Gabriela Ferreira da Silva

QUALIDADE SSEA TRABECULAR: CARACTERIZAO POR MICROTOMOGRAFIA 3D

POR RAIO-X

Trabalho de Concluso de Curso apresentado Escola de Engenharia de So

Carlos da Universidade de So Paulo

Curso de Engenharia Eltrica nfase em Eletrnica

ORIENTADOR: Prof. Dr. Jos Marcos Alves

So Carlos Dezembro - 2008

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Dedicatria

Dedico este trabalho primeiramente minha famlia, que sempre me apoiou em minhas decises, guiando-me para que fossem as melhores, amando-me incondicionalmente e dando-me a segurana de que tanto precisei. Aos meus verdadeiros amigos, os conquistados neste perodo da Universidade e os que vm de antes, de minha cidade natal, e que fizeram destes os melhores e mais divertidos anos da minha vida.

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Agradecimentos

Agradeo aos professores que me ajudaram a chegar at aqui. EESC - USP por me oferecer um curso de qualidade. Ao Prof. Dr. Jos Marcos Alves pela ateno e orientao neste trabalho, ao mestrando Alessandro Mrcio Hakme da Silva por ceder as amostras sseas do seu projeto de pesquisa para uso na minha investigao, pelo apoio no aprendizado do uso do microtomgrafo e do software CT-Analyzer e pela pacincia comigo, e ao Prof. Dr. Ben-Hur Viana Borges por disponibilizar a infra-estrutura computacional do seu laboratrio para a reconstruo tomogrfica e quantificao microestrutural das amostras sseas.

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Resumo

A osteoporose uma doena do esqueleto caracterizada por baixa massa ssea e deteriorao da arquitetura do tecido com conseqente aumento da fragilidade e susceptibilidade fratura. O osso trabecular possui maior superfcie e metabolismo (formao e reabsoro) mais rpido que o osso cortical. A incidncia de fraturas causada pela osteoporose maior nas vrtebras lombares, na extremidade distal do rdio / ulna e na cabea femoral. A massa ssea explica no mximo 65% da variao na resistncia ssea. A forma e distribuio do tecido trabecular no espao 3D (arquitetura ssea) so responsveis por cerca de 30 a 50% da resistncia mecnica do osso. A arquitetura, quando quantificada atravs da anisotropia do tecido (fabric), e incorporada na anlise da resistncia ssea, eleva o entendimento dessa variao. O objetivo desta investigao foi aprender os conceitos bsicos sobre as tcnicas de monitoramento da qualidade ssea e determinar os ndices morfomtricos de amostras de osso trabecular bovino utilizando um microtomgrafo por raio-X de bancada de alta resoluo.

Palavras chave: Osteoporose, arquitetura ssea, anisotropia, osso trabecular.

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Abstract

Osteoporosis is a bone disease that affects all the skeleton. It is characterized by low bone mass and deterioration of the architecture of the tissue with consequent increase of the fragility and chance of succeeding fractures. The trabecular bone has a greater surface and faster metabolism (formation and resorption) than the cortical bone. The incidence of fractures caused by osteoporosis is bigger in the lumbar vertebrae, the distal extremity of the radius/ulna and in the femoral head. The bone mass explains about 65% of the variation in the bone strength. The shape and distribution of the trabecular tissue in the 3D space (bone architecture) are responsible for about 30 to 50% of the mechanics strength of the bone. The architecture, when quantified through the anisotropy of the tissue (fabric), and incorporated in the analysis of the bone strength improves the understanding of that variation. The aim of this investigation was to learn the basic concepts about the assessment of bone quality as well as to carry out morphometric measurements of bovine trabecular bone samples using a portable and high resolution x-ray microtomograph.

Key words: Osteoporosis, trabecular tissue, anisotropy, bone architecture.

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Sumrio

Dedicatria .................................................................................................................... i Agradecimentos ............................................................................................................ ii Resumo ........................................................................................................................ iii Abstract ..........................................................................................................................iv Lista de Figuras .............................................................................................................vi Lista de Tabelas .......................................................................................................... vii 1. Introduo ............................................................................................................. 1

1.1 Tecido sseo ................................................................................................. 1 1.2 Qualidade ssea ............................................................................................ 3

2. Objetivos ............................................................................................................... 6 3. Microtomografia Computadorizada (CT) ............................................................. 6

3.1 Princpios ........................................................................................................ 6 3.2 Quantificao da Microestrutura ..................................................................... 8

3.2.1 Morfometria ........................................................................................... 8

3.2.2 Conectividade ...................................................................................... 10

3.2.3 Anisotropia........................................................................................... 11

3.2.4 ndice de modelo estrutural (SMI) ........................................................ 13 3.2.5 Porosidade .......................................................................................... 14

4. Material e Mtodo ............................................................................................... 14 4.1 Obteno de Amostras sseas Trabeculares ............................................... 14 4.2 Quantificao Microestrutural ....................................................................... 16

5. Resultados .......................................................................................................... 19 6. Discusso e Concluso ....................................................................................... 22 7. Bibliografia .......................................................................................................... 23 Anexo ......................................................................................................................... 25

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Lista de Figuras

Figura 1.1 - Estrutura do osso trabecular do calcneo humano com predominncia de bastonetes (a) e placas (b) (Hildebrant et al., 1999) .................................................... 2 Figura 1.2 - Colo do fmur com osso trabecular normal (A) e osteoportico (B) ; vrtebra lombar com osso trabecular normal (C) e osteoportico (D) [2] ....................... 2 Figura 1.3 - Imagem 3D e sees transversais de uma amostra de osso trabecular .... 2 Figura 1.4 - Medida da BMD na coluna vertebral (a) e na cabea femoral (b) .............. 4 Figura 3.1 Principais elementos de um microtomgrafo ............................................. 7 Figura 3.2 Fluxograma da reconstruo tomogrfica ................................................. 7 Figura 3.3 - Magnificao tomogrfica ......................................................................... 8 Figura 3.4 Desenho esquemtico do princpio da determinao de Tb.Th* pela anlise 3D ..................................................................................................................... 9 Figura 3.5 Desenho esquemtico do princpio da determinao de Tb.N* pela anlise 3D ............................................................................................................................... 10 Figura 3.6 Medio do MIL em duas dimenses [17] . ............................................... 11 Figura 3.7 Representao do MIL em duas dimenses por uma elipse [18] .............. 12 Figura 3.8 - Representao do MIL em trs dimenses por um elipside [5] ............... 12 Figura 3.9 Elipses obtidas sobre planos mutuamente ortogonais em trs amostras de osso trabecular: a) fmur distal; b) rdio distal; c) crista do ilaco [9] ............................ 13 Figura 4.1 - Equipamento para retirada de amostra cbica ......................................... 15 Figura 4.2 - Amostra cbica extrada da regio trabecular .......................................... 15 Figura 4.3 Extrao das amostras cilndricas ........................................................... 15 Figura 4.4 - Microtomgrafo de bancada SkyScan 1172 ............................................. 16 Figura 4.5 Exemplo de projeo da amostra ssea ................................................. 17 Figura 4.6 Seo reconstruda ................................................................................. 18 Figura 4.7 VOIs radiografos e reconstrudos ............................................................ 18 Figura 5.1 Resultado da anlise 2D da seo 500 (central) ..................................... 19

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Lista de Tabelas

Tabela 4.1 - Especificaes do Microtomgrafo SkyScan 1172 .................................. 17 Tabela 5.1 - Anlise Microestrutural 2D (6.7 m de resoluo) ................................... 20 Tabela 5.2 - Anlise Microestrutural 3D (6.7 m de resoluo) ................................... 21

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1. Introduo

1.1 Tecido sseo

A osteoporose uma doena do esqueleto caracterizada por baixa massa ssea e deteriorao da arquitetura do tecido sseo com conseqente aumento da fragilidade e susceptibilidade fratura. Na osteoporose h um comprometimento da resistncia mecnica ssea. A sua ocorrncia mais comum em mulheres aps a menopausa e em pessoas com idade mais avanada.

O esqueleto responsvel pela sustentao do corpo, proteo de rgos, produo de clulas vermelhas e brancas do sangue e armazenamento de minerais. Ele deve resistir aos carregamentos externos, tais como o prprio peso do corpo e os esforos dinmicos. O entendimento da influncia da estrutura nas propriedades mecnicas do osso trabecular proporciona o desenvolvimento de tcnicas de monitoramento da qualidade ssea, com impacto no tratamento de doenas como a osteoporose.

O osso um material compsito constitudo de componentes orgnicos e inorgnicos. A matriz orgnica constituda basicamente de colgeno (95%) e de outras protenas no colagenosas (glicoprotenas, fsforoprotenas, prteolipdeos e mucopolisacrides). A matriz mineral consiste essencialmente de hidroxiapatita (Ca10(PO4)6(OH)2 , 95%). Esta substncia inicialmente depositada na matriz orgnica como fosfato de clcio, mas depois se transforma em cristais de apatita.

A arquitetura do tecido sseo varia com a regio do esqueleto, podendo ser esponjosa, denominada osso trabecular, ou compacta, denominada osso cortical. O osso trabecular possui microestrutura porosa com elevada rea superficial. A estrutura porosa composta de trabculas cujo formato varia entre bastonetes e placas [1], conforme mostrado na Fig. 1.1. A fig. 1.2 ilustra a aparncia do osso trabecular normal e osteoportico no colo do fmur e vrtebras da coluna lombar. O osso trabecular predominantemente encontrado nas extremidades dos ossos longos protegido por uma camada de osso cortical. tambm encontrado na estrutura interna de outros ossos, tais como o calcneo, o crnio, a plvis e as vrtebras da coluna vertebral.

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Figura 1.1 - Estrutura do osso trabecular do calcneo humano com predominncia de bastonetes (a) e placas (b) (Hildebrant et al., 1999)

Figura 1.2 - Colo do fmur com osso trabecular normal (A) e osteoportico (B) ; vrtebra lombar com osso trabecular normal (C) e osteoportico (D) [2]

A orientao das trabculas sseas em uma amostra de osso trabecular varia de acordo com a direo [3], conforme mostrado na Fig 1.3. Observa-se que no plano zy h uma orientao preferencial das trabculas e que nos planos xy e zx no h orientao preferencial.

Figura 1.Erro! Nenhum texto com o estilo especificado foi encontrado no documento.3 - Imagem 3D e sees transversais de uma amostra de osso trabecular

C

D

A B

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1.2 Qualidade ssea

A resistncia mecnica do osso trabecular foi relacionada sua densidade [4]. Apesar das medidas de densidade freqentemente levarem estimativas razoveis das propriedades mecnicas, elas no explicam certas variaes observadas nestas propriedades, nem do conta das organizaes microestruturais de um osso trabecular, representando assim uma medida escalar incompleta para a previso das propriedades mecnicas. Goldstein et al (1993) apresenta um exemplo que ilustra este fato. Duas amostras sseas com fraes de volume (BV/TV= Volume de Tecido sseo/Volume) prximas entre si de 18% e 19%, respectivamente, apresentaram propriedades mecnicas que variaram de 30% a uma ordem de magnitude, dependendo da direo analisada [5].

Os ossos com maior risco de osteoporose so aqueles que possuem maior quantidade de osso trabecular como as vrtebras da coluna vertebral, o colo do fmur, costelas, pulso e calcanhares.

Na clnica o mtodo mais utilizado para o monitoramento da qualidade ssea utiliza raio-X de baixa intensidade, o DEXA (Dual Energy X-ray Absorptiomery) determina a densidade mineral ssea em uma determinada rea (g/cm2). O resultado expresso atravs dos parmetros Z-score e T-score mostrados nas equaes 1.1 e 1.2, respectivamente (BMD densidade mineral ssea; SD - desvio padro; SI mesmo sexo e mesma idade; SJ mesmo sexo e paciente jovem).

(1.1)

(1.2)

A qualidade ssea, utilizando-se a BMD, classificada segundo o valor do T-score: BMD normal (T-score > -1), Osteopenia (-1

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Figura 1.4 - Medida da BMD na coluna vertebral (a) e na cabea femoral (b)

Alguns fatores podem aumentar a probabilidade de ocorrncia de osteoporose: a) sexo: em mulheres a osteoporose duas vezes mais comum que em homens; b) Idade: a BMD diminui com a idade; c) Etnia: caucasianos e asiticos tm maior risco de osteoporose que negros e hispnicos; d) predisposio gentica; e) pessoas com menor estrutura so mais susceptveis; f) Fumar; g) uso prolongado de remdios com corticides; h) mulheres que j sofreram cncer de mama; i) alimentao pobre em clcio, j) falta de exerccio; k) consumo excessivo de lcool [2].

Outros mtodos de avaliao do tecido sseo so utilizados [6]:

Radiografia Magnificada: uma radiografia das mos com maior detalhamento.

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Radiogrametria: a determinao da espessura cortical do metacarpo. No detecta precocemente a osteoporose.

Morfometria (MXA Morphometric X-ray Absorptiometry): Raio-x do trax e da coluna lombar so analisadas e o tamanho (altura anterior, posterior medial) e contorno dos corpos vertebrais so determinados por um software. Uma reduo de 15% nesses parmetros caracteriza compresso dos corpos vertebrais.

Medidas de Parmetros do Fmur Proximal: alguns parmetros radiolgicos do fmur proximal, por exemplo, o comprimento do colo do fmur, tm correlao com o risco de fratura nessa regio anatmica.

Tomografia Computadorizada: pode ser realizado apenas com instrumentos modernos de alta resoluo, mas expe o paciente a maiores nveis de radiao.

Imagem por Ressonncia Magntica: este mtodo no envolve exposio radiao e especialmente adaptado para o exame de medula ssea. a maneira ideal para se diferenciar entre uma fratura por osteoporose e a de uma devido metstase.

Bipsias sseas da crista do ilaco podem ser utilizadas para se investigar a estrutura trabecular analisando-se sees do tecido. Diversos ndices so derivados dessa anlise e a tcnica denominada histomorfometria 2D. ndices histomorfomtricos 3D so obtidos de imagens 2D (reconstrues microtomogrficas) atravs da medida de ndices morfolgicos primrios (BS superfcie ssea trabecular; BV frao de volume sseo trabecular; TV volume da amostra ssea). Esses ndices so utilizados para o clculo de ndices histomorfomtricos derivados utilizando-se conceitos de estereologia e assumindo-se um modelo estrutural trabecular constante e composto apenas de placas sseas. A estrutura trabecular, no entanto, se altera devido ao envelhecimento e doenas metablicas. Os ndices derivados calculados so: Tb.Th espessura trabecular; Tb.Sp espessura das cavidades contendo medula ssea; Tb.N nmero de trabculas por unidade de comprimento.

Reconstrues tridimensionais permitem a medida direta dos mesmos ndices primrios e histomorfomtricos. Estas medidas no so baseadas em um modelo

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estrutural trabecular constante e incluem a conectividade, o grau de anisotropia e o ndice de modelo estrutural (SMI), que uma estimativa da quantidade de placas e bastonetes presentes na estrutura trabecular. A tcnica baseada em microtomografia tridimensional por raio-X tem sido investigada em laboratrios dos EUA e Europa para a caracterizao da qualidade ssea trabecular visando o diagnstico da osteoporose[7].

2. Objetivos

Os objetivos desta investigao so o aprendizado dos conceitos bsicos sobre as tcnicas de monitoramento da qualidade ssea e a determinao dos ndices morfomtricos de amostras de osso trabecular bovino utilizando um microtomgrafo por raio-X de bancada de alta resoluo.

3. Microtomografia Computadorizada (CT)

3.1 Princpios

Imagens tridimensionais de um objeto podem ser adquiridas para anlises qualitativas e quantitativas da sua microestrutura pela tcnica de microtomografia computadorizada. A figura 3.1 descreve esquematicamente os principais constituintes de um microtomgrafo: a) tubo de raio-x com um foco de dimenso micromtrica e um campo de emisso cnico; b) mesa com movimento de preciso rotacional e translacional (direes X, Y e Z), onde fixado o objeto a ser analisado; c) detector de radiao. A figura 3.2 descreve as etapas do processo de obteno da imagem 3D do objeto. As etapas de caracterizao compreendem:

a) obteno das projees atravs da rotao do objeto. O ngulo de rotao determina o nmero de projees (por exemplo, se =1, sero obtidas 360 projees). Uma mdia das projees obtida a cada incremento angular.

b) pr-processamento e reconstruo 2D das sees do objeto.

c) segmentao das sees do objeto e reconstruo 3D.

d) quantificao da microestrutura do objeto utilizando softwares desenvolvidos para essa finalidade.

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Figura 3.1 Principais elementos de um microtomgrafo

Figura 3.2 Fluxograma da reconstruo tomogrfica

As variveis que influem na resoluo da microtomografia esto mostradas figura 3.3: D1 a distncia da fonte ao objeto, D2 a distncia da fonte ao detetor de radiao, H altura do objeto, D3 altura do objeto projetado no detetor de radiao, R a resoluo microtomogrfica e K a dimenso do pixel no detetor. O fator de magnificao M=(D1+D2/D1). A resoluo R=K/M.

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Figura 3.3 - Magnificao tomogrfica

3.2 Quantificao da Microestrutura

A quantificao da microestrutura do osso trabecular pode ser realizada utilizando-se sees da amostra ssea obtidas por CT (anlise 2D) ou o volume do objeto a partir da reconstruo tridimensional obtida por CT (anlise 3D) [8]. Em ambas as quantificaes so utilizados os seguintes ndices primrios: a) rea da superfcie ssea da amostra (BS); b) volume sseo da amostra (BV); c) volume total da amostra (TV). Para se comparar amostras com diferentes dimenses utiliza-se ndices normalizados obtendo-se BV/TV, BS/TV e BS/BV. A quantificao da microestrutura envolve os parmetros a seguir descritos:

3.2.1 Morfometria

Anlise 2D

Os parmetros histomorfomtricos so calculados assumindo-se que a amostra ssea possui uma microestrutura constante (composta apenas de placas ou bastonetes) e utilizando-se tcnicas de estereologia [9]. Assumindo-se o modelo de placas, as seguintes equaes so utilizadas para determinao dos parmetros morfomtricos [9, 10]:

a) Espessura Trabecular (Tb.Th): a espessura mdia das trabculas.

Tb.Th = 2 / (BS/BV) (3.1)

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b) Nmero trabecular (Tb.N): o nmero de placas por unidade de comprimento.

Tb.N = (BV/TV)/Tb.Th (3.2)

c) Espao trabecular (Tb.Sp): a espessura mdia das cavidades com medula ssea.

Tb.Sp = (1/TbN) Tb.Th (3.3)

Anlise 3D

Imagens tridimensionais obtidas por CT permitem a determinao dos parmetros microestruturais no espao 3D. Estas tcnicas no se baseiam na existncia de nenhum modelo estrutural e so isentas dos erros devidos ao uso destes modelos. Os ndices morfolgicos medidos no espao 3D so denotados por um asterisco. O ndice primrio BS* calculado usando o mtodo de Marching Cubes que triangulariza a superfcie do tecido sseo [11,12]. O ndice BV* calculado usando tetraedros correspondentes ao volume relativo superfcie triangularizada [13]. O ndice TV* determinado atravs de uma contagem de voxels. Para comparar amostras com tamanhos diferentes os ndices normalizados BV*/TV* e BS*/TV* so utilizados. A superfcie ssea especfica BS*/BV*. Os seguintes conceitos so utilizados para determinao dos parmetros morfomtricos [8]:

a) Tb.Th* (espessura trabecular): a espessura mdia das trabculas determinada utilizando-se esferas cujo dimetro deve preencher a estrutura da trabcula, conforme esquematizado na figura 3.4. A espessura mdia calculada para se obter Tb.Th;

Figura 3.4 Desenho esquemtico do princpio da determinao de Tb.Th* pela anlise 3D

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b) Tb.Sp* (espao trabecular): a espessura mdia das cavidades que contm medula ssea. Utiliza-se o mesmo princpio da determinao de Tb.Th. nos voxels que contm a medula ssea.

f) Tb.N* (nmero trabecular): o inverso da distncia entre os eixos mdios das trabculas sseas (fig. 3.5).

Figura 3.5 Desenho esquemtico do princpio da determinao de Tb.N* pela anlise 3D

3.2.2 Conectividade

O parmetro Euler-Poincare ou nmero de Euler um indicador de conectividade de uma estrutura 3D[14,15]. A conectividade definida como uma medida do grau que uma estrutura est multiplamente conectada, isto , o nmero mximo de conexes que podem ser rompidas antes que a estrutura seja separada em duas partes. O nmero de Euler () para uma estrutura 3D determinado pela equao 3.5:

21 = o (3.5)

o o nmero de partes sseas no conectadas, (1 a conectividade e (2 o nmero de cavidades com medula ssea totalmente circundadas por osso. O osso trabecular uma estrutura totalmente conectada ((0 = 1), e com nenhuma cavidade fechada contendo medula ssea ((2 = 0). A expresso acima fica ento simplificada:

11 = (3.6)

A anlise de Euler tambm expressa por densidade de conectividade (Eu.Conn.D, mm-3) que o quociente entre 1 e o volume da amostra (TV).

Uma outra medida de conectividade denominada fator padro de osso trabecular (Tb.Pf) foi proposta por Hahn e colaboradores em 1992. Em uma anlise

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2D o parmetro calcula um ndice de relativa convexidade e concavidade da superfcie ssea considerando que concavidade indica conectividade (presena de ns) e convexidade indica estruturas desconectadas isoladas (trabculas sseas). Em 2D, conforme equao 3.7, o ndice Tb.Pf compara rea e permetro (ou volume e superfcie na anlise 3D) de um slido binarizado antes e depois (subscrito 1 e 2, respectivamente) de um processo de dilatao. Como resultado, menores valores de Tb.Pf significam estrutura trabecular mais conectada enquanto maiores valores de Tb.Pf significam estrutura trabecular menos desconectada.

(3.7)

3.2.3 Anisotropia

Whitehouse [16] (1974) descreveu a medida da anisotropia microestrutural utilizando uma tcnica de contagem de interseo. Ele expressou a anisotropia atravs da medida do comprimento da interseo mdia (mean intercept length, MIL). O princpio da MIL a contagem em uma seo plana de osso trabecular do nmero de intersees entre uma grade de linhas paralelas e a interface trabcula / medula ssea (Fig. 3.6). O MIL o comprimento mdio entre duas intersees sendo calculado pela razo entre o nmero de intersees em uma dada direo da grade, I(), e o comprimento L total da grade. Ao construir diagramas polares com os pontos (, L), Whitehouse constatou que estes pontos podem ser interpolados de forma precisa e representados por uma elipse (Fig. 3.7).

Figura 3.6 Medio do MIL em duas dimenses [17]

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Figura 3.7 Representao do MIL em duas dimenses por uma elipse [18]

A generalizao do conceito da anisotropia estrutural para trs dimenses gera uma elipside, como ilustrado na figura 3.8. A equao geral de uma elipside em um sistema de coordenadas cartesiano com eixos x, y e z dada pela equao 3.7:

2 2 2Ax By Cz 2Dxy 2Exz 2Fyz 1+ + + + + = (3.7)

Figura 3.8 - Representao do MIL em trs dimenses por um elipside [5]

Seja L() o MIL calculado na direo em um plano com direo qualquer. O plano intercepta uma amostra ssea gerando uma seo. Sejam n1, n2 e n3 as projees no sistema de coordenadas x, y e z de um vetor unitrio n com direo pertencente ao plano , e seja um vetor com magnitude L() na direo do vetor unitrio n do plano . As coordenadas do vetor com magnitude L() nos eixos x, y e z so dadas por: x= L() n1, y= L() n2 e z= L() n3. A equao 3.7 pode ser reescrita como segue:

12 2 2An Bn Cn 2Dn n 2En n 2Fn n1 2 1 3 2 31 2 3 2L ( )+ + + + + =

(3.8)

A equao 3.8 pode ser reescrita como:

[ ]A D E n1 1

n n n . D B F . n1 2 3 2 2L ( )E F C n3

= (3.9)

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Onde M um tensor de segunda ordem, positivo definido, e n um versor que define a direo sobre a qual infere-se o valor de L(). O tensor M, tensor de anisotropia, caracteriza o arranjo geomtrico da microestrutura do meio poroso. Os autovetores de M fornecem as direes principais do elipside, as quais so as orientaes preferenciais das trabculas.

Harrigan & Mann (1984) propuseram uma tcnica experimental de medida de L() em uma direo arbitrria e do MIL em trs dimenses. A tcnica consiste em obter elipses sobre trs planos mutuamente ortogonais da amostra, as quais so as projees ortogonais de um elipside sobre estes planos. Observa-se na Fig. 3.9 que os eixos principais das elipses determinam as orientaes das trabculas.

Figura 3.9 Elipses obtidas sobre planos mutuamente ortogonais em trs amostras de osso trabecular: a) fmur distal; b) rdio distal; c) crista do ilaco [9]

O grau de anisotropia (DA) definido conforme a equao 3.10, utilizando-se o autovalor mnimo e mximo da matriz M.

(3.10)

3.2.4 ndice de modelo estrutural (SMI)

O SMI (structure model index) indica a predominncia de bastonetes ou placas no osso trabecular. Este parmetro de muita importncia na osteoporose do osso trabecular que caracterizada pela transio da arquitetura de placas para bastonetes. Uma estrutura apenas com placas ou bastonetes ter valores de SMI 0 e 3, respectivamente. O clculo da SMI expresso pela equao 3.11 e baseado na

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dilatao do modelo de voxel 3D, Sendo S a rea superficial do objeto antes da dilatao, S a diferena na rea causa por pela dilatao e V o volume inicial sem dilatao.

(3.11)

3.2.5 Porosidade

A porosidade medida na anlise 2D. Nos objetos binarizados so identificados espaos completamente fechados. A porosidade a rea destes espaos expressa como percentual da rea total dos objetos binarizados. Uma medida de porosidade em 3D pode ser obtida por integrao desta medida no volume de interesse do objeto.

4. Material e Mtodo

4.1 Obteno de Amostras sseas Trabeculares

Seis amostras de osso trabecular foram obtidas de fmur bovino, extrado de um animal sacrificado com quatro anos de idade, atravs do seguinte procedimento executado no Laboratrio de Biomecnica do Instituto de Ortopedia e Traumatologia do Hospital das Clnicas da Faculdade de Medicina da USP: a) congelamento dos fmures; b) retirada em temperatura ambiente de uma amostra cbica da regio trabecular de um par de fmures do mesmo animal utilizando um mecanismo de movimentao angular e longitudinal e uma serra circular de 1mm de espessura (figuras 4.1 e 4.2); d) extrao de trs amostras cilndricas com dimenso de 10mm de raio e 20 mm de altura de cada cubo nas direes principais do trabeculado (fig. 4.3). A primeira direo foi obtida de observao radiogrfica do fmur considerando-se a direo preferencial das trabculas; e) manuteno das amostras cilndricas em soro (soluo salina com 0.9% de NaCl) at a realizao da quantificao estrutural atravs de microtomografia.

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Figura 4.1 - Equipamento para retirada de amostra cbica

Figura 4.2 - Amostra cbica extrada da regio trabecular

Figura 4.3 Extrao das amostras cilndricas

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4.2 Quantificao Microestrutural

A anlise microestrutural das amostras cilndricas foi realizada no Microtomgrafo 3D de bancada na EMBRAPA Instrumentao Agropecuria de So Carlos (modelo 1172, SkyScan, Blgica), mostrado na Fig. 4.4. A Tabela 4.1 descreve as caractersticas do microtomgrafo. O seguinte procedimento foi utilizado na quantificao microestrutural:

- Cada uma das amostras cilndricas foi afixada em um template com uma massa de modelar a fim de se obter um alinhamento vertical, evitar deslocamentos durante a movimentao angular e manuteno no campo visual do detector de radiao (cmera CCD), conforme ilustrado na figura 4.5. A reconstruo tomogrfica utiliza o algoritmo de Feldkamp [9].

