16
Introdução As enzimas são proteínas que catalisam reações químicas, nos seres vivos e possuem um centro ativo, onde se processam as reações com determinados substratos. O emprego de reações enzimáticas em química analítica tem sido amplamente explorado devido a seu alto poder catalítica e alta seletividade A enzima urease, selecionada para o desenvolvimento desta prática, foi extraído de sementes de soja (outras fontes poderiam ser utilizadas como sementes de melancia). A urease é a enzima responsável pela hidrolise da uréia em amônia e dioxo de carbono. Análises da formação dos produtos da reação catalisada pela uréase, seram o ponto de partida a evidenciarmos a caracterização e propriedades das enzimas.

relatorio bioquimica enzimas

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: relatorio bioquimica enzimas

Introdução

As enzimas são proteínas que catalisam reações químicas, nos seres vivos e possuem um centro ativo, onde se processam as reações com determinados substratos. O emprego de reações enzimáticas em química analítica tem sido amplamente explorado devido a seu alto poder catalítica e alta seletividade A enzima urease, selecionada para o desenvolvimento desta prática, foi extraído de sementes de soja (outras fontes poderiam ser utilizadas como sementes de melancia). A urease é a enzima responsável pela hidrolise da uréia em amônia e dioxo de carbono. Análises da formação dos produtos da reação catalisada pela uréase, seram o ponto de partida a evidenciarmos a caracterização e propriedades das enzimas.

Page 2: relatorio bioquimica enzimas

1 - Objetivo

O principal objetivo dessa prática é evidenciar a influência da temperatura e do pH na atividade enzimática, constatar a grande especificidade enzimática e a ação de inibidores na atividade enzimática.

2 - Materiais Utilizados

Tubos de ensaio de 10ml; Refrigerador ajustado para 0oC; Forno para banho maria ajusta para 37 e 100oC; Pera; Pipeta 3ml.

3 - Soluções Utilizadas

Solução de Urease (extraída da soja); Solução tampão 0,1 M pH 7,0 contendo 1% de Tiouréia; Solução tampão 0,1 M pH 7,0 contendo 1% de Uréia; Solução tampão 0,1 M pH 4,0 contendo 1% de Uréia; Solução tampão 0,1 M pH 5,0 contendo 1% de Uréia; Solução tampão 0,1 M pH 6,0 contendo 1% de Uréia; Solução tampão 0,1 M pH 7,0; Solução de Vermelho de Fenol ( 0,1g de vermelho de fenol dissolvido

em 250ml de agua destilada alcalinizada com 2,82ml de NaOH 0,1N) Solução de Cloreto de Mercúrio a 0,01%; Solução de Uréia a 1%.

4 - Procedimentos Realizados e Variações Físicas Observadas

Page 3: relatorio bioquimica enzimas

Os procedimentos realizados foram divididos em cinco experimentos independentes. Sendo que as soluções utilizadas (descritas no item 3), foram previamente preparadas por outra equipe.

● Primeiro experimento; determinação da atividade enzimática. Foram preparados dois tubos de ensaio, o primeiro com 3ml da solução tampão pH 7 com 1% de ureia, 3 gotas da solução de uréase e 3 gotas da solução do indicador ácido-base, vermelho fenol. Inicialmente ambos os tubos apresentaram uma coloração alaranjada, após aproximadamente uma hora observou-se a mudança de coloração no “tubo um” para um tom de vermelho, conforme a figura 1.

● Segundo experimento: Influência da temperatura sobre a atividade enzimática. Foram preparados três tubos, inicialmente adicionou-se em cada tubo 5 gotas de uréase e 3ml da solução tampão pH 7 sem ureia, o rotulado como “dois” foi colocado no refrigerador a 0oC, o rotulado como “três”, em banho maria a 37oC e o como “um” em banho maria a 100oC, todos por um período de 20mim, em seguida foram adicionados em cada um deles 0,3ml da solução de ureia a 1% e três gotas da solução de vermelho fenol, após cinco minutos observou-se as colorações conforme mostradas na figura 2, para cada tubo.

