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UNIVERSIDADE DE FRANCA FERNANDA DINIZ DE SOUSA RELATÓRIOS AULAS PRÁTICAS Trabalho apresentado a Universidade de Franca, para a matéria de Bacteriologia Geral, de todas as aulas práticas feitas Prof. Dr. Carlos Henrique G. Martins

Relatório aula prática bacteriologia

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Aulas práticas de bacteriologia

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UNIVERSIDADE DE FRANCAFERNANDA DINIZ DE SOUSA

RELATRIOS AULAS PRTICAS

Trabalho apresentado a Universidade de Franca,para a matria de Bacteriologia Geral,de todas as aulas prticas feitas

Prof. Dr. Carlos Henrique G. Martins

FRANCA 2015SumrioColorao de Gram5Introduo5Objetivo5Materiais e Reagentes5Procedimento Experimental5Resultado.5Concluso6Colorao de Ziehl-Neelsen6Introduo6Objetivo6Materiais e Reagentes6Procedimentos6Resultado7Concluso7Colorao de Parede (Mtodo de Robinow)7Introduo7Objetivo7Materiais e Reagentes7Procedimentos7Resultado8Concluso8Mtodo de Impregnao pela Prata (Fontana Tribomdeau)8Introduo8Objetivo8Materiais e Reagentes8Procedimentos8Resultado9Concluso9Colorao de Esporos (Mtodo de Wirtz)9Introduo9Objetivo9Materiais e Reagentes9Procedimentos9Resultado10Concluso10Colorao de Cpsula (Mtodo de JH)10Introcuo10Objetivo10Materiais e Reagentes10Procedimentos10Resultado10Concluso10Introduo11Objetivo11Fezes e Urina11Materiais e Reagentes11Procedimento11Resultado12Concluso12Semeadura de Bactrias em diferentes condies de cultura e incubao.12Introduo12Objetivo12Materiais e Reagentes12Procedimentos13Resultado13Concluso13Identificao Bacteriana da Famlia Enterobacteriaceae13Introduo13Objetivo13Materiais e Reagentes13Procedimento14Resultado14Concluso15Identificao de cocos Gram Positivo15Introduo15Objetivo15Materiais e Reagentes15Procedimento16Resultado16Concluso16Avaliao da atividade antimicrobiana de agentes fsicos e qumicos17Introduo17Objetivo17Materiais e Reagentes17Procedimento17Resultado18Concluso18Antibiograma Disco Difuso18Introduo18Objetivo19Materiais e Reagentes19Procedimentos19Resultado19Concluso20Testes de Sensibilidade dos antimicrobianos20Introduo20Objetivos20Materiais e Reagentes20Procedimento21Resultados21Concluso21Conjuno Bacteriana21Introduo21Objetivo21Materiais21Procedimentos22Resultado22Concluso22Referncias Bibliogrficas23

Coloraes:Colorao de Gram

IntroduoA colorao de Gram recebeu este nome em homenagem a seu descobridor, o mdico dinamarqus Hans Cristian Joaquim Gram. Em 1884, Gram observou que as bactrias adquiriram cores diferentes, quando tratadas com diferentes corantes. Isso permitiu classific-las em dois grupos distintos: as que ficavam roxas, que foram chamadas de Gram-positivas, e as que ficavam vermelhas, chamadas de Gram-negativas. Aps descrio do mtodo, inmeras propostas de modificao foram feitas.O mtodo tintorial predominante utilizado em bacteriologia o mtodo de Gram. A bacterioscopia, aps colorao pelo mtodo de Gram com diagnstico presuntivo, de triagem, ou at mesmo confirmatrio em alguns casos, constituindo-se uma pea importante e fundamental. Essa tcnica simples, rpida e tem capacidade de resoluo, permitindo o correto diagnstico em cerca de 80% dos pacientes em carter de pronto atendimento em nvel local.

ObjetivoSaber identificar se a bactria Gram positiva ou Gram negativa, qual o seu arranjo e a sua forma, a partir do microscpio ptico.

Materiais e Reagentes Lmina Placa de Petri com a bactria Bico de Bunsen Ala de Platina gua corrente Cristal Violeta Lugol lcool-Acetona Fucsina

Procedimento Experimental Fazer um esfregao fino, uma bactria por lmina Fixar o esfregao, passando a lmina trs vezes sob o bico de Bunsen. Cobrir a lmina com Cristal Violeta (corante bsico) 1 minuto. Escorrer o excesso e cobrir a lmina com Lugol (mordente) 1 minuto. Lavar a lmina delicadamente em gua corrente. Escorrer at desprender o corante com uma soluo lcool-acetona (1.1) descorante Lavar a lmina delicadamente em gua corrente Cobrir a lmina com Fucsina (corante bsico) 30 segundos. Escorrer e lavar a lmina delicadamente em gua corrente Deixar secar e observar a lmina em objetiva de imerso.

Resultado.

