REGENERAÇÃO in vitro DE Eucalyptus cloeziana F. Muell · ALEX ZICHNER ZORZ REGENERAÇÃO in vitro DE Eucalyptus cloeziana F. Muell. Orientador: Dr. GILVANO EBLING BRONDANI Co-orientadores:

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO

FACULDADE DE ENGENHARIA FLORESTAL

Programa de Pós-Graduação em Ciências Florestais e Ambientais

REGENERAÇÃO in vitro DE Eucalyptus cloeziana F. Muell.

ALEX ZICHNER ZORZ

Cuiabá – MT 2016

ALEX ZICHNER ZORZ

REGENERAÇÃO in vitro DE Eucalyptus cloeziana F. Muell.

Orientador: Dr. GILVANO EBLING BRONDANI

Co-orientadores: Dr. LEANDRO SILVA DE OLIVEIRA

Dr. ANDRÉ LUIS LOPES DA SILVA

Dissertação apresentada à Faculdade de

Engenharia Florestal da Universidade

Federal de Mato Grosso, como parte das

exigências do Curso de Pós-Graduação

em Ciências Florestais e Ambientais, para

obtenção do título de mestre.

Cuiabá – MT 2016

Agradecimentos

À minha família, pelo apoio constante e a fortaleza que representam para

minha vida.

À OEA e o Grupo Coimbra, à Universidade Federal de Mato Grosso e ao

“Programa de Pós-graduação em Ciências Florestais e Ambientais”, pela

oportunidade da realização do mestrado.

À CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível

Superior), pela concessão da bolsa de estudo.

Ao Professor Dr. Gilvano E. Brondani, pela orientação académica e

profissional e também pela amizade construída nesses anos.

Ao Professor Dr. Leandro Silva de Oliveira, pela amizade e ajuda na

condução dos experimentos.

Aos colegas do mestrado, essencialmente a Fernanda Furlan e Natália

Gavilan, pelo apoio, ajuda incondicional, amizade construída e pela

atmosfera de confiança que ofereceram para mim desde o primeiro dia do

curso.

À família do “Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais” e à grande família

dos Bolsistas Estrangeiros que também contribuíram direta ou

indiretamente na realização do trabalho.

SUMÁRIO

Lista de tabelas ........................................................................................ i

Lista de figuras ...................................................................................... iii

Resume .................................................................................................... v

Abstract ................................................................................................. vii

Resumen ............................................................................................... viii

1 INTRODUÇÃO ........................................................................................ 1

2 REVISÃO BIBLIOGRAFICA ................................................................. 4

2.1 Eucalyptus sp. ................................................................................. 4

2.2 Eucalyptus cloeziana ...................................................................... 5

2.3 Propagação de Eucalyptus cloeziana ........................................... 8

2.4 Micropropagação de Eucalyptus sp. ............................................. 9

2.5 Organogênese ................................................................................ 10

2.6 Fatores que influenciam a organogênese in vitro ..................... 12

2.6.1 Tipo de explante ......................................................................... 12

2.6.2 Reguladores de crescimento ..................................................... 14

3 MATERIAL E MÉTODOS .................................................................... 17

3.1 Local dos experimentos ................................................................ 17

3.2 Material vegetal ............................................................................. 17

3.3 Desinfestação das sementes e germinação in vitro .................. 17

3.4 Preparação do meio de cultura e condições experimentais ..... 17

3.5 Cultura organogênica .................................................................... 19

3.5.1 Fonte de explantes e tratamentos ........................................... 19

3.5.2 Regeneração in vitro ............................................................... 22

3.5.3 Multiplicação e alongamento in vitro ...................................... 22

3.5.4 Enraizamento ex vitro e aclimatização .................................. 23

3.6 Análise histológica ....................................................................... 23

3.7 Análise estatística dos dados ....................................................... 24

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................ 25

5 CONCLUSÕES ..................................................................................... 49

6 CONSIDERAÇÕES FINAIS E RECOMENDAÇÕES ............................ 50

7 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ................................................... 51

i

Lista de Tabelas

Tabela 1. Composição básica do meio de cultura WPM utilizado para a indução organogênica de Eucalyptus cloeziana ...................................... 18 Tabela 2. Descrição das combinações de fito-reguladores empregados na cultura calogênica de tecidos de Eucalyptus cloeziana inoculados in vitro ................................................................................................................. 20 Tabela 3. Intensidade de calejamento dos diferentes tecidos de Eucalyptus cloeziana inoculados in vitro aos 30 dias ................................................. 21 Tabela 4. Combinação dos fito-reguladores BAP e AIB na etapa de multiplicação e alongamento in vitro de explantes de Eucalyptus cloeziana ................................................................................................................. 22 Tabela 5. Resumo da análise de variância para a porcentagem de manifestação bacteriana (BAC), oxidação (OXI), calo (CAL) e regeneração dos brotos (REG) in vitro de Eucalyptus cloeziana em relação aos tratamentos testados aos 30 dias ............................................................ 25 Tabela 6. Porcentagem de explantes de Eucalyptus cloeziana que apresentaram manifestação bacteriana in vitro em relação aos diferentes tecidos e combinações de fito-reguladores na indução à calogênese, aos 30 dias após a instalação do experiment ................................................. 28 Tabela 7. Porcentagem de explantes de Eucalyptus cloeziana que apresentaram oxidação in vitro em relação aos diferentes tecidos e combinações de fito-reguladores na indução à calogênese, aos 30 dias após a instalação do experiment ............................................................. 30 Tabela 8. Porcentagem de explantes de Eucalyptus cloeziana que apresentaram calo in vitro em relação aos diferentes tecidos e combinações de fito-reguladores na indução à calogênese, aos 30 dias após a instalação do experiment .......................................................................................... 32 Tabela 9. Resumo da intensidade calogênica in vitro nos diferentes tratamentos .............................................................................................. 33 Tabela 10. Resumo das características anatômicas identificadas em calos de Eucalyptus cloeziana relacionados aos tratamentos na fase de indução calogênica ................................................................................................ 34 Tabela 11. Porcentagem de explantes de Eucalyptus cloeziana que apresentaram regeneração adventícia in vitro no meio de indução à organogênese, aos 30 dias ...................................................................... 40

ii

Tabela 12. Descrição dos tratamentos que apresentaram formação de brotos adventícios na etapa de regeneração ........................................... 41 Tabela 13. Resumo da análise de variância do número de brotos (NB) por calo regenerado in vitro de Eucalyptus cloeziana na etapa de regeneração de brotos em relação aos tratamentos, aos 90 dias ................................ 41 Tabela 14. Número de brotos (NB) por calo regenerado in vitro de Eucalyptus cloeziana em relação aos diferentes tecidos de origem e as combinações de fito-reguladores na etapa de regeneração .................... 43 Tabela 15. Resumo da análise de variância para a porcentagem de sobrevivência (SOB%) e enraizamento (ENR%) ex vitro de brotações de Eucalyptus cloeziana aos 20 dias ............................................................ 45 Tabela 16. Porcentagem de sobrevivência (SOB%) ex vitro de microestacas de Eucalyptus cloeziana segundo a origem e os meios de multiplicação e alongamento in vitro (MMA), aos 20 dias ........................ 46 Tabela 17. Porcentagem de enraizamento (ENR%) ex vitro de microestacas de Eucalyptus cloeziana segundo a origem e os meios de multiplicação e alongamento in vitro (MMA), aos 20 dias ........................ 47

iii

Lista de figuras Figura 1. Ocorrência natural de Eucalyptus cloeziana .............................. 6 Figura 2. Tecidos de Eucalyptus cloeziana inoculados in vitro. (A) Hipocótilo; (B) cotilédone; (C) raiz. Barra = 0,25 cm ................................ 19 Figura 3. Manifestação de colônias bacterianas e oxidação in vitro em explantes de Eucalyptus cloeziana, aos 30 dias após a inoculação. (A) Tecido do hipocótilo apresentando manifestação de bactérias (setas) e (D) oxidação. (B) Bactérias presentes (setas) no tecido cotiledonar e (E) oxidação do tecido. (C) Segmentos de raiz apresentando manifestação de bactérias (setas) e (F) oxidação do tecido. Barra = 0,5 cm ...................... 27 Figura 4. Histologia de calos de Eucalyptus cloeziana. (A) Formação de calo (setas) na epiderme do explante. (B) Detalhe de estruturas meristemáticas (EM) induzidas na epiderme do explante. (C) Raízes adventícias (Ra) geradas a partir do calo (C). (E) Calos apresentando área com características meristemáticas e (D) formação de meristemoides (m). Barra = 100 µm ........................................................................................ 36 Figura 5. Calos embriogênicos de Eucalyptus cloeziana. (A e C) Detalhe de embriões somáticos de origem multicelular (ES) na fase globular desenvolvidos diretamente do explante inicial e (E) indiretamente através do calo. Barra = 100 µm. (B e D) Calos apresentando células pró- embrionárias (CPE). Barra = 25 µm. S: suspensor. Pt: Protoderme ........ 37 Figura 6. Histologia de calos organogênicos de Eucalyptus cloeziana obtidos do tratamento constituído pela combinação 7 (2,0 mg L-1 de TDZ) e o tecido do hipocótilo, evidenciando a regeneração de brotos. (A) Detalhe de regiões de atividade meristemática (setas vermelhas) e (A e B) brotações adventícias (setas amarelas) apresentando conexão vascular com a massa celular de origem (seta preta). C= Calo; B= Broto; F= Folha; MA= Meristema apical ............................................................................. 39 Figura 7. Detalhe da síntese de antocianina (setas) na superfície de calos organogênicos no 1o subcultivo (30 dias) dos explantes no meio de regeneração de brotos. Calos advindos tratamentos de indução calogênica da combinação 7 (2,0 mg L-1 de TDZ) nos tecidos do (A) hipocótilo e (B) cotilédone. Barra = 1 cm .......................................................................... 39 Figura 8. Organogênese in vitro, enraizamento ex vitro e aclimatização de microestacas de Eucalyptus cloeziana. (A e B) Calo apresentando regeneração de brotos adventícios in vitro no meio de regeneração, aos 90 dias (barra = 1 cm); (C) Calo regenerado apresentando brotos alongados ao terceiro subcultivo (90 dias) (barra = 0,5 cm); (D) Broto coletado para enraizamento ex vitro (barra = 1 cm); (E e F) Enraizamento ex vitro debrotos aos 20 dias (barra = 1 cm); (G) Enraizamento in vitro e formação de micro-

iv

cepa (barra = 1cm); (H) Mudas aclimatizadas e alocadas em casa de sombra aos 150 dias ................................................................................ 42 Figura 9. Detalhe do tufo padrão utilizado para a multiplicação e alongamento dos brotos. Corte longitudinal do calo organogênico procedente do hipocótilo induzido pela combinação 7 (2,0 mg L -1 de TDZ), conservando na base o tecido de origem. C= calo .................................. 44

v

RESUMO

ZICHNER, A. Z. Regeneração in vitro de Eucalyptus cloeziana F. Muell. 2015. (Mestrado em Ciências Florestais e Ambientais) – Universidade Federal de Mato Grosso, Cuiabá-MT. Orientador: Dr. Gilvano Ebling Brondani. Co-orientadores: Dr. Leandro Silva de Oliveira; Dr. André Luís Lopes da Silva.

Dentre as espécies de Eucalyptus plantadas no Brasil, o Eucalyptus cloeziana F. Muell tem papel destacado no setor florestal em razão das características da madeira, especialmente nos setores industriais energéticos e moveleiros. Atualmente, as instalações de plantios comerciais da espécie se reduzem a materiais genéticos por via seminal, resultando povoamentos de alta heterogeneidade com baixos rendimentos econômicos. A dificuldade de promoção rizogênica de propágulos representa o principal limitante na reprodução clonal de genótipos selecionados, na qual a cultura de tecidos, através da técnica de micropropagação, apresenta-se como uma opção atrativa e amplamente reconhecida pelas vantagens que oferece no intuito de propagar espécies e genótipos de alto valor genético. Considerando os escassos estudos direcionados ao desenvolvimento de metodologias de reprodução vegetativa de E. cloeziana, o presente trabalho teve por objetivo principal desenvolver um protocolo efetivo de micropropagação através da organogênese indireta, avaliando a interação de fito-reguladores em tecidos juvenis nas distintas etapas estabelecidas. Hipocótilo, cotilédone e raiz, foram inoculados in vitro e submetidos a 27 combinações de fito-

reguladores, compostas por concentrações entre 0, 2,0 e 4,0 mg L-1 do ácido naftalenoacético (ANA) e 0, 1,0 e 2,0 mg L-1 do thidiazuron (TDZ) e do ácido diclorofenoxiacético (2,4-D) respectivamente, sendo estes os principais tratamentos nas fases de calogênese, regeneração adventícia de brotos, multiplicação e alongamento das brotações in vitro e sua competência no enraizamento e aclimatização ex vitro. Os resultados foram avaliados mediante a análise de variância (p<0,01 e p<0,05) e a comparação de médias pelo teste de Duncan (p<0,05). A resposta à desdiferenciação celular e formação de calo foi eficiente na maioria dos tratamentos, destacando as elevadas intensidades calogênicas fornecidas

pelas concentrações de 1,0 mg L-1 de 2,4-D e 2,0 mg L-1 de TDZ nos tecidos utilizados. Analises histológicas favoreceram a identificação de características morfogênicas relacionadas à formação de estruturas pro embriogênicas e embriôes somáticos na fase globular destacados nas combinações dos reguladores ANA e 2,4-D. Todos os tecidos apresentando calo foram transferidos no meio de regeneração constituído

pela concentração de 1,0 mg L-1 de benzilaminopurina (BAP) para estimular a competência dos calos à formação de brotações adventícias destacando- se, principalmente, o tratamento composto pelo tecido do hipocótilo na

concentração de 2,0 mg L-1 do TDZ do meio de indução, o qual forneceu uma média de 41,5 brotos por calo organogênico. Na fase de enraizamento e aclimatização ex vitro, o mesmo tratamento foi destacado nas variáveis de porcentagem de sobrevivência (80 e 100%), e enraizamento (55,6 e 80%) das brotações advindas dos meios de cultura de multiplicação e

vi

alongamento. O sistema de miniestufa foi adequado para a aclimatização inicial e posteriormente as mudas foram rustificadas em casa de sombra (50%). Dessa forma, comprovou-se a eficiência da cultura de tecidos através da organogênese in vitro e sua possível implementação para o desenvolvimento de novas metodologias visando a produção de mudas de Eucalyptus cloeziana.

