Relatório de Estágio

António Jorge Pinto Sequeira

Aluno nº 7161 da Licenciatura em Química Aplicada Ramo Biotecnologia

Pesquisa de Organismos GeneticamentePesquisa de Organismos Geneticamente

ModificadosModificados

em Alimentação Animalem Alimentação Animal

Faculdade de Ciências e Tecnologia

UNIVERSIDADE NOVA DE LISBOA

L i s b o a

2 0 0 2

Este relatório refere-se a um estágio curricular da licenciatura

em Química Aplicada ramo Biotecnologia da Faculdade de Ciências

e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa realizado, sob a

orientação do Dr. José Manuel Gaspar Nunes da Costa, no Serviço de

Química Alimentar e Toxicologia do Departamento de Higiene

Pública do Laboratório Nacional de Investigação Veterinária (LNIV),

com um breve período no BPL do Laboratório de Microbiologia do

Instituto de Biologia Experimental e Tecnológica (IBET).

R e s u m o

O estágio efectuado foi um primeiro passo para a

implementação em rotina laboratorial de um método para o rastreio

da presença de organismos geneticamente modificados (OGM) em

alimentos para animais por PCR (polymerase chain reaction). O

trabalho experimental consistiu na adaptação às matrizes das

rações usadas na alimentação animal do método comunitário

baseado na pesquisa do promotor 35S do vírus do mosaico da

couve-flor (CaMV 35S) e do terminador NOS (nopalina sintase) do

plasmídeo Ti (tumour-inducing) da bactéria do solo Agrobacterium

tumefaciens [1], desenvolvido e testado em farinhas de milho e de

soja [2].

A g r a d e c i m e n t o s

Í n d i c e

1 Introdução..................................................................................13

1.1 A Emergência dos OGM..........................................................13

1.2 Definições...............................................................................17

1.3 Legislação sobre OGM............................................................19

1.4 Métodos de Pesquisa de OGM................................................23

1.4.1 Statu Quo da Normalização e Validação dos Métodos. .23

1.4.2 PCR vs. ELISA................................................................24

1.4.3 Fundamento do Método Adoptado................................26

2 Procedimento Experimental......................................................31

2.1 Advertências...........................................................................31

2.2 Reagentes e Equipamento.....................................................32

2.3 Amostras e Padrões................................................................33

2.4 Preparação das Amostras.......................................................34

2.4.1 Moagem/Homogeneização em Stomacher....................34

2.4.2 Pesagem.......................................................................34

2.5 Extracção/Purificação de DNA................................................35

2.5.1 Método CTAB................................................................35

2.6 Avaliação da Integridade e Concentração do DNA.................37

2.6.1 Electroforese do DNA Extraído......................................37

2.6.2 Captura de Imagem dos Géis Obtidos..........................38

Coloração do Gel com Solução de Brometo de Etídeo........38

Aquisição e Registo da Imagem Fotográfica do Gel............38

2.6.3 Diluições.......................................................................38

2.7 Controlo da Amplificabilidade do DNA e da Inibição pela Matriz

39

2.7.1 PCR de DNA de Cloroplasto...........................................39

2.7.2 Electroforese dos Produtos de Amplificação.................41


2.8 Pesquisa do Promotor CaMV 35S............................................43

2.8.1 PCR do Promotor CaMV 35S..........................................43



2.9 Pesquisa do Terminador NOS.................................................44

2.9.1 PCR do Terminador NOS...............................................44



3 Resultados.................................................................................47

3.1 Avaliação da Integridade e Concentração do DNA.................47

3.2 Controlo da Amplificabilidade do DNA e da Inibição pela Matriz

49

3.3 Pesquisa do Promotor CaMV 35S............................................50

3.4 Pesquisa do Terminador NOS.................................................51

4 Discussão...................................................................................55

5 Bibliografia.................................................................................63

Introdução

1 I n t r o d u ç ã o

1.1 A Emergência dos OGM

A aplicação da biotecnologia1 à actividade agrícola (motivada

por conveniências económicas mas também ecológicas),

particularmente no que se refere à manipulação genética de

cultivares, tem lançado no mercado espécies vegetais com

propriedades alteradas, que as diferenciam das respectivas

congéneres convencionais. Assim, as novas características

introduzidas nas plantas alteradas por engenheria genética

actualmente aprovadas podem ser divididas nas seguintes

categorias [6]:

I. Melhoramento da qualidade do produto

(durabilidade, firmeza, adiamento da

senescência do fruto);

II. Resistência a pragas (insectos, nemátodos,

vírus);

III. Benefícios agronómicos (tolerância a

herbicidas).

No presente, são os benefícios para os agricultores que

dominam, no leque de produtos obtidos por engenheria genética

disponíveis no mercado (é aliás a expectativa de aumento de

rendimento e conveniência das culturas transgénicas que explicam

a sua adopção pelos agricultores), mas espera-se que uma segunda

vaga da biotecnologia agrícola (vide definição de cultivares de 2ª

geração no glossário da referência 4) se volte para a criação de

alimentos cujas vantagens para o consumidor sejam mais

evidentes, como é o caso de culturas com características

nutricionais [7] e/ou organolépticas melhoradas, com um aumento

do poder de conservação, uma redução do potencial alergénio e a

1 Definida pela OCDE como "a aplicação da ciência e tecnologia a organismos vivos bem como a partes, produtos ou modelos deles provenientes, para alterar material vivo ou não-vivo para a produção de conhecimento, bens e serviços" [3]. Vide também a definição apresentada nos glossários das referências 4 e 5.

13

Pesquisa de Organismos Geneticamente Modificados em Alimentação Animal

eliminação de toxinas naturais, para além da manutenção ou

diminuição do preço dos produtos produzidos a partir delas [8, 9].

Os benefícios actuais e previstos da aplicação da engenheria

genética à actividade agrícola incluem ainda o aumento da

produtividade e do rendimento, a melhoria da qualidade das

colheitas e o uso mais racional dos factores de produção (água,

fertilizantes e fitofármacos), o desenvolvimento de culturas

resistentes à seca (o que implica um menor consumo de àgua), a

produção de combustíveis biológicos (fontes de energia renováveis),

a diminuição da produção de resíduos e de consumo de energia e,

incluisivamente, a aplicação de plantas geneticamente modificadas

(GM) na administração de vacinas ou vitaminas.

O crescimento da população mundial e evolução dos hábitos

alimentares requer da agricultura um substancial aumento de

rendimento, especialmente se se pretender não perturbar

ecossistemas virgens, como as florestas tropicais. A biotecnologia

agrícola é vista como um meio de garantir que a agricultura consiga

alimentar os 8000 milhões de pessoas estimados para 2025, dado

que a área agrícola disponível, cerca de 7% da superfície do

planeta, não pode aumentar indefinidamente. As culturas GM terão

assim de ser um importante factor a ter em conta nos futuros

estudos de sustentabilidade da agricultura [10, 11].

As vantagens da biotecnologia agrícola têm como

consequência um crescimento explosivo da área de cultivo de

espécies GM [5, 12, 13], principalmente nos EUA (que em 1999

detinham 70% do total da área de cultivo GM mundial), Argentina e

Canadá. A Europa fica muito aquém, com apenas 0,03% do total da

área de cultivo de espécies GM (vide tabela 1.1 da referência 5).

O atraso europeu fica a dever-se a preocupações de vária

ordem sobre os potenciais riscos das plantas transgénicas,

nomeadamente: a possibilidade de produção de compostos

alergénios, a transferência da resitência a antibióticos usada para

marcação genética, a ameaça para a biodiversidade e o

14

Introdução

desenvolvimento de "super ervas daninhas", por transferência da

tolerância a herbicidas. Qualquer um destes riscos potenciais é

desdramatizado, senão mesmo invalidado na referência 14. Fala-se

mesmo de "histeria em massa" e "irracionalidade quanto à questão

dos OGMs" [15]. Também os produtores e distribuidores confiam

nos anos de investigação e desenvolvimento gastos na produção de

espécies transgénicas, bem como no processo de avaliação da sua

segurança [9, 16-18]. Contudo, a preocupação dos consumidores é

alimentada pela falta de informação, pelos protestos dos grupos

ambientalistas e por numerosos estudos realizados pela

comunidade científica sobre a matéria [19-31].

Um caso paradigmático é o do artigo publicado na revista

Nature que parecia indicar que o pólen de uma variedade de milho a

quem tinha sido inserido o gene da biotoxina de Bacillus thurigiensis

(Bt)2 era prejudicial a larvas de borboletas monarca (Danaus

plexippus) [32]. O artigo gerou uma intensa polémica, exacerbando

as dúvidas sobre a segurança das culturas Bt, não isenta de

consequências legislativas (vide ponto 1.3). Porém, os próprios

autores do referido estudo concluem o artigo alertando para a

necessidade de recolher dados para avaliar os riscos da engenheria

genética enquanto tecnologia agrícola e comparar esses riscos com

os colocados pelos pesticidas e outras tácticas de controlo de

pragas. Alguns autores [33] fazem pender essa avaliação a favor

das plantas transgénicas em detrimento dos pesticidas cujos efeitos

toxicológicos e suas consequências são bem conhecidos [34]. A

referência 35 dá conta da controvérsia do caso ao reproduzir artigos

que expressam a preocupação relativa às culturas Bt [36] e outros

que a acham exagerada e sem fundamento [37].

Dada a importância do milho (Zea mays Linnaeus) [38] e dos

produtos do complexo soja (Glycine max L.) [39] na alimentação

animal – representando cerca de 30% e 17%, respectivamente, ou

2 Bacillus thurigiensis é uma bactéria do solo que produz toxinas contra insectos (principalmente dos géneros Lepidoptera, Diptera e Coleoptera). São usadas preparações de Bt na agricultura biológica como insecticida [5].

15


seja 47% do total das matérias-primas consumidas – o debate em

torno da utilização de OGM assume particular relevância na

indústria de alimentos compostos para animais [8, 40],

principalmente se se tomar em consideração que apenas 1% das

importações de soja são usadas para alimentação humana [5]. Esse

facto e a dependência do exterior no aprovisionamento de matérias-

primas – Portugal é deficitário em cerca de 70%, com a soja a

representar uma dependência total, sendo importada da Argentina,

Brasil e Estados Unidos – explicam o enfoque dado àquelas duas

culturas no desenvolvimento de métodos de pesquisa de OGM em

alimentos para animais.