ResultadoFormaArranjoGramDiagnsticoPresuntivo

L. caseiBaciloPositiva

S. aureusCocosCacho de uvaPositiva

E. coliBaciloNegativa

Yersinia sp.BaciloNegativa

B. MegateriumBaciloEstreptobaciloPositivaGonococo

MeningococoNisseria gonorrhoeaeNisseria meningitidis

Neisseria sp.CocosDiplococoNegativa

Streprococus mutanscocosCadeia Positiva

ConclusoA realizao de identificao de bactrias, atravs da colorao de Gram, permitiu-se distinguir se era positivo ou negativo, com ajuda pela cor, Gram-negativa, vermelha e Gram-positiva, roxa. Conseguiu-se identificar a sua forma e arranjo.Colorao de Ziehl-Neelsen

IntroduoA colorao de Ziehl-Neelsen baseasse na capacidade de algumas bactrias (microbactria e actinomicetes) resistirem aos mtodos comuns de colorao devido composio altamente lipdica da parede celular. Aps um processo de colorao especial a quente uma vez coradas no sofrem ao de descorantes fortes como soluo de lcool cido. Desta forma, a fucsina de Ziehl cora todas as bactrias de vermelhos, e aps de descolorao com lcool-cido somente os bacilos lcool-cido resistentes (BAAR) conservaro est cor. para facilitar a visualizao cora-se o fundo com azul metileno, estabelecendose contraste ntido entre elementos celulares e outras bactrias (azuis) e os BAAR (vermelhos).

ObjetivoConseguir identificar as microbactrias, que so conhecidas como bacilos lcool-cido resistente (BAAR).

Materiais e Reagentes Placa de Petri com a bactria Lmina Ala de Platina Bico de Bunsen Fucsina de Ziehl concentrada lcool-cido Clordrico a 1% gua corrente Algodo Fogo Soluo diluda de azul de metileno Microscpio

Procedimentos Fazer um esfregao com Mycobacterium sp. Fixar no calor Corar com fucsina de Ziehl concentrada, aquecendo cuidadosamente a lmina at a emisso de vapor, durante 5 minutos. Escorrer o corante e diferenciar com lcool-cido clordrico a 1%. Lavar com gua corrente, delicadamente. Corar com uma soluo diluda de azul de metileno 30 segundos Lavar com gua corrente e secar. Observa em objetiva de imerso.

Resultado

Microrganismoformaziehl-neelsen

M. smugmatisBaciloBAAR

ConclusoA colorao de Ziehl Neelsen foi realizada com sucesso, j que conseguimos identificar a micobactria, que forma de bacilos e aparece sempre em rosa.Colorao de Parede (Mtodo de Robinow)

IntroduoO mtodo de Robinow & Murray reputado por seus autores como especfico para demonstrar a parede celular de bactrias, fornece contraste ntido a essa estrutura quando aplicado a bactrias Gram positivas. Todavia, em se tratando de bactrias Gram negativas, no se consegue resultados satisfatrios porque todo o corpo bacteriano se torna corado. Knaysi empregando um mordente preparado com cido tnico e alumen de potssio, seguido de colorao com fucsina, conseguiu evidenciar bem a parede celular. O processo, contudo, envolve uma delicadeza de tcnica que acaba por torn-lo pouco prtico. Procurando encontrar um mtodo que pudesse revelar a citada estrutura e que reunisse praticabilidade a condio de eficincia para bactrias Gram positivas e Gram negativas, fomos levados a ensaiar o emprego de um mordente cido, capaz de transformar os componentes do citoplasma de corveis em no corveis, e, ao mesmo tempo, impregnar a camada superficial de forma a torn-la suficientemente ntida sob ao de um corante. Scanga reconhece no cido tnico a propriedade de promover aquela modificao no citoplasma e verificamos que a adio de pequenas propores de cloreto frrico favorece a alterao desejada. Conseguimos nosso objetivo com um mordente composto de cido tnico e cloreto frrico, em solues a 5% e 2% respectivamente. Bactrias submetidas a tal mordente e depois coradas com Azul Vitria ou Verde Malaquita, exibiram, em bom contraste, a camada superficial.

Objetivo conseguir corar a parede celular, que tem melhor resultado em uma bactria Gram-Positiva, j que sua parede celular mais fina que a Gram-Negativa.

Materiais e Reagentes Lmina Bactria B. megaterium 4h (BHI) Ala de platina Bico de Bunsen Soluo de cido tnico Violeta de genciana gua Microscpio.

