 485 nm e de
emissão em 528 nm. Utilizou-se como sonda sintética, a fluoresceína (Sigma-
Aldrich), cuja fluorescência decai, indicando assim, a intensidade da sua reacção
com os radicais formados.
Os extratos das amostras foram centrifugados a 14000 rpm durante 5 min
numa Microcentrifugadora (Hetich Refrigerada Micro 200R) e o sobrenadante foi
utilizado para a análise, depois de se ter efetuado uma diluição apropriada com a
solução de tampão fosfato 75 mM (pH 7,4).
O ABAP (0,4 g) foi completamente dissolvido em 4 ml de tampão fosfato
75 mM (pH 7,4) e foi mantido no congelador. A solução “stock” de fluoresceína
(mM) foi feita em tampão fosfato 75 mM (pH 7,4) e foi mantida a 4 °C, no escuro.
A solução de trabalho (solução intermédia) de fluoresceína foi feita diluindo-se
0,4 ml da solução stock em 10 ml de tampão fosfato 75 mM (pH 7,4). A solução
de fluoresceína foi feita no próprio dia, diluindo-se 0,2 ml da solução intermédia
em 10 ml de tampão fosfato 75 mM (pH 7,4).
Assim, para a preparação do controlo pipetou-se directamente para os poços
50 µl de tampão fosfato de potássio (K2HPO4 a 1M, Merck), 150 µl de fluoresceína
e deixou-se incubar durante 10 min a 37 °C. Após os 10 min, adicionou-se 25 µl
de ABAP. A placa foi agitada durante 30 s e foram iniciadas as leituras. O leitor da
placa foi programado para efetuar agitação adicional ao conteúdo dos poços
antes de se efetuar cada leitura, de forma a obter uma sensibilidade máxima.
Para a preparação das amostras colocaram-se 150 µl de fluoresceína e 25 µl
de amostra. Deixou-se incubar tal como efetuado no controlo durante 10 min, com
23
a posterior adição de 25 µl de ABAP, sendo realizadas três leituras independentes
para cada uma das amostras.
Para a curva padrão, o procedimento é idêntico ao utilizado para preparar as
amostras, no entanto, a amostra é substituída pelas diferentes concentrações de
padrão Trolox. A gama de concentrações utilizadas para construir a reta de
calibração foi de 3,125; 6,25 12,5 e 25 µM.
Os valores finais ORAC foram calculados usando a reta de calibração entre a
concentração de Trolox e o Net AUC obtido das leituras.
O AUC foi calculado pelo aparelho pela seguinte expressão:
AUC = 0.5 + f1/f0 + ... fi/f0 + ... + f180/f0 + 0.5(f181/f0).
Onde:
f0 é a leitura inicial da fluorescência no tempo 0 e f1 é a leitura de fluorescência
no momento da leitura.
O net AUC é obtido subtraindo-se a AUC do branco a partir de uma amostra:
[(AUCamostra - AUCbranco)/(AUCTROLOX – AUCbranco)]
A capacidade antioxidante é expressa em micromoles de Equivalentes Trolox
por grama de massa seca.
24
3 - Resultados e Discussão
3.1 - Micropropagação
3.1.1 – Estabelecimento e multiplicação
Os meristemas apicais isolados foram estabelecidos em cultura com sucesso
(Figura 3.1A e 3.1B).
A fase de multiplicação iniciou-se 3 meses após a inoculação das culturas. Na
produção de novos rebentos axilares não foi observada formação de callus nem
produção de fenóis que poderiam inibir a proliferação in vitro. As plântulas
multiplicadas apresentavam morfologia semelhante a planta mãe. No
alongamento prévio ao enraizamento as plântulas apresentavam dimensão média
de 1 cm (Figura 3.1C).