16

Introdução

1.2 Definições

A falha de equivalência entre uma espécie geneticamente

modificada e a sua congénere que não sofreu alteração por via de

engenheria genética tem por base a existência de "modificação

genética" (que era definida na Directiva 90/220/CEE [41] como

"modificação do material genético por recurso às técnicas definidas

na Directiva 90/220/CEE" [41], onde se incluíam as técnicas de DNA

recombinante que utilizem sistemas de vectores como as já

abrangidas pela Recomendação 82/472/CEE do Conselho3 [42]), que

ocorre quando são utilizadas as técnicas referidas na parte 1 do

anexo I A da Directiva 2001/18/CE4 [43]. A alteração genética de

uma espécie manifesta-se pela presença de DNA que não está

normalmente presente no genoma da espécie em causa,

nomeadamente sequências de DNA endógeno modificadas ou de

DNA heterólogo (constituindo ambos informação genética "extra"

que pode ser pesquisada), e/ou de proteínas codificadas por esse

DNA acrescentado. No mesmo documento, define-se "organismo

geneticamente modificado" como "qualquer organismo, com

3 Documento em que se definem "trabalhos que envolvem o ADN recombinante" como "a formação de novas combinações de materiais genéticos pela inserção de moléculas de ácido nucleico, produzido exteriormente à célula seja por que processo for, no interior de qualquer vírus, plasmídeo bacteriano ou sistema vectorial, de forma a permitir a sua incorporação num organismo hospedeiro no interior do qual não aparecem de forma natural, mas onde podem multiplicar-se de forma contínua."4 «Técnicas referidas no nº 2 do artigo 2º. Parte 1. As técnicas de modificação genética referidas no nº 2, alínea a), do artigo 2º, são, nomeadamente:

1) Técnicas de recombinação de ácidos nucleicos que envolvam a formação de novas combinações de material genético através da inserção de moléculas de ácidos nucleicos em vírus, plasmídeos de bactérias ou outros vectores, independentemente do modo como sejam produzidas fora do organismo, e respectiva incorporação num organismo hospedeiro em que não ocorrem naturalmente mas onde poderão continuar a ser propagadas;

2) Técnicas, incluindo a micro-injecção, a macro-injecção e o micro-encapsulamento, que envolvam a introdução directa num organismo de material geneticamente transmissível preparado fora desse organismo;

3) Técnicas de fusão celular (incluindo a fusão protoplástica) ou de hibridação em que células viáveis com combinações novas de material geneticamente transmissível sejam formadas através da fusão de duas ou mais células através de meios ou métodos que não ocorrem naturalmente.»

17


excepção do ser humano5, cujo material genético tenha sido

modificado de uma forma que não ocorre naturalmente por meio de

cruzamentos e/ou de recombinação natural6.".

5 Na Directiva 90/220/CEE [41] e na definição incluída no glossário da Recomendação 97/618/CE da Comissão [44] ainda não existia a exclusão explícita do ser humano na definição de OGM (introduzida, provavelmente, para ressalvar os doentes tratados por terapia genética).6 O método de transformação é maioritariamente (64%) o uso de plasmídeos modificados de Agrobacterium tumefaciens, que actua como vector [6].

18

Introdução

1.3 Legislação sobre OGM

Em 1996 e 1997, ao abrigo da Directiva 90/220/CEE [41]

(revogada pela Directiva 2001/18/CE [43])7, que regulamenta a

libertação deliberada de OGM no ambiente, foram colocados no

mercado da União Europeia (UE) dois produtos GM: a soja Roundup

Ready® [16] e o milho Bt-176 [51, 52]. Em 1997, vinte e oito

produtos de origem vegetal geneticamente modificados foram

aprovados em todo o mundo [6]. Nesse ano, e dando voz à

preocupação expressa por alguns sectores da população

relativamente à utilização dos chamados "(alimentos) transgénicos"

na alimentação humana e animal e por forma a garantir o direito à

informação que assiste ao consumidor, a UE formulou o

Regulamento (CE) nº 258/97 [53]. Este último obriga a que os

"novos alimentos e ingredientes alimentares que contenham ou

consistam em organismos geneticamente modificados" que não

sejam substancialmente equivalentes aos respectivos organismos

tradicionais sejam rotulados como tal.

Uma vez que a comercialização no mercado comunitário dos

dois produtos anteriormente mencionados tinha sido aprovada

antes da implementação do Regulamento dos Novos Alimentos [53],

foi criado o Regulamento (CE) nº 1139/98 [54] do Conselho, para

7 Em Portugal, da transposição das Directivas 90/219/CEE [45] (acerca do uso confinado de microrganismos geneticamente modificados) e 90/220/CEE [41] resultou o Decreto-Lei nº 126/93, de 20 de Abril [46], que regula a utilização e comercialização de organismos geneticamente modificados. Esse Decreto-Lei refere-se apenas à utilização e comercialização de OGM e foi posteriormente regulamentado pela Portaria nº 751/94, de 16 de Agosto [47], que estabelece as regras a que devem obedecer as notificações para a libertação deliberada no ambiente e colocação no mercado de OGM, bem como a notificação da colocação no mercado de produtos que contenham esses organismos. O Decreto-Lei nº 126/93 [46] foi ainda alterado pelo Decreto-Lei nº 63/99, de 2 de Março [48], que corrige algumas lacunas e obriga o notificador a pagar taxas. O Decreto-Lei nº 172/98, de 25 de Junho [49] resulta da transposição da Directiva 97/35/CE, de 18 de Junho [50], que altera o Anexo III da Directiva 90/220/CEE [41], que passou a exigir que todos os produtos colocados no mercado que contenham OGM sejam objecto de rotulagem. Aquele documento legislativo transpõe o Anexo, corrigindo algumas incorrecções e acrescenta anexos que estavam em falta na Portaria nº 751/94, de 16 de Agosto, relativa à notificação da libertação deliberada no ambiente de organismos geneticamente modificados [47].

19


colmatar o vazio legislativo relativamente à rotulagem de produtos

contendo ou consistindo naqueles dois OGM8.

Mais recentemente, o Regulamento (CE) nº 49/2000 [56]

altera aquele diploma legislativo, fixando em 1% o limite máximo

admitido para contaminações adventícias9 com OGM de géneros

alimentícios cujos produtores tenham apresentado prova da não

incorporação de OGM e da aplicação de medidas preventivas da

contaminação com OGM. O referido regulamento estabelece como

que um intervalo de tolerância para o que se pode considerar um

produto isento de OGM – acima do limiar de 1%, o alimento

supostamente GMO-free fica sujeito a rotulagem, como qualquer

produto contendo ou consistido em OGM aprovados na UE.

É com base no valor de 1% que os Serviços da Comissão

preparam legislação por forma a estipularem limiares para a

presença de semente GM em lotes de variedades convencionais.

Neste momento, a Comissão prepara Directivas que alteram os

anexos das Directivas relativas à comercialização de sementes de

forma a estabelecer modalidades baseadas nos requisitos de

rotulagem previstos na Directiva 98/95/CE do Conselho [57] para as

sementes de variedades geneticamente modificadas de espécies de

plantas agrícolas e produtos hortícolas e ainda estabelecer critérios

de pureza para a presença acidental de sementes GM em lotes de

sementes de variedades de plantas tradicionais.

No que se refere à alimentação animal, o Livro Branco sobre a

Segurança dos Alimentos [58], prevê a obrigatoriedade da

declaração de todos os ingredientes utilizados na formulação dos

alimentos compostos para animais, pelo que a respectiva rotulagem

contemplará a declaração obrigatória da incorporação de OGM. De

8 Em 1999, devido à crise das borboletas monarca e do milho Bt (vide ponto 1.1), assistiu-se ao endurecimento da legislação concernente aos OGM mesmo pelo Japão, país que abraçou a biotecnologia agrícola de forma quase tão efusiva quanto os Estados Unidos e alguns países da América Latina [55].9 A "presença adventícia" é definida como "uma presença em baixo nível, tecnicamente inevitável e não intencional (por exemplo vestígios de produtos GM encontrados em cargas de produtos similares convencionais resultantes da mistura de ambos)" [4].

20

Introdução

acordo com o anexo relativo ao Plano de Acção em Matéria de

Segurança dos Alimentos do referido documento, a adopção pelo

Conselho e Parlamento Europeu de um sistema centralizado de

autorização da utilização de produtos não convencionais,

principalmente OGM e seus derivados, na alimentação animal é um

objectivo prioritário, agendado para o final de 2001. A Directiva

70/524/CEE do Conselho, de 23 de Novembro de 1970

relativamente aos aditivos na alimentação para animais [59], com a

última redacção que lhe foi dada pela directiva 1999/20/CE do

Conselho [60], prevê um procedimento de autorização para a

colocação no mercado de aditivos nos alimentos para animais. Além

deste procedimento de autorização, os aditivos nos alimentos para

animais que contenham, consistam ou sejam produzidos a partir de

OGM deverão ser abrangidos pelo âmbito do Regulamento do

Parlamento Europeu e do Conselho relativo a alimentos

geneticamente modificados para a alimentação humana e animal,

actualmente em fase de proposta [61], no que diz respeito à

avaliação de segurança da modificação genética, enquanto que a

autorização final deverá ser concedida ao abrigo do procedimento

estabelecido na Directiva 70/524/CEE [59] (que prevê que possam

ser autorizados novos aditivos em função da evolução dos

conhecimentos científicos e técnicos). Os alimentos para animais

geneticamente modificados têm de ser rotulados de acordo com a

Directiva 90/220/CEE [41] (actualmente, 2001/18/CE [43]) que é

apenas aplicável aos OGM vivos. Assim, não existem requisitos de

rotulagem para alimentos para animais produzidos a partir de OGM

mas que já não contenham OGM. Além disso, até à segunda revisão

da Directiva 90/220/CEE [41], não era obrigatória a rotulagem

indicando a presença de OGM, pelo que, actualmente, quatro

autorizações de OGM para utilização em alimentos para animais não

exigem rotulagem obrigatória enquanto que outras quatro exigem

essa rotulagem.

21


Um sistema adequado de rotulagem de alimentos

geneticamente modificados para a alimentação humana e animal é

encarado como um dos aspectos principais no sentido de garantir

uma maior aceitação da aplicação da tecnologia genética no sector

agro-alimentar. O Eurobarómetro 2000 [62] e vários outros estudos

efectuados por toda a Europa [63] (a referência 64 analisa os dados

do Eurobarómetro de 1996 e compara-os com o de 1993 e de 1991)

revelam que os consumidores exigem uma rotulagem mais clara

indicando se os produtos consistem em, contêm ou foram

produzidos a partir de organismos geneticamente modificados no

sentido de poderem efectuar uma selecção individual10.

10 A forma como os inquéritos são levados a cabo e as conclusões que deles se retiram têm, no entanto, sido postas em causa por autores envolvidos no processo de sondagem de opinião dos consumidores acerca da utilização da biotecnologia na alimentação [65].

22

Introdução

1.4 Métodos de Pesquisa de OGM

De modo a satisfazer os requisitos de rotulagem, é imperativo

o desenvolvimento, validação e aplicação sistemática de métodos

de controlo das sementes e alimentos que circulam no mercado

europeu. Esses métodos passam pelo rastreio da presença de OGM

de forma genérica nas sementes, matérias-primas e alimentos

processados bem como pela quantificação do teor de cada OGM

aprovado na UE, nas amostras que tenham dado resultado positivo

no diagnóstico inicial (para determinar se esse teor está ou não

acima do limiar máximo de 1%, fixado para os casos de

contaminações adventícias com OGM de produtos que

alegadamente não foram produzidos com recurso a OGM).

1.4.1 Statu Quo da Normalização e Validação dos Métodos

Na UE, um número crescente de laboratórios de controlo de

alimentos e de controlo de sementes estão a adoptar a tecnologia

de PCR como técnica de rotina. Contudo, a normalização e validação

internacional de métodos para detecção de OGM por protocolos

harmonizados estão ainda nas suas fases iniciais.