Palavras-chave: Eucalipto, organogênese, calo, enraizamento adventício.

vii

ABSTRACT

ZICHNER, A. Z. In vitro regeneration of Eucalyptus cloeziana F. Muell. 2015. 2015. Dissertation (Master in Forestry and Environmental Sciences) - Federal University of Mato Grosso, Cuiabá. Adviser: Dr. Gilvano Ebling Brondani. Co-advisers: Dr. Leandro Silva de Oliveira; Dr. André Luís Lopes da Silva. Among the species of Eucalyptus planted in Brazil, Eucalyptus cloeziana F. Muell has a prominent role in the forestry sector due to the wood characteristics, especially in the energy and furniture industrial sectors. Currently, the commercial growing of plants of the species are reduced to genetic material by seminal seedlings, resulting stands high heterogeneity with low economic returns. The difficulty of rizogenic seedlings promotion is the main limiting the clonal reproduction of selected genotypes, in which tissue culture through micropropagation technique presents itself as an attractive option and widely recognized by the advantages it offers in order to propagate species and high genetic value genotypes. Considering the few studies directed to the development of vegetative reproduction methods of E. cloeziana, the present work had as main objective to develop an effective micropropagation protocol by indirect organogenesis, assessing the interaction of phyto-regulators in juvenile tissues in different stages established. Hypocotyl, cotyledon and root were inoculated in vitro and submitted to 27 combinations of phyto-regulators, concentrations

comprised between 0, 2.0 and 4.0 mg L-1 naphthalene acetic acid (NAA) and 0, 1.0 and 2.0 mg L -1 thidiazuron (TDZ) and dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) respectively, which are the main treatments in phases of callus formation, adventitious bud regeneration, multiplication and elongation of shoots in vitro and competence rooting and acclimatization ex vitro. The results were evaluated by analysis of variance (p<0.01 and p<0.05) and comparison of means by Duncan test (p<0.05). The response to cell dedifferentiation and callus formation was efficient most of the treatments

highlighting the high calogenic intensities provided by 2.0 mg L-1 of TDZ concentration and 1.0 mg L-1 of 2,4-D on all tissues tested. Histological analysis facilitated the identification of morphogenesis features related to the formation of pro embryogenic structures and somatic embryos in globular stage highlighting combinations of NAA and 2,4-D regulators. All callus tissue was exposed to the effect of the benzylaminopurine (BAP) concentration of 1.0 mg L-1 to enhance the competence of the callus regeneration of adventitious shoots highlighting mainly the treatment

composed by the hypocotyl tissue in the TDZ concentration of 1.0 mg L-1

induction medium, which provided an average of 41.5 shoots per organogenic callus. In the ex vitro acclimatization phase, the same treatment was highlighted in survival percentage variables (80 and 100%), and rooting (55.6 and 80%) of shoots arising from multiplying and stretching culture medium. The mini-incubator system was adequate for the initial acclimatization and later the seedlings were rustic in shade house (50%). Thus, it proved the efficiency of tissue culture through organogenesis in vitro and possible implementation for the development of new methods aiming at

viii

the production of Eucalyptus cloeziana plants.

Keywords: Eucalypt, organogenesis, calli, adventitious rooting

ix

RESUMEN

ZICHNER, A. Z. Regeneración in vitro de Eucalyptus cloeziana F. Muell. 2015. (Maestría en Ciencias Forestales y Ambientales) – Universidad Federal de Mato Grosso, Cuiabá-MT. Orientador: Dr. Gilvano Ebling Brondani. Coorietadores: Dr. Leandro Silva de Oliveira; Dr. André Luís Lopes da Silva.

Entre las especies de eucalipto plantados en Brasil, Eucalyptus cloeziana F. Muell tiene un papel destacado en el sector forestal, debido a las características de la madera, especialmente en los sectores energéticos e fabricantes de muebles. Actualmente, el cultivo comercial de plantas de la especie se reduce a material genético por vía seminal, lo que demuestra alta heterogeneidad con retornos económicos bajos. La dificultad de la promoción rizogénica de las plántulas es la principal limitación de la reproducción clonal de genotipos seleccionados, en los que el cultivo de tejidos a través de la técnica de micropropagación, representa como una opción atractiva y ampliamente reconocida por las ventajas que ofrece para propagar especies y genotipos de altos valor genético. Teniendo en cuenta los pocos estudios dirigidos al desarrollo de métodos de reproducción vegetativa de E. cloeziana, el presente trabajo tuvo como objetivo principal el desarrollo de un protocolo efectivo de micropropagación E. cloeziana por organogénesis indirecta, mediante la evaluación de la interacción de los fito-reguladores en los tejidos juveniles en las diferentes etapas establecidas. Hipocótilo, cotiledón y segmentos de raíz fueron inoculados in vitro y sometidos a 27 combinaciones de fito-reguladores, con concentraciones comprendidas entre 0, 2,0 y 4,0 mg L-1 ácido acético naftaleno (ANA) y 0, 1,0 y 2,0 mg L-1 thidiazurón (TDZ) y ácido diclorofenoxiacético (2,4-D), respectivamente, fueron los principales tratamientos en las fases de formación de callo, la regeneración yemas adventicias y la competencia enraizamiento ex vitro, evaluados mediante análisis de la varianza (p<0,01 y p<0,05) y la comparación de medias mediante el test de Duncan (p <0,05). La respuesta a la desdiferenciación celular y la formación de callo fue eficiente para la mayoría de los tratamientos destacando altas intensidades de calogênicas proporcionadas por las concentraciones de 2,0 mg L-1 de TDZ y 1,0 mg L-1 2,4-D en los tejidos testados. Análisis histológicos detectaron características morfogénicas relacionadas a la formación de estructuras pre embriogénicas y embriones somáticos en fase globular, destacados en las combinaciones de los reguladores ANA y 2,4-D. Todos los callos han sido expuestos al efecto de la concentración 1,0 mg L-1 de la citocinina bencilaminopurina (BAP) para inducir a la regeneración de brotes adventicios, en los cuales se destacó el tratamiento que comprende el tejido de hipocótilo y la concentración de 1,0 mg L-1 de TDZ del medio de inducción, que proporcionó un promedio de 41,5 brotes por callo organogénico. En la fase de aclimatación ex vitro, el mismo tratamiento se destacó en las variables de porcentaje de supervivencia (80 y 100%), y enraizamiento (55,6 y 80%) de los brotes resultantes de los medios de multiplicación y alongamiento in vitro. El sistema miniestufa fue adecuado para la aclimatación inicial y más tarde las plántulas fueron rustificadas en casa de sombra (50%). Por lo

x

tanto, se demostró la eficacia de cultivo de tejidos a través de organogénesis in vitro y su posible aplicación para el desarrollo de nuevos métodos con el objetivo de la producción satisfactoria de plantas de Eucalyptus cloeziana. Palabras claves: Eucalipto, organogénesis, callos, enraizamiento adventicio.

1

1 INTRODUÇÃO

Dentro das espécies exóticas mais cultivadas no setor florestal

brasileiro destacam-se as espécies do gênero Eucalyptus; reconhecidas

por suas características silviculturais, rápido crescimento, grande

plasticidade ecológica e propriedades na madeira, as quais tornam à árvore

atrativa para atividades comerciais e de pesquisa.

A maioria dessas espécies se desenvolve em regiões tropicais e

subtropicais, assim como no Brasil onde é considerado o gênero florestal

mais importante. Diversas espécies vêm sendo avaliadas para o

estabelecimento de plantações comerciais devido à grande demanda de

produtos florestais. Dentre as espécies promissoras destaca-se o

Eucalyptus cloeziana pela aptidão e competência na silvicultura. Ademais,

características tecnológicas da sua madeira como alta densidade, grande

durabilidade e excelente qualidade para serrarias, produção de carvão e

uso na construção civil apresentam-se atrativas para o setor florestal.

O melhoramento genético é uma realidade de grande

importância no setor florestal atual, a qual se fundamenta na seleção de

espécies e indivíduos com características determinadas por fatores

genéticos e na evolução das ferramentas para obter produtos madeireiros

de maior qualidade, num espaço e tempo menor, para diversos ramos

industriais que expressam constante crescimento.

Associada às técnicas de propagação clonal destes indivíduos

selecionados, a biotecnologia também tem avançado com os programas de

melhoramento das espécies florestais, fornecendo metodologias para a

produção massiva de mudas através da clonagem de árvores. Como forma

de propagação vegetativa, baseada em técnicas de cultura de tecidos in

vitro, a micropropagação torna-se uma alternativa para a regeneração de

plantas que apresentam dificuldades de reprodução natural e também onde

os métodos convencionais de propagação clonal não se tornam viáveis

(THORPE et al., 1991).

Uma das metodologias atuais adotadas para a obtenção de

mudas de espécies de Eucalyptus constitui a organogênese, atualmente

escolhida como alternativa para micropropagar espécies lenhosas em

2

grande escala. Ademais atende trabalhos de transformação genética que

estão sendo gerados com a tentativa de inserir caracteres genéticos que

poderiam promover propriedades de interesse econômico, não apenas à

produtividade, mas também à qualidade de madeira, resistência a

herbicidas, pragas e doenças (GIRIJASHANKAR, 2011).

A realização de análises histológicas em trabalhos de

organogênese in vitro é fundamental para a confirmação da origem dos

novos órgãos formados em cultivo, excluindo-se a possibilidade de

interpretação equivocada dos resultados advindos da presença de gemas

pré-formadas no explante original (ALVES et al., 2004b).

Apesar dos grandes avanços na silvicultura clonal das espécies

de eucalipto, a propagação vegetativa de Eucalyptus cloeziana constitui

ainda um fator limitante para a produção de mudas em escala comercial,

sendo a espécie considerada, por muitos autores, como de difícil

enraizamento em comparação às demais espécies do gênero (ALFENAS

et al., 2004).

Por tanto, a importância de desenvolver novas metodologias e

protocolos efetivos de regeneração in vitro, especificamente para espécie

Eucalyptus cloeziana são atrativas, visando conhecer as diversas

respostas envolvidas no processo da micropropagação, as quais estão

associadas não apenas à resposta da espécie também as respostas

envolvidas na idade fisiológica dos explantes e a resposta aos reguladores

de crescimento.

1.1 Objetivos

Objetivo geral

Estabelecer um protocolo efetivo para a micropropagação de

Eucalyptus cloeziana através da organogênese indireta.

Objetivos específicos

1. Avaliar o efeito das combinações de fito-reguladores (ácido

naftalenoacético (ANA), thidiazuron (TDZ) e ácido diclorofenoxiacético (2,4-

D)) na indução de calos em tecidos juvenis (hipocótilo, cotilédone e raiz).

2. Avaliar a competência morfogênica dos calos na regeneração

de órgãos adventícios.

3

3. Avaliar a composição da origem dos brotos na resposta à

promoção de raízes adventícias.

4. Identificar padrões de diferenciação histológica e a origem

do desenvolvimento organogênico e/ou embriogênico nos explantes.

4

2 REVISÃO BIBLIOGRAFICA

2.1 Eucalyptus sp.

O gênero Eucalyptus engloba aproximadamente 700 espécies

arbóreas que pertencem à família Myrtaceae (BOLAND et al., 2006) onde

naturalmente ocorrem nos territórios da Austrália, Filipinas, Ilhas Timor e

Nova Guiné e representam, provavelmente, as árvores mais conhecidas

(ALVES, 2007), com maior quantidade de investigações e mais utilizadas

para plantações florestais (ALVES et al., 2004).

As principais características destas árvores se referem ao rápido

crescimento, a plasticidade e adaptabilidade às diferentes condições edafo-

climáticas que permite inúmeras utilizações como matéria-prima, onde sua

madeira é aproveitada para a construção civil, carvão para energia,

produção de papel, e as folhas para a extração de óleos essenciais (TIBOK

et al., 1995) e, atualmente, escolhidas também por sua capacidade de

oferecer serviços ambientais, tais como a captura de carbono atmosférico

e recuperação de áreas degradadas.

Muitas espécies de Eucalyptus, e seus híbridos, são utilizados

amplamente como espécies exóticas para plantações em muitas áreas

tropicais e subtropicais do mundo (POTTS e DUNGEY, 2004; PEREIRA et

al., 2000). Os principais híbridos (incluindo os recíprocos) utilizados

comercialmente são o E. grandis × E. urophylla, E. grandis × E.

camaldulensis incluindo as espécies E. saligna, E. pellita, E. exserta e E.

tereticornis (DUNGEY e NIKLES 2000). Embora no Brasil e no Congo são

plantados em grande escala, consideráveis plantações também ocorrem na

China, Indonésia e África do Sul. Há também pequenas áreas destes

híbridos e espécies de eucalipto em outros países da Ásia (Filipinas, Vietnã,

Tailândia e Malásia) e América do Sul (Chile, Uruguai, Argentina, Paraguai)

(DUNGEY e NIKLES, 2000).

Nas áreas de florestas plantadas no Brasil com Eucalyptus,

predomina a espécie E. grandis, que ocupa 55% da área total, seguido de

17% com E. saligna, 11% com híbridos de E. grandis × E. urophylla, 9%

com E. urophylla, 2% com E. viminalis, e 6% com outras espécies

(CAMPOS et al., 2011), onde as espécies de E. cloeziana e E. dunnii são

5

consideradas promissoras para as regiões central e sul, respectivamente,

e o E. benthamii, vem se destacando nas regiões frias do sul do país

(HIGASHI et al., 2000).

Segundo o Anuário Estatístico da Associação Brasileira de

Produtores de Florestas Plantadas (ABRAF, 2013) em 2012, a área de

plantios de Eucalyptus no Brasil totalizou 5.102.030 ha, representando

crescimento de 4,5% (228.078 ha) frente ao indicador de 2011. Tratando-

se de produtos de florestas plantadas, o Brasil figura como o maior

exportador mundial de celulose e fibra de eucalipto (SARTORETTO et al.,

2008). O principal fator que alavancou esse crescimento foi o

estabelecimento de novos plantios com base na biotecnologia, frente à

demanda futura dos projetos industriais, principalmente do segmento de

papel e celulose.

2.2 Eucalyptus cloeziana

Natural da Austrália, o Eucalyptus cloeziana F. Muell também é

denominado como Gympie messmate, e representa a única espécie do

subgenero Idiogenes, onde ocorre ao leste do Estado de Queensland, no

distrito de Gympie no sudeste, com extensas ocorrências em Mundubbera

ao oeste de Springsure, e alguns pomares isolados no norte e oeste de

Townsville (Figura 1). Apresenta ocorrências descontínuas ao norte da

região de Townsville e ao oeste de Cooktown (BOLAND et al., 2006).

Na região de origem, o clima é quente e sub-úmido a úmido, com

temperatura média do mês mais quente entre 29 e 34ºC, e a média das

mínimas do mês mais frio entre 5 e 18ºC, podendo ocorrer fracas geadas

em até 5 dias por ano. A precipitação pluviométrica média anual varia entre

550 e 2300 mm (IPEF, 2015). O melhor desenvolvimento da espécie ocorre

nos solos bem drenados, ácidos e de baixa a média fertilidade natural, ou

seja, situações associadas a áreas de depósito de sedimentos ou de

misturas calcário e argila de origem vulcânica, de profundidade moderada

(BOLAND et al., 2006).

Eucalyptus cloeziana é uma espécie rústica e de rápido

crescimento, adequada para reflorestamentos destinados à produção de

madeira para diversos usos.

6

No Brasil, é uma espécie considerada de recente introdução e

tem-se observado bom desempenho de diferentes procedências em

regiões tropicais como no Cerrado (savana) onde, segundo Moura e

Guimarães (1988) foram registrados crescimentos em volume iguais a 35

m3/ha/ano, destacando-se materiais procedentes de Kennedy, assim como

também na região nordeste do pais onde plantios das procedências de

Gympie e Paluma tiveram desenvolvimento esperados (MOURA e

GUIMARÃES, 1988). Em regiões subtropicais também apresentaram

desenvolvimento adequado, principalmente no sudeste e o Sul (MOURA,

2003; LORENZI et al., 2003).