3.1.2 – Enraizamento
Na fase de enraizamento não se verificou a formação de callus basal como se
pode observar na Figura 3.1D. Os primórdios radiculares foram observados ao fim
de 8 dias. Na Tabela 3.1 apresentam-se os resultados dos diferentes
enraizamentos efectuados. Verificou-se que a média de enraizamento foi de
87,9%, em cada plântula verificou-se um número médio de 2,5 raízes, obteve-se o
valor de 6,8cm do comprimento da parte aérea e o comprimento médio da parte
aérea de 1,9cm.
Tabela 3.1 – Média de enraizamento, número médio de raízes, comprimento da maior
raiz e comprimento médio da parte aérea.
09-3-2011 20-5-2011 22-6-2011 Média Final
Percentagem de enraizamento 77,6 88,2 97,8 87,9
N.º médio de raizes por explante 2,4 2,8 2,3 2,5
Comprimento médio da maior raiz (cm) 5,9 7,6 7,0 6,8
Comprimento médio da parte aérea (cm) 1,9 1,9 1,9 1,9
Nas plântulas de pereira enraizadas verificou-se que as raízes possuíam
poucos pêlos radiculares de acordo com o referido por Debergh & Maene (1981) e
Simmonds (1983), que afirmaram que as raízes crescidas em agar geralmente
25
não possuem pêlos absorventes.
AB
C D
E
A
E F
Figura 3.1 – A Gomos apicais, B Detalhe de gomo apical, C Contentor com plântulas em
multiplicação, D Detalhe do enraizamento, E Plantas em início da aclimatação, F Planta
com 5 semanas de aclimatação.
Contrariamente ao referido por estes autores não se verificou mortalidade
excessiva na aclimatação. Zimmerman (1981) referiu que o enraizamento em
agar é insatisfatório, devido ao volume de calo produzido, com as raízes
formando-se acima dele, no entanto na espécie de pereira em estudo este
problema não foi encontrado.
Estudo feitos na formação de raizes in vitro em explantes da cultivar
'Conference' e 'Doyenne d'Hiver' demostra que estes são afectados pela luz e por
auxinas externas. Para os explantes de 'Doyenne d'Hiver' o suplemento de IBA é
essencial para o aparecimento e consistência das raízes (Bertazza,1995). A
mergulhia em IBA é significativamente melhor do que o controlo, mas não possui
26
diferença significativa perante o tratamento com o meio com a adição de 10mM
IBA, ambos induzem raízes (Reed, 1995). Com altas concentrações de
reguladores de crescimento (0.5-2.0 mgl-1), a resposta da rizogenese é mais
significativa no IBA do que no NAA (Takura, 2008).
3.1.3 – Aclimatação
As plantas foram colocadas em tabuleiros para se proceder a aclimatação Figura
3.1E, e passado 4 semanas fez-se o levantamento (Figura 3.1.F).
Em todos os tratamentos obteve-se uma percentagem de plantas aclimatadas
de 100%.
Os substratos utilizados não permitiram efeitos estatisticamente significativos
sobre o número e comprimento máximo das raízes. Os substratos geraram pesos
frescos de raízes e parte aérea com diferenças (p= 0,014 e =0,000,
respectivamente). Os substratos SO e SO + perlite deram origem a maior peso
fresco de raízes e SO a maior peso de parte aérea. Não existem diferenças para
os pesos secos (Figuras 3.2 e 3.3).
Legenda:
Figura 3.2 – Distribuição do número e comprimento máximo (cm) das raizes com os três
tratamentos. A linha a negrito representa a mediana entre o 1º Quartil (extremo inferior da
caixa e o 3º Quartil (extremo superior da caixa). As barras inferiores e superiores
representam, respectivamente o mínimo e o máximo das distribuições. Nº 16, 18 e 23 –
outliers.
27
- I- II- III- IV
I
I
I
II II II
III
III
III
IV IVIV
a
b
b
c c
d
Legenda:
Figura 3.3 – Distribuição do peso fresco e seco das raízes e parte aérea com 3
tratamentos. As letras diferentes correspondem a valores significativamente diferentes de
acordo com o teste HSD de Turkey seguido das comparações múltiplas de médias para
α=0,05. Nº 2, 15,16, 24 e 27 – outliers.