Procedimentos Fazer um esfregao em lmina (Bacillus Megaterium) 4h BHI Deixar secar Mergulhar a lmina em uma soluo de cido tnico (sol. A) 20 minutos Lavar com gua corrente Cobrir o esfregao com violeta de genciana (sol. B) 30 segundos Lava com gua corrente Deixar secar Observar com objetiva de imerso

ResultadoBactriaFormaArranjo

B. megateriumBacilo-

ConclusoA colorao de parede foi realizada com sucesso, pois conseguimos identificar a sua forma, bacilo, que gram-positiva.Mtodo de Impregnao pela Prata (Fontana Tribomdeau)

IntroduoDesenvolvido em 1920, no um mtodo de colorao verdadeiro. Na realidade, trata-se de uma tcnica de impregnao pela prata usada para auxiliar a visualizao de bactrias espiraladas, as quais, geralmente, so muito finas e se coram de forma insuficiente pelo Gram (ex.: Treponema pallidum e Leptospira interrogans). A partir desta tcnica, as espiroquetas aparecem em cor marrom-escura ou negra, sobre um fundo amarelo-castanho ou marrom-claro.As espiroquetas so bactrias presentes na placa bacteriana, que so facilmente reconhecidas. Elas tambm so encontradas no clculo dentrio e nas bolsas periodontais. Podem ser visualizadas atravs de vrios mtodos como o exame de campo escuro, colorao pelo Giemsa, esfregaos com tinta da China, demonstrao das espiroquetas em corte. Sendo que na prtica iremos utilizar o mtodo de Fontana-Tribondeau que ser descrito mais detalhadamente frente.As espiroquetas so divididas em duas famlias principais: Spirochaetaceae e uma outra de importncia como patgenos humanos: Treponemaceae. Sendo que est ltima tem como principais gneros: Treponema, Borrelia e Leptospira. E esta famlia possui como caractersticas gerais: bacilos longos e delgados, espiralados e GRAM negativo, apresentando flagelos que do mobilidade bactria.

ObjetivoConseguir visualizar as espiroquetas e identifica-las.

Materiais e Reagentes Lmina Palito de dente Sulco da Gengiva (Treponema sp) Lquido de Rouge (Fixador A) Soluo B gua gua destilada Soluo impregnadora (soluo C) Bico de Bunsen Fogo Microscpio

Procedimentos Com um palito de dente, colher amostras do sulco da gengiva dos dentes posteriores Fazer um esfregao em lmina Deixar secar e fixar o esfregao em lquido de Rouge (fixador A) 1 minuto Lavar cuidadosamente em gua corrente Mordiar com soluo B, aquecendo at emisso de vapor Lavar em gua corrente e aps com gua destilada Cobrir com soluo impregnadora (soluo C) e aquecer at emisso de vapores 30 segundos Lavar em gua corrente e deixar secar Observar em objetiva de imerso.

ResultadoTreponema sp................................. espiroquetas.

ConclusoA impregnao pela prata foi realizada com sucesso, j que conseguimos identificar as espiroquetas, visualizadas na cor marrom-escura.

Colorao de Esporos (Mtodo de Wirtz)

IntroduoA parede dos esporos constitui uma barreira eficaz contra a entrada e sada de materiais do esporo, mas por sua impermeabilidade, geralmente refringente e de difcil colorao. A exposio prolongada ao corante verde malaquita, associado ao aquecimento, permite a penetrao do corante e a colorao do esporo por um verde intenso. Como contraste (contracorante), utiliza-se a safranina, que cora outras estruturas em vermelho, facilitando a diferenciao dos esporos.Um endosporo uma estrutura especial resistente, dormente, formada dentro de uma clula que protege uma bactria das condies ambientais adversas. Embora os endosporos sejam relativamente incomuns nas clulas bacterianas, podem ser formados por alguns gneros de bactrias. Os endosporos no podem ser corados pelos mtodos comuns, como a colorao simples e a colorao de Gram, pois os corantes no penetram a parede do endosporo.

ObjetivoO objetivo conseguir distinguir o que so os esporos.

Materiais e Reagentes Lmina B. megaterium Verde Malaquita Ala de platina Bico de Bunsen Fogo gua corrente Safranina Microscpio

Procedimentos Fazer um esfregao fino de B. megaterium Deixar secar e fixar a lmina Cobrir o esfregao com verde malaquita Aquecer a lmina at a emisso de vapor 2 minutos Lavar em gua corrente Cobrir o esfregao com Safranina 1 minuto Lavar em gua corrente Deixar secar e observar em objetiva de imerso

ResultadoOs esporos foram corados de verde e as bactrias de vermelho, e os esporos so esfricos.

ConclusoA colorao de esporos foi um sucesso, j que conseguiu ver os esporos e conseguir diferencia-los.

Colorao de Cpsula (Mtodo de JH)

IntrocuoMuitos micro-organismos contm um revestimento gelatinoso denominada cpsula. Na microbiologia mdica, a demonstrao da presena de uma cpsula um modo de determinar a virulncia do organismo, o grau em que um patgeno pode causar doena.A colorao da cpsula mais difcil que outros tipos de procedimentos de colorao, pois os materiais capsulares so solveis em gua e podem ser desalojados ou removidos durante uma lavagem rigorosa. Para demonstrar a presena de cpsulas, um microbiologista pode misturar as bactrias em uma soluo contendo uma fina suspenso coloidal de partculas coradas (geralmente com tinta nanquim ou nigrosina), para fornecer um fundo contrastante e ento corar as bactrias com uma colorao simples, como a safranina. Devido sua composio qumica, as cpsulas no reagem com a maioria dos corantes, como a safranina, e desse modo aparecem como halos circundando cada clula bacteriana.