Figura 1. Ocorrência natural de Eucalyptus cloeziana (BOLAND et

al., 2006)

Segundo Moura (2003), existem registros de plantações

estabelecidas com essa espécie em outras regiões do mundo, onde é

considerado importante para reflorestamentos destinados para suportes de

linhas telefônicas e transmissão de energia, especialmente em países no

sul da África como Congo, Quênia, Malawi, Nigéria, Moçambique, África do

Sul, Zimbábue e Uganda e Zâmbia. Os plantios são realizados,

principalmente nas regiões de chuvas de verão com precipitação anual de

1000 a 1500 mm e uma estação seca de 4 a 5 meses (HOPEWELL et al.,

2008).

7

Hopewell et al. (2008) e Chen et al. (2010) consideram a

Eucalyptus cloeziana como uma das espécies candidatas para o

estabelecimento de plantios comerciais com objetivo de produção de

madeira sólida, devido a sua excepcional forma e retidão do fuste

(BLEAKLEY e CANT, 1985), o que garante a presença de toras com alto

aproveitamento no processamento mecânico.

Além disso, a alta densidade (0,855 a 1,140 g/cm3) e a durabilidade

natural da madeira, mesmo sem tratamento químico, são, sem dúvida, as

principais qualidades desejadas para a construção civil, produção de

escoras, caibros e mourões (PEREIRA et al., 2000; PALUDZYSZYN FILHO

et al., 2006), além de oferecer matéria-prima para atender às exigências da

indústria moveleira e de laminados (GONZALEZ et al., 2006;

INTERAMNENSE, 1998).

Eucalyptus cloeziana, em conjunto com outras espécies de

eucalipto, tais como E. camaldulensis, E. citriodora e E. deglupta,

representa uma das espécies escolhidas para a instalação de plantações

para fins energéticos (COUTO et al., 2011). Em programas de

melhoramento genético são selecionados espécies e clones que

apresentem resistência a doenças e alto conteúdo de carbono fixo e lignina

na madeira, desejado para a produção de carvão (AMS, 2004),

características que diferem em projetos para plantios direcionados às

indústrias de celulose e papel.

Entre as limitações silviculturais importantes da espécie, E.

cloeziana apresenta susceptibilidade às geadas fortes (CLARKE et al.,

2009) e não se adapta bem em regiões com deficiência hídrica severa

(NGUGI et al., 2004).

Em relação à instalação de plantações, esporadicamente esta

espécie é afetada pelo lepidóptero desfolhador Thyrintheina arnobia em

solos arenosos e de baixa fertilidade (MOURA, 2001). Também se destaca

a susceptibilidade à ferrugem causada por Puccinia psidii (FERREIRA.

1989; ALFENAS et al., 2004).

A incidência severa de ferrugem causada por este fungo foi

verificada nos plantios de E. cloeziana no sul da Bahia, com até seis a oito

meses de idade (MORAES et al., 1982). Esta doença incide sobre partes

8

jovens da planta, tais como primórdios foliares, pecíolos, ápices dos ramos

e na haste principal de mudas no viveiro; e ataca da mesma forma,

brotações de cepas (RUIZ et al., 1987), limitando o seu plantio em regiões

sujeitas a esta enfermidade.

2.3 Propagação de Eucalyptus cloeziana

Escassos são os estudos científicos que envolvem a produção

de mudas de Eucalyptus cloeziana o qual necessita, todavia, de maior

desenvolvimento e pesquisa que possam consolidar metodologias de

propagação, tanto seminal como clonal, que possam apoiar programas de

melhoramento genético e o estabelecimento de plantios comerciais.

A metodologia de propagação dessa espécie ainda é restrita

pela obtenção de mudas por sementes, mesmo que a espécie apresente

altos índices de produção de sementes, todavia há baixa porcentagem de

germinação e dificuldade na repicagem em condições de viveiro (MOURA

e GUIMARÃES, 2003). Em condições in vitro Cid et al. (1997) relataram a

dificuldade de germinação e estabelecimento de sementes de E. cloeziana

devido, principalmente, a manifestação de fungos e a presença de

bactérias no meio de cultura.

Atualmente, os avanços na silvicultura clonal de diferentes

espécies do gênero Eucalyptus são relevantes na comunidade científica e

empresarial. Contudo, são poucos os estudos que envolvem a propagação

vegetativa de Eucalyptus cloeziana em escala comercial, considerando que

o enraizamento adventício em estacas e miniestacas apresenta-se como

fator limitante para a produção de mudas clonais (ALFENAS et al., 2004).

Técnicas de propagação amplamente utilizadas como estaquia

e miniestaquia foram desenvolvidas por Almeida et al. (2007a) e Almeida

et al. (2007b) respectivamente, os quais verificaram altas porcentagens de

enraizamento dos propágulos, mesmo assim destacaram a variabilidade

apresentada dos resultados dependendo dos materiais genéticos e da fonte

de fornecimento dos propágulos.

Trueman et al. (2013) também avaliaram a porcentagem de

enraizamento de miniestacas de E. cloeziana frente a condições de

temperatura nas quais as mini-cepas foram submetidas, concluindo que

9

elevando a temperatura, em torno de 33 °C, foi eficiente para promover a

produção de propágulos e aumentar a porcentagem de enraizamento.

Atualmente, visando o estabelecimento de protocolos efetivos

de propagação de espécies de Eucalyptus que apresentam dificuldades ao

enraizamento de propágulos, são utilizadas estratégias mediante a cultura

in vitro, que é amplamente descrito na literatura (SHARMA e

RAMAMURTHY, 2000; BORGES et al., 2011, OLIVEIRA et al., 2012;

BRONDANI et al., 2012a), em situações em que as metodologias

convencionais não foram satisfatórias para a promoção da juvenilidade dos

tecidos ou mesmo para aumentar a multiplicação e produção de mudas

clonais (CHAPERON, 1987).

Baseado nesse contexto, Oliveira (2014) estabeleceu

protocolos pioneiros de micropropagação por meio das técnicas de

organogênese indireta e a proliferação de gemas axilares de Eucalyptus

cloeziana, evidenciando os procedimentos como efetivos para a

propagação extensiva da espécie. Assim também, Oliveira et al. (2015)

avaliaram o processo da micropropagação de material adulto de árvores

selecionadas de Eucalyptus cloeziana promovendo a reversão do estado

juvenil e em consequência, o enraizamento efetivo das micro-estacas,

fornecendo resultados promissores para a propagação clonal da espécie.

2.4 Micropropagação de Eucalyptus sp.

A micropropagação é a aplicação mais prática da cultura de

tecidos de plantas, sendo uma das técnicas de propagação de maior

impacto e mais difundida nos últimos anos (GRATTAPAGLIA e MACHADO,

1998; OLIVEIRA et al., 2013). Atualmente se encontra embutida no setor

florestal, principalmente no que diz respeito aos programas de

melhoramento genético.

A clonagem de Eucalyptus no Brasil passou por inúmeras

transformações, tendo iniciado com a técnica de estaquia que foi

implementada em escala comercial no final da década de 70 (XAVIER et

al., 2013).

Devido às dificuldades de enraizamento encontradas em

algumas espécies e híbridos de Eucalyptus na propagação clonal por

10

estaquia, principalmente no que envolve material adulto, o

desenvolvimento de técnicas visando a reversão à juvenilidade e o vigor

dos propágulos, como a mini-estaquia seriada (WENDLING e XAVIER,

2005) e da micro-estaquia (XAVIER e COMÉRIO, 1996; ASSIS, 1997) têm

permitido avanços consideráveis na propagação clonal de Eucalyptus. Em

clones com maior dificuldade de enraizar, existe maior eficiência de

enraizamento em resposta ao rejuvenescimento in vitro pelo uso da micro-

estaquia (SANTOS et al., 2005; TITON et al., 2006; OLIVEIRA et al., 2012),

além de favorecer a maximização do processo de produção de mudas

micropropagadas, através do enraizamento ex vitro.

Dentre outras vantagens são descritos a maximização ou a

manutenção do valor genético do clone a ser propagado (DUTRA et al.,

2009), preservação de germoplasma, produção de plantas livres de

doenças (XAVIER et al., 2013) e constituir uma base para o emprego de

outras técnicas biotecnológicas, como a transformação genética

(GONZALEZ, 2002).

Conforme o explante utilizado e sua subsequente manipulação,

a micropropagação pode ser conduzida por uma das três maneiras:

mediante a multiplicação por meio da proliferação de gemas axilares;

mediante a indução de gemas adventícias por organogênese direta ou

indireta ou mediante embriogênese somática (THORPE et al., 1991;

BONGA e VON ADERKAS, 1992; LAKSHMI SITA, 1993; GRATTAPAGLIA

e MACHADO, 1998), onde a primeira corresponde ao principal método de

cultivo in vitro do Eucalyptus, com diversos trabalhos relatando o uso dessa

metodologia para a clonagem de espécies deste gênero (XAVIER e SILVA,

2010), sendo este sistema mais facilmente controlado e apresenta

fidelidade genética muito alta, em que as gemas pré-formadas possuem

determinação para o crescimento vegetativo, as quais irão se desenvolver

naturalmente em plantas completas (GRATTAPAGLIA e MACHADO,

1998).

2.5 Organogênese

O processo de organogênese in vitro é considerado um evento

complexo (XAVIER e OTONI, 2009). Este dá-se mediante a

11

desdiferenciação e diferenciação celular, retomada da atividade

meristemática em células maduras diferenciadas ou em um tecido

calogênico desorganizado (ALVES et al., 2004a). Em outras palavras, pela

indução de gemas adventícias diretamente sobre os explantes ou sobre

uma massa de células não-organizadas, denominada calo (THORPE et al.,

1991; BONGA e VON ADERKAS, 1992).

Quando as gemas se formam diretamente sobre os explantes,

a organogênese é denominada direta, ocorrendo em tecidos que

apresentam potencial morfogênico. Em certas espécies, gemas

adventícias podem surgir diretamente do tecido do explante, não havendo

a formação prévia de calos, o que proporciona fidelidade na propagação

(XAVIER et al., 2013).

A organogênese é denominada indireta quando formação da

gema é precedida pela formação de calo, onde o processo se produz

previamente a desdiferenciação e diferenciação celular e surgem gemas

que crescem e se desenvolvem em novas partes aéreas (VIJAYA e GIRI,

2003).

Dentre a principais utilidades dessa técnica, além de oferecer

uma alta taxa de multiplicação e regeneração, reproduzindo grandes

quantidades de plantas (THORPE et al., 1991). Também é adotado quando

se deseja produzir células para manipulações genéticas, como

poliploidizações e transformações genéticas (VENTURIERI e

VENTURIERI, 2004). Por tanto, a fidelidade das características genéticas

se vê comprometida em protocolos de propagação clonal que induzem a

formação de calo, possivelmente na promoção de variações somaclonais

(GIRIJASHANKAR, 2012), as quais não são facilmente controladas.

As multiplicações sucessivas podem dar-se pela subdivisão do

calo e manutenção de um sistema adventício, ou pela alteração do

processo para proliferação axilar (GRATTAPAGLIA e MACHADO, 1998).

A regeneração in vitro de espécies de Eucalyptus através da

organogênese tem sido relatada para algumas espécies, tais como o E.

tereticornis (SUBBAIAH e MINOCHA, 1990; AGGARWAL et al., 2010), E.

grandis (BRONDANI et al., 2012b; ARENHART e ZAFFARI, 2008;

PEREIRA et al. 2013), E. grandis × E. urophylla (ALCANTARA et al., 2011;

12

BATISTA, 2012; HAJARI et al., 2006), E. nitens (BANDYOPADHYAY et al.,

1999), E. saligna (DIBAX et al., 2010a), E. globulus (NUGENT et al., 2001),

camaldulensis (MURALIDHARAN e MASCARENHAS, 1987; DIBAX et al.,

2010b; GIRIJASHANKAR, 2012), E. benthamii × E. dunnii (CAUDURO,

2013) e E. gunnii (HERVÉ et al., 2001).

Apesar dos estudos demonstrarem a viabilidade e relativa

facilidade da multiplicação in vitro de diferentes espécies de eucalipto via

organogênese é preciso levar em consideração que o protocolo de

regeneração deve ser adaptado para cada espécie, pois embora um

protocolo seja estabelecido para uma espécie, ou até mesmo para um

clone, normalmente pode não ser eficiente para outra espécie

(ALCANTARA, 2008). Alguns estudos demonstraram que diferentes

espécies submetidas às mesmas condições de cultivo, resultaram com

desempenho produtivo divergente (NASCIMENTO, 2013).

2.6 Fatores que influenciam a regeneração in vitro

Na obtenção da regeneração in vitro são testados múltiplos

fatores externos e internos, envolvendo interação entre o meio de cultura,

fatores do ambiente de incubação (PERES, 2002; BORGES et al., 2012),

ação de reguladores de crescimento, em particular a relação entre auxinas

e citocininas (LEMOS, 2010) como também da habilidade ou competência

dos tecidos para responder às mudanças hormonais durante o período de

cultivo (GEORGE et al., 2008; PIERIK, 1997).

2.6.1 Tipo de explante

A partir da seleção da espécie que se deseja micropropagar,

identifica-se a fonte de explante que possa apresentar melhores condições

de resposta ao cultivo in vitro (CID e TEIXEIRA. 2010). Qualquer parte do

tecido extraído da planta destinada ao uso in vitro denomina-se explante.

A lista de possíveis explantes é longa e variada, mas não todos

os explantes reagem da mesma forma a uma determinada condição in vitro.

Assim, é importante a identificação de partes da planta que possam

responder satisfatoriamente à propagação vegetativa, mas haverá maior

sucesso se forem utilizados tecidos jovens, os quais possuem maior

competência organogênica (XAVIER et al., 2013; WENDLING et al., 2014).

13

O sucesso no cultivo do material vegetal in vitro é influenciado

pela idade do tecido ou órgão que será utilizado como explante inicial.

Assim, os requerimentos na formação do calo frequentemente diferem de

acordo com a idade do explante (GEORGE et al., 2008). Ainda,

considerando o tipo de material inicial, juvenil ou adulto, assim como a

posição original do explante na planta refletem os níveis hormonais

endógenos das células do tecido utilizado, podendo ter importante

influência sobre cada processo como o da divisão celular nos processos de

regeneração in vitro, tanto na organogênese e a embriogênese (PIERIK,

1997).

Na regeneração in vitro, tanto para processos organogênicos,

como embriogênicos em espécies de Eucalyptus, são utilizados uma ampla

gama de explantes dependendo da rota morfogênica desejável, como

embriões zigóticos (PINTO et al., 2002; PRAKASH e GURUMURTHI,

2010), cotilédones (BANDYOPADHYAY et al., 1999; DIBAX et al., 2010b;

DIBAX et al., 2005), hipocótilos (SUBBAIAH e MINOCHA, 1990; HUANG et

al., 2010), ápices meristemáticos (GLOCKE et al., 2006) segmentos nodais

(GIRIJASHANKAR, 2012; BRONDANI et al., 2012b).

Embora segmentos de raiz apresentam capacidade

morfogênica (KERBAUY, 1998), estudos em processos orgenogênicos de

Eucalyptus este tipo de explante não são escolhidos por apresentar

grande sensibilidade ao estresse oxidativo.