3.1.4 – Análise de substratos
A análise ao substrato “SO” determinou os seguintes elementos determinados
em (mg.L-1) de extrato. Valores representados na seguinte Tabela 3.2.
Tabela 3.2 – Elementos determinados (mg.L-1) de extrato em extração aquosa 1:1½ (v/v)
e em extração CaCl2.DTPA (1:5 v/v).
Elementos determinados (mg.L-1)
de extrato
Extração aquosa 1:1½ (v/v) Extração CaCl2.DTPA (1:5 v/v)
Ca 256,00 -
Mg 107,00 275,00
K 130,00 191,00
Na 45,60 89,50
Cu 0,01 0,01
Fe 0,70 29,30
Zn 0,60 2,50
Mn 0,20 6,70
N-NO3- 761,00 -
pH 5,60 3,67
Condutividade elétrica (ms.cm-1) 1,58 3,98
28
3.2 - Caracterização da variedade de Pyrus communis L. em estudo
3.2.1 – Caracterização fenológica
O registo das datas de ocorrência dos diferentes estados fenológicos da pêra
Tavares são detalhados na Tabela 3.3, e o registo fotográfico do aspecto dos
diferentes estados nas Figura 3.4 e 3.5.
Das observações realizadas aos estados fenológicos, verificou-se que a pereira
Tavares é uma pereira de Verão, uma vez que apresenta frutos que amadurecem
em Agosto.
Tabela 3.3 - Datas de ocorrência dos estados fenológicos para a pêra Tavares.
Estado fenológico Data
A- Repouso vegetativo 28-02-2011
B – Pré-abrolhamento 06-03-2011
C - Abrolhamento 08-03-2011
D - Botão verde (aparecimento das pontas verdes das flores) 15-03-2011
E- Botão branco 19-03-2011
F1- Desabrolhamento 1.ª Flor aberta 24-03-2011
F2 - Plena floração
G - Inicio da queda das pétalas
H - Queda das ultimas pétalas
I - Vingamento dos frutos
J - Frutificação
Segundo comunicação pessoal do Engenheiro responsável da quinta onde se
encontra o exemplar da espécie em estudo, a frutificação de 2010 mostrou um
desfasamento de 10 dias, comparativamente com o observado para a pêra
Rocha, no mesmo ano.
Por motivos alheios ao decurso deste trabalho não foi possível completar a
caracterização fenológica, pelo que seria da maior importância fazer a recolha de
dados durante o corrente ano.
29
A B C
D E
F G
Figura 3.4 – A Pré abrolhamento, B Abrolhamento, C Detalhe de ramo, D Detalhe de
abrolhamento, E Detalhe do botão verde, F Detalhe do botão rosa, G Detalhe sépala.
30
H I
J
L
M
NO
Figura 3.5 – H Exemplar da cultivar em estudo, I Desabrochamento, J Detalhe do
desabrochamento, L Ramo com página superior da folha, M Ramo com página inferior da
folha, N Detalhe página superior da folha, O Ramo com página inferior da folha.
3.2.2 – Caracterização dos frutos
Na caracterização de variedades de pomóideas regionais são tidos em conta um
conjunto de parâmetros, entre os quais parâmetros específicos do fruto. Com
vista a caracterizar a cultivar de pereira Tavares, foi realizada uma avaliação
preliminar, de um conjunto de critérios analíticos específicos do fruto (Tabela 3.4).
A pêra Tavares tem forma cónica, mais ou menos alongada, com um pedúnculo
31
curto e carnudo. O calibre médio é de 60 e 70mm (Figuras 3.6 e 3.7). A coloração
do fruto é verde, matizado raiado de vermelho na face voltada para o sol.
Normalmente o fruto não apresenta a rugosidade típica de muitas pêras,
designada por carepa. A polpa é branca, doce, não ácida, sumarenta e de óptimo
paladar (Tabela 3.4).
Com base na análise comparativa dos diferentes parâmetros verificou-se que a
pêra Tavares não se identifica com nenhuma das cultivares descritas, inicialmente
referenciadas como potenciais cultivares (Tabela 3.4).