ObjetivoO objetivo conseguir visualizar as cpsulas.

Materiais e Reagentes Lmina Bico de Bunsen Ala de platina Fucsina 1% Klebsiella pneumoniae Eosina 1% Microscpio

Procedimentos Colocar 1 gota de fucsina 1% na lmina, misturar nesta gota uma alada do crescimento de Klebsiella pneumoniae, sem espalhar a gota deixar em repouso por 30 segundos Acrescentar 1 gota de eosina 1%, bronogeneizar 1 minuto Fazer o esfregao com auxlio de outra lmina Deixar secar Observar em objetiva de imerso

ResultadoA cpsula visvel na cor rosa e por dentro se v em amarelo ou transparente.

ConclusoA colorao de cpsula foi um sucesso, pois foi fcil visualizar a cpsula, consegue se deferenciar.

Tcnica de Isolamento por Esgotamento:

IntroduoA maioria dos materiais infecciosos, como pus, escarro e urina, contm diversos tipos de bactrias; da mesma forma que amostras de solo, gua ou alimento. Quando esses materiais so semeados na superfcie de meio slido, as colnias formam cpias exatas do organismo original. Uma colnia visvel teoricamente vem de um nico esporo ou clula vegetativa ou de um grupo dos mesmos microrganismos juntos em agregados ou cadeias. As colnias microbianas frequentemente tm aparncia diferente, o que permite distinguir um microrganismo do outro. As bactrias devem ser espalhadas de maneira suficientemente ampla na placa para que as colnias possam ser separadas umas das outras.

ObjetivoVisualizar os crescimentos das bactrias e as divises das colnias.

Fezes e UrinaMateriais e Reagentes Fezes Urina Escarro Meios de cultura: Placa MC MH CLED AS TSA cido Citrato SS Caldos TSA BHI MH VB Selenito Motilidade Ala de platina Bico de Bunsen Placa de Petri Agulha de prata

Procedimento Na placa do meio de cultura de CLED, se faz um risco com urina no meio e depois estreia-se a placa inteira. Nos meios de cultura na placa, faz-se estrias com urina, fezes ou escarro. Como a imagem a baixo: No caldo de Motilidade, coloca-se a agulha com fezes exatamente no meio do tudo, sem tremer, no chegando at o final. No caldo TSA, faz-se estrias apenas na parte inclinada do tubo. Nos outros meios, com uma alada da amostra, homogeneza-se no caldo.

ResultadoPgina | 22

Meios:MC urina colnia isoladaMH escarro isolou CLED urina ficou amarelo, 1 bactriaAS fezes isolou Citrato fezes no aconteceu nada, h presena de bactriaTSA urina uma colnia SS fezes coliforme fecal, isolou em uma colnia

Caldos:TSA fezes bactria cresceu, tudo inclinadoBHI urina turvou, cresceuMH fezes turvou, cresceuVB fezes turvou, cresceuSelenito fezes turvou, cresceuMotilidade fezes bactria cresceu na parte superior.

ConclusoConseguimos visualizar as colnias isoladas nas placas, e o crescimento das bactrias nos dois meios (gar e caldo) com as amostras fornecidas.

Semeadura de Bactrias em diferentes condies de cultura e incubao.

IntroduoTcnica de Isolamento por esgotamento.

ObjetivoVisualizar o crescimento das bactrias conforme a sua incubao e o meio.

Materiais e Reagentes Bactria: Yersinia sp Ala de platina Bico de Bunsen Meios: gar sangue gar BHI gar EMB gar CLED gar SS gar-gar gar MH gar Mitis-Salivarius Incubao: 37C aerbia (estufa bacteriolgica) Microaerofilia a 37C Anaerobiose (jarra + gerador de anaerobiose) 2 a 8C - geladeira Temperatura Ambiente 42 aerobiose

Procedimentos Com uma alada da bactria escolhida, faz-se as estreias, em cada meio de cultura. Depois se dividiu as placas para se incubar.

ResultadoYersinia sp.Meio: gar SangueCresceu em temperatura ambienteMeio: gar BHICresceu em Microaerofilia a 37C e no cresceu em 2 a 8CMeio: gar EMBNo cresceu em Anaerobiose e 2 a 8CMeio: gar CLEDCresceu em Microaerofilia a 37 e temperatura ambienteMeio: gar SSCresceu em Microaerofilia a 37Meio: gar-garNo cresceu em 37 AerobioseMeio: gar MHCresceu em temperatura ambiente e no cresceu em AnaerobioseMeio: gar Mitis-SalivariusCresceu em 37C aerobiose

ConclusoA Yersinia sp uma bactria que cresce em temperaturas mais elevadas, em meio gar-gar no se cresce bactria e em alguns meios tambm no cresceu. E a bactria tambm no se cresce na temperatura baixa, na geladeira.