A escolha do explante dependerá da viabilidade para a sua

utilização, sobretudo pela capacidade de resposta morfogênica em relação

aos estímulos induzidos no cultivo in vitro (LEMOS, 2010). Dessa forma,

a opção por explantes que apresentem um menor grau de diferenciação

reflete em uma maior probabilidade de sucesso quanto à regeneração de

gemas adventícias ou embriões nos explantes. Embora explantes adultos

coletados de materiais selecionados são poucos relatados na literatura

devido a sua dificuldade na expressão de respostas in vitro, mas através

de culturas sucessivas pode-se reverter o estado juvenil, favorecendo

assim altos índices de regeneração.

14

2.6.2 Reguladores de crescimento

Reguladores de crescimento ou fito-hormônios vegetais são

aqueles produzidos pela própria planta; que em baixas concentrações, são

biologicamente ativos, podendo promover, inibir ou modificar o

crescimento, geralmente em um local diferente daquele onde foi produzido,

mas também esses podem ser sintetizadas produzindo efeitos

semelhantes aos hormônios naturais (LEMOS, 2010).

A escolha do fito-hormônio a ser utilizado na cultura in vitro

dependerá do tipo de morfogênese desejada; de seu nível endógeno no

explante no momento da excisão; da capacidade do tecido sintetizar o

regulador durante o período da cultura e da possível interação entre os fito-

hormônios endógenos e aqueles adicionados ao meio (SANTOS, 2003).

Cid e Teixeira (2010) salientam que na cultura de tecidos as

auxinas são utilizadas no enraizamento de brotos, e combinações com

citocininas são frequentemente usadas na organogênese e/ou

embriogênese favorecendo à indução do calo a partir de um explante.

Combinações de auxinas, como o ácido naftalenoacético (ANA)

e o ácido diclorofenildioxiacético (2,4-D), com as citocininas,

benzilaminopurina (BAP) e o thidiazuron (TDZ), são amplamente utilizadas

nas fases de indução à formação de calo e formação de brotos, destacando

que alguns reguladores de crescimento têm uma posição ambígua, pois

atuam como auxina ou como citocinina. Esse é o caso do Thidiazuron ou

TDZ (LU, 1993), que grande parte dos trabalhos com espécies de

Eucalyptus relataram o uso do TDZ em concentrações que variam de 0,01

mg L-1 a 10 mg L-1 para a indução de calos in vitro (CID et al., 1999; ALVES

et al., 2004a, b).

Embora sejam destacadas as vantagens do uso do TDZ,

Huetteman e Preece, (1993) e Lu (1993) reportam dificuldades na

conversão das brotações induzidas por esse regulador em plantas inteiras,

reduzidos índices nos processos de alongamento e enraizamento, os quais

recomendam a adequação de concentrações efetivas nos processos de

regeneração in vitro e evitar prolongadas exposições nos meios de cultura

onde concentrações de TDZ foram adicionados.

15

Calogênese

Arenhart e Zaffari (2008) avaliaram diferentes combinações dos

reguladores 2,4-D, TDZ, ANA e AIA (ácido indolilacético) na formação de

calos, registrando porcentagens reduzidas e nulas nas combinações entre

2,4-D e TDZ, mas nos tratamentos de concentrações isoladas responderam

efetivamente. Segundo George et al. (2008), o 2,4-D representa a auxina

mais usada na indução de calo em estudos de organogênese indireta.

Apesar disso, o 2,4-D é pouco usado na cultura de Eucalyptus, mas

atualmente vem sendo avaliado nos processos de embriogênese, em

combinação com outras auxinas (PINTO et al. 2002).

Oliveira (2014) destacou a efetividade do uso de concentrações

isoladas de TDZ na formação calos organogênicos de Eucalyptus

cloeziana, em comparação às concentrações de ANA, sendo esta última

não favorável. Contudo, as experiências de Alves et al. (2004b) e Dibax et

al. (2010b) indicam melhores resultados de calejamento de tecidos nos

tratamentos com a combinação dos reguladores de crescimento desses

reguladores (TDZ e ANA) no hibrido Eucalyptus grandis × Eucalyptus

urophylla e em Eucalyptus saligna, respectivamente.

Em explantes de hipocótilo de plântulas com idade de 14 dias de

Eucalyptus urophylla em meio de cultura com TDZ mais ANA, além de que

induziram tanto à organogênese quanto a formação de estruturas

semelhantes a embriões no estádio cordiforme (TIBOK et al., 1995).

Dibax et al. (2005) também testaram a relação auxina/citocininas

na organogênese de E. camaldulensis mediante diferentes combinações

de ANA e BAP durante a fase de calogênese, e observaram que em

concentrações estabelecidas de BAP, a formação de calos foi favorecida

com a presença de maiores concentrações de ANA.

Diferenciação celular e formação de brotos

Na etapa de indução à diferenciação celular e adoção à

competência organogênica para a formação de multibrotações adventícias

em calos, as citocininas são utilizadas, dentre as quais comumente em

cultura de tecidos como ZEA (zeatina), a 2iP (isopententenil adenina), KIN

(cinetina) e a BAP (benzilaminopurina). Esta última é reportada como a

16

principal citocinina utilizada na micropropagação de Eucalyptus (BUNN,

2005).

O BAP favoreceu a geração de calos organogênicos em cultivos

que contiveram a concentração isolada da citocinina, sendo pouco efetiva

a combinação com concentrações de ANA, sendo essa combinação de

reguladores amplamente utilizada nas fases de multiplicação in vitro de

explantes de diversas espécies de eucalipto, sendo demonstrado sua

efetividade na regeneração de calos de Eucalyptus cloeziana (OLIVEIRA,

2014).

Os estudos citados anteriormente descrevem os protocolos de

calogênese e regeneração sujeitos ao material genético e à resposta

dependente das concentrações, tipos e combinações de reguladores para

cada espécie a ser testada. Contudo, muitos dos estudos são restritos nas

fases iniciais e também pouco aprofundados no sentido de

acompanhamento do processo organogênico. Este processo é de grande

importância uma vez que podem auxiliar em futuros estudos no sentido de

aprimoramento de técnicas de multiplicação.

17

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Local do experimento

O presente experimento foi conduzido no Laboratório de Cultura

de Tecidos Vegetais da Faculdade de Engenharia Florestal, Universidade

Federal de Mato Grosso, campus Cuiabá.

3.2 Material vegetal

Foram utilizados explantes oriundos de plântulas germinadas in

vitro de Eucalyptus cloeziana F. Muell cuja procedência das sementes foi

de uma Área Produtora de Sementes (APS) localizada em Anhembi,

Estado do São Paulo, determinado pelo cultivar LCFA026 do Instituto de

pesquisas e estudos florestais (IPEF).

3.3 Desinfestação das sementes e germinação in vitro

As sementes de Eucalyptus cloeziana foram pré-tratadas

mediante embebição em água destilada por 24h. Posteriormente, as

sementes foram lavadas com água corrente por cinco minutos, sendo

desinfestadas em uma solução de álcool 70% por 90 segundos e em

seguida em hipoclorito de sódio 2,5% (v/v) contendo uma gota (0,05 mL)

de Tween-20 durante 25 minutos.

Após o processo de desinfestação, as sementes foram lavadas

três vezes em água destilada autoclavada. As sementes selecionadas para

o cultivo foram aquelas que apresentaram estado de turgência e coloração

branca, as quais foram inoculadas in vitro em tubos de ensaio contendo

meio de cultura constituído por água destilada e uma concentração de ágar

de 6,0 gL-1.As sementes foram mantidas em sala de crescimento com

temperatura de 25 ± 2ºC, fotoperíodo de 16h de luz e irradiância de 32 µmol

m-2s-1.

3.4 Preparação do meio de cultura e condições experimentais

O meio de cultura utilizado, para o cultivo das sementes assim como

para a indução calogênica e organogênica dos explantes, foi composto pelos sais

básicos do meio de cultura Woody Plant Medium (WPM) (LLOYD e McCOWN,

1980), utilizando água deionizada, o valor do pH foi para 5,8 mediante uso

de NaOH (0,1 mol L-1) ou HCl (0,1 mol L-1), antes da adição do ágar e da

18

Tabela 1. Composição básica do meio de cultura WPM utilizado para a

indução organogênica de Eucalyptus cloeziana

Nutriente (mg.L-1)

NO3- 135,89

NH4+ 69,97

P 38,69

Ca 120,54

K 493,11

S 237,67

Mg 36,49

B 1,08

Cu 0,064

Fe 5,58

Mo 0,10

Mn 5,49

Zn 1,96

Fonte de Macro e Micronutrientes FQ / PM (mg.L-1)

Nitrato de amônio NH4NO3 / 80,04 400,00

Cloreto de cálcio CaCl2.2H2O / 147,02 96,00

Nitrato de cálcio Ca(NO3)2.4H2O / 236,15 556,00

Fosfato de potássio monobásico KH2PO4 / 136,09 170,00

Sulfato de potássio K2SO4 / 174,26 990,00

Sulfato de magnésio MgSO4.7H2O / 246,48 370,00

Sódio - EDTA Na2-EDTA.2H2O / 372,24 37,30

Sulfato de ferro FeSO4.7H2O / 278,02 27,80

Sulfato de manganês MnSO4.H2O / 169,01 16,90

Sulfato de zinco ZnSO4.7H2O / 287,54 8,60

Ácido bórico H3BO3 / 61,83 6,20

Sulfato de cobre CuSO4.5H2O / 249,68 0,25

Molibdato de sódio Na2MoO4.2H2O / 241,95 0,25

Fonte de Vitamina FQ / PM (mg.L-1)

Tiamina-HCl C12H18Cl2N4O5.xH2O/337,27 1,00

Piridoxina-HCl C8H12ClNO3 / 205,64 1,00

Ácido nicotínico C6H5NO2 / 123,11 1,00

Pantotenato Ca2+ C18H32CaN2O10 / 476,54 1,00

Biotina C10H16N2O3S / 244,30 1,00

Fonte de Aminoácido FQ / PM (mg.L-1)

Glicina H2NCH2COOH / 75,07 1,00

Fonte de Carbono FQ / PM (mg.L-1)

Mio-inositol C6H12O6 / 180,20 100,00

Sacarose C12H22O11 / 342,30 30.000,00

Agente polimerizador (mg.L-1)

Ágar 6.000,00

19

autoclavagem. O meio de cultura foi autoclavado na temperatura de

121ºC, que corresponde a pressão aproximada de 1 kgf cm-2, durante 15

minutos (Tabela 1).

3.5 Cultura organogênica

3.5.1 Fonte de explantes e tratamentos

Plântulas obtidas de sementes germinadas in vitro com 20 dias

de idade foram utilizadas como fonte dos explantes. Segmentos de raízes

e hipocótilo, medindo 0,5 cm de comprimento, e cotilédones seccionados

à metade contendo o pecíolo (Figura 2 A-C) foram excisados e inoculados

individualmente em tubos de ensaio de vidro contendo 6,0 ml de meio de

cultura WPM, suplementados com diferentes combinações e

concentrações de fito-reguladores.

Figura 2. Tecidos de Eucalyptus cloeziana inoculados in vitro. (A) Hipocótilo; (B) cotilédone; (C) raiz. Barra = 0,25 cm.

Após a inoculação, os explantes foram mantidos em sala de

crescimento na ausência de luminosidade (escuro) e temperatura de 25 ±

2ºC por 30 dias.

Os fatores que constituíram os tratamentos na cultura calogênica

foram os tipos de explantes e as combinações de diferentes concentrações

de fito-reguladores. Concentrações de 0,0; 1,0 e 2,0 mg L-1 foram

estabelecidos para o thidiazuron (TDZ) e para o ácido diclorofenoxiacético

(2,4-D), e 0,0; 2,0 e 4,0 mg L-1 para o ácido naftaleno acético (ANA). Cada

um dos tratamentos foi constituído por 10 repetições (10 tubos de ensaio),

contendo 1 explante em cada repetição, as quais foram dispostas em um

delineamento inteiramente causalizado em arranjo fatorial (3x27),

avaliando a interação de 3 tipos de tecidos (explantes) e 27 combinações

A B C

20

de fito-reguladores (Tabela 2).

Após 30 dias da aplicação dos tratamentos foram avaliados o

aspecto visual dos tecidos (visando verificar alguma anormalidade), além

da porcentagem de manifestação bacteriana, oxidação e tecidos que

apresentaram calogênese. Para os tecidos que apresentam calogênese

foram adotadas referências de classificação: 1 para presença e 0 para

ausência de calo. Considerou-se contaminação as colônias bacterianas

que surgiram no início do estabelecimento in vitro dos explantes,

principalmente na superfície do meio de cultura.

Tabela 2. Descrição das combinações de fito-reguladores empregados na cultura calogênica de tecidos de Eucalyptus cloeziana inoculados in vitro.

Combinações de

Fito-reguladores (mg L-1)

Nº ANA TDZ 2,4-D

1 0,0 0,0 0,0 2 0,0 0,0 1,0 3 0,0 0,0 2,0 4 0,0 1,0 0,0 5 0,0 1,0 1,0 6 0,0 1,0 2,0 7 0,0 2,0 0,0 8 0,0 2,0 1,0 9 0,0 2,0 2,0 10 2,0 0,0 0,0 11 2,0 0,0 1,0 12 2,0 0,0 2,0 13 2,0 1,0 0,0 14 2,0 1,0 1,0 15 2,0 1,0 2,0 16 2,0 2,0 0,0 17 2,0 2,0 1,0 18 2,0 2,0 2,0 19 4,0 0,0 0,0 20 4,0 0,0 1,0 21 4,0 0,0 2,0 22 4,0 1,0 0,0 23 4,0 1,0 1,0 24 4,0 1,0 2,0 25 4,0 2,0 0,0 26 4,0 2,0 1,0

27 4,0 2,0 2,0

21

Para os tratamentos que apresentaram calo foram

determinadas categorias de intensidade de calejamento dos tecidos. As

categorias foram utilizadas para estabelecer a porcentagem da superfície

do explante original que formou calo (Tabela 3).

Tabela 3. Intensidade de calejamento dos diferentes tecidos de Eucalyptus cloeziana inoculados in vitro aos 30 dias

Intensidade do calo Hipocótilo Cotilédone Raiz

1

(x ≤ 25%)

2

(25% < x < 50%)

3 (x = 50%)

4

(50% < x < 75%)

5

(x ≥ 100%)

22

3.5.2 Regeneração in vitro

Explantes iniciais da cultura calogênica, que apresentaram ou

não calos, foram transferidos para o meio de regeneração organogênica,

constituído pelo meio básico WPM suplementado com 1,0 mg L-1 de BAP

(6-benzilamino purina).

Subcultivos foram realizados a cada 30 dias, com a intenção de

renovar a concentração nutritiva do meio de cultura, tanto dos sais WPM

quanto do fito-regulador. Foram avaliados os tratamentos; constituídos

pelas culturas calogênicas (tecidos originais mais as combinações de fito-

reguladores); que apresentaram regeneração organogênica (broto e/ou

raiz). Também foi contabilizada a quantidade de brotações adventícias

induzidas de cada tecido regenerado após o 3o subcultivo (90 dias).