P
Q
Figura 3.6 – P Frutos da cultivar em estudo, Q Detalhe dos frutos.
32
R
S
Figura 3.7 - R Detalhe do interior do fruto, S Detalhe da semente.
33
Tabela 3.4 – Parâmetros de caracterização comparativos entre diferentes cultivares e a
pêra Tavares.
Frutos Pêra
Parâmetro Marmela S. Bartolomeu Rocha Williams's Tavares
Outras Designações
(Nacional)
Flamenga,
Marmela de
Verão, Moscatel
Passa de
Viseu,
Carvalhal, de
secar, Rouval,
Ruival,
Vermelha ou de
Viseu
Outras Designações
(Internacional)
França: Bom
Chrétien d'Eté,
Itália: Gracioli
França: Bom
Chrétien,
USA: Bartlett
Coloração Verde, matizado
raiado de
vermelho na face
voltada para o sol
Verde-
amarelado,
matizado
manchado de
vermelho na
face voltada
para o sol
Verde-amarelado.
Por vezes mancha
ténue vermelha na
face voltada para o
sol
verde,
amarela a
maturação
Verde, matizado
raiado de
vermelho na face
voltada para o
sol
Carepa Normalmente
sem carepa.
Quando presente
ocorre na base e
na face apical
Normalmente
com carepa na
base e na fossa
apical
Sempre com
carepa. Unida na
base e dispersando
pela superfície
Normalmente
sem carepa.
Quando presente
ocorre sobretudo
na base
Pontuações Evidentes Evidentes Evidentes Evidentes Evidentes
Sépalas Divergentes Divergentes Convergentes
Pedúnculo (cm) 3 4 3 2
Forma Arredondada Oblonga
Piriforme
obovada
Variável.
Predominantes as
formas redonda
ovada, redonda
piriforme, piriforme
ovada e oblonga
piriforme
Piriforme,
regular,
simetrica com
pedunculo
carnudo
Oblonga
Piriforme
obovada
Polpa (Textura) Granitada Granitada Granitada Macia Macia
Polpa (Facilidade de
oxidação)
Baixa Baixa Baixa (apenas
por apreciação
visual)
Dureza (Kg/0.5cm2) 3,5 4,2 5.6 a 6.5 1.5 a 2.5 2,2
Índice Refractométrico
(IR) (ºBrix)
13 14 11 a 13 11 a 15 18
Acidez (Ácido málico)
(g/l)
2 5 2 a 3 2 a 4 2
Calibre médio (↔ ↕)
(mm)
83 e 75 54 e 74 60 e 65 65 a 70 60 e 70
Peso (g) 246 95 130 138
Matéria seca (%) 17 19 22
Referência AGRO 740,
BORGES 1999
AGRO 740,
BORGES 1999
ANP (s.d.),
BORGES 1999
VAYSSE et al.
2000
34
3.2.3 – Caracterização da componente volátil dos frutos
A componente volátil isolada, quer da pêra Tavares, quer da pêra Rocha, foi
obtida num rendimento <0.05% (v/p.f.).
A análise comparativa do perfil de compostos voláteis dos frutos de ambos os
cultivares (Tabela 3.5), mostrou, nos dois casos, a dominância do mesmo tipo de
compostos, ainda que se verifiquem diferenças importantes, em termos de
compostos minoritários. Estas diferenças podem determinar a desigualdade
aromática dos dois cultivares.
Tabela 3.5 - Composição química percentual da componente volátil isolada dos frutos de
dois cultivares de pêra (Pyrus communis L.), em dois anos consecutivos e mantidas em
diferentes condições de armazenamento (vide Tabela 2.1).
Pyrus communis L.
Componentes Tavares Rocha
IR T_C_10 T_C_11 T_CF_11 R_10 R_C_11 R_CF_11
Álcool isopentílico 836 1.6 1.4 1.1 0.4 1.0 0.6
n-Hexanal 854 0.1 v v v v v
Acetato de butilo 854 11.7 v 8.8 18.2 0.9 22.5
n-Hexanol 882 3.8 0.6 3.3 4.4 4.7 5.3
Acetato de 2-metil butilo 882 1.8 v v v v v
Acetato de pentilo 908 0.7 v 0.4 0.9 v 2.1
5-Metil furfural 938 0.3
n-Heptanol 952 v v v 0.1 v v
6-Metillhept-5-en-2-ona 960 v v v v v v
2-Pentil furano 973 v v v v v v
Acetato de hexilo 995 55.1 0.4 20.8 36.4 1.4 38.4
Benzeno acetaldeido 1002 v v v v v v
A 0.1 v
n-Octanol 1045 v v v 0.4 0.6 0.1
n-Nonanal 1073 0.1 0.5 0.1 0.5 8.7 1.1
Ester hexilico do ácido propiónico 1079 v v v v v v
Acetato de heptilo 1086 v v v 0.2 v v
n-Undecano 1100 v v v v v v
Isobutanoato de hexilo 1127 0.1 v v v v v
n-Nonanol 1151 0.2 v v v v v
Metilo chavicol 1163 0.3 v 0.6 0.1 v 0.3
Butanoato de hexilo 1173 0.4 v 0.5 0.1 0.6 v
Octanoato de etilo 1170 v v v
n-Decanal 1180 v v v 0.6
Acetato de octanol 1189 0.2 v v v v 0.3
Éster hexilico do ácido 2-metil butírico 1220 0.1 v 0.1 v v v
2-trans-Decenal 1224 v v 0.1 v 1.8 v
Hexanoato de isoamilo 1240 v v v v v
35
Pyrus communis L.
Componentes Tavares Rocha
IR T_C_10 T_C_11 T_CF_11 R_10 R_C_11 R_CF_11
trans-Anetole 1254 v v v v v
2-trans,4-trans-Decadienal 1286 0.1 v v v v
n-Undecanal 1288 0.6
Ácido decanóico 1350 v v v v v
cis-β-Damascenona* 1352 0.1 v 0.5 v 0.6 v
trans-4-Decenoato de etilo* 1371 0.2 1.5 0.4
α-Copaeno 1375 v 0.7 v v 1.6 v
Hexanoato de hexilo 1375 1.0 0.7 1.4 0.7 1.6 0.7
Ester metilico do ácido 2-trans,4-cis-
decadienóico 1376 v v 0.5 0.7 v 0.5
Decanoato de etilo 1387 0.2 v v 0.9 v 0.6
β-Elemeno 1388 v v v
n-Dodecanal 1397 v v v v 1.6 v
Ester metilico do ácido 2-cis,4-trans-
decadienóico 1408 0.1 v v v v
trans-2-Decenoato de etilo 1433 0.2 v
Acetona de geranilo 1434 v v v v v v
B 1440 0.4 0.6
C 1447 0.9 0.7
α-Humuleno 1447 v v v
2trans, 4cis-Decadienoato de etilo 1450 v v 0.5 3.6 6.4
trans-Metilisoeugenol 1471 0.4 v
Miristicina 1493 0.5
cis,trans-α-Farneseno* 1493 0.1 v 0.8 0.3 0.8 3.2
B' 1493 v v v v v
α-Muuroleno 1494 v 0.2 v
n-Tridecanal 1499 v 0.2 v 0.8 2.1 v
trans,trans-α-Farneseno 1500 4.0 12.0 32.8 14.9 7.1 6.3
n-Pentadecano 1500 v v v v v v
δ-Cadineno 1505 0.3 4.1 1.0 0.2 1.7 v
Benzoato de hexilo 1550 0.1 0.4 1.0 0.1 v
Nonil valerato 1574 0.3 v
Dodecanoato de etilo 1580 0.3 v
n-Tetradecanal 1596 1.8
n-Hexadecano 1600 v
β-Atlantona 1653 0.1 v 0.1
D 1666 0.7 0.8 1.3 0.7 0.5
cis,cis-Farnesol 1672 0.9 0.4 0.4
n-Pentadecanal 1688 1.3
Acetato de trans,trans-farnesilo* 1691 2.9 0.8 8.2 1.3 1.2
E 1718 0.5 2.2
F 1719 1.1 2.4
G 1720 3.0 1.5
Ácido tetradecanóico 1723 1.4
Tetradecanoato de etilo 1774 0.2 v
n-Hexadecanal 1776 1.7
n-Hexadecanol 1821 0.5 5.6
n-Nonadecano 1900 0.6
Hexadecanoato de metilo 1904 0.1 0.4 v 0.2 v
Ácido palmítico 1908 0.6 13.9 1.4 0.2 10.8 0.1
Hexadecanoato de etilo 1936 0.1 0.6 0.2 0.3 v
36
Pyrus communis L.