Organismos de normalização como o CEN (Comité Européen

de Normalisation, Bruxelas, Bélgica) e a AFNOR (Association

Française de Normalisation, Paris, França) já iniciaram actividades

nesta área, existindo alguns documentos preliminares no que diz

respeito a amostragem e detecção de OGM. Também já foram

realizados ensaios interlaboratoriais para validação de métodos de

detecção de DNA para o rastreio de diferentes OGM em géneros

alimentícios, organizados por entidades como o Joint Research

Centre (JRC) da UE (Ispra, Itália) [66, 67], o DMIF-GEN (Development

of Methods to Identify Foods produced by means of Genetic

Engineering) project [68], e o BgVV (Bundesinstitut für

gesundheitlichen Verbrauncherschutz und Veterinärmedizin, Berlim,

Alemanha) [69]. De igual forma, métodos de análise quantitativa já

foram testados, embora mais estudos de validação sejam

23


necessários, tendo em conta os resultados obtidos. De facto, urge

definir alguns parâmetros de validação, como a especificidade e a

sensibilidade, que dariam informação sobre a precisão dos métodos

utilizados e que permitiriam a sua consequente certificação.

Incluído nos esforços desenvolvidos a nível comunitário para a

validação de métodos para a monitorização de OGM, o Joint

Research Center promoveu ainda um ensaio interlaboratorial para a

validação de um ensaio imuno-enzimático com vista à detecção de

soja GM [70], em que o LNIV foi participante.

1.4.2 PCR vs. ELISA

As metodologias que permitem distinguir espécies

geneticamente modificadas das que não o foram assentam na

pesquisa de fragmentos de DNA estranho ao organismo testado –

sequências que regulam a expressão do(s) transgene(s) (como

promotores e terminadores), fragmentos do próprio transgene e de

genes que servem como marcadores11, durante o processo de

construção genética [74, 75]– ou da produção de proteínas que não

são típicas da espécie.

Para a procura de DNA exógeno pode recorrer-se à

amplificação, por PCR [76, 77], de fragmentos de elementos

genéticos reguladores, presentes na quase totalidade dos OGM

actualmente aprovados na UE (vide tabela 19 da referência 6), para

11 Geralmente genes de resistência a antibióticos. A utilização de tais marcadores tem levantado preocupação sobre a possibilidade de a resistência a antibióticos ser transferida para estirpes sensíveis, aquando da libertação dos OGM no ambiente (a presença do gene blaTEM-1 – que codifica para uma -lactamase – no genoma cromossómico do milho da Novartis desencadeou debates na UE sobre os riscos para a saúde humana da possível transferência desse gene para a microflora intestinal, como consequência do seu uso na alimentação animal ou humana), apesar de tal possibilidade ser ínfima (a frequência de transferência de genes marcadores de resistência a antibióticos é de 10-13 a 10-18). A avaliação dos riscos do uso dos genes de resistência a antibióticos é feita durante o processo de aprovação da libertação de OGM no ambiente, de acordo com o procedimento estipulado no Anexo II da Directiva 90/220/CEE [41]. A presença de genes de resistência a antibióticos em plantas transgénicas tem reforçado, desde finais de 1996, a fraca aceitação dos OGM pela opinião pública e levou a que, em 1999, a utilização de tais genes como marcadores em plantas para consumo humano ou animal fosse banida na Europa [71]. A preocupação com o uso de genes de resistência a antibióticos veio fomentar a investigação sobre eliminação de marcadores moleculares em espécies GM [72, 73].

24

Introdução

um rastreio inicial da presença de OGM, seguida da detecção

específica de genes inseridos, característicos de determinados OGM,

por amplificação de fragmentos desses mesmos genes12.

A presença de proteínas codificadas por genes acrescentados

artificialmente ao genoma de um dado organismo pode ser revelada

através de ensaios imuno-enzimáticos (ELISA13), envolvendo

anticorpos específicos contra essas proteínas [76].

Existem kits comerciais fundamentados em cada uma das

técnicas mencionadas, que permitem averiguar de forma fácil e

rápida se a amostra contém OGM específicos – como o GMO Soya

Kit da SDI, um teste por ELISA específico para a proteína CP4

enolpiruvilxiquimato-3-fosfatosintase (EPSPS) da Monsanto em soja

Roundup Ready®, validado no ensaio interlaboratorial

anteriormente referido [70] – ou se incorpora ou consite numa ou

mais espécies que sofreram modificação genética – caso do Allin

1.0, sistema de PCR usado para pesquisar a presença de milho e

soja e, simultaneamente, do promotor de CaMV.

A pesquisa de DNA exógeno tem vantagem sobre a de

proteínas estranhas:

– por ter um limite de detecção mais baixo (0,01% –

100 mg de soja GM por kg dá resultado positivo),

– por ser mais específica – os ensaios imunológicos

podem produzir reacção com diferentes proteínas

de espécies aparentadas, ao passo que é possível

seleccionar sequências de DNA específicas de

dada espécie [78],

– por o DNA ser menos sensível ao tratamento

térmico a que alguns alimentos são sujeitos

durante o seu processamento do que as proteínas,

que facilmente se desnaturam a alta temperatura,

12 Esta segunda fase é desnecessária se apenas fôr pretendido determinar se dado alimento contém ou não OGM, não sendo requerida uma identificação dos OGM eventualmente presentes na amostra.13 Enzime-linked immunosorbent assay.

25


– porque permite obter resultados positivos mesmo

quando há produção da proteína estranha

especificamente em tecidos menos ou de todo

utilizados na produção de alimentos e

– porque permite a detecção de genes não

traduzidos em proteínas14.

1.4.3 Fundamento do Método Adoptado

Pelos motivos apontados, a detecção de organismos

geneticamente modificados, no âmbito do estágio realizado, foi feita

por PCR, utilizando como sequências reguladoras universais a

amplificar o promotor CaMV 35S15 e o terminador NOS (a pesquisa

destas duas sequências em conjunto permitia detectar 26 ou 27 das

28 cultivares GM que se encontravam aprovadas em 1997, segundo

dados desse ano [6]), seguindo o método oficial europeu

desenvolvido pelo JRC para a pesquisa de OGM em alimentos [1]:

O DNA é extraído da amostra, sendo o rendimento da

extracção e a integridade do DNA controlados por

electroforese em gel de agarose. As sequências de DNA alvo

específicas dos elementos genéticos pesquisados são

amplificadas por PCR através do uso dos oligonucleotídeos

14 Como no caso do tomate Flavr Savr™ da Calgene, em que se recorre à antisense RNA technology: ao ser transcrito, o gene introduzido hibrida com o mRNA que codifica para uma enzima envolvida no processo de senescência (a PG, poligalacturanase, que degrada a pectina, um dos principais componentes da parede celular do fruto), impedindo-o de ser traduzido, o que reduz para 10% do normal a produção da enzima, aumentando o tempo de conservação do tomate e proporcionando aos consumidores o sabor de um tomate colhido maduro [79] (a maioria dos tomates convencionais são colhidos verdes para facilitar o seu transporte e são amadurecidos artificialmente, recorrendo a etileno para lhes conferir a cor vermelha [6]). Neste caso, o objectivo é a produção de um RNA complementar à cadeia sense (daí o nome "tecnologia antisense"), não havendo produção de proteína transgénica [80, 81]. O OGM discutido foi o primeiro alimento GM a ser posto no mercado e a segunda aprovação da FDA (U.S. Food and Drug Administration) para um produto biotecnológico usado na alimentação (a primeira foi para a quimosina – um agente de coagulação do leite –, para a produção de queijo) [82]. Um método para a sua detecção por PCR é descrito na referência 83.15 O efeito da duplicação deste elemento genético na activação de genes de plantas e as sequências necessárias para a sua activação são discutidos nas referências 84 e 85, respectivamente.

26

Introdução

iniciadores e condições de reacção adequados (vide pontos

2.8 e 2.9). Os produtos de PCR são então separados por

electroforese em gel de agarose, controlando-se a presença

dos fragmentos de amplificação esperados pela comparação

da mobilidade electroforética das bandas obtidas com a das

bandas de um padrão de peso molecular.

27

28

29

30

Procedimento Experimental

2 P r o c e d i m e n t o E x p e r i m e n t a l

2.1 Advertências

No sentido de minorar os riscos de contaminação cruzada entre

amostras, todo o material e reagentes usados são estéreis e o

trabalho é executado sob condições de esterilidade; sempre que

ácidos nucleícos estejam envolvidos, são usadas pipetas resistentes

a aerossóis (com filtro); a extracção de DNA dos padrões de soja e

milho GM que servirão de controlos negativos é efectuada num dia

anterior ao da extracção do DNA controlo positivo; a extracção de

DNA, a amplificação por PCR e a análise dos resultados por

electroforese são levadas a cabo em salas diferentes; cada uma

dessas salas tem o seu próprio material e reagentes, que não são

trocados entre salas; é usada uma outra bata para a preparação das

mastermixes, na sala de PCR.

Outras precauções a tomar relacionadas, nomeadamente, com o

manuseamento de alguns reagentes ou com a execução de

determinados métodos podem ser consultadas no protocolo original

[1].

31


2.2 Reagentes e Equipamento

Apesar de se terem introduzido algumas modificações ao

protocolo apresentado na referência 1, os reagentes empregues nas

diversas etapas deste trabalho são os referidos nessa fonte

bibliográfica (vide páginas 5 a 9 da referência 1).

Uma lista do equipamento necessário às diversas etapas do

trabalho pode igualmente ser encontrada na referência 1. As

marcas e modelos de alguns dos aparelhos usados são referidos no

presente texto, quando pertinente.

32


2.3 Amostras e Padrões16

Os resultados apresentados e discutidos adiante referem-se

ao seguinte conjunto de amostras e padrões:

- Uma amostra de ração para frangos, que deu

entrada no Departamento de Higiene Pública do

LNIV com o número 7566 (este número será usado

doravante para referir esta amostra);

- Uma amostra de ração para novilhos de

engorda, que deu entrada no Departamento de

Higiene Pública do LNIV com o número 8144 (este

número será usado doravante para referir esta

amostra);

- Uma amostra de milho em grão supostamente

não GM (esta amostra serviu de controlo negativo

para a presença de milho GM no lote de amostras

considerado, substituindo o padrão de milho Bt-

176 a 0%, habitualmente usado para o efeito);

- Um padrão de milho Bt-176 a 2% (usado como

controlo positivo para a presença de milho GM nas

amostras);

- Um padrão de soja Roundup Ready® a 0%

(usado como controlo negativo para a presença de

soja GM nas amostras);

- Um padrão de soja Roundup Ready® a 2%

(usado como controlo positivo para a presença de

soja GM nas amostras).

16 Os padrões de milho Bt-176 e de soja Roundup Ready®, material de referência certificado, são comercializados pela Fluka. Os padrões de soja Roundup Ready® a 0 e 2% usados nas sessões laboratoriais a que este relatório se refere eram material remanescente do ensaio interlaboratorial para validação de um ensaio imunológico para a detecção e quantificação de soja GM em alimentos em que o LNIV participou [70], produzido pelo IRMM (Institute for Reference Materials and Measurments, Geel, Bélgica).