Page 4: relatorio bioquimica enzimas

● Terceiro experimento: Inibição da atividade por sais de Mercúrio. Em um tubo de ensaio adicionou-se 2ml de água destilada, duas gotas de solução de uréase e uma gota da solução do Cloreto de Mercúrio a 0,01%, após agitação adicionou-se 3ml da solução tampão pH 7 contendo ureia a 1% e uma gota da solução de vermelho fenol. Um segundo tubo foi preparado, porém sem a solução de cloreto de mercúrio, após cinco minutos observou-se as colorações conforme a figura 3.

Page 5: relatorio bioquimica enzimas

● Quarto experimento: Teste de especificidade enzimática. Foram preparados dois tubos de ensaio, ambos com duas gostas da solução de uréase e três gotas da solução de vermelho fenol, porém o tubo que especificamos como “tubo um”, foi adicionado 3ml da solução tampão pH7 com 1% de ureia, enquanto que o especificado como “tubo dois”, foi adicionado 3ml da solução tampão pH7 com 1% de tiureia. Agitou-se as misturas e após cinco minutos observou-se as colorações conforme mostradas na figura 4.

● Quinto experimento: preparou-se quatro tubos de ensaio, cada um deles com três gotas da solução de vermelho fenol, três gotas da solução de uréase, e 3ml da solução tampão com 1% de uréia, porém a solução tampão usada no tubo que foi identificado como “tudo um”, era de pH7, o tubo identificado como “dois”, era de pH4, o identificado como “três”, era de pH 5 e o identificado como “tubo quatro” era de pH 6. Após cinco minutos as misturas apresentaram as colorações mostradas na figura 5.

Page 6: relatorio bioquimica enzimas

5 - Fundamentações Teóricas e Discussões dos Resultados

Para que possamos compreender os resultados obtidos experimentalmente é necessário que tenhamos algumas fundamentações teóricas, como; a composição química do substrato e produtos da catalise enzimática, noções gerais sobre a variação da atividade enzimática em função da variação de temperatura e pH, especificidade das enzimas, ação de inibidores e as características do indicador ácido-base vermelho fenol.

5.1 - Reação Catalisada pela Uréase

A uréase é uma enzima que catalisa a hidrólise da uréia em dióxido de carbono e amônia conforme equação abaixo;

+ H2O → CO2 + 2NH3

Page 7: relatorio bioquimica enzimas

A hidrólise da uréia promove a elevação do pH, em função da inserção de amônia no meio. Essa será a característica chave para evidenciarmos a ocorrência da catalise e a sua intensidade, mesmo que de forma qualitativa.

Em meio aquoso ocorre a reação da amônia com a água formando hidróxido de amônio, e a reação da água com dióxido de carbono formando o ácido carbônico, formando assim o carbonato de amônio (que e uma sal de caráter básico, a atividade enzimática e verificada pela formação de carbonato de amônio), conforme reações abaixo;

2 NH3 + 2 H2O →2 NH4OH , CO2 + H2O → H2CO3

H2CO3 + 2 NH4OH → (NH4) 2CO3 + 2H2O

5.2 - Variantes da Atividade Enzimática

Fatores como pH e temperatura atuam no mecanismo cinético das reações enzimáticas, podendo aumentar ou diminuir a velocidade reacional pela modificação na estrutura do sitio ativo, alterando assim a atividade catalítica.

A grande sensibilidade da reação catalítica em função da temperatura e pH, os fazem fatores limitantes em relação a atividade enzimática. Para cada enzima existe valores ideais de pH e temperatura, no que diz respeito a performance da sua atividade enzimática.

1Estudos da atividade enzimática da uréase em função da temperatura e pH são resumidos nos gráficos abaixo;

1 - trabalho experimental realizado por Amaral, K.C.O.G (UFRN), publicado no endereço eletrônico; http://www.abq.org.br/cbq/2008/trabalhos/4/4-371-4759.htm

Page 8: relatorio bioquimica enzimas

.

