II

(Actos natildeo legislativos)

REGULAMENTOS

REGULAMENTO (UE) N o 612011 DA COMISSAtildeO

de 24 de Janeiro de 2011

que altera o Regulamento (CEE) n o 256891 relativo agraves caracteriacutesticas dos azeites e dos oacuteleos de bagaccedilo de azeitona bem como aos meacutetodos de anaacutelise relacionados

A COMISSAtildeO EUROPEIA

Tendo em conta o Tratado sobre o Funcionamento da Uniatildeo Europeia

Tendo em conta o Regulamento (CE) n o 12342007 do Conseshylho de 22 de Outubro de 2007 que estabelece uma organizashyccedilatildeo comum dos mercados agriacutecolas e disposiccedilotildees especiacuteficas para certos produtos agriacutecolas (Regulamento laquoOCM uacutenicaraquo) ( 1 ) nomeadamente o artigo 113 o n o 1 aliacutenea a) e o artigo 121 o aliacutenea h) em conjugaccedilatildeo com o artigo 4 o

Considerando o seguinte

(1) O Regulamento (CEE) n o 256891 da Comissatildeo ( 2 ) deshyfine as caracteriacutesticas fiacutesicas e quiacutemicas dos azeites e dos oacuteleos de bagaccedilo de azeitona bem como os meacutetodos de anaacutelise relacionados Estes meacutetodos assim como os vashylores-limite relativos agraves caracteriacutesticas dos azeites e oacuteleos tecircm de ser actualizados com base no parecer dos peritos quiacutemicos e de ser coerentes com os trabalhos efectuados no acircmbito do Conselho Oleiacutecola Internacional

(2) Dado que os peritos quiacutemicos consideraram nomeadashymente que o teor de eacutesteres etiacutelicos de aacutecidos gordos e de eacutesteres metiacutelicos de aacutecidos gordos constitui um paracircshymetro uacutetil de qualidade dos azeites virgem extra eacute adeshyquado incluir valores-limite para esses eacutesteres bem como um meacutetodo de determinaccedilatildeo do respectivo teor

(3) Para possibilitar um periacuteodo de adaptaccedilatildeo agraves novas norshymas e a implantaccedilatildeo dos meios necessaacuterios agrave aplicaccedilatildeo das mesmas e para natildeo perturbar as transacccedilotildees comershyciais as alteraccedilotildees efectuadas pelo presente regulamento devem ser aplicaacuteveis a partir de 1 de Abril de 2011 Pelas mesmas razotildees eacute conveniente prever que os azeites e os oacuteleos de bagaccedilo de azeitona legalmente fabricados e roshytulados na Uniatildeo ou legalmente importados para a mesma e colocados em livre praacutetica antes da data refeshyrida possam ser comercializados ateacute ao esgotamento das existecircncias

(4) O Regulamento (CEE) n o 256891 deve portanto ser alterado em conformidade

(5) As medidas previstas no presente regulamento estatildeo em conformidade com o parecer do Comiteacute de Gestatildeo para a Organizaccedilatildeo Comum dos Mercados Agriacutecolas

ADOPTOU O PRESENTE REGULAMENTO

Artigo 1 o

O Regulamento (CEE) n o 256891 eacute alterado do seguinte modo

1) Ao artigo 2 o n o 1 eacute aditado o seguinte travessatildeo

laquomdash para a determinaccedilatildeo do teor de ceras de eacutesteres metiacutelishycos de aacutecidos gordos e de eacutesteres etiacutelicos de aacutecidos gordos por cromatografia em fase gasosa com coluna capilar o meacutetodo constante do anexo XXraquo

2) Ao sumaacuterio dos anexos eacute aditado o seguinte

laquoAnexo XX Meacutetodo de determinaccedilatildeo do teor de ceras de eacutesteres metiacutelicos de aacutecidos gordos e de eacutesteres etiacutelicos de aacutecidos gordos por cromatografia em fase gasosa com coluna capilarraquo

3) O anexo I eacute substituiacutedo pelo texto do anexo I do presente regulamento

4) Eacute aditado o anexo XX constante do anexo II do presente regulamento

Artigo 2 o

Os produtos legalmente fabricados e rotulados na Uniatildeo ou legalmente importados para a mesma e colocados em livre praacutetica antes de 1 de Abril de 2011 podem ser comercializados ateacute ao esgotamento das existecircncias

PT 2712011 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia L 231

( 1 ) JO L 299 de 16112007 p 1 ( 2 ) JO L 248 de 591991 p 1

Artigo 3 o

O presente regulamento entra em vigor no terceiro dia seguinte ao da sua publicaccedilatildeo no Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia

O presente regulamento eacute aplicaacutevel a partir de 1 de Abril de 2011

O presente regulamento eacute obrigatoacuterio em todos os seus elementos e directamente aplicaacutevel em todos os Estados-Membros

Feito em Bruxelas em 24 de Janeiro de 2011

Pela Comissatildeo O Presidente

Joseacute Manuel BARROSO

PT L 232 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia 2712011

ANEXO I

laquoANEXO I

CARACTERIacuteSTICAS DOS AZEITES

Categoria

Eacutesteres metiacutelicos de aacutecidos gordos (FAME) e eacutesteres etiacutelicos de aacutecidos gordos

(FAEE)

Iacutendice de peroacutexidos

mEq O 2kg ()

Ceras mgkg

()

Monopalmitato de 2-glicerilo ()

Estigmastashydieno mgkg

(1 )

Diferenccedila entre o ECN42

determishynado por HPLC e o

ECN42 obtido por

caacutelculo teoacuterico

K 232 () K 270 () Delta-K ()

Exame organoshyleacuteptico

Mediana dos defeitos (Md) ()

Exame organoshyleacuteptico

Mediana do frutado (Mf) ()

1 Azeite virgem extra Σ FAME + FAEE le 75 mgkg ou 75 mgkg

ltΣ FAME + FAEE le 150 mgkg e (FAEE

FAME) le 15

le 08 le 20 le 250 le 09 se aacutecido palmiacuteshytico total le 14

le 010 le 02 le 250 le 022 le 001 Md = 0 Mf gt 0

le 10 se aacutecido palmiacuteshytico total gt 14

2 Azeite virgem mdash le 20 le 20 le 250 le 09 se aacutecido palmiacuteshytico total le 14

le 010 le 02 le 260 le 025 le 001 Md le 35 Mf gt 0

le 10 se aacutecido palmiacuteshytico total gt 14

3 Azeite lampante mdash gt 20 mdash le 300 (3 ) le 09 se aacutecido palmiacuteshytico total le 14

le 050 le 03 mdash mdash mdash Md gt 35 (2 ) mdash

le 11 se aacutecido palmiacuteshytico total gt 14

4 Azeite refinado mdash le 03 le 5 le 350 le 09 se aacutecido palmiacuteshytico total le 14

mdash le 03 mdash le 110 le 016 mdash mdash

le 11 se aacutecido palmiacuteshytico total gt 14

5 Azeite (constituiacutedo por azeites refinados e azeishytes virgens)

mdash le 10 le 15 le 350 le 09 se aacutecido palmiacuteshytico total le 14

mdash le 03 mdash le 090 le 015 mdash mdash

le 10 se aacutecido palmiacuteshytico total gt 14

6 Oacuteleo de bagaccedilo de azeishytona bruto

mdash mdash mdash gt 350 (4 ) le 14 mdash le 06 mdash mdash mdash mdash mdash

7 Oacuteleo de bagaccedilo de azeishytona refinado

mdash le 03 le 5 gt 350 le 14 mdash le 05 mdash le 200 le 020 mdash mdash

8 Oacuteleo de bagaccedilo de azeishytona

mdash le 10 le 15 gt 350 le 12 mdash le 05 mdash le 170 le 018 mdash mdash

(1 ) Soma dos isoacutemeros - separaacuteveis ou natildeo em coluna capilar (2 ) Ou quando a mediana dos defeitos for inferior ou igual a 35 e a mediana do frutado igual a 0 (3 ) Os azeites cujo teor de ceras esteja comprendido entre 300 mgkg e 350 mgkg satildeo considerados azeite lampante se o teor de aacutelcoois alifaacuteticos totais for inferior ou igual a 350 mgkg ou se a percentagem de eritrodiol e uvaol for inferior

ou igual a 35 (4 ) Os oacuteleos cujo teor de ceras esteja comprendido entre 300 mgkg e 350 mgkg satildeo considerados oacuteleo de bagaccedilo de azeitona bruto se o teor de aacutelcoois alifaacuteticos totais for superior a 350 mgkg e se a percentagem de eritrodiol e uvaol for

superior a 35

PT 2712011

Jornal Oficial da U

niatildeo Europeia L 233

Categoria

Teor de aacutecidos (1 ) Soma dos isoacutemeros transoleishy

cos ()

Soma dos isoacutemeros translinoshyleicos +

translinoshyleacutenicos

()

Composiccedilatildeo esteroacutelica

Esteroacuteis toshytais

(mgkg)

Eritrodiol e uvaol

() ()

Miriacutestico ()

Linoleacutenico ()

Araquiacuteshydico ()

Eicoseshynoacuteico

()

Beeacutenico ()

Lignoceacuteshyrico ()

Colesterol ()

Brassicasshyterol ()

Campesterol ()

Estigmasteshyrol ()

Betasitosshyterol () (2 )

Delta-7- estigmasshy

tenol ()

1 Azeite virgem extra le 005 le 10 le 06 le 04 le 02 le 02 le 005 le 005 le 05 le 01 le 40 lt Camp ge 930 le 05 ge 1 000 le 45

2 Azeite virgem le 005 le 10 le 06 le 04 le 02 le 02 le 005 le 005 le 05 le 01 le 40 lt Camp ge 930 le 05 ge 1 000 le 45

3 Azeite lampante le 005 le 10 le 06 le 04 le 02 le 02 le 010 le 010 le 05 le 01 le 40 mdash ge 930 le 05 ge 1 000 le 45 (3 )

4 Azeite refinado le 005 le 10 le 06 le 04 le 02 le 02 le 020 le 030 le 05 le 01 le 40 lt Camp ge 930 le 05 ge 1 000 le 45

5 Azeite (constituiacutedo por azeishytes refinados e azeites virshygens)

le 005 le 10 le 06 le 04 le 02 le 02 le 020 le 030 le 05 le 01 le 40 lt Camp ge 930 le 05 ge 1 000 le 45

6 Oacuteleo de bagaccedilo de azeitona bruto

le 005 le 10 le 06 le 04 le 03 le 02 le 020 le 010 le 05 le 02 le 40 mdash ge 930 le 05 ge 2 500 gt 45 (4 )

7 Oacuteleo de bagaccedilo de azeitona refinado

le 005 le 10 le 06 le 04 le 03 le 02 le 040 le 035 le 05 le 02 le 40 lt Camp ge 930 le 05 ge 1 800 gt 45

8 Oacuteleo de bagaccedilo de azeitona le 005 le 10 le 06 le 04 le 03 le 02 le 040 le 035 le 05 le 02 le 40 lt Camp ge 930 le 05 ge 1 600 gt 45

(1 ) Teores de outros aacutecidos gordos () palmiacutetico 75 - 200 palmitoleico 03 - 35 heptadecanoacuteico le 03 heptadecenoacuteico le 03 esteaacuterico 05 - 50 oleico 550 - 830 linoleico 35 - 210 (2 ) Soma de delta-523-estigmastadienol + clerosterol + beta-sitosterol + sitostanol + delta-5-avenasterol + delta-524-estigmastadienol (3 ) Os azeites cujo teor de ceras esteja comprendido entre 300 mgkg e 350 mgkg satildeo considerados azeite lampante se o teor de aacutelcoois alifaacuteticos totais for inferior ou igual a 350 mgkg ou se a percentagem de eritrodiol e uvaol for inferior

ou igual a 35 (4 ) Os oacuteleos cujo teor de ceras esteja comprendido entre 300 mgkg e 350 mgkg satildeo considerados oacuteleo de bagaccedilo de azeitona bruto se o teor de aacutelcoois alifaacuteticos totais for superior a 350 mgkg e se a percentagem de eritrodiol e uvaol for

superior a 35

Notas

a) Os resultados das anaacutelises devem ser expressos com um nuacutemero de algarismos significativos idecircntico ao previsto para cada caracteriacutestica Se o algarismo seguinte for superior a 4 o uacuteltimo algarismo significativo deve ser aumentado de uma unidade

b) Basta que uma das caracteriacutesticas esteja fora dos limites fixados para que o produto seja classificado noutra categoria ou declarado natildeo conforme quanto agrave sua pureza para os efeitos do presente regulamento c) O asterisco () associado a determinadas caracteriacutesticas de qualidade do azeite significa o seguinte

mdash no caso do azeite lampante que os limites correspondentes podem natildeo ser observados simultaneamente mdash no caso dos azeites virgens que a natildeo observacircncia de um dos limites correspondentes implica uma mudanccedila de categoria mantendo-se poreacutem a classificaccedilatildeo numa das categorias de azeites virgens

d) No caso dos oacuteleos de bagaccedilo de azeitona os limites relativos agraves caracteriacutesticas de qualidade assinaladas com dois asteriscos () podem natildeo ser observados simultaneamenteraquo

PT L 234

Jornal Oficial da U

niatildeo Europeia 2712011

ANEXO II

laquoANEXO XX

Meacutetodo de determinaccedilatildeo do teor de ceras de eacutesteres metiacutelicos de aacutecidos gordos e de eacutesteres etiacutelicos de aacutecidos gordos por cromatografia em fase gasosa com coluna capilar

1 OBJECTIVO

Apresenta-se seguidamente o meacutetodo de determinaccedilatildeo do teor de ceras e de eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos de aacutecidos gordos de azeites e oacuteleos de bagaccedilo de azeitona As ceras e os eacutesteres alquiacutelicos satildeo separados de acordo com o respectivo nuacutemero de aacutetomos de carbono O meacutetodo eacute recomendado para distinguir azeites de oacuteleos de bagaccedilo de azeitona e para determinar a qualidade dos azeites virgem extra permitindo a detecccedilatildeo de misturas fraudulentas destes com azeites de qualidade inferior quer sejam virgens lampantes ou desodorizados

2 PRINCIacutePIO

Adiccedilatildeo ao azeite ou oacuteleo de bagaccedilo de azeitona de padrotildees internos adequados e fraccionamento por cromatoshygrafia com uma coluna de silicagel hidratada Recuperaccedilatildeo da fracccedilatildeo eluiacuteda nas condiccedilotildees de ensaio (fracccedilatildeo com polaridade inferior agrave dos triacilgliceroacuteis) e anaacutelise directa por cromatografia em fase gasosa com coluna capilar

3 APARELHOS E UTENSIacuteLIOS

31 Erlenmeyer de 25 ml

32 Coluna de vidro para cromatografia em fase liacutequida (15 mm de diacircmetro interno 30-40 cm de comprimento) munida de uma torneira adequada

33 Cromatoacutegrafo de fase gasosa utilizaacutevel com coluna capilar equipado com um sistema de injecccedilatildeo directa na coluna constituiacutedo pelos seguintes componentes

331 Forno termostaacutetico com programaccedilatildeo de temperatura

332 Injector para injecccedilatildeo directa a frio na coluna

333 Detector de ionizaccedilatildeo de chama e conversor-amplificador

334 Registador-integrador (nota 1) para utilizaccedilatildeo com o conversor-amplificador (333) com tempo de resposta natildeo superior a 1 s e velocidade do papel variaacutevel

Nota 1 Podem tambeacutem utilizar-se sistemas informatizados no caso de os dados cromatograacuteficos serem registados num compushytador pessoal

335 Coluna capilar de siacutelica fundida (para a anaacutelise das ceras e dos eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos) de 8-12 m de comprimento e 025-032 mm de diacircmetro interno com revestimento interno de fase liacutequida (nota 2) numa espessura uniforme de 010-030 μm

Nota 2 Para o fim em causa encontram-se disponiacuteveis no comeacutercio fases liacutequidas como SE52 SE54 etc

34 Microsseringa de 10 μl munida de agulha de accedilo cementado para injecccedilatildeo directa na coluna

35 Vibrador eleacutectrico

36 Evaporador rotativo

37 Mufla

38 Balanccedila analiacutetica com sensibilidade de plusmn 01 mg

39 Material de vidro de uso laboratorial corrente

PT 2712011 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia L 235

4 REAGENTES

41 Silicagel com granulometria de 60-200 μm Colocar a silicagel na mufla a 500 degC durante pelo menos 4 h Deixar arrefecer e adicionar 2 de aacutegua relativamente agrave quantidade de silicagel Agitar bem para homogeneizar e manter no exsicador durante pelo menos 12 h antes de utilizar

42 n-Hexano de qualidade cromatograacutefica ou para determinaccedilatildeo de resiacuteduos (eacute necessaacuterio comprovar o grau de pureza)

ADVERTEcircNCIA ndash Possibilidade de igniccedilatildeo dos vapores Manter ao abrigo de fontes de calor faiacutescas ou chamas descobertas Assegurar que os frascos satildeo devidamente fechados Assegurar uma ventilaccedilatildeo adequada durante o uso Evitar a acumulaccedilatildeo de vapores e eliminar todas as possiacuteveis fontes de incecircndio como dispositivos de aquecimento e dispositivos eleacutectricos que natildeo sejam constituiacutedos por materiais natildeo-inflamaacuteveis Nocivo por inalaccedilatildeo podendo causar danos agraves ceacutelulas nervosas Evitar respirar os vapores Se necessaacuterio utilizar um dispositivo de respiraccedilatildeo adequado Evitar o contacto com os olhos e a pele

43 Eacuteter etiacutelico de qualidade cromatograacutefica

ADVERTEcircNCIA ndash Altamente inflamaacutevel e moderadamente toacutexico Irritante para a pele Nocivo por inalaccedilatildeo Pode causar danos oculares Possibilidade de efeitos retardados Possibilidade de formaccedilatildeo de peroacutexidos explosivos Possibilidade de igniccedilatildeo dos vapores Manter ao abrigo de fontes de calor faiacutescas ou chamas descobertas Assegurar que os frascos satildeo devidamente fechados Assegurar uma ventilaccedilatildeo adequada durante o uso Evitar a acumulaccedilatildeo de vapores e eliminar todas as possiacuteveis fontes de incecircndio como dispositivos de aquecimento e dispositivos eleacutectricos que natildeo sejam constituiacutedos por materiais natildeo-inflamaacuteveis Natildeo evaporar agrave secura ou perto da secura A adiccedilatildeo de aacutegua ou de um agente redutor adequado reduz o risco da formaccedilatildeo de peroacutexidos Natildeo beber Evitar respirar os vapores Evitar o contacto prolongado ou repetido com a pele

44 n-Heptano de qualidade cromatograacutefica ou iso-octano

ADVERTEcircNCIA ndash Inflamaacutevel Nocivo por inalaccedilatildeo Manter afastado de fontes de calor faiacutescas ou chamas descoshybertas Assegurar que os frascos satildeo devidamente fechados Assegurar uma ventilaccedilatildeo adequada durante o uso Evitar respirar os vapores Evitar o contacto prolongado ou repetido com a pele

45 Soluccedilatildeo-padratildeo de araquidato de laurilo (nota 3) a 005 (mV) em heptano (padratildeo interno para as ceras)

Nota 3 Podem tambeacutem utilizar-se palmitato de palmitilo estearato de miristilo ou laureato de araquidilo

46 Soluccedilatildeo-padratildeo de heptadecanoato de metilo a 002 (mv) em heptano (padratildeo interno para os eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos)

47 Corante Sudan 1 (1-fenilazo-2-naftol)

48 Gaacutes vector hidrogeacutenio ou heacutelio puros de qualidade para cromatografia em fase gasosa

ADVERTEcircNCIA

Hidrogeacutenio Altamente inflamaacutevel sob pressatildeo Manter ao abrigo de fontes de calor faiacutescas chamas descobertas ou dispositivos eleacutectricos que natildeo sejam constituiacutedos por materiais natildeo-inflamaacuteveis Assegurar que a torneira da garrafa se encontra fechada quando esta natildeo estiver a ser utilizada Utilizar sempre um redutor de pressatildeo Reduzir a tensatildeo da mola redutora antes de abrir a torneira da garrafa Natildeo permanecer em frente da saiacuteda da garrafa ao abrir a torneira Assegurar uma ventilaccedilatildeo adequada durante o uso Natildeo transferir hidrogeacutenio entre garrafas Natildeo misturar gases na garrafa Assegurar que as garrafas natildeo possam cair Manter as garrafas ao abrigo da luz solar e de fontes de calor Armazenar ao abrigo da corrosatildeo Natildeo utilizar garrafas danificadas ou sem roacutetulo

Heacutelio Gaacutes comprimido a alta pressatildeo Reduz a quantidade de oxigeacutenio respiraacutevel Manter a garrafa fechada Assegurar uma ventilaccedilatildeo adequada durante o uso Natildeo aceder aos locais de armazenagem se os mesmos natildeo estiverem devidamente ventilados Utilizar sempre um redutor de pressatildeo Reduzir a tensatildeo da mola redutora antes de abrir a torneira da garrafa Natildeo transferir gaacutes entre garrafas Assegurar que as garrafas natildeo possam cair Natildeo permanecer em frente da saiacuteda da garrafa ao abrir a torneira Manter as garrafas ao abrigo da luz solar e de fontes de calor Armazenar ao abrigo da corrosatildeo Natildeo utilizar garrafas danificadas ou sem roacutetulo Natildeo inalar Utilizar apenas para fins teacutecnicos

PT L 236 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia 2712011

49 Gases auxiliares

mdash Hidrogeacutenio puro de qualidade cromatograacutefica

mdash Ar puro de qualidade para cromatografia em fase gasosa

ADVERTEcircNCIA

Ar Gaacutes comprimido a alta pressatildeo Utilizar com precauccedilatildeo na presenccedila de substacircncias combustiacuteveis dado que a temperatura de auto-igniccedilatildeo da maioria dos compostos orgacircnicos no ar eacute consideravelmente inferior a altas pressotildees Assegurar que a torneira da garrafa se encontra fechada quando esta natildeo estiver a ser utilizada Utilizar sempre um redutor de pressatildeo Reduzir a tensatildeo da mola redutora antes de abrir a torneira da garrafa Natildeo permanecer em frente da saiacuteda da garrafa ao abrir a torneira Natildeo transferir gaacutes entre garrafas Natildeo misturar gases na garrafa Assegurar que as garrafas natildeo possam cair Manter ao abrigo da luz solar e de fontes de calor Armazenar ao abrigo da corrosatildeo Natildeo utilizar garrafas danificadas ou sem roacutetulo O ar destinado a utilizaccedilotildees teacutecnicas natildeo pode ser utilizado em dispositivos de inalaccedilatildeo ou respiratoacuterios

5 PROCEDIMENTO

51 Preparaccedilatildeo da coluna cromatograacutefica

Preparar uma suspensatildeo de 15 g de silicagel (41) em n-hexano (42) e introduzi-la na coluna (32) Deixar assentar espontaneamente Completar a operaccedilatildeo por recurso a um vibrador eleacutectrico de modo a tornar mais homogeacutenea a camada cromatograacutefica Fazer passar 30 ml de n-hexano para remover eventuais impurezas Por recurso agrave balanccedila analiacutetica (38) pesar rigorosamente cerca de 500 mg da amostra no erlenmeyer de 25 ml (31) adicionando uma quantidade adequada de padratildeo interno (45) em funccedilatildeo do teor de ceras previsiacutevel (adicionar por exemplo 01 mg de araquidato de laurilo no caso dos azeites 025-050 mg no caso dos oacuteleos de bagaccedilo de azeitona e 005 mg de heptadecanoato de metilo no caso dos azeites e dos oacuteleos de bagaccedilo de azeitona (46))

Transferir a amostra preparada para a coluna cromatograacutefica com o auxiacutelio de duas porccedilotildees de 2 ml de n-hexano (42)

Deixar fluir o solvente ateacute 1 mm acima da camada de silicagel e fazer passar em seguida mistura n-hexanoeacuteter etiacutelico (991) Recolher 220 ml a um caudal aproximado de 15 gotas em cada 10 segundos (Esta fracccedilatildeo conteacutem os eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos e as ceras) (nota 4) (nota 5)

Nota 4 A mistura de n-hexanoeacuteter etiacutelico (991) deve ser preparada diariamente

Nota 5 Com o objectivo de verificar visualmente se as ceras satildeo eluiacutedas de forma adequada pode adicionar-se agrave soluccedilatildeo-amostra 100 μl de corante Sudan I a 1

O tempo de retenccedilatildeo do corante situa-se entre os tempos de retenccedilatildeo das ceras e dos triacilgliceroacuteis Assim deve suspender-se a eluiccedilatildeo quando o corante atinge a base da coluna cromatograacutefica dado todas as ceras terem entatildeo sido eluiacutedas

Evaporar as fracccedilotildees resultantes num evaporador rotativo ateacute agrave remoccedilatildeo quase total do solvente Remover os uacuteltimos 2 ml com uma corrente de azoto ligeira Recolher a fracccedilatildeo que conteacutem os eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos e diluir com 2-4 ml de n-heptano ou iso-octano

52 Anaacutelise por cromatografia em fase gasosa

521 Operaccedilotildees preliminares

Instalar a coluna no cromatoacutegrafo de fase gasosa (33) ligando uma das extremidades ao sistema de injecccedilatildeo directa na coluna e a outra extremidade ao detector Efectuar uma verificaccedilatildeo do sistema cromatograacutefico (operashycionalidade dos circuitos de gases eficiecircncia do detector e do registador etc)

Se a coluna for utilizada pela primeira vez eacute aconselhaacutevel proceder ao seu condicionamento Para o efeito passar um ligeiro fluxo gasoso pela coluna ligando o cromatoacutegrafo de seguida Aumentar a temperatura gradualmente de forma a atingir 350 degC apoacutes cerca de 4 h