Bioquimismo bacteriano:

Identificao Bacteriana da Famlia Enterobacteriaceae

IntroduoO passo final para a identificao de uma bactria dado pelo Estudo do seu bioquimismo. Para este estudo, crucial o isolamento das bactrias em questo, impedindo a contaminao para que no haja erro de identificao. Podemos realizar uma srie de testes, optando por aquele que nos parece mais adequado.Enterobacteriaceae uma famlia de bactrias Gram-negativas muito abundante, incluindo uma grande variedade de bactrias patognicas.

ObjetivoIdentificao de bactrias por meio de indicadores de pH e por meio de testes bioqumicos.

Materiais e Reagentes Bactria 01 Semeaduras: Glicose (lquido) Lactose (lquido) Sacrose (lquido) Manitol (lquido) Sorbitol (lquido) Maltose (lquido) Malonato de sdio (lquido) Indol (lquido) Rafinose (lquido) Adonitol (lquido) Lisina (lquido) Ornitina (lquido) Arginina (lquido) Controle de aminocidos (lquido) DNase (placa) Motilidade (tubo, slido) Citrato (tubo, slido) Ureia (tubo, slido) Fenilalanina (tubo, slido) TSI (tubo, slido) Ala de platina Agulha de platina Bico de Bunsen Estante Placa de Petri

Procedimento Nas semeaduras em lquido, com uma alada da bactria se mistura com os meios, sempre flambando a ala ao mudar de meio. Na placa de DNase, com a ala, pegar um pouco da bactria e fazer um crculo no meio da placa. Na motilidade, com a agulha, introduzir no meio no encostando no final do tudo, uma linha reta. No citrato, com a agulha fazer um risco na parte inclinada Na ureia, com agulha ou ala fazer estreias na parte inclinada Na fenilalanina, com ala ou agulha fazer estreias na parte inclinada. No TSI, com a agulha, introduzir no meio no encostando no fim do tubo, uma linha, e na parte inclinada uma estria. Na Lisina, Ornitina, Arginina e no controle, coloca-se um leo vegetal estril.

ResultadoMotilidade positivoCitrato negativo (o fundo ficou verde em cima ficou azul)TSI H2S negativoGlicose positivoLactose e Sacarose positivoUreia positivo (D)Fenilalanina (cloreto frrico) negativoArginina negativoGlicose negativoLactose negativoSacarose negativoManitol positivoSorbitol positivoMaltose positivoOrnitina positivoIndol (Kovac's) positivoLisina negativoRafinose negativoAdonitol negativoDNase - negativoMalanato de sdio pH neutro

ConclusoAps os testes de bioqumicos, e comparar com a tabela, a bactria que eu escolhi para fazer, foi Yersinia sp.

AntibiogramaIdentificao de cocos Gram PositivoIntroduoO antibiograma um exame de diagnstico que consegue identificar qual a bactria que est causando a infeco no indivduo, indicando tambm qual o antibitico mais indicado para o seu tratamento.Quando um paciente tem uma infeco causada por bactrias, geralmente receitado um antibitico capaz de eliminar estas bactrias, mas algumas infeces nem sempre so causadas por um tipo conhecido de bactrias e, nesse caso, receitar um antibitico que no seja eficaz contra esses micro-organismos pode piorar a infeco.Antibiograma por difuso em gar: neste procedimento so colocados pequenos discos de papel que contm diferentes antibiticos na placa onde as bactrias crescem. Aps algumas horas observa-se se existiu crescimento de bactrias em voltas dos discos e na ausncia de crescimento bacteriano, descobre-se qual o antibitico mais adequado.O resultado do antibiograma pode demorar 4 a 5 dias e obtido atravs da anlise do efeito dos antibiticos no crescimento das bactrias. O antibitico que inibir o crescimento das bactrias o indicado para tratar a infeco, mas caso as bactrias cresam e os antibiticos no tenham efeito, o resultado um antibiograma negativo, sendo necessrio utilizar outras tcnicas para identificar a bactria e combater a infeco.

Objetivo identificar o halo de inibio dos antibiticos, saber se resistente ou no. E por meio dos testes Bioqumicos conseguir identificar a bactria escolhida.

Materiais e Reagentes Bactria 03 Ala de platina Discos: Polimixina Novabiocina Tubo de ensaio Bico de Bunsen Plasma de coelho Banho Maria Escala de 0,5 McFarland Swab Soluo salina Placa de MH Tubo com H2O2 Palito estril Placa de DNase Xilol Sacarose Trealose Maltose