- Foram obtidas 480 projees geradas e caracterizadas como imagens no formato TIF/16bits com resoluo de 6,7 m para cada pxel. Com esta resoluo no foi possvel radiografar toda a amostra ssea, conforme fig. 4.5, obtendo-se um arquivo de projees de tamanho aproximado de 4Gb e um arquivo de reconstruo 3D de aproximadamente 32Gb (formato STL) com 936 seces (fig. 4.6). O uso de uma maior resoluo permitiria observar toda a amostra, mas produziria um arquivo muito grande de reconstruo 3D.

- Dificuldades de processamento computacional do arquivo de 32Gb resultaram em uma escolha ainda menor do volume de interesse da amostra utilizado na anlise microestrutural (ver anexo), conforme fig. 4.7.

Figura 4.4 - Microtomgrafo de bancada SkyScan 1172

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Tabela 4.1 - Especificaes do Microtomgrafo SkyScan 1172 Especificaes SkyScan 1172 80kV SkySkan 1172 100kV Nvel de detalhe 1 m para 10Mp e 2m para 1.3Mp

Tamanho do Pixel e Magnificao mx.

8m 5m

Fonte de Raios-X Tubo selado microfocado, ventilado, vida til maior que 10000h.

Tamanho do ponto < 8m @ 8W, 20-80kV, 0-100A

Tamanho do ponto < 5m @ 4W, 20-1ookV, 0-250A (10W mx.)

Detector de Raios-X 10 Mp (4000 X 2300) CCD digital 12-bit 1.3 Mp (1280 X 1024) CCD digital 12-bit

Tamanho mximo do objeto para

reconstruo

Cmera de 10Mp: 35mm de dimetro para varredura standard e 68mm para varredura com offset.

Cmera com 1.3 Mp: 20mm de dimetro para varredura standard e 37mm para varredura com offset.

Computador para controle, reconstruo 3D e analise de imagem

Computador com processamento paralelo e rpida reconstruo volumtrica para feixe em cone

(algoritmo de Feldkamp) Segurana de radiao < 1$v/h em qualquer ponto da superfcie do equipamento

Dimenses / condies de operao

1250X690X360 / 240kg, para 100-130AC - 4A ou 220 - 240 AC - 3A / 50-60Hz (apenas scanner).

De -10C at 50 armazenamento, de 18 at 25 em operao, 70% de umidade mxima (sem condensao).

Figura 4.5 Exemplo de projeo da amostra ssea

18

Figura 4. 6 Seo reconstruda

Figura 4.7 VOIs radiografos e reconstrudos

19

5. Resultados

A fig. 5.1 ilustra o resultado da anlise 2D de uma das amostras sseas utilizando-se o software CT-Analyser. A tabela 5.1 descreve os resultados das seis amostras sseas, nas direes principais P1, P2 e P3, das seguintes anlises 2D: morfometria, conectividade, anisotropia, ndice de modelo estrutural e porosidade. A Tabela 5.2 descreve os resultados da anlise 3D nas mesmas amostras.

Figura 5.1 Resultado da anlise 2D da seo 500 (central)

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Tabela 5.1 - Anlise Microestrutural 2D (6.7 m de resoluo) na seo 500

Parmetros Abreviao Amostras sseas

Direes Principais (P1, P2, P3) Fmures Esquerdo (E) e Direito (D)

Unidade

P1 (E) P1 (D) P2 (E) P2 (D) P3 (E) P3 (D)

Tissue Area T.Ar 76.99 76.94 76.79 77.82 77.72 76.08 mm2

Bone Area B.Ar 5.44 2.05 2.58 3.65 1.61 0.87 mm2

Percent Bone Area B.Ar/ T.Ar 7.06 2.67 3.36 4.69 2.07 1.15 %

Tissue Perimeter T.Pm 32.82 32.81 32.77 32.99 32.97 32.61 mm

Bone Perimeter B.Pm 726.49 369.92 393.21 546.48 329.10 198.36 mm

Trabecular pattern factor Tb.Pf 6.79 7.99 6.32 5.83 6.65 7.84 1/ mm

Euler Number Eu.N 6999 6107 5036 6542 6130 4381 -

Percent Porosity Po 1.94 0.48 0.47 0.62 0.04 0.01 %

Trabecular thickness Tb.Th 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 mm

Trabecular separation Tb.Sp 0.19 0.41 0.38 0.27 0.46 0.76 mm

Trabecular Number Tb.N 4.72 2.40 2.56 3.51 2.11 1.30 1/ mm

21

Tabela 5.2 - Anlise Microestrutural 3D (6.7 m de resoluo)

Parmetros Abreviao Amostras sseas

Direes Principais (P1, P2, P3) Fmures Esquerdo (E) e Direito (D)

Unidade

P1 (E) P1 (D) P2 (E) P2 (D) P3 (E) P3 (D)

Tissue Volume TV 51.44 54.10 51.31 51.99 51.93 50.83 mm3

Bone Volume BV 3.45 1.39 1.46 2.34 0.99 0.49 mm3

Percent Bone Volume BV/TV 6.69 2.56 2.84 4.50 1.92 0.98 %

Tissue Surface TS 175.79 176.81 175.34 177.55 177.34 173.81 mm2

Bone Surface BS 594.08 326.19 297.15 455.51 270.96 155.26 mm2

Bone Surface/Volume

Ratio BS/BV 172.41 235.49 203.79 194.66 271.10 313.06 1/ mm

Bone Surface Density BS/TV 11.55 6.03 5.79 8.76 5.22 3.05 1/ mm

Trabecular pattern factor Tb.Pf 23.28 84.03 56.89 45.10 100.60 123.77 1/ mm

Trabecular thickness Tb.Th 0.03 0.03 0.03 0.03 0.02 0.02 mm

Trabecular number Tb.N 2.24 0.95 1.02 1.58 0.80 0.47 1/ mm

Trabecular separation Tb.Sp 0.31 0.33 0.35 0.32 0.31 0.34 mm

Degree of Anisotropy DA 0.51 0.52 0.48 0.49 0.49 0.49 -

Eingenvalue 1 0.64 0.69 0.67 0.67 0.65 0.67 -

Eingenvalue 2 0.69 0.65 0.65 0.68 0.68 0.66 -

Eingenvalue 3 0.34 0.33 0.35 0.35 0.34 0.34 -

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6. Discusso e Concluso

A tcnica de microtomografia tem dado contribuies relevantes para se investigar o aprimoramento da caracterizao da qualidade ssea [21-23]. A microtomografia de alta resoluo uma ferramenta incrvel, assim como os softwares para visualizao e quantificao microestrutural, para investigaes sobre a influncia da microestrutura na resistncia mecnica do osso trabecular atravs da correlao dos parmetros microestruturais com os parmetros de resistncia mecnica (coeficientes elsticos da matriz de rigidez) [24]. A utilizao de um mdulo de ensaio mecnico acoplado ao microtomgrafo [24] permitir a determinao dessas correlaes, bem como o desenvolvimento de tcnicas visando o aprimoramento da caracterizao da qualidade ssea para o diagnstico de doenas do metabolismo sseo como a osteoporose. O software quantifica diversos parmetros da microestrutura atravs de anlise microestrutural 2D e 3D.

As amostras sseas foram extradas de um par de fmures de um mesmo animal. A anlise microestrutural 3D descrita na tabela 5.2 mostra que houve pequena variao nos parmetros das amostras sseas frao de volume (BV/TV), superfcie ssea (BS), densidade de superfcie ssea (BS/TV), conectividade (Tb.Pf) e nmero trabecular (Tb.N) entre as amostras cilndricas extradas de um mesmo fmur em direes perpendiculares entre si e entre amostras de fmures diferentes com a mesma direo. Os parmetros de espessura trabecular (Tb.Th), separao trabecular (Tb.Sp) e grau de anisotropia (DA) e autovalores no variaram entre as amostras de um mesmo fmur ou de fmures diferentes com a mesma direo. Os valores medidos dos autovalores e do grau de anisotropia mostram que as trabculas das amostras sseas extradas dos dois fmures tm a mesma orientao espacial nas direes principais.

O nmero de amostras sseas utilizadas nessa investigao, apesar de pequeno, foi suficiente para demonstrar o enorme potencial da microtomografia de alta resoluo nas investigaes sobre a influncia dos parmetros microestruturais do osso trabecular na qualidade ssea.

23

7. Bibliografia

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24

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Anexo (Software CT-Analyser)

O uso do software CT-Analyser para quantificao microestrutural envolve as seguintes etapas:

Etapa 1: Abrir os arquivos de reconstruo com formato bmp

Etapa 2: Observar as sees reconstrudas

Etapa 3: Escolha da ROI (anlise 2D) e do VOI (anlise 3D) com formato irregular ou regular

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Etapa 4: Binarizao, Anlise de Densidade e Reconstruo 3D

Binarizao

Reconstruo 3D

Etapa 5: Anlise Morfomtrica 2D ou 3D

Anlise 2D

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Escolha dos parmetros de interesse da quantificao 3D

Anlise 3D