PT 2712011 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia L 237

Manter esta temperatura durante pelo menos 2 h regulando seguidamente o aparelho para as condiccedilotildees de trabalho (regular o caudal de gaacutes acender a chama ligar ao registador electroacutenico - ponto 334 - regular a temperatura do forno para a coluna regular o detector etc) Registar o sinal obtido com uma sensibilidade pelo menos dupla da sensibilidade prevista para a execuccedilatildeo da anaacutelise A linha de base deve ser linear sem qualquer pico ou desvio

A ocorrecircncia de um desvio linear negativo indica que as ligaccedilotildees da coluna natildeo foram efectuadas de modo correcto a ocorrecircncia de um desvio positivo indica que a coluna natildeo foi condicionada de forma correcta

522 Escolha das condiccedilotildees de trabalho para a determinaccedilatildeo das ceras e dos eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos (nota 6)

As condiccedilotildees de trabalho satildeo em geral as seguintes

mdash Temperatura da coluna

20 degCmin 5 degCmin

80 degC no iniacutecio (1prime) 140 degC 335 degC (20prime)

mdash Temperatura do detector 350 degC

mdash Quantidade injectada 1 μl de soluccedilatildeo de n-heptano (2-4 ml)

mdash Gaacutes vector heacutelio ou hidrogeacutenio agrave velocidade linear oacuteptima para o gaacutes seleccionado (ver o apecircndice A)

mdash Sensibilidade dos instrumentos adequada ao cumprimento das condiccedilotildees atraacutes referidas

Nota 6 Atendendo agrave elevada temperatura final eacute admissiacutevel um desvio positivo mas que natildeo deveraacute exceder 10 da escala

Estas condiccedilotildees podem ser alteradas em funccedilatildeo das caracteriacutesticas da coluna e do cromatoacutegrafo tendo em vista a separaccedilatildeo total das ceras e dos eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos dos aacutecidos gordos e uma resoluccedilatildeo satisfatoacuteria dos picos (ver as figuras 2 3 e 4) bem como a obtenccedilatildeo de um tempo de retenccedilatildeo de 18 plusmn 3 minutos para o padratildeo interno (araquidato de laurilo) O pico mais representativo correspondente agraves ceras deveraacute elevar-se a pelo menos 60 da escala devendo o pico correspondente ao padratildeo interno para os eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos (heptadecanoato de metilo) atingir a totalidade da escala

Os paracircmetros de integraccedilatildeo dos picos devem ser determinados de modo a obter uma estimativa correcta das aacutereas dos picos pertinentes

53 Execuccedilatildeo da anaacutelise

Efectuar uma toma de 10 μl de soluccedilatildeo com a microsseringa de 10 μl puxando o ecircmbolo ateacute esvaziar a agulha Introduzir a agulha no sistema de injecccedilatildeo e decorridos 1-2 s injectar rapidamente a amostra Retirar cuidadoshysamente a agulha decorridos cerca de 5 s

Efectuar o registo ateacute agrave eluiccedilatildeo completa das ceras ou dos estigmastadienos consoante a fracccedilatildeo em anaacutelise

A linha de base deve satisfazer sempre as condiccedilotildees requeridas

54 Identificaccedilatildeo dos picos

Identificar os picos com base nos tempos de retenccedilatildeo comparando-os com os tempos de retenccedilatildeo de misturas conhecidas de ceras analisadas nas mesmas condiccedilotildees Os eacutesteres alquiacutelicos satildeo identificados com base em misturas de eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos dos principais aacutecidos gordos presentes no azeite (aacutecidos palmiacutetico e oleico)

A figura 1 apresenta um cromatograma caracteriacutestico das ceras de um azeite virgem As figuras 2 e 3 apresentam cromatogramas de dois azeites extra virgem vendidos a retalho num dos casos com os respectivos eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos e no outro sem eles A figura 4 apresenta cromatogramas caracteriacutesticos de um azeite virgem extra de qualidade superior e do mesmo azeite apoacutes a adiccedilatildeo de 20 de um azeite desodorizado

PT L 238 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia 2712011

55 Anaacutelise quantitativa das ceras

Com o auxiacutelio do integrador determinar a aacuterea dos picos correspondentes ao padratildeo interno (araquidato de laurilo) e aos eacutesteres alifaacuteticos C 40 -C 46

Determinar o teor total de ceras expresso em mgkg de gordura atraveacutes do somatoacuterio das vaacuterias ceras por recurso agrave seguinte foacutermula

Ceras mg=kg frac14 ethΣA x THORN m s 1 000 A s m

sendo

A x = aacuterea do pico correspondente a um determinado eacutester calculada por via informaacutetica

A s = aacuterea do pico correspondente ao padratildeo interno (araquidato de laurilo) calculada por via informaacutetica

m s = massa de padratildeo interno (araquidato de laurilo) adicionada em miligramas

m = massa da toma de amostra para a determinaccedilatildeo em gramas

551 Anaacutelise quantitativa dos eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos

Com o auxiacutelio do integrador determinar a aacuterea dos picos correspondentes ao padratildeo interno (heptadecanoato de metilo) aos eacutesteres metiacutelicos dos aacutecidos gordos C 16 e C 18 e aos eacutesteres etiacutelicos dos mesmos aacutecidos gordos

Determinar o teor de cada eacutester alquiacutelico expresso em mgkg de gordura por recurso agrave seguinte foacutermula

Ester mg=kg frac14 A x m s 1 000

A s m

sendo

A x = aacuterea do pico correspondente a um determinado eacutester C 16 ou C 18 calculada por via informaacutetica

A s = aacuterea do pico correspondente ao padratildeo interno (heptadecanoato de metilo) calculada por via informaacutetica

m s = massa de padratildeo interno (heptadecanoato de metilo) adicionada em miligramas

m = massa da toma de amostra para a determinaccedilatildeo em gramas

6 APRESENTACcedilAtildeO DOS RESULTADOS

Apresentar a soma dos teores das vaacuterias ceras de C 40 a C 46 (nota 7) em miligramas por quilograma de gordura

Apresentar a soma dos teores dos eacutesteres metiacutelicos e dos eacutesteres etiacutelicos de C 16 a C 18 bem como o total de ambos

Os resultados devem ser expressos com a aproximaccedilatildeo de 1 mgkg

Nota 7 Os componentes a quantificar dizem respeito aos picos correspondentes aos eacutesteres C 40 - C 46 com nuacutemero par de aacutetomos de carbono como se exemplifica no cromatograma das ceras de um azeite que consta da figura anexa Para fins de identificaccedilatildeo em caso de desdobramento do eacutester C 46 recomenda-se a anaacutelise da fracccedilatildeo de ceras de um oacuteleo de bagaccedilo de azeitona no qual o pico correspondente ao eacutester C 46 se distingue pela sua predominacircncia

Apresentar a relaccedilatildeo entre eacutesteres etiacutelicos e eacutesteres metiacutelicos

PT 2712011 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia L 239

Figura 1

Exemplo de cromatograma de fase gasosa da fracccedilatildeo de ceras de um azeite ()

Picos com tempos de retenccedilatildeo compreendidos entre 5 e 8 min correspondentes aos eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos dos aacutecidos gordos

Legenda

IS = Araquidato de laurilo

1 = Eacutesteres diterpeacutenicos

2+2prime = Eacutesteres C 40

3+3prime = Eacutesteres C 42

4+4prime = Eacutesteres C 44

5 = Eacutesteres C 46

6 = Eacutesteres de esteroacuteis e de aacutelcoois triterpeacutenicos

PT L 2310 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia 2712011

() O cromatograma natildeo deve apresentar quaisquer picos significativos (correspondentes a triacilgliceroacuteis) apoacutes a eluiccedilatildeo dos eacutesteres de esteroacuteis

Figura 2

Eacutesteres metiacutelicos eacutesteres etiacutelicos e ceras num azeite virgem

Legenda

1 ndash Eacutesteres metiacutelicos C 16

2 ndash Eacutesteres etiacutelicos C 16

3 ndash Padratildeo interno (heptadecanoato de metilo)

4 ndash Eacutesteres metiacutelicos C 18

5 ndash Eacutesteres etiacutelicos C 18

6 ndash Esqualeno

7 ndash Padratildeo interno (araquidato de laurilo)

A ndash Eacutesteres diterpeacutenicos

B ndash Ceras

C ndash Eacutesteres de esteroacuteis e eacutesteres triterpeacutenicos

PT 2712011 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia L 2311

Figura 3

Eacutesteres metiacutelicos eacutesteres etiacutelicos e ceras num azeite virgem extra

Legenda

1 ndash Padratildeo interno (heptadecanoato de metilo)

2 ndash Eacutesteres metiacutelicos C 18

3 ndash Eacutesteres etiacutelicos C 18

4 ndash Esqualeno

5 ndash Padratildeo interno (araquidato de laurilo)

A ndash Eacutesteres diterpeacutenicos

B ndash Ceras

C ndash Eacutesteres de esteroacuteis e eacutesteres triterpeacutenicos

PT L 2312 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia 2712011

Figura 4

Parte do cromatograma de um azeite virgem extra e do mesmo azeite apoacutes a adiccedilatildeo de azeite desodorizado

Legenda

1 ndash Padratildeo interno (miristato de metilo)

2 ndash Palmitato de metilo

3 ndash Palmitato de etilo

4 ndash Padratildeo interno (heptadecanoato de metilo)

5 ndash Linoleato de metilo

6 ndash Oleato de metilo

7 ndash Estearato de metilo

8 ndash Linoleato de etilo

9 ndash Oleato de etilo

10 ndash Estearato de etilo

PT 2712011 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia L 2313

Apecircndice A

Determinaccedilatildeo da velocidade linear do gaacutes

Injectar 1 a 3 μl de metano (ou propano) no cromatoacutegrafo de fase gasosa regulado para as condiccedilotildees normais de trabalho e medir o tempo necessaacuterio para o gaacutes percorrer a coluna desde o momento da injecccedilatildeo ateacute ao registo do respectivo pico (tM)

A velocidade linear expressa em cms eacute dada por LtM sendo L o comprimento da coluna expresso em centiacutemetros e tM o tempo de retenccedilatildeo expresso em segundosraquo

PT L 2314 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia 2712011

Artigo 3 o

O presente regulamento entra em vigor no terceiro dia seguinte ao da sua publicaccedilatildeo no Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia

O presente regulamento eacute aplicaacutevel a partir de 1 de Abril de 2011

O presente regulamento eacute obrigatoacuterio em todos os seus elementos e directamente aplicaacutevel em todos os Estados-Membros

Feito em Bruxelas em 24 de Janeiro de 2011

Pela Comissatildeo O Presidente

Joseacute Manuel BARROSO

PT L 232 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia 2712011

ANEXO I

laquoANEXO I

CARACTERIacuteSTICAS DOS AZEITES

Categoria

Eacutesteres metiacutelicos de aacutecidos gordos (FAME) e eacutesteres etiacutelicos de aacutecidos gordos

(FAEE)

Iacutendice de peroacutexidos

mEq O 2kg ()

Ceras mgkg

()

Monopalmitato de 2-glicerilo ()

Estigmastashydieno mgkg

(1 )

Diferenccedila entre o ECN42

determishynado por HPLC e o

ECN42 obtido por

caacutelculo teoacuterico

K 232 () K 270 () Delta-K ()

Exame organoshyleacuteptico

Mediana dos defeitos (Md) ()

Exame organoshyleacuteptico

Mediana do frutado (Mf) ()

1 Azeite virgem extra Σ FAME + FAEE le 75 mgkg ou 75 mgkg

ltΣ FAME + FAEE le 150 mgkg e (FAEE

FAME) le 15

le 08 le 20 le 250 le 09 se aacutecido palmiacuteshytico total le 14

le 010 le 02 le 250 le 022 le 001 Md = 0 Mf gt 0

le 10 se aacutecido palmiacuteshytico total gt 14

2 Azeite virgem mdash le 20 le 20 le 250 le 09 se aacutecido palmiacuteshytico total le 14

le 010 le 02 le 260 le 025 le 001 Md le 35 Mf gt 0

le 10 se aacutecido palmiacuteshytico total gt 14

3 Azeite lampante mdash gt 20 mdash le 300 (3 ) le 09 se aacutecido palmiacuteshytico total le 14

le 050 le 03 mdash mdash mdash Md gt 35 (2 ) mdash

le 11 se aacutecido palmiacuteshytico total gt 14

4 Azeite refinado mdash le 03 le 5 le 350 le 09 se aacutecido palmiacuteshytico total le 14

mdash le 03 mdash le 110 le 016 mdash mdash

le 11 se aacutecido palmiacuteshytico total gt 14

5 Azeite (constituiacutedo por azeites refinados e azeishytes virgens)

mdash le 10 le 15 le 350 le 09 se aacutecido palmiacuteshytico total le 14

mdash le 03 mdash le 090 le 015 mdash mdash

le 10 se aacutecido palmiacuteshytico total gt 14

6 Oacuteleo de bagaccedilo de azeishytona bruto

mdash mdash mdash gt 350 (4 ) le 14 mdash le 06 mdash mdash mdash mdash mdash

7 Oacuteleo de bagaccedilo de azeishytona refinado

mdash le 03 le 5 gt 350 le 14 mdash le 05 mdash le 200 le 020 mdash mdash

8 Oacuteleo de bagaccedilo de azeishytona

mdash le 10 le 15 gt 350 le 12 mdash le 05 mdash le 170 le 018 mdash mdash

(1 ) Soma dos isoacutemeros - separaacuteveis ou natildeo em coluna capilar (2 ) Ou quando a mediana dos defeitos for inferior ou igual a 35 e a mediana do frutado igual a 0 (3 ) Os azeites cujo teor de ceras esteja comprendido entre 300 mgkg e 350 mgkg satildeo considerados azeite lampante se o teor de aacutelcoois alifaacuteticos totais for inferior ou igual a 350 mgkg ou se a percentagem de eritrodiol e uvaol for inferior

ou igual a 35 (4 ) Os oacuteleos cujo teor de ceras esteja comprendido entre 300 mgkg e 350 mgkg satildeo considerados oacuteleo de bagaccedilo de azeitona bruto se o teor de aacutelcoois alifaacuteticos totais for superior a 350 mgkg e se a percentagem de eritrodiol e uvaol for

superior a 35

PT 2712011

Jornal Oficial da U

niatildeo Europeia L 233

Categoria

Teor de aacutecidos (1 ) Soma dos isoacutemeros transoleishy

cos ()

Soma dos isoacutemeros translinoshyleicos +

translinoshyleacutenicos

()

Composiccedilatildeo esteroacutelica

Esteroacuteis toshytais

(mgkg)

Eritrodiol e uvaol

() ()

Miriacutestico ()

Linoleacutenico ()

Araquiacuteshydico ()

Eicoseshynoacuteico

()

Beeacutenico ()

Lignoceacuteshyrico ()

Colesterol ()

Brassicasshyterol ()

Campesterol ()

Estigmasteshyrol ()

Betasitosshyterol () (2 )

Delta-7- estigmasshy

tenol ()

1 Azeite virgem extra le 005 le 10 le 06 le 04 le 02 le 02 le 005 le 005 le 05 le 01 le 40 lt Camp ge 930 le 05 ge 1 000 le 45

2 Azeite virgem le 005 le 10 le 06 le 04 le 02 le 02 le 005 le 005 le 05 le 01 le 40 lt Camp ge 930 le 05 ge 1 000 le 45

3 Azeite lampante le 005 le 10 le 06 le 04 le 02 le 02 le 010 le 010 le 05 le 01 le 40 mdash ge 930 le 05 ge 1 000 le 45 (3 )

4 Azeite refinado le 005 le 10 le 06 le 04 le 02 le 02 le 020 le 030 le 05 le 01 le 40 lt Camp ge 930 le 05 ge 1 000 le 45

5 Azeite (constituiacutedo por azeishytes refinados e azeites virshygens)

le 005 le 10 le 06 le 04 le 02 le 02 le 020 le 030 le 05 le 01 le 40 lt Camp ge 930 le 05 ge 1 000 le 45

6 Oacuteleo de bagaccedilo de azeitona bruto

le 005 le 10 le 06 le 04 le 03 le 02 le 020 le 010 le 05 le 02 le 40 mdash ge 930 le 05 ge 2 500 gt 45 (4 )

7 Oacuteleo de bagaccedilo de azeitona refinado

le 005 le 10 le 06 le 04 le 03 le 02 le 040 le 035 le 05 le 02 le 40 lt Camp ge 930 le 05 ge 1 800 gt 45

8 Oacuteleo de bagaccedilo de azeitona le 005 le 10 le 06 le 04 le 03 le 02 le 040 le 035 le 05 le 02 le 40 lt Camp ge 930 le 05 ge 1 600 gt 45

(1 ) Teores de outros aacutecidos gordos () palmiacutetico 75 - 200 palmitoleico 03 - 35 heptadecanoacuteico le 03 heptadecenoacuteico le 03 esteaacuterico 05 - 50 oleico 550 - 830 linoleico 35 - 210 (2 ) Soma de delta-523-estigmastadienol + clerosterol + beta-sitosterol + sitostanol + delta-5-avenasterol + delta-524-estigmastadienol (3 ) Os azeites cujo teor de ceras esteja comprendido entre 300 mgkg e 350 mgkg satildeo considerados azeite lampante se o teor de aacutelcoois alifaacuteticos totais for inferior ou igual a 350 mgkg ou se a percentagem de eritrodiol e uvaol for inferior

ou igual a 35 (4 ) Os oacuteleos cujo teor de ceras esteja comprendido entre 300 mgkg e 350 mgkg satildeo considerados oacuteleo de bagaccedilo de azeitona bruto se o teor de aacutelcoois alifaacuteticos totais for superior a 350 mgkg e se a percentagem de eritrodiol e uvaol for

superior a 35

Notas

a) Os resultados das anaacutelises devem ser expressos com um nuacutemero de algarismos significativos idecircntico ao previsto para cada caracteriacutestica Se o algarismo seguinte for superior a 4 o uacuteltimo algarismo significativo deve ser aumentado de uma unidade

b) Basta que uma das caracteriacutesticas esteja fora dos limites fixados para que o produto seja classificado noutra categoria ou declarado natildeo conforme quanto agrave sua pureza para os efeitos do presente regulamento c) O asterisco () associado a determinadas caracteriacutesticas de qualidade do azeite significa o seguinte

mdash no caso do azeite lampante que os limites correspondentes podem natildeo ser observados simultaneamente mdash no caso dos azeites virgens que a natildeo observacircncia de um dos limites correspondentes implica uma mudanccedila de categoria mantendo-se poreacutem a classificaccedilatildeo numa das categorias de azeites virgens

d) No caso dos oacuteleos de bagaccedilo de azeitona os limites relativos agraves caracteriacutesticas de qualidade assinaladas com dois asteriscos () podem natildeo ser observados simultaneamenteraquo

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Jornal Oficial da U

niatildeo Europeia 2712011

ANEXO II

laquoANEXO XX

Meacutetodo de determinaccedilatildeo do teor de ceras de eacutesteres metiacutelicos de aacutecidos gordos e de eacutesteres etiacutelicos de aacutecidos gordos por cromatografia em fase gasosa com coluna capilar

1 OBJECTIVO

Apresenta-se seguidamente o meacutetodo de determinaccedilatildeo do teor de ceras e de eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos de aacutecidos gordos de azeites e oacuteleos de bagaccedilo de azeitona As ceras e os eacutesteres alquiacutelicos satildeo separados de acordo com o respectivo nuacutemero de aacutetomos de carbono O meacutetodo eacute recomendado para distinguir azeites de oacuteleos de bagaccedilo de azeitona e para determinar a qualidade dos azeites virgem extra permitindo a detecccedilatildeo de misturas fraudulentas destes com azeites de qualidade inferior quer sejam virgens lampantes ou desodorizados

2 PRINCIacutePIO

Adiccedilatildeo ao azeite ou oacuteleo de bagaccedilo de azeitona de padrotildees internos adequados e fraccionamento por cromatoshygrafia com uma coluna de silicagel hidratada Recuperaccedilatildeo da fracccedilatildeo eluiacuteda nas condiccedilotildees de ensaio (fracccedilatildeo com polaridade inferior agrave dos triacilgliceroacuteis) e anaacutelise directa por cromatografia em fase gasosa com coluna capilar

3 APARELHOS E UTENSIacuteLIOS

31 Erlenmeyer de 25 ml

32 Coluna de vidro para cromatografia em fase liacutequida (15 mm de diacircmetro interno 30-40 cm de comprimento) munida de uma torneira adequada

33 Cromatoacutegrafo de fase gasosa utilizaacutevel com coluna capilar equipado com um sistema de injecccedilatildeo directa na coluna constituiacutedo pelos seguintes componentes

331 Forno termostaacutetico com programaccedilatildeo de temperatura

332 Injector para injecccedilatildeo directa a frio na coluna

333 Detector de ionizaccedilatildeo de chama e conversor-amplificador

334 Registador-integrador (nota 1) para utilizaccedilatildeo com o conversor-amplificador (333) com tempo de resposta natildeo superior a 1 s e velocidade do papel variaacutevel

Nota 1 Podem tambeacutem utilizar-se sistemas informatizados no caso de os dados cromatograacuteficos serem registados num compushytador pessoal

335 Coluna capilar de siacutelica fundida (para a anaacutelise das ceras e dos eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos) de 8-12 m de comprimento e 025-032 mm de diacircmetro interno com revestimento interno de fase liacutequida (nota 2) numa espessura uniforme de 010-030 μm

Nota 2 Para o fim em causa encontram-se disponiacuteveis no comeacutercio fases liacutequidas como SE52 SE54 etc

34 Microsseringa de 10 μl munida de agulha de accedilo cementado para injecccedilatildeo directa na coluna

35 Vibrador eleacutectrico

36 Evaporador rotativo

37 Mufla

38 Balanccedila analiacutetica com sensibilidade de plusmn 01 mg

39 Material de vidro de uso laboratorial corrente

PT 2712011 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia L 235

4 REAGENTES

41 Silicagel com granulometria de 60-200 μm Colocar a silicagel na mufla a 500 degC durante pelo menos 4 h Deixar arrefecer e adicionar 2 de aacutegua relativamente agrave quantidade de silicagel Agitar bem para homogeneizar e manter no exsicador durante pelo menos 12 h antes de utilizar

42 n-Hexano de qualidade cromatograacutefica ou para determinaccedilatildeo de resiacuteduos (eacute necessaacuterio comprovar o grau de pureza)

ADVERTEcircNCIA ndash Possibilidade de igniccedilatildeo dos vapores Manter ao abrigo de fontes de calor faiacutescas ou chamas descobertas Assegurar que os frascos satildeo devidamente fechados Assegurar uma ventilaccedilatildeo adequada durante o uso Evitar a acumulaccedilatildeo de vapores e eliminar todas as possiacuteveis fontes de incecircndio como dispositivos de aquecimento e dispositivos eleacutectricos que natildeo sejam constituiacutedos por materiais natildeo-inflamaacuteveis Nocivo por inalaccedilatildeo podendo causar danos agraves ceacutelulas nervosas Evitar respirar os vapores Se necessaacuterio utilizar um dispositivo de respiraccedilatildeo adequado Evitar o contacto com os olhos e a pele

43 Eacuteter etiacutelico de qualidade cromatograacutefica

ADVERTEcircNCIA ndash Altamente inflamaacutevel e moderadamente toacutexico Irritante para a pele Nocivo por inalaccedilatildeo Pode causar danos oculares Possibilidade de efeitos retardados Possibilidade de formaccedilatildeo de peroacutexidos explosivos Possibilidade de igniccedilatildeo dos vapores Manter ao abrigo de fontes de calor faiacutescas ou chamas descobertas Assegurar que os frascos satildeo devidamente fechados Assegurar uma ventilaccedilatildeo adequada durante o uso Evitar a acumulaccedilatildeo de vapores e eliminar todas as possiacuteveis fontes de incecircndio como dispositivos de aquecimento e dispositivos eleacutectricos que natildeo sejam constituiacutedos por materiais natildeo-inflamaacuteveis Natildeo evaporar agrave secura ou perto da secura A adiccedilatildeo de aacutegua ou de um agente redutor adequado reduz o risco da formaccedilatildeo de peroacutexidos Natildeo beber Evitar respirar os vapores Evitar o contacto prolongado ou repetido com a pele

44 n-Heptano de qualidade cromatograacutefica ou iso-octano

ADVERTEcircNCIA ndash Inflamaacutevel Nocivo por inalaccedilatildeo Manter afastado de fontes de calor faiacutescas ou chamas descoshybertas Assegurar que os frascos satildeo devidamente fechados Assegurar uma ventilaccedilatildeo adequada durante o uso Evitar respirar os vapores Evitar o contacto prolongado ou repetido com a pele

45 Soluccedilatildeo-padratildeo de araquidato de laurilo (nota 3) a 005 (mV) em heptano (padratildeo interno para as ceras)

Nota 3 Podem tambeacutem utilizar-se palmitato de palmitilo estearato de miristilo ou laureato de araquidilo

46 Soluccedilatildeo-padratildeo de heptadecanoato de metilo a 002 (mv) em heptano (padratildeo interno para os eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos)

47 Corante Sudan 1 (1-fenilazo-2-naftol)

48 Gaacutes vector hidrogeacutenio ou heacutelio puros de qualidade para cromatografia em fase gasosa

ADVERTEcircNCIA

Hidrogeacutenio Altamente inflamaacutevel sob pressatildeo Manter ao abrigo de fontes de calor faiacutescas chamas descobertas ou dispositivos eleacutectricos que natildeo sejam constituiacutedos por materiais natildeo-inflamaacuteveis Assegurar que a torneira da garrafa se encontra fechada quando esta natildeo estiver a ser utilizada Utilizar sempre um redutor de pressatildeo Reduzir a tensatildeo da mola redutora antes de abrir a torneira da garrafa Natildeo permanecer em frente da saiacuteda da garrafa ao abrir a torneira Assegurar uma ventilaccedilatildeo adequada durante o uso Natildeo transferir hidrogeacutenio entre garrafas Natildeo misturar gases na garrafa Assegurar que as garrafas natildeo possam cair Manter as garrafas ao abrigo da luz solar e de fontes de calor Armazenar ao abrigo da corrosatildeo Natildeo utilizar garrafas danificadas ou sem roacutetulo