Procedimento O primeiro teste a se fazer foi o da Catalase: Com um palito estril pegar um pouco do crescimento bacteriano e colocar no tubo com H2O2. Observar formao de bolhas. Positivo: Staphylococcus Negativo: StreptococcusSe o teste de Catalase der positivo fazer: O segundo teste feito foi o Coagular: Adicionar em um tubo 500L de plasma de coelho + uma alada de crescimento bacteriano Colocar em banho-maria a 37C e observar a formao de cogulo a cada 30 minutos Depois fez-se os Discos, polimixina e novobiocina. Fazer um inoculo em soluo salina (escala 0,5 McFarland). Semear com swab por toda a placa de MH. Aplicar os discos de polimixina e novobiocina Incubar a 37C por 24 horas. Aps, fez-se o DNase: Com o auxlio de uma ala de platina, inocular as colnias em forma circular central sobre o gar. Incubar por at 72 horas a 37C. E o ltimo teste a se fazer foi o do Carboidratos: Com auxlio de uma ala de platina, dissolver as colnias no caldo de cada carboidrato: Xilol Sacarose Trealose MaltoseSe o teste de Catalase der negativo fazer: Teste Camp: Fazer uma estria com Staphylococcus aureus. Fazer estrias paralelas das bactrias a ser identificada sem encostar na estria de S. aureus. Meio: gar Sangue NaCl 65% (Caldo): com auxlio da ala, inocular as colnias no tubo. Incubar. Bile Escubina: Estriar as colnias na superfcie do gar. Incubar. Discos de Bacitracina e Optoquina: Fazer um inoculo em soluo salina (escala de 0,5 McFarland) semear com swab por toda a placa de gar sangue. Aplicar o disco de Bacitracina e Optativa. Incubar.

Resultado Catalase: Positivo DNase: Negativo MH: - novobiocina: 0mm - resistente - poliximina: 16mm qualquer halo inibio. Trealose: positivo Maltose: positivo Sacarose: positivo Xilol: negativo Coagulase: negativo

ConclusoAps os resultados e os testes feitos, se compara com a tabela, e a bactria escolhida foi S. saprophyticus.

Avaliao da atividade antimicrobiana de agentes fsicos e qumicosIntroduoOs agentes microbianos podem ser microbicidas, que matam os microorganismos, ou microbiostico, que apenas inibem o crescimento destes.O critrio de morte de um microrganismo em Microbiologia baseado em uma nica propriedade: a capacidade de se reproduzir.Agentes fsicosO mtodo mais empregado para matar microorganismos o calor, por ser eficaz, barato e prtico. Os microorganismos so considerados mortos quando perdem a capacidade de multiplicar. Eles so: calor mido, calor seco, pasteurizao, radiaes, indicadores biolgicos, microndas, filtrao, presso osmtica, dessecao.Agentes qumicosOs agentes qumicos so apresentados em grupos que tenham em comum, ou as funes qumicas, ou elementos qumicos, ou mecanismo de ao.So eles: lcoois, aldedos e derivados, fenis e derivados, halognicos e derivados, cidos inorgnicas e orgnicos, agentes de superfcie, metais pesados e derivados, agentes oxidantes, esterilizantes gasosos.

ObjetivoIdentificar o crescimento das bactrias nos agentes fsicos, e tambm conseguir identificar o halo dos agentes qumicos na bactria escolhida.

Materiais e Reagentes Tiras de algodo vermelha e preta Tubos com gua peptonada Ala de platina Bico de Bunsen Estufa 45C Temperatura Ambiente Pipeta estril C. albicans lquido B. subtilis lquido S. aureus lquido P. aeruginosa lquido Escala de McFarland Swab Placa de MH C. albicans placa Discos de papel de filtro com 50L de: Proplis Periogard Plax Listerine Hipoclorito

Procedimento Agente Fsico Na tira de algodo preta se umedece com S. aureus e P. aeruginosa (2 vezes) e coloca uma em cada tudo com gua peptonada, identificando a bactria, uma ir para a estufa de 45 e a outra ficar em temperatura ambiente. Na tira de algodo vermelha se umedece com C. albicans e B. subtilis (2 vezes) e coloca uma em cada tudo com gua peptonada, identificando a bactria, uma ir para a estufa de 45 e a outra ficar em temperatura ambiente.

Agente Qumico Turvar a bactria C. albicans na escala 0,5 McFarland. Semear com swab na placa de gar Mueller-Hinton, em campo sobrepostos Umedecer os discos de papel de filtro com 50L de cada agente qumico: Prpolis Periogard Plax Listerine Hipoclorito Colocar os discos nas placas espaados, e identificar o lugar e o agente qumico na placa.

Resultado Agente FsicoTemperatura ambienteestufa de 45

B. subtilisPresentePresente

S. aureusPresente Presente

P. aeruginosaPresentePresente

C. albicansPresentePresente

Agente QumicoFungo: C. albicansListerine 0mmHipoclorito 36mmPlax 11mmPeriogard 14mmPrpolis 9mm

Concluso Agente FsicosAs bactrias sobreviveram nas temperaturas expostas, por mais que seja um mesofilo, sobrevive a mais de 45C.

Agentes QumicosPor ter fatores que tenha interferncia como, o tanto de inoculo que passou na placa, a concentrao dos agentes qumicos, a validade do produto, pode ter dado algumas diferenas.O Hipoclorito o que age com mais eficcia, o listerine por ser um antissptico bocal, ele no conseguiu ser eficaz, pelo fato de C. albicans ser um fungo tambm encontrado na boca, ele no fez efeito, mas pode ter tido interferncia porque o produto estava vencido.