33


2.4 Preparação das Amostras

2.4.1 Moagem/Homogeneização em Stomacher

As amostras de alimentos compostos para animais (sob a

forma de granulado) foram trituradas e homogeneizadas num

stomacher17 (Stomacher 400 da Seward): foram adicionados 60 ml

de água estéril a 30 g de amostra num saco de plástico estéril

próprio para stomacher que foi levado ao aparelho até se obter uma

suspenção homogénea (cerca de 1,5 min., à velocidade normal). A

amostra de milho foi moída num almofariz estéril18 e com azoto

líquido. Os padrões de soja e milho geneticamente modificados

usados como controlos positivos e negativos vêm sob a forma de

um pó homogéneo, não necessitando, portanto, de qualquer

tratamento preliminar.

2.4.2 Pesagem

As massas referidas de seguida são as requeridas para o

método CTAB modificado utilizado.

Foram pesados 1 g de cada amostra homogeneizada para

tubos cónicos de 50 ml com saia estéreis. No caso dos padrões de

soja e milho GM, um décimo dessa quantidade é suficiente para se

obter DNA amplificável (i.e., com concentração superior a 10 g/l –

vide ponto 2.6.3), pelo que foram pesados 100 mg de cada padrão

para tubos de microcentrífuga de 2 ml (tipo Eppendorf) estéreis.

17 A escolha do dispositivo de redução do tamanho de partículas depende da natureza da amostra: no protocolo do Wizard® Magnetic DNA Purification System for Food da Promega [86] recomenda-se o uso de um moinho para café caseiro ou outros moinhos, como o Mixer Mill MM 200 (Retsch / Brinkmann), para um maior número de amostras. Alerta-se ainda para ter o cuidado de lavar cuidadosamente o moinho com detergente e álcool entre cada amostra para evitar contaminação cruzada.18 A sua esterilização é feita por calor seco a 170ºC durante 2 h.

34


2.5 Extracção/Purificação de DNA

2.5.1 Método CTAB 19

Adicionaram-se 500 l de tampão de extracção CTAB aos

padrões de soja e milho GM e 5000 l do mesmo tampão às

amostras de rações e milho. Quer as amostras, quer os padrões de

soja e milho foram incubados durante 30 minutos a 65ºC, com

agitação.

Foram pipetadas duas alíquotas de 500 l de cada amostra de

rações e de milho (com a ponta da micropipeta cortada para que

não entupisse com partículas em suspensão) para tubos de

Eppendorf de 2 ml. Os tubos de microcentrífuga contendo os

padrões bem como os contendo as amostras e respectivos

duplicados foram centrifugados durante 10 minutos a 16000g,

sendo o sobrenadante transferido para um novo tubo de reacção.

Foram adicionados 200 l de clorofórmio e agitou-se durante

30 segundos.

Centrifugou-se a mistura durante 10 minutos a 12000g, até

completa separação de fases e transferiu-se o sobrenadante (fase

aquosa) para um novo tubo de reacção.

Foram adicionados 2 volumes de solução CTAB de

precipitação e agitou-se bem.

As amostras e padrões foram então incubados durante 60

minutos, à temperatura ambiente.

Centrifugou-se durante 10 minutos a 14500g e rejeitou-se o

sobrenadante.

O precipitado foi dissolvido em 350 l de NaCl.

Adicionaram-se 350 l de clorofórmio e misturou-se durante

30 s.

19 O método CTAB descrito é uma alteração ao protocolo apresentado na referência 1. Difere na medida em que os tempos de incubação e as centrifugações são mais prolongados.

35


Centrifugou-se a mistura durante 10 min. a 12000g, até

completa separação de fases e transferiu-se o sobrenadante (fase

aquosa) para um novo tubo de reacção.

Adicionou-se 0,8 do volume transferido em isopropanol,

misturou-se e incubou-se durante 30 min. a 4ºC.

Centrifugou-se durante 30 min. a 15000g e rejeitou-se o

sobrenadante.

Adicionaram-se 500 l de etanol a 70% (V/V) e misturou-se.

Centrifugou-se durante 15 min. a 15000g.

Decantou-se o sobrenadante, descartando-o cuidadosamente.

Secou-se o DNA e ressuspendeu-se em 50 l de água estéril.

Para cada amostra de milho e de alimentos compostos para

animais, juntou-se, num mesmo tubo de 500 l, o DNA extraído em

cada um dos respectivos duplicados.

O DNA extraído foi conservado a 4ºC (entre 2 e 8ºC) até ser

usado (no dia seguinte20).

O processo de extracção/purificação de DNA descrito foi

igualmente aplicado a um tubo vazio, que serviu como controlo da

extracção (para despistar possíveis contaminações durante o

processo).

20 Guardar a -20ºC, no caso de armazenamentos mais prolongados.

36


2.6 Avaliação da Integridade e Concentração do DNA

2.6.1 Electroforese do DNA Extraído

O objectivo desta operação é a avaliação da pureza e

dimensão dos fragmentos do DNA extraído – estimando o peso

molecular das bandas obtidas por comparação da sua mobilidade

electroforética com a das diferentes bandas de um padrão de peso

molecular – e a estimativa da concentração de cada amostra, por

comparação da fluorescência das suas bandas (vide ponto seguinte)

com a de padrões de DNA de concentrações conhecidas.

Foram adicionadas alíquotas de 10 l de cada amostra, de

cada padrão e do controlo de extracção, previamente agitados e

centrifugados por cerca de 10 s, a 4 l de tampão de arrastamento

(xileno cianol e ficol 400 – vide referência 1) em tubos de 50 l,

homogeneizando-se e centrifugando-se durante cerca de 10 s antes

de depositar cada solução no gel.

A migração electroforética foi efectuada num mini gel de

agarose21 a 1,5% em tampão TBE 1 sob um campo eléctrico

aplicado de 5 V/cm ( que corresponde a uma corrida a uma

diferença de potencial de 70 V durante uma hora, no caso da tina de

reduzidas dimensões utilizada). O padrão de peso molecular usado

foi o 100 bp DNA Ladder (da Promega)22. Como padrões de

concentração do DNA, recorreu-se a diluições de 10, 25, 50, 100 e

200 g/l de DNA (Non-Methylated) da Amersham Pharmacia.

21 Preparação do gel: pesar a quantidade apropriada de agarose, juntar o volume de tampão necessário e levar ao forno de microondas até fundir completamente; agitar sempre até atingir a temperatura de 50ºC, deitar a solução no tabuleiro, colocar os pentes e esperar 30 min. para que o gel polimerize, retirando então os pentes com cuidado (para não partir os poços).22 Composição da solução de padrão de peso molecular depositada: 16 l de água estéril desionizada, 4 l de tampão de arrastamento e 4 l de 100 bp DNA ladder. A solução resultante é conservada a 4ºC.

37


2.6.2 Captura de Imagem dos Géis Obtidos

A visualização das bandas foi feita através da fluorescência,

sob radiação ultravioleta (312 nm), do brometo de etídeo

incorporado:

Coloração do Gel com Solução de Brometo de

Etídeo

Após a corrida, o gel foi imerso numa

solução a 10 g/ml de brometo de etídeo (EtBr)

durante cerca de 15 minutos.

Aquisição e Registo da Imagem Fotográfica do

Gel

O gel corado com EtBr foi fotografado num

sistema de Imagem Eagle Eye II da Stratagene,

sob radiação ultravioleta para induzir a

fluorescência do EtBr intercalado nas bases do

DNA. A imagem devidamente tratada para

evidenciar as bandas foi impressa e arquivada em

suporte informático (disquete de 3½'').

2.6.3 Diluições

Para ser amplificado, a concentração do DNA deve situar-se

entre 10 g/l e 50 g/l. Nos casos em que a concentração estava

acima daquele valor máximo, efectuaram-se diluições com água

desionizada estéril (para um volume final de 40 l) para que a

concentração de DNA das amostras ficásse dentro do intervalo

indicado.

38


2.7 Controlo da Amplificabilidade do DNA e da Inibição pela

Matriz

Antes de se proceder à reacção de PCR que conduz à detecção

dos elementos genéticos a pesquisar, é necessário avaliar se o DNA

extraído é amplificável e se a matriz da amostra contém produtos

inibidores da reacção de amplificação. O teste da amplificabilidade é

feito recorrendo a uma PCR de fragmentos de DNA universais de

plantas (que, portanto, se sabe estarem presentes nas amostras

analisadas) como DNA de cloroplasto ou de fragmentos de genes de

proteínas específicas como a lecitina (para amostras contendo soja)

ou a invertase [87] (para amostras contendo ou consistindo em

milho). Para investigar a presença de inibidores da PCR na matriz

das amostras, efectuam-se, em paralelo, duplicados de cada

amostra e padrão a que se adicionou DNA controlo, amplificável

com o programa de amplificação e concentrações usadas.

2.7.1 PCR 23 de DNA de Cloroplasto

Nas amostras cujos resultados são apresentados e discutidos,

o controlo da amplificabilidade e da inibição da matriz é feito por

amplificação de um fragmento não codificante universal de DNA de

cloroplasto (cpDNA) [88]. As sequências do par de oligonucleotídeos

iniciadores usado são:

c – 5'-GCA AAT CGG TAG ACG CTA CG-3'

d – 5'-GGG GAT AGA GGG ACT TGA AC-3'.

Aqueles primers geram fragmentos de amplificação entre 500

a 600 bp, dependendo da espécie vegetal cujo DNA foi submetido a

amplificação: obtem-se um fragmento de amplificação de cerca 600

bp em amostras contendo soja; a presença de milho é revelada pelo

aparecimento de um fragmento de amplificação com menos de 200

bp e de outro com pouco mais de 500 bp.

23 As diversas PCR constantes no procedimento experimental foram realizadas num termociclador Trio da Biometra, pelo que os programas de amplificação mencionados são referentes a este aparelho.

39


Quando não há amplificação com aquele par de

oligonucleotídeos iniciadores, tentam-se as PCR de lecitina e

invertase, que geram produtos de amplificação mais curtos24, o que

pode permitir a obtenção de resultados positivos quando a

degradação do DNA da amostra impossibilita obter amplicons com a

dimensão dos que resultam da PCR de cpDNA.

O programa de amplificação usado com os oligonucleotídeos

iniciadores c e d consiste num passo de desnaturação inicial com a

duração de 3 min. e 3 s a 98ºC, seguido de 35 ciclos de amplificação

– em que cada um compreende um passo de desnaturação de 1

min. a 94ºC, a desnaturação dos primers, operação com a duração

de 1 min. à temperatura de 54ºC e a fase de elongação, levada a

cabo a 72ºC25, durante 2 min – a que se segue uma elongação final

de 3 min. a 72ºC, terminando com um arrefecimento opcional a 4ºC

(duração de 0 min. na programação do aparelho), para o caso de as

amostras terem de pemanecer no aparelho durante algum tempo

(ou mesmo de um dia para o outro).

O DNA controlo usado para testar a presença de inibidores da

PCR na matriz das amostras foi extraído de milho Bt-176 a 5%.