Heacutelio Gaacutes comprimido a alta pressatildeo Reduz a quantidade de oxigeacutenio respiraacutevel Manter a garrafa fechada Assegurar uma ventilaccedilatildeo adequada durante o uso Natildeo aceder aos locais de armazenagem se os mesmos natildeo estiverem devidamente ventilados Utilizar sempre um redutor de pressatildeo Reduzir a tensatildeo da mola redutora antes de abrir a torneira da garrafa Natildeo transferir gaacutes entre garrafas Assegurar que as garrafas natildeo possam cair Natildeo permanecer em frente da saiacuteda da garrafa ao abrir a torneira Manter as garrafas ao abrigo da luz solar e de fontes de calor Armazenar ao abrigo da corrosatildeo Natildeo utilizar garrafas danificadas ou sem roacutetulo Natildeo inalar Utilizar apenas para fins teacutecnicos

PT L 236 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia 2712011

49 Gases auxiliares

mdash Hidrogeacutenio puro de qualidade cromatograacutefica

mdash Ar puro de qualidade para cromatografia em fase gasosa

ADVERTEcircNCIA

Ar Gaacutes comprimido a alta pressatildeo Utilizar com precauccedilatildeo na presenccedila de substacircncias combustiacuteveis dado que a temperatura de auto-igniccedilatildeo da maioria dos compostos orgacircnicos no ar eacute consideravelmente inferior a altas pressotildees Assegurar que a torneira da garrafa se encontra fechada quando esta natildeo estiver a ser utilizada Utilizar sempre um redutor de pressatildeo Reduzir a tensatildeo da mola redutora antes de abrir a torneira da garrafa Natildeo permanecer em frente da saiacuteda da garrafa ao abrir a torneira Natildeo transferir gaacutes entre garrafas Natildeo misturar gases na garrafa Assegurar que as garrafas natildeo possam cair Manter ao abrigo da luz solar e de fontes de calor Armazenar ao abrigo da corrosatildeo Natildeo utilizar garrafas danificadas ou sem roacutetulo O ar destinado a utilizaccedilotildees teacutecnicas natildeo pode ser utilizado em dispositivos de inalaccedilatildeo ou respiratoacuterios

5 PROCEDIMENTO

51 Preparaccedilatildeo da coluna cromatograacutefica

Preparar uma suspensatildeo de 15 g de silicagel (41) em n-hexano (42) e introduzi-la na coluna (32) Deixar assentar espontaneamente Completar a operaccedilatildeo por recurso a um vibrador eleacutectrico de modo a tornar mais homogeacutenea a camada cromatograacutefica Fazer passar 30 ml de n-hexano para remover eventuais impurezas Por recurso agrave balanccedila analiacutetica (38) pesar rigorosamente cerca de 500 mg da amostra no erlenmeyer de 25 ml (31) adicionando uma quantidade adequada de padratildeo interno (45) em funccedilatildeo do teor de ceras previsiacutevel (adicionar por exemplo 01 mg de araquidato de laurilo no caso dos azeites 025-050 mg no caso dos oacuteleos de bagaccedilo de azeitona e 005 mg de heptadecanoato de metilo no caso dos azeites e dos oacuteleos de bagaccedilo de azeitona (46))

Transferir a amostra preparada para a coluna cromatograacutefica com o auxiacutelio de duas porccedilotildees de 2 ml de n-hexano (42)

Deixar fluir o solvente ateacute 1 mm acima da camada de silicagel e fazer passar em seguida mistura n-hexanoeacuteter etiacutelico (991) Recolher 220 ml a um caudal aproximado de 15 gotas em cada 10 segundos (Esta fracccedilatildeo conteacutem os eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos e as ceras) (nota 4) (nota 5)

Nota 4 A mistura de n-hexanoeacuteter etiacutelico (991) deve ser preparada diariamente

Nota 5 Com o objectivo de verificar visualmente se as ceras satildeo eluiacutedas de forma adequada pode adicionar-se agrave soluccedilatildeo-amostra 100 μl de corante Sudan I a 1

O tempo de retenccedilatildeo do corante situa-se entre os tempos de retenccedilatildeo das ceras e dos triacilgliceroacuteis Assim deve suspender-se a eluiccedilatildeo quando o corante atinge a base da coluna cromatograacutefica dado todas as ceras terem entatildeo sido eluiacutedas

Evaporar as fracccedilotildees resultantes num evaporador rotativo ateacute agrave remoccedilatildeo quase total do solvente Remover os uacuteltimos 2 ml com uma corrente de azoto ligeira Recolher a fracccedilatildeo que conteacutem os eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos e diluir com 2-4 ml de n-heptano ou iso-octano

52 Anaacutelise por cromatografia em fase gasosa

521 Operaccedilotildees preliminares

Instalar a coluna no cromatoacutegrafo de fase gasosa (33) ligando uma das extremidades ao sistema de injecccedilatildeo directa na coluna e a outra extremidade ao detector Efectuar uma verificaccedilatildeo do sistema cromatograacutefico (operashycionalidade dos circuitos de gases eficiecircncia do detector e do registador etc)

Se a coluna for utilizada pela primeira vez eacute aconselhaacutevel proceder ao seu condicionamento Para o efeito passar um ligeiro fluxo gasoso pela coluna ligando o cromatoacutegrafo de seguida Aumentar a temperatura gradualmente de forma a atingir 350 degC apoacutes cerca de 4 h

PT 2712011 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia L 237

Manter esta temperatura durante pelo menos 2 h regulando seguidamente o aparelho para as condiccedilotildees de trabalho (regular o caudal de gaacutes acender a chama ligar ao registador electroacutenico - ponto 334 - regular a temperatura do forno para a coluna regular o detector etc) Registar o sinal obtido com uma sensibilidade pelo menos dupla da sensibilidade prevista para a execuccedilatildeo da anaacutelise A linha de base deve ser linear sem qualquer pico ou desvio

A ocorrecircncia de um desvio linear negativo indica que as ligaccedilotildees da coluna natildeo foram efectuadas de modo correcto a ocorrecircncia de um desvio positivo indica que a coluna natildeo foi condicionada de forma correcta

522 Escolha das condiccedilotildees de trabalho para a determinaccedilatildeo das ceras e dos eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos (nota 6)

As condiccedilotildees de trabalho satildeo em geral as seguintes

mdash Temperatura da coluna

20 degCmin 5 degCmin

80 degC no iniacutecio (1prime) 140 degC 335 degC (20prime)

mdash Temperatura do detector 350 degC

mdash Quantidade injectada 1 μl de soluccedilatildeo de n-heptano (2-4 ml)

mdash Gaacutes vector heacutelio ou hidrogeacutenio agrave velocidade linear oacuteptima para o gaacutes seleccionado (ver o apecircndice A)

mdash Sensibilidade dos instrumentos adequada ao cumprimento das condiccedilotildees atraacutes referidas

Nota 6 Atendendo agrave elevada temperatura final eacute admissiacutevel um desvio positivo mas que natildeo deveraacute exceder 10 da escala

Estas condiccedilotildees podem ser alteradas em funccedilatildeo das caracteriacutesticas da coluna e do cromatoacutegrafo tendo em vista a separaccedilatildeo total das ceras e dos eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos dos aacutecidos gordos e uma resoluccedilatildeo satisfatoacuteria dos picos (ver as figuras 2 3 e 4) bem como a obtenccedilatildeo de um tempo de retenccedilatildeo de 18 plusmn 3 minutos para o padratildeo interno (araquidato de laurilo) O pico mais representativo correspondente agraves ceras deveraacute elevar-se a pelo menos 60 da escala devendo o pico correspondente ao padratildeo interno para os eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos (heptadecanoato de metilo) atingir a totalidade da escala

Os paracircmetros de integraccedilatildeo dos picos devem ser determinados de modo a obter uma estimativa correcta das aacutereas dos picos pertinentes

53 Execuccedilatildeo da anaacutelise

Efectuar uma toma de 10 μl de soluccedilatildeo com a microsseringa de 10 μl puxando o ecircmbolo ateacute esvaziar a agulha Introduzir a agulha no sistema de injecccedilatildeo e decorridos 1-2 s injectar rapidamente a amostra Retirar cuidadoshysamente a agulha decorridos cerca de 5 s

Efectuar o registo ateacute agrave eluiccedilatildeo completa das ceras ou dos estigmastadienos consoante a fracccedilatildeo em anaacutelise

A linha de base deve satisfazer sempre as condiccedilotildees requeridas

54 Identificaccedilatildeo dos picos

Identificar os picos com base nos tempos de retenccedilatildeo comparando-os com os tempos de retenccedilatildeo de misturas conhecidas de ceras analisadas nas mesmas condiccedilotildees Os eacutesteres alquiacutelicos satildeo identificados com base em misturas de eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos dos principais aacutecidos gordos presentes no azeite (aacutecidos palmiacutetico e oleico)

A figura 1 apresenta um cromatograma caracteriacutestico das ceras de um azeite virgem As figuras 2 e 3 apresentam cromatogramas de dois azeites extra virgem vendidos a retalho num dos casos com os respectivos eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos e no outro sem eles A figura 4 apresenta cromatogramas caracteriacutesticos de um azeite virgem extra de qualidade superior e do mesmo azeite apoacutes a adiccedilatildeo de 20 de um azeite desodorizado

PT L 238 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia 2712011

55 Anaacutelise quantitativa das ceras

Com o auxiacutelio do integrador determinar a aacuterea dos picos correspondentes ao padratildeo interno (araquidato de laurilo) e aos eacutesteres alifaacuteticos C 40 -C 46

Determinar o teor total de ceras expresso em mgkg de gordura atraveacutes do somatoacuterio das vaacuterias ceras por recurso agrave seguinte foacutermula

Ceras mg=kg frac14 ethΣA x THORN m s 1 000 A s m

sendo

A x = aacuterea do pico correspondente a um determinado eacutester calculada por via informaacutetica

A s = aacuterea do pico correspondente ao padratildeo interno (araquidato de laurilo) calculada por via informaacutetica

m s = massa de padratildeo interno (araquidato de laurilo) adicionada em miligramas

m = massa da toma de amostra para a determinaccedilatildeo em gramas

551 Anaacutelise quantitativa dos eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos

Com o auxiacutelio do integrador determinar a aacuterea dos picos correspondentes ao padratildeo interno (heptadecanoato de metilo) aos eacutesteres metiacutelicos dos aacutecidos gordos C 16 e C 18 e aos eacutesteres etiacutelicos dos mesmos aacutecidos gordos

Determinar o teor de cada eacutester alquiacutelico expresso em mgkg de gordura por recurso agrave seguinte foacutermula

Ester mg=kg frac14 A x m s 1 000

A s m

sendo

A x = aacuterea do pico correspondente a um determinado eacutester C 16 ou C 18 calculada por via informaacutetica

A s = aacuterea do pico correspondente ao padratildeo interno (heptadecanoato de metilo) calculada por via informaacutetica

m s = massa de padratildeo interno (heptadecanoato de metilo) adicionada em miligramas

m = massa da toma de amostra para a determinaccedilatildeo em gramas

6 APRESENTACcedilAtildeO DOS RESULTADOS

Apresentar a soma dos teores das vaacuterias ceras de C 40 a C 46 (nota 7) em miligramas por quilograma de gordura

Apresentar a soma dos teores dos eacutesteres metiacutelicos e dos eacutesteres etiacutelicos de C 16 a C 18 bem como o total de ambos

Os resultados devem ser expressos com a aproximaccedilatildeo de 1 mgkg

Nota 7 Os componentes a quantificar dizem respeito aos picos correspondentes aos eacutesteres C 40 - C 46 com nuacutemero par de aacutetomos de carbono como se exemplifica no cromatograma das ceras de um azeite que consta da figura anexa Para fins de identificaccedilatildeo em caso de desdobramento do eacutester C 46 recomenda-se a anaacutelise da fracccedilatildeo de ceras de um oacuteleo de bagaccedilo de azeitona no qual o pico correspondente ao eacutester C 46 se distingue pela sua predominacircncia

Apresentar a relaccedilatildeo entre eacutesteres etiacutelicos e eacutesteres metiacutelicos

PT 2712011 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia L 239

Figura 1

Exemplo de cromatograma de fase gasosa da fracccedilatildeo de ceras de um azeite ()

Picos com tempos de retenccedilatildeo compreendidos entre 5 e 8 min correspondentes aos eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos dos aacutecidos gordos

Legenda

IS = Araquidato de laurilo

1 = Eacutesteres diterpeacutenicos

2+2prime = Eacutesteres C 40

3+3prime = Eacutesteres C 42

4+4prime = Eacutesteres C 44

5 = Eacutesteres C 46

6 = Eacutesteres de esteroacuteis e de aacutelcoois triterpeacutenicos

PT L 2310 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia 2712011

() O cromatograma natildeo deve apresentar quaisquer picos significativos (correspondentes a triacilgliceroacuteis) apoacutes a eluiccedilatildeo dos eacutesteres de esteroacuteis

Figura 2

Eacutesteres metiacutelicos eacutesteres etiacutelicos e ceras num azeite virgem

Legenda

1 ndash Eacutesteres metiacutelicos C 16

2 ndash Eacutesteres etiacutelicos C 16

3 ndash Padratildeo interno (heptadecanoato de metilo)

4 ndash Eacutesteres metiacutelicos C 18

5 ndash Eacutesteres etiacutelicos C 18

6 ndash Esqualeno

7 ndash Padratildeo interno (araquidato de laurilo)

A ndash Eacutesteres diterpeacutenicos

B ndash Ceras

C ndash Eacutesteres de esteroacuteis e eacutesteres triterpeacutenicos

PT 2712011 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia L 2311

Figura 3

Eacutesteres metiacutelicos eacutesteres etiacutelicos e ceras num azeite virgem extra

Legenda

1 ndash Padratildeo interno (heptadecanoato de metilo)

2 ndash Eacutesteres metiacutelicos C 18

3 ndash Eacutesteres etiacutelicos C 18

4 ndash Esqualeno

5 ndash Padratildeo interno (araquidato de laurilo)

A ndash Eacutesteres diterpeacutenicos

B ndash Ceras

C ndash Eacutesteres de esteroacuteis e eacutesteres triterpeacutenicos

PT L 2312 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia 2712011

Figura 4

Parte do cromatograma de um azeite virgem extra e do mesmo azeite apoacutes a adiccedilatildeo de azeite desodorizado

Legenda

1 ndash Padratildeo interno (miristato de metilo)

2 ndash Palmitato de metilo

3 ndash Palmitato de etilo

4 ndash Padratildeo interno (heptadecanoato de metilo)

5 ndash Linoleato de metilo

6 ndash Oleato de metilo

7 ndash Estearato de metilo

8 ndash Linoleato de etilo

9 ndash Oleato de etilo

10 ndash Estearato de etilo

PT 2712011 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia L 2313

Apecircndice A

Determinaccedilatildeo da velocidade linear do gaacutes

Injectar 1 a 3 μl de metano (ou propano) no cromatoacutegrafo de fase gasosa regulado para as condiccedilotildees normais de trabalho e medir o tempo necessaacuterio para o gaacutes percorrer a coluna desde o momento da injecccedilatildeo ateacute ao registo do respectivo pico (tM)

A velocidade linear expressa em cms eacute dada por LtM sendo L o comprimento da coluna expresso em centiacutemetros e tM o tempo de retenccedilatildeo expresso em segundosraquo

PT L 2314 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia 2712011

ANEXO I

laquoANEXO I

CARACTERIacuteSTICAS DOS AZEITES

Categoria

Eacutesteres metiacutelicos de aacutecidos gordos (FAME) e eacutesteres etiacutelicos de aacutecidos gordos

(FAEE)

Iacutendice de peroacutexidos

mEq O 2kg ()

Ceras mgkg

()

Monopalmitato de 2-glicerilo ()

Estigmastashydieno mgkg

(1 )

Diferenccedila entre o ECN42

determishynado por HPLC e o

ECN42 obtido por

caacutelculo teoacuterico

K 232 () K 270 () Delta-K ()

Exame organoshyleacuteptico

Mediana dos defeitos (Md) ()

Exame organoshyleacuteptico

Mediana do frutado (Mf) ()

1 Azeite virgem extra Σ FAME + FAEE le 75 mgkg ou 75 mgkg

ltΣ FAME + FAEE le 150 mgkg e (FAEE

FAME) le 15

le 08 le 20 le 250 le 09 se aacutecido palmiacuteshytico total le 14

le 010 le 02 le 250 le 022 le 001 Md = 0 Mf gt 0

le 10 se aacutecido palmiacuteshytico total gt 14

2 Azeite virgem mdash le 20 le 20 le 250 le 09 se aacutecido palmiacuteshytico total le 14

le 010 le 02 le 260 le 025 le 001 Md le 35 Mf gt 0

le 10 se aacutecido palmiacuteshytico total gt 14

3 Azeite lampante mdash gt 20 mdash le 300 (3 ) le 09 se aacutecido palmiacuteshytico total le 14

le 050 le 03 mdash mdash mdash Md gt 35 (2 ) mdash

le 11 se aacutecido palmiacuteshytico total gt 14

4 Azeite refinado mdash le 03 le 5 le 350 le 09 se aacutecido palmiacuteshytico total le 14

mdash le 03 mdash le 110 le 016 mdash mdash

le 11 se aacutecido palmiacuteshytico total gt 14

5 Azeite (constituiacutedo por azeites refinados e azeishytes virgens)

mdash le 10 le 15 le 350 le 09 se aacutecido palmiacuteshytico total le 14

mdash le 03 mdash le 090 le 015 mdash mdash

le 10 se aacutecido palmiacuteshytico total gt 14

6 Oacuteleo de bagaccedilo de azeishytona bruto

mdash mdash mdash gt 350 (4 ) le 14 mdash le 06 mdash mdash mdash mdash mdash

7 Oacuteleo de bagaccedilo de azeishytona refinado

mdash le 03 le 5 gt 350 le 14 mdash le 05 mdash le 200 le 020 mdash mdash

8 Oacuteleo de bagaccedilo de azeishytona

mdash le 10 le 15 gt 350 le 12 mdash le 05 mdash le 170 le 018 mdash mdash

(1 ) Soma dos isoacutemeros - separaacuteveis ou natildeo em coluna capilar (2 ) Ou quando a mediana dos defeitos for inferior ou igual a 35 e a mediana do frutado igual a 0 (3 ) Os azeites cujo teor de ceras esteja comprendido entre 300 mgkg e 350 mgkg satildeo considerados azeite lampante se o teor de aacutelcoois alifaacuteticos totais for inferior ou igual a 350 mgkg ou se a percentagem de eritrodiol e uvaol for inferior

ou igual a 35 (4 ) Os oacuteleos cujo teor de ceras esteja comprendido entre 300 mgkg e 350 mgkg satildeo considerados oacuteleo de bagaccedilo de azeitona bruto se o teor de aacutelcoois alifaacuteticos totais for superior a 350 mgkg e se a percentagem de eritrodiol e uvaol for

superior a 35

PT 2712011

Jornal Oficial da U

niatildeo Europeia L 233

Categoria

Teor de aacutecidos (1 ) Soma dos isoacutemeros transoleishy

cos ()

Soma dos isoacutemeros translinoshyleicos +

translinoshyleacutenicos

()

Composiccedilatildeo esteroacutelica

Esteroacuteis toshytais

(mgkg)

Eritrodiol e uvaol

() ()

Miriacutestico ()

Linoleacutenico ()

Araquiacuteshydico ()

Eicoseshynoacuteico

()

Beeacutenico ()

Lignoceacuteshyrico ()

Colesterol ()

Brassicasshyterol ()

Campesterol ()

Estigmasteshyrol ()

Betasitosshyterol () (2 )

Delta-7- estigmasshy

tenol ()

1 Azeite virgem extra le 005 le 10 le 06 le 04 le 02 le 02 le 005 le 005 le 05 le 01 le 40 lt Camp ge 930 le 05 ge 1 000 le 45

2 Azeite virgem le 005 le 10 le 06 le 04 le 02 le 02 le 005 le 005 le 05 le 01 le 40 lt Camp ge 930 le 05 ge 1 000 le 45

3 Azeite lampante le 005 le 10 le 06 le 04 le 02 le 02 le 010 le 010 le 05 le 01 le 40 mdash ge 930 le 05 ge 1 000 le 45 (3 )

4 Azeite refinado le 005 le 10 le 06 le 04 le 02 le 02 le 020 le 030 le 05 le 01 le 40 lt Camp ge 930 le 05 ge 1 000 le 45

5 Azeite (constituiacutedo por azeishytes refinados e azeites virshygens)

le 005 le 10 le 06 le 04 le 02 le 02 le 020 le 030 le 05 le 01 le 40 lt Camp ge 930 le 05 ge 1 000 le 45

6 Oacuteleo de bagaccedilo de azeitona bruto

le 005 le 10 le 06 le 04 le 03 le 02 le 020 le 010 le 05 le 02 le 40 mdash ge 930 le 05 ge 2 500 gt 45 (4 )

7 Oacuteleo de bagaccedilo de azeitona refinado

le 005 le 10 le 06 le 04 le 03 le 02 le 040 le 035 le 05 le 02 le 40 lt Camp ge 930 le 05 ge 1 800 gt 45

8 Oacuteleo de bagaccedilo de azeitona le 005 le 10 le 06 le 04 le 03 le 02 le 040 le 035 le 05 le 02 le 40 lt Camp ge 930 le 05 ge 1 600 gt 45

(1 ) Teores de outros aacutecidos gordos () palmiacutetico 75 - 200 palmitoleico 03 - 35 heptadecanoacuteico le 03 heptadecenoacuteico le 03 esteaacuterico 05 - 50 oleico 550 - 830 linoleico 35 - 210 (2 ) Soma de delta-523-estigmastadienol + clerosterol + beta-sitosterol + sitostanol + delta-5-avenasterol + delta-524-estigmastadienol (3 ) Os azeites cujo teor de ceras esteja comprendido entre 300 mgkg e 350 mgkg satildeo considerados azeite lampante se o teor de aacutelcoois alifaacuteticos totais for inferior ou igual a 350 mgkg ou se a percentagem de eritrodiol e uvaol for inferior

ou igual a 35 (4 ) Os oacuteleos cujo teor de ceras esteja comprendido entre 300 mgkg e 350 mgkg satildeo considerados oacuteleo de bagaccedilo de azeitona bruto se o teor de aacutelcoois alifaacuteticos totais for superior a 350 mgkg e se a percentagem de eritrodiol e uvaol for

superior a 35

Notas

a) Os resultados das anaacutelises devem ser expressos com um nuacutemero de algarismos significativos idecircntico ao previsto para cada caracteriacutestica Se o algarismo seguinte for superior a 4 o uacuteltimo algarismo significativo deve ser aumentado de uma unidade

b) Basta que uma das caracteriacutesticas esteja fora dos limites fixados para que o produto seja classificado noutra categoria ou declarado natildeo conforme quanto agrave sua pureza para os efeitos do presente regulamento c) O asterisco () associado a determinadas caracteriacutesticas de qualidade do azeite significa o seguinte

mdash no caso do azeite lampante que os limites correspondentes podem natildeo ser observados simultaneamente mdash no caso dos azeites virgens que a natildeo observacircncia de um dos limites correspondentes implica uma mudanccedila de categoria mantendo-se poreacutem a classificaccedilatildeo numa das categorias de azeites virgens

d) No caso dos oacuteleos de bagaccedilo de azeitona os limites relativos agraves caracteriacutesticas de qualidade assinaladas com dois asteriscos () podem natildeo ser observados simultaneamenteraquo

PT L 234

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niatildeo Europeia 2712011

ANEXO II

laquoANEXO XX

Meacutetodo de determinaccedilatildeo do teor de ceras de eacutesteres metiacutelicos de aacutecidos gordos e de eacutesteres etiacutelicos de aacutecidos gordos por cromatografia em fase gasosa com coluna capilar

1 OBJECTIVO

Apresenta-se seguidamente o meacutetodo de determinaccedilatildeo do teor de ceras e de eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos de aacutecidos gordos de azeites e oacuteleos de bagaccedilo de azeitona As ceras e os eacutesteres alquiacutelicos satildeo separados de acordo com o respectivo nuacutemero de aacutetomos de carbono O meacutetodo eacute recomendado para distinguir azeites de oacuteleos de bagaccedilo de azeitona e para determinar a qualidade dos azeites virgem extra permitindo a detecccedilatildeo de misturas fraudulentas destes com azeites de qualidade inferior quer sejam virgens lampantes ou desodorizados

2 PRINCIacutePIO

Adiccedilatildeo ao azeite ou oacuteleo de bagaccedilo de azeitona de padrotildees internos adequados e fraccionamento por cromatoshygrafia com uma coluna de silicagel hidratada Recuperaccedilatildeo da fracccedilatildeo eluiacuteda nas condiccedilotildees de ensaio (fracccedilatildeo com polaridade inferior agrave dos triacilgliceroacuteis) e anaacutelise directa por cromatografia em fase gasosa com coluna capilar

3 APARELHOS E UTENSIacuteLIOS

31 Erlenmeyer de 25 ml

32 Coluna de vidro para cromatografia em fase liacutequida (15 mm de diacircmetro interno 30-40 cm de comprimento) munida de uma torneira adequada

33 Cromatoacutegrafo de fase gasosa utilizaacutevel com coluna capilar equipado com um sistema de injecccedilatildeo directa na coluna constituiacutedo pelos seguintes componentes

331 Forno termostaacutetico com programaccedilatildeo de temperatura

332 Injector para injecccedilatildeo directa a frio na coluna

333 Detector de ionizaccedilatildeo de chama e conversor-amplificador

334 Registador-integrador (nota 1) para utilizaccedilatildeo com o conversor-amplificador (333) com tempo de resposta natildeo superior a 1 s e velocidade do papel variaacutevel

Nota 1 Podem tambeacutem utilizar-se sistemas informatizados no caso de os dados cromatograacuteficos serem registados num compushytador pessoal

335 Coluna capilar de siacutelica fundida (para a anaacutelise das ceras e dos eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos) de 8-12 m de comprimento e 025-032 mm de diacircmetro interno com revestimento interno de fase liacutequida (nota 2) numa espessura uniforme de 010-030 μm

Nota 2 Para o fim em causa encontram-se disponiacuteveis no comeacutercio fases liacutequidas como SE52 SE54 etc

34 Microsseringa de 10 μl munida de agulha de accedilo cementado para injecccedilatildeo directa na coluna

35 Vibrador eleacutectrico

36 Evaporador rotativo

37 Mufla

38 Balanccedila analiacutetica com sensibilidade de plusmn 01 mg

39 Material de vidro de uso laboratorial corrente

PT 2712011 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia L 235

4 REAGENTES

41 Silicagel com granulometria de 60-200 μm Colocar a silicagel na mufla a 500 degC durante pelo menos 4 h Deixar arrefecer e adicionar 2 de aacutegua relativamente agrave quantidade de silicagel Agitar bem para homogeneizar e manter no exsicador durante pelo menos 12 h antes de utilizar

42 n-Hexano de qualidade cromatograacutefica ou para determinaccedilatildeo de resiacuteduos (eacute necessaacuterio comprovar o grau de pureza)

ADVERTEcircNCIA ndash Possibilidade de igniccedilatildeo dos vapores Manter ao abrigo de fontes de calor faiacutescas ou chamas descobertas Assegurar que os frascos satildeo devidamente fechados Assegurar uma ventilaccedilatildeo adequada durante o uso Evitar a acumulaccedilatildeo de vapores e eliminar todas as possiacuteveis fontes de incecircndio como dispositivos de aquecimento e dispositivos eleacutectricos que natildeo sejam constituiacutedos por materiais natildeo-inflamaacuteveis Nocivo por inalaccedilatildeo podendo causar danos agraves ceacutelulas nervosas Evitar respirar os vapores Se necessaacuterio utilizar um dispositivo de respiraccedilatildeo adequado Evitar o contacto com os olhos e a pele

43 Eacuteter etiacutelico de qualidade cromatograacutefica

ADVERTEcircNCIA ndash Altamente inflamaacutevel e moderadamente toacutexico Irritante para a pele Nocivo por inalaccedilatildeo Pode causar danos oculares Possibilidade de efeitos retardados Possibilidade de formaccedilatildeo de peroacutexidos explosivos Possibilidade de igniccedilatildeo dos vapores Manter ao abrigo de fontes de calor faiacutescas ou chamas descobertas Assegurar que os frascos satildeo devidamente fechados Assegurar uma ventilaccedilatildeo adequada durante o uso Evitar a acumulaccedilatildeo de vapores e eliminar todas as possiacuteveis fontes de incecircndio como dispositivos de aquecimento e dispositivos eleacutectricos que natildeo sejam constituiacutedos por materiais natildeo-inflamaacuteveis Natildeo evaporar agrave secura ou perto da secura A adiccedilatildeo de aacutegua ou de um agente redutor adequado reduz o risco da formaccedilatildeo de peroacutexidos Natildeo beber Evitar respirar os vapores Evitar o contacto prolongado ou repetido com a pele

44 n-Heptano de qualidade cromatograacutefica ou iso-octano

ADVERTEcircNCIA ndash Inflamaacutevel Nocivo por inalaccedilatildeo Manter afastado de fontes de calor faiacutescas ou chamas descoshybertas Assegurar que os frascos satildeo devidamente fechados Assegurar uma ventilaccedilatildeo adequada durante o uso Evitar respirar os vapores Evitar o contacto prolongado ou repetido com a pele

45 Soluccedilatildeo-padratildeo de araquidato de laurilo (nota 3) a 005 (mV) em heptano (padratildeo interno para as ceras)

Nota 3 Podem tambeacutem utilizar-se palmitato de palmitilo estearato de miristilo ou laureato de araquidilo

46 Soluccedilatildeo-padratildeo de heptadecanoato de metilo a 002 (mv) em heptano (padratildeo interno para os eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos)

47 Corante Sudan 1 (1-fenilazo-2-naftol)

48 Gaacutes vector hidrogeacutenio ou heacutelio puros de qualidade para cromatografia em fase gasosa

ADVERTEcircNCIA

Hidrogeacutenio Altamente inflamaacutevel sob pressatildeo Manter ao abrigo de fontes de calor faiacutescas chamas descobertas ou dispositivos eleacutectricos que natildeo sejam constituiacutedos por materiais natildeo-inflamaacuteveis Assegurar que a torneira da garrafa se encontra fechada quando esta natildeo estiver a ser utilizada Utilizar sempre um redutor de pressatildeo Reduzir a tensatildeo da mola redutora antes de abrir a torneira da garrafa Natildeo permanecer em frente da saiacuteda da garrafa ao abrir a torneira Assegurar uma ventilaccedilatildeo adequada durante o uso Natildeo transferir hidrogeacutenio entre garrafas Natildeo misturar gases na garrafa Assegurar que as garrafas natildeo possam cair Manter as garrafas ao abrigo da luz solar e de fontes de calor Armazenar ao abrigo da corrosatildeo Natildeo utilizar garrafas danificadas ou sem roacutetulo

Heacutelio Gaacutes comprimido a alta pressatildeo Reduz a quantidade de oxigeacutenio respiraacutevel Manter a garrafa fechada Assegurar uma ventilaccedilatildeo adequada durante o uso Natildeo aceder aos locais de armazenagem se os mesmos natildeo estiverem devidamente ventilados Utilizar sempre um redutor de pressatildeo Reduzir a tensatildeo da mola redutora antes de abrir a torneira da garrafa Natildeo transferir gaacutes entre garrafas Assegurar que as garrafas natildeo possam cair Natildeo permanecer em frente da saiacuteda da garrafa ao abrir a torneira Manter as garrafas ao abrigo da luz solar e de fontes de calor Armazenar ao abrigo da corrosatildeo Natildeo utilizar garrafas danificadas ou sem roacutetulo Natildeo inalar Utilizar apenas para fins teacutecnicos

PT L 236 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia 2712011

49 Gases auxiliares

mdash Hidrogeacutenio puro de qualidade cromatograacutefica

mdash Ar puro de qualidade para cromatografia em fase gasosa

ADVERTEcircNCIA

Ar Gaacutes comprimido a alta pressatildeo Utilizar com precauccedilatildeo na presenccedila de substacircncias combustiacuteveis dado que a temperatura de auto-igniccedilatildeo da maioria dos compostos orgacircnicos no ar eacute consideravelmente inferior a altas pressotildees Assegurar que a torneira da garrafa se encontra fechada quando esta natildeo estiver a ser utilizada Utilizar sempre um redutor de pressatildeo Reduzir a tensatildeo da mola redutora antes de abrir a torneira da garrafa Natildeo permanecer em frente da saiacuteda da garrafa ao abrir a torneira Natildeo transferir gaacutes entre garrafas Natildeo misturar gases na garrafa Assegurar que as garrafas natildeo possam cair Manter ao abrigo da luz solar e de fontes de calor Armazenar ao abrigo da corrosatildeo Natildeo utilizar garrafas danificadas ou sem roacutetulo O ar destinado a utilizaccedilotildees teacutecnicas natildeo pode ser utilizado em dispositivos de inalaccedilatildeo ou respiratoacuterios

5 PROCEDIMENTO

51 Preparaccedilatildeo da coluna cromatograacutefica

Preparar uma suspensatildeo de 15 g de silicagel (41) em n-hexano (42) e introduzi-la na coluna (32) Deixar assentar espontaneamente Completar a operaccedilatildeo por recurso a um vibrador eleacutectrico de modo a tornar mais homogeacutenea a camada cromatograacutefica Fazer passar 30 ml de n-hexano para remover eventuais impurezas Por recurso agrave balanccedila analiacutetica (38) pesar rigorosamente cerca de 500 mg da amostra no erlenmeyer de 25 ml (31) adicionando uma quantidade adequada de padratildeo interno (45) em funccedilatildeo do teor de ceras previsiacutevel (adicionar por exemplo 01 mg de araquidato de laurilo no caso dos azeites 025-050 mg no caso dos oacuteleos de bagaccedilo de azeitona e 005 mg de heptadecanoato de metilo no caso dos azeites e dos oacuteleos de bagaccedilo de azeitona (46))

Transferir a amostra preparada para a coluna cromatograacutefica com o auxiacutelio de duas porccedilotildees de 2 ml de n-hexano (42)

Deixar fluir o solvente ateacute 1 mm acima da camada de silicagel e fazer passar em seguida mistura n-hexanoeacuteter etiacutelico (991) Recolher 220 ml a um caudal aproximado de 15 gotas em cada 10 segundos (Esta fracccedilatildeo conteacutem os eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos e as ceras) (nota 4) (nota 5)

Nota 4 A mistura de n-hexanoeacuteter etiacutelico (991) deve ser preparada diariamente

Nota 5 Com o objectivo de verificar visualmente se as ceras satildeo eluiacutedas de forma adequada pode adicionar-se agrave soluccedilatildeo-amostra 100 μl de corante Sudan I a 1

O tempo de retenccedilatildeo do corante situa-se entre os tempos de retenccedilatildeo das ceras e dos triacilgliceroacuteis Assim deve suspender-se a eluiccedilatildeo quando o corante atinge a base da coluna cromatograacutefica dado todas as ceras terem entatildeo sido eluiacutedas

Evaporar as fracccedilotildees resultantes num evaporador rotativo ateacute agrave remoccedilatildeo quase total do solvente Remover os uacuteltimos 2 ml com uma corrente de azoto ligeira Recolher a fracccedilatildeo que conteacutem os eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos e diluir com 2-4 ml de n-heptano ou iso-octano

52 Anaacutelise por cromatografia em fase gasosa

521 Operaccedilotildees preliminares

Instalar a coluna no cromatoacutegrafo de fase gasosa (33) ligando uma das extremidades ao sistema de injecccedilatildeo directa na coluna e a outra extremidade ao detector Efectuar uma verificaccedilatildeo do sistema cromatograacutefico (operashycionalidade dos circuitos de gases eficiecircncia do detector e do registador etc)

Se a coluna for utilizada pela primeira vez eacute aconselhaacutevel proceder ao seu condicionamento Para o efeito passar um ligeiro fluxo gasoso pela coluna ligando o cromatoacutegrafo de seguida Aumentar a temperatura gradualmente de forma a atingir 350 degC apoacutes cerca de 4 h

PT 2712011 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia L 237

Manter esta temperatura durante pelo menos 2 h regulando seguidamente o aparelho para as condiccedilotildees de trabalho (regular o caudal de gaacutes acender a chama ligar ao registador electroacutenico - ponto 334 - regular a temperatura do forno para a coluna regular o detector etc) Registar o sinal obtido com uma sensibilidade pelo menos dupla da sensibilidade prevista para a execuccedilatildeo da anaacutelise A linha de base deve ser linear sem qualquer pico ou desvio

A ocorrecircncia de um desvio linear negativo indica que as ligaccedilotildees da coluna natildeo foram efectuadas de modo correcto a ocorrecircncia de um desvio positivo indica que a coluna natildeo foi condicionada de forma correcta

522 Escolha das condiccedilotildees de trabalho para a determinaccedilatildeo das ceras e dos eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos (nota 6)

As condiccedilotildees de trabalho satildeo em geral as seguintes

mdash Temperatura da coluna

20 degCmin 5 degCmin

80 degC no iniacutecio (1prime) 140 degC 335 degC (20prime)

mdash Temperatura do detector 350 degC

mdash Quantidade injectada 1 μl de soluccedilatildeo de n-heptano (2-4 ml)

mdash Gaacutes vector heacutelio ou hidrogeacutenio agrave velocidade linear oacuteptima para o gaacutes seleccionado (ver o apecircndice A)

mdash Sensibilidade dos instrumentos adequada ao cumprimento das condiccedilotildees atraacutes referidas

Nota 6 Atendendo agrave elevada temperatura final eacute admissiacutevel um desvio positivo mas que natildeo deveraacute exceder 10 da escala

Estas condiccedilotildees podem ser alteradas em funccedilatildeo das caracteriacutesticas da coluna e do cromatoacutegrafo tendo em vista a separaccedilatildeo total das ceras e dos eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos dos aacutecidos gordos e uma resoluccedilatildeo satisfatoacuteria dos picos (ver as figuras 2 3 e 4) bem como a obtenccedilatildeo de um tempo de retenccedilatildeo de 18 plusmn 3 minutos para o padratildeo interno (araquidato de laurilo) O pico mais representativo correspondente agraves ceras deveraacute elevar-se a pelo menos 60 da escala devendo o pico correspondente ao padratildeo interno para os eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos (heptadecanoato de metilo) atingir a totalidade da escala

Os paracircmetros de integraccedilatildeo dos picos devem ser determinados de modo a obter uma estimativa correcta das aacutereas dos picos pertinentes

53 Execuccedilatildeo da anaacutelise

Efectuar uma toma de 10 μl de soluccedilatildeo com a microsseringa de 10 μl puxando o ecircmbolo ateacute esvaziar a agulha Introduzir a agulha no sistema de injecccedilatildeo e decorridos 1-2 s injectar rapidamente a amostra Retirar cuidadoshysamente a agulha decorridos cerca de 5 s

Efectuar o registo ateacute agrave eluiccedilatildeo completa das ceras ou dos estigmastadienos consoante a fracccedilatildeo em anaacutelise

A linha de base deve satisfazer sempre as condiccedilotildees requeridas

54 Identificaccedilatildeo dos picos

Identificar os picos com base nos tempos de retenccedilatildeo comparando-os com os tempos de retenccedilatildeo de misturas conhecidas de ceras analisadas nas mesmas condiccedilotildees Os eacutesteres alquiacutelicos satildeo identificados com base em misturas de eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos dos principais aacutecidos gordos presentes no azeite (aacutecidos palmiacutetico e oleico)

A figura 1 apresenta um cromatograma caracteriacutestico das ceras de um azeite virgem As figuras 2 e 3 apresentam cromatogramas de dois azeites extra virgem vendidos a retalho num dos casos com os respectivos eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos e no outro sem eles A figura 4 apresenta cromatogramas caracteriacutesticos de um azeite virgem extra de qualidade superior e do mesmo azeite apoacutes a adiccedilatildeo de 20 de um azeite desodorizado

PT L 238 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia 2712011

55 Anaacutelise quantitativa das ceras

Com o auxiacutelio do integrador determinar a aacuterea dos picos correspondentes ao padratildeo interno (araquidato de laurilo) e aos eacutesteres alifaacuteticos C 40 -C 46

Determinar o teor total de ceras expresso em mgkg de gordura atraveacutes do somatoacuterio das vaacuterias ceras por recurso agrave seguinte foacutermula

Ceras mg=kg frac14 ethΣA x THORN m s 1 000 A s m

sendo

A x = aacuterea do pico correspondente a um determinado eacutester calculada por via informaacutetica

A s = aacuterea do pico correspondente ao padratildeo interno (araquidato de laurilo) calculada por via informaacutetica

m s = massa de padratildeo interno (araquidato de laurilo) adicionada em miligramas

m = massa da toma de amostra para a determinaccedilatildeo em gramas

551 Anaacutelise quantitativa dos eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos

Com o auxiacutelio do integrador determinar a aacuterea dos picos correspondentes ao padratildeo interno (heptadecanoato de metilo) aos eacutesteres metiacutelicos dos aacutecidos gordos C 16 e C 18 e aos eacutesteres etiacutelicos dos mesmos aacutecidos gordos

Determinar o teor de cada eacutester alquiacutelico expresso em mgkg de gordura por recurso agrave seguinte foacutermula

Ester mg=kg frac14 A x m s 1 000

A s m

sendo

A x = aacuterea do pico correspondente a um determinado eacutester C 16 ou C 18 calculada por via informaacutetica

A s = aacuterea do pico correspondente ao padratildeo interno (heptadecanoato de metilo) calculada por via informaacutetica

m s = massa de padratildeo interno (heptadecanoato de metilo) adicionada em miligramas

m = massa da toma de amostra para a determinaccedilatildeo em gramas

6 APRESENTACcedilAtildeO DOS RESULTADOS

Apresentar a soma dos teores das vaacuterias ceras de C 40 a C 46 (nota 7) em miligramas por quilograma de gordura

Apresentar a soma dos teores dos eacutesteres metiacutelicos e dos eacutesteres etiacutelicos de C 16 a C 18 bem como o total de ambos

Os resultados devem ser expressos com a aproximaccedilatildeo de 1 mgkg

Nota 7 Os componentes a quantificar dizem respeito aos picos correspondentes aos eacutesteres C 40 - C 46 com nuacutemero par de aacutetomos de carbono como se exemplifica no cromatograma das ceras de um azeite que consta da figura anexa Para fins de identificaccedilatildeo em caso de desdobramento do eacutester C 46 recomenda-se a anaacutelise da fracccedilatildeo de ceras de um oacuteleo de bagaccedilo de azeitona no qual o pico correspondente ao eacutester C 46 se distingue pela sua predominacircncia

Apresentar a relaccedilatildeo entre eacutesteres etiacutelicos e eacutesteres metiacutelicos

PT 2712011 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia L 239

Figura 1

Exemplo de cromatograma de fase gasosa da fracccedilatildeo de ceras de um azeite ()

Picos com tempos de retenccedilatildeo compreendidos entre 5 e 8 min correspondentes aos eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos dos aacutecidos gordos

Legenda

IS = Araquidato de laurilo

1 = Eacutesteres diterpeacutenicos

2+2prime = Eacutesteres C 40

3+3prime = Eacutesteres C 42

4+4prime = Eacutesteres C 44

5 = Eacutesteres C 46

6 = Eacutesteres de esteroacuteis e de aacutelcoois triterpeacutenicos

PT L 2310 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia 2712011

() O cromatograma natildeo deve apresentar quaisquer picos significativos (correspondentes a triacilgliceroacuteis) apoacutes a eluiccedilatildeo dos eacutesteres de esteroacuteis

Figura 2

Eacutesteres metiacutelicos eacutesteres etiacutelicos e ceras num azeite virgem

Legenda

1 ndash Eacutesteres metiacutelicos C 16

2 ndash Eacutesteres etiacutelicos C 16

3 ndash Padratildeo interno (heptadecanoato de metilo)

4 ndash Eacutesteres metiacutelicos C 18

5 ndash Eacutesteres etiacutelicos C 18

6 ndash Esqualeno

7 ndash Padratildeo interno (araquidato de laurilo)

A ndash Eacutesteres diterpeacutenicos

B ndash Ceras

C ndash Eacutesteres de esteroacuteis e eacutesteres triterpeacutenicos

PT 2712011 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia L 2311

Figura 3

Eacutesteres metiacutelicos eacutesteres etiacutelicos e ceras num azeite virgem extra

Legenda

1 ndash Padratildeo interno (heptadecanoato de metilo)

2 ndash Eacutesteres metiacutelicos C 18

3 ndash Eacutesteres etiacutelicos C 18

4 ndash Esqualeno

5 ndash Padratildeo interno (araquidato de laurilo)

A ndash Eacutesteres diterpeacutenicos

B ndash Ceras

C ndash Eacutesteres de esteroacuteis e eacutesteres triterpeacutenicos

PT L 2312 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia 2712011

Figura 4

Parte do cromatograma de um azeite virgem extra e do mesmo azeite apoacutes a adiccedilatildeo de azeite desodorizado

Legenda

1 ndash Padratildeo interno (miristato de metilo)

2 ndash Palmitato de metilo

3 ndash Palmitato de etilo

4 ndash Padratildeo interno (heptadecanoato de metilo)

5 ndash Linoleato de metilo

6 ndash Oleato de metilo

7 ndash Estearato de metilo

8 ndash Linoleato de etilo

9 ndash Oleato de etilo

10 ndash Estearato de etilo

PT 2712011 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia L 2313

Apecircndice A

Determinaccedilatildeo da velocidade linear do gaacutes

Injectar 1 a 3 μl de metano (ou propano) no cromatoacutegrafo de fase gasosa regulado para as condiccedilotildees normais de trabalho e medir o tempo necessaacuterio para o gaacutes percorrer a coluna desde o momento da injecccedilatildeo ateacute ao registo do respectivo pico (tM)

A velocidade linear expressa em cms eacute dada por LtM sendo L o comprimento da coluna expresso em centiacutemetros e tM o tempo de retenccedilatildeo expresso em segundosraquo

PT L 2314 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia 2712011

Categoria

Teor de aacutecidos (1 ) Soma dos isoacutemeros transoleishy

cos ()

Soma dos isoacutemeros translinoshyleicos +

translinoshyleacutenicos

()

Composiccedilatildeo esteroacutelica

Esteroacuteis toshytais

(mgkg)

Eritrodiol e uvaol

() ()

Miriacutestico ()

Linoleacutenico ()

Araquiacuteshydico ()

Eicoseshynoacuteico

()

Beeacutenico ()

Lignoceacuteshyrico ()

Colesterol ()

Brassicasshyterol ()

Campesterol ()

Estigmasteshyrol ()

Betasitosshyterol () (2 )

Delta-7- estigmasshy

tenol ()

1 Azeite virgem extra le 005 le 10 le 06 le 04 le 02 le 02 le 005 le 005 le 05 le 01 le 40 lt Camp ge 930 le 05 ge 1 000 le 45

2 Azeite virgem le 005 le 10 le 06 le 04 le 02 le 02 le 005 le 005 le 05 le 01 le 40 lt Camp ge 930 le 05 ge 1 000 le 45

3 Azeite lampante le 005 le 10 le 06 le 04 le 02 le 02 le 010 le 010 le 05 le 01 le 40 mdash ge 930 le 05 ge 1 000 le 45 (3 )

4 Azeite refinado le 005 le 10 le 06 le 04 le 02 le 02 le 020 le 030 le 05 le 01 le 40 lt Camp ge 930 le 05 ge 1 000 le 45

5 Azeite (constituiacutedo por azeishytes refinados e azeites virshygens)

le 005 le 10 le 06 le 04 le 02 le 02 le 020 le 030 le 05 le 01 le 40 lt Camp ge 930 le 05 ge 1 000 le 45

6 Oacuteleo de bagaccedilo de azeitona bruto

le 005 le 10 le 06 le 04 le 03 le 02 le 020 le 010 le 05 le 02 le 40 mdash ge 930 le 05 ge 2 500 gt 45 (4 )

7 Oacuteleo de bagaccedilo de azeitona refinado

le 005 le 10 le 06 le 04 le 03 le 02 le 040 le 035 le 05 le 02 le 40 lt Camp ge 930 le 05 ge 1 800 gt 45

8 Oacuteleo de bagaccedilo de azeitona le 005 le 10 le 06 le 04 le 03 le 02 le 040 le 035 le 05 le 02 le 40 lt Camp ge 930 le 05 ge 1 600 gt 45

(1 ) Teores de outros aacutecidos gordos () palmiacutetico 75 - 200 palmitoleico 03 - 35 heptadecanoacuteico le 03 heptadecenoacuteico le 03 esteaacuterico 05 - 50 oleico 550 - 830 linoleico 35 - 210 (2 ) Soma de delta-523-estigmastadienol + clerosterol + beta-sitosterol + sitostanol + delta-5-avenasterol + delta-524-estigmastadienol (3 ) Os azeites cujo teor de ceras esteja comprendido entre 300 mgkg e 350 mgkg satildeo considerados azeite lampante se o teor de aacutelcoois alifaacuteticos totais for inferior ou igual a 350 mgkg ou se a percentagem de eritrodiol e uvaol for inferior

ou igual a 35 (4 ) Os oacuteleos cujo teor de ceras esteja comprendido entre 300 mgkg e 350 mgkg satildeo considerados oacuteleo de bagaccedilo de azeitona bruto se o teor de aacutelcoois alifaacuteticos totais for superior a 350 mgkg e se a percentagem de eritrodiol e uvaol for

superior a 35

Notas

a) Os resultados das anaacutelises devem ser expressos com um nuacutemero de algarismos significativos idecircntico ao previsto para cada caracteriacutestica Se o algarismo seguinte for superior a 4 o uacuteltimo algarismo significativo deve ser aumentado de uma unidade

b) Basta que uma das caracteriacutesticas esteja fora dos limites fixados para que o produto seja classificado noutra categoria ou declarado natildeo conforme quanto agrave sua pureza para os efeitos do presente regulamento c) O asterisco () associado a determinadas caracteriacutesticas de qualidade do azeite significa o seguinte

mdash no caso do azeite lampante que os limites correspondentes podem natildeo ser observados simultaneamente mdash no caso dos azeites virgens que a natildeo observacircncia de um dos limites correspondentes implica uma mudanccedila de categoria mantendo-se poreacutem a classificaccedilatildeo numa das categorias de azeites virgens

d) No caso dos oacuteleos de bagaccedilo de azeitona os limites relativos agraves caracteriacutesticas de qualidade assinaladas com dois asteriscos () podem natildeo ser observados simultaneamenteraquo

PT L 234

Jornal Oficial da U

niatildeo Europeia 2712011

ANEXO II

laquoANEXO XX

Meacutetodo de determinaccedilatildeo do teor de ceras de eacutesteres metiacutelicos de aacutecidos gordos e de eacutesteres etiacutelicos de aacutecidos gordos por cromatografia em fase gasosa com coluna capilar

1 OBJECTIVO

Apresenta-se seguidamente o meacutetodo de determinaccedilatildeo do teor de ceras e de eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos de aacutecidos gordos de azeites e oacuteleos de bagaccedilo de azeitona As ceras e os eacutesteres alquiacutelicos satildeo separados de acordo com o respectivo nuacutemero de aacutetomos de carbono O meacutetodo eacute recomendado para distinguir azeites de oacuteleos de bagaccedilo de azeitona e para determinar a qualidade dos azeites virgem extra permitindo a detecccedilatildeo de misturas fraudulentas destes com azeites de qualidade inferior quer sejam virgens lampantes ou desodorizados

2 PRINCIacutePIO

Adiccedilatildeo ao azeite ou oacuteleo de bagaccedilo de azeitona de padrotildees internos adequados e fraccionamento por cromatoshygrafia com uma coluna de silicagel hidratada Recuperaccedilatildeo da fracccedilatildeo eluiacuteda nas condiccedilotildees de ensaio (fracccedilatildeo com polaridade inferior agrave dos triacilgliceroacuteis) e anaacutelise directa por cromatografia em fase gasosa com coluna capilar

3 APARELHOS E UTENSIacuteLIOS

31 Erlenmeyer de 25 ml

32 Coluna de vidro para cromatografia em fase liacutequida (15 mm de diacircmetro interno 30-40 cm de comprimento) munida de uma torneira adequada

33 Cromatoacutegrafo de fase gasosa utilizaacutevel com coluna capilar equipado com um sistema de injecccedilatildeo directa na coluna constituiacutedo pelos seguintes componentes

331 Forno termostaacutetico com programaccedilatildeo de temperatura

332 Injector para injecccedilatildeo directa a frio na coluna

333 Detector de ionizaccedilatildeo de chama e conversor-amplificador

334 Registador-integrador (nota 1) para utilizaccedilatildeo com o conversor-amplificador (333) com tempo de resposta natildeo superior a 1 s e velocidade do papel variaacutevel

Nota 1 Podem tambeacutem utilizar-se sistemas informatizados no caso de os dados cromatograacuteficos serem registados num compushytador pessoal

335 Coluna capilar de siacutelica fundida (para a anaacutelise das ceras e dos eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos) de 8-12 m de comprimento e 025-032 mm de diacircmetro interno com revestimento interno de fase liacutequida (nota 2) numa espessura uniforme de 010-030 μm

Nota 2 Para o fim em causa encontram-se disponiacuteveis no comeacutercio fases liacutequidas como SE52 SE54 etc

34 Microsseringa de 10 μl munida de agulha de accedilo cementado para injecccedilatildeo directa na coluna

35 Vibrador eleacutectrico

36 Evaporador rotativo

37 Mufla

38 Balanccedila analiacutetica com sensibilidade de plusmn 01 mg

39 Material de vidro de uso laboratorial corrente

PT 2712011 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia L 235

4 REAGENTES

41 Silicagel com granulometria de 60-200 μm Colocar a silicagel na mufla a 500 degC durante pelo menos 4 h Deixar arrefecer e adicionar 2 de aacutegua relativamente agrave quantidade de silicagel Agitar bem para homogeneizar e manter no exsicador durante pelo menos 12 h antes de utilizar

42 n-Hexano de qualidade cromatograacutefica ou para determinaccedilatildeo de resiacuteduos (eacute necessaacuterio comprovar o grau de pureza)

ADVERTEcircNCIA ndash Possibilidade de igniccedilatildeo dos vapores Manter ao abrigo de fontes de calor faiacutescas ou chamas descobertas Assegurar que os frascos satildeo devidamente fechados Assegurar uma ventilaccedilatildeo adequada durante o uso Evitar a acumulaccedilatildeo de vapores e eliminar todas as possiacuteveis fontes de incecircndio como dispositivos de aquecimento e dispositivos eleacutectricos que natildeo sejam constituiacutedos por materiais natildeo-inflamaacuteveis Nocivo por inalaccedilatildeo podendo causar danos agraves ceacutelulas nervosas Evitar respirar os vapores Se necessaacuterio utilizar um dispositivo de respiraccedilatildeo adequado Evitar o contacto com os olhos e a pele

43 Eacuteter etiacutelico de qualidade cromatograacutefica

ADVERTEcircNCIA ndash Altamente inflamaacutevel e moderadamente toacutexico Irritante para a pele Nocivo por inalaccedilatildeo Pode causar danos oculares Possibilidade de efeitos retardados Possibilidade de formaccedilatildeo de peroacutexidos explosivos Possibilidade de igniccedilatildeo dos vapores Manter ao abrigo de fontes de calor faiacutescas ou chamas descobertas Assegurar que os frascos satildeo devidamente fechados Assegurar uma ventilaccedilatildeo adequada durante o uso Evitar a acumulaccedilatildeo de vapores e eliminar todas as possiacuteveis fontes de incecircndio como dispositivos de aquecimento e dispositivos eleacutectricos que natildeo sejam constituiacutedos por materiais natildeo-inflamaacuteveis Natildeo evaporar agrave secura ou perto da secura A adiccedilatildeo de aacutegua ou de um agente redutor adequado reduz o risco da formaccedilatildeo de peroacutexidos Natildeo beber Evitar respirar os vapores Evitar o contacto prolongado ou repetido com a pele

44 n-Heptano de qualidade cromatograacutefica ou iso-octano

ADVERTEcircNCIA ndash Inflamaacutevel Nocivo por inalaccedilatildeo Manter afastado de fontes de calor faiacutescas ou chamas descoshybertas Assegurar que os frascos satildeo devidamente fechados Assegurar uma ventilaccedilatildeo adequada durante o uso Evitar respirar os vapores Evitar o contacto prolongado ou repetido com a pele

45 Soluccedilatildeo-padratildeo de araquidato de laurilo (nota 3) a 005 (mV) em heptano (padratildeo interno para as ceras)

Nota 3 Podem tambeacutem utilizar-se palmitato de palmitilo estearato de miristilo ou laureato de araquidilo

46 Soluccedilatildeo-padratildeo de heptadecanoato de metilo a 002 (mv) em heptano (padratildeo interno para os eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos)

47 Corante Sudan 1 (1-fenilazo-2-naftol)

48 Gaacutes vector hidrogeacutenio ou heacutelio puros de qualidade para cromatografia em fase gasosa

ADVERTEcircNCIA

Hidrogeacutenio Altamente inflamaacutevel sob pressatildeo Manter ao abrigo de fontes de calor faiacutescas chamas descobertas ou dispositivos eleacutectricos que natildeo sejam constituiacutedos por materiais natildeo-inflamaacuteveis Assegurar que a torneira da garrafa se encontra fechada quando esta natildeo estiver a ser utilizada Utilizar sempre um redutor de pressatildeo Reduzir a tensatildeo da mola redutora antes de abrir a torneira da garrafa Natildeo permanecer em frente da saiacuteda da garrafa ao abrir a torneira Assegurar uma ventilaccedilatildeo adequada durante o uso Natildeo transferir hidrogeacutenio entre garrafas Natildeo misturar gases na garrafa Assegurar que as garrafas natildeo possam cair Manter as garrafas ao abrigo da luz solar e de fontes de calor Armazenar ao abrigo da corrosatildeo Natildeo utilizar garrafas danificadas ou sem roacutetulo

Heacutelio Gaacutes comprimido a alta pressatildeo Reduz a quantidade de oxigeacutenio respiraacutevel Manter a garrafa fechada Assegurar uma ventilaccedilatildeo adequada durante o uso Natildeo aceder aos locais de armazenagem se os mesmos natildeo estiverem devidamente ventilados Utilizar sempre um redutor de pressatildeo Reduzir a tensatildeo da mola redutora antes de abrir a torneira da garrafa Natildeo transferir gaacutes entre garrafas Assegurar que as garrafas natildeo possam cair Natildeo permanecer em frente da saiacuteda da garrafa ao abrir a torneira Manter as garrafas ao abrigo da luz solar e de fontes de calor Armazenar ao abrigo da corrosatildeo Natildeo utilizar garrafas danificadas ou sem roacutetulo Natildeo inalar Utilizar apenas para fins teacutecnicos

PT L 236 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia 2712011

49 Gases auxiliares

mdash Hidrogeacutenio puro de qualidade cromatograacutefica

mdash Ar puro de qualidade para cromatografia em fase gasosa

ADVERTEcircNCIA

Ar Gaacutes comprimido a alta pressatildeo Utilizar com precauccedilatildeo na presenccedila de substacircncias combustiacuteveis dado que a temperatura de auto-igniccedilatildeo da maioria dos compostos orgacircnicos no ar eacute consideravelmente inferior a altas pressotildees Assegurar que a torneira da garrafa se encontra fechada quando esta natildeo estiver a ser utilizada Utilizar sempre um redutor de pressatildeo Reduzir a tensatildeo da mola redutora antes de abrir a torneira da garrafa Natildeo permanecer em frente da saiacuteda da garrafa ao abrir a torneira Natildeo transferir gaacutes entre garrafas Natildeo misturar gases na garrafa Assegurar que as garrafas natildeo possam cair Manter ao abrigo da luz solar e de fontes de calor Armazenar ao abrigo da corrosatildeo Natildeo utilizar garrafas danificadas ou sem roacutetulo O ar destinado a utilizaccedilotildees teacutecnicas natildeo pode ser utilizado em dispositivos de inalaccedilatildeo ou respiratoacuterios

5 PROCEDIMENTO

51 Preparaccedilatildeo da coluna cromatograacutefica

Preparar uma suspensatildeo de 15 g de silicagel (41) em n-hexano (42) e introduzi-la na coluna (32) Deixar assentar espontaneamente Completar a operaccedilatildeo por recurso a um vibrador eleacutectrico de modo a tornar mais homogeacutenea a camada cromatograacutefica Fazer passar 30 ml de n-hexano para remover eventuais impurezas Por recurso agrave balanccedila analiacutetica (38) pesar rigorosamente cerca de 500 mg da amostra no erlenmeyer de 25 ml (31) adicionando uma quantidade adequada de padratildeo interno (45) em funccedilatildeo do teor de ceras previsiacutevel (adicionar por exemplo 01 mg de araquidato de laurilo no caso dos azeites 025-050 mg no caso dos oacuteleos de bagaccedilo de azeitona e 005 mg de heptadecanoato de metilo no caso dos azeites e dos oacuteleos de bagaccedilo de azeitona (46))

Transferir a amostra preparada para a coluna cromatograacutefica com o auxiacutelio de duas porccedilotildees de 2 ml de n-hexano (42)

Deixar fluir o solvente ateacute 1 mm acima da camada de silicagel e fazer passar em seguida mistura n-hexanoeacuteter etiacutelico (991) Recolher 220 ml a um caudal aproximado de 15 gotas em cada 10 segundos (Esta fracccedilatildeo conteacutem os eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos e as ceras) (nota 4) (nota 5)

Nota 4 A mistura de n-hexanoeacuteter etiacutelico (991) deve ser preparada diariamente

Nota 5 Com o objectivo de verificar visualmente se as ceras satildeo eluiacutedas de forma adequada pode adicionar-se agrave soluccedilatildeo-amostra 100 μl de corante Sudan I a 1

O tempo de retenccedilatildeo do corante situa-se entre os tempos de retenccedilatildeo das ceras e dos triacilgliceroacuteis Assim deve suspender-se a eluiccedilatildeo quando o corante atinge a base da coluna cromatograacutefica dado todas as ceras terem entatildeo sido eluiacutedas

Evaporar as fracccedilotildees resultantes num evaporador rotativo ateacute agrave remoccedilatildeo quase total do solvente Remover os uacuteltimos 2 ml com uma corrente de azoto ligeira Recolher a fracccedilatildeo que conteacutem os eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos e diluir com 2-4 ml de n-heptano ou iso-octano

52 Anaacutelise por cromatografia em fase gasosa

521 Operaccedilotildees preliminares

Instalar a coluna no cromatoacutegrafo de fase gasosa (33) ligando uma das extremidades ao sistema de injecccedilatildeo directa na coluna e a outra extremidade ao detector Efectuar uma verificaccedilatildeo do sistema cromatograacutefico (operashycionalidade dos circuitos de gases eficiecircncia do detector e do registador etc)

Se a coluna for utilizada pela primeira vez eacute aconselhaacutevel proceder ao seu condicionamento Para o efeito passar um ligeiro fluxo gasoso pela coluna ligando o cromatoacutegrafo de seguida Aumentar a temperatura gradualmente de forma a atingir 350 degC apoacutes cerca de 4 h

PT 2712011 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia L 237

Manter esta temperatura durante pelo menos 2 h regulando seguidamente o aparelho para as condiccedilotildees de trabalho (regular o caudal de gaacutes acender a chama ligar ao registador electroacutenico - ponto 334 - regular a temperatura do forno para a coluna regular o detector etc) Registar o sinal obtido com uma sensibilidade pelo menos dupla da sensibilidade prevista para a execuccedilatildeo da anaacutelise A linha de base deve ser linear sem qualquer pico ou desvio

A ocorrecircncia de um desvio linear negativo indica que as ligaccedilotildees da coluna natildeo foram efectuadas de modo correcto a ocorrecircncia de um desvio positivo indica que a coluna natildeo foi condicionada de forma correcta

522 Escolha das condiccedilotildees de trabalho para a determinaccedilatildeo das ceras e dos eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos (nota 6)

As condiccedilotildees de trabalho satildeo em geral as seguintes

mdash Temperatura da coluna

20 degCmin 5 degCmin

80 degC no iniacutecio (1prime) 140 degC 335 degC (20prime)

mdash Temperatura do detector 350 degC

mdash Quantidade injectada 1 μl de soluccedilatildeo de n-heptano (2-4 ml)

mdash Gaacutes vector heacutelio ou hidrogeacutenio agrave velocidade linear oacuteptima para o gaacutes seleccionado (ver o apecircndice A)

mdash Sensibilidade dos instrumentos adequada ao cumprimento das condiccedilotildees atraacutes referidas

Nota 6 Atendendo agrave elevada temperatura final eacute admissiacutevel um desvio positivo mas que natildeo deveraacute exceder 10 da escala

Estas condiccedilotildees podem ser alteradas em funccedilatildeo das caracteriacutesticas da coluna e do cromatoacutegrafo tendo em vista a separaccedilatildeo total das ceras e dos eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos dos aacutecidos gordos e uma resoluccedilatildeo satisfatoacuteria dos picos (ver as figuras 2 3 e 4) bem como a obtenccedilatildeo de um tempo de retenccedilatildeo de 18 plusmn 3 minutos para o padratildeo interno (araquidato de laurilo) O pico mais representativo correspondente agraves ceras deveraacute elevar-se a pelo menos 60 da escala devendo o pico correspondente ao padratildeo interno para os eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos (heptadecanoato de metilo) atingir a totalidade da escala

Os paracircmetros de integraccedilatildeo dos picos devem ser determinados de modo a obter uma estimativa correcta das aacutereas dos picos pertinentes

53 Execuccedilatildeo da anaacutelise

Efectuar uma toma de 10 μl de soluccedilatildeo com a microsseringa de 10 μl puxando o ecircmbolo ateacute esvaziar a agulha Introduzir a agulha no sistema de injecccedilatildeo e decorridos 1-2 s injectar rapidamente a amostra Retirar cuidadoshysamente a agulha decorridos cerca de 5 s

Efectuar o registo ateacute agrave eluiccedilatildeo completa das ceras ou dos estigmastadienos consoante a fracccedilatildeo em anaacutelise

A linha de base deve satisfazer sempre as condiccedilotildees requeridas

54 Identificaccedilatildeo dos picos

Identificar os picos com base nos tempos de retenccedilatildeo comparando-os com os tempos de retenccedilatildeo de misturas conhecidas de ceras analisadas nas mesmas condiccedilotildees Os eacutesteres alquiacutelicos satildeo identificados com base em misturas de eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos dos principais aacutecidos gordos presentes no azeite (aacutecidos palmiacutetico e oleico)

A figura 1 apresenta um cromatograma caracteriacutestico das ceras de um azeite virgem As figuras 2 e 3 apresentam cromatogramas de dois azeites extra virgem vendidos a retalho num dos casos com os respectivos eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos e no outro sem eles A figura 4 apresenta cromatogramas caracteriacutesticos de um azeite virgem extra de qualidade superior e do mesmo azeite apoacutes a adiccedilatildeo de 20 de um azeite desodorizado

PT L 238 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia 2712011

55 Anaacutelise quantitativa das ceras

Com o auxiacutelio do integrador determinar a aacuterea dos picos correspondentes ao padratildeo interno (araquidato de laurilo) e aos eacutesteres alifaacuteticos C 40 -C 46

Determinar o teor total de ceras expresso em mgkg de gordura atraveacutes do somatoacuterio das vaacuterias ceras por recurso agrave seguinte foacutermula

Ceras mg=kg frac14 ethΣA x THORN m s 1 000 A s m

sendo

A x = aacuterea do pico correspondente a um determinado eacutester calculada por via informaacutetica

A s = aacuterea do pico correspondente ao padratildeo interno (araquidato de laurilo) calculada por via informaacutetica

m s = massa de padratildeo interno (araquidato de laurilo) adicionada em miligramas

m = massa da toma de amostra para a determinaccedilatildeo em gramas

551 Anaacutelise quantitativa dos eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos

Com o auxiacutelio do integrador determinar a aacuterea dos picos correspondentes ao padratildeo interno (heptadecanoato de metilo) aos eacutesteres metiacutelicos dos aacutecidos gordos C 16 e C 18 e aos eacutesteres etiacutelicos dos mesmos aacutecidos gordos

Determinar o teor de cada eacutester alquiacutelico expresso em mgkg de gordura por recurso agrave seguinte foacutermula

Ester mg=kg frac14 A x m s 1 000

A s m

sendo

A x = aacuterea do pico correspondente a um determinado eacutester C 16 ou C 18 calculada por via informaacutetica

A s = aacuterea do pico correspondente ao padratildeo interno (heptadecanoato de metilo) calculada por via informaacutetica

m s = massa de padratildeo interno (heptadecanoato de metilo) adicionada em miligramas

m = massa da toma de amostra para a determinaccedilatildeo em gramas

6 APRESENTACcedilAtildeO DOS RESULTADOS

Apresentar a soma dos teores das vaacuterias ceras de C 40 a C 46 (nota 7) em miligramas por quilograma de gordura

Apresentar a soma dos teores dos eacutesteres metiacutelicos e dos eacutesteres etiacutelicos de C 16 a C 18 bem como o total de ambos

Os resultados devem ser expressos com a aproximaccedilatildeo de 1 mgkg

Nota 7 Os componentes a quantificar dizem respeito aos picos correspondentes aos eacutesteres C 40 - C 46 com nuacutemero par de aacutetomos de carbono como se exemplifica no cromatograma das ceras de um azeite que consta da figura anexa Para fins de identificaccedilatildeo em caso de desdobramento do eacutester C 46 recomenda-se a anaacutelise da fracccedilatildeo de ceras de um oacuteleo de bagaccedilo de azeitona no qual o pico correspondente ao eacutester C 46 se distingue pela sua predominacircncia

Apresentar a relaccedilatildeo entre eacutesteres etiacutelicos e eacutesteres metiacutelicos

PT 2712011 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia L 239

Figura 1

Exemplo de cromatograma de fase gasosa da fracccedilatildeo de ceras de um azeite ()

Picos com tempos de retenccedilatildeo compreendidos entre 5 e 8 min correspondentes aos eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos dos aacutecidos gordos

Legenda

IS = Araquidato de laurilo

1 = Eacutesteres diterpeacutenicos

2+2prime = Eacutesteres C 40

3+3prime = Eacutesteres C 42

4+4prime = Eacutesteres C 44

5 = Eacutesteres C 46

6 = Eacutesteres de esteroacuteis e de aacutelcoois triterpeacutenicos

PT L 2310 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia 2712011

() O cromatograma natildeo deve apresentar quaisquer picos significativos (correspondentes a triacilgliceroacuteis) apoacutes a eluiccedilatildeo dos eacutesteres de esteroacuteis

Figura 2

Eacutesteres metiacutelicos eacutesteres etiacutelicos e ceras num azeite virgem

Legenda

1 ndash Eacutesteres metiacutelicos C 16

2 ndash Eacutesteres etiacutelicos C 16

3 ndash Padratildeo interno (heptadecanoato de metilo)

4 ndash Eacutesteres metiacutelicos C 18

5 ndash Eacutesteres etiacutelicos C 18

6 ndash Esqualeno

7 ndash Padratildeo interno (araquidato de laurilo)

A ndash Eacutesteres diterpeacutenicos

B ndash Ceras

C ndash Eacutesteres de esteroacuteis e eacutesteres triterpeacutenicos

PT 2712011 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia L 2311

Figura 3

Eacutesteres metiacutelicos eacutesteres etiacutelicos e ceras num azeite virgem extra

Legenda

1 ndash Padratildeo interno (heptadecanoato de metilo)

2 ndash Eacutesteres metiacutelicos C 18

3 ndash Eacutesteres etiacutelicos C 18

4 ndash Esqualeno

5 ndash Padratildeo interno (araquidato de laurilo)

A ndash Eacutesteres diterpeacutenicos

B ndash Ceras

C ndash Eacutesteres de esteroacuteis e eacutesteres triterpeacutenicos

PT L 2312 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia 2712011

Figura 4

Parte do cromatograma de um azeite virgem extra e do mesmo azeite apoacutes a adiccedilatildeo de azeite desodorizado

Legenda

1 ndash Padratildeo interno (miristato de metilo)

2 ndash Palmitato de metilo

3 ndash Palmitato de etilo

4 ndash Padratildeo interno (heptadecanoato de metilo)

5 ndash Linoleato de metilo

6 ndash Oleato de metilo

7 ndash Estearato de metilo

8 ndash Linoleato de etilo

9 ndash Oleato de etilo

10 ndash Estearato de etilo

PT 2712011 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia L 2313

Apecircndice A

Determinaccedilatildeo da velocidade linear do gaacutes

Injectar 1 a 3 μl de metano (ou propano) no cromatoacutegrafo de fase gasosa regulado para as condiccedilotildees normais de trabalho e medir o tempo necessaacuterio para o gaacutes percorrer a coluna desde o momento da injecccedilatildeo ateacute ao registo do respectivo pico (tM)

A velocidade linear expressa em cms eacute dada por LtM sendo L o comprimento da coluna expresso em centiacutemetros e tM o tempo de retenccedilatildeo expresso em segundosraquo

PT L 2314 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia 2712011

ANEXO II

laquoANEXO XX

Meacutetodo de determinaccedilatildeo do teor de ceras de eacutesteres metiacutelicos de aacutecidos gordos e de eacutesteres etiacutelicos de aacutecidos gordos por cromatografia em fase gasosa com coluna capilar

1 OBJECTIVO

Apresenta-se seguidamente o meacutetodo de determinaccedilatildeo do teor de ceras e de eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos de aacutecidos gordos de azeites e oacuteleos de bagaccedilo de azeitona As ceras e os eacutesteres alquiacutelicos satildeo separados de acordo com o respectivo nuacutemero de aacutetomos de carbono O meacutetodo eacute recomendado para distinguir azeites de oacuteleos de bagaccedilo de azeitona e para determinar a qualidade dos azeites virgem extra permitindo a detecccedilatildeo de misturas fraudulentas destes com azeites de qualidade inferior quer sejam virgens lampantes ou desodorizados

2 PRINCIacutePIO

Adiccedilatildeo ao azeite ou oacuteleo de bagaccedilo de azeitona de padrotildees internos adequados e fraccionamento por cromatoshygrafia com uma coluna de silicagel hidratada Recuperaccedilatildeo da fracccedilatildeo eluiacuteda nas condiccedilotildees de ensaio (fracccedilatildeo com polaridade inferior agrave dos triacilgliceroacuteis) e anaacutelise directa por cromatografia em fase gasosa com coluna capilar

3 APARELHOS E UTENSIacuteLIOS

31 Erlenmeyer de 25 ml

32 Coluna de vidro para cromatografia em fase liacutequida (15 mm de diacircmetro interno 30-40 cm de comprimento) munida de uma torneira adequada

33 Cromatoacutegrafo de fase gasosa utilizaacutevel com coluna capilar equipado com um sistema de injecccedilatildeo directa na coluna constituiacutedo pelos seguintes componentes

331 Forno termostaacutetico com programaccedilatildeo de temperatura

332 Injector para injecccedilatildeo directa a frio na coluna

333 Detector de ionizaccedilatildeo de chama e conversor-amplificador

334 Registador-integrador (nota 1) para utilizaccedilatildeo com o conversor-amplificador (333) com tempo de resposta natildeo superior a 1 s e velocidade do papel variaacutevel

Nota 1 Podem tambeacutem utilizar-se sistemas informatizados no caso de os dados cromatograacuteficos serem registados num compushytador pessoal

335 Coluna capilar de siacutelica fundida (para a anaacutelise das ceras e dos eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos) de 8-12 m de comprimento e 025-032 mm de diacircmetro interno com revestimento interno de fase liacutequida (nota 2) numa espessura uniforme de 010-030 μm

Nota 2 Para o fim em causa encontram-se disponiacuteveis no comeacutercio fases liacutequidas como SE52 SE54 etc

34 Microsseringa de 10 μl munida de agulha de accedilo cementado para injecccedilatildeo directa na coluna

35 Vibrador eleacutectrico

36 Evaporador rotativo

37 Mufla

38 Balanccedila analiacutetica com sensibilidade de plusmn 01 mg

39 Material de vidro de uso laboratorial corrente

PT 2712011 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia L 235

4 REAGENTES

41 Silicagel com granulometria de 60-200 μm Colocar a silicagel na mufla a 500 degC durante pelo menos 4 h Deixar arrefecer e adicionar 2 de aacutegua relativamente agrave quantidade de silicagel Agitar bem para homogeneizar e manter no exsicador durante pelo menos 12 h antes de utilizar

42 n-Hexano de qualidade cromatograacutefica ou para determinaccedilatildeo de resiacuteduos (eacute necessaacuterio comprovar o grau de pureza)

ADVERTEcircNCIA ndash Possibilidade de igniccedilatildeo dos vapores Manter ao abrigo de fontes de calor faiacutescas ou chamas descobertas Assegurar que os frascos satildeo devidamente fechados Assegurar uma ventilaccedilatildeo adequada durante o uso Evitar a acumulaccedilatildeo de vapores e eliminar todas as possiacuteveis fontes de incecircndio como dispositivos de aquecimento e dispositivos eleacutectricos que natildeo sejam constituiacutedos por materiais natildeo-inflamaacuteveis Nocivo por inalaccedilatildeo podendo causar danos agraves ceacutelulas nervosas Evitar respirar os vapores Se necessaacuterio utilizar um dispositivo de respiraccedilatildeo adequado Evitar o contacto com os olhos e a pele

43 Eacuteter etiacutelico de qualidade cromatograacutefica

ADVERTEcircNCIA ndash Altamente inflamaacutevel e moderadamente toacutexico Irritante para a pele Nocivo por inalaccedilatildeo Pode causar danos oculares Possibilidade de efeitos retardados Possibilidade de formaccedilatildeo de peroacutexidos explosivos Possibilidade de igniccedilatildeo dos vapores Manter ao abrigo de fontes de calor faiacutescas ou chamas descobertas Assegurar que os frascos satildeo devidamente fechados Assegurar uma ventilaccedilatildeo adequada durante o uso Evitar a acumulaccedilatildeo de vapores e eliminar todas as possiacuteveis fontes de incecircndio como dispositivos de aquecimento e dispositivos eleacutectricos que natildeo sejam constituiacutedos por materiais natildeo-inflamaacuteveis Natildeo evaporar agrave secura ou perto da secura A adiccedilatildeo de aacutegua ou de um agente redutor adequado reduz o risco da formaccedilatildeo de peroacutexidos Natildeo beber Evitar respirar os vapores Evitar o contacto prolongado ou repetido com a pele

44 n-Heptano de qualidade cromatograacutefica ou iso-octano

ADVERTEcircNCIA ndash Inflamaacutevel Nocivo por inalaccedilatildeo Manter afastado de fontes de calor faiacutescas ou chamas descoshybertas Assegurar que os frascos satildeo devidamente fechados Assegurar uma ventilaccedilatildeo adequada durante o uso Evitar respirar os vapores Evitar o contacto prolongado ou repetido com a pele

45 Soluccedilatildeo-padratildeo de araquidato de laurilo (nota 3) a 005 (mV) em heptano (padratildeo interno para as ceras)

Nota 3 Podem tambeacutem utilizar-se palmitato de palmitilo estearato de miristilo ou laureato de araquidilo

46 Soluccedilatildeo-padratildeo de heptadecanoato de metilo a 002 (mv) em heptano (padratildeo interno para os eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos)

47 Corante Sudan 1 (1-fenilazo-2-naftol)

48 Gaacutes vector hidrogeacutenio ou heacutelio puros de qualidade para cromatografia em fase gasosa

ADVERTEcircNCIA

Hidrogeacutenio Altamente inflamaacutevel sob pressatildeo Manter ao abrigo de fontes de calor faiacutescas chamas descobertas ou dispositivos eleacutectricos que natildeo sejam constituiacutedos por materiais natildeo-inflamaacuteveis Assegurar que a torneira da garrafa se encontra fechada quando esta natildeo estiver a ser utilizada Utilizar sempre um redutor de pressatildeo Reduzir a tensatildeo da mola redutora antes de abrir a torneira da garrafa Natildeo permanecer em frente da saiacuteda da garrafa ao abrir a torneira Assegurar uma ventilaccedilatildeo adequada durante o uso Natildeo transferir hidrogeacutenio entre garrafas Natildeo misturar gases na garrafa Assegurar que as garrafas natildeo possam cair Manter as garrafas ao abrigo da luz solar e de fontes de calor Armazenar ao abrigo da corrosatildeo Natildeo utilizar garrafas danificadas ou sem roacutetulo

Heacutelio Gaacutes comprimido a alta pressatildeo Reduz a quantidade de oxigeacutenio respiraacutevel Manter a garrafa fechada Assegurar uma ventilaccedilatildeo adequada durante o uso Natildeo aceder aos locais de armazenagem se os mesmos natildeo estiverem devidamente ventilados Utilizar sempre um redutor de pressatildeo Reduzir a tensatildeo da mola redutora antes de abrir a torneira da garrafa Natildeo transferir gaacutes entre garrafas Assegurar que as garrafas natildeo possam cair Natildeo permanecer em frente da saiacuteda da garrafa ao abrir a torneira Manter as garrafas ao abrigo da luz solar e de fontes de calor Armazenar ao abrigo da corrosatildeo Natildeo utilizar garrafas danificadas ou sem roacutetulo Natildeo inalar Utilizar apenas para fins teacutecnicos

PT L 236 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia 2712011

49 Gases auxiliares

mdash Hidrogeacutenio puro de qualidade cromatograacutefica

mdash Ar puro de qualidade para cromatografia em fase gasosa

ADVERTEcircNCIA

Ar Gaacutes comprimido a alta pressatildeo Utilizar com precauccedilatildeo na presenccedila de substacircncias combustiacuteveis dado que a temperatura de auto-igniccedilatildeo da maioria dos compostos orgacircnicos no ar eacute consideravelmente inferior a altas pressotildees Assegurar que a torneira da garrafa se encontra fechada quando esta natildeo estiver a ser utilizada Utilizar sempre um redutor de pressatildeo Reduzir a tensatildeo da mola redutora antes de abrir a torneira da garrafa Natildeo permanecer em frente da saiacuteda da garrafa ao abrir a torneira Natildeo transferir gaacutes entre garrafas Natildeo misturar gases na garrafa Assegurar que as garrafas natildeo possam cair Manter ao abrigo da luz solar e de fontes de calor Armazenar ao abrigo da corrosatildeo Natildeo utilizar garrafas danificadas ou sem roacutetulo O ar destinado a utilizaccedilotildees teacutecnicas natildeo pode ser utilizado em dispositivos de inalaccedilatildeo ou respiratoacuterios

5 PROCEDIMENTO

51 Preparaccedilatildeo da coluna cromatograacutefica

Preparar uma suspensatildeo de 15 g de silicagel (41) em n-hexano (42) e introduzi-la na coluna (32) Deixar assentar espontaneamente Completar a operaccedilatildeo por recurso a um vibrador eleacutectrico de modo a tornar mais homogeacutenea a camada cromatograacutefica Fazer passar 30 ml de n-hexano para remover eventuais impurezas Por recurso agrave balanccedila analiacutetica (38) pesar rigorosamente cerca de 500 mg da amostra no erlenmeyer de 25 ml (31) adicionando uma quantidade adequada de padratildeo interno (45) em funccedilatildeo do teor de ceras previsiacutevel (adicionar por exemplo 01 mg de araquidato de laurilo no caso dos azeites 025-050 mg no caso dos oacuteleos de bagaccedilo de azeitona e 005 mg de heptadecanoato de metilo no caso dos azeites e dos oacuteleos de bagaccedilo de azeitona (46))

Transferir a amostra preparada para a coluna cromatograacutefica com o auxiacutelio de duas porccedilotildees de 2 ml de n-hexano (42)

Deixar fluir o solvente ateacute 1 mm acima da camada de silicagel e fazer passar em seguida mistura n-hexanoeacuteter etiacutelico (991) Recolher 220 ml a um caudal aproximado de 15 gotas em cada 10 segundos (Esta fracccedilatildeo conteacutem os eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos e as ceras) (nota 4) (nota 5)

Nota 4 A mistura de n-hexanoeacuteter etiacutelico (991) deve ser preparada diariamente

Nota 5 Com o objectivo de verificar visualmente se as ceras satildeo eluiacutedas de forma adequada pode adicionar-se agrave soluccedilatildeo-amostra 100 μl de corante Sudan I a 1

O tempo de retenccedilatildeo do corante situa-se entre os tempos de retenccedilatildeo das ceras e dos triacilgliceroacuteis Assim deve suspender-se a eluiccedilatildeo quando o corante atinge a base da coluna cromatograacutefica dado todas as ceras terem entatildeo sido eluiacutedas

Evaporar as fracccedilotildees resultantes num evaporador rotativo ateacute agrave remoccedilatildeo quase total do solvente Remover os uacuteltimos 2 ml com uma corrente de azoto ligeira Recolher a fracccedilatildeo que conteacutem os eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos e diluir com 2-4 ml de n-heptano ou iso-octano

52 Anaacutelise por cromatografia em fase gasosa

521 Operaccedilotildees preliminares

Instalar a coluna no cromatoacutegrafo de fase gasosa (33) ligando uma das extremidades ao sistema de injecccedilatildeo directa na coluna e a outra extremidade ao detector Efectuar uma verificaccedilatildeo do sistema cromatograacutefico (operashycionalidade dos circuitos de gases eficiecircncia do detector e do registador etc)

Se a coluna for utilizada pela primeira vez eacute aconselhaacutevel proceder ao seu condicionamento Para o efeito passar um ligeiro fluxo gasoso pela coluna ligando o cromatoacutegrafo de seguida Aumentar a temperatura gradualmente de forma a atingir 350 degC apoacutes cerca de 4 h

PT 2712011 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia L 237

Manter esta temperatura durante pelo menos 2 h regulando seguidamente o aparelho para as condiccedilotildees de trabalho (regular o caudal de gaacutes acender a chama ligar ao registador electroacutenico - ponto 334 - regular a temperatura do forno para a coluna regular o detector etc) Registar o sinal obtido com uma sensibilidade pelo menos dupla da sensibilidade prevista para a execuccedilatildeo da anaacutelise A linha de base deve ser linear sem qualquer pico ou desvio

A ocorrecircncia de um desvio linear negativo indica que as ligaccedilotildees da coluna natildeo foram efectuadas de modo correcto a ocorrecircncia de um desvio positivo indica que a coluna natildeo foi condicionada de forma correcta

522 Escolha das condiccedilotildees de trabalho para a determinaccedilatildeo das ceras e dos eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos (nota 6)

As condiccedilotildees de trabalho satildeo em geral as seguintes

mdash Temperatura da coluna

20 degCmin 5 degCmin

80 degC no iniacutecio (1prime) 140 degC 335 degC (20prime)

mdash Temperatura do detector 350 degC

mdash Quantidade injectada 1 μl de soluccedilatildeo de n-heptano (2-4 ml)

mdash Gaacutes vector heacutelio ou hidrogeacutenio agrave velocidade linear oacuteptima para o gaacutes seleccionado (ver o apecircndice A)

mdash Sensibilidade dos instrumentos adequada ao cumprimento das condiccedilotildees atraacutes referidas

Nota 6 Atendendo agrave elevada temperatura final eacute admissiacutevel um desvio positivo mas que natildeo deveraacute exceder 10 da escala

Estas condiccedilotildees podem ser alteradas em funccedilatildeo das caracteriacutesticas da coluna e do cromatoacutegrafo tendo em vista a separaccedilatildeo total das ceras e dos eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos dos aacutecidos gordos e uma resoluccedilatildeo satisfatoacuteria dos picos (ver as figuras 2 3 e 4) bem como a obtenccedilatildeo de um tempo de retenccedilatildeo de 18 plusmn 3 minutos para o padratildeo interno (araquidato de laurilo) O pico mais representativo correspondente agraves ceras deveraacute elevar-se a pelo menos 60 da escala devendo o pico correspondente ao padratildeo interno para os eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos (heptadecanoato de metilo) atingir a totalidade da escala

Os paracircmetros de integraccedilatildeo dos picos devem ser determinados de modo a obter uma estimativa correcta das aacutereas dos picos pertinentes

53 Execuccedilatildeo da anaacutelise

Efectuar uma toma de 10 μl de soluccedilatildeo com a microsseringa de 10 μl puxando o ecircmbolo ateacute esvaziar a agulha Introduzir a agulha no sistema de injecccedilatildeo e decorridos 1-2 s injectar rapidamente a amostra Retirar cuidadoshysamente a agulha decorridos cerca de 5 s

Efectuar o registo ateacute agrave eluiccedilatildeo completa das ceras ou dos estigmastadienos consoante a fracccedilatildeo em anaacutelise

A linha de base deve satisfazer sempre as condiccedilotildees requeridas

54 Identificaccedilatildeo dos picos

Identificar os picos com base nos tempos de retenccedilatildeo comparando-os com os tempos de retenccedilatildeo de misturas conhecidas de ceras analisadas nas mesmas condiccedilotildees Os eacutesteres alquiacutelicos satildeo identificados com base em misturas de eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos dos principais aacutecidos gordos presentes no azeite (aacutecidos palmiacutetico e oleico)

A figura 1 apresenta um cromatograma caracteriacutestico das ceras de um azeite virgem As figuras 2 e 3 apresentam cromatogramas de dois azeites extra virgem vendidos a retalho num dos casos com os respectivos eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos e no outro sem eles A figura 4 apresenta cromatogramas caracteriacutesticos de um azeite virgem extra de qualidade superior e do mesmo azeite apoacutes a adiccedilatildeo de 20 de um azeite desodorizado

PT L 238 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia 2712011

55 Anaacutelise quantitativa das ceras

Com o auxiacutelio do integrador determinar a aacuterea dos picos correspondentes ao padratildeo interno (araquidato de laurilo) e aos eacutesteres alifaacuteticos C 40 -C 46

Determinar o teor total de ceras expresso em mgkg de gordura atraveacutes do somatoacuterio das vaacuterias ceras por recurso agrave seguinte foacutermula

Ceras mg=kg frac14 ethΣA x THORN m s 1 000 A s m

sendo

A x = aacuterea do pico correspondente a um determinado eacutester calculada por via informaacutetica

A s = aacuterea do pico correspondente ao padratildeo interno (araquidato de laurilo) calculada por via informaacutetica

m s = massa de padratildeo interno (araquidato de laurilo) adicionada em miligramas

m = massa da toma de amostra para a determinaccedilatildeo em gramas

551 Anaacutelise quantitativa dos eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos

Com o auxiacutelio do integrador determinar a aacuterea dos picos correspondentes ao padratildeo interno (heptadecanoato de metilo) aos eacutesteres metiacutelicos dos aacutecidos gordos C 16 e C 18 e aos eacutesteres etiacutelicos dos mesmos aacutecidos gordos

Determinar o teor de cada eacutester alquiacutelico expresso em mgkg de gordura por recurso agrave seguinte foacutermula

Ester mg=kg frac14 A x m s 1 000

A s m

sendo

A x = aacuterea do pico correspondente a um determinado eacutester C 16 ou C 18 calculada por via informaacutetica

A s = aacuterea do pico correspondente ao padratildeo interno (heptadecanoato de metilo) calculada por via informaacutetica

m s = massa de padratildeo interno (heptadecanoato de metilo) adicionada em miligramas

m = massa da toma de amostra para a determinaccedilatildeo em gramas

6 APRESENTACcedilAtildeO DOS RESULTADOS

Apresentar a soma dos teores das vaacuterias ceras de C 40 a C 46 (nota 7) em miligramas por quilograma de gordura

Apresentar a soma dos teores dos eacutesteres metiacutelicos e dos eacutesteres etiacutelicos de C 16 a C 18 bem como o total de ambos

Os resultados devem ser expressos com a aproximaccedilatildeo de 1 mgkg

Nota 7 Os componentes a quantificar dizem respeito aos picos correspondentes aos eacutesteres C 40 - C 46 com nuacutemero par de aacutetomos de carbono como se exemplifica no cromatograma das ceras de um azeite que consta da figura anexa Para fins de identificaccedilatildeo em caso de desdobramento do eacutester C 46 recomenda-se a anaacutelise da fracccedilatildeo de ceras de um oacuteleo de bagaccedilo de azeitona no qual o pico correspondente ao eacutester C 46 se distingue pela sua predominacircncia

Apresentar a relaccedilatildeo entre eacutesteres etiacutelicos e eacutesteres metiacutelicos

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Figura 1

Exemplo de cromatograma de fase gasosa da fracccedilatildeo de ceras de um azeite ()

Picos com tempos de retenccedilatildeo compreendidos entre 5 e 8 min correspondentes aos eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos dos aacutecidos gordos

Legenda

IS = Araquidato de laurilo

1 = Eacutesteres diterpeacutenicos

2+2prime = Eacutesteres C 40

3+3prime = Eacutesteres C 42

4+4prime = Eacutesteres C 44

5 = Eacutesteres C 46

6 = Eacutesteres de esteroacuteis e de aacutelcoois triterpeacutenicos

PT L 2310 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia 2712011

() O cromatograma natildeo deve apresentar quaisquer picos significativos (correspondentes a triacilgliceroacuteis) apoacutes a eluiccedilatildeo dos eacutesteres de esteroacuteis

Figura 2

Eacutesteres metiacutelicos eacutesteres etiacutelicos e ceras num azeite virgem

Legenda

1 ndash Eacutesteres metiacutelicos C 16

2 ndash Eacutesteres etiacutelicos C 16

3 ndash Padratildeo interno (heptadecanoato de metilo)

4 ndash Eacutesteres metiacutelicos C 18

5 ndash Eacutesteres etiacutelicos C 18

6 ndash Esqualeno

7 ndash Padratildeo interno (araquidato de laurilo)

A ndash Eacutesteres diterpeacutenicos

B ndash Ceras

C ndash Eacutesteres de esteroacuteis e eacutesteres triterpeacutenicos

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Figura 3

Eacutesteres metiacutelicos eacutesteres etiacutelicos e ceras num azeite virgem extra

Legenda

1 ndash Padratildeo interno (heptadecanoato de metilo)

2 ndash Eacutesteres metiacutelicos C 18

3 ndash Eacutesteres etiacutelicos C 18

4 ndash Esqualeno

5 ndash Padratildeo interno (araquidato de laurilo)

A ndash Eacutesteres diterpeacutenicos

B ndash Ceras

C ndash Eacutesteres de esteroacuteis e eacutesteres triterpeacutenicos

PT L 2312 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia 2712011

Figura 4

Parte do cromatograma de um azeite virgem extra e do mesmo azeite apoacutes a adiccedilatildeo de azeite desodorizado

Legenda

1 ndash Padratildeo interno (miristato de metilo)

2 ndash Palmitato de metilo

3 ndash Palmitato de etilo

4 ndash Padratildeo interno (heptadecanoato de metilo)

5 ndash Linoleato de metilo

6 ndash Oleato de metilo

7 ndash Estearato de metilo

8 ndash Linoleato de etilo

9 ndash Oleato de etilo

10 ndash Estearato de etilo

PT 2712011 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia L 2313

Apecircndice A

Determinaccedilatildeo da velocidade linear do gaacutes

Injectar 1 a 3 μl de metano (ou propano) no cromatoacutegrafo de fase gasosa regulado para as condiccedilotildees normais de trabalho e medir o tempo necessaacuterio para o gaacutes percorrer a coluna desde o momento da injecccedilatildeo ateacute ao registo do respectivo pico (tM)

A velocidade linear expressa em cms eacute dada por LtM sendo L o comprimento da coluna expresso em centiacutemetros e tM o tempo de retenccedilatildeo expresso em segundosraquo

PT L 2314 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia 2712011

4 REAGENTES

41 Silicagel com granulometria de 60-200 μm Colocar a silicagel na mufla a 500 degC durante pelo menos 4 h Deixar arrefecer e adicionar 2 de aacutegua relativamente agrave quantidade de silicagel Agitar bem para homogeneizar e manter no exsicador durante pelo menos 12 h antes de utilizar

42 n-Hexano de qualidade cromatograacutefica ou para determinaccedilatildeo de resiacuteduos (eacute necessaacuterio comprovar o grau de pureza)

ADVERTEcircNCIA ndash Possibilidade de igniccedilatildeo dos vapores Manter ao abrigo de fontes de calor faiacutescas ou chamas descobertas Assegurar que os frascos satildeo devidamente fechados Assegurar uma ventilaccedilatildeo adequada durante o uso Evitar a acumulaccedilatildeo de vapores e eliminar todas as possiacuteveis fontes de incecircndio como dispositivos de aquecimento e dispositivos eleacutectricos que natildeo sejam constituiacutedos por materiais natildeo-inflamaacuteveis Nocivo por inalaccedilatildeo podendo causar danos agraves ceacutelulas nervosas Evitar respirar os vapores Se necessaacuterio utilizar um dispositivo de respiraccedilatildeo adequado Evitar o contacto com os olhos e a pele

43 Eacuteter etiacutelico de qualidade cromatograacutefica

ADVERTEcircNCIA ndash Altamente inflamaacutevel e moderadamente toacutexico Irritante para a pele Nocivo por inalaccedilatildeo Pode causar danos oculares Possibilidade de efeitos retardados Possibilidade de formaccedilatildeo de peroacutexidos explosivos Possibilidade de igniccedilatildeo dos vapores Manter ao abrigo de fontes de calor faiacutescas ou chamas descobertas Assegurar que os frascos satildeo devidamente fechados Assegurar uma ventilaccedilatildeo adequada durante o uso Evitar a acumulaccedilatildeo de vapores e eliminar todas as possiacuteveis fontes de incecircndio como dispositivos de aquecimento e dispositivos eleacutectricos que natildeo sejam constituiacutedos por materiais natildeo-inflamaacuteveis Natildeo evaporar agrave secura ou perto da secura A adiccedilatildeo de aacutegua ou de um agente redutor adequado reduz o risco da formaccedilatildeo de peroacutexidos Natildeo beber Evitar respirar os vapores Evitar o contacto prolongado ou repetido com a pele

44 n-Heptano de qualidade cromatograacutefica ou iso-octano

ADVERTEcircNCIA ndash Inflamaacutevel Nocivo por inalaccedilatildeo Manter afastado de fontes de calor faiacutescas ou chamas descoshybertas Assegurar que os frascos satildeo devidamente fechados Assegurar uma ventilaccedilatildeo adequada durante o uso Evitar respirar os vapores Evitar o contacto prolongado ou repetido com a pele

45 Soluccedilatildeo-padratildeo de araquidato de laurilo (nota 3) a 005 (mV) em heptano (padratildeo interno para as ceras)

Nota 3 Podem tambeacutem utilizar-se palmitato de palmitilo estearato de miristilo ou laureato de araquidilo

46 Soluccedilatildeo-padratildeo de heptadecanoato de metilo a 002 (mv) em heptano (padratildeo interno para os eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos)

47 Corante Sudan 1 (1-fenilazo-2-naftol)

48 Gaacutes vector hidrogeacutenio ou heacutelio puros de qualidade para cromatografia em fase gasosa

ADVERTEcircNCIA

Hidrogeacutenio Altamente inflamaacutevel sob pressatildeo Manter ao abrigo de fontes de calor faiacutescas chamas descobertas ou dispositivos eleacutectricos que natildeo sejam constituiacutedos por materiais natildeo-inflamaacuteveis Assegurar que a torneira da garrafa se encontra fechada quando esta natildeo estiver a ser utilizada Utilizar sempre um redutor de pressatildeo Reduzir a tensatildeo da mola redutora antes de abrir a torneira da garrafa Natildeo permanecer em frente da saiacuteda da garrafa ao abrir a torneira Assegurar uma ventilaccedilatildeo adequada durante o uso Natildeo transferir hidrogeacutenio entre garrafas Natildeo misturar gases na garrafa Assegurar que as garrafas natildeo possam cair Manter as garrafas ao abrigo da luz solar e de fontes de calor Armazenar ao abrigo da corrosatildeo Natildeo utilizar garrafas danificadas ou sem roacutetulo

Heacutelio Gaacutes comprimido a alta pressatildeo Reduz a quantidade de oxigeacutenio respiraacutevel Manter a garrafa fechada Assegurar uma ventilaccedilatildeo adequada durante o uso Natildeo aceder aos locais de armazenagem se os mesmos natildeo estiverem devidamente ventilados Utilizar sempre um redutor de pressatildeo Reduzir a tensatildeo da mola redutora antes de abrir a torneira da garrafa Natildeo transferir gaacutes entre garrafas Assegurar que as garrafas natildeo possam cair Natildeo permanecer em frente da saiacuteda da garrafa ao abrir a torneira Manter as garrafas ao abrigo da luz solar e de fontes de calor Armazenar ao abrigo da corrosatildeo Natildeo utilizar garrafas danificadas ou sem roacutetulo Natildeo inalar Utilizar apenas para fins teacutecnicos

PT L 236 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia 2712011

49 Gases auxiliares

mdash Hidrogeacutenio puro de qualidade cromatograacutefica

mdash Ar puro de qualidade para cromatografia em fase gasosa

ADVERTEcircNCIA

Ar Gaacutes comprimido a alta pressatildeo Utilizar com precauccedilatildeo na presenccedila de substacircncias combustiacuteveis dado que a temperatura de auto-igniccedilatildeo da maioria dos compostos orgacircnicos no ar eacute consideravelmente inferior a altas pressotildees Assegurar que a torneira da garrafa se encontra fechada quando esta natildeo estiver a ser utilizada Utilizar sempre um redutor de pressatildeo Reduzir a tensatildeo da mola redutora antes de abrir a torneira da garrafa Natildeo permanecer em frente da saiacuteda da garrafa ao abrir a torneira Natildeo transferir gaacutes entre garrafas Natildeo misturar gases na garrafa Assegurar que as garrafas natildeo possam cair Manter ao abrigo da luz solar e de fontes de calor Armazenar ao abrigo da corrosatildeo Natildeo utilizar garrafas danificadas ou sem roacutetulo O ar destinado a utilizaccedilotildees teacutecnicas natildeo pode ser utilizado em dispositivos de inalaccedilatildeo ou respiratoacuterios

5 PROCEDIMENTO

51 Preparaccedilatildeo da coluna cromatograacutefica

Preparar uma suspensatildeo de 15 g de silicagel (41) em n-hexano (42) e introduzi-la na coluna (32) Deixar assentar espontaneamente Completar a operaccedilatildeo por recurso a um vibrador eleacutectrico de modo a tornar mais homogeacutenea a camada cromatograacutefica Fazer passar 30 ml de n-hexano para remover eventuais impurezas Por recurso agrave balanccedila analiacutetica (38) pesar rigorosamente cerca de 500 mg da amostra no erlenmeyer de 25 ml (31) adicionando uma quantidade adequada de padratildeo interno (45) em funccedilatildeo do teor de ceras previsiacutevel (adicionar por exemplo 01 mg de araquidato de laurilo no caso dos azeites 025-050 mg no caso dos oacuteleos de bagaccedilo de azeitona e 005 mg de heptadecanoato de metilo no caso dos azeites e dos oacuteleos de bagaccedilo de azeitona (46))

Transferir a amostra preparada para a coluna cromatograacutefica com o auxiacutelio de duas porccedilotildees de 2 ml de n-hexano (42)

Deixar fluir o solvente ateacute 1 mm acima da camada de silicagel e fazer passar em seguida mistura n-hexanoeacuteter etiacutelico (991) Recolher 220 ml a um caudal aproximado de 15 gotas em cada 10 segundos (Esta fracccedilatildeo conteacutem os eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos e as ceras) (nota 4) (nota 5)

Nota 4 A mistura de n-hexanoeacuteter etiacutelico (991) deve ser preparada diariamente

Nota 5 Com o objectivo de verificar visualmente se as ceras satildeo eluiacutedas de forma adequada pode adicionar-se agrave soluccedilatildeo-amostra 100 μl de corante Sudan I a 1

O tempo de retenccedilatildeo do corante situa-se entre os tempos de retenccedilatildeo das ceras e dos triacilgliceroacuteis Assim deve suspender-se a eluiccedilatildeo quando o corante atinge a base da coluna cromatograacutefica dado todas as ceras terem entatildeo sido eluiacutedas

Evaporar as fracccedilotildees resultantes num evaporador rotativo ateacute agrave remoccedilatildeo quase total do solvente Remover os uacuteltimos 2 ml com uma corrente de azoto ligeira Recolher a fracccedilatildeo que conteacutem os eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos e diluir com 2-4 ml de n-heptano ou iso-octano

52 Anaacutelise por cromatografia em fase gasosa

521 Operaccedilotildees preliminares

Instalar a coluna no cromatoacutegrafo de fase gasosa (33) ligando uma das extremidades ao sistema de injecccedilatildeo directa na coluna e a outra extremidade ao detector Efectuar uma verificaccedilatildeo do sistema cromatograacutefico (operashycionalidade dos circuitos de gases eficiecircncia do detector e do registador etc)

Se a coluna for utilizada pela primeira vez eacute aconselhaacutevel proceder ao seu condicionamento Para o efeito passar um ligeiro fluxo gasoso pela coluna ligando o cromatoacutegrafo de seguida Aumentar a temperatura gradualmente de forma a atingir 350 degC apoacutes cerca de 4 h

PT 2712011 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia L 237

Manter esta temperatura durante pelo menos 2 h regulando seguidamente o aparelho para as condiccedilotildees de trabalho (regular o caudal de gaacutes acender a chama ligar ao registador electroacutenico - ponto 334 - regular a temperatura do forno para a coluna regular o detector etc) Registar o sinal obtido com uma sensibilidade pelo menos dupla da sensibilidade prevista para a execuccedilatildeo da anaacutelise A linha de base deve ser linear sem qualquer pico ou desvio

A ocorrecircncia de um desvio linear negativo indica que as ligaccedilotildees da coluna natildeo foram efectuadas de modo correcto a ocorrecircncia de um desvio positivo indica que a coluna natildeo foi condicionada de forma correcta

522 Escolha das condiccedilotildees de trabalho para a determinaccedilatildeo das ceras e dos eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos (nota 6)

As condiccedilotildees de trabalho satildeo em geral as seguintes

mdash Temperatura da coluna

20 degCmin 5 degCmin

80 degC no iniacutecio (1prime) 140 degC 335 degC (20prime)

mdash Temperatura do detector 350 degC

mdash Quantidade injectada 1 μl de soluccedilatildeo de n-heptano (2-4 ml)

mdash Gaacutes vector heacutelio ou hidrogeacutenio agrave velocidade linear oacuteptima para o gaacutes seleccionado (ver o apecircndice A)

mdash Sensibilidade dos instrumentos adequada ao cumprimento das condiccedilotildees atraacutes referidas

Nota 6 Atendendo agrave elevada temperatura final eacute admissiacutevel um desvio positivo mas que natildeo deveraacute exceder 10 da escala

Estas condiccedilotildees podem ser alteradas em funccedilatildeo das caracteriacutesticas da coluna e do cromatoacutegrafo tendo em vista a separaccedilatildeo total das ceras e dos eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos dos aacutecidos gordos e uma resoluccedilatildeo satisfatoacuteria dos picos (ver as figuras 2 3 e 4) bem como a obtenccedilatildeo de um tempo de retenccedilatildeo de 18 plusmn 3 minutos para o padratildeo interno (araquidato de laurilo) O pico mais representativo correspondente agraves ceras deveraacute elevar-se a pelo menos 60 da escala devendo o pico correspondente ao padratildeo interno para os eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos (heptadecanoato de metilo) atingir a totalidade da escala

Os paracircmetros de integraccedilatildeo dos picos devem ser determinados de modo a obter uma estimativa correcta das aacutereas dos picos pertinentes

53 Execuccedilatildeo da anaacutelise

Efectuar uma toma de 10 μl de soluccedilatildeo com a microsseringa de 10 μl puxando o ecircmbolo ateacute esvaziar a agulha Introduzir a agulha no sistema de injecccedilatildeo e decorridos 1-2 s injectar rapidamente a amostra Retirar cuidadoshysamente a agulha decorridos cerca de 5 s

Efectuar o registo ateacute agrave eluiccedilatildeo completa das ceras ou dos estigmastadienos consoante a fracccedilatildeo em anaacutelise

A linha de base deve satisfazer sempre as condiccedilotildees requeridas

54 Identificaccedilatildeo dos picos

Identificar os picos com base nos tempos de retenccedilatildeo comparando-os com os tempos de retenccedilatildeo de misturas conhecidas de ceras analisadas nas mesmas condiccedilotildees Os eacutesteres alquiacutelicos satildeo identificados com base em misturas de eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos dos principais aacutecidos gordos presentes no azeite (aacutecidos palmiacutetico e oleico)

A figura 1 apresenta um cromatograma caracteriacutestico das ceras de um azeite virgem As figuras 2 e 3 apresentam cromatogramas de dois azeites extra virgem vendidos a retalho num dos casos com os respectivos eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos e no outro sem eles A figura 4 apresenta cromatogramas caracteriacutesticos de um azeite virgem extra de qualidade superior e do mesmo azeite apoacutes a adiccedilatildeo de 20 de um azeite desodorizado

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55 Anaacutelise quantitativa das ceras

Com o auxiacutelio do integrador determinar a aacuterea dos picos correspondentes ao padratildeo interno (araquidato de laurilo) e aos eacutesteres alifaacuteticos C 40 -C 46

Determinar o teor total de ceras expresso em mgkg de gordura atraveacutes do somatoacuterio das vaacuterias ceras por recurso agrave seguinte foacutermula

Ceras mg=kg frac14 ethΣA x THORN m s 1 000 A s m

sendo

A x = aacuterea do pico correspondente a um determinado eacutester calculada por via informaacutetica

A s = aacuterea do pico correspondente ao padratildeo interno (araquidato de laurilo) calculada por via informaacutetica

m s = massa de padratildeo interno (araquidato de laurilo) adicionada em miligramas

m = massa da toma de amostra para a determinaccedilatildeo em gramas

551 Anaacutelise quantitativa dos eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos

Com o auxiacutelio do integrador determinar a aacuterea dos picos correspondentes ao padratildeo interno (heptadecanoato de metilo) aos eacutesteres metiacutelicos dos aacutecidos gordos C 16 e C 18 e aos eacutesteres etiacutelicos dos mesmos aacutecidos gordos

Determinar o teor de cada eacutester alquiacutelico expresso em mgkg de gordura por recurso agrave seguinte foacutermula

Ester mg=kg frac14 A x m s 1 000

A s m

sendo

A x = aacuterea do pico correspondente a um determinado eacutester C 16 ou C 18 calculada por via informaacutetica

A s = aacuterea do pico correspondente ao padratildeo interno (heptadecanoato de metilo) calculada por via informaacutetica

m s = massa de padratildeo interno (heptadecanoato de metilo) adicionada em miligramas

m = massa da toma de amostra para a determinaccedilatildeo em gramas

6 APRESENTACcedilAtildeO DOS RESULTADOS

Apresentar a soma dos teores das vaacuterias ceras de C 40 a C 46 (nota 7) em miligramas por quilograma de gordura

Apresentar a soma dos teores dos eacutesteres metiacutelicos e dos eacutesteres etiacutelicos de C 16 a C 18 bem como o total de ambos

Os resultados devem ser expressos com a aproximaccedilatildeo de 1 mgkg

Nota 7 Os componentes a quantificar dizem respeito aos picos correspondentes aos eacutesteres C 40 - C 46 com nuacutemero par de aacutetomos de carbono como se exemplifica no cromatograma das ceras de um azeite que consta da figura anexa Para fins de identificaccedilatildeo em caso de desdobramento do eacutester C 46 recomenda-se a anaacutelise da fracccedilatildeo de ceras de um oacuteleo de bagaccedilo de azeitona no qual o pico correspondente ao eacutester C 46 se distingue pela sua predominacircncia

Apresentar a relaccedilatildeo entre eacutesteres etiacutelicos e eacutesteres metiacutelicos

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Figura 1

Exemplo de cromatograma de fase gasosa da fracccedilatildeo de ceras de um azeite ()

Picos com tempos de retenccedilatildeo compreendidos entre 5 e 8 min correspondentes aos eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos dos aacutecidos gordos

Legenda

IS = Araquidato de laurilo

1 = Eacutesteres diterpeacutenicos

2+2prime = Eacutesteres C 40

3+3prime = Eacutesteres C 42

4+4prime = Eacutesteres C 44

5 = Eacutesteres C 46

6 = Eacutesteres de esteroacuteis e de aacutelcoois triterpeacutenicos

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() O cromatograma natildeo deve apresentar quaisquer picos significativos (correspondentes a triacilgliceroacuteis) apoacutes a eluiccedilatildeo dos eacutesteres de esteroacuteis

Figura 2

Eacutesteres metiacutelicos eacutesteres etiacutelicos e ceras num azeite virgem

Legenda

1 ndash Eacutesteres metiacutelicos C 16

2 ndash Eacutesteres etiacutelicos C 16

3 ndash Padratildeo interno (heptadecanoato de metilo)

4 ndash Eacutesteres metiacutelicos C 18

5 ndash Eacutesteres etiacutelicos C 18

6 ndash Esqualeno

7 ndash Padratildeo interno (araquidato de laurilo)

A ndash Eacutesteres diterpeacutenicos

B ndash Ceras

C ndash Eacutesteres de esteroacuteis e eacutesteres triterpeacutenicos

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Figura 3

Eacutesteres metiacutelicos eacutesteres etiacutelicos e ceras num azeite virgem extra

Legenda

1 ndash Padratildeo interno (heptadecanoato de metilo)

2 ndash Eacutesteres metiacutelicos C 18

3 ndash Eacutesteres etiacutelicos C 18

4 ndash Esqualeno

5 ndash Padratildeo interno (araquidato de laurilo)

A ndash Eacutesteres diterpeacutenicos

B ndash Ceras

C ndash Eacutesteres de esteroacuteis e eacutesteres triterpeacutenicos

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Figura 4

Parte do cromatograma de um azeite virgem extra e do mesmo azeite apoacutes a adiccedilatildeo de azeite desodorizado

Legenda

1 ndash Padratildeo interno (miristato de metilo)

2 ndash Palmitato de metilo

3 ndash Palmitato de etilo

4 ndash Padratildeo interno (heptadecanoato de metilo)

5 ndash Linoleato de metilo

6 ndash Oleato de metilo

7 ndash Estearato de metilo

8 ndash Linoleato de etilo

9 ndash Oleato de etilo

10 ndash Estearato de etilo

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Apecircndice A

Determinaccedilatildeo da velocidade linear do gaacutes

Injectar 1 a 3 μl de metano (ou propano) no cromatoacutegrafo de fase gasosa regulado para as condiccedilotildees normais de trabalho e medir o tempo necessaacuterio para o gaacutes percorrer a coluna desde o momento da injecccedilatildeo ateacute ao registo do respectivo pico (tM)

A velocidade linear expressa em cms eacute dada por LtM sendo L o comprimento da coluna expresso em centiacutemetros e tM o tempo de retenccedilatildeo expresso em segundosraquo

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49 Gases auxiliares

mdash Hidrogeacutenio puro de qualidade cromatograacutefica

mdash Ar puro de qualidade para cromatografia em fase gasosa

ADVERTEcircNCIA

Ar Gaacutes comprimido a alta pressatildeo Utilizar com precauccedilatildeo na presenccedila de substacircncias combustiacuteveis dado que a temperatura de auto-igniccedilatildeo da maioria dos compostos orgacircnicos no ar eacute consideravelmente inferior a altas pressotildees Assegurar que a torneira da garrafa se encontra fechada quando esta natildeo estiver a ser utilizada Utilizar sempre um redutor de pressatildeo Reduzir a tensatildeo da mola redutora antes de abrir a torneira da garrafa Natildeo permanecer em frente da saiacuteda da garrafa ao abrir a torneira Natildeo transferir gaacutes entre garrafas Natildeo misturar gases na garrafa Assegurar que as garrafas natildeo possam cair Manter ao abrigo da luz solar e de fontes de calor Armazenar ao abrigo da corrosatildeo Natildeo utilizar garrafas danificadas ou sem roacutetulo O ar destinado a utilizaccedilotildees teacutecnicas natildeo pode ser utilizado em dispositivos de inalaccedilatildeo ou respiratoacuterios

5 PROCEDIMENTO

51 Preparaccedilatildeo da coluna cromatograacutefica

Preparar uma suspensatildeo de 15 g de silicagel (41) em n-hexano (42) e introduzi-la na coluna (32) Deixar assentar espontaneamente Completar a operaccedilatildeo por recurso a um vibrador eleacutectrico de modo a tornar mais homogeacutenea a camada cromatograacutefica Fazer passar 30 ml de n-hexano para remover eventuais impurezas Por recurso agrave balanccedila analiacutetica (38) pesar rigorosamente cerca de 500 mg da amostra no erlenmeyer de 25 ml (31) adicionando uma quantidade adequada de padratildeo interno (45) em funccedilatildeo do teor de ceras previsiacutevel (adicionar por exemplo 01 mg de araquidato de laurilo no caso dos azeites 025-050 mg no caso dos oacuteleos de bagaccedilo de azeitona e 005 mg de heptadecanoato de metilo no caso dos azeites e dos oacuteleos de bagaccedilo de azeitona (46))

Transferir a amostra preparada para a coluna cromatograacutefica com o auxiacutelio de duas porccedilotildees de 2 ml de n-hexano (42)

Deixar fluir o solvente ateacute 1 mm acima da camada de silicagel e fazer passar em seguida mistura n-hexanoeacuteter etiacutelico (991) Recolher 220 ml a um caudal aproximado de 15 gotas em cada 10 segundos (Esta fracccedilatildeo conteacutem os eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos e as ceras) (nota 4) (nota 5)

Nota 4 A mistura de n-hexanoeacuteter etiacutelico (991) deve ser preparada diariamente

Nota 5 Com o objectivo de verificar visualmente se as ceras satildeo eluiacutedas de forma adequada pode adicionar-se agrave soluccedilatildeo-amostra 100 μl de corante Sudan I a 1

O tempo de retenccedilatildeo do corante situa-se entre os tempos de retenccedilatildeo das ceras e dos triacilgliceroacuteis Assim deve suspender-se a eluiccedilatildeo quando o corante atinge a base da coluna cromatograacutefica dado todas as ceras terem entatildeo sido eluiacutedas

Evaporar as fracccedilotildees resultantes num evaporador rotativo ateacute agrave remoccedilatildeo quase total do solvente Remover os uacuteltimos 2 ml com uma corrente de azoto ligeira Recolher a fracccedilatildeo que conteacutem os eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos e diluir com 2-4 ml de n-heptano ou iso-octano

52 Anaacutelise por cromatografia em fase gasosa

521 Operaccedilotildees preliminares

Instalar a coluna no cromatoacutegrafo de fase gasosa (33) ligando uma das extremidades ao sistema de injecccedilatildeo directa na coluna e a outra extremidade ao detector Efectuar uma verificaccedilatildeo do sistema cromatograacutefico (operashycionalidade dos circuitos de gases eficiecircncia do detector e do registador etc)

Se a coluna for utilizada pela primeira vez eacute aconselhaacutevel proceder ao seu condicionamento Para o efeito passar um ligeiro fluxo gasoso pela coluna ligando o cromatoacutegrafo de seguida Aumentar a temperatura gradualmente de forma a atingir 350 degC apoacutes cerca de 4 h

PT 2712011 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia L 237

Manter esta temperatura durante pelo menos 2 h regulando seguidamente o aparelho para as condiccedilotildees de trabalho (regular o caudal de gaacutes acender a chama ligar ao registador electroacutenico - ponto 334 - regular a temperatura do forno para a coluna regular o detector etc) Registar o sinal obtido com uma sensibilidade pelo menos dupla da sensibilidade prevista para a execuccedilatildeo da anaacutelise A linha de base deve ser linear sem qualquer pico ou desvio

A ocorrecircncia de um desvio linear negativo indica que as ligaccedilotildees da coluna natildeo foram efectuadas de modo correcto a ocorrecircncia de um desvio positivo indica que a coluna natildeo foi condicionada de forma correcta

522 Escolha das condiccedilotildees de trabalho para a determinaccedilatildeo das ceras e dos eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos (nota 6)

As condiccedilotildees de trabalho satildeo em geral as seguintes

mdash Temperatura da coluna

20 degCmin 5 degCmin

80 degC no iniacutecio (1prime) 140 degC 335 degC (20prime)

mdash Temperatura do detector 350 degC

mdash Quantidade injectada 1 μl de soluccedilatildeo de n-heptano (2-4 ml)

mdash Gaacutes vector heacutelio ou hidrogeacutenio agrave velocidade linear oacuteptima para o gaacutes seleccionado (ver o apecircndice A)

mdash Sensibilidade dos instrumentos adequada ao cumprimento das condiccedilotildees atraacutes referidas

Nota 6 Atendendo agrave elevada temperatura final eacute admissiacutevel um desvio positivo mas que natildeo deveraacute exceder 10 da escala

Estas condiccedilotildees podem ser alteradas em funccedilatildeo das caracteriacutesticas da coluna e do cromatoacutegrafo tendo em vista a separaccedilatildeo total das ceras e dos eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos dos aacutecidos gordos e uma resoluccedilatildeo satisfatoacuteria dos picos (ver as figuras 2 3 e 4) bem como a obtenccedilatildeo de um tempo de retenccedilatildeo de 18 plusmn 3 minutos para o padratildeo interno (araquidato de laurilo) O pico mais representativo correspondente agraves ceras deveraacute elevar-se a pelo menos 60 da escala devendo o pico correspondente ao padratildeo interno para os eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos (heptadecanoato de metilo) atingir a totalidade da escala

Os paracircmetros de integraccedilatildeo dos picos devem ser determinados de modo a obter uma estimativa correcta das aacutereas dos picos pertinentes

53 Execuccedilatildeo da anaacutelise

Efectuar uma toma de 10 μl de soluccedilatildeo com a microsseringa de 10 μl puxando o ecircmbolo ateacute esvaziar a agulha Introduzir a agulha no sistema de injecccedilatildeo e decorridos 1-2 s injectar rapidamente a amostra Retirar cuidadoshysamente a agulha decorridos cerca de 5 s

Efectuar o registo ateacute agrave eluiccedilatildeo completa das ceras ou dos estigmastadienos consoante a fracccedilatildeo em anaacutelise

A linha de base deve satisfazer sempre as condiccedilotildees requeridas

54 Identificaccedilatildeo dos picos

Identificar os picos com base nos tempos de retenccedilatildeo comparando-os com os tempos de retenccedilatildeo de misturas conhecidas de ceras analisadas nas mesmas condiccedilotildees Os eacutesteres alquiacutelicos satildeo identificados com base em misturas de eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos dos principais aacutecidos gordos presentes no azeite (aacutecidos palmiacutetico e oleico)

A figura 1 apresenta um cromatograma caracteriacutestico das ceras de um azeite virgem As figuras 2 e 3 apresentam cromatogramas de dois azeites extra virgem vendidos a retalho num dos casos com os respectivos eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos e no outro sem eles A figura 4 apresenta cromatogramas caracteriacutesticos de um azeite virgem extra de qualidade superior e do mesmo azeite apoacutes a adiccedilatildeo de 20 de um azeite desodorizado

PT L 238 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia 2712011

55 Anaacutelise quantitativa das ceras

Com o auxiacutelio do integrador determinar a aacuterea dos picos correspondentes ao padratildeo interno (araquidato de laurilo) e aos eacutesteres alifaacuteticos C 40 -C 46

Determinar o teor total de ceras expresso em mgkg de gordura atraveacutes do somatoacuterio das vaacuterias ceras por recurso agrave seguinte foacutermula

Ceras mg=kg frac14 ethΣA x THORN m s 1 000 A s m

sendo

A x = aacuterea do pico correspondente a um determinado eacutester calculada por via informaacutetica

A s = aacuterea do pico correspondente ao padratildeo interno (araquidato de laurilo) calculada por via informaacutetica

m s = massa de padratildeo interno (araquidato de laurilo) adicionada em miligramas

m = massa da toma de amostra para a determinaccedilatildeo em gramas

551 Anaacutelise quantitativa dos eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos

Com o auxiacutelio do integrador determinar a aacuterea dos picos correspondentes ao padratildeo interno (heptadecanoato de metilo) aos eacutesteres metiacutelicos dos aacutecidos gordos C 16 e C 18 e aos eacutesteres etiacutelicos dos mesmos aacutecidos gordos

Determinar o teor de cada eacutester alquiacutelico expresso em mgkg de gordura por recurso agrave seguinte foacutermula

Ester mg=kg frac14 A x m s 1 000

A s m

sendo

A x = aacuterea do pico correspondente a um determinado eacutester C 16 ou C 18 calculada por via informaacutetica

A s = aacuterea do pico correspondente ao padratildeo interno (heptadecanoato de metilo) calculada por via informaacutetica

m s = massa de padratildeo interno (heptadecanoato de metilo) adicionada em miligramas

m = massa da toma de amostra para a determinaccedilatildeo em gramas

6 APRESENTACcedilAtildeO DOS RESULTADOS

Apresentar a soma dos teores das vaacuterias ceras de C 40 a C 46 (nota 7) em miligramas por quilograma de gordura

Apresentar a soma dos teores dos eacutesteres metiacutelicos e dos eacutesteres etiacutelicos de C 16 a C 18 bem como o total de ambos

Os resultados devem ser expressos com a aproximaccedilatildeo de 1 mgkg

Nota 7 Os componentes a quantificar dizem respeito aos picos correspondentes aos eacutesteres C 40 - C 46 com nuacutemero par de aacutetomos de carbono como se exemplifica no cromatograma das ceras de um azeite que consta da figura anexa Para fins de identificaccedilatildeo em caso de desdobramento do eacutester C 46 recomenda-se a anaacutelise da fracccedilatildeo de ceras de um oacuteleo de bagaccedilo de azeitona no qual o pico correspondente ao eacutester C 46 se distingue pela sua predominacircncia

Apresentar a relaccedilatildeo entre eacutesteres etiacutelicos e eacutesteres metiacutelicos

PT 2712011 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia L 239

Figura 1

Exemplo de cromatograma de fase gasosa da fracccedilatildeo de ceras de um azeite ()

Picos com tempos de retenccedilatildeo compreendidos entre 5 e 8 min correspondentes aos eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos dos aacutecidos gordos

Legenda

IS = Araquidato de laurilo

1 = Eacutesteres diterpeacutenicos

2+2prime = Eacutesteres C 40

3+3prime = Eacutesteres C 42

4+4prime = Eacutesteres C 44

5 = Eacutesteres C 46

6 = Eacutesteres de esteroacuteis e de aacutelcoois triterpeacutenicos

PT L 2310 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia 2712011

() O cromatograma natildeo deve apresentar quaisquer picos significativos (correspondentes a triacilgliceroacuteis) apoacutes a eluiccedilatildeo dos eacutesteres de esteroacuteis

Figura 2

Eacutesteres metiacutelicos eacutesteres etiacutelicos e ceras num azeite virgem

Legenda

1 ndash Eacutesteres metiacutelicos C 16

2 ndash Eacutesteres etiacutelicos C 16

3 ndash Padratildeo interno (heptadecanoato de metilo)

4 ndash Eacutesteres metiacutelicos C 18

5 ndash Eacutesteres etiacutelicos C 18

6 ndash Esqualeno

7 ndash Padratildeo interno (araquidato de laurilo)

A ndash Eacutesteres diterpeacutenicos

B ndash Ceras

C ndash Eacutesteres de esteroacuteis e eacutesteres triterpeacutenicos

PT 2712011 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia L 2311

Figura 3

Eacutesteres metiacutelicos eacutesteres etiacutelicos e ceras num azeite virgem extra

Legenda

1 ndash Padratildeo interno (heptadecanoato de metilo)

2 ndash Eacutesteres metiacutelicos C 18

3 ndash Eacutesteres etiacutelicos C 18

4 ndash Esqualeno

5 ndash Padratildeo interno (araquidato de laurilo)

A ndash Eacutesteres diterpeacutenicos

B ndash Ceras

C ndash Eacutesteres de esteroacuteis e eacutesteres triterpeacutenicos

PT L 2312 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia 2712011

Figura 4

Parte do cromatograma de um azeite virgem extra e do mesmo azeite apoacutes a adiccedilatildeo de azeite desodorizado