Antibiograma Disco Difuso

IntroduoO teste de disco-difuso em gar foi descrito em 1966, por Bauer e Kirby. O teste fornece resultados qualitativos. um dos mtodos de suscetibilidade mais simples, confivel e mais utilizado pelos laboratrios de microbiologia. O seu princpio bsico a difuso do antimicrobiano na superfcie do gar, a partir de um disco impregnado com o mesmo antimicrobianoO teste realizado dispensando os discos de papel-filtro, impregnados com antimicrobianos em concentraes fixas, sobre a placa de gar, aps a semeadura do inculo bacteriano com aproximadamente 1 a 2 x 108 UFC/mL.Antibiograma por difuso em agar: neste procedimento so colocados pequenos discos de papel que contm diferentes antibiticos na placa onde as bactrias crescem. Aps algumas horas observa-se se existiu crescimento de bactrias em voltas dos discos e na ausncia de crescimento bacteriano, descobre-se qual o antibitico mais adequado.

ObjetivoConseguir identificar o halo dos antibiticos e com auxlio de uma tabela, saber se resistente, intermedirio ou sensvel.

Materiais e Reagentes Ala de Platina Bico de Bunsen Bactrias: Escheria coli (Gram negativa) Staphylococcus aureus (Gram positiva) gar MH Escala de McFarland Discos para E.coli Sulfa + Trimetoprim SUT Tetraciclina TET Cefalotina - CFL Ampicilina AMP Ciprofloxacina CIP Gentamicina GEN Tobramicina - TOB Discos para S. aureus Penincilina PEN Cefalotina CFL Amicacina AMI Clorafenicol CLO Ampicilina AMP Oxacilina OXA

Procedimentos Padronizado: Meio de Cultura gar MH Espessura de 4 a 6 mm Inoculo 1,5x108 UFC/ml (comparao com a escala de 0,5 McFarland) Em uma soluo salina, fazer um inoculo de E. coli comparando com a escala de McFarland, com um swab espalhar por toda a placa de MH, e colocar os discos de antibiticos. Em uma soluo salina, fazer um inoculo de S. aureus comparando com escala de McFarland, com um swab espalhar por toda a placa de MH, e colocar os discos de antibiticos.

Resultado

E. coliCIP 38mm sensvel SUT 0mm resistente TOB 23mm sensvel AMP 0mm resistente CFL 11mm resistente GEN 24mm sensvel TET 27mm sensvel

S. aureus CFL 43mm sensvelCLO 25,5mm sensvelAMP 42mm sensvelPEN 47mm sensvelAMI 28 mm sensvelOXA 31mm sensvelTET 30mm sensvel

ConclusoAlguns antibiticos para a E. coli so resistente, no fazendo efeito, quando outros so sensveis, fazendo um efeito melhor.J no S. aureus os antibiticos testados so todos sensveis, tendo uma melhor eficcia.

Testes de Sensibilidade dos antimicrobianos

IntroduoA realizao do teste de sensibilidade aos antimicrobianos (TSA) uma das principais tarefas executadas pelo laboratrio de microbiologia. Alm de orientar a escolha da terapia antimicrobiana mais adequada, o TSA representa uma importante ferramenta no monitoramento da evoluo da resistncia bacteriana e age tambm como um mtodo auxiliar na implantao de medidas de controle que evitem a disseminao de bactrias multirresistentes.A tcnica de microdiluio em caldo corresponde miniaturizao da tcnica de macrodiluio.Em vez da utilizao de diversos tubos contendo meio de cultura e antimicrobiano, a tcnica de microdiluio em caldo utiliza placas plsticas estreis, com 96 poos, com o fundo em formato de U, para permitir melhor visualizao do crescimento bacteriano.Nesta placa, um nmero varivel de antimicrobianos, em torno de 12 drogas, colocado em distintas concentraes (4 a 8 diluies logartmicas).

Objetivos

Materiais e Reagentes Ala de platina Bico de Bunsen Placa de Petri Estante Placa de 96 poos Caldo MH E. coli Gentamicina Soluo salina 3ml Soluo salina 4ml Caldo MH 5ml Escala 0,5 McFarland Pipetas automticas Ponteiras

Procedimento Inoculo 01 Com uma alada de bactria colocar na soluo salina de 3 ml, comparando com a escala de McFarland. (1,5x108 UFC/ml) Inoculo 02 Transferir 0,5ml com a pipeta do inoculo 01 para uma soluo salina de 4,5 ml (1,5x107 UFC/ml) Inoculo 03 Transferir 1 ml com pipeta do inoculo 02 para o caldo MH de 5ml (2,5x106 UFC/ml) Quando inocular na microplaca o inoculo estar com 5x105 UFC/ml no poo. Na microplaca, na linha A, nas colunas 1 a 10 e 12 coloca 50L de Caldo. Na linha A1, coloca 50L de Gentamicina, homogeniza Na linha A2, coloca 50L de A1, e assim por diante, em cada pocinho da linha A, colocar 50 L da coluna anterior. Aps isso, nas colunas 1 a 10, da linha A, coloca-se 30L de caldo e 20L de inoculo 03. Na linha H e coluna 1, coloca-se 100L de caldo, que faz o controle do caldo Na linha H, coluna 5, coloca-se 80L de caldo e 20L inoculo 03. Para controle de cultura de E.coli. Feito tudo isso, se joga resazulina nos poos.

