RELATÓRIO DE ESTÁGIO - bdigital.ipg.ptbdigital.ipg.pt/dspace/bitstream/10314/1948/1/F EP2_ Cátia V D... · relatÓrio de estÁgio profissional ii cÁtia vanessa dias resende relatÓrio

R E L A T Ó R I O D E E S T Á G I O

P R O F I S S I O N A L I I

CÁTIA VANESSA DIAS RESENDE

RELATÓRIO PARA A OBTENÇÃO DO GRAU DE LICENCIADO EM FARMÁCIA

julho | 2014

Escola Superior de Saúde

Instituto Politécnico da Guarda

CURSO FARMÁCIA - 1º CICLO

4º ANO / 1º SEMESTRE

RELATÓRIO DE ESTÁGIO PROFISSIONAL II

CÁTIA VANESSA DIAS RESENDE

ORIENTADORES E SUPERVISORES: PROFESSOR MAXIMIANO RIBEIRO

E PROFESSORA PAULA COUTINHO

julho|2014

Escola Superior de Saúde

Instituto Politécnico da Guarda

SIGLAS

BSA – Albumina sérica de bovino

LES – Lúpus Eritematoso Sistémico

SLC – Sistemas de Libertação Controlada

ABREVIATURAS

g – gramas

mg – miligramas

mL – mililitros

µL - microlitros

Dedico este trabalho a todos aqueles que nunca duvidaram das minhas capacidades e me

apoiaram, ao longo de todo o percurso, nos momentos positivos e menos positivos,

incentivando sempre um passo firme em direção ao futuro.

Agradeço, de forma especial, ao professor Maximiano Ribeiro e à professora Paula Coutinho

pela amabilidade, disponibilidade, compreensão, empenho e, especialmente, pela orientação e

paciência tidos durante o período de estágio e que contribuíram pela maior motivação no

desenvolver de todos os processos que o trabalho laboratorial exigiu.

Agradeço, de igual forma, aos restantes professores e comunidade escolar pelo interesse

demonstrado pelo projeto, pela curiosidade despertada, pelo empenho quando alguma

dificuldade surgia e pelo otimismo sempre transmitido.

A todos, MUITO OBRIGADA!

“Nada se manifesta à mente humana, se esta não começa por mostrar-se acessível ao

conhecimento que generosamente se apresenta à sua investigação.”

Carlos Bernardo González Pecotche

RESUMO

Este trabalho tem como objetivo primordial a produção de um sistema de libertação

controlada de fármacos com base em polímeros naturais com potencial utilização na

libertação de fármacos a nível intestinal e na libertação de fármacos em locais alvo. Um

sistema de libertação promissor são as micropartículas. Este foi o sistema escolhido para o

tratamento do lúpus.

Foram sintetizadas micropartículas de alginato e micropartículas de alginato revestidas

com quitosano. Ambas as partículas tinham encapsulada albumina sérica de bovino (BSA) –

proteína modelo.

Foi determinada a percentagem de encapsulação da BSA nos dois tipos de

micropartículas e avaliado o perfil de libertação da proteína in vitro. Para isso, procedeu-se à

elaboração de uma solução que simula-se o pH gástrico e outra que simula-se o pH entérico.

A quantificação de proteína libertada e encapsulada foi realizada pelo método de Bradford.

Depois dos testes de solubilidade efetuados e da verificação da proteína libertada, concluiu-se

que as micropartículas alginato/quitosano apresentam um melhor sistema de libertação

controlada, uma vez que as micropartículas de alginato apresentaram uma taxa de eficácia de

67,88% (ou seja, libertou-se 1,88mg de 2,77mg de BSA) e as micropartículas de

alginato/quitosano apresentaram uma taxa de eficácia de 74,93% (ou seja, libertou-se 3,08mg

de 4,12mg de BSA).

Este estudo serviria de modelo para a síntese de micropartículas que encapsulassem

fármacos com inúmeros efeitos secundários indesejáveis utilizados no tratamento do lúpus.

PALAVRAS-CHAVE: micropartículas, alginato, quitosano, BSA, encapsulação, testes de

solubilidade, lúpus.

ABSTRACT

The main goal of this work was the synthesis of a delivery system for the controlled

release of drugs based on natural polymers with potential use in drug delivery at the intestinal

and target places. A promising system of release is the microparticulated systemes, which was

selected for this work for the preliminary evaluation for lupus treatment.

Microparticles of Alginate and microparticles of alginate crosslinked with quitosano

were synthesized. Both systems had bovine serum albumin (BSA) (protein model)

encapsulated.

The percentage of encapsulation of BSA was determined for both types of

microparticles and the protein release profile measured in vitro. For this, was used and

prepared solutions that simulates gastric pH and the enteric pH. The quantification of released

and encapsulation of protein was performed by the Bradford method. After the solubility test

and the evaluation of the protein release, it was concluded that the alginate / chitosan

microparticles are a better controlled release system.

This preliminary study can be used for the development of delivery systems adapted to

the drugs used to treat lupus, and that have been refered for their undesirable side effects

mostly associated to a deficient release system.

KEYWORDS: microparticles, alginate, chitosan, BSA, encapsulation, solubility tests, lupus.

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1 – (a) monómeros que constituem o alginato (b) alginato em cadeia (c) sequência esquemática

da conformação da cadeia de alginato (Draget et al) ............................................................................ 21

Figura 2 – Estrutura do quitosano (Santos, 2006) ................................................................................. 23

Figura 3 – Espectrofotómetro ................................................................................................................ 32

Figura 4 – Amostras em banho maria a uma temperatura constante de 37ºC ....................................... 33

Figura 5 – Micropartículas de alginato ................................................................................................. 35

Figura 6 – Micropartículas de alginato/quitosano ................................................................................. 35

Figura 7 – Gotejamento de alginato com BSA em cloreto de cálcio .................................................... 37

Figura 8 – Micropartículas de alginato ................................................................................................. 37

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1 – Tratamento medicamentoso em diferentes comprometimentos (Sato et. al) ......... 15

Tabela 2 – Tratamento não medicamentoso (Sato et. al & Araújo et. al) ................................ 16

Tabela 3 – Vantagens dos sistemas de libertação controlada (adaptada de Lyra et. al 2007 [12]

) ................................................................................................................................................. 18

Tabela 4 – Exemplos de polímeros naturais utilizados na síntese de SLC (Adaptado de

Coimbra,2010 [13] ) ................................................................................................................. 20

Tabela 5 – Propriedades do alginato que o tornam alvo de interesse na síntese de SLC

(adaptado de Gombotz et. al [21]) ............................................................................................ 22

Tabela 6 – Propriedades do quitosano (Adaptado de Coimbra, 2010) ..................................... 24

Tabela 7 – Determinação da percentagem de encapsulação de BSA ....................................... 37

Tabela 8 – Determinação da percentagem de encapsulação de BSA nas micropartículas de

alginato ..................................................................................................................................... 38

Tabela 9 – Determinação da massa de BSA libertada .............................................................. 39

ÍNDICE DE GRÁFICOS

Gráfico 1 – Reta de calibração ................................................................................................. 36

Gráfico 2 – Perfil de libertação de BSA no suco gástrico nas micropartículas de alginato e nas

de alginato/quitosano ................................................................................................................ 41

Gráfico 3 – Perfil de libertação de BSA em suco entérico nas micropartículas de

alginato/quitosano. O perfil de libertação de BSA no mesmo suco em micropartículas de

alginato não está representado pelos valores díspares obtidos. ................................................ 41

ÍNDICE

CAPÍTULO I: INTRODUÇÃO................................................................................................ 10

1.1. LÚPUS ERITEMATOSO SISTÉMICO ................................................................... 11

1.1.1. Caracterização da patologia: causas, fatores de risco, prognóstico, diagnóstico,

controlo e prevenção ......................................................................................................... 11

1.1.2. Tratamento .......................................................................................................... 14

1.2. LIBERTAÇÃO CONTROLADA DE FÁRMACOS ................................................ 17

1.3. SISTEMAS DE LIBERTAÇÃO CONTROLADA DE BASE POLIMÉRICA ........ 18

1.3.1. Polímeros de origem natural: aplicações nos sistemas de libertação controlada

de fármacos ....................................................................................................................... 19

1.4. MICROPARTÍCULAS POLIMÉRICAS .................................................................. 24

1.5. LIBERTAÇÃO IN VITRO DE FÁRMACOS E PROTEÍNAS MODELO ............... 25

1.5.1. Suco Gástrico Artificial ...................................................................................... 26

1.5.2. Suco Entérico Artificial ...................................................................................... 26

1.5.3. Métodos de quantificação de fármacos e proteínas ............................................ 26

1.6. OBJETIVOS .............................................................................................................. 28

CAPÍTULO II: MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................ 29

2.1. MATERIAIS .................................................................................................................. 30

2.2. MÉTODOS ................................................................................................................ 30

2.2.1. Síntese de micropartículas de alginato com BSA ............................................... 30

2.2.2. Síntese de micropartículas de alginato revestidas com quitosano ...................... 31

2.2.3. Reta de calibração ............................................................................................... 31

2.2.4. Determinação da eficiência de encapsulação de BSA em Alginato e

alginato/quitosano ............................................................................................................. 31

2.2.5. Determinação da libertação in vitro de BSA em diferentes pH ......................... 32

CAPÍTULO III: RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................... 34

3.1. CARACTERIZAÇÃO DAS MICROPARTÍCULAS ................................................... 35

3.2EFICIÊNCIA DE ENCAPSULAÇÃO DE BSA EM ALGINATO ................................ 35

3.2. EFICIÊNCIA DE ENCAPSULAÇÃO DE BSA NAS MICROPARTÍCULAS DE

ALGINATO/QUITOSANO ................................................................................................. 38

3.3. DETERMINAÇÃO DA LIBERTAÇÃO IN VITRO DE BSA EM DIFERENTES pH 39

CAPÍTULO IV: CONCLUSÃO E PRESPETIVAS FUTURAS ............................................. 42

4. CONCLUSÃO E PRESPETIVAS FUTURAS ............................................................. 43

CAPÍTULO V: REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................... 44

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................... 45

ANEXOS .................................................................................................................................. 47

10

CAPÍTULO I: INTRODUÇÃO

11

1.1.LÚPUS ERITEMATOSO SISTÉMICO

O lúpus eritematoso sistémico (LES) é uma doença autoimune crónica. Lupus é o latim

utilizado para lobo e refere-se, desta forma, à erupção cutânea que se verifica na face de

grande parte dos doentes afetados por esta patologia e que se assemelha à mordida de um

lobo. Já Sistémica é a palavra usada para traduzir uma doença que pode afetar os órgãos e

tecidos por todo o corpo.

O lúpus eritematoso sistémico é apenas um dos tipos de lúpus existentes. Este tipo é o

mais comum e o que pode levar a complicações sistémicas graves. Outras formas de lúpus

incluem: lúpus eritematoso cutâneo (que se limita à pele não afetando outras partes do corpo),

lúpus eritematoso discóide (um tipo de lúpus eritematoso cutâneo que apresenta erupções sob

forma de disco na face, no couro cabeludo e/ou nos ouvidos), lúpus induzido por fármacos

(forma temporária e leve de lúpus causada por alguns medicamentos antihipertensores como a

hidralazina, inibidores da enzima de conversão da angiotensina e bloqueadores dos canais de

cálcio e diuréticos como é o caso da hidroclorotiazida) e lúpus neonatal (forma rara de lúpus

que afeta recém-nascidos que as mães são portadoras de LES e que nascem com problemas de

fígado e de sangue, com erupções cutâneas e que podem desenvolver problemas cardíacos)

[1].

1.1.1. Caracterização da patologia: causas, fatores de risco, prognóstico, diagnóstico,

controlo e prevenção

O sistema imunitário é o sistema de defesa do organismo. Quando saudável este

sistema produz anticorpos que defendem o corpo humano de agentes agressores,

reconhecendo-os e atuando para os eliminar. Em doentes portadores de LES, o sistema

imunológico está debilitado e, em vez de produzir anticorpos que protegem o organismo,

produz autoanticorpos que atacam e destroem equivocadamente células e os tecidos saudáveis

do próprio paciente. Estes autoanticorpos provocam inflamação anormal dos vasos

sanguíneos, acabando por danificar células, tecidos e, consequentemente, órgãos [1].

Não se sabe exatamente o que desponta uma resposta imune anormal, no entanto, o

mais provável é a combinação de fatores genéticos e ambientais. Existem, assim, diversos

fatores de risco que podem desencadear uma predisposição para a patologia são eles o género

12

(cerca de 90% dos pacientes com LES são mulheres em idade fértil), a idade (grande parte dos

pacientes com LES desenvolvem a patologia entre os 15 e os 44 anos), a raça e etnia (afro-

americanos e asiáticos são mais suscetíveis à patologia), a história de família e causas

ambientais e externas (vírus, radiação ultravioleta, fumo, químicos, terapia de reposição

hormonal e contracetivos orais)[2].

O número e a variedade de anticorpos que podem estar presentes no lúpus são maiores

do que em qualquer outra doença e, juntamente com outros fatores como os referidos

anteriormente, determinam os sintomas que se desenvolvem. Assim, os sintomas e a sua

intensidade bem como gravidade, variam muito de caso para caso. O LES pode ser ligeiro,

devastador, incapacitante ou mesmo mortal [3]. Esta patologia tem associada uma ampla

gama de sintomas, sendo os mais comuns dor nas articulações, erupções cutâneas e febre sem

outra causa. Outros sintomas comuns incluem: dor no peito aquando de uma respiração

profunda, fadiga, desconforto geral, alopecia, úlceras na cavidade oral, fotossensibilidade e

edema dos gânglios linfáticos. Há sintomas que dependem especificamente da parte do corpo

que é afetada. Quando o cérebro e o sistema nervoso são afetados verifica-se uma

predominância de sintomas como: cefaleias, (formigueiro/dormência), convulsões, problemas

visuais e alterações de personalidade. No caso de afetar o aparelho digestivo verifica-se dor

abdominal, náuseas e vómitos e no caso de ser o coração o órgão afetado as arritmias tornam-

se os sintomas mais evidentes. Tosse com sangue e dificuldade em respirar são sintomas

predominantes quando o pulmão de encontra afetado e cor de pele irregular bem como

fenómeno de Raynaud são sintomas associados à pele. Algumas pessoas apresentam apenas

sintomas de pele, o que se denomina de lúpus discoide.

Embora o lúpus possa ser crónico e persistente, este manifesta-se de forma

intermitente, ou seja, é marcado por períodos de remissão (onde há uma ausência de sintomas)

alternados com crises em que a patologia se encontra ativa e os sintomas tendem em piorar,

sendo que estas crises diminuem, habitualmente, após a menopausa. Os períodos de ausência

de sintomas podem, por vezes, durar anos, mas o curso do LES é imprevisível e varia muito

de pessoa para pessoa. Alguns pacientes apresentam uma forma leve de lúpus manifestada por

erupções de pele ocasionais, febre, fadiga ou dores musculares e articulares. Por vezes, o

lúpus permanece na sua forma leve, outras vezes pode evoluir para uma forma mais grave. O

lúpus grave envolve sérias complicações de saúde e danos nos órgãos. Devido a um

tratamento mais eficaz e agressivo, o prognóstico para o LES tem melhorado

significativamente ao longo das últimas duas décadas. Um tratamento precoce que controle a

13

inflamação inicial pode melhorar as perspetivas a longo prazo. Mais de 95% dos pacientes

sobrevivem pelo menos 10 anos e, muitos deste, têm uma expetativa de vida normal [2].

O Colégio Americano de Reumatologia criou uma lista de sintomas e medidas que os

médicos podem utilizar como guia para decidir se o paciente tem lúpus, para isso, o paciente

tem de apresentar pelo menos quatro dos seguintes problemas:

Erupções:

o Rash malar;

o Erupção discoide;

o Erupção na pele exposta ao sol

Úlceras na boca e nariz: feridas na boca ou nariz que persistem durante alguns

dias ou mais de um mês;

Artrite: dor e edema com duração de algumas semanas;

Envolvimento cardiopulmonar: inflamação do tecido que reveste os pulmões

(pleurite) ou o coração (pericardite) que pode causar dor no peito ao respirar

profundamente;

Problema renal: sangue ou proteína na urina, ou testes que sugiram

insuficiência renal;

Problema neurológico: convulsões, derrames ou psicoses;

Alterações hematológicas: anemia hemolítica, baixa contagem de glóbulos

brancos ou baica contagem de plaquetas;

Alterações imunológicas:

o Anti ds-DNA;

o Anti-Sm;

o Anticorpos anti fosfolípido baseado em:

Níveis anormais de anticorpos anti cardiolipina IgG ou IgM;

Anticoagulante lúpico positivo;

Teste serológico falso positivo confirmado para Treponema

palidum, durante pelo menos 6 meses;

Presença de anticorpos antinucleares (ANA)[1].

Devido à diversidade de sintomas esta patologia parece-se com muitas outras doenças

o que torna difícil o seu diagnóstico. Exemplo disso é o facto de esta patologia ser várias

vezes confundida com a artrite reumatoide por afetar o tecido conjuntivo das articulações [3].

14

No controlo da atividade do LES devem realizar-se hemogramas, avaliação da

velocidade de sedimentação, da função renal (ureia/creatinina), dos anticorpos anti-dsDNA,

dos fatores do complemento C3 e C4 (e, se ambos apresentarem valores normais, CH50) e do

anti-C1q (para despiste de nefropatia lúpica).

Como forma de prevenção, o paciente com lúpus deve realizar regularmente consultas

de rotina para reavaliar sintomas, sinais observados pelo médico e análise e exames realizados

com o intuito de reajustar, se necessário, o tratamento; evitar o stress; recorrer ao uso diário

de protetores solares e vestuário adequado para prevenir a exposição solar e evitar exposição a

luz fluorescente e raios UV; fazer um repouso adequado; evitar esforços físicos exagerados;

tratar precocemente as infeções e pedir sempre aconselhamento sobre qual o melhor

contracetivo oral para evitar a administração de altas doses de estrogénio [4].

1.1.2. Tratamento

O tratamento para o LES não tem como objetivo a cura mas sim o alívio dos sintomas

que a patologia envolve. O tratamento varia de paciente para paciente, dependendo da

gravidade dos seus sintomas e de que parte do seu corpo é afetado. A maioria dos doentes

com LES é visto regularmente por um especialista que orienta a sua terapêutica. Assim, o

tratamento pode dividir-se em medicamentoso convencional, não medicamentoso e novos

sistemas terapêuticos já desenvolvidos.

1.1.2.1.Medicamentoso convencional

O tratamento medicamentoso convencional utilizado, independentemente do órgão ou

do sistema afetado, prende-se com o uso contínuo de antimaláricos (utilizados com o intuito

de reduzir a atividade da doença, reduzir a administração de corticoides e o risco de

tromboses), glicocorticóides e imunossupressores [5, 6].

“É importante o diagnóstico diferencial entre atividade da doença e infeção,

lembrando da possibilidade de coexistência de ambas, assim como da presença de co

morbidades”

A definição da terapêutica para cada paciente é determinada pela sintomatologia

persistente (Tabela 1) [5].

15

Tabela 1 – Tratamento medicamentoso em diferentes comprometimentos (Sato et. al)

Tratamento medicamentoso

Comprometimento cutâneo

- Terapia tópica com corticoide não fluorado

na face;

- Terapia com corticoide fluorado em lesões

hipertróficas aplicada sob forma oclusiva ou

de infiltração

Comprometimento articular

- Artrites agudas: sem comprometimento

sistémico - anti-inflamatórios não hormonais,

prednisolona em doses baixas, antimalárico

ou metotrexato; com comprometimento

sistémico – infiltração com glicocorticóides

Comprometimento hematológico

- Prednisolona;

- Metilprednisolona (em casos graves);

- Associação de prednisolona a

imunossupressores;

- Imunoglobulina intravenosa (em pacientes

com anemia hemolítica autoimune);

Comprometimento cardiopulmonar

- Corticosteróides;

- Imunossupressores;

- Vasodilatadores;

- Anticoagulantes.

Comprometimento Neuropsiquiátrico

- Glucocorticoides e/ou imunossupressores

(principalmente ciclofosfamida);

- Anticoagulantes (em caso de doenças

cerebrovasculares);

- Anticonvulsivantes (para tratamento de

convulsões)

16

1.1.2.2.Não medicamentoso

O tratamento não medicamentoso do LES prende-se a algumas orientações essenciais

para os portadores (Tabela 2)[5, 6].

Tabela 2 – Tratamento não medicamentoso (Sato et. al & Araújo et. al)

Tratamento não medicamentoso

Atividade física

Repouso nos surtos da patologia devido ao

condicionamento físico.

Nos períodos de remissão estimular a atividade

física regular

Dieta Adoção de uma dieta equilibrada evitando

excessos de sal, hidratos de carbono e lípidos.

Outros

Utilização diária de protetor solar.

Evitar o tabagismo.

Não usar anticoncecionais orais.

A educação do paciente é também um fator a ter em conta. Explicar aos pacientes e

aos seus familiares o que é a doença, quais as suas implicações e tratamentos é essencial para

que se consiga viver uma vida sem condicionantes de maior. O apoio psicológico é outro

aspeto a não esquecer, uma vez que o paciente necessita de otimismo e motivação para

concretizar/atingir projetos de vida.

1.1.2.3. Novos Sistemas Terapêuticos

Os novos sistemas terapêuticos sintetizados para o tratamento de LES são anticorpos

monoclonais: rituximab, epratuzumab e belimumab.

O rituximab é responsável pela depleção de linfócitos B de maneira a evitar a sua

diferenciação em plasmócitos e, desta forma, diminuir a produção de autoanticorpos.

O epratuzumab tem ainda o seu mecanismo de ação pouco conhecido, mas acredita-se

que também atue influenciando a depleção das células B circulantes.

O belimumab foi o primeiro inibidor do estimulador dos linfócitos B e assegura a sua

redução em pacientes com lúpus.

17

1.2.LIBERTAÇÃO CONTROLADA DE FÁRMACOS

“O principal objetivo de um fármaco, quando administrado, é atingir

concentrações plasmáticas ou níveis de concentrações adequadas nos tecidos,

sendo terapeuticamente efetivo e não tóxico, por um longo tempo”.[7]

O desenvolvimento de novos e eficazes sistemas de libertação controlada de fármacos

é fundamental na melhoria dos perfis farmacológicos de muitos grupos farmacoterapêuticos,

uma vez que combatem algumas lacunas existentes no que toca a efeitos indesejáveis mas

também a forma farmacêutica de apresentação dos mesmos [8], apresentando, assim,

inúmeras vantagens tanto farmacológicas como a nível de eficácia terapêutica no que toca à

adesão do paciente (Tabela 3).

De forma a minimizar a degradação e perda de substância ativa, bem como, evitar

efeitos secundários indesejáveis e aumentar a biodisponibilidade do fármaco na zona

requerida, têm sido desenvolvidos diversos sistemas de libertação. Estes sistemas de

libertação têm como objetivo o direcionamento e distribuição efetiva do fármaco. Entre os

veículos de fármacos pode-se destacar os polímeros solúveis, lipossomas, micelas,

micropartículas biodegradáveis (naturais e sintéticas), micropartículas de polímeros

insolúveis, microcápsulas [9], lipossomas, micelas poliméricas, nanopartículas poliméricas e

de cerâmica e dendrimeros [10]. Cada um destes veículos apresenta vantagens e desvantagens

próprias, tendo de ser, por isso, escolhido consoante as necessidades e especificações do

fármaco [9].

Assim, consideramos que os SLC foram desenvolvidos com o intuito principal de

manter uma concentração controlada de fármaco dentro da janela terapêutica do mesmo

diminuindo, desta forma, o risco de toxicidade [11].

18

Tabela 3 – Vantagens dos sistemas de libertação controlada (adaptada de Lyra et. al 2007 [12] )

Vantagens

Farmacológicas

- Manter nível terapêutico;

- Impedir efeitos colaterais indesejados e níveis tóxicos;

- Evitar subníveis terapêuticos;

- Aumentar segurança na administração de fármacos

Eficácia terapêutica

- Maior comodidade devido à diminuição do número de tomas

diárias;

- Facilidade na adesão à terapêutica por parte do paciente

- Redução dos efeitos secundários indesejados

1.3.SISTEMAS DE LIBERTAÇÃO CONTROLADA DE BASE POLIMÉRICA

“Os materiais poliméricos, pela sua variedade, versatilidade e

propriedades, são a classe de materiais mais investigada no desenvolvimento

de SLC.”[13]

Cada vez mais, com o conhecimento das propriedades e do desenvolvimento de novos

polímeros, tem exigido a criação de veículos de libertação de fármacos mais eficientes e mais

funcionais. Assim, são sintetizados polímeros com funções específicas no que diz respeito à

libertação dos fármacos como, por exemplo, a sua solubilidade em diferentes pH e

direcionamento pretendido, de forma a solucionar problemas emergentes [11].

A escolha do polímero a utilizar é, sobretudo, feita de acordo com o princípio ativo,

uma vez que a interação excipiente-fármaco influencia os mecanismos de desintegração,

libertação, absorção e biodisponibilidade do princípio ativo, ou seja, o perfil

farmacoterapêutico é diretamente correlacionado com a interação do fármaco com o

polímero[14].

Nos SLC de fármacos de base polimérica, o princípio ativo encontra-se encapsulado

numa matriz polimérica moldada conforme a via de administração [7], ou seja, num sistema

constituído por cadeias polimerizadas de uma ou várias substâncias químicas que são agentes

19

moduladores da libertação do mesmo [15]. A libertação da substância ativa é controlada por

mecanismos como a erosão, difusão e intumescimento [7].

É exigido, na preparação de um SLC, que os produtos de degradação do mesmo não

sejam tóxicos e que tenham uma boa biocompatibilidade nos tecidos para onde são

direcionados [13].

Segundo Coimbra [13], os SLC de fármacos de base polimérica podem classificar-se

em:

Sistemas de libertação controlados por difusão (que podem ser de reservatório

ou matricial);

Sistemas de libertação ativados pelo solvente (controlados pela pressão

osmótica ou pela absorção de água);

Sistemas de libertação controlados por ação química (de cadeias pendentes ou

de sistemas biodegradáveis).

1.3.1. Polímeros de origem natural: aplicações nos sistemas de libertação controlada de

fármacos

Os polímeros naturais são produzidos por organismos vivos e amplamente utilizados

na síntese de SLC [13], essencialmente micropartículas e nanopartículas poliméricas [16].

Os peptídeos, as proteínas, os polissacarídeos e os polihidroxialcanoatos são os

polímeros naturais que se destacam na preparação de SLC com base em polímeros naturais

(Tabela 4) [16].

Estes polímeros são utilizados na indústria farmacêutica como agentes emulsionantes e

adjuvantes no desenvolvimento de produtos farmacêuticos e cosméticos [17].

As vantagens desta classe de polímeros incluem a bioadesão (à mucosa ocular,

urinária, gastrointestinal, vaginal e nasal), a biocompatibilidade, a biodegradabilidade e

biodisponibilidade. Por outro lado, a desvantagem mais verificada é a variação do processo de

obtenção e purificação de lote para lote [16].

Para a realização do trabalho laboratorial utilizaram-se dois polissacarídeos: o alginato

e o quitosano.

20

Tabela 4 – Exemplos de polímeros naturais utilizados na síntese de SLC (Adaptado de Coimbra,2010 [13] )

Classe Exemplos

Polímeros de base proteica Gelatina, albumina, colagénio, fibrina e

proteína de soja

Polissacarídeos

Alginato, agarose, ácido hialurónico, amido,

pectina, dextrano, quitosano, carragenina,

derivados de celulose e sulfato de condroitina

Polihidroxialcanoatos Poli(3-hidroxibutirato) e poli(3-

hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato)

1.3.1.1.Polissacarídeos: estrutura, propriedades e aplicações

Polissacarídeos são biopolímeros que apresentam elevado peso molecular. Estes

biopolímeros são constituídos por monossacarídeos ligados entre si através de ligações

glicosídicas [18].

A conformação em cadeia e as associações intermoleculares irão influenciar as

propriedades físico-químicas desta classe de polímeros e o arranjo mais estável dos átomos

que constituem o polissacarídeo será aquele que satisfaça as forças intra e intermoleculares.

Eles são classificados consoante os monossacáridos que os constituem e as ligações entre eles,

assim como pela configuração absoluta que adquirem (D- ou L-).

Estes polímeros podem ser obtidos através de fontes microbianas, animais ou vegetais

e mostram apresentar hemocompatibilidade elevada provavelmente pelas suas caraterísticas

químicas serem semelhantes com a heparina. Os polissacarídeos não são tóxicos e, em

comparação com outros polímeros naturais, têm baixos custos o que também tem

impulsionado a sua utilização na engenharia de tecidos (em particular nas cartilagens), em

sistemas para imobilização de células e em veículos de SLC de fármacos[19].

O alginato e o quitosano, os dois polissacarídeos envolvidos no trabalho laboratorial e

que de seguida se apresentam, são dois polissacarídeos com uma extensa história na medicina,

farmácia e ciências básicas, uma vez que são facilmente extraídos de plantas marinhas e de

casca de crustáceos [20].

21

1.3.1.1.1. Alginato

O alginato é um polímero natural com aplicações crescentes na indústria

biotecnológica. Este polímero tem sido amplamente utilizado na alimentação e nas bebidas

devido às suas propriedades espessantes, gelificantes e estabilizadoras. Nos últimos tempos

tem sido investigada a sua aplicação em SLC de fármacos pelas propriedades únicas que

apresenta (Tabela 5) [21].

Este polissacarídeo apresenta uma estrutura linear não ramificada que contém blocos

de repetição das unidades de 1,4-ligado-β-D-ácido manurónico (M) e α-L-ácido gulurónico

(G) (Figura 1) [22], presentes nas algas marinhas das quais derivam [23]. Os blocos são

compostos por resíduos consecutivos de M (MMMMM), por resíduos consecutivos de G

(GGGGGG) e por alternância entre eles (GMGMGM) [24].

Os alginatos comerciais são extraídos de algas castanhas (Phaeophyce) de espécies

como Laminaria hyperborea, Ascophyllum nodosum e Macroscystis pyrifera por tratamento

por soluções alcalinas, como é o caso do hidróxido de sódio (NaOH) [21].

A gelificação deste polímero natural é facilmente conseguida através da adição de

catiões bivalentes (como o cálcio – Ca2+

) [24]. Esta gelificação efetua-se pela interação

cooperativa dos blocos de monómeros L com o catião Ca2+

que forma pontes entre as cadeias

dos diferentes polímeros iónicos [25].

Figura 1 – (a) monómeros que constituem o alginato (b) alginato

em cadeia (c) sequência esquemática da conformação da cadeia de

alginato (Draget et al)

22

A solubilidade do alginato em água é regulada pelo pH do solvente, pela força iónica

do meio e pela presença de iões de gelificação. Assim, para que o alginato seja solúvel no

meio é fundamental que o pH se encontre acima do valor crítico e os grupos de ácido

carboxílico se encontrem desprotonados. Alternando a força iónica do meio, a conformação

do polímero, a extensão da cadeia e a viscosidade consegue-se alterar a solubilidade do

alginato. Outro fator importante para que o alginato se consiga dissolver é a ausência de

agentes reticulantes no meio em que se pretende solubilizar. Quanto à degradação enzimática

esta é realizada pelo mecanismo de β-eliminação e a sua taxa aumenta a pH acima de 10 e

abaixo de 5. Acima de pH 10 verifica-se a β-eliminação, no entanto, abaixo de pH 5 é

verificada uma hidrólise catalisada por ácido [26].

Na engenharia de tecidos, a função do alginato é, sobretudo, a de assegurar a

integridade mecânica e a transmissão inicial de sinais mecânicos para as células e para o

desenvolvimento dos tecidos [25], já na síntese de SLC este polímero é utilizado pela sua

biocompatibilidade, baixa toxicidade e boa capacidade de gelificação [24].

Tabela 5 – Propriedades do alginato que o tornam alvo de interesse na síntese de SLC (adaptado de Gombotz et. al [21])

Propriedades do alginato

Interior da matriz contém um meio aquoso relativamente inerte

Processo de encapsulamento a temperatura ambiente livre de solventes orgânicos

Gel com porosidade que permite elevadas taxas de difusão de macromoléculas

Capacidade de controlar porosidade por processos de revestimento simples

Dissolução e biodegradação do sistema sob condições fisiológicas normais

1.3.1.1.2. Quitosano

O quitosano (Figura 2) é sintetizado pela desacetilação da quitina (que está presente na

natureza nos exoesqueletos de artrópodes ou nas paredes celulares de fungos e leveduras[27])

em meio alcalino. O método da preparação do quitosano varia consoante a fonte e, por isso,

origina algumas diferenças na amostra obtida [28]. Habitualmente, todos os derivados da

quitina designam-se por quitosano quando esta apresenta um grau de acetilação inferior a 40%

[13].

23

No estado sólido, o quitosano é um polímero semi-cristalino e a sua solubilidade é

habitualmente testada em ácido acético, dissolvendo-o em ácido acético a 1% (a quantidade

de ácido acético necessária depende da quantidade de quitosano a ser dissolvido). Na

realidade a solubilidade é um parâmetro difícil de controlar, uma vez que se relaciona com a

concentração iónica, o pH, a natureza do ácido aquando da protonação e a distribuição dos

grupos acetil ao longo da cadeia [29].

O quitosano, devido à sua versatilidade tem inúmeras aplicações nas mais diversas áreas.

Na biomedicina é utilizado, por exemplo, nas membranas de hemodiálise, nas suturas

biodegradáveis, como substituinte artificial da pele, como agente cicatrizante em queimaduras

e em SLC de fármacos. Na química analítica, por sua vez, é utilizado no fabrico de eletrodos

específicos para metais, na absorção de iões de metais pesados e em cromatografia. É também

utilizado em cosméticos, em cremes para a pele e para o corpo assim como na dietética (em

adelgaçantes). Na agricultura é utilizado como aditivo para alimento dos animais e na

formulação de pesticidas. É, de igual forma, aplicado na indústria têxtil, do papel e alimentar

bem como, no tratamento de água (na remoção de metais e surfatantes) [30].

Ao longo dos últimos anos, o quitosano tem sido alvo de diversas investigações pelos

seus potenciais e propriedades (Tabela 6) que apresenta na utilização enquanto

biomaterial[13].

Figura 2 – Estrutura do quitosano (Santos, 2006)

24

Tabela 6 – Propriedades do quitosano (Adaptado de Coimbra, 2010)

1.4.MICROPARTÍCULAS POLIMÉRICAS

As micropartículas são partículas em que as suas dimensões se situam entre 1 e

1000µm[31]. O termo micropartícula é usado para descrever microcápsulas e microesferas e

são vários os motivos pelos quais lhes são incorporados fármacos. Nas microcápsulas o

fármaco (no estado sólido ou líquido) encontra-se envolvido numa membrana polimérica num

sistema vesicular, enquanto que nas microesferas o fármaco encontra-se disperso ou

solubilizado numa matriz polimérica maciça [13].

Estes veículos podem ser utilizados para controlar a libertação de fármaco, disfarçar

características organoléticas (sabor e odor), proteger os fármacos da degradação e proteger o

organismo de efeitos nocivos [32]. Assim, o SLC de fármacos através de micropartículas

poliméricas beneficia a proteção do fármaco encapsulado e também o controlo da libertação

da substância ativa, melhorando a adesão do paciente à terapêutica [33].

A utilização de micropartículas deve ter em atenção a via de administração escolhida

[33]. Por exemplo, por via oral, o fármaco encontra várias barreiras que alteram a sua

biodisponibilidade final como a permeabilidade gástrica, intestinal, os metabolismos intestinal

e hepático, a solubilidade e o tamanho, a finalidade do uso de micropartículas seria superar

estas limitações direcionando o fármaco para o local alvo [34]. Para além deste facto, a

Propriedades do quitosano

Biodegradibilidade

Biocompatibilidade

Bioadesividade/mucoadesividade

Promotor de absorção

Atividade antiflamatória, antifúngica e antibacteriana

Promotor da regeneração de vários tecidos

Hemoestático

Antitrombogénico

Processabilidade

25

administração de fármacos por este sistema apresenta inúmeras vantagens, uma vez que as

micropartículas podem ser administradas via oral ou intravenosa e adaptam-se ao perfil de

libertação desejado.

As micropartículas devem cumprir alguns critérios[33]:

Apresentarem elevada eficiência de encapsulação;

Preservarem a atividade do fármaco durante o encapsulamento e o

armazenamento;

Facilitarem a administração para o local alvo;

Controlarem a taxa de libertação de forma a alcançarem um efeito terapêutico

minimizando os efeitos secundário.

Diversos métodos têm sido utilizados para a preparação de micropartículas poliméricas

na área da microencapsulação. O método escolhido para a preparação determina o tamanho e

tipo de micropartícula sintetizada [32].

Ao longo do período de estágio foram desenvolvidas micropartículas de alginato

precipitadas em cloreto de cálcio e micropartículas de alginato precipitadas em cloreto de

cálcio, revestidas com quitosano e precipitadas em tripolifosfato. Nestas micropartículas

poliméricas foi incorporada uma proteína modelo – a BSA.

A BSA é a proteína mais abundante no sangue bovino. Apresenta-se sob a forma de

cadeia polipeptídica simples e pode formar dímeros, especialmente em altas concentrações ou

na sua forma cristalizada. Na sua estrutura primária, a BSA não é carregada uniformemente.

Esta proteína, a pH 7, apresenta uma carga negativa e altera a sua conformação entre pH 4 e 8.

A BSA carateriza-se pelo elevado número de cisteína, ácido aspártico, ácido glutâmico, lisina,

arginina e aminoácidos carregados e baixo número de triptofano e metionina [35].

Esta proteína é utilizada em diversas áreas. A nível bioquímico, por exemplo, a BSA é

utilizada na estabilização de algumas enzimas durante a digestão do ADN, para determinar a

quantidade de outras proteínas e como nutriente em cultura de células microbianas.

1.5.LIBERTAÇÃO IN VITRO DE FÁRMACOS E PROTEÍNAS MODELO

Para se proceder à síntese de um SLC de fármacos, é necessário conhecer os diferentes

mecanismos de libertação dos mesmos, para isso, é essencial avaliar a libertação in vitro de

fármacos, ou como é o caso, da proteína modelo. Esta avaliação in vitro pode ser avaliada

26

submetendo o sistema sintetizado a uma solução de suco gástrico artificial e suco entérico

artificial e a sua quantificação efetuada pelo método de Bradford e espectrofotometria.

1.5.1. Suco Gástrico Artificial

O suco gástrico artificial, como o próprio nome indica, é uma solução que mimetiza o

meio gástrico, tendo características idênticas ao mesmo. O suco gástrico possui, na sua

constituição, água, enzimas, sais inorgânicos, uma pequena quantidade de ácido lático e ácido

clorídrico e que é o principal responsável pelo pH ácido do meio. No estomago, as enzimas

digestivas começam a degradar o fármaco e, se este não possuir um invólucro que o proteja do

meio, parte da substância ativa será, já no estomago, absorvida e passa para a corrente

sanguínea [36].

1.5.2. Suco Entérico Artificial

Assim como o suco gástrico artificial, o suco entérico artificial mimetiza, in vitro, o

suco entérico produzido no intestino delgado. O suco entérico é uma solução rica em enzimas

e com pH alcalino. É no intestino que ocorre a maior absorção de substância ativa, uma vez

que este órgão é rodeado por inúmeros vasos sanguíneos. Os fármacos sendo,

maioritariamente, facilmente solúveis atravessam as membranas permeáveis do intestino e

penetram nos vasos que farão o transporte dos mesmos ao local alvo [36].

1.5.3. Métodos de quantificação de fármacos e proteínas

Métodos rápidos e precisos para quantificar proteínas e fármacos são essenciais nas

áreas de bioquímica e biologia [37].

Existem diversos métodos de quantificação de fármacos e proteínas. Os métodos mais

utilizados são:

Método do biureto;

Método de Lowry;

27

Método de Bradford;

Método de Smith ou BCA;

Método de absorção ultra-violeta.

Para quantificar a proteína modelo no trabalho laboratorial, utilizou-se o método de

Bradford e espectrofotometria, descritos de seguida.

1.5.3.1. Método de Bradford

O método de Bradford é baseado na ligação do corante de azul de Coomassie G-250 à

proteína [38] formada por aminoácidos com cadeias laterais aromáticas ou básicas [39].

A interação entre a proteína e o corante provoca a alteração do corante para a sua

forma aniónica que absorve e é detetável a um comprimento de onda de 595nm [39].

Este método é muito utilizado por utilizar apenas um reagente corante para

quantificação da amostra de proteína, por ser rápido, por se poder realizar à temperatura

ambiente sem sofrer interferência [40] e por manterem estabilidade de cor durante, pelo

menos, uma hora ao abrigo da luz [41].

Catiões como o sódio, o potássio ou hidratos de carbono não mostram interferir neste

método. A solução de Bradford apresenta modificação de cor aquando a presença de proteína,

de um azul acastanhado para um azul mais forte [41].

O método de Bradford tem a sua aplicação de proteínas totais em meios como o

plasma, a saliva humana, o leite humano, em tecidos de plantas, em produtos alimentares e em

detergentes [39].

1.5.3.2.Espectrofotometria

A espectrofotometria é um procedimento analítico pelo qual se determina a

concentração de espécies químicas aquando a absorção de luz. Este método é utilizado em

estudos químicos e biológicos.

O espectrofotómetro é o aparelho que permite comparar a radiação absorvida ou

transmitida por uma solução com uma concentração desconhecida de determinada substância,

determinada por este método[42].

28

1.6.OBJETIVOS

Este estudo teve como objetivo principal a síntese de um SLC para incorporação de um

fármaco utilizado no tratamento do LES, alterando a via da administração do mesmo, de

forma a aumentar a adesão à terapêutica por parte do paciente. No entanto, para testar o SLC

foi necessária a incorporação de uma proteína modelo – a BSA. Assim, o estudo teve como

objetivos secundários a incorporação da BSA no SLC, a determinação da concentração da

proteína quando sujeita a diferentes pH (pH gástrico e entérico), otimização das

micropartículas para promover a libertação da proteína apenas em pH entérico para que,

quando se incorporasse o fármaco, este ser resistente a pH gástrico e assim minimizar efeitos

secundários indesejados.

29

CAPÍTULO II: MATERIAL E MÉTODOS

30

2.1. MATERIAIS

Para o desenvolvimento de micropartículas utilizou-se alginato de sódio da Applichem

Panreac®

, cloreto de cálcio dihidratado da Scharlau®, quitosano da Acros Organics

®, vinagre

de vinho branco (Ácido Acético) da Cigalou®, tripolifosfato da Acros Organics

® e BSA da

Sigma®.

Para testar in vitro a solubilidade da proteína nos diferentes sucos orgânicos,

procedeu-se ao desenvolvimento da solução de suco gástrico artificial e da solução de suco

entérico artificial segundo a Farmacopeia Portuguesa.

Na solução do suco gástrico artificial utilizou-se como reagentes cloreto de sódio do

laboratório Panreac® e ácido clorídrico a 33% do laboratório José M. Vaz Pereira, S.A.

®.

Na solução do suco entérico artificial utilizou-se como reagentes fosfato

monopotássico e hidróxido de sódio da Merck®.

Para se poder efectuar a quantificação da proteína na encapsulação do BSA nas

micropartículas de alginato e quitosano procedeu-se ao desenvolvimento de uma solução. A

solução do Método de Bradford foi constituída por azul de coomassie (G-250) do laboratório

Fisher Scientific®, metanol do laboratório Scharlau

® e ácido fosfórico a 85% do laboratório

José M.Vaz Pereira, S.A®.

2.2.MÉTODOS

2.2.1. Síntese de micropartículas de alginato com BSA

Inicialmente, para efetuar a síntese de micropartículas de alginato com BSA são efetuados

os cálculos de forma a determinar o peso de BSA, de alginato e de cloreto de cálcio

necessários para, posteriormente, executar as soluções precisas para a síntese.

De seguida, são pesadas as substâncias em causa e é realizada a dissolução da BSA no

alginato sob agitação. A solução final, de 2 mL, tem uma concentração de BSA de 20mg/mL.

A solução obtida é colocada numa seringa, 1 mL e posteriormente, gotejado para um gobelé

onde se encontra uma solução de cloreto de cálcio a 4%. Desta forma, o alginato com BSA

precipita no cloreto de cálcio e dá-se a formação de micropartículas.

As partículas que se obtêm são filtradas e de seguida pesadas.

31

2.2.2. Síntese de micropartículas de alginato revestidas com quitosano

A primeira parte do processo de síntese de micropartículas de alginato revestidas com

quitosano é igual ao processo descrito anteriormente em 2.2.1..

Após a divisão e pesagem dos quatro grupos, as micropartículas são inseridas numa

solução de quitosano a 1% na qual são revestidas, após são adicionadas a uma solução de

tripolifosfato a 4 % cada um, onde são precipitadas.

As partículas obtidas são filtradas e pesadas.

A solução de quitosano a 1% é obtida pela dissolução de quitosano em ácido acético a

1%.

2.2.3. Reta de calibração

Para traçar a reta de calibração faz-se 6 diluições (0,125mg/mL, 0,25mg/mL,

0,5mg/mL, 1mg/mL, 1,5mg/mL e 2mg/mL) da solução-mãe de BSA que se encontra a

20mg/mL. De cada solução-filha obtida retira-se uma alíquota de 20µL e adiciona-se 1000µL

de solução de Bradford. É medida a absorvância pelo espectrofotómetro e traçada a reta de

calibração.

2.2.4. Determinação da eficiência de encapsulação de BSA em Alginato e

alginato/quitosano

De cada solução filtrada, são retiradas 5 alíquotas de 40µL e a cada uma destas

adicionados 1000µL de solução de Bradford. É medida a absorvância pelo espectrofotómetro

(Figura 3) e calculada, através dos resultados obtidos e a equação da reta de calibração

previamente traçada, a percentagem de encapsulamento de BSA nas micropartículas.

32

2.2.5. Determinação da libertação in vitro de BSA em diferentes pH

Para proceder à avaliação do perfil de libertação in vitro de BSA foram sintetizadas

duas soluções, uma a simular o suco gástrico e outro a simular o suco entérico, as duas

consoante as indicações da Farmacopeia Portuguesa.

2.2.5.1.Simulação do suco gástrico: pH 1,2

A solução de suco gástrico artificial é constituída por cloreto de sódio, água e ácido

clorídrico a 1M com o intuito de obter uma solução com pH de 1,2. Este pH é acertado com o

auxílio do medidor de pH.

As partículas são subtidas a este suco durante um período de duas horas, a uma

temperatura constante de 37oC em banho-maria (Figura 4). De meia em meia hora as

partículas são filtradas e subtidas a nova solução. Da solução filtrada são retiradas 5 alíquotas

de 40µL e a cada uma destas adicionados 1000µL de solução de Bradford. É medida a

absorvância e assim calculada a massa libertada.

Figura 3 – Espectrofotómetro

33

2.2.5.2.Simulação do suco entérico: pH 6,8

A solução de suco gástrico entérico é constituída por fosfato monopotássico, água e

hidróxido de sódio a 0,2M com o intuito de obter uma solução com pH de 6,8. Este pH é

acertado com o auxílio do medidor de pH.

As partículas são subtidas a este suco durante um período de duas horas, a uma

temperatura constante de 37oC. De meia em meia hora as partículas são filtradas e subtidas a

nova solução. Da solução filtrada são retiradas 5 alíquotas de 40µL e a cada uma destas

adicionados 1000µL de solução de Bradford. É medida a absorvância e assim calculada a

massa libertada.

Figura 4 – Amostras em banho maria a uma temperatura constante de 37ºC

34

CAPÍTULO III: RESULTADOS E DISCUSSÃO

35

3.1. CARACTERIZAÇÃO DAS MICROPARTÍCULAS

Após a formação das partículas estas são observadas e pesadas.

Verificou-se, depois da pesagem, que as partículas de alginato sintetizadas pesavam cerca

de 0,600g e as de alginato/quitosano cerca de 0,900g.

Em relação ao aspeto de cada um dos tipos de micropartículas formadas, as

micropartículas de alginato (Figura 5) apresentavam um aspeto aproximadamente esférico e

esbranquiçado e as micropartículas de alginato/quitosano (Figura 6) um aspeto idêntico

acrescentando o revestimento transparente e gelificado observável a olho nu.

3.2EFICIÊNCIA DE ENCAPSULAÇÃO DE BSA EM ALGINATO

Para se quantificar a concentração de BSA nas amostras, estas são analisadas no

espectrofotómetro a um comprimento de onda de 595nm. A conversão do valor de

absorvância em quantidade de BSA é determinada através da reta de regressão linear obtida

na curva de calibração.

Assim, para se conseguir determinar a eficiência da encapsulação da BSA em alginato é,

inicialmente, necessário traçar a reta de calibração com diferentes concentrações de BSA

(Gráfico 1). A reta de calibração é representada pela equação geral:

em que representa a absorvância e a concentração, desta forma após a obtenção da

equação específica para este caso e da medição das absorvâncias obtidas depois da filtração

das partículas de alginato a 1% com BSA precipitado em cloreto de cálcio a 4%, seria apenas

Figura 5 – Micropartículas de alginato

Figura 6 – Micropartículas de

alginato/quitosano

36

y = 0,7206x + 0,0275

R² = 0,9971

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6

Ab

sorv

ânci

a

Concentração de BSA

necessário substituir o pelos valores de absorvância e obter-se assim a concentração de BSA

libertado.

Para se traçar a reta de calibração diluiu-se o BSA de forma a que se obtivesse as

concentrações de 0,125 mg/mL, 0,25 mg/mL, 0,5 mg/mL, 1mg/mL, 1,5 mg/mL e a 2mg/mL,

A absorvância foi, para todas as amostras, medida a um comprimento de onda de 595 nm e o

valor obtido a 2mg/mL foi rejeitado.

Depois de se gotejar o alginato a 1% com a BSA para o cloreto de cálcio a 4% (Figura

7 e 8) e de filtrar as partículas obtidas, pesou-se as mesmas determinou-se a percentagem de

encapsulação da BSA pela medição da absorvância de cada amostra (Tabela 7).

A concentração de BSA é calculada como já foi referido anteriormente pela equação

da reta de calibração. A massa, por sua vez é calculada pela equação

em que representa a concentração, a massa em mg e o volume em mL.

A percentagem de encapsulação é calculada recorrendo à fórmula:

Após os cálculos efetuados, verificou-se uma percentagem de encapsulação

relativamente baixa ( 55,4%), o que pode ser devido à falta de destreza na realização do

processo.

Gráfico 1 – Reta de calibração

37

Tabela 7 – Determinação da percentagem de encapsulação de BSA

A percentagem de encapsulação permite saber a massa de BSA que ainda se encontra

encapsulada no alginato. Assim, neste caso concreto, resta libertar aproximadamente 11,1mg.

Ou seja, aproximadamente 2,77 mg para cada grupo de partículas uma vez que foram

equitativamente dividas em quatro. De seguida as partículas foram submetidas a diferentes

pH, dados apresentados na secção 3.3..

Determinação da percentagem de encapsulação de BSA

Absorvância Concentração de BSA Massa %Encapsulação

0,632 0,419442

8,91063 55,44685

0,646 0,429156

0,638 0,423605

0,704 0,4694

0,728 0,486053

Figura 8 – Micropartículas de alginato

Figura 7 – Gotejamento de alginato com BSA em

cloreto de cálcio

38

3.2. EFICIÊNCIA DE ENCAPSULAÇÃO DE BSA NAS MICROPARTÍCULAS DE

ALGINATO/QUITOSANO

Assim como descrito na secção anterior, após o gotejamento de alginato a 1% com BSA

no cloreto de cálcio a 4% foi determinada a percentagem de encapsulação da BSA (Tabela 8).

Tabela 8 – Determinação da percentagem de encapsulação de BSA nas micropartículas de alginato

Determinação da percentagem de encapsulação de BSA

Absorvância Concentração de BSA Massa %Encapsulação

0,953 0,642173

13,54011 54,86632

1,035 0,69907

1,063 0,718498

1,018 0,687274

0,947 0,63801

A percentagem de encapsulação obtida neste ensaio é, de igual forma, baixa

( 54,87%), o que mostra um erro persistente ou mostra que a concentração de alginato ou de

cloreto de cálcio era insuficiente para manter a BSA encapsulada no seu interior ou para

precipitar o alginato, respetivamente.

Assim, e como se mediu 1,5 mL (ou seja, existia 30 mg de BSA aquando da

precipitação) restavam libertar aproximadamente 16,46 mg (aproximadamente 4,11 mg por

grupo).

Após se pesar as partículas obtidas e as dividir em quatro grupos, procedeu-se ao

revestimento das mesmas por quitosano a 1%. De seguida, reticularam-se as partículas já

revestidas em tripolifosfato e, após, se filtrar as partículas procedeu-se à pesagem das mesmas

à medição das absorvâncias do filtrado (Tabela 9).

Devido aos valores negativos de massa libertada obtidos na amostra 3 e na amostra 4

os mesmos são rejeitados. Assim, a massa total média libertada é de aproximadamente

0,11mg, ou seja, aproximadamente 99,6% de BSA encapsulada. Este valor elevado deve-se à

afinidade existente entre o quitosano e o tripolifosfato que confere estabilidade às

micropartículas.

Relativamente às pesagens, verificou-se um aumento de peso da primeira pesagem

(quando a BSA estava encapsulada em alginato a 1% e reticulada por cloreto de cálcio a 4%)

39

para a segunda (em que as micropartículas já estavam revestidas com quitosano a 1% e

precipitadas em tripolifosfato a 4%), em média de 0,200 mg em cada amostra.

Tabela 9 – Determinação da massa de BSA libertada e da eficiência de encapsulação

Determinação da massa de BSA libertada

Amostra 1 Amostra 2

Absorvância Concentração Massa Absorvância Concentração Massa

0,044 0,011449

0,158895

0,047 0,01353

0,060366

0,054 0,018387 0,027 -0,00035

0,053 0,017694 0,042 0,010061

0,052 0,017 0,035 0,005204

0,049 0,014918 0,03 0,001735

Amostra 3 Amostra 4


0,007 -0,01422

-0,14641

0,01 -0,01214

-0,08673

0,002 -0,01769 0,015 -0,00867

0,008 -0,01353 0,022 -0,00382

0,007 -0,01422 0,018 -0,00659

0,008 -0,01353 0,01 -0,01214

Massa média libertada %Encapsulação

0,109631 99,33395

3.3. DETERMINAÇÃO DA LIBERTAÇÃO IN VITRO DE BSA EM DIFERENTES pH

Após a síntese das micropartículas, estas foram submetidas a diferentes pH.

Os dois tipos de micropartículas sintetizadas apresentaram perfis de libertação diferentes,

entre elas, em pH gástrico e entérico.

Nas micropartículas em que a BSA está encapsulada no alginato, verifica-se uma

libertação considerável na primeira hora e meia em que são submetidas ao suco gástrico e

também na primeira hora em que estão sujeitas ao suco entérico (Gráfico 2). No Gráfico 2

estão representados graficamente os dados obtidos e existentes no ANEXO I. Ao final da

40

primeira hora e meia em meio gástrico já se tinha libertado aproximadamente 1,1 mg de

2,77mg a libertar, aliás, foi ao final da primeira meia hora que se verificou o pico de

libertação ( 0,88mg). Assim, pode-se assumir que o alginato não é resistente a pH gástrico e

liberta grande parte da substância que transporta no estômago não sendo, desta forma, uma

opção viável para o pretendido. Se se procede-se à incorporação de um fármaco em alginato,

este seria libertado no estômago e, assim, não iria minimizar os efeitos secundários do mesmo

(que seria o objetivo da utilização de um veículo diferente para a libertação controlada do

fármaco). O facto de na primeira hora em que as micropartículas são sujeitas ao suco entérico

libertarem uma quantidade significativa de BSA ( 0,54mg) pode prender-se à mudança de

meio e à quebra da restante interação alginato-BSA. Dezassete horas depois voltou-se a medir

a absorvância e verificou-se a libertação de aproximadamente 0,27mg. Assim, no total

verificou-se a libertação de aproximadamente 1,88mg o que significa que ainda faltariam

libertar cerca de 0,89mg. A taxa de eficácia verificada é de sensivelmente 67,88%.

Nas micropartículas de alginato com BSA revestidas com quitosano verifica-se uma

libertação ínfima de BSA no suco gástrico, o que é extremamente relevante neste estudo

(Gráfico 2 e 3). Os dados para obter os gráficos encontram-se no ANEXO II. Quando

submetidas a pH entérico estas micropartículas mostram uma libertação gradual ao longo do

tempo o que as tornam bons exemplos de SLC. No total verificou-se a libertação de

sensivelmente 3,08mg, ou seja, ficou por libertar cerca de 1mg. A taxa de eficácia verificada é

de cerca de 74,93%.

Comparando as taxas de eficácia, pode-se comprovar que as micropartículas

alginato/quitosano apresentam uma maior viabilidade e, portanto, são as mais apropriadas

para as necessidades exigidas. Estas micropartículas, otimizadas, poderiam ser potenciais SLC

de fármacos.

41

Gráfico 2 – Perfil de libertação de BSA no suco gástrico nas micropartículas de alginato e nas de alginato/quitosano

Gráfico 3 – Perfil de libertação de BSA em suco entérico nas micropartículas de alginato/quitosano. O perfil de libertação de

BSA no mesmo suco em micropartículas de alginato não está representado pelos valores díspares obtidos.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 20 40 60 80 100 120 140

% l

iber

taçã

o d

e B

SA

Tempo (min)

Alginato

Alginato/quitosano

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 50 100 150 200

% l

iber

taçã

o d

e B

SA

Tempo (min)

Alginato/quitosano

42

CAPÍTULO IV: CONCLUSÃO E PRESPETIVAS FUTURAS

43

4. CONCLUSÃO E PRESPETIVAS FUTURAS

O LES é uma doença autoimune crónica que envolve complicações em vários órgãos e

tecidos do organismo, o que faz com que não exista uma terapêutica base para o tratamento do

LES, ou seja, a terapêutica tem de ser adaptada a cada paciente.

Os fármacos utilizados no tratamento do LES, sobretudo os glucocorticoides, têm

inúmeros efeitos secundários adjacentes e, foi por este aspeto que me propôs a desenvolver

este trabalho. Um trabalho com o intuito de desenvolver um SLC de fármacos que minimiza-

se este impacto e que aumenta-se a adesão à terapêutica por parte dos pacientes.

Os polímeros naturais têm sido dos excipientes mais utilizados em tecnologia

farmacêutica e que proporcionam a sua evolução através das diversas aplicações e

funcionalidades que possuem. A escolha do polímero para um SLC de fármacos depende de

diversos fatores, como por exemplo, as propriedades da substância ativa e o mecanismo de

libertação pretendido.

A concentração de polímero utilizada pode ter sido uma das lacunas neste trabalho, uma

vez que se sabe que o aumento da concentração de polímero reduz a quantidade de fármacos

libertada por unidade de tempo.

O objetivo primordial deste trabalho não foi alcançado, não foi possível, devido ao tempo

de otimização dos processos, encapsular fármaco e verificar o seu perfil de libertação a nível

gástrico e intestinal. No entanto, para testar as micropartículas desenvolvidas encapsulou-se a

BSA (proteína modelo) e verificou uma eficácia superior nas micropartículas

alginato/quitosano relativamente às de alginato.

Futuramente, se conseguir prosseguir o projeto, gostaria de otimizar as micropartículas de

alginato/quitosano e encapsular fármaco de forma a definir os perfis de libertação de forma

fidedigna e conclusiva e poder testar com recurso a outros métodos.

44

CAPÍTULO V: REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

45

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Systemic Lupus Erythematosus (Lupus) American College of Rheumatology, 2013. 2. Systemic lupus erythematosus. University of Maryland Medical Center, 2013. 3. Dohme, M.S., Lúpus Eritematoso Sistémico. Manual Merck, 2009. 4. Germano de Sousa, C.d.M.L. Núcleo de Excelência - Lúpus. [cited 2014 08/05/2014];

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33. Tran, V.-T., J.-P. Benoît, and M.-C. Venier-Julienne, Why and how to prepare biodegradable, monodispersed, polymeric microparticles in the field of pharmacy? International journal of pharmaceutics, 2011. 407(1): p. 1-11.

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38. Whiffen, L.K., D.J. Midgley, and P.A. McGee, Polyphenolic compounds interfere with quantification of protein in soil extracts using the Bradford method. Soil Biology and Biochemistry, 2007. 39(2): p. 691-694.

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47

ANEXOS

48

ANEXO I – MICROPARTÍCULAS DE ALGINATO SUBMETIDAS A SUCO GÁSTRICO

E ENTÉRICO

Libertação de BSA em suco gástrico – 30 min

Amostra 1 Amostra 2


0,173 0,10096

1,19831

0,159 0,09124

0,83888

0,211 0,12732 0,123 0,06626

0,219 0,13288 0,144 0,08084

0,212 0,12802 0,154 0,08777

0,186 0,10998 0,162 0,09333

Amostra 3 Amostra 4


0,111 0,05794

0,7237

0,119 0,06349

0,75423

0,149 0,0843 0,136 0,07528

0,123 0,06626 0,158 0,09055

0,140 0,07806 0,150 0,085

0,136 0,07528 0,118 0,06279

49


Amostra 1 Amostra 2


0,064 0,02533

0,27685

0,061 0,02324

0,17555

0,061 0,02324 0,043 0,01075

0,061 0,02324 0,064 0,02533

0,089 0,04267 0,048 0,01422

0,062 0,02394 0,048 0,01422

Amostra 3 Amostra 4


0,018 -0,00659

-0,04788

0,032 0,00312

0,13808

0,019 -0,0059 0,031 0,00243

0,015 -0,00867 0,046 0,01284

0,028 0,00035 0,077 0,03435

0,023 -0,00312 0,051 0,01631


Amostra 1 Amostra 2


0,02 -0,0052

-0,05343

0,034 0,00451

0,02151

0,031 0,00243 0,032 0,00312

0,016 -0,00798 0,031 0,00243

0,014 -0,00937 0,026 -0,00104

0,018 -0,00659 0,030 0,00173

Amostra 3 Amostra 4


-0,018 -0,03157

-0,22273

0,008 -0,01353

-0,14502

-0,007 -0,02394 0,007 -0,01422

-0,013 -0,0281 0,007 -0,01422

0,006 -0,01492 0,005 -0,01561

0,009 -0,01284 0,006 -0,01492

50


Amostra 1 Amostra 2


0,006 -0,01492

-0,14363

0,000 -0,01908

-0,16768

0,010 -0,01214 -0,003 -0,02116

0,004 -0,01631 0,015 -0,00867

0,006 -0,01492 -0,002 -0,02047

0,008 -0,01353 0,010 -0,01214

Amostra 3 Amostra 4


0,008 -0,01353

-0,08211

0,009 -0,01284

-0,17

0,011 -0,01145 0,007 -0,01422

0,014 -0,00937 -0,002 -0,02047

0,022 -0,00382 0,004 -0,01631

0,029 0,00104 0,008 -0,01353

Libertação de BSA em suco entérico – 60 min

Amostra 1 Amostra 2


0,095 0,04684

0,4975

0,105 0,05377

0,59326

0,101 0,051 0,121 0,06488

0,088 0,04198 0,118 0,06279

0,108 0,05586 0,100 0,05031

0,104 0,05308 0,128 0,06973

Amostra 3 Amostra 4


0,123 0,06626

0,4938

0,134 0,0739

0,49611

0,120 0,06418 0,120 0,06418

0,100 0,05031 0,093 0,04545

0,076 0,03365 0,084 0,0392

0,088 0,04198 0,100 0,05031

51


Amostra 1 Amostra 2


0,006 -0,01492

-0,06869

0,010 -0,01214

-0,14224

0,026 -0,00104 0,002 -0,01769

0,038 0,00729 0,008 -0,01353

0,013 -0,01006 0,011 -0,01145

0,005 -0,01561 0,001 -0,01839

Amostra 3 Amostra 4


-0,038 -0,04545

-0,22551

0,039 0,00798

0,15381

-0,013 -0,0281 0,060 0,02255

-0,014 -0,0288 0,028 0,00035

0,012 -0,01075 0,061 0,02324

0,002 -0,01769 0,055 0,01908


Amostra 1 Amostra 2


0,051 0,01631

0,15612

0,025 -0,00173

-0,03122

0,047 0,01353 0,020 -0,0052

0,054 0,01839 0,029 0,00104

0,048 0,01422 0,020 -0,0052

0,054 0,01839 0,023 -0,00312

Amostra 3 Amostra 4


0,008 -0,01353

-0,23245

0,07 0,02949

0,42904

-0,005 -0,02255 0,08 0,03643

-0,007 -0,02394 0,109 0,05655

-0,006 -0,02324 0,079 0,03573

0,002 -0,01769 0,07 0,02949

52

ANEXO II – MICROPARTÍCULAS DE ALGINATO/QUITOSANO SUBMETIDAS A

SUCO GÁSTRICO E ENTÉRICO


Amostra 1 Amostra 2


-0,008 -0,02463

-0,20192

0,001 -0,01839

-0,238

0,000 -0,01908 -0,012 -0,02741

-0,003 -0,02116 -0,011 -0,02671

0,001 -0,01839 -0,010 -0,02602

0,002 -0,01769 -0,002 -0,02047

Amostra 3 Amostra 4


-0,063 -0,06279

-0,44754

-0,002 -0,02047

-0,25604

-0,020 -0,03296 -0,010 -0,02602

-0,018 -0,03157 -0,015 -0,02949

-0,028 -0,03851 -0,012 -0,02741

-0,056 -0,05794 -0,008 -0,02463

53


Amostra 1 Amostra 2


0,010 -0,01214

-0,09645

0,026 -0,00104

-0,04233

0,015 -0,00867 0,024 -0,00243

0,014 -0,00937 0,012 -0,01075

0,016 -0,00798 0,022 -0,00382

0,013 -0,01006 0,023 -0,00312

Amostra 3 Amostra 4


0,008 -0,01353

-0,12975

0,013 -0,01006

-0,04788

0,011 -0,01145 0,006 -0,01492

0,009 -0,01284 0,028 0,000347

0,009 -0,01284 0,034 0,00451

0,007 -0,01422 0,022 -0,00382


Amostra 1 Amostra 2


0,024 -0,00243

0,024285

0,03 0,001735

0,078407

0,034 0,00451 0,051 0,016306

0,036 0,005898 0,035 0,005204

0,027 -0,00035 0,048 0,014224

0,034 0,00451 0,030 0,001735

Amostra 3 Amostra 4


0,004 -0,01631

-0,08118

0,016 -0,00798

-0,11171

0,019 -0,0059 0,007 -0,01422

0,022 -0,00382 0,011 -0,01145

0,017 -0,00729 0,015 -0,00867

0,017 -0,00729 0,008 -0,01353

54


Amostra 1 Amostra 2


0,041 0,009367

0,147794

0,069 0,028795

0,294893

0,056 0,019775 0,067 0,027408

0,045 0,012143 0,076 0,033653

0,053 0,017694 0,070 0,029489

0,049 0,014918 0,068 0,028102

Amostra 3 Amostra 4


0,010 -0,01214

-0,11449

0,022 -0,00382

-0,0451

0,009 -0,01284 0,020 -0,0052

0,017 -0,00729 0,019 -0,0059

0,007 -0,01422 0,026 -0,00104

0,012 -0,01075 0,018 -0,00659


Amostra 1 Amostra 2


0,067 0,027408

0,289689

0,094 0,046142

0,475298

0,076 0,033653 0,092 0,044754

0,071 0,030183 0,102 0,051693

0,063 0,024632 0,090 0,043367

0,078 0,03504 0,102 0,051693

Amostra 3 Amostra 4


0,127 0,06904

0,698723

0,196 0,116916

1,009575

0,122 0,06557 0,194 0,115529

0,133 0,073203 0,147 0,082917

0,130 0,071121 0,158 0,09055

0,129 0,070427 0,170 0,098876

55


Amostra 1 Amostra 2


0,188 0,111366

1,256592

0,208 0,125243

1,327366

0,226 0,137732 0,219 0,132875

0,220 0,133569 0,255 0,157855

0,217 0,131488 0,208 0,125243

0,192 0,114141 0,204 0,122467

Amostra 3 Amostra 4


0,163 0,094019

0,980433

0,203 0,121774

1,152512

0,130 0,071121 0,185 0,109284

0,199 0,118998 0,202 0,12108

0,182 0,107202 0,186 0,109978

0,170 0,098876 0,192 0,114141


Amostra 1 Amostra 2


0,136 0,075284

0,722315

0,177 0,103733

1,044269

0,134 0,073897 0,165 0,095407

0,130 0,071121 0,163 0,094019

0,130 0,071121 0,196 0,116916

0,128 0,069734 0,189 0,112059

Amostra 3 Amostra 4


0,136 0,075284

0,825007

0,125 0,067652

0,701499

0,152 0,086386 0,126 0,068346

0,157 0,089856 0,131 0,071815

0,148 0,083611 0,132 0,072509

0,139 0,077366 0,129 0,070427

56


Amostra 1 Amostra 2


0,02 -0,0052

-0,0451

0,033 0,003816

0,017347

0,027 -0,00035 0,031 0,002429

0,016 -0,00798 0,028 0,000347

0,022 -0,00382 0,031 0,002429

0,02 -0,0052 0,027 -0,00035

Amostra 3 Amostra 4


0,035 0,005204

0,02151

0,033 0,003816

0,003469

0,029 0,001041 0,023 -0,00312

0,030 0,001735 0,025 -0,00173

0,027 -0,00035 0,025 -0,00173

0,032 0,003122 0,034 0,00451


Amostra 1 Amostra 2


0,008 -0,01353

-0,10616

0,026 -0,00104

0,00902

0,010 -0,01214 0,028 0,000347

0,007 -0,01422 0,031 0,002429

0,019 -0,0059 0,029 0,001041

0,017 -0,00729 0,030 0,001735

Amostra 3 Amostra 4


0,015 -0,00867

-0,09922

0,036 0,005898

0,036775

0,013 -0,01006 0,030 0,001735

0,010 -0,01214 0,033 0,003816

0,008 -0,01353 0,035 0,005204

0,020 -0,0052 0,030 0,001735

57


Amostra 1 Amostra 2


0,028 0,000347

0,006245

0,037 0,006592

0,079795

0,022 -0,00382 0,033 0,003816

0,033 0,003816 0,045 0,012143

0,030 0,001735 0,038 0,007286

0,029 0,001041 0,042 0,010061

Amostra 3 Amostra 4


0,020 -0,0052

-0,02845

0,032 0,003122

0,033999

0,029 0,001041 0,026 -0,00104

0,023 -0,00312 0,038 0,007286

0,022 -0,00382 0,040 0,008673

0,023 -0,00312 0,026 -0,00104


Amostra 1 Amostra 2


0,014 -0,00937

-0,10061

0,001 -0,01839

-0,12605 0,012 -0,01075 0,012 -0,01075

0,013 -0,01006 0,015 -0,00867

Amostra 3 Amostra 4


0,010 -0,01214

-0,15381

0,000 -0,01908

-0,16768 0,004 -0,01631 0,002 -0,01769

0,002 --0,01769 0,008 -0,01353

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