A composição, por cada tubo de reacção, da mastermix para

amplificação de cpDNA com o par de oligonucleotídeos iniciadores e

o programa de amplificação descritos é a seguinte: 26 l de H2O;

5,25 l de tampão de PCR 10; 5,25 l de MgCl2 a 25 mM; 5,25 l de

BSA a 20 g/ml; 2,6 l de uma solução equimolar dos 4 dNTPs a 4

mM; 1,3 l de soluções de cada um dos oligonucleotídeos

iniciadores ambas a 10 pmol/l; 0,25 l de Taq DNA Polymerase. A

quantidade de DNA adicionada por tubo foi de 7 l26. Aos duplicados

de cada amostra e padrão foram ainda acrescentados 2 l do DNA 24 Oligonucleotídeos iniciadores para lecitina, que geram um fragmento de amplificação de 118 bp: IVR-1-F – 5'-CCG CTG TAT CAC AAG GGC TGG TAC C-3', IVR-1-R – 5'-GGA GCC CGT GTA GAG CAT GAC GAT C-3'. Oligonucleotídeos iniciadores para invertase, que geram um fragmento de amplificação de 226 bp: IVR-1-F – 5'-CCG CTG TAT CAC AAG GGC TGG TAC C-3', IVR-1-R – 5'-GGA GCC CGT GTA GAG CAT GAC GAT C-3'.25 Que é a temperatura óptima da polimerase do DNA termoresistente da bactéria hipertermófila Thermus aquaticus – a Taq Polymerase [76], usada na maioria das PCR efectuadas em todo o mundo [89].

40


controlo. Preparou-se igualmente um controlo da mastermix,

substituindo o DNA molde por água estéril desionizada, o qual foi

submetido à reacção de amplificação juntamente com os outros

tubos. Em todos os casos, adicionou-se o DNA (e o DNA controlo,

nos duplicados para controlo da inibição pela matriz) ou a água (no

caso do controlo da mastermix) a uma alíquota de 45 l de

mastermix num tubo de 0,2 ml, agitando-se a mistura e

centrifugando-se brevemente antes de colocar o tubo no

termociclador que, sendo um modelo com tampa aquecida, permitiu

prescindir da adição de óleo mineral à mistura reaccional.

O controlo da extracção, obtido como indicado no ponto 2.5.1,

e o seu duplicado a que se adicionou o DNA de milho Bt-176 a 5%

sofreram o mesmo processo de amplificação que as amostras, os

padrões, os respectivos duplicados e o controlo da mastermix.

2.7.2 Electroforese dos Produtos de Amplificação 27

A electroforese dos fragmentos amplificados pela PCR de

cloroplasto foi efectuada num gel de agarose a 2% em tampão TBE

1 (preparado como descrito na nota de rodapé do ponto 2.6.1),

adicionando-se 16 l de tampão de arrastamento à totalidade de

cada um dos produtos de amplificação obtidos no passo anterior (18

l, no caso dos tubos que continham DNA controlo). No sentido de

melhorar a visualização das bandas no gel (vide nota de rodapé do

ponto anterior), foi aplicado um volume maior que os habituais 14 l

de cada solução resultante (cerca de 25 a 30 l), utilizando-se para

isso um gel com pentes mais largos. O gel (de 200 ml coberto com

26 A quantidade normalmente utilizada é de 5 l mas, com esse volume, obteve-se uma má visualização das bandas no gel subsequente (dados não apresentados) pelo que a reacção foi repetida, com esta alteração.27 Alternativamente à separação dos fragmentos de amplificação por electroforese e da sua visualização através da fluorescência do EtBr incorporado, alguns autores propoem a separação e quantificação de misturas de DNA por cromatografia líquida [90-92]. Esse método permite a separação bem com a quantificação dos fragmentos de DNA de forma mais rápida que os métodos electroforéticos (o que é vantajoso sobretudo na fase de optimização das condições de amplificação por PCR) e possibilita uma fácil recuperação e posterior purificação dos produtos de interesse.

41


cerca de 2 l de tampão TBE 1) foi deixado a correr durante 2 h,

sob uma diferença de potencial de 125 V (campo eléctrico aplicado

de 5 V/cm). Como padrão de peso molecular foi, de novo, empregue

a solução de 100 bp DNA Ladder, cuja composição é indicada na

nota de rodapé do ponto 2.6.1.


Esta parte do protocolo experimental foi realizada segundo o

procedimento descrito no ponto 2.6.2.

42


2.8 Pesquisa do Promotor CaMV 35S

2.8.1 PCR do Promotor CaMV 35S

A presença do promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor

– CaMV (cauliflower mosaic virus) – é revelada pela amplificação de

um fragmento de 195 bp da sua sequência, usando o par de

oligonucleotídeos iniciadores 35S-1, 35S-2 [1].

O programa de amplificação para este elemento genético é

apresentado na referência 1.

A composição da mastermix, por cada tubo de reacção, é a

que se segue: 26 l de H2O; 5,25 l de tampão de PCR 10; 5,25 l

de MgCl2 a 25 mM; 5,25 l de BSA a 20 g/ml; 2,6 l de uma solução

equimolar dos 4 dNTPs a 4 mM; 1,3 l de cada solução de

oligonucleotídeo iniciador, ambas a 20 M; 0,25 l de Taq DNA

Polymerase (AmpliTaq Gold® DNA Polymerase da Applied

Biosystems). A quantidade de DNA – ou água, para preparar o

controlo da extracção – a adicionar é de 5 l28. A mistura reaccional

foi preparada como descrito para a reacção de amplificação anterior

(vide em 3.6.1).

2.8.2 Electroforese dos Produtos de Amplificação

A separação dos fragmentos de amplificação obtidos na PCR

da sequência alvo foi efectuada como descrito para a electroforese

dos produtos de amplificação da PCR de cpDNA (vide ponto 2.7.2).




28 À semelhança do que aconteceu na PCR anterior, também a aqui a quantidade inicial de DNA molde teve de ser aumentada para 7 l, pelo mesmo motivo.

43


2.9 Pesquisa do Terminador NOS

2.9.1 PCR do Terminador NOS

A existência do terminador NOS (da sintase de nopalina) no

DNA da amostra é detectada pela amplificação de um fragmento de

180 bp desse elemento genético, utilizando o par de

oligonucleotídeos iniciadores NOS-1, NOS-3 [1].

A pesquisa deste elemento genético regulador partilha o

mesmo programa de amplificação que o promotor CaMV 35S (vide

referência 1).

A mastermix para a pesquisa da sequência de interesse difere

apenas no par de oligonucleotídeos iniciadores adicionado (vide

preparação da mastermix para a PCR anterior). A mistura reaccional

foi preparada como descrito para a reacção de amplificação de um

fragmento do promotor 35S (vide ponto 2.8.1).

2.9.2 Electroforese dos Produtos de Amplificação

A separação dos produtos de amplificação obtidos na PCR da

sequência pesquisada foi levada a cabo como descrito para a

electroforese dos produtos de amplificação da PCR de cpDNA (vide

ponto 2.7.2).




44

45

46

Resultados

3 R e s u l t a d o s

A interpretação e arquivo dos dados obtidos ao longo do

processo que se acabou de descrever é feito através das imagens

fotográficas dos géis de agarose que resultaram das diversas

electroforeses realizadas ao longo do procedimento experimental.

Assim, apresentar-se-ão nas figuras que se seguem os diversos géis

referentes ao conjunto de amostras considerado.

3.1 Avaliação da Integridade e Concentração do DNA

Como se pode observar por comparação

com os padrões de concentração da Figura 2, todas as amostras e

padrões, à excepção do padrão de soja Roundup Ready® a 0% e da

amostra de milho comercial não transgénico, tinham concentrações

em DNA abaixo de 10 g/l – o limite mínimo aconselhado para

47

Figura 1 – Imagem fotográfica do gel da electroforese do DNA extraído. Poço 1, padrão de peso molecular (100 bp DNA Ladder); poço 2, controlo da extracção; poço 3, soja Roundup Ready® a 0%; poço 4, soja Roundup Ready® a 2%; poço 5, milho comercial; poço 6, ração nº 8144; poço 7, ração nº 7566; poço 8, padrão de peso molecular (100 bp DNA Ladder).

1 2 3 4 5 6 7 8

Figura 2 – Imagem fotográfica do gel da electroforese das diferentes diluições do padrão de concentração ( DNA). Poço 1, padrão de peso molecular (100 bp DNA Ladder); poço 2, padrão de concentração a 10 g/l; poço 3, padrão de concentração a 25 g/l; poço 4, padrão de concentração a 50 g/l; poço 5, padrão de concentração a 100 g/l; poço 6, padrão de concentração a 200 g/l.

1 2 3 4 5 6


garantir amplificabilidade (vide ponto 2.6.3) – apesar disso, essas

amostras de DNA foram submetidas ao teste de amplificabilidade

por PCR de cloroplasto, já que se supunha que seriam, ainda assim,

amplificáveis. Pelo contrário, o DNA extraído do padrão de soja

Roundup Ready® a 0% e da amostra de milho em grão (poços 3 e 5

da Figura 1, respectivamente) teve de ser diluído, como indicado em

2.6.3, de 1:5, no primeiro caso e de 1:2 na amostra de milho, antes

de lhes ser aplicado o teste de amplificabilidade. Verifica-se ainda

que o controlo da extracção se apresentava isento de DNA, como

era suposto.

Acrescentou-se, nos passos seguintes do procedimento

experimental, uma amostra de DNA de milho Bt-176 a 2% para

comparação com a amostra comercial de milho, que estava a ser

usada como controlo negativo para a presença de milho GM.

48

Resultados

3.2 Controlo da Amplificabilidade do DNA e da Inibição pela

Matriz29

Na

figura acima, verificou-se que mesmo as amostras com uma

concentração de DNA tão baixa que eram praticamente não

detectáveis na Figura 1 eram de facto amplificáveis. Observa-se

igualmente que houve uma certa inibição da PCR nos duplicados a

que se adicionou DNA controlo, por excesso de DNA.

Os resultados obtidos nesta parte do procedimento

experimental permitiram assegurar o prosseguimento da pesquisa

pretendida para todas as amostras do lote considerado.

29 O gel apresentado é uma repetição do gel original em que se depositou um volume superior de amostra (vide nota de rodapé do ponto 3.6.1) e se omitiu o controlo da extracção, que se tinha revelado limpo de DNA no primeiro gel efectuado (dados não apresentados).

49

Figura 3 – Imagem fotográfica do gel de agarose da electroforese dos produtos de PCR de DNA de cloroplasto obtidos no ponto 2.7.1. do procedimento experimental. Poço 1, padrão de peso molecular (100 bp DNA Ladder); poço 2, ração nº 7566; poço 3, ração nº 7566 + controlo; poço 4, ração nº 8144; poço 5, ração nº 8144 + controlo; poço 6, milho comercial; poço 7, milho comercial + controlo; poço 8, milho Bt-176 a 2%; poço 9, milho Bt-176 a 2% + controlo; poço 10, soja Roundup Ready® a 0%; poço 11, soja Roundup Ready® a 0% + controlo; poço 12, soja Roundup Ready® a 2%; poço 13, soja Roundup Ready® a 2% + controlo; poço 14, controlo da mastermix; poço 15, controlo da mastermix + controlo; poço 16, padrão de peso molecular (100 bp DNA Ladder).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16


3.3 Pesquisa do Promotor CaMV 35S

50

Figura 4 – Imagem fotográfica do gel de agarose da electroforese dos produtos de PCR do promotor 35S obtidos no ponto 2.8.1. do procedimento experimental. Poço 1, padrão de peso molecular (100 bp DNA Ladder); poço 2, ração nº 7566; poço 3, ração nº 8144; poço 4, milho comercial; poço 5, milho Bt-176 a 2%; poço 6, soja Roundup Ready® a 0%; poço 7, soja Roundup Ready® a 2%; poço 8, controlo da mastermix; poço 9, padrão de peso molecular (100 bp DNA Ladder).

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Resultados

3.4 Pesquisa do Terminador NOS

51

Figura 5 – Imagem fotográfica do gel de agarose da electroforese dos produtos de PCR do promotor 35S obtidos no ponto 2.9.1. do procedimento experimental. Poço 1, padrão de peso molecular (100 bp DNA Ladder); poço 2, ração nº 7566; poço 3, ração nº 8144; poço 4, milho comercial; poço 5, milho Bt-176 a 2%; poço 6, soja Roundup Ready® a 0%; poço 7, soja Roundup Ready® a 2%; poço 8, controlo da mastermix; poço 9, padrão de peso molecular (100 bp DNA Ladder).

1 2 3 4 5 6 7 8 9

52

53

54

Discussão

4 D i s c u s s ã o

Os resultados apresentados na secção anterior permitem

descobrir se o promotor CaMV 35S e/ou o terminador NOS estão

presentes em cada uma das amostras analisadas e, dado que esses

elementos genéticos são largamente utilizados em biotecnologia

agrícola, inferir sobre a presença de OGM nas amostras em que se

detectaram fragmentos de amplificação nas PCR dos pontos 2.8.1

e/ou 2.9.1. No entanto, a análise dos resultados tem de ser

cautelosa já que a presença quer de um, quer do outro fragmento

pesquisado numa dada amostra não significa necessariamente que

esta contenha OGM [1]:

- podem obter-se falsos positivos baseados na

presença do promotor CaMV 35S uma vez que o

vírus do mosaico da couve-flor de onde é derivado

infecta crucíferas (sendo mínimo o risco de

infecção de outras famílias com CaMV) [93], razão

pela qual a análise de resultados positivos

referentes a amostras contendo plantas da família

Cruciferae deve ser feita com cuidado;

- o terminador NOS, sendo de origem bacteriana,

pode ser incorporado em alimentos através do

solo, pelo que têm de ser tomadas precauções na

análise de raízes.

A detecção do terminador NOS é menos sensível que a do

promotor 35S, o que tem como consequência um número

ligeiramente superior de falsos negativos [2]. Por outro lado, o facto

de esse elemento genético não estar presente no milho Bt-176 [6]

(uma das quatro variedades de milho actualmente autorizadas na

UE [94]) pode permitir, nalguns casos, a sua identificação preliminar

numa amostra30, antes de se realizarem testes específicos por

30 Se uma amostra composta exclusivamente por milho (a PCR de cpDNA tem um papel preponderante na confirmação da composição das amostras, como se pode constatar na discussão dos respectivos resultados) der resultado positivo para o promotor 35S mas não contiver indicação da existência do terminador NOS, pode

55


exemplo para a presença da versão sintética truncada do gene cry

IA(b), que codifica para a -edotoxina de Bacillus thuringiensis

subsp. kurstaki [95] presente naquela cultura vegetal GM.

Um resultado positivo nas pesquisas em análise limita-se a

dar algum fundamento a uma suspeita da presença de OGM, que

poderá, como se referiu na introdução, ser confirmada através de

testes para a presença de genes específicos de determinados OGM.

O gel do DNA extraído (Figura 1) mostra, que embora a

dimensão da maioria dos fragmentos se encontre abaixo dos 300

bp, existe uma quantidade significativa do DNA das amostras que

tem uma dimensão na ordem desse valor e mesmo acima, o que,

em princípio, permite assegurar a amplificação dos fragmentos dos

dois elementos genéticos reguladores pesquisados (cuja dimensão

se situa abaixo de 200 bp), dependendo da concentração do DNA

nas amostras. Relativamente a esse aspecto, a concentração da

maioria das amostras era de facto inferior ao limite mínimo

recomendado – 10 g/l (vide ponto 2.6.3) – mas este facto não

invalidou o teste da amplificabilidade subsequente, como se pode

comprovar na Figura 3.

Da análise das bandas obtidas no gel da Figura 3 (a

interpretação das bandas resultantes da PCR de cpDNA foi discutida

no ponto 2.7.1) depreende-se que a ração para frangos com o nº

7566 contém milho, o mesmo acontecendo com a outra ração

analisada (ração para novilhos de engorda com o nº 8144), que

também contém soja, bem como outra(s) planta(s) forrageira(s)

(talvez trigo).

Os resultados obtidos em 2.8.2 (vide Figura 4) permitem

concluir que ambas as amostras de rações analisadas continham o

fragmento de 195 bp do promotor 35S do vírus do mosaico da

couve-flor, enquanto que a amostra de milho em grão revelou estar

isenta desse elemento genético, como era esperado (recorde-se que

se sabia à partida que o milho analisado não era GM – vide ponto

apostar-se fortemente na identificação da amostra em causa como sendo de milho Bt-176.

56

Discussão

2.3). Os padrões tiveram o comportamento que era suposto: tanto o

padrão de milho Bt-176 a 2% como o de soja Roundup Ready® a

2% apresentaram uma banda perto dos 200 bp, ao passo que quer

a amostra de milho, quer o padrão de soja Roundup Ready® a 0%

deram resultado negativo nesta pesquisa.

Na pesquisa do terminador NOS, cujos resultados são

apresentados na Figura 5, ambas as rações deram resultado

positivo e a amostra de milho comercial não acusou a banda de 180

bp, o que está de acordo com a informação de que se dispunha

sobre essa amostra (vide ponto 2.3). Da análise dos padrões

obteve-se um resultado coerente com a sua natureza: os padrões

negativos de espécies transgénicas não evidenciaram o elemento

genético pesquisado, o mesmo acontecendo com o padrão de milho

Bt-176 a 2% – uma vez que este tipo de milho não contém o

terminador NOS –, pelo que, de entre os padrões, só o de soja

Roundup Ready® a 2% originou a banda característica da

amplificação efectuada.

Em suma, os resultados obtidos mostram que ambas as

rações analisadas podem conter OGM31, ao passo que o milho

testado não é, de facto, transgénico (salvo se tiver sido

geneticamente modificado recorrendo a outros elementos genéticos

reguladores que não os pesquisados – se esse fosse o caso, o milho

em questão seria um OGM não aprovado na UE, já que as quatro

variedades de milho GM aprovadas32 contêm, pelo menos, o

promotor CaMV 35S [6]).

A confirmação da indentificação dos fragmentos de DNA

amplificados com a sequência de DNA alvo em cada pesquisa

31 Facto que não é surpreendente, dada a dependência portuguesa de soja, que o nosso país importa da Argentina, Brasil e Estados Unidos [8], sabendo-se que os Estados Unidos da América e a Argentina são os países onde a percentagem de cultivo de variedades GM daquela cultura é mais significativa e que, apesar de o Brasil não autorizar a plantação de culturas GM, inúmeros relatórios mencionam que, em 1999, pelo menos 10% da soja brasileira era GM (as sementes são importadas de forma fraudulenta da Argentina) [5, 15].32 O milho Bt-176 da Ciba-Geigy, o milho T25 da AgrEvo, o milho MON 810 (YieldGard®) da Monsanto [17] e o milho Bt-11 da Novartis, segundo dados de Maio de 2000 [94].

57


poderia ter sido feita por uma análise de restrição (digestão dos

produtos de amplificação com endonucleases apropriadas e

obtenção consequente de dois ou mais fragmentos de tamanhos

conhecidos), como proposto na referência 1, por Southern Blot

(recorrendo a sondas de DNA específicas para sequências contidas

em cada um dos fragmentos amplificados) [96-98] ou ainda (para

uma identificação inequívoca) por sequênciação dos fragmentos

obtidos [98]. No entanto, os métodos de confirmação prolongam o

tempo de análise e aumentam o seu custo – factores a ter em conta

em exames de rotina – e tornam-se prescindíveis assim que se

estabeleça a robustez e fiabilidade do método empregue, com

determinado tipo de matrizes.

Os fragmentos de amplificação de ambos os elementos

genéticos pesquisados resultantes da aplicação dos

oligonucleotídeos iniciadores usados neste trabalho rondam os 200

bp mas, no caso de alimentos processados (nomeadamente nos

produtos expandidos), submetidos a um tratamento térmico33

agressivo que degrade os ácidos nucleícos [96], visto a quantidade

e o tamanho médio do DNA presente na amostra ser inferior

(nalguns alimentos, como os óleos ou o chocolate, pode ter-se

apenas quantidades residuais de DNA, para além da presença de

produtos que inibem a PCR), pode ser necessário utilizar-se

oligonucleotídeos iniciadores que giram fragmentos de amplificação

mais curtos34. Em alernativa ou juntamente com a diminiução dos

fragmentos de amplificação, pode recorrer-se a métodos de

extracção de DNA que dêem maior rendimento, como o CTAB, em

detrimento de kits comerciais (como o Wizard® da Promega [99,

78]), que permitem obter DNA de melhor qualidade para a PCR

33 As forças de corte usadas no processamento das matérias-primas e o pH (sobretudo àcido) são também responsáveis por uma clivagem aleatória do DNA, reduzindo o tamanho médio dos fragmentos de DNA presentes na amostra.34 Sequências (3'5') dos primers para amplificação do promotor CaMV 35S (amplicon de 123 bp) e do terminador NOS (amplicon de 118 bp) em alimentos processados:p35S-cf3 – CCA CGT CTT CAA AGC AAG TGG e p35S-cr4 – TCC TCT CCA AAT GAA ATG AAC TTC C; HANOS 118-f – GCA TGA CGT TAT TTA TGA GAT GGG e HANOS 118-r – GAC ACC GCG CGC GAT AAT TTA TCC.

58

Discussão

subsequente mas com um rendimento muito inferior [100], e/ou

fazer mais que uma extracção por amostra e juntar o DNA obtido

em cada uma. Uma outra hipótese para a amplificação de amostras

com DNA muito degradado e que pode ser usada em conjunto com

as acima referidas é o recurso à tecnica de nested PCR [75, 101,

102].

Como apreciação final, pode afirmar-se que o método

validado a nível comunitário para a detecção de OGM em alimentos

[1] revelou ser aplicável a amostras de alimentos para animais,

nomeadamente à matriz particular dos alimentos compostos para

animais35, o que o torna numa ferramenta valiosa para pôr em

prática a legislação vigente e futura sobre comercialização e

rotulagem de OGM destinados ao consumo animal no mercado

único europeu.

35 Os resultados da aplicação do método discutido tinham já sido apresentados oralmente no 5º Encontro de Química de Alimentos, realizado entre 8 e 11 de Maio de 2001 na Escola Superior de Biotecnologia da Universidade Católica Portuguesa, tendo sido publicada no respectivo livro de actas a comunicação "Nunes da Costa, J.M. & Sequeira, A.J. Detecção de Organismos Geneticamente Modificados em Alimentos para Animais por PCR".

59

60

61

62

Bibliografia

5 B i b l i o g r a f i a

[1]DG JRC, Environment Institute, Consumer Protection & Food Unit.

Screening method for the identification of genetically modified

organisms (GMO) in food: Detection of the CAMV 35S promoter

and NOS terminator by means of polymerase chain reaction

(PCR).

[2]Lipp, M., Brodman, P. Pietsch, K., Pauwels, J. and Anklam, E.

1999. IUPAC collaborative trial study of a method to detect

genetically modified soy beans and maize in dried powder. J.

AOAC Int. 82: 923-928.

[3]Organisation for Economic Co-operation and Development.

01/06/2001 Biotech Statistics Progress.

http://www.oecd.org/doc/M00003000/M00003698.doc.

[4]COM (2001) 454 final Communication from the commission

Towards a Strategic Vision of Sciences and Biotechnology:

Consultation Document.

http://europa.eu.int/eur-lex/com/cnc/2001/

com2001_0454en01.pdf.

[5]Directorate-General for Agriculture. Economic Impacts of

Genetically Modified Crops in the Agri-Food Sector.

http://europa.eu.int/comm/agriculture/publi/gmo/gmo.pdf.

[6]Hemmer, W. 1997. Foods derived from genetically modified

organisms and detection methods. BATS-Report, Agency for

Biosafety research And Assessment of Technology Impacts of the

Suiss Priority Programme Biotechnology of the Swiss National

Science Foundation, Clarastr. 13, CH-4058 Basel. 2/97.

[7]Molving, L., Tabe, L.M., Eggum, B.O., Moore, A.E. Craig, S.,

Spencer, D. and Higgins, T.J.V. 1997. Enhanced methionine levels

and increased nutritive value of seeds of transgenic lupins

(Lupinus angustifolius L.) expressing a sunflower seed albumin

gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 8393-8398.

63

http://europa.eu.int/comm/agriculture/publi/gmo/gmo.pdf

http://europa.eu.int/eur-lex/com/cnc/2001/com2001_0454en01.pdf

http://europa.eu.int/eur-lex/com/cnc/2001/com2001_0454en01.pdf

http://www.oecd.org/doc/M00003000/M00003698.doc


[8]Piçarra, J. 2000. Organismos Geneticamente Modificados: Uma

Perspectiva da Indústria de Alimentos Compostos para Animais.

Alimentação Animal 36:4-6.

[9]Zak, J.R. 2000. Comentário sobre Biotecnologia dos Produtores de

Soja dos EUA. Alimentação Animal 36: 12-23.

[10] Rasmussen, P.E., Goulding, K.W.T., Brown, J.R., Grace, P.R.,

Janzen, H.H. and Körschens, M. 1998. Long-Term Agroecosystem

Experiments: Assessing Agricultural Sustainability and Global

Change. Science 282: 893-896.

[11] Stone, R. 1994. Large Plots Are Next Test For Transgenic

Plants. Science 266: 1472-1473.

[12] International Service for the Acquisition of Agri-biotech

Applications. 2001. Global GM Crop Area Continues to Grow –

Likely to Reach 50 Million Hectares, or 125 Million Acres, in 2001.

www.isaaa.org/press%20release/Global%20GMO%20Area.htm.

[13] EuropaBio. 2001. GMO Fact Sheet.

www.europabio.org/upload/articles/article_90.pdf.

[14] Rosa, J.J.S. 2000. OGM's, Agricultura e Progresso. Alimentação

Animal 36: 10-11.

[15] Green, D. 2000. OGMs Como Evitar uma Crise. Alimentação

Animal 36: 24-25.

[16] Monsanto. Caderno Técnico nº 1: Avaliação da Segurança da

Soja Roundup Ready® (Evento 40-3-2).

[17] YeldGard Maiz protegido contra taladros – Monsanto. Caderno

Técnico nº 2: Segurança do Milho MON 810 (YiedGard®),

Geneticamente Protegido contra as Brocas.

[18] Daniell, H., Datta, R., Varma, S., Gray, S. and Lee, S.

Containment of herbicide resistance through genetic engineering

of the chloroplast genome. Nature Biotechnology 16: 345-348.

[19] Bergelsin, J., Purrington, C.B. and Wichmann, G. 1998.

Promiscuity in transgenic plants. Nature 395: 25.

64

http://www.europabio.org/upload/articles/article_90.pdf

http://www.isaaa.org/press%20release/Global%20GMO%20Area.htm

Bibliografia

[20] Stewart, C.N., Prakash, C.S. 1998. Chloroplast-transgenic

plants are not a gene flow panacea. Nature Biotechnology 16:

401.

[21] Anthony, R.G., Waldin, T.R., Ray, J.A., Bright, S.W.J. and

Hussey, P.J. 1998. Herbicide resistence caused by spontaneous

mutation of the cytoskeletal protein tubulin. Nature 393: 260-

263.

[22] Altieri, M. 1998. The Environmental Risks of Transgenic Crops:

an Agroecological Assessment. Ecological Impacts.

[23] Lehrer, S.B., Horner, W.E. and Reese, G. 1996. Why are some

proteins allergenic? Implications for biotechnology. Crit Rev Food

Sci Nutr 36 (6): 553-564.

[24] Cookson, C. The Nature of Things: The huge unstoppable

experiment. Finacial Times November 8, 1997.

[25] Palukaitis, P. and Roossinck, M.J. 1996. Spontaneous change of

a benign satellite RNA of cucumber mosaic virus to a pathogenic

variant. Nature Biotechnology 14: 1264-1268.

[26] Timmons, A.M., Charters, Y.M., Crawford, J.W., Burn, D., Scott,

S.E., Dubbels, S.J., Wilson, N.J., Robertson, A., O'Brien, E.T.,

Squire, G.R. and Wilkinson, M.J. 1996. Risks from transgenic

crops. Nature 380: 487.

[27] Mikkelsen, T.R., Andersen, B. and Jrgensen, R.B. The risk of

crop transgene spread. Nature 380: 31.

[28] Tabashnik, B.E., Liu, Y., Finson, N., Masson, L. and Heckel, D.G.

1997. One gene in diamondback moth confers resistence to four

Bacillus thuringiensis toxins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 1640-

1644.

[29] Falk, B.W. and Bruening, G. 1994. Will Transgenic Crops

Generate New Viruses and New Diseases? Science 263: 1395-

1396.

[30] Kareiva, P. Transgenic plants on trial. Nature 363: 580-581.

65


[31] Crawley, M.J., Hails, R.S., Rees, M., Kohn, D. and Buston, J.

Ecology of transgenic oilseed rape in natural habitats. Nature

363: 620-623.

[32] Losey, J.E., Rayor, L.S. and Carter, M.E. 1999. Transgenic

pollen harms monarch larvae. Nature 399: 214.

[33] Estruch, J.J., Carozzi, N.B., Desai, N., Duck, N.B., Warren, G.W.

and Koziel, M.G. 1997. Transgenic plants: An emerging approach

to pest control. Nature Biotechnology 15: 137-141.

[34] Marrs, T.C. Toxicology of Pesticides. General & Applied

Toxicology Edited by Ballantyne, B., Marrs, M. and Turner, P.

Volume 2. Stockton Press. 1994.

[35] http://www.biotech-info.net/butterflies_btcorn.html.

[36] Monarch Butterflies and Toxic Pollen.

www.ucsusa.org/agriculture/monarch.html.

[37] Pimentel, D. S. and Raven, P.H. 2000. Bt Corn Pollen Impacts

on Nontarget Lepidoptera: Assessment of Effects in Nature. Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 97 (15):8198-8199.

[38] http://www.aphis.usda.gov/biotech/corn.html.

[39] http://www.aphis.usda.gov/biotech/soybean.html.

[40] Piçarra, J. 1999. Organismos Geneticamente Modificados: Uma

Perspectiva da Indústria. Alimentação Animal 32: 6-7.

[41] Directiva 90/220/CEE do Conselho de 23 de Abril de 1990

relativa à libertação deliberada no ambiente de organismos

geneticamente modificados. Jornal Oficial das Comunidades

Europeias das Comunidades Europeias L 117, 08/05/90, p.0015-

0027.

[42] Recomendação 82/472/CEE do Conselho, de 30 de Junho de

1982, relativa ao registo dos trabalhos respeitantes ao ácido

desoxiribonucleico (ADN) recombinante. Jornal Oficial das

Comunidades Europeias L 213, 21/07/1982 p. 0015-0016.

[43] Directiva 2001/18/CE do Parlamento Europeu e do Conselho,

de 12 de Março de 2001, relativa à libertação deliberada no

ambiente de organismos geneticamente modificados e que

66

http://www.aphis.usda.gov/biotech/soybean.html

http://www.aphis.usda.gov/biotech/corn.html

http://www.ucsusa.org/agriculture/monarch.html

http://www.biotech-info.net/butterflies_btcorn.html

Bibliografia

revoga a Directiva 90/220/CEE do Conselho. Jornal Oficial das

Comunidades Europeias L 106, 17/04/2001, p. 0001-0039.

[44] Recomendação 97/618/CE da Comissão, de 29 de Julho de

1997, relativamente aos aspectos científicos, à apresentação dos

pedidos de colocação no mercado de novos alimentos e

ingredientes alimentares e à elaboração dos relatórios de

avaliação preliminar nos termos do Regulamento (CE) nº 258/97

do Parlamento Europeu e do Conselho.

[45] Directiva 90/219/CEE do Conselho, de 23 de Abril de 1990,

relativa à utilização confinada de microrganismos geneticamente

modificados. Jornal Oficial das Comunidades Europeias L 117,

08/05/1990, p. 0001 – 0014.

[46] Decreto-Lei nº 126/93, de 20 de Abril. Diário da República

Número 92 Série I-A.

[47] Portaria nº 751/94, de 16 de Agosto. Diário da República

Número 188/94 Série I-B.

[48] Decreto-Lei nº 63/99, de 2 de Março. Diário da República

Número 51/99 Série I-A.

[49] Decreto-Lei nº 172/98, de 25 de Junho. Diário da República

Número 144/98 Série I-A.

[50] Directiva 97/35/CE da Comissão de 18 de Junho de 1997 que

adapta pela segunda vez ao progresso técnico a directiva

90/220/CEE do conselho relativa à libertação deliberada no

ambiente de organismos geneticamente modificados. Jornal

Oficial das Comunidades Europeias L 169, 27/06/1997 p. 0072-

0073.

[51] Decisão 96/281/CE da Comissão de 3 de Abril 1996 relativa à

colocação no mercado de soja (Glycine max L.) geneticamente

modificada com maior tolerância ao herbicida glifosato, nos

termos da Directiva 90/220/CEE do Conselho. Jornal Oficial das


[52] Decisão 97/98/CE da Comissão de 23 de Janeiro 1997 relativa

à colocação no mercado de milho (Zea mays L.) geneticamente

67


modificado com propriedades insecticidas conferidas pelo gene

da Bt-endotoxina juntamente com uma maior tolerância ao

herbicida glufosinato-amónio, ao abrigo da Directiva 90/220/CEE

do Conselho. Jornal Oficial das Comunidades Europeias L 031,

01/02/1997, p. 0069-0070.

[53] Regulamento (CE) Nº 258/97 do Parlamento Europeu e do

Conselho de 27 de Janeiro de 1997 relativo a novos alimentos e

ingredientes alimentares. Jornal Oficial das Comunidades

Europeias L 043, 14/02/97 p. 0001-0007.

[54] Regulamento (CE) Nº 1139/98 do Conselho, de 26 de Maio de

1998, relativo à menção obrigatória, na rotulagem de

determinados géneros alimentícios produzidos a partir de

organismos geneticamente modificados, de outras informações

para além das previstas na Directiva 79/112/CEE. Jornal Oficial

das Comunidades Europeias L 159, p. 0004-0007.

[55] Saegusa, A. 1999. Japan tightens rules on GM crops to protect

the environment. Nature 399: 719.

[56] Regulamento (CE) Nº 49/2000 da Comissão de 10 de Janeiro

de 2000 que altera o Regulamento (CE) Nº 1139/98 do Conselho

relativo à menção obrigatória, na rotulagem de determinados

géneros alimentícios produzidos a partir de organismos

geneticamente modificados, de outras informações para além

das previstas na Directiva 79/112/CEE. Jornal Oficial das


[57] Directiva 98/95/CE do Conselho de 14 de Dezembro de 1998

que altera, no que diz respeito à consolidação do mercado

interno, às variedades de plantas geneticamente modificadas e

aos recursos genéticos, as Directivas 66/400/CEE, 66/402/CEE,

66/403/CEE, 69/208/CEE, 70/457/CEE e 70/458/CEE relativas à

comercialização de sementes de beterraba, sementes de plantas

forrageiras, sementes de cereais, batatas de sementes,

sementes de plantas oleaginosas e de fibras e sementes de

produtos hortícolas a ao catálogo comum das variedades de

68

Bibliografia

plantas agrícolas. Jornal Oficial das Comunidades Europeias L

025, 01/02/1999 p. 0001-0026.

[58] Livro Branco sobre Segurança dos Alimentos, Anexo relativo

ao Plano de Acção em matéria de Segurança dos Alimentos.

Comissão das Comunidades Europeias (1999) 719 final. Ed.

12.1.2000, Bruxelas.

[59] Directiva 70/524/CEE do Conselho, de 23 de Novembro de

1970 relativamente aos aditivos na alimentação para animais.

Jornal Oficial das Comunidades Europeias L 270, 14/12/1970, p.

0001-0017.

[60] Directiva 1999/20/CE do Conselho de 22 de Março de 1999

que altera as Directivas 70/524/CEE relativa aos aditivos na

alimentação para animais, 82/471/CEE relativa a certos produtos

utilizados na alimentação dos animais, 95/53/CE que fixa os

princípios relativos à organização dos controlos oficiais no

domínio da alimentação animal e 95/69/CE que estabelece as

condições e regras aplicáveis à aprovação e ao registo de certos

estabelecimentos e intermediários no sector da alimentação

animal. Jornal Oficial das Comunidades Europeias L 080,

25/03/1999, p. 0020-0021.

[61] Proposta de Regulamento 2001/0173 do Parlamento Europeu

e do Conselho relativo a alimentos geneticamente modificados

para a alimentação humana e animal. Comissão das

Comunidaddes Europeias, 25/07/2001.

[62] Eurobarometer 52.1 The Europeans and Biotechnology.

http://europa.eu.int/comm/research/pdf/eurobarometer-en.pdf.

[63] Silva, M. 2000. Transgénicos em Portugal: Há Vantagens?.

Alimentação Animal 36: 8-9.

[64] Europe ambivalent on biotechnology (1997). Nature 387 845-

847.

[65] Hoban, T.J. 2000. A Biotecnologia no Novo Milénio.

Alimentação Animal 36: 30-32.

69

http://europa.eu.int/comm/research/pdf/eurobarometer-en.pdf


[66] Lipp, M., Bluth, A., Eyquem, F., Kruse, L., Schimmel, H., Van

den Eede, G. and Anklam, E. 2000. Validation of method based

on polymerase chain reaction for the detection of genetically

modified organisms in various processed foodstuffs. Eur. Food

Res. Techol., in press.

[67] Van den Eede, G., Lipp, M., Eyquem, F. and Anklam, E. 2000.

Validation of an analytical method for the detection of GMO-

derived DNA in processed foodstuffs. EUR 19677 EN (2000).

[68] DMIF-GEN Final Project. 1999. DMIF-GEN Project: development

of methods to identify foods produced by means of genetic

engineering. EU-Project SMT4-CT96-2072, Final report 12/1999.

http://food.ethz.ch/dmif-gen/.

[69] EU Tender Project. 2000. Development of qualitative as well

as quantitative detection methods to identify a genetic

modification in soybean and maize products. Report of the EU

tender No XXIV/98/A3/001 (2000).

[70] Lipp, M. and Anklam, E. 2000. Validation of an Immunoassay

for Detection and Quantification of a Genetically Modified

Soybean in Food and Food Fractions Using Reference Materials:

Interlaboratory Study. Journal of AOAC International 83 (4): 919-

927.

[71] http://biosafety.ihe.be/ARGMO/GMO_Plants.html.

[72] Yoder, J. I., Goldsbrough, A. P. 1994. Transfomation Systems

for Generating Marker-Free Transgenic Plants. Bio/Technology

12: 263-267.

[73] Sanchis, V., Agaisse, H., Chaufaux, J., Lereclus, D. 1997. A

Recombinase-Mediated System for Elimination of Antibiotic

Resistance Gene Markers from Genetically Engineered Bacillus

thuringiensis Strains. Applied and Environmental Microbiology.

63: 779-784.

[74] MacCormick, C.A., Griffin, H.G., Underwood, H.M. and Gasson,

M.J. 1998. Common DNA sequences with potencial for detection

70

http://biosafety.ihe.be/ARGMO/GMO_Plants.html

http://food.ethz.ch/dmif-gen/

Bibliografia

of genetically manipulated organisms in food. Journal of Applied

Microbiology 84: 969-980.

[75] http://www.eurofins.com.

[76] Stryer, L. Biochemistry, 4th ed. W. H. Freeman and Company,

New York, 1995.

[77] Lodish, L., Baltimore, D., Berk, A., Zipursky, S. L., Matsudaira,

P., Darnell, J. Molecular Cell Biology, 3rd ed., Scientific American

Books, New York, 1997.

[78] Meyer, R., Candrian, U. and Lüthy, J. 1994. Detection of Pork in

Heated Meat Products by the Polymerase Chain Reaction. Journal

of AOAC International 77:617-622.

[79] http://people.ne.mediaone.net/jkimball/BiologyPages/A/

AntisenseRNA.html.

[80] Rensberg, B. 93/01/04. Technique May Fight Disease by

Reversing Instructions to Cells. The Washington Post, Science –

Genetic Engineering.

[81] Weintraub, H. 1990. Antisense RNA and DNA. Scientific

American January: 34-40.

[82] http://www.fda.gov/bbs/topics/NEWS/NEW00482.html.

[83] Meyer, R. 1995. Detection of genetically engineered plants by

polymerase chain reaction (PCR) using the FLAVR SAVR tomato

as an example. Z Lebensm Unters Forsch 201 (6): 583-586.

[84] Kay, R., Chan, A., Daly, M., McPherson, J. 1987. Duplication of

CaMV 35S Promotor Sequences creates a Strong Enhancer for

Plant Genes. Science 236:1299-1309.

[85] Odell, J.T., Nagy, F. and Chua, N. 1985. Identification of DNA

sequences required for activity of the cauliflower mosaic virus

35S promoter. Nature 313:810-812.

[86] Promega. Wizard® Magnetic DNA Purification System for

Food. Technical Bulletin No. 284.

http://www.promega.com/tbs/tb284/tb284.pdf

71

http://www.promega.com/tbs/tb284/tb284.pdf

http://www.fda.gov/bbs/topics/NEWS/NEW00482.html

http://people.ne.mediaone.net/jkimball/BiologyPages/A/AntisenseRNA.html

http://people.ne.mediaone.net/jkimball/BiologyPages/A/AntisenseRNA.html

http://www.eurofins.com/


[87] Xu, J., Pemberton, G.H., Almira, E., McCarty, D.R. and Koch,

K.E. 1995. The Ivr 1 Gene for Invertase in Maize. Plant Physiol.

108: 1293-1294.

[88] Taberlet, P., Gielly, L., Panton, G. and Bouvet, J. 1991.

Universal primers for amplification of three non coding regions of

chloroplast DNA. Plant Molecular Biology 17: 1105-1109.

[89] PhorTech International. 2000. 1999/2000 U.S. DNA

Amplification Survey. 1999/2000 MSPPSA series.

[90] Katz, E.D., Haff, L.A. and Eksteen, R. 1990. Rapid separation,

quantitation and purification of products of polymerase chain

reaction by liquid chromatography. Journal of Chromatography

512: 433-444.

[91] Kato, Y., Yamasaki, Y., Onaka, A., Kitamura, T., Hashimoto, T.,

Murotsu, T., Fukushige, S. and Matsubara, K. 1989. Separation of

DNA restriction fragments by high-performance ion-exchange

chromatography on a non-porous ion exchanger. Journal of

Chromatography 478: 264-268.

[92] Kato, Y., Kitamura, T., Mitsui, A., Yamasaki, Y., Hashimoto, T.,

Murotsu, T., Fukushige, S. and Matsubara, K. Separation of

oligonucleotides by high-performance ion-exchange

chromatography on a non-porous ion exchanger. Journal of

Chromatography 447: 212-220.

[93] http://image.fs.uidaho.edu/vide/descr184.htm.

[94] Facts on GMOs in the EU.

http://europa.eu.int/comm/dgs/health-consumer/library/press/

press63_en.pdf.

[95] Aronson, A.I. Insecticidal Toxins. Bacillus subtilis and Other

Gram-Positive Bacteria. (1993). Ed. Soneshein, A.L., Hoch, J.A.

and Losick, R. A.S.M. Washington, D.C.

[96] Hupfer, C., Hotzel, H., Sachse, K. 1998. Detection of the

genetic modifications in heat-treated products of Bt maize by

polymerase chain reaction. Z Lebensm Unters Forsh A. 206: 203-

207.

72

http://europa.eu.int/comm/dgs/health-consumer/library/press/press63_en.pdf

http://europa.eu.int/comm/dgs/health-consumer/library/press/press63_en.pdf

http://image.fs.uidaho.edu/vide/descr184.htm

Bibliografia

[97] Vollenhofer, S., Burg, K., Schmidt, J. and Kroath, H. 1999.

Genetically Modified Organisms in Food – Screening and Specific

Detection by Polymerase Chain Reaction. J. Agric. Food Chem.

47: 5038-5043.

[98] Hupfer, C., Hotzel, H., Sachse, K. and Engel, K. 1997.

Detection of genetically modified insect-resistant Bt maize by

means of polymerase chain reaction. Z Lebensm Unters Forsch A

205: 442-445.

[99] Promega Corporation 1999. Wizard® Plus Minipreps DNA

Purification Systems. Technical Bulletin No. 117.

[100] Zimmermann, A., Lüthy, J. and Pauli, U. 1998. Quantitative

and qualitative evaluation of nine different extraction methods

for nucleic acids on soya bean food samples. Z. Lebensm Unters

Forsch A 207:81-90.

[101] Van Hoef, A. M. A., Kok, E. J., Bouw, E., Kuiper, H. A. and Keijer,

J. 1998. Development and Application of a selective detection

method for genetically modified soy and soy-derived products.

Food Additives and Contaminants 15 (7): 767-774.

[102] Meyer, M., Chardonnens, F., Hübner, P. and Lüthy, J. 1996.

Polymerase chain reaction (PCR) in the quality and safety

assurance of food: detection of soya in processed meat products.

Z Lebensm Unters Forsh 203: 339-344.

73

Documents

Relatório de Estágio