3.5.3 Multiplicação e alongamento in vitro

Os calos regenerados foram divididos em explantes padrões

(tufos ou aglomerado de brotações) contendo, aproximadamente, 3

brotações de comprimento superior a 1 cm, mantendo a identificação do

tratamento que deu origem ao calo inicial. Os explantes foram sub-

cultivados a cada 30 dias e sub-divididos conforme a necessidade, com o

intuito de oferecer melhores condições para seu desenvolvimento in vitro

e manter o vigor vegetativo.

O meio de cultivo para a etapa de multiplicação in vitro foi

constituído pelo meio básico (WPM) suplementado com BAP e ácido indol-

butírico (AIB) (Tabela 4).

Tabela 4. Combinação dos fito-reguladores BAP e AIB na etapa de multiplicação e alongamento in vitro de explantes de Eucalyptus cloeziana.

Meios de multiplicação

e alongamento BAP AIB

1 1,0 mg L-1 0,5 mg L-1

2 0,5 mg L-1 1,0 mg L-1

Nesta etapa objetivou-se manter os tufos sob condições

hormonais diferentes visando à produção de material vegetativo e a futura

23

coleta de brotações alongadas para a instalação de

ensaios de enraizamento ex vitro.

3.5.4 Enraizamento ex vitro e aclimatização

Brotações alongadas, possuindo comprimento superior ou igual

a 1 cm foram coletadas e inoculadas ex vitro no sistema de mini-estufa, a

qual foi constituída de uma estrutura plástica de cor transparente, a fim de

favorecer a luminosidade e evitar variação da umidade relativa do ar. O

substrato utilizado para promover o enraizamento das micro-estacas foi

constituído por substrato orgânico comercial adicionado com argila sintética

vermiculita, na proporção igual a 1:1 (v/v).

As condições ambientais dos primeiros 20 dias de incubação ex

vitro foram iguais as condições à sala de crescimento das culturas in vitro

(temperatura média de 25±2 ºC e o fotoperíodo de 16h).

Variáveis como a porcentagem de sobrevivência, enraizamento

adventício das microestacas foram avaliadas aos 20 dias de incubação ex

vitro.

Posteriormente, as mudas foram retiradas da miniestufa e

subcultivadas em recipientes individuais de volume maior (250 ml)

contendo a mesma proporção do substrato utilizado e fornecidos de uma

solução nutritiva composta por o 50% das concentrações dos sais macro e

micronutrientes correspondentes ao meio MS (Murashige e Skoog) a fim de

fornecer uma fonte nutritiva e promover o continuo desenvolvimento das

mudas.

Para completar a fase de aclimatização, as mudas

micropropagadas foram transplantadas para uma casa de sombrite (50%)

e transferidas para copos plásticos de maior dimensão (500 ml).

3.6 Análise histológica

Amostras do corte transversal e longitudinal da região da gema

axilar foram fixadas em solução de formaldeído e glutaraldeído (Karnovsky,

1965) modificado (glutaraldeído 1%; paraformaldeído 4% em tampão

fostato de sódio (NaH2PO4.H2O à 0,1 M; pH 7,2) e submetidas a seis séries

de vácuo (-600 mmHg) por 30 minutos cada. Posteriormente, as amostras

foram armazenadas durante 30 dias a 4°C. Em seguida, as amostras foram

24

desidratadas por meio de série alcoólica-etílica em concentrações

crescentes (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 e 100%, v/v), permanecendo

em cada solução por 15 minutos. Em seguida as amostras foram imersas

em meio de infiltração (Historesina, Leica) durante 24 horas e após, foram

alocadas na porção inferior do recipiente de moldura. Em seguida as

amostras foram emblocadas em Historesina (hidroxietil metacrilato, Leica)

com endurecedor conforme recomendação do fabricante onde

permaneceram durante 28 dias à temperatura de 24°C. Os blocos contendo

as amostras foram seccionados longitudinalmente ou transversalmente à

5 μm de espessura com o uso de micrótomo rotativo automático Microm

HM 355S (Thermo Scientific). Os cortes obtidos foram corados com azul

de toluidina (0,05%, v/v) em tampão fostato de sódio e ácido cítrico (Sakai,

1973) durante 30 minutos e montados em lâminas histológicas com resina

sintética (Entellan). As lâminas histológicas foram analisadas e

fotomicrografadas em microscópio de luz (Opton) sendo as imagens

capturadas em escala micrométrica.

3.7 Análise estatística dos dados

Os dados mensurados de todos os experimentos foram

submetidos ao teste de Hartley (p<0,05) e Shapiro-Wilk (p<0,05), a fim de

verificar a homogeneidade das variâncias e a distribuição normal dos

dados, respectivamente. Os dados foram transformados conforme a

necessidade pelo teste de Box-Cox. Em seguida, foi realizada a análise

de variância (ANOVA, p<0,01 e p<0,05). De acordo com a significância da

ANOVA, os dados dos fatores qualitativos foram comparados pelo teste

de Duncan (p<0,01 e p<0,05). Para a análise estatística dos dados foi

utilizado os programas computacionais R (R Development Core Team,

2012) e SOC (Embrapa, 1990).

25

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Cultura calogênica e regeneração in vitro

De acordo com a análise de variância foram detectadas

diferenças significativas (p<0,01) em relação a interação dos fatores

testados, tanto nas variáveis da fase de indução à calogênese

(Manifestação de bactérias (BAC), oxidação (OXI) e presença de calos

(CAL)), como também na regeneração das brotações (REG) (Tabela 5).

Tabela 5. Resumo da análise de variância para a porcentagem de manifestação bacteriana (BAC), oxidação (OXI), calo (CAL) e regeneração dos brotos (REG) in vitro de Eucalyptus cloeziana em relação aos tratamentos testados aos 30 dias.

Fonte de variação GL Quadrados médios

BAC(%)(1) OXI(%)(1)

CAL(%)(1) REG(%)(1)

COMB 26 1,13** 0,71** 5,62** 0,035** TEC 2 0,62** 1,56** 17,18** 0,033**

COMB × TEC 52 0,012** 0,19** 1,42** 0,018** Resíduo 697 0,026 0,025 0,198 0,004 Média - 23,5 19,9 78,4 1,5

CVexp(%) - 19,2 18,2 18,8 6,4

** Valor significativo ao nível de 1% de probabilidade de erro, respectivamente pelo teste F. (1) Dados transformados por 1/exp[(n+0,5)/100] , onde n = dado amostrado. GL = graus de liberdade, CVexp. = coeficiente de variação experimental. COMB = combinação de fito- regulador, TEC = tipo de tecido.

Sementes de Eucalyptus cloeziana foram inoculadas in vitro

para a obtenção de plântulas como fonte de explantes, dentre as quais

foram selecionados aqueles cultivos que não apresentaram manifestação

de patógenos (bactérias ou fungos), geralmente encontrados em explantes

introduzidos in vitro.

4.1.1 Manifestação de bactérias

Apesar da metodologia de desinfestação das sementes tenha

controlado o desenvolvimento de micro-organismos na maioria dos cultivos

seminais, tecidos utilizados na indução à calogênese apresentaram

manifestação de bactérias (Figura 3 A, B e C), atingindo uma média geral

de 23,5%, incluindo o tratamento da testemunha. Com base nesse

resultado, pode-se supor que nos tecidos desta espécie encontram-se

bactérias endógenas que podem comprometer o sucesso do cultivo in vitro.

26

A presença de manifestação bacteriana foi avaliada dentre os

tipos de tecidos testados, apresentando porcentagens entre 0 a 100% para

os explantes de hipocótilos e raiz, e para o cotilédone porcentagens de 0

a 70%.

Ressalta-se que os tratamentos referentes as combinações de

fito-reguladores que apresentaram a maior concentração de ANA (4,0 mg

L-1), destacando os tratamentos das combinações 25 (4,0 mgL-1 ANA + 2,0

mgL-1 TDZ) e 26 (4,0 mgL-1 ANA + 2,0 mgL-1 TDZ + 1,0 mgL-1 2,4-D) nas

quais se registraram maiores porcentagens de manifestação bacteriana

nos três tecidos; 100%, 60-70% e 100% para hipocótilo, cotilédone e raiz,

respectivamente. Além disso, os tratamentos das combinações 2, 6, 13, 20,

22, 23 e 27 apresentaram elevada manifestação de bactérias nos diferentes

tecidos (Tabela 6).

A contaminação dos tecidos por bactérias endógenas é um

problema relativamente comum nos procedimentos de micropropagação,

devido à dificuldade de eliminação durante o processo de desinfestação,

representando problemas para o estabelecimento das culturas (PIERIK,

1997).

Todavia, se o procedimento de desinfestação dos explantes for

efetivo, a manifestação endofítica in vitro pode ocorrer em condições de

qualquer tipo e/ou intensidade de estresse abiótico, que eventualmente

possa ocorrer durante as diferentes fases de micropropagação (ALMEIDA

et al., 2005). Dessa forma, as concentrações de fito-reguladores podem ter

causado estresse fisiológico nos explantes, especificamente nos

tratamentos que apresentaram a concentração mais elevada (4,0 mg L-1)

do ANA, acarretando a manifestação de bactérias, efeito também

registrado em cultura in vitro de Eucalyptus citriodora (ALMEIDA, 2012).

Em brotações epicórmicas de Eucalyptus cloeziana coletadas

para introdução in vitro, Oliveira (2014) observou porcentagens de

manifestação bacteriana similares ao presente trabalho, entre 26,4 a 35,8%

sujeitas à época de coleta, com reduzida manifestação durante o período

de baixa precipitação pluviométrica.

27

Figura 3. Manifestação de colônias bacterianas e oxidação in vitro em explantes de Eucalyptus cloeziana, aos 30 dias após a inoculação. (A) Tecido do hipocótilo apresentando manifestação de bactérias (setas) e (D) oxidação. (B) Bactérias presentes (setas) no tecido cotiledonar e (E) oxidação do tecido. (C) Segmentos de raiz apresentando manifestação de bactérias (setas) e (F) oxidação do tecido. Barra = 0,5 cm

Além disso, o mesmo autor registrou diferenças nas taxas de

multiplicação dentre vários materiais genéticos, considerando que a

presença de bactérias endofíticas podem ter influenciado o

desenvolvimento de explantes, principalmente ao considerar a

competição pelos nutrientes do meio de cultura.

Porém, alguns autores (ESPOSITO-POLESI, 2011; ALMEIDA

et al., 2005) não consideram a presença de microrganismos endofíticos

como uma barreira nos procedimentos da cultura in vitro, sendo descrita a

relação planta/microrganismos como benéfica na micropropagação de

clones de Eucalyptus benthamii, relatado por Piotto (2013), o qual

evidenciou essa interação no crescimento dos índices de massa seca das

brotações e na promoção do alongamento das mesmas, favorecendo a

posterior aclimatização dos materiais genéticos.

E F

B A

28

Tabela 6. Porcentagem de explantes de Eucalyptus cloeziana que apresentaram manifestação bacteriana in vitro em relação aos diferentes tecidos e combinações de fito-reguladores na indução à calogênese, aos 30 dias após a instalação do experimento.

Combinações de fito- reguladores (mg L-1)

Tecido de origem

Nº ANA TDZ 2,4-D Hipocótilo Cotilédone Raiz

1 0,0 0,0 0,0 33,3±16,7Db 55,6±17,6ABa

37,5±18,3DEb

2 0,0 0,0 1,0 50,0±16,7Ca 0,0±0,0Eb

50,0±18,9CDa

3 0,0 0,0 2,0 0,0±0,0Ea 0,0±0,0Ea

0,0±0,0Fa

4 0,0 1,0 0,0 0,0±0,0Ea 0,0±0,0Ea

0,0±0,0Fa

5 0,0 1,0 1,0 0,0±0,0Ea 0,0±0,0Ea

0,0±0,0Fa

6 0,0 1,0 2,0 40,0±16,3CDa 44,4±17,6BCa

33,3±16,7Eb

7 0,0 2,0 0,0 0,0±0,0Ea 0,0±0,0Ea

0,0±0,0Fa

8 0,0 2,0 1,0 0,0±0,0Ea 0,0±0,0Ea

0,0±0,0Fa

9 0,0 2,0 2,0 0,0±0,0Ea 0,0±0,0Ea

0,0±0,0Fa

10 2,0 0,0 0,0 0,0±0,0Ea 0,0±0,0Ea

0,0±0,0Fa

11 2,0 0,0 1,0 0,0±0,0Ea 0,0±0,0Ea

0,0±0,0Fa

12 2,0 0,0 2,0 0,0±0,0Ea 0,0±0,0Ea

0,0±0,0Fa

13 2,0 1,0 0,0 100,0±0,0Aa 20,0±13,3Db

100,0±0,0Aa

14 2,0 1,0 1,0 0,0±0,0Ea 0,0±0,0Ea

0,0±0,0Fa

15 2,0 1,0 2,0 0,0±0,0Eb 0,0±0,0Eb

10,0±10Fa

16 2,0 2,0 0,0 0,0±0,0Ea 0,0±0,0Ea

0,0±0,0Fa

17 2,0 2,0 1,0 0,0±0,0Ea 0,0±0,0Ea

0,0±0,0Fa

18 2,0 2,0 2,0 0,0±0,0Ea 0,0±0,0Ea

0,0±0,0Fa

19 4,0 0,0 0,0 0,0±0,0Ea 0,0±0,0Ea

0,0±0,0Fa

20 4,0 0,0 1,0 50,0±16,7Cb 0,0±0,0Ec

100,0±0,0Aa

21 4,0 0,0 2,0 0,0±0,0Eb 0,0±0,0Eb

80,0±13,3Ba

22 4,0 1,0 0,0 90,0±10Aa 40,0±16,3Cc

60,0±16,3Cb

23 4,0 1,0 1,0 40,0±16,3CDc 60,0±16,3Aa

50,0±16,7CDb

24 4,0 1,0 2,0 0,0±0,0Ea 0,0±0,0Ea

0,0±0,0Fa

25 4,0 2,0 0,0 100,0±0,0Aa 70,0±15,3Ab

100,0±0,0Aa

26 4,0 2,0 1,0 100,0±0,0Aa 60,0±16,3Ab

100,0±0,0Aa

27 4,0 2,0 2,0 70,0±15,3Bb 60,0±16,3Ac

90,0±10ABa

Nas colunas, médias seguidas por mesma letra maiúscula e, nas linhas, médias seguidas por mesma letra minúscula não diferem significativamente pelo teste de Duncan ao nível de 5% de probabilidade de erro. Dados apresentados como: média ± erro padrão.

4.1.2 Oxidação dos tecidos

Os tecidos cultivados in vitro também apresentaram

porcentagem de oxidação, com valor de 19,9% entre todos os tratamentos,

porém o valor pode ser considerado reduzido, pelo fato que este representa

29

uma limitação na cultura de tecidos vegetais podendo dificultar o

estabelecimento do experimento (GRATTAPAGLIA e MACHADO, 1998)

considerando que os explantes foram cultivados em condições de escuro

como estratégia para a prevenção da oxidação dos tecidos.

A oxidação foi registrada mediante avaliação visual dos tecidos

que apresentaram necrose (Figura 3 D, E e F), dentre os quais o tecido

cotiledonar se destacou apresentou menor quantidade de tratamentos com

explantes oxidados, favorecido pelo maior grau de diferenciação celular em

comparação aos outros utilizados (hipocótilo e raiz).