Componentes Tavares Rocha
IR T_C_10 T_C_11 T_CF_11 R_10 R_C_11 R_CF_11
2-Etilo hexil salicilato 1974 3.8 1.3
n-Octadecanal 2008
Miristato de isopropilo 2055
n-Octadecanol 2071 0.9
Acido linoleico 2125 0.3 5.0 1.2 0.3 1.6 v
Linoleato de etilo 2137 1.8 2.6 1.9
H 2162 0.9 0.4
Estereato de etilo 2163 1.3 4.7 1.7
Hexadecanoatoisoamilo 2476 0.5
n-Docosanol 2498 2.5 4.9
% de Identificação 91.0 57.7 90.7 95.9 71.4 98.7
IR: Índices de retenção relativos a uma série de n-alcanos C8-C25, numa coluna DB-1; v: vestigial
(<0,05%); A-H: compostos não identificados; *Compostos identificados apenas com base no espectro de
massa.
Entre os compostos dominantes, isto é, compostos presentes numa
percentagem >10% em pelo menos uma das amostras analisadas, Tabela 3.5;
destacaram-se o acetato de hexilo (0.4-55%), o trans,trans-α-farneseno (4-33%),
o acetato de butilo (v-23%) e o ácido palmítico (0.1-14%). Os ésteres e compostos
terpénicos revelaram-se assim maioritários, em ambos os cultivares.
A análise do dendrograma, Figura 3.8, revela a formação de dois
agrupamentos (clusters) muito pouco correlacionados (Scor<0.2), e que parecem
discriminar as amostras com base no processo de armazenamento dos frutos.
Dentro de cada agrupamento encontram-se, em simultâneo, as amostras de
pêras Tavares e de pêra Rocha, revelando correlação na composição da
componente volátil dos dois tipos de frutos.
Sendo o acetato de exilo um composto presente numa percentagem elevada
quer na pêra Rocha, quer na Tavares, e também descrito na literatura como
abundante em outras variedades de pêra, como a William’s (Rapparini e Predieri,
2003), a presença deste composto não parece constituir um caracter
diagnosticante entre as várias cultivares.
Dois dos compostos dominantes, o acetato de hexilo e o acetato de butilo, são
compostos frequentes na componente volátil de muitos frutos e responsáveis pelo
característico odor, e sabor, frutado. O trans,trans-α-farneseno, igualmente
abundante, é um dos compostos responsáveis pelo aroma de “maçã verde”.
37
Coeficiente de Correlacção0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0
MW
T_C_10
R_10
R_CF_11
T_CF_11
T_C_11
R_C_11
Figura 3.8 - Dendrograma obtido por análise aglomerativa em grupos (clusters). A
correlação foi seleccionada como medida de semelhança e utilizou-se o agrupamento
segundo a associação média (UPGMA) na definição dos clusters. Para definição de
códigos vide Tabela 2.1.
Uma revisão de Rapparini e Predieri (2003) identificou como compostos mais
frequentemente referenciados na literatura na componente volátil da pêras os
(1) ésteres, nomeadamente os acetatos de etilo, propilo, butilo e hexilo, e os
decanoatos, como o decanoato de etilo, o 2-trans,4-cis decadienoato de metilo, e
o decanoato etilo, e (2) terpenos, como o α-farneseno.
