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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁCENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICASPROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA DA DISCIPLINA DE MÉTODOS DE PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS
Ana Paula Ferro Bruna Polacchine da Silva
Cidnei MarschalkFabiane Cristina dos Santos
Thatiane Rodrigues MotaVerônica Sayuri Nishida
Profª Dra. Rosane Marina Peralta
MARINGÁ,SETEMBRO DE 2012.
1 Introdução
1.1α-Amilase
A α-amilase (1,4-α-D-glicano glicanoidrolase) possui atividade endohidrolítica e atua aleatoriamente sobre ligações glicosídicas α-1,4, produzindo uma mistura de glicose, maltose, maltotriose e dextrinas, podendo ser encontrada em animais, plantas, fungos e bactérias. α-Amilases são membros da família das amilases ou família 13 das glicosídeo hidrolases (GH-13), classificação esta, baseada na similaridade das sequências de aminoácidos (HENRISSAT e BAIROCH, 1996) e cuja relação estrutural e evolucionária com outros membros da família das glicosídeo hidrolases vem sendo amplamente investigada (JANEČEK, 1997; PUJADAS e PALAU, 2001).
As α-amilases compartilham a estrutura barril (β/α)8, similar a encontrada para a triose fosfato isomerase (TIM) e ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase), apresentando no entanto, características distintas em sua estrutura primária que as diferem da TIM e CGTase. O tipo de arranjo estrutural encontrado nas α-amilases pode ser evidenciado também nas famílias GH-70 e GH-77 das glicosídeo hidrolases, desta forma, as famílias GH-13, GH-70 e GH-77 foram organizadas em um novo grupo, GH-H, que reflete aspectos evolutivos mais próximos entre seus membros, como por exemplo, os resíduos catalíticos e a disposição espacial dos mesmos (VIEIRA-JUNIOR, 2001).
1.2Método de Bradford
O método de Bradford é uma técnica para a determinação de proteínas totais que utiliza o corante de “Coomassie brilliant blue” BG-250. Este método é baseado na interação entre o corante BG-250 e macromoléculas de proteínas que contém aminoácidos de cadeias laterais básicas ou aromáticas.
No pH de reação, a interação entre a proteína de alto peso molecular e o corante BG-250 provoca o deslocamento do equilíbrio do corante para a forma aniônica, que absorve fortemente em 595nm, tem sido utilizado para a determinação de proteínas totais em diversos meios: plasma ou soro sanguíneo, líquor, saliva humana, produtos alimentícios, leite humano, tecidos de plantas, suspensões de células, avidina e estreptoavidina, urina e detergentes.
As metodologias utilizando equipamentos automatizados estão tornando este método mais rápido. Apesar do método de Bradford ser mais rápido, sensível e estar sujeito a um número bem menor de interferentes que o método de Lowry, o mesmo apresenta algumas desvantagens, tais como a variação da absortividade específica para diferentes proteínas, devido à baixa solubilidade ou baixo peso molecular das mesmas e fornecimento de resultados nem sempre reprodutíveis devido ao grau de pureza do corante BG-250 que varia conforme a procedência, sendo recomendável a padronização das condições de reação para cada lote de corante adquirido. No caso de amostras com proteínas de baixo peso molecular, não é recomendado a utilização deste método.
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Existem substâncias que são interferentes no método de Bradford, e estes interferentes normalmente reagem com as proteínas impedindo a reação com o corante BG-250 ou reagem com o corante causando aumento na absorbância (Tabela 1).
Tabela1: Algumas substâncias que interferem na determinação de proteínas totais.
Fonte: ZAIA et. al., 1998.
1.3Método do DNS (ácido 3,5-dinitrosalicílico)
Um dos métodos empregados na quantificação de açúcares redutores é o método do DNS. É um método rápido e prático na determinação de açúcares redutores, e tem grande aplicabilidade industrial. Como exemplo de aplicação tem: controle de qualidade na caracterização das matérias primas para fins de processamento, verificação se determinado produto está dentro dos parâmetros e padrões exigidos pela legislação, indústria açucareira, no acompanhamento do processo de fermentação, que permite verificar as taxas de consumo de açúcar pelo microrganismo. A determinação de açúcares redutores pelo método do DNS baseia-se na redução, em meio alcalino, do ácido 3,5-dinitrosalicílico (coloração amarela). O produto formado é estável, com coloração laranja-avermelhado (ácido 3-amino-5-nitro-salicílico) na proporção estequiométrica e máxima absorção da luz visível no comprimento de onda de 540nm. Neste método ocorre a seguinte reação de oxidação (Figura 1):
Figura 1: Reação de oxidação da carbonila pelo reagente DNS. Fonte: MILLER, 1959.
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1.4 Métodos de separação de proteínas
As técnicas de separação de proteínas podem ser classificadas em três categorias: alta produtividade e baixa resolução; alta resolução e baixa produtividade; alta resolução e alta produtividade. As técnicas de baixa resolução e alta produtividade são usadas na concentração das proteínas. Em seguida, para o fracionamento das proteínas são utilizadas as técnicas de alta resolução e baixa produtividade ou alta resolução e alta produtividade (GHOSH, 2003). Os processos de bioseparação comumente usados na concentração, purificação e fracionamento de proteínas estão apresentados na Tabela 2. A ultrafiltração é listada em duas categorias, sendo que a resolução do processo depende do produto que será obtido e da forma que o processo será operado.
Tabela 2. Técnicas de bioseparação de proteínas. Categorias Processos
Alta produtividade e baixa resolução
Precipitação
Centrifugação
Extração líquido-líquido
Microfiltração
Ultrafiltração
Extração supercrítica
Alta resolução e baixa produtividade
Cromatografia em leito empacotado
Ultracentrifugação
Separação por afinidade
Eletroforese
Cromatografia com fluido supercrítico
Alta resolução e alta produtividade
Cromatografia em leito fluidizado
Cromatografia em membrana
Ultrafiltração
Cromatografia de coluna com monólitos
Adaptada de GHOSH (2003).
1.5 Cromatografia de exclusão molecular
Mais recentemente, a cromatografia de exclusão molecular (CEM) tem sido empregada, com sucesso no fracionamento de substâncias em diferentes sistemas e em diferentes matrizes (CHIN & GSCHWEND, 1991; SHAW et al., 1994; NOVOTNY et al., 1999). A CEM tem-se caracterizado pela rapidez e confiabilidade na aferição do peso molecular. O uso dessa técnica
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baseia-se no princípio de migração diferenciada do material na coluna cromatográfica. Moléculas de maior peso molecular exibem menor interação com a matriz silicosa que empacota a coluna cromatográfica, sendo excluídas no menor tempo possível. Moléculas de menor peso molecular têm maior tempo de retenção por exibir caminho mais sinuoso, em virtude do maior aprofundamento na estrutura do material que empacota a coluna. Compostos de tamanho molecular intermediário exibem velocidades de migração médias àquelas das classes de compostos anteriormente citadas (MEYER, 1993).
A cromatografia de exclusão molecular é um dos métodos com mais vasta aplicação. É frequentemente usada, como o primeiro passo de uma purificação para separar moléculas de interesse das que têm características (de tamanho) radicalmente diferentes. Também pode ser empregada para mudar o ambiente do tampão ou para retirar o sal de uma amostra de biopolímeros, como por exemplo, a remoção de sal em amostras contendo proteínas precipitadas por salting – out, sendo um processo menos moroso do que a diálise.
Finalmente, a cromatografia pode ser implementada como um meio para determinar parâmetros moleculares como o raio hidrodinâmico e a comum massa molecular, o que é conseguido usando, por exemplo, proteínas de peso molecular bem conhecido e traçando uma reta de calibração, como será descrito a seguir (HUBER, 2000).
De acordo com DEUTSCHER et al. (1990) na cromatografia de exclusão molecular, um volume de eluição do pico do soluto (Vr) de substâncias de peso molecular elevado (MW), tendo um coeficiente de distribuição, aproximadamente, de 1.0 coincide com o volume de espaços vazios, intra – partículas da coluna (Vm). Para moléculas com um coeficiente de distribuição menor que 1.0, existe uma relação linear entre o log (MW) e o volume ou tempo de eluição do soluto. Assim, em condições ideais, a ordem de eluição pode ser prevista, geralmente, pelo tamanho de moléculas uma vez que existe uma relação linear entre o seu volume de eluição e o valor logarítmico do seu peso molecular (MIKES, 1988). É exibido, esquematicamente, o gráfico de calibração na Figura 2.
Em determinadas gamas do peso molecular (MW) de um soluto ou nanopartículas existe uma dependência linear de log (MW) com o volume de eluição ou o tempo de retenção, intervalo 2. Moléculas maiores são excluídas e não separadas numa situação como a do intervalo 1. Moléculas menores penetram completamente na fase estacionária e não estão separadas na situação do intervalo 3.
Figura 2. Representação esquemática da dependência do peso molecular dos solutos (MW) com o tempo de retenção, onde V0 é o volume de espaços vazios e Vt é o volume total da coluna.
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A CEM apresenta a vantagem de requerer pequenas quantidades de material a ser analisado e propicia ainda medições diretas, as quais resultam em avaliações de propriedades das substâncias.
Para se conseguir uma boa resolução é fundamental a escolha do gel (matriz), o tamanho da amostra e a qualidade do enchimento da coluna. De um modo geral, deve-se escolher um gel em que as moléculas de maior dimensão saiam com o volume de espaços vazios.
Na cromatografia em coluna, o sólido utilizado na fase fixa deve ser um material insolúvel na fase móvel associada (eluente); sendo que os mais empregados são a sílica gel (SiO2) e alumina (Al2O3), geralmente na forma de pó finamente dividido. A mistura a ser separada é colocada na coluna com um eluente pouco polar, aumentando-se gradativamente a polaridade do eluente e, consequentemente, o seu poder de arraste de substâncias mais polares.
O fluxo de eluente deve ser contínuo para não haver o ressecamento do material que preenche a coluna (recheio). Os diferentes componentes da mistura movem-se com velocidades distintas dependendo de sua afinidade relativa pelo adsorvente (grupos polares interagem melhor com o adsorvente) e também pelo eluente. Assim, a capacidade de um determinado eluente em arrastar um composto adsorvido na coluna depende quase diretamente da polaridade do solvente em relação ao composto. À medida que os compostos da mistura são separados, bandas ou zonas móveis começam a ser formadas; cada banda contendo somente um composto. De um modo geral, os compostos apolares atravessam a coluna com uma velocidade maior do que os compostos polares, porque os primeiros têm menor afinidade com a fase estacionária. Se o adsorvente escolhido interagir fortemente com todos os compostos da mistura, ela não se moverá. Por outro lado, se for escolhido um solvente muito polar, todos os solutos podem ser eluídos sem serem separados. Com uma escolha cuidadosa das condições (adsorvente, eluente, tamanho da coluna, velocidade de eluição), praticamente qualquer mistura pode ser separada (Figura 3).
Figura 3. Ilustração de uma cromatografia de exclusão molecular, em que a amostra é passada através da coluna e separada conforme seus pesos moleculares. As frações são coletadas e analisadas.
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Tempo 0 Tempo 1 Tempo 2 Tempo n
Três parâmetros permitem avaliar a eficiência do processo de purificação de uma proteína:
- Atividade específica (AE): é a razão entre a quantidade da proteína de interesse, medida através de sua atividade biológica, e a quantidade total de proteínas presentes em cada etapa de purificação. Esse índice aumenta ao longo da purificação;
- Índice de purificação: indica quantas vezes em relação ao material de partida a proteína de interesse foi “concentrada”. Calcula-se como a razão entre as atividades específicas inicial (material de partida) e final (proteína pura);
- Rendimento: indica quanto (em %) da proteína de interesse ativa presente no material de partida foi recuperado ao final da purificação. Um certo grau de perda é inerente do processo de purificação (em cada etapa só devem ser processadas as frações mais ricas em atividade biológica, desprezando-se aquelas que apresentam pouca atividade). Também podem ocorrer perdas por desnaturação das proteínas devido às diferentes
condições (pH, sais, etc) a que são submetidas nas diferentes etapas de purificação. Espera-se recuperar o máximo possível da proteína de interesse.
1.6 Eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE
Eletroforese é o fenômeno de movimentação de uma molécula por um campo elétrico, sendo a velocidade de migração dependente da intensidade do campo elétrico, da carga global da proteína e do coeficiente de atrito (massa e forma da molécula + viscosidade do meio). A movimentação da molécula carregada depende da força elétrica que a impulsiona para o eletródio com carga oposta.
As separações eletroforéticas são quase sempre executadas em géis, porque o gel serve de peneira molecular que acentua a separação. Moléculas que sejam pequenas em relação aos poros no gel movem-se prontamente através dele, enquanto moléculas muito maiores que os poros são quase imóveis. Moléculas de tamanhos intermediários movem-se através do gel com graus variáveis de facilidade. O sentido do fluxo é de cima para baixo.
A eletroforese é executada em uma fina lâmina vertical de poliacrilamida. Os géis de poliacrilamida são meios de suporte preferidos para eletroforese, porque são quimicamente inertes e são prontamente formados pela polimerização de acrilamida com uma pequena quantidade do agente interligante metileno-bisacrilamida, incluído para fazer uma malha tridimensional. A eletroforese difere da filtração em gel no fato de que todas as moléculas, não importa qual o tamanho, são forçadas a se moverem através da mesma matriz (BERG et al., 2008).
As proteínas podem ser separadas, principalmente em base de massas, pela eletroforese em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes. A mistura de proteínas é antes dissolvida em uma solução de dodecil sulfato de sódio (SDS), um detergente aniônico que rompe quase todas as interações não covalentes em proteínas nativas. Também se adiciona mercaptoetanol (2-tilo-etanol) ou ditiotreitol para reduzir as pontes dissulfetos. Os aniontes do SDS ligam-se às cadeias principais em uma proporção de cerca de um para cada dois aminoácidos. Este complexo de SDS com uma proteína desnaturada tem grande carga negativa, que é aproximadamente proporcional à massa da proteína. A carga negativa adquirida na ligação ao
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SDS é geralmente muito maior do que aquela na proteína nativa, portanto, esta carga nativa torna-se insignificante. Os complexos SDS-proteína são então submetidos à eletroforese.
Quando esta estiver completa as proteínas no gel podem ser visualizadas pela coloração com prata ou com um corante, o azul de Coomassie, que revela uma série de faixas. Marcações radioativas, se tiverem sido incorporadas nas proteínas, podem ser detectadas, colocando-se uma chapa de raio X sobre o gel, um procedimento chamado de auto-radiografia (BERG et al., 2008).
Proteínas pequenas movem-se rapidamente através do gel, enquanto as grandes permanecem acima, perto do ponto de aplicação da mistura. A mobilidade da maioria das cadeias peptídicas nestas condições é diretamente proporcional ao logaritmo de suas massas. Contudo, algumas proteínas ricas em glicídeos e as proteínas de membranas não obedecem esta relação empírica. A técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS (muitas vezes referida como SDS-PAGE do inglês sodium dodecyl sulfate-poliacrylamide gel electrophoresis), é rápida, sensível e capaz de alto grau de resolução. Basta uma quantidade de 0,1g (≈ 2pmoles) de uma proteína para dar uma faixa distinta com azul de Coomassie, e até menos (≈ 0,02g) pode ser detectado na coloração com prata. Proteínas que difiram em massa por cerca de 2% (por exemplo, 50 e 51KDa, provenientes de uma diferença em torno de 10 aminoácidos) podem geralmente ser distinguidas. Podemos examinar a eficácia de nosso esquema de purificação, analisando uma parte de cada fração por eletroforese. A fração inicial apresentará de dúzias a centenas de proteínas. Na medida em que progride a purificação, o número de faixas diminui e a saliência de uma das faixas aumenta. Esta faixa corresponde às proteínas de interesse (BERG et al., 2008).
Para a análise do gel deve-se medir, com o auxílio de uma régua, a distância percorrida pelo corante azul de bromofenol, a dos marcadores de peso molecular e da amostra estudada. Posteriormente deve-se calcular o Rf (mobilidade relativa), dividindo a distância percorrida por cada marcador pela distância percorrida pela corante. Assim, constrói-se um gráfico plotando na abcissa os valores de Rf e na ordenada os logaritmos dos pesos moleculares dos padrões. Para a análise da amostra deve-se interpolar na reta o Rf da amostra, e assim, determinar seu peso molecular (BRACHT et al., 2003).
2 Objetivos
2.1 Objetivo geralPurificar e caracterizar a amilase pancreática suína comercial.
2.2 Objetivos específicos Determinar a atividade de uma amilase pancreática suína comercial e avaliar a
atividade específica (U/mg de proteínas); Fracionar a amostra fornecida por cromatografia de exclusão molecular; Avaliar o produto obtido por cromatografia de exclusão molecular por
eletroforese de poliacrilamida desnaturante; Avaliar a massa molecular da amilase pancreática.
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3 Materiais e Métodos
3.1 Dosagem de Proteínas
As proteínas foram dosadas pelo método de Bradford (1976), utilizando-se soro albumina bovina como padrão.
Amostra: diluição 1:1 (10mg de α-amilase em 10mL de tampão fosfato-sódio 20mM com NaCl 100mM, pH 6,9).
3 tubos de ensaio:1) Branco: 0,25mL de água destilada + 2,5mL de reagente de Bradford;2/3) Amostra (duplicata): 0,25mL amostra (1:1) + 2,5mL de reagente de Bradford.Esperou-se 5 min a temperatura ambiente e em seguida, a leitura foi realizada em
espectrofotômetro (Shimadzu UV 1800) em 595nm.Cálculo: fator de Bradford (0,168) x Abs= mg/mLObs: na preparação da amostra enzimática, esta foi bem homogeneizada para a total
dissolução. Como isso não ocorreu, a amostra foi submetida a centrifugação a 5000rpm/5min (Jouan BR 4i – refrigerada). Após a preparação da amostra, esta foi mantida sempre em banho de gelo.
3.2 Ensaio para atividade enzimática em U/mL:
Método de Miller (1959) – DNSSubstrato: amido 1% em tampão fosfato-sódio 20mM com NaCl 100mM, pH 6,9.A amostra foi diluída em tampão (1:50).A reação ocorreu em 4 tubos:1) 1mL de amido 1% foi deixado em banho-maria por 2 min/30ºC, em seguida,
adicionou-se 1mL de enzima (amostra 1:50) e a mesma foi agitada. Retirou-se uma alíquota de 250µl imediatamente para o tubo 2 (previamente com DNS) e após 5 min de reação em banho-maria 30ºC, foi transferido 250µl do tubo 1 para os tubos 3 e 4 também previamente com DNS;
2) Branco: 250µl DNS + 250µl da reação 1;3/4) 250µl DNS + 250µl da reação 1 após 5 min (em duplicata).Os tubos 2, 3 e 4 foram fervidos por 5min (a água já deve estar fervendo, pois a reação
com o DNS ocorre em temperatura acima de 80ºC), em seguida, os mesmos foram transferidos para banho frio afim de diminuir a
temperatura, logo depois foi adicionado 2,5mL de água deionizada em cada tubo.A leitura foi realizada em espectrofotômetro (Shimadzu UV 1800) a 540nm.Cálculo: abs/fator DNS (0,1113) x diluição= U/mL
3.3 Atividade Específica da enzima em U/mg de proteína:
Cálculo: atividade enzimática (U/mL) / dosagem de proteínas (mg/mL).
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3.4 Preparação da coluna e determinação do volume morto
A resina Sephadex G-50 foi hidratada com água e posteriormente equilibrada com tampão Fosfato de sódio 20mM com NaCl 100mM pH 6,9. Foi adicionado de maneira homogênea 200µl de blue dextran 2mg/mL em toda a superfície da resina, para verificar se o empacotamento foi adequado e para determinar o volume morto da coluna, sendo que este refere-se ao volume necessário para a eluição de partículas que não entram em qualquer poro da resina de filtração. A quantidade de blue dextran foi determinada a partir do volume total da coluna (25mL), pois o volume do corante deve ser no máximo 1% deste valor. Em seguida, também, à superfície da resina, foi adicionado o tampão para a eluição do corante. O material foi coletado em tubos de vidro na parte inferior da coluna, sendo que em cada qual foi adicionado 1mL. A coleta terminou assim que o blue dextran foi retirado completamente nos tubos e estes foram levados ao espectrofotômetro para medir a absorbância a 610nm. Foram lidas somente as amostras que apresentaram indícios de corante (amostras 8 a 12) e a partir das absorbâncias o volume morto foi determinado.
3.5 Aplicação e fracionamento da amostra
Foi adicionado 200µl da enzima 1mg/mL na coluna e 30 frações de 1mL cada foram coletadas. À medida que as frações foram retiradas, o tampão foi reposto na parte superior da coluna para evitar o ressecamento da resina. Como se tratava de uma coluna de 25mL, optou-se coletar 30mL de material, visando obter uma margem de segurança de 5mL, tendo em vista que deve-se coletar no mínimo o volume total da coluna utilizada, nesse caso, o volume mínimo é 25mL.
3.6 Determinação do perfil proteico e localização da amilase nas frações eluídas
As frações coletadas foram unidas aos pares para preencher o volume total da cubeta (2mL) e lidas em espectrofotômetro à 280nm. Em seguida, a atividade amilolítica da enzima foi quantificada em todas as frações pelo método de Miller (1959).