Resultados

Onde fica rosa tem vida, onde fica azul no tem vida.O MIC deu no 5 poo, com concentrao 0,3688g/ml.

ConclusoO controle do antibitico Gentamicina, ficou azul, ento indica que ele eficaz, e mata a bactria.O controle do caldo ficou azul, indicando que no est infectado.E o controle do inoculo tem que ficar rosa indicando vida da bactria.Nos 5 primeiros poos ficou azul, indicando que a bactria estava morta e do 6 ao 10 poo ficou rosa, indicando vida.Conclumos que a concentrao do antibitico para matar a bactria tem que ser 0,3688g/ml.

Conjuno Bacteriana

IntroduoNa conjugao bacteriana, pedaos de DNA passam diretamente de uma bactria doadora, o "macho", para uma receptora, a "fmea". Isso acontece atravs de microscpicos tubos proticos, chamados pili, que as bactrias "macho" possuem em sua superfcie.O fragmento de DNA transferido se recombina com o cromossomo da bactria "fmea", produzindo novas misturas genticas, que sero transmitidas s clulas-filhas na prxima diviso celular.

ObjetivoO objetivo dessa prtica ver se teve ou no crescimento da bactria.

Materiais Tubo de 9ml de caldo simples Tubo de E. coli 100 Tubo de E. coli K12 2 Placas de EMB + Estreptoncina + Kanamicina Placa de EMB Placa de EMB + Estreptonicina (200g/ml) Placa de EMB + Kanamicina (20g/ml) Pipeta Ala Bico de Bunsen

Procedimentos Em um tubo de 9ml de caldo simples adicionar 0,1ml de E. coli 100 e 0,9ml de E. coli K12, aps 4 horas semear em uma placa de EMB + Estreptoncina + Kernamicina Semear as bactrias do estudo nas placas: Placa de EMB, Placa de EMB + Estreptonicina (200g/ml), Placa de EMB + Kanamicina (20g/ml) e Placa de EMB + Estreptoncina + Kernamicina Cada placa estar identificada onde semear a K12 e a 100, divida ao meio. Caractersticas das Bactrias: E. coli 100: Doador Resistncia a Kanamicina Plasmidial Lactose + E. coli K12: Receptora Resistncia a Estreptonicina Cromosonal Lactose

Resultado EMB + Kanamicina + Estreptonicina (4h aps)Cresce apenas a K12 EMB Cresce as duas, K12 e 100 EMB + Kanamicina Cresce apenas a 100 EMB + EstreptonicinaCresce apenas a K12 EMB + Kanamicina + EstreptonicinaNo cresce nenhuma.

ConclusoQuando semeamos as duas bactrias no tubo e depois de 4h na placa BEM + Kanamicina + Estreptonicina, a E. coli 100, que sendo uma doadora, doou a resistncia a Kanamicina para a E. coli K12, que uma receptora, fazendo com que ela consiga ficar resistente aos dois antibiticos e assim crescendo, j a 100 no consegue crescer pelo fato de que sendo resistente a Kanamicina cresceria, mas ela no resistente a Estreptonicina, a matando.Na placa EMB cresce as duas bactrias j que o meio seletivo e inibem o crescimento de algumas bactrias gram-positiva e os corantes servem como indicadores de diferenciais da fermentao de carboidratos, portanto, servem para diferenciar fermentadores e no-fermentadores de lactose.Na placa EMB + Kanamicina, cresce apenas a E. coli 100 por conta dela ser resistente a este antibitico, j a K12 morta.Na placa EMB + Estreptonicina cresce apenas a E.coli K12 por ela ser resistente ao antibitico, a 100 acaba morrendo.J na placa EMB + Kanamicina + Estreptonicina no cresce nenhuma porque resistente a um antibitico, mas no a outro, ento acaba morrendo.

Referncias Bibliogrficas

http://www.sobiologia.com.br/conteudos/Reinos/biomonera3.php_Filoneto, M Pilonetto,C.V. manual de procedimentos laboratoriais em microbiologia POPs em Microbiologia. Curitiba microscience, 1998._Farmacopia dos Estados Unidos do Brasil. 2 ed. So Paulo: Siqueira. 1959.http://www.revistas.usp.br/rfmvusp/article/viewFile/62539/65337 http://www.epsjv.fiocruz.br/upload/d/cap3.pdfhttp://www.tuasaude.com/antibiograma/ http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/controle/rede_rm/cursos/atm_racional/modulo2/metodos5.htm http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/controle/rede_rm/cursos/boas_praticas/modulo5/microdiluicao.htm