Os esteres metílicos e hexílicos do ácido 2-trans,4-cis decadienóico são os
compostos característicos da pêra William’s, e outros ésteres incluindo o acetato
de exilo, o acetato de 2-metil propilo, o acetato de butilo o butil butanoato, o
acetato de pentilo e hexanoato de etilo contribuem para o aroma de pêra
(Rapparini e Predieri, 2003).
Todos estes compostos foram identificados na pêra Tavares e na pêra Rocha,
sendo as diferenças mais marcantes resultado das condições de armazenamento.
3.2.4 – Avaliação da actividade antioxidante da água de decocção dos frutos
O teor em fenóis totais na pêra Rocha e na pêra Tavares, medido pelo método
38
de Folin, foi de 9,21,3 e 8,51,4 mg/g (peso seco). Estes valores são superiores
aos descritos para algumas frutas (Hassimotto et al., 2005) e mesmo para a pêra
(Keverset al., 2011). Também a actividade antioxidante encontrada nas amostras
medida pelo método ORAC foi bastante superior à descrita por Kevers et al
(2011). Para a pêra Rocha, a actividade encontrada foi: 1005,6364,3 M TE/g
(ps) e 1322,8352,7 M TE/g (ps) para a pêra Tavares. Os resultados obtidos
podem dever-se às diferentes cultivares usadas no presente trabalho em relação
às descritas pelos autores (Kevers et al., 2011) como também se ter trabalhado
com material liofilizado (seco), ao passo que os autores trabalharam com material
fresco. Apesar da diferença das actividades encontradas nas duas cultivares, ela
não foi relevante.
A actividade antioxidante determinada pelo método TEAC, também revelou que
ambas as peras têm actividade e sem diferenças importantes entre elas. Os
valores encontrados foram: 3164,9107.5 M TE para a pêra Rocha e
3433,7197,0 M TE para a pêra Tavares.
39
4 – Conclusões e perspectivas futuras
A pêra ocupa, actualmente, a segunda posição nos frutos frescos mais
produzidos em Portugal. Reconhecida a relevância da pereira em Portugal, e
tendo como objectivo contribuir para a propagação e uma melhor caracterização
de uma cultivar de pereira proveniente de uma “semente do acaso”, designada
pêra Tavares, originada numa quinta em Tábua, Concelho de Oliveira do Hospital,
foi possível com este trabalho:
1) Optimizar as condições de micropropagação desta variedade,
2) Definição dos substratos e condições de aclimatação, adequadas para uma
boa taxa de aclimatação,
3) Dar início à caracterização fenológica da cultivar em estudo,
4) Realizar uma caracterização morfológica preliminar do fruto, por avaliação
de diferentes parâmetros,
5) Isolar e caracterizar quimicamente os voláteis da pêra Tavares e compará-
los com os da pêra Rocha,
6) Determinar a actividade antioxidante das águas de decocção de ambos os
frutos.
Em termos de perspectivas futuras seria de todo o interesse:
1) Fazer um estudo para avaliar o comportamento das plantas em campo,
2) Em relação à determinação de Potássio deverá ser feita uma reavaliação da
metodologia de análise dos substratos de forma a optimizar a mesma,
3) Repetir a caracterização fenológica da cultivar em estudo,
4) Proceder a uma reavaliação da caracterização morfológica do fruto,
comparativamente com outros frutos de variedade devidamente estabelecida,
5) Elaborar uma caracterização com recurso a marcadores moleculares de
forma a poder comparar com outras cultivares,
6) Repetir a caracterização dos voláteis da pêra Tavares e compará-la com a
de outras variedades de pêra,
7) Avaliar o efeito da frigorificação na composição de voláteis.
A obtenção destes dados permitiria futuramente a completa caracterização
desta variedade Portuguesa de acordo com os descritores actualmente existentes
e dessa forma contribuir para a conservação da biodiversidade agrícola Nacional.
40
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