3.7Eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE
1 - Preparo do gel (volume final 20 mL) 6,25 mL de acrilamida 40% 5,0 mL de Solução H (tampão Tris pH 8,8) 200 L de SDS a 10% 8,5 mL de água deionizada 6,5 L de TEMED 100 L de persulfato a 10% (preparado na hora e colocado por último)
Os reagentes foram colocados na ordem acima em um Becker de 50 mL. Após o preparo, o gel foi colocado entre as placas de vidro.
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2 - Tampão da corrida (1,0 L) 9,08g de Tris 14,44 g de glicina 1g de SDS Acertar o pH para 8,7
Esta solução foi fornecida pronta.
3 - Receita da solução H para 50 mL 9,08g de Tris Ajustar o pH para 8,8 q.s.p. 50 mL de água destilada.
Esta solução foi fornecida pronta.
4 - Azul de bromofenol a 0,02% em água 2 g de azul de bromofenol Água suficiente para completar 100 mL.
Esta solução foi fornecida pronta.
5 - Preparo da amostra 50,0 l da amostra 50,0 l de sacarose a 40% preparada em tampão de corrida 5,0 l de azul de bromofenol a 0,02%
6- solução de fixação do gel 100 mL de ácido acético 400 mL de etanol Completar o volume para 1,0 L com água destilada.
7- solução de coloração Coomassie Blue G-250
0,5 g de CoomassieBlue G-250 Água bi destilada em q.s.p. 10 ml
Agitar por alguns minutos. O corante não se dissolvera completamente.
Para a realização da eletroforese desnaturante da proteína obtida após coluna de Sephadex G-50 foi primeiramente montado o sistema de placas de vidro para a aplicação do gel e amostras. As placas foram limpas com álcool e mantidas juntas pelo sistema de suporte e presilhas. Após o encaixe das placas de vidro no sistema, foi adicionado água destilada entre as placas para verificação de possíveis vazamentos.
Com o sistema de placas de vidro montado, foi preparado o gel de poliacrilamida a 40% seguindo protocolo. Foram tomados os cuidados no manuseio da acrilamida, por esta ser
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neurotóxica. O persulfato de amônia foi preparado no momento da aplicação e adicionado por último, pois se decompõe em sulfato de amônia, o qual não possui atividade catalítica.
Após o preparo do gel de poliacrilamida, este foi colocado entre as placas de vidro e o pente foi colocado na margem superior, entre as placas, para que fossem formados os poços onde posteriormente se adicionaria as amostras. Aguardou-se a polimerização do mesmo, sendo este colocado em estufa para acelerar a polimerização. Com o gel polimerizado, o sistema foi colocado na cuba eletroforética, com a parte chanfrada para o interior, e adicionado o tampão de corrida.
Foi adicionado em cada amostra uma solução contendo sacarose (40%), para conferir densidade, e azul de bromofenol a 0,02%, para marcar as proteínas e determinar o fim da corrida. Não foi necessário adicionar ao padrão de peso molecular sacarose e azul de bromofenol, pois este foi adquirido comercialmente com o marcador e densidade correta. Com o gel polimerizado, foram adicionados aos poços 50µL de amostra (duplicata) e 25µL de padrão.
A cuba eletroforética, contendo o tampão de corrida, as amostras e o padrão, foi conectada a uma fonte de 150V e 50mA. A corrida eletroforética durou 2 horas e 30 minutos e o azul de bromofenol atingiu a base do sistema, sendo interrompido o fornecimento de energia à cuba.
Após o término da corrida, o sistema de placas foi desmontado da cuba eletroforética. O gel foi retirado cuidadosamente e colocado na solução de fixação (ácido acético, etanol e água) por 30 minutos. Após a fixação do gel, este permaneceu overnight em solução de coloração com Coomassie blue G-250 coloidal. Em seguida, o corante foi retirado com lavagens repetidas utilizando água bi destilada e foi conservado em ácido acético para posterior visualização de suas bandas.
A análise da corrida foi feita medindo-se a distância entre o ponto de aplicação da amostra e o fronte da corrida e da distância do ponto de aplicação da amostra e o meio da banda da mesma. Com estes dados, realizou-se o cálculo do Rf (distância da amostra/distância total da corrida). Fez-se este mesmo cálculo para o marcador de peso molecular e assim foi possível encontrar o peso molecular das amostras após cálculo da reta com os padrões e interpolação do Rf da amostra.
4 Resultados e Discussão
4.1 Dosagem de proteína
Abs 1: 0,212Abs 2: 0,213Média das Abs: 0,2125Cálculo: fator de Bradford (0,168) x Abs= mg/