5.3 – Vermelho de fenol

O vermelho fenol é um cristal vermelho, cuja formula estrutural é apresentada na figura 6.

A solução de vermelho de fenol é usada como indicador de pH, apresentando uma gradual transição do amarelo ao vermelho entre o pH 6,6 e 8, acima do pH 8,1 apresenta uma coloração rosa conforme figuara 7,

5.4 - Interpretações dos Resultados

Page 9: relatorio bioquimica enzimas

Para interpretarmos os resultados adequadamente é necessário que esteja consolidada a idéia de que a elevação do pH no meio está relacionado com a atividade enzimática, que injeta amônia e dióxido e carbono no meio promovendo a formação do sal carbonato de amônio (básico), e que as variações de coloração das misturas, promovidas pelo indicador ácido-base, vermelho fenol, representa essa formação, que por sua vez representa atividade enzimática.

●Primeiro experimento: relacionando as colorações observadas em ambos os tubos de ensaio, os colocamos em diferentes pontos na escala de pH, conforme características do indicador vermelho fenol, verificando um pH mais elevado no “tubo um”, caracterizando a atividade enzimática, figura 8.

●Segundo experimento: nesse experimento ao tentarmos posicionar de forma relativa os três tubos na escala de pH, encontramos muita dificuldade em função da proximidade de suas cores, entretanto observamos um tom mais avermelhado no tubo um (100oC), provavelmente por ter ocorrido hidrólise da uréia em função da temperatura, já que nessa temperatura é esperada a desnaturação da uréase pelo calor, não havendo assim atividade enzimática, já o tubo dois( 0oC) apresenta um tom mais avermelhado que o tudo três (37oC), o que não está de acordo com estudos anteriores publicados e fontes confiáveis, que diz que a atividade enzimática da uréase é maior na temperatura 37oC do que em 0oC. Os resultados demonstram que ocorreram falhas na execução do experimento, figura 9.

Page 10: relatorio bioquimica enzimas

Terceiro experimento: posicionando de forma relativa os dois tubos na escala de pH, observamos que o “tubo dois” é muito mais básico que o “tubo um” (figura 10) o que evidencia a atuação do cloreto de Mercúrio como agente inibidor da catálise enzimática da uréase.

Quarto experimento: observamos um tom amarelado no “tudo dois”, já no “tubo um” observamos um tom de vermelho (figura 11), o que caracteriza a atividade enzimática no tubo um e a não atividade no tubo dois, evidenciando assim a especificidade da uréase em relação a ureia. Vale ressaltar a grande similaridade da uréia em relação a tiuréia (figura 12)

Quinto experimento: fundamentando-se nas mudanças de coloração proporcionada pelo vermelho fenol, posicionamos os quatro tubos em função do pH, tendo o tubo um (tampão pH7) o maior pH, sequencialmente o tubo quatro, três, e dois (figura 13) o que demonstra maior atividade enzimática no

Page 11: relatorio bioquimica enzimas

tubo um, reduzindo a atividade com a redução do pH da solução tampão com ureia utilizada, evidenciando assim a influência do pH na atividade enzimática. No tudo dois (tampão 4), não há nenhum indicio de atividade enzimática em função da acentuada coloração amarela.

Page 12: relatorio bioquimica enzimas

Conclusão

Falhas operacionais ocorreram, porém nada que comprometa os objetivos esperados. Nessa prática trabalhamos com propriedades das enzimas de caráter limitante; restrições funcionais, fragilidade, vulnerabilidade a ação de agentes inibidores, o que não reduz a grandiosidade do universo das enzimas, sem dúvida está entre as obras mais fascinantes da “engenharia química da vida”.

Page 13: relatorio bioquimica enzimas

Referencias Bibliográficas

LEHNINGER, Albert Lester “Princípios de Bioquímica” 2ª ed. Editora Sarvier,SP, 839p. 1993.

http://www.abq.org.br/cbq/2008/trabalhos/4/4-371-4759.htm, acessado em 10/05/2012