Legenda

1 ndash Padratildeo interno (miristato de metilo)

2 ndash Palmitato de metilo

3 ndash Palmitato de etilo

4 ndash Padratildeo interno (heptadecanoato de metilo)

5 ndash Linoleato de metilo

6 ndash Oleato de metilo

7 ndash Estearato de metilo

8 ndash Linoleato de etilo

9 ndash Oleato de etilo

10 ndash Estearato de etilo

PT 2712011 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia L 2313

Apecircndice A

Determinaccedilatildeo da velocidade linear do gaacutes

Injectar 1 a 3 μl de metano (ou propano) no cromatoacutegrafo de fase gasosa regulado para as condiccedilotildees normais de trabalho e medir o tempo necessaacuterio para o gaacutes percorrer a coluna desde o momento da injecccedilatildeo ateacute ao registo do respectivo pico (tM)

A velocidade linear expressa em cms eacute dada por LtM sendo L o comprimento da coluna expresso em centiacutemetros e tM o tempo de retenccedilatildeo expresso em segundosraquo

PT L 2314 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia 2712011

Manter esta temperatura durante pelo menos 2 h regulando seguidamente o aparelho para as condiccedilotildees de trabalho (regular o caudal de gaacutes acender a chama ligar ao registador electroacutenico - ponto 334 - regular a temperatura do forno para a coluna regular o detector etc) Registar o sinal obtido com uma sensibilidade pelo menos dupla da sensibilidade prevista para a execuccedilatildeo da anaacutelise A linha de base deve ser linear sem qualquer pico ou desvio

A ocorrecircncia de um desvio linear negativo indica que as ligaccedilotildees da coluna natildeo foram efectuadas de modo correcto a ocorrecircncia de um desvio positivo indica que a coluna natildeo foi condicionada de forma correcta

522 Escolha das condiccedilotildees de trabalho para a determinaccedilatildeo das ceras e dos eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos (nota 6)

As condiccedilotildees de trabalho satildeo em geral as seguintes

mdash Temperatura da coluna

20 degCmin 5 degCmin

80 degC no iniacutecio (1prime) 140 degC 335 degC (20prime)

mdash Temperatura do detector 350 degC

mdash Quantidade injectada 1 μl de soluccedilatildeo de n-heptano (2-4 ml)

mdash Gaacutes vector heacutelio ou hidrogeacutenio agrave velocidade linear oacuteptima para o gaacutes seleccionado (ver o apecircndice A)

mdash Sensibilidade dos instrumentos adequada ao cumprimento das condiccedilotildees atraacutes referidas

Nota 6 Atendendo agrave elevada temperatura final eacute admissiacutevel um desvio positivo mas que natildeo deveraacute exceder 10 da escala

Estas condiccedilotildees podem ser alteradas em funccedilatildeo das caracteriacutesticas da coluna e do cromatoacutegrafo tendo em vista a separaccedilatildeo total das ceras e dos eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos dos aacutecidos gordos e uma resoluccedilatildeo satisfatoacuteria dos picos (ver as figuras 2 3 e 4) bem como a obtenccedilatildeo de um tempo de retenccedilatildeo de 18 plusmn 3 minutos para o padratildeo interno (araquidato de laurilo) O pico mais representativo correspondente agraves ceras deveraacute elevar-se a pelo menos 60 da escala devendo o pico correspondente ao padratildeo interno para os eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos (heptadecanoato de metilo) atingir a totalidade da escala

Os paracircmetros de integraccedilatildeo dos picos devem ser determinados de modo a obter uma estimativa correcta das aacutereas dos picos pertinentes

53 Execuccedilatildeo da anaacutelise

Efectuar uma toma de 10 μl de soluccedilatildeo com a microsseringa de 10 μl puxando o ecircmbolo ateacute esvaziar a agulha Introduzir a agulha no sistema de injecccedilatildeo e decorridos 1-2 s injectar rapidamente a amostra Retirar cuidadoshysamente a agulha decorridos cerca de 5 s

Efectuar o registo ateacute agrave eluiccedilatildeo completa das ceras ou dos estigmastadienos consoante a fracccedilatildeo em anaacutelise

A linha de base deve satisfazer sempre as condiccedilotildees requeridas

54 Identificaccedilatildeo dos picos

Identificar os picos com base nos tempos de retenccedilatildeo comparando-os com os tempos de retenccedilatildeo de misturas conhecidas de ceras analisadas nas mesmas condiccedilotildees Os eacutesteres alquiacutelicos satildeo identificados com base em misturas de eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos dos principais aacutecidos gordos presentes no azeite (aacutecidos palmiacutetico e oleico)

A figura 1 apresenta um cromatograma caracteriacutestico das ceras de um azeite virgem As figuras 2 e 3 apresentam cromatogramas de dois azeites extra virgem vendidos a retalho num dos casos com os respectivos eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos e no outro sem eles A figura 4 apresenta cromatogramas caracteriacutesticos de um azeite virgem extra de qualidade superior e do mesmo azeite apoacutes a adiccedilatildeo de 20 de um azeite desodorizado

PT L 238 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia 2712011

55 Anaacutelise quantitativa das ceras

Com o auxiacutelio do integrador determinar a aacuterea dos picos correspondentes ao padratildeo interno (araquidato de laurilo) e aos eacutesteres alifaacuteticos C 40 -C 46

Determinar o teor total de ceras expresso em mgkg de gordura atraveacutes do somatoacuterio das vaacuterias ceras por recurso agrave seguinte foacutermula

Ceras mg=kg frac14 ethΣA x THORN m s 1 000 A s m

sendo

A x = aacuterea do pico correspondente a um determinado eacutester calculada por via informaacutetica

A s = aacuterea do pico correspondente ao padratildeo interno (araquidato de laurilo) calculada por via informaacutetica

m s = massa de padratildeo interno (araquidato de laurilo) adicionada em miligramas

m = massa da toma de amostra para a determinaccedilatildeo em gramas

551 Anaacutelise quantitativa dos eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos

Com o auxiacutelio do integrador determinar a aacuterea dos picos correspondentes ao padratildeo interno (heptadecanoato de metilo) aos eacutesteres metiacutelicos dos aacutecidos gordos C 16 e C 18 e aos eacutesteres etiacutelicos dos mesmos aacutecidos gordos

Determinar o teor de cada eacutester alquiacutelico expresso em mgkg de gordura por recurso agrave seguinte foacutermula

Ester mg=kg frac14 A x m s 1 000

A s m

sendo

A x = aacuterea do pico correspondente a um determinado eacutester C 16 ou C 18 calculada por via informaacutetica

A s = aacuterea do pico correspondente ao padratildeo interno (heptadecanoato de metilo) calculada por via informaacutetica

m s = massa de padratildeo interno (heptadecanoato de metilo) adicionada em miligramas

m = massa da toma de amostra para a determinaccedilatildeo em gramas

6 APRESENTACcedilAtildeO DOS RESULTADOS

Apresentar a soma dos teores das vaacuterias ceras de C 40 a C 46 (nota 7) em miligramas por quilograma de gordura

Apresentar a soma dos teores dos eacutesteres metiacutelicos e dos eacutesteres etiacutelicos de C 16 a C 18 bem como o total de ambos

Os resultados devem ser expressos com a aproximaccedilatildeo de 1 mgkg

Nota 7 Os componentes a quantificar dizem respeito aos picos correspondentes aos eacutesteres C 40 - C 46 com nuacutemero par de aacutetomos de carbono como se exemplifica no cromatograma das ceras de um azeite que consta da figura anexa Para fins de identificaccedilatildeo em caso de desdobramento do eacutester C 46 recomenda-se a anaacutelise da fracccedilatildeo de ceras de um oacuteleo de bagaccedilo de azeitona no qual o pico correspondente ao eacutester C 46 se distingue pela sua predominacircncia

Apresentar a relaccedilatildeo entre eacutesteres etiacutelicos e eacutesteres metiacutelicos

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Figura 1

Exemplo de cromatograma de fase gasosa da fracccedilatildeo de ceras de um azeite ()

Picos com tempos de retenccedilatildeo compreendidos entre 5 e 8 min correspondentes aos eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos dos aacutecidos gordos

Legenda

IS = Araquidato de laurilo

1 = Eacutesteres diterpeacutenicos

2+2prime = Eacutesteres C 40

3+3prime = Eacutesteres C 42

4+4prime = Eacutesteres C 44

5 = Eacutesteres C 46

6 = Eacutesteres de esteroacuteis e de aacutelcoois triterpeacutenicos

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() O cromatograma natildeo deve apresentar quaisquer picos significativos (correspondentes a triacilgliceroacuteis) apoacutes a eluiccedilatildeo dos eacutesteres de esteroacuteis

Figura 2

Eacutesteres metiacutelicos eacutesteres etiacutelicos e ceras num azeite virgem

Legenda

1 ndash Eacutesteres metiacutelicos C 16

2 ndash Eacutesteres etiacutelicos C 16

3 ndash Padratildeo interno (heptadecanoato de metilo)

4 ndash Eacutesteres metiacutelicos C 18

5 ndash Eacutesteres etiacutelicos C 18

6 ndash Esqualeno

7 ndash Padratildeo interno (araquidato de laurilo)

A ndash Eacutesteres diterpeacutenicos

B ndash Ceras

C ndash Eacutesteres de esteroacuteis e eacutesteres triterpeacutenicos

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Figura 3

Eacutesteres metiacutelicos eacutesteres etiacutelicos e ceras num azeite virgem extra

Legenda

1 ndash Padratildeo interno (heptadecanoato de metilo)

2 ndash Eacutesteres metiacutelicos C 18

3 ndash Eacutesteres etiacutelicos C 18

4 ndash Esqualeno

5 ndash Padratildeo interno (araquidato de laurilo)

A ndash Eacutesteres diterpeacutenicos

B ndash Ceras

C ndash Eacutesteres de esteroacuteis e eacutesteres triterpeacutenicos

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Figura 4

Parte do cromatograma de um azeite virgem extra e do mesmo azeite apoacutes a adiccedilatildeo de azeite desodorizado

Legenda

1 ndash Padratildeo interno (miristato de metilo)

2 ndash Palmitato de metilo

3 ndash Palmitato de etilo

4 ndash Padratildeo interno (heptadecanoato de metilo)

5 ndash Linoleato de metilo

6 ndash Oleato de metilo

7 ndash Estearato de metilo

8 ndash Linoleato de etilo

9 ndash Oleato de etilo

10 ndash Estearato de etilo

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Apecircndice A

Determinaccedilatildeo da velocidade linear do gaacutes

Injectar 1 a 3 μl de metano (ou propano) no cromatoacutegrafo de fase gasosa regulado para as condiccedilotildees normais de trabalho e medir o tempo necessaacuterio para o gaacutes percorrer a coluna desde o momento da injecccedilatildeo ateacute ao registo do respectivo pico (tM)

A velocidade linear expressa em cms eacute dada por LtM sendo L o comprimento da coluna expresso em centiacutemetros e tM o tempo de retenccedilatildeo expresso em segundosraquo

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55 Anaacutelise quantitativa das ceras

Com o auxiacutelio do integrador determinar a aacuterea dos picos correspondentes ao padratildeo interno (araquidato de laurilo) e aos eacutesteres alifaacuteticos C 40 -C 46

Determinar o teor total de ceras expresso em mgkg de gordura atraveacutes do somatoacuterio das vaacuterias ceras por recurso agrave seguinte foacutermula

Ceras mg=kg frac14 ethΣA x THORN m s 1 000 A s m

sendo

A x = aacuterea do pico correspondente a um determinado eacutester calculada por via informaacutetica

A s = aacuterea do pico correspondente ao padratildeo interno (araquidato de laurilo) calculada por via informaacutetica

m s = massa de padratildeo interno (araquidato de laurilo) adicionada em miligramas

m = massa da toma de amostra para a determinaccedilatildeo em gramas

551 Anaacutelise quantitativa dos eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos

Com o auxiacutelio do integrador determinar a aacuterea dos picos correspondentes ao padratildeo interno (heptadecanoato de metilo) aos eacutesteres metiacutelicos dos aacutecidos gordos C 16 e C 18 e aos eacutesteres etiacutelicos dos mesmos aacutecidos gordos

Determinar o teor de cada eacutester alquiacutelico expresso em mgkg de gordura por recurso agrave seguinte foacutermula

Ester mg=kg frac14 A x m s 1 000

A s m

sendo

A x = aacuterea do pico correspondente a um determinado eacutester C 16 ou C 18 calculada por via informaacutetica

A s = aacuterea do pico correspondente ao padratildeo interno (heptadecanoato de metilo) calculada por via informaacutetica

m s = massa de padratildeo interno (heptadecanoato de metilo) adicionada em miligramas

m = massa da toma de amostra para a determinaccedilatildeo em gramas

6 APRESENTACcedilAtildeO DOS RESULTADOS

Apresentar a soma dos teores das vaacuterias ceras de C 40 a C 46 (nota 7) em miligramas por quilograma de gordura

Apresentar a soma dos teores dos eacutesteres metiacutelicos e dos eacutesteres etiacutelicos de C 16 a C 18 bem como o total de ambos

Os resultados devem ser expressos com a aproximaccedilatildeo de 1 mgkg

Nota 7 Os componentes a quantificar dizem respeito aos picos correspondentes aos eacutesteres C 40 - C 46 com nuacutemero par de aacutetomos de carbono como se exemplifica no cromatograma das ceras de um azeite que consta da figura anexa Para fins de identificaccedilatildeo em caso de desdobramento do eacutester C 46 recomenda-se a anaacutelise da fracccedilatildeo de ceras de um oacuteleo de bagaccedilo de azeitona no qual o pico correspondente ao eacutester C 46 se distingue pela sua predominacircncia

Apresentar a relaccedilatildeo entre eacutesteres etiacutelicos e eacutesteres metiacutelicos

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Figura 1

Exemplo de cromatograma de fase gasosa da fracccedilatildeo de ceras de um azeite ()

Picos com tempos de retenccedilatildeo compreendidos entre 5 e 8 min correspondentes aos eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos dos aacutecidos gordos

Legenda

IS = Araquidato de laurilo

1 = Eacutesteres diterpeacutenicos

2+2prime = Eacutesteres C 40

3+3prime = Eacutesteres C 42

4+4prime = Eacutesteres C 44

5 = Eacutesteres C 46

6 = Eacutesteres de esteroacuteis e de aacutelcoois triterpeacutenicos

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() O cromatograma natildeo deve apresentar quaisquer picos significativos (correspondentes a triacilgliceroacuteis) apoacutes a eluiccedilatildeo dos eacutesteres de esteroacuteis

Figura 2

Eacutesteres metiacutelicos eacutesteres etiacutelicos e ceras num azeite virgem

Legenda

1 ndash Eacutesteres metiacutelicos C 16

2 ndash Eacutesteres etiacutelicos C 16

3 ndash Padratildeo interno (heptadecanoato de metilo)

4 ndash Eacutesteres metiacutelicos C 18

5 ndash Eacutesteres etiacutelicos C 18

6 ndash Esqualeno

7 ndash Padratildeo interno (araquidato de laurilo)

A ndash Eacutesteres diterpeacutenicos

B ndash Ceras

C ndash Eacutesteres de esteroacuteis e eacutesteres triterpeacutenicos

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Figura 3

Eacutesteres metiacutelicos eacutesteres etiacutelicos e ceras num azeite virgem extra

Legenda

1 ndash Padratildeo interno (heptadecanoato de metilo)

2 ndash Eacutesteres metiacutelicos C 18

3 ndash Eacutesteres etiacutelicos C 18

4 ndash Esqualeno

5 ndash Padratildeo interno (araquidato de laurilo)

A ndash Eacutesteres diterpeacutenicos

B ndash Ceras

C ndash Eacutesteres de esteroacuteis e eacutesteres triterpeacutenicos

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Figura 4

Parte do cromatograma de um azeite virgem extra e do mesmo azeite apoacutes a adiccedilatildeo de azeite desodorizado

Legenda

1 ndash Padratildeo interno (miristato de metilo)

2 ndash Palmitato de metilo

3 ndash Palmitato de etilo

4 ndash Padratildeo interno (heptadecanoato de metilo)

5 ndash Linoleato de metilo

6 ndash Oleato de metilo

7 ndash Estearato de metilo

8 ndash Linoleato de etilo

9 ndash Oleato de etilo

10 ndash Estearato de etilo

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Apecircndice A

Determinaccedilatildeo da velocidade linear do gaacutes

Injectar 1 a 3 μl de metano (ou propano) no cromatoacutegrafo de fase gasosa regulado para as condiccedilotildees normais de trabalho e medir o tempo necessaacuterio para o gaacutes percorrer a coluna desde o momento da injecccedilatildeo ateacute ao registo do respectivo pico (tM)

A velocidade linear expressa em cms eacute dada por LtM sendo L o comprimento da coluna expresso em centiacutemetros e tM o tempo de retenccedilatildeo expresso em segundosraquo

PT L 2314 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia 2712011

Figura 1

Exemplo de cromatograma de fase gasosa da fracccedilatildeo de ceras de um azeite ()

Picos com tempos de retenccedilatildeo compreendidos entre 5 e 8 min correspondentes aos eacutesteres metiacutelicos e etiacutelicos dos aacutecidos gordos

Legenda

IS = Araquidato de laurilo

1 = Eacutesteres diterpeacutenicos

2+2prime = Eacutesteres C 40

3+3prime = Eacutesteres C 42

4+4prime = Eacutesteres C 44

5 = Eacutesteres C 46

6 = Eacutesteres de esteroacuteis e de aacutelcoois triterpeacutenicos

PT L 2310 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia 2712011

() O cromatograma natildeo deve apresentar quaisquer picos significativos (correspondentes a triacilgliceroacuteis) apoacutes a eluiccedilatildeo dos eacutesteres de esteroacuteis

Figura 2

Eacutesteres metiacutelicos eacutesteres etiacutelicos e ceras num azeite virgem

Legenda

1 ndash Eacutesteres metiacutelicos C 16

2 ndash Eacutesteres etiacutelicos C 16

3 ndash Padratildeo interno (heptadecanoato de metilo)

4 ndash Eacutesteres metiacutelicos C 18

5 ndash Eacutesteres etiacutelicos C 18

6 ndash Esqualeno

7 ndash Padratildeo interno (araquidato de laurilo)

A ndash Eacutesteres diterpeacutenicos

B ndash Ceras

C ndash Eacutesteres de esteroacuteis e eacutesteres triterpeacutenicos

PT 2712011 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia L 2311

Figura 3

Eacutesteres metiacutelicos eacutesteres etiacutelicos e ceras num azeite virgem extra

Legenda

1 ndash Padratildeo interno (heptadecanoato de metilo)

2 ndash Eacutesteres metiacutelicos C 18

3 ndash Eacutesteres etiacutelicos C 18

4 ndash Esqualeno

5 ndash Padratildeo interno (araquidato de laurilo)

A ndash Eacutesteres diterpeacutenicos

B ndash Ceras

C ndash Eacutesteres de esteroacuteis e eacutesteres triterpeacutenicos

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Figura 4

Parte do cromatograma de um azeite virgem extra e do mesmo azeite apoacutes a adiccedilatildeo de azeite desodorizado

Legenda

1 ndash Padratildeo interno (miristato de metilo)

2 ndash Palmitato de metilo

3 ndash Palmitato de etilo

4 ndash Padratildeo interno (heptadecanoato de metilo)

5 ndash Linoleato de metilo

6 ndash Oleato de metilo

7 ndash Estearato de metilo

8 ndash Linoleato de etilo

9 ndash Oleato de etilo

10 ndash Estearato de etilo

PT 2712011 Jornal Oficial da Uniatildeo Europeia L 2313

Apecircndice A

Determinaccedilatildeo da velocidade linear do gaacutes

Injectar 1 a 3 μl de metano (ou propano) no cromatoacutegrafo de fase gasosa regulado para as condiccedilotildees normais de trabalho e medir o tempo necessaacuterio para o gaacutes percorrer a coluna desde o momento da injecccedilatildeo ateacute ao registo do respectivo pico (tM)

A velocidade linear expressa em cms eacute dada por LtM sendo L o comprimento da coluna expresso em centiacutemetros e tM o tempo de retenccedilatildeo expresso em segundosraquo

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Figura 2

Eacutesteres metiacutelicos eacutesteres etiacutelicos e ceras num azeite virgem

Legenda

1 ndash Eacutesteres metiacutelicos C 16

2 ndash Eacutesteres etiacutelicos C 16

3 ndash Padratildeo interno (heptadecanoato de metilo)

4 ndash Eacutesteres metiacutelicos C 18

5 ndash Eacutesteres etiacutelicos C 18

6 ndash Esqualeno

7 ndash Padratildeo interno (araquidato de laurilo)

A ndash Eacutesteres diterpeacutenicos

B ndash Ceras

C ndash Eacutesteres de esteroacuteis e eacutesteres triterpeacutenicos

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Figura 3

Eacutesteres metiacutelicos eacutesteres etiacutelicos e ceras num azeite virgem extra

Legenda

1 ndash Padratildeo interno (heptadecanoato de metilo)

2 ndash Eacutesteres metiacutelicos C 18

3 ndash Eacutesteres etiacutelicos C 18

4 ndash Esqualeno

5 ndash Padratildeo interno (araquidato de laurilo)

A ndash Eacutesteres diterpeacutenicos

B ndash Ceras

C ndash Eacutesteres de esteroacuteis e eacutesteres triterpeacutenicos

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Figura 4

Parte do cromatograma de um azeite virgem extra e do mesmo azeite apoacutes a adiccedilatildeo de azeite desodorizado

Legenda

1 ndash Padratildeo interno (miristato de metilo)

2 ndash Palmitato de metilo

3 ndash Palmitato de etilo

4 ndash Padratildeo interno (heptadecanoato de metilo)

5 ndash Linoleato de metilo

6 ndash Oleato de metilo

7 ndash Estearato de metilo

8 ndash Linoleato de etilo

9 ndash Oleato de etilo

10 ndash Estearato de etilo

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Apecircndice A

Determinaccedilatildeo da velocidade linear do gaacutes

Injectar 1 a 3 μl de metano (ou propano) no cromatoacutegrafo de fase gasosa regulado para as condiccedilotildees normais de trabalho e medir o tempo necessaacuterio para o gaacutes percorrer a coluna desde o momento da injecccedilatildeo ateacute ao registo do respectivo pico (tM)

A velocidade linear expressa em cms eacute dada por LtM sendo L o comprimento da coluna expresso em centiacutemetros e tM o tempo de retenccedilatildeo expresso em segundosraquo

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Figura 3

Eacutesteres metiacutelicos eacutesteres etiacutelicos e ceras num azeite virgem extra

Legenda

1 ndash Padratildeo interno (heptadecanoato de metilo)

2 ndash Eacutesteres metiacutelicos C 18

3 ndash Eacutesteres etiacutelicos C 18

4 ndash Esqualeno

5 ndash Padratildeo interno (araquidato de laurilo)

A ndash Eacutesteres diterpeacutenicos

B ndash Ceras

C ndash Eacutesteres de esteroacuteis e eacutesteres triterpeacutenicos

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Figura 4

Parte do cromatograma de um azeite virgem extra e do mesmo azeite apoacutes a adiccedilatildeo de azeite desodorizado

Legenda

1 ndash Padratildeo interno (miristato de metilo)

2 ndash Palmitato de metilo

3 ndash Palmitato de etilo

4 ndash Padratildeo interno (heptadecanoato de metilo)

5 ndash Linoleato de metilo

6 ndash Oleato de metilo

7 ndash Estearato de metilo

8 ndash Linoleato de etilo

9 ndash Oleato de etilo

10 ndash Estearato de etilo

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Apecircndice A

Determinaccedilatildeo da velocidade linear do gaacutes

Injectar 1 a 3 μl de metano (ou propano) no cromatoacutegrafo de fase gasosa regulado para as condiccedilotildees normais de trabalho e medir o tempo necessaacuterio para o gaacutes percorrer a coluna desde o momento da injecccedilatildeo ateacute ao registo do respectivo pico (tM)

A velocidade linear expressa em cms eacute dada por LtM sendo L o comprimento da coluna expresso em centiacutemetros e tM o tempo de retenccedilatildeo expresso em segundosraquo

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Figura 4

Parte do cromatograma de um azeite virgem extra e do mesmo azeite apoacutes a adiccedilatildeo de azeite desodorizado

Legenda

1 ndash Padratildeo interno (miristato de metilo)

2 ndash Palmitato de metilo

3 ndash Palmitato de etilo

4 ndash Padratildeo interno (heptadecanoato de metilo)

5 ndash Linoleato de metilo

6 ndash Oleato de metilo

7 ndash Estearato de metilo

8 ndash Linoleato de etilo

9 ndash Oleato de etilo

10 ndash Estearato de etilo

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Apecircndice A

Determinaccedilatildeo da velocidade linear do gaacutes

Injectar 1 a 3 μl de metano (ou propano) no cromatoacutegrafo de fase gasosa regulado para as condiccedilotildees normais de trabalho e medir o tempo necessaacuterio para o gaacutes percorrer a coluna desde o momento da injecccedilatildeo ateacute ao registo do respectivo pico (tM)

A velocidade linear expressa em cms eacute dada por LtM sendo L o comprimento da coluna expresso em centiacutemetros e tM o tempo de retenccedilatildeo expresso em segundosraquo

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Apecircndice A

Determinaccedilatildeo da velocidade linear do gaacutes

Injectar 1 a 3 μl de metano (ou propano) no cromatoacutegrafo de fase gasosa regulado para as condiccedilotildees normais de trabalho e medir o tempo necessaacuterio para o gaacutes percorrer a coluna desde o momento da injecccedilatildeo ateacute ao registo do respectivo pico (tM)

A velocidade linear expressa em cms eacute dada por LtM sendo L o comprimento da coluna expresso em centiacutemetros e tM o tempo de retenccedilatildeo expresso em segundosraquo

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