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Quantificação de RNA
PCR quantitativo
(RT-PCR Tempo Real)
Métodos de Detecção de RNA
• Northern Blots
• Hibridização in situ
• Teste de Proteção de RNAse
• RT-PCR (qPCR)
• Microarranjo
qPCR
• Rapidez
• Sensibilidade
• Especificidade
PCR
Eletroforese
Confirmação do produto específico
PCR
Caixa Preta
PCR em tempo Real
PCR Tempo Real
Amplificação Visualização da
amplificação em tempo Real
Curva de Melting
Etapas
RNA RT PCR Quantificação
Iniciadores Iniciadores
e/ou
sondas
Modelos matemáticos
Desnaturação inicial (95oC – 5’)
Desnaturação (95oC – 15’’ a 1’)
Anelamento (50 a 65oC – 1’)
Extensão (72oC – 1’)
Extensão final (72oC – 10’)
Resfriamento (4-10oC - ∞)
30-40 x
Fases da PCR
Equipamentos
RotorGene 3000 (Corbett)LightCycler (Roche)
iCycler iQ (BioRad)ABI Prism 7700
Detecção do sinal
• Fluoróforos
– Associados a sondas
– Intercalados ao produto amplificado
Beacons
TaqMan
Scorpion
Syber Green I
Desenho do Fragmento
• Menor que 100 pb– Amplificam com maior eficiência– Denaturam com maior facilidade– Eficiência da Taq ( 30 -70 pb/sec)
• Menor fragmento 67 pb
Desenho dos Iniciadores
• Separando Exons
• Programas
• Tamanho – 15- 20 pb– 5 GC entre 20-70%– Tm 58-60oC
Quantificação
• Absoluta– Número de cópias por amostras– Curva padrão
• Relativa– Amostra A tem mais copias que B– Normalização (Gene Referência)
Quantificação - Conceitos
Visualização da amplificação em
tempo RealThreshold
Ct
Quantificação - Absoluta
Curva Padrão
Quantificação - Relativa
Controle. Tratamento
Gene Alvo
Gene Ref
Gene Alvo
Gene Ref
Modelos Matemáticos
DELTA DELTA
Gene Referência Gene Alvo
Controle
Tratamento
Controle
tratamento
Quantificação - Relativa
Pfaffl (2001)
Armadilhas
• Qualidade do RNA
• Especificidade x Inespecificidade da sonda
• Linearidade da RT
• Analise do dados
• O threshold
Conclusões
• Rapidez
• Sensibilidade
• Especificidade
• Limitado pelo alto
custo dos reagentes e
equipamentos