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Q-TOF
Quadrople Time of Fligth Mass Espectomotry
ResultadosSeqüenciamento de Proteínas
Lucas BrandãoUFRPE
Espectrômetro de Massa
• Existem diversas plataformas para análise em espectrometria de massa– Várias configurações possíveis.
• A primeira pergunta– Qual a diferença principal nos resultados entre os
q-TOF para outras plataformas?
Conclusão
• Q-TOF é muito mais sensível e com um poder de resolução muito maior
• MAIOR– Sensibilidade– Resolução– acurácia
Quadropole-Time of Flight
• Devido as vantagens do espectro de TOF ele é utilizado como analisador
• Assim o quadropole pode ser usado como um filtro de massa que transmite apenas o íon parente (precursores) de interesse
Todos os espectros de massas obtidos tanto no MS, quanto MS/MS mode, são gravados com um TDC (time-to-digital converter)
Q-TOF pode ser utlizado tanto no modo MS, quanto no modo MS/MS
• Segunda pergunta:– O que pode influenciar no resultado final de um q-
TOF?
Ionização positivaIonização negativa TCD (time-to-digital converter)
Perguntas que se deve fazer
• Amostra:– como será processada?– Qual a procedência?
• Ionização:– Positiva ou negativa?– ESI ou MALDI? MAIOR
SensibilidadeResoluçãoacurácia
Tipos de dados
• O principal tipo de dado que um espectrômetro de massas produz é um– Espectro de massa
Espectro de massa
Cromatograma de massa
• selected ion monitoring (SIM),• total ion current (TIC), • selected reaction monitoring chromatogram (SRM)
Espectro de MassaMS
m/z
Intensidade
Resolução de MassaDefinição: como a separação de duas massas pela espectrometria de massa.
Sendo diretamente proporcional a acurácia
M1 = 2,0157 M2 = 1,9793
Resolução de Massa
Quanto mais estreito o pico, maior é a resolução e maior a precisão em determinar m/z
Full width at half maximum
Definição: como a separação de duas massas pela espectrometria de massa. Sendo diretamente proporcional a acurácia
M1 = 2,0157M2 = 1,9793M1-M2 = 0.0364
Resolução = (286/0.0364) = 7857
Resolução de Massa
Comparação entre alta e baixa resolução
Baixa resolução:Um único pico
BAIXA RESOLUÇÃO:Amostra com contaminantes mas apenas um único pico
ALTA RESOLUÇÃO:Amostra com contaminante sendo mostrado com dois picos
Seqüenciamento de Proteínas
Overview
Q-TOF
Duas possibilidades
Modo MS Modo MS/MS
Resultados em MS mode
• Produz um mapa peptídico (peptide map) ou PMF (peptide mass fingerprint)– A proteína foi tripsinizada e depois analisada pela MS,
sem a necessidade de ocorrer a separação (filtro) de íons
– Se a proteína já existe ele será encontrada no banco de dados.
Resultados em MS/MS mode
• Caso da caracterização pelo peptide map, não seja suficiente para determinar a proteína,
• Pode ser realizada a separação, fragmentação dos íons selecionados e em seguida ocorrer a analise pelo TOF.
Modo MS/MS
• Para fazer esta analise é necessário realizar a seleção do íon precursor– Visto que o volume de dados impossibilita a
aquisição de todos os íons num único espectro de massa
– Tomar a decisão de qual íon precursor deve ser selecionado
Critérios
• Intensidade• Status da carga• m/z
Depois que ocorre a seleção do íon precursor, o modo MS/MS é automaticamente ligado
Após um determinado período ou até que que um certo critério seja preenchido o sistema retorna ao modo MS
E permanece nesse modo (MS) até que outro íon precursor seja novamente selecionado
Seleção e fragmentação
Ou seja...
• Uma corrida– Dura 70mim– 350 espectros de massa (TOF)• Muitos picos: solventes, contaminantes e íons de
peptídeos.
“De novo” seqüenciamento
O Papel da câmera de colisão
Seqüenciamento de Proteínas
• Para seqüenciar peptídeos é necessário realizar a sua fragmentação– Podem existir 3 tipos de quebras de ligações
diferentes• NH-CH, CH-CO, e a ligação CO-NH
– Cada fragmentação da origem a duas espécies• Uma neutra• E outra carregada
• A fragmentação acontece de maneira randômica e não seqüencial
• Além disso, algumas fragmentações são “preferidas” em relação a outras– Por isso se encontra sinais de intensidades
diferentes
Fragmentação peptídica e nomenclatura
Íons• b = no amino terminal• y = no carboxil terminal A questão é que a fragmentação peptidica não
acontece de forma sequencial
Íons b Íons y
Os íons b e y são utilizados para fazer o seqüenciamentos de um peptídeo.
OUTRO EXEMPLO
O Que fazer?
1- Olhar para os imunoíons menores:Provaveis a.a. Presentes no peptídeo.
2 – olhar para o íon precursor:
OBRIGADO PELA ATENÇÃ[email protected]