Os valores da porcentagem de oxidação (Tabela 7) foram

semelhantes à manifestação bacteriana entre os diferentes tipos de

tecidos; 0-100%, 0-60% e 0-100%, respectivamente para hipocótilo,

cotilédone e raiz. A raiz foi o tecido mais susceptível, registrando os maiores

valores de manifestação bacteriana e oxidação (90 - 100%) nas

combinações 13 (2,0 mg L-1 ANA + 1,0 mg L-1 TDZ), 20 (4,0 mg L-1 ANA +

1,0 mg L-1 2,4-D), 25 (4,0 mg L-1 ANA + 2,0 mg L-1 TDZ), 26 (4,0 mg L-1

ANA + 2,0 mg L-1 TDZ + 1,0 mg L-1 2,4-D) e 27 (4,0 mg L-1 ANA + 2,0 mg

L-1 TDZ + 2,0 mg L-1 2,4-D).

Cabe ressaltar que, semelhante ao tecido radicular, o hipocótilo

também demonstrou elevados valores de manifestação bacteriana nas

mesmas combinações (13, 20, 25, 26 e 27), mas diferiu em relação a

porcentagem de oxidação, apresentando valores porcentuais menores (20

– 100%). Esse resultado pode estar relacionado ao fato que estes

explantes responderam mais rapidamente ao estímulo produzido pelos

reguladores de crescimento, situação similar que também foi relatada na

etapa de calogênese em tecidos de Eucalyptus benthamii x E. dunnii

(CAUDURO, 2011).

Reguladores de crescimento também podem intensificar o

estres oxidativo desencadeando o desequilíbrio hormonal devido à

natureza, combinação e/ou concentração dos reguladores adicionados ao

meio de cultura, ou estar relacionados à síntese de outros compostos que

promovem a oxidação celular como o caso do TDZ, o qual está relacionado

com a liberação de etileno que induz a senescência e necrose dos

explantes cultivados in vitro (CARVALHO et al., 2011).

30

Tabela 7. Porcentagem de explantes de Eucalyptus cloeziana que apresentaram oxidação in vitro em relação aos diferentes tecidos e combinações de fito-reguladores na indução à calogênese, aos 30 dias após a instalação do experimento.

Combinações de fito- reguladores (mg L-1)

Tecidos de origem


1 0,0 0,0 0,0 100,0±0,0Aa 33,3±16,7BCb

25,0±16,4Ec

2 0,0 0,0 1,0 50,0±16,7CDa 11,1±11,1Dc

37,5±18,3DEb

3 0,0 0,0 2,0 0,0±0,0Fa 0,0±0,0Da

0,0±0,0Fa

4 0,0 1,0 0,0 0,0±0,0Fa 0,0±0,0Da

0,0±0,0Fa

5 0,0 1,0 1,0 0,0±0,0Fa 0,0±0,0Da

0,0±0,0Fa

6 0,0 1,0 2,0 40,0±16,3Db 44,4±17,6Ba

33,3±16,7Ec

7 0,0 2,0 0,0 0,0±0,0Fa 0,0±0,0Da

0,0±0,0Fa

8 0,0 2,0 1,0 0,0±0,0Fa 0,0±0,0Da

0,0±0,0Fa

9 0,0 2,0 2,0 0,0±0,0Fa 0,0±0,0Da

0,0±0,0Fa

10 2,0 0,0 0,0 0,0±0,0Fa 0,0±0,0Da

0,0±0,0Fa

11 2,0 0,0 1,0 0,0±0,0Fa 0,0±0,0Da

0,0±0,0Fa

12 2,0 0,0 2,0 0,0±0,0Fa 0,0±0,0Da

0,0±0,0Fa

13 2,0 1,0 0,0 20,0±13,3Eb 0,0±0,0Dc

100±0,0Aa

14 2,0 1,0 1,0 0,0±0,0Fa 0,0±0,0Da

0,0±0,0Fa

15 2,0 1,0 2,0 10,0±10,0EFb 0,0±0,0Dc

80,0±13,3Ba

16 2,0 2,0 0,0 0,0±0,0Fa 0,0±0,0Da

0,0±0,0Fa

17 2,0 2,0 1,0 0,0±0,0Fa 0,0±0,0Da

0,0±0,0Fa

18 2,0 2,0 2,0 0,0±0,0Fa 0,0±0,0Da

0,0±0,0Fa

19 4,0 0,0 0,0 0,0±0,0Fa 0,0±0,0Da

0,0±0,0Fa

20 4,0 0,0 1,0 50,0±16,7CDb 0,0±0,0Dc

100,0±0,0Aa

21 4,0 0,0 2,0 10,0±10,0EFc 40,0±16,3BCb

80,0±13,3Ba

22 4,0 1,0 0,0 10,0±10,0EFb 0,0±0,0Dc

60,0±16,3Ca

23 4,0 1,0 1,0 10,0±10,0EFb 0,0±0,0Dc

50,0±16,7CDa

24 4,0 1,0 2,0 10,0±10,0EFa 0,0±0,0Db

0,0±0,0Fb

25 4,0 2,0 0,0 60,0±16,3BCb 0,0±0,0Dc

100,0±0,0Aa

26 4,0 2,0 1,0 100,0±0,0Aa 30,0±15,3Cb

100,0±0,0Aa

27 4,0 2,0 2,0 70,0±15,3Bb 60,0±16,3Ac

90,0±10,0ABa


4.1.3 Indução da calogênese e intensidade calogênica

A indução a calogênese foi considerada elevada em todos os

tratamentos, atingindo média geral de 78,4%, demonstrando adequação

dos fito-reguladores testados e a competência dos tecidos em relação a

indução de estruturas celulares desdiferenciadas (Figura 4 A e B), os quais

31

registraram porcentagens iguais dentre 0-100% para o hipocótilo e tecido

radicular, e 40-100% para o cotilédone (Tabela 8).

A calogênese também foi categorizada por meio da intensidade

de calo induzido na área do tecido em 30 dias de cultivo in vitro (Tabela 9).

As categorias de calejamento 4 (50%≥75% de calejamento) e 5 (100% de

calejamento) foram adotadas para determinar os maiores índices de

calogênese registrados nos tratamentos de indução (tecidos e

combinações de fito-reguladores).

Tratamentos que apresentaram quantidades percentuais iguais

ou superiores a 50% de tecidos apresentando calo nas categorias

superiores de calejamento (4 e 5), foram aquelas combinações que

apresentaram apenas um regulador. As diferentes combinações

estabelecidas entre os fito-reguladores ANA, TDZ e 2,4-D não favoreceram

a indução de elevadas intensidades calogênicas, com uma única exceção

dos tratamentos constituído pelo tecido cotiledonar nas combinações 12

(2,0 mg L-1 de ANA + 2,0 mgL-1 de 2,4-D) e 27 (4,0 mg L-1 de ANA + 2,0

mgL-1 de TDZ + 2,0 mgL-1 de 2,4-D)

Os tratamentos que registraram maior quantidade explantes de

elevada intensidade de calejamento foram destacados os tratamentos das

combinações 7 (2,0 mg L-1 do TDZ), o qual apresentou 88,9% e 77,8% para

hipocótilo e raiz respectivamente, e da combinação 2 (2,0 mgL-1 de 2,4-D)

que apresentou 62.5% no tecido cotiledonar. Assim como também

ressaltaram as combinações 3 (2,0 mg L-1 de 2,4-D) e 19 (4,0 mg L-1 de

ANA) nos tecidos cotiledonar e hipocótilo respectivamente. (Tabela 9).

Em termos gerais, os tecidos do hipocótilo (25,5%) e cotiledonar

(25,0%) apresentaram destaque em relação às intensidades superiores de

calejamento. O tecido radicular apresentou a menor quantidade de calos

nas categorias 4 e 5 (11,6%), evidenciando a reduzida aptidão à

desdiferenciação celular.

32

Tabela 8. Porcentagem de explantes de Eucalyptus cloeziana que apresentaram calo in vitro em relação aos diferentes tecidos e combinações de fito-reguladores na indução à calogênese, aos 30 dias após a instalação do experimento.

Combinações de Fito-reguladores (mg L-1)

Tecidos de origem


1 0,0 0,0 0,0 - 66,7±16,7Ba 25,0±16,4DEb

2 0,0 0,0 1,0 40,0±16,3CDb 88,9±11,1Aa

37,5±18,3CDb

3 0,0 0,0 2,0 100,0±0,0Aa 100,0±0,0Aa

100,0±0,0Aa

4 0,0 1,0 0,0 50,0±16,7Cc 85,7±14,3Aa

70,0±15,3Bb

5 0,0 1,0 1,0 100,0±0,0Aa 100,0±0,0Aa

100,0±0,0Aa

6 0,0 1,0 2,0 50,0±16,7Cc 55,6±17,6Bb

66,7±16,7Ba

7 0,0 2,0 0,0 100,0±0,0Aa 100,0±0,0Aa

100,0±0,0Aa

8 0,0 2,0 1,0 100,0±0,0Aa 100,0±0,0Aa

100,0±0,0Aa

9 0,0 2,0 2,0 100,0±0,0Aa 100,0±0,0Aa

100,0±0,0Aa

10 2,0 0,0 0,0 100,0±0,0Aa 100,0±0,0Aa

100,0±0,0Aa

11 2,0 0,0 1,0 100,0±0,0Aa 100,0±0,0Aa

100,0±0,0Aa

12 2,0 0,0 2,0 100,0±0,0Aa 100,0±0,0Aa

100,0±0,0Aa

13 2,0 1,0 0,0 80,0±13,3Bb 100,0±0,0Aa

-

14 2,0 1,0 1,0 100,0±0,0Aa 100,0±0,0Aa

100,0±0,0Aa

15 2,0 1,0 2,0 90,0±10ABb 100,0±0,0Aa

20,0±13,3Ec

16 2,0 2,0 0,0 100,0±0,0Aa 100,0±0,0Aa

100,0±0,0Aa

17 2,0 2,0 1,0 100,0±0,0Aa 100,0±0,0Aa

100,0±0,0Aa

18 2,0 2,0 2,0 100,0±0,0Aa 100,0±0,0Aa

100,0±0,0Aa

19 4,0 0,0 0,0 100,0±0,0Aa 100,0±0,0Aa

100,0±0,0Aa

20 4,0 0,0 1,0 50,0±16,7Cb 100,0±0,0Aa

-

21 4,0 0,0 2,0 90,0±10,0ABa 90,0±10,0Aa

20,0±13,3Eb

22 4,0 1,0 0,0 90,0±10,0ABb 100,0±0,0Aa

40,0±16,3Cc

23 4,0 1,0 1,0 90,0±10,0ABb 100,0±0,0Aa

50,0±16,7Cc

24 4,0 1,0 2,0 90,0±10,0ABb 100,0±0,0Aa

100,0±0,0Aa

25 4,0 2,0 0,0 40,0±16,3CDb 100,0±0,0Aa

-

26 4,0 2,0 1,0 - 90,0±10,0Aa -

27 4,0 2,0 2,0 30,0±15,3Db 40,0±16,3Ca

- Nas colunas, médias seguidas por mesma letra maiúscula e, nas linhas, médias seguidas por mesma letra minúscula não diferem significativamente pelo teste de Duncan ao nível de 5% de probabilidade de erro. Dados apresentados como: média ± erro padrão.

33

Tabela 9. Resumo da intensidade calogênica in vitro nos diferentes tratamentos.

Nº ANA TDZ 2,4-D 1(1) 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 0,0 0,0 0,0 - - - - - 100,0 - - - - 100,0 - - - -

2 0,0 0,0 1,0 - - 25,0 25,0 50,0 - 12,5 12,5 12,5 62,5 - 33,3 - - 66,7

3 0,0 0,0 2,0 - 11,1 11,1 22,2 55,6 - 11,1 11,1 22,2 55,6 100,0 - - - -

4 0,0 1,0 0,0 40,0 - 20,0 40,0 - - 16,7 33,3 33,3 16,7 42,8 28,6 14,3 - 14,3

5 0,0 1,0 1,0 - 66,7 11,1 22,2 - 11,1 44,4 33,4 11,1 - 55,6 33,3 11,1 - -

6 0,0 1,0 2,0 60,0 40,0 - - - 40,0 40,0 - 20,0 - 100,0 - - - -

7 0,0 2,0 0,0 - - - 11,1 88,9 - 22,2 11,1 66,7 - 11,1 - - 11,1 77,8

8 0,0 2,0 1,0 - 50,0 20,0 - 30,0 60,0 30,0 - 10 - 40,0 20,0 - 10,0 30,0

9 0,0 2,0 2,0 77,8 22,2 - - - 100,0 - - - - 100,0 - - - -

10 2,0 0,0 0,0 - 33,3 33,3 11,1 22,3 - 33,3 44,4 22,3 - 12,5 50,0 - - 37,5

11 2,0 0,0 1,0 70,0 - - 10,0 20,0 10,0 40,0 40,0 10,0 - 80,0 20,0 - - -

12 2,0 0,0 2,0 100,0 - - - - 30,0 20,0 - - 50 100,0 - - - -

13 2,0 1,0 0,0 75,0 12,5 - - 12,5 70,0 20,0 10,0 - - - - - - -

14 2,0 1,0 1,0 40,0 50,0 - 10,0 - 50,0 50,0 - - - 100,0 - - - -

15 2,0 1,0 2,0 11,1 55,6 33,3 - - 70,0 20,0 10,0 - - 50,0 50,0 - - -

16 2,0 2,0 0,0 40,0 20,0 10,0 10,0 20,0 20,0 40,0 10,0 30,0 - 62,5 25,0 12,5 - -

17 2,0 2,0 1,0 10,0 80,0 10,0 - - 70,0 30,0 - - - 70,0 30,0 - - -

18 2,0 2,0 2,0 90,0 10,0 - - - 70,0 - 10,0 - 20,0 100 - - - -

19 4,0 0,0 0,0 - - 20,0 50,0 30,0 - 10,0 30,0 20,0 40,0 33,4 44,4 11,1 - 11,1

20 4,0 0,0 1,0 - 40,0 20,0 20,0 20,0 - 10,0 20,0 30,0 40,0 - - - - -

21 4,0 0,0 2,0 - - 44,4 33,4 22,2 11,1 - 22,2 22,2 44,5 - 100,0 - - -

22 4,0 1,0 0,0 77,8 11,1 11,1 - - 50,0 10,0 10,0 20,0 10,0 100,0 - - - -

23 4,0 1,0 1,0 100,0 - - - - 90,0 10,0 - - - 100,0 - - - -

24 4,0 1,0 2,0 66,7 33,3 - - - 90,0 10,0 - - - 90,0 10,0 - - -

25 4,0 2,0 0,0 100,0 - - - - 80,0 10,0 10,0 - - - - - - -

26 4,0 2,0 1,0 - - - - - 77,8 22,2 - - - - - - - -

27 4,0 2,0 2,0 100,0 - - - - 50,0 - - - 50,0 - - - - -

Média 40,69 22,55 10,78 9,80 15,69 43,33 20,00 11,67 11,25 13,75 70,73 15,24 3,05 2,44 9,15 (1) Parâmetros estabelecidos para a avaliação da intensidade calogênica descritas na Tabela 3.

34

Com o intuito de avaliar o desempenho morfogênico a nível

celular, foram coletados explantes calogênicos de diferentes tratamentos

e foram identificadas características anatômicas relacionadas com a

competência organogênica e/ou embriogênica dos tecidos induzidos pelas

combinações de fito-reguladores utilizados (Tabela 10).

Tabela 10. Resumo das características anatômicas identificadas em calos de Eucalyptus cloeziana relacionados aos tratamentos na fase de indução calogênica.

Combinações de Fito-reguladores (mg L-1)

Tecidos de origem


1 0,0 0,0 0,0 - - - 2 0,0 0,0 1,0 Ra CPE CPE, RM, ESg 3 0,0 0,0 2,0 C CPE, ESg - 4 0,0 1,0 0,0 CPE RM CPE, ESg 5 0,0 1,0 1,0 C - CPE 6 0,0 1,0 2,0 CPE, m - ESg 7 0,0 2,0 0,0 - CPE, RM m 8 0,0 2,0 1,0 m - C 9 0,0 2,0 2,0 - - -

10 2,0 0,0 0,0 RM, CPE CPE, m, RM CPE 11 2,0 0,0 1,0 RM ESg, CPE C 12 2,0 0,0 2,0 ESg, RM - - 13 2,0 1,0 0,0 - - - 14 2,0 1,0 1,0 - C - 15 2,0 1,0 2,0 - RM - 16 2,0 2,0 0,0 - - - 17 2,0 2,0 1,0 - C C 18 2,0 2,0 2,0 - RM, CPE - 19 4,0 0,0 0,0 - ESg, RM - 20 4,0 0,0 1,0 - CPE, ESg - 21 4,0 0,0 2,0 ESg, CPE, RM ESg, Ra ESg 22 4,0 1,0 0,0 - - RM 23 4,0 1,0 1,0 - - - 24 4,0 1,0 2,0 - - - 25 4,0 2,0 0,0 - m - 26 4,0 2,0 1,0 - - - 27 4,0 2,0 2,0 - m - Ra: raiz adventícia; CPE: Células pro-embrionarias; RM: Região meristemática; ESg: Embrião somático no estado globular; C: calo; m: Meristemoide.

Dentre as características mais relevantes foram identificadas

áreas celulares de competência meristemática, destacados pelo tamanho

reduzido das células, isodiamétricas e de relação núcleo/plasmática densa

35

(Figura 4 E) as quais promovem a formação de meristemoides (Figura 4 D)

e, em consequência, a geração de novos órgãos de origem adventício

(THORPE e KUMAR, 1993), dos quais os tratamentos das combinações

2 (1,0 mg L-1 2,4-D) e 21 (4,0 mg L-1 ANA + 2,0 mg L-1 2,4-D) forneceram

o balanço hormonal efetivo para a proliferação inicial de raízes adventícias

a partir do calo nos tecidos do hipocótilo e do cotilédone respetivamente.

(Figura 4 C).

Outras características morfogênicas encontradas nas amostras

se diferenciaram em estruturas ou células pró embriogênicas (Figura 5 B

e D) e embriões somáticos, as quais se destacaram os tratamentos que

apresentaram concentrações, tanto isoladas como combinadas, de ANA e

2,4-D na formação de embriões em estágios iniciais (globular) (Figura 5 A,

B, C e E) essencialmente os tratamentos da combinação 21 constituído de

concentrações de 4,0 mg L-1 ANA e 2,0 mg L-1 de 2,4-D em todos os tecidos

testados.

A efetividade desses reguladores também foi relatada por

Muralidharan e Mascarenhas (1987; 1995) na embriogênese somática de

E. citriodora a partir de embriões zigoticos utilizando 3,5 mg L-1 de ANA.

Em E. dunnii, Termignoni et al. (1996) constataram a formação de setores

embriogênicos em explantes cultivados em meio de cultura contendo ANA

ou a combinação de ANA e 2,4-D, nas proporções de 1:1 e 3:1. Pinto et al.

(2002) também observaram a embriogênese somática em E. globulus em

calos derivados de embriões zigóticos maduros inteiros na presença de 3-

15 mg L-1 de ANA isoladamente ou na combinação de 1 mg L-1 de ANA com

1 mg L-1 de 2,4-D.

No entanto, a maioria dos trabalhos relata a inexistência de um

protocolo eficiente de regeneração de Eucalyptus por embriogênese

somática, uma vez que ainda existem problemas básicos a serem

solucionados como metodologias para maturação dos embriões, o número

reduzido de embriões obtidos e a baixa taxa de conversão dos embriões

em plantas.

36

Figura 4. Histologia de calos de Eucalyptus cloeziana. (A) Formação de calo (setas) na epiderme do explante. (B) Detalhe da estrutura celular desdiferenciada (calo) e acúmulo de amido. (C) Raízes adventícias (Ra) geradas a partir do calo (c). (E) Calos apresentando área com características meristemáticas e (D) formação de meristemoides (m). Barra= 100 µm

A

C

EI

B

Ra

Ra

D

E

37

Figura 5. Calos embriogênicos de Eucalyptus cloeziana. (A, C e E) Embriões somáticos (ES) na fase globular. Barra = 100 µm (B) Imagem aproximada do embrião somático presente em A. Barra = 25 µm. (D) Calo apresentando células pró-embrionárias (CPE). Barra = 25 µm. S: suspensor. Pt: Protoderme

A

ES ES

ES ES

ES ES

ES

ES ES

ES

ES ES

B

Pt

CPE

S

ES

ES E

38

4.1.4 Regeneração adventícia

Todos os tecidos de Eucalyptus cloeziana que formaram calo

foram transferidos para meio de cultura, o qual foi suplementado com 1,0

mg L-1 de BAP para todos os tratamentos, visando a regeneração de gemas

e brotos. Considerando a avaliação histológica dos explantes calosos de

alguns tratamentos na formação de estruturas embriogênicas, o meio de

regeneração não apresentou eficiência na promoção da diferenciação dos

embriões nas fases de maturação (coração, torpedo e cotiledonar).

A diferenciação dos tecidos e a formação de órgãos (brotações

adventícias) foram consideradas como reduzidas. Em termos gerais,

observou-se que cerca de 1,5% dos calos demonstraram competência

organogênica (Figura 8 A e B), dos quais sobressaíram os tratamentos

constituídos pelas combinações 4 (1,0 mg L-1 de TDZ), 7 (2,0 mg L-1 de

TDZ) e 16 (2,0 mg L-1 de ANA + 2,0 mg L-1 de TDZ). Os tecidos com

potencial morfogênico ressaltaram o hipocótilo e o cotilédone.

Calos regenerados a partir de tecidos do hipocótilo não

apresentaram diferença significativa nas combinações 7 (2,0 mg L-1 de

TDZ) e 16 (2,0 mg L-1 de ANA + 2,0 mg L-1 de TDZ), os quais resultaram

valores médios de regeneração de brotos de 22,2% e 20,0%,

respectivamente. Por outro lado, dentre os calos obtidos de origem

cotiledonar, houve diferença significativa entre os tratamentos que foram

constituídos pelas combinações 4 e 7, constituídas pelas concentrações de

1,0 mg L-1 e 2,0 mg L-1 de TDZ, respectivamente, sendo este último mais

responsivo ao meio de regeneração, atingindo uma porcentagem igual a

55,6% de calos que regeneraram brotos (Tabela 11).

Diante dos cortes histológicos foi confirmada a regeneração de

brotações adventícias, as quais foram originadas de calos que

apresentaram competência organogênica, evidenciando regiões

meristemáticas (Figura 6 A) e a conexão vascular das brotações com a

massa celular de origem (Figura 6 B).

39

A B

Figura 6. Histologia de calos organogênicos de Eucalyptus cloeziana

obtidos do tratamento constituído pela combinação 7 (2,0 mg L-1 de TDZ) e o tecido do hipocótilo, evidenciando a regeneração de brotos. (A) Detalhe de regiões de atividade meristemática (setas vermelhas) e (A e B) brotações adventícias (setas amarelas) apresentando conexão vascular com a massa celular de origem (seta preta). C= Calo; B= Broto; F= Folha; MA= Meristema apical.

Apesar da elevada intensidade calogênica de todos tecidos por

meio da aplicação de concentrações de ANA e 2,4-D, estes não

apresentaram competência organogênica ao serem transferidos para o

meio de regeneração. O tecido radicular não apresentou competência para

a indução de órgãos adventícios no meio de regeneração em nenhuma das

combinações de reguladores devido à alta determinação epigenética das

células deste tipo de tecido.

Figura 7. Detalhe da síntese de antocianina (setas) na superfície de calos

organogênicos no 1o subcultivo (30 dias) dos explantes no meio de regeneração de brotos. Calos advindos tratamentos de indução calogênica

da combinação 7 (2,0 mg L-1 de TDZ) nos tecidos do (A) hipocótilo e (B) cotilédone. Barra = 1 cm.

A

C

B

B

F

MA

B

40

Além disso, os calos oriundos dos tecidos radiculares foram os

únicos que não apresentaram pigmentação avermelhada, característica

própria da síntese de antocianinas que responde à continua divisão celular

e a possível formação de pontos meristemáticos (Figura 7 A e B), relação

detalhada em diversos trabalhos na regeneração in vitro de espécies de

eucalipto (MURALIDHARAN e MASCARENHAS, 1987; SUBBAIAH e

MINOCHA, 1990; HERVÉ et al., 2001; ALVES et al., 2004a; DIBAX et al.,

2005).

Tabela 11. Porcentagem de explantes de Eucalyptus cloeziana que apresentaram regeneração adventícia in vitro no meio de indução à organogênese, aos 30 dias.


Combinações de Fito-reguladores (mg L-1) Tecidos de origem


1 0,0 0,0 0,0 0,0±0,0Ba 0,0±0,0Ca

0,0±0,0Aa

2 0,0 0,0 1,0 0,0±0,0Ba 0,0±0,0Ca

0,0±0,0Aa

3 0,0 0,0 2,0 0,0±0,0Ba 0,0±0,0Ca

0,0±0,0Aa

4 0,0 1,0 0,0 0,0±0,0Bb 42,8±20,2Ba

0,0±0,0Ab

5 0,0 1,0 1,0 0,0±0,0Ba 0,0±0,0Ca

0,0±0,0Aa

6 0,0 1,0 2,0 0,0±0,0Ba 0,0±0,0Ca

0,0±0,0Aa

7 0,0 2,0 0,0 22,2±14,7Ab 55,5±17,5Aa

0,0±0,0Ac

8 0,0 2,0 1,0 0,0±0,0Ba 0,0±0,0Ca

0,0±0,0Aa

9 0,0 2,0 2,0 0,0±0,0Ba 0,0±0,0Ca

0,0±0,0Aa

10 2,0 0,0 0,0 0,0±0,0Ba 0,0±0,0Ca

0,0±0,0Aa

11 2,0 0,0 1,0 0,0±0,0Ba 0,0±0,0Ca

0,0±0,0Aa

12 2,0 0,0 2,0 0,0±0,0Ba 0,0±0,0Ca

0,0±0,0Aa

13 2,0 1,0 0,0 0,0±0,0Ba 0,0±0,0Ca

0,0±0,0Aa

14 2,0 1,0 1,0 0,0±0,0Ba 0,0±0,0Ca

0,0±0,0Aa

15 2,0 1,0 2,0 0,0±0,0Ba 0,0±0,0Ca

0,0±0,0Aa

16 2,0 2,0 0,0 20,0±13,3Aa 0,0±0,0Cb

0,0±0,0Ab

17 2,0 2,0 1,0 0,0±0,0Ba 0,0±0,0Ca

0,0±0,0Aa

18 2,0 2,0 2,0 0,0±0,0Ba 0,0±0,0Ca

0,0±0,0Aa

19 4,0 0,0 0,0 0,0±0,0Ba 0,0±0,0Ca

0,0±0,0Aa

20 4,0 0,0 1,0 0,0±0,0Ba 0,0±0,0Ca

0,0±0,0Aa

21 4,0 0,0 2,0 0,0±0,0Ba 0,0±0,0Ca

0,0±0,0Aa

22 4,0 1,0 0,0 0,0±0,0Ba 0,0±0,0Ca

0,0±0,0Aa

23 4,0 1,0 1,0 0,0±0,0Ba 0,0±0,0Ca

0,0±0,0Aa

24 4,0 1,0 2,0 0,0±0,0Ba 0,0±0,0Ca

0,0±0,0Aa

25 4,0 2,0 0,0 0,0±0,0Ba 0,0±0,0Ca

0,0±0,0Aa

26 4,0 2,0 1,0 0,0±0,0Ba 0,0±0,0Ca

0,0±0,0Aa

27 4,0 2,0 2,0 0,0±0,0Ba 0,0±0,0Ca

0,0±0,0Aa

41

4.1.5 Número de brotos

Dentre os calos regenerados foi avaliado o número de brotações

adventícias (NB) no meio de regeneração ao final da 3o subcultivo (90 dias

de cultivo in vitro). Os tratamentos foram constituídos pelos tecidos e

combinações de fito-reguladores que deram origem aos calos

organogênicos (Tabela 12).

Tabela 12. Descrição dos tratamentos que apresentaram formação de

brotos adventícios na etapa de regeneração.

C = cotilédone; H = hipocótilo.

Por meio da análise de variância (Tabela 13) foi constatado o

efeito significativo dos tratamentos testados (p<0,05) inoculados no meio

de regeneração.

Tabela 13. Resumo da análise de variância do número de brotos (NB) por calo regenerado in vitro de Eucalyptus cloeziana na etapa de regeneração de brotos em relação aos tratamentos, aos 90 dias.

Fonte de variância

GL

Quadrado médio

NB (1)

Tratamento 3 0,17*

Resíduo 8 0,038

Média - 18,5

CVexp(%) - 16,52

* Valor significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro, respectivamente pelo teste F. (1) Dados transformados por log10 (n+0,5), onde n = dado amostrado. GL = graus de liberdade, CVexp. = coeficiente de variação experimental.

Tratamentos Fito-reguladores (mg L-1) e tecido de origem

ANA TDZ 2,4-D Tecido

1 0,0 1,0 0,0 C

2 0,0 2,0 0,0 H

3 0,0 2,0 0,0 C

4 2,0 2,0 0,0 H

42

Figura 8. Organogênese in vitro, enraizamento ex vitro e aclimatização de

microestacas de Eucalyptus cloeziana. (A e B) Calo apresentando

regeneração de brotos adventícios in vitro no meio de regeneração, aos 90

dias (barra = 1 cm); (C) Broto coletado para enraizamento ex vitro (barra

= 1 cm); (D) Calo regenerado apresentando brotos alongados ao terceiro

subcultivo (90 dias) (barra = 0,5 cm); (E) Enraizamento in vitro e formação

de micro-cepa (barra = 1cm); (G) Mudas aclimatizadas e alocadas em casa

de sombra aos 150 dias; (F e H) Enraizamento ex vitro de brotos aos 20

dias (barra = 1 cm).

O tratamento 2 o qual foi constituído pelo calo regenerado da

combinação 2,0 mg L-1 de TDZ e o tecido do hipocótilo, apresentou maior

quantidade de brotações adventícias no meio de regeneração (Figura 8 B),

F

G

A B

E

43

estabelecendo uma média geral de 41,5 brotações por calo, diferindo

estatisticamente dos demais tratamentos (Tabela 14).

Considerando que os calos procedentes deste tratamento

apresentaram índices elevados na intensidade calogênica (100%) o que

pode ter favorecido a competência organogênica, resultando calos com

regiões de alta atividade meristemática e promovendo quantidades

superiores de brotos adventícios. Esta relação pode ter estimulado as

diferenças quanto à regeneração entre os tecidos de hipocótilo em

comparação ao tecido cotiledonar (Tratamento 3), nos quais os dos

tratamentos foram induzidos na mesma concentração de TDZ (2,0 mg L-1).

Tabela 14. Número de brotos (NB) por calo regenerado in vitro de Eucalyptus cloeziana em relação aos diferentes tecidos de origem e as combinações de fito-reguladores na etapa de regeneração.

Tratamento

Fito-regulador (mg L-1)

e tecido de origem NB

ANA TDZ 2,4-D Tecido

1 0,0 1,0 0,0 C 20,0±3,5b

2 0,0 2,0 0,0 H 41,5±16,5a

3 0,0 2,0 0,0 C 12,0±2,9b

4 2,0 2,0 0,0 H 9,5±3,5b

Médias seguidas por mesma letra minúscula não diferem significativamente pelo teste de Duncan ao nível de 5% de probabilidade de erro. Dados apresentados como: média ± erro padrão. C = cotilédone; H = hipocótilo.

Comparando os tratamentos 2 e 4, os quais possuíram

características similares, tais como o tecido de origem (hipocótilo), e a

combinação do meio de indução calogênica (2,0 mg L-1 de TDZ e 2,0 mg L-

1 de ANA + 2,0 mg L-1 de TDZ, respectivamente), foi observada diferença

significativa em relação ao número de brotações regeneradas (Tabela 14).

A concentração da auxina ANA contida nos calos do tratamento 4 pode ter

apresentado um efeito desfavorável na adoção à competência celular na

formação dos brotos, considerando que este grupo de fito-reguladores

inibem a formação de brotações aéreas (TAIZ e ZIEGER, 2004).

Todos os calos regenerados foram subdivididos em explantes

padrão (tufos) contendo como mínimo 3 brotações aéreas (Figura 9),

44

conservando a base calogênica que deu origem, e cultivadas em 2 meios

de multiplicação e alongamento (Tabela 4) constituídas por concentrações

diferentes dos fito-reguladores BAP e AIB (Figura 8 C e D), como também

se objetivou induzir a competência rizogênica das bases calosas para o

estabelecimento de micro-cepas in vitro, o qual foi apenas eficiente para

um explante, procedente do tecido cotiledonar e do meio de indução 4 (1,0

mgL-1 de TDZ), inoculado no meio de multiplicação e alongamento 2 (0,5

mgL-1 de BAP + 1,0 mgL-1 de AIB) (Figura 8 E).

Teoricamente, em uma estrutura celular desdiferenciada (calo)

depois de ter-se diferenciado e regenerado em um tipo de órgão (brotos),

a retomada de uma rota morfogênica e formação de um órgão diferente é

pouco provável devido a que, comumente, o processo organogênico

apresenta-se como unipolar, quer dizer, a formação de uma brotação aérea

ou raiz em uma mesma massa celular, ou no caso de se formar os dois

órgãos, estes não apresentarão conexão vascular (Peres, 2002).

Figura 9. Detalhe do tufo padrão utilizado para a multiplicação e alongamento dos brotos. Corte longitudinal do calo organogênico

procedente do hipocótilo induzido pela combinação 7 (2,0 mg L -1 de TDZ), conservando na base o tecido de origem. C= calo 4.2 Sobrevivência e enraizamento ex vitro de micro-estacas

A sobrevivência e enraizamento das micro-estacas foram

avaliados aos 20 dias de incubação no sistema de miniestufa, alocados na

sala de crescimento, as quais apresentaram respostas significativas

descritas através da análise de variância (Tabela 15).

O sistema de mini-estufa foi adotado por meio das vantagens

destacadas em trabalhos de aclimatização ex vitro, principalmente, de

Eucalyptus benthamii relatados por Brondani et al. (2012a) e Baccarin et al.

C

45

(2015) e Eucalyptus cloeziana por Oliveira et al. (2015).

Tabela 15. Resumo da análise de variância para a porcentagem de sobrevivência (SOB%) e enraizamento (ENR%) ex vitro de brotações de Eucalyptus cloeziana aos 20 dias.

Fonte de variância gl Quadrado meio

SOB(%) ENR(%)

Fito-reguladores e Tecidos de origem

(FTO)

2

3,51**

4,62**

Meio de cultura (ME)

1

0,0006ns

1,28ns

FTOxME 2 1,027ns 2,61**

Resíduo 48 0,534 0,47

Média - 68,51 38,9

CVexp(%) - 33,4 40,87

ns Valor não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F. * e ** Valor significativo ao nível de 5% e 1% de probabilidade de erro, respectivamente pelo teste F. Dados transformados por exp(n/100) , onde n = dado amostrado. GL = graus de liberdade, CVexp. = coeficiente de variação experimental.

Esse sistema, além de favorecer condições adequadas de

umidade relativa do ar e temperatura também incrementou o sucesso da

aclimatização dos explantes, evitando fatores relacionados ao estresse no

momento de transferências de plantas com raízes induzidas in vitro no

substrato nas condições ex vitro, como também os danos possivelmente

provocados nas operações dificultando a aclimatização e crescimento das

mudas.

Considerado que isso foi satisfatório para a aclimatização e

acondicionamento ex vitro das microestacas de Eucalyptus cloeziana, no

qual a porcentagem de sobrevivência esteve diretamente influenciada

(p<0,01) pelo tecido e o meio de indução que deram origem aos propágulos

utilizados, atingindo uma porcentagem média do 68,51% de explantes

vivos.

O sistema de mini-estufa permitiu controle fitossanitário e

desenvolvimento individual das micro-estacas, permitindo a mínima

influência das condições externas e atuando como barreira para

46

disseminação diversos agentes patogênicos, podendo inferir que nas

principais etapas para a otimização do processo rizogênico é fundamental

a mínima interferência ambiental para o sucesso da aclimatização e

enraizamento ex vitro das micro-estacas.

No entanto, porcentagens de sobrevivência ex vitro

apresentaram diferencias significativas entre os tratamentos que deram

origem às micro-estacas, destacando novamente o tratamento constituído

pelo tecido do hipocótilo + 2,0 mg L-1 de TDZ que apresentou melhores

porcentagens de sobrevivência dos propágulos, dentre 80 e 100% de

acordo com os MMA 1 e MMA2 respectivamente (Tabela 16).

Tabela 16. Porcentagem de sobrevivência (SOB%) ex vitro de microestacas de Eucalyptus cloeziana segundo a origem e os meios de multiplicação e alongamento in vitro (MMA), aos 20 dias.

Fito-regulador (mg L-1) e

tecido de origem MMA

Combinação

ANA TDZ 2,4-D Tecido 1 2

1 0,0 1,0 0,0 C 66,7±14,2a 66,7±12,6b

2 0,0 2,0 0,0 H 80,0±13,3a 100,0±0,0a

3 2,0 2,0 0,0 H 50,0±28,9a 0,0±0,0c

Médias seguidas por mesma letra minúscula não diferem significativamente na coluna, pelo teste de Duncan ao nível de 5% de probabilidade de erro. Dados apresentados como: média ± erro padrão. C = cotilédone; H = hipocótilo.

Micro-estacas provenientes da combinação 3 (2,0 mg L-1 de

ANA + 2,0 mg L-1 de TDZ), coletados do MMA2 (0,5 mg L-1 de BAP + 1,0

mg L-1 de AIB) apresentaram dificuldade na aclimatização ex vitro. Esse

efeito pode estar relacionado ao comprimento reduzido das brotações

alongadas (comprimento médio= 1,2 cm), as quais apresentaram estresse

durante a transferência para a mini-estufa.

A etapa de sobrevivência de propágulos ex vitro, reflete a

adequação do sistema de aclimatização e enraizamento, visando a

maximização dos processos de produção de mudas.

A porcentagem de enraizamento ex vitro das micro-estacas de

Eucalyptus cloeziana (Figura 8 F e H) a presentou média de 38,9%, a qual

47

pode ser considerada como resultado prometedor para a espécie, a qual

se caracteriza pela dificuldade de enraizamento de propágulos (ALFENAS

et al., 2004). Discriminando entre os diferentes tratamentos, foram

encontradas diferencias significativas dependendo da origem das micro-

estacas (tecidos e combinações de fito-reguladores) e os meios de

multiplicação e alongamento nos quais estiveram cultivados no ambiente in

vitro.

Tabela 17. Porcentagem de enraizamento (ENR%) ex vitro de microestacas de Eucalyptus cloeziana segundo a origem e os meios de multiplicação e alongamento in vitro (MMA), aos 20 dias.

Fito-regulador (mg L-1) e

tecido de origem MMA

Combinação

ANA TDZ 2,4-D Tecido 1 2

1 0,0 1,0 0,0 C 0,0Bb 53,3±13,33Aa

2 0,0 2,0 0,0 H 80,0±13,33Aa 55,6±17,57Ab

3 2,0 2,0 0,0 H 0,0Ba 0,0Ba

Nas colunas, médias seguidas por mesma letra maiúscula e, nas linhas, médias seguidas por mesma letra minúscula não diferem significativamente pelo teste de Duncan ao nível de 5% de probabilidade de erro. Dados apresentados como: média ± erro padrão. C = cotilédone; H = hipocótilo

Apesar da média geral de enraizamento das micro-estacas

tinha sido considerada reduzida, os diferentes tratamentos apresentaram

respostas divergentes, porém promissoras para a produção clonal da

espécie, sendo registrado o porcentual maior de brotos enraizados (80%)

em brotações procedentes da combinação 2 (hipocótilo + 2, mg L-1 de TDZ)

cultivados no meio MMA1 (1,0 mg L-1 de BAP + 0,5 mg L-1 de AIB) (Figura

8 F) que foram suplementadas ao meio de cultura (Tabela 17).

Cabe salientar a relação entre os dois reguladores como pouco

comuns na estimulação a competência à rizogênese de propágulos pelo

fato de conter a concentração de citocinina superior, as quais são definidas

como inibidores na promoção de raízes adventícias, em comparação às

auxinas utilizadas no meio de cultura (TAIZ e ZEIGER 2004).

Concentrações de AIB em torno de 0,5 mg L-1 poderiam

promover a predisposição ao enraizamento em brotos alongados,

48

diferindo estatisticamente em comparação com os propágulos da

mesma combinação de origem cultivamos no meio MMA2 (0,5 mg L-1 de

BAP + 1,0 mg L-1 de AIB), que teoricamente, pelo fato de conter a

concentração superior do regulador AIB (1,0 mg L-1), deveriam ter

fornecido maiores porcentagens dos propágulos, os quais forneceram

valor igual a 55,6%.

Porcentagens similares aos registrados neste trabalho foram

mencionados por Oliveira et al. (2015), os quais observaram porcentagens

de enraizamento de micro-estacas da mesma espécie, apresentando

elevada resposta quanto ao tipo do material genético avaliado. Os valores

de enraizamento ex vitro das micro-estacas variaram de 25% e 55%,

respectivamente para matrizes adultas e rejuvenescidas por meio da micro-

estaquia.

Cabe destacar o tempo de cultivo in vitro, desde a etapa de

calogênese (30 dias), regeneração de brotações (90 dias), multiplicação e

alongamento de brotos (90 dias), o enraizamento ex vitro (20 dias) e a

aclimatização e rustificação (Figura 8 G) das mudas (100 dias) o protocolo

apresentado (330 dias) pode ser considerado como uma alternativa rápida

e efetiva de propagação da espécie.

A metodologia desenvolvida pode ser testada em outras

espécies que apresentam dificuldade de enraizamento, levando em

consideração que nos processos atuais de rejuvenescimento in vitro

comumente são considerados dentre 12 a 19 sub-cultivos sucessivos (360

a 523 dias) visando a juvenilidade/revigoramento dos tecidos e

consequentemente o aumento na competência rizogênica de propágulos.

Cabe salientar que o protocolo foi desenvolvido para explantes coletados

de plântulas obtidas pela germinação in vitro, sendo necessário testar, para

plantas adultas selecionadas, a viabilidade da aplicação da técnica.

49

5 CONCLUSÕES

1. A competência dos tecidos e as concentrações dos fito-

reguladores foram efetivas à formação de calo.

2. As combinações 2 (1,0 mg L-1 de 2,4-D) e 7 (2,0 mg L-1 de TDZ)

induziram elevadas intensidades calogênicas nos tecidos testados.

3. A presença de estruturas pró embrionárias e embriões somáticos no

estágio globular foram promovidas principalmente nas combinações de

ANA e 2,4-D, destacando os tratamentos da combinação 21 (4,0 mg L-1 de

ANA + 2,0 mg L-1 de 2,4-D) nos tecidos utilizados.

4. O BAP no meio de regeneração adventícia dos explantes promoveu

a diferenciação celular e a formação de brotos aéreos, mas não foi efetivo

na diferenciação de embriões somáticos em estágios maduros.

5. O tratamento constituído pelo tecido cotiledonar induzido na

combinação 7 (2,0 mg L-1 de TDZ) destacou na promoção dos calos

organogênicos (55,6%), ademais das variáveis quantidade de brotos (41,5

brotos/explante), porcentagens de sobrevivência (80 - 100%) e

enraizamento ex vitro (55,6 – 80%).

6. Mediante o sistema de mini-estufa e a seguinte transferência a casa

se sombra forneceram condições ótimas para aclimatização e rustificação

das microestacas, respectivamente.

50

6 CONSIDERAÇÕES FINAIS E RECOMENDAÇÕES

Porcentagens de manifestação bacteriana e a ocorrência da

oxidação nos tecidos apresentaram-se interligadas nos primeiros estágios

da cultura calogênica, mas estas não constituíram uma problemática para

o desenvolvimento do experimento.

Tecidos juvenis apresentaram resposta eficiente ao estimulo do

fito-regulador TDZ principalmente ás concentrações isoladas de 1,0 e 2,0

mg L-1 destacando-se nas diferentes etapas in vitro e ex vitro, podendo ser

utilizado para o estabelecimento de protocolos de organogênese indireta

mediante a utilização de explantes maduros provenientes de matrizes

selecionadas a campo.

A utilização de combinações de BAP e AIB foram adequadas

para a multiplicação e alongamento das brotações, inclusive foi possível

combinar as duas etapas no mesmo período de cultivo, mas a identificação

de concentrações que promovam maiores taxas de multiplicação e índices

de alongamento das brotações favoreceriam na eficiência da metodologia.

Protocolos efetivos para a formação de micro-cepas in vitro e/ou

mini-cepas ex vitro de Eucalyptus cloeziana poderiam beneficiar à

constituição de bancos de matrizes para o fornecimento de brotações com

elevada competência ao enraizamento.

Metodologias para o desenvolvimento efetivo e obtenção de

embriões somáticos maduros in vitro poderiam favorecer ao

estabelecimento do protocolo de embriogênese somática de Eucalyptus

cloeziana para estratégias para a obtenção de sementes artificiais e

propagação clonal da espécie.

51

7 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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REGENERAÇÃO in vitro DE Eucalyptus cloeziana F. Muell · ALEX ZICHNER ZORZ REGENERAÇÃO in vitro DE Eucalyptus cloeziana F. Muell. Orientador: Dr. GILVANO EBLING BRONDANI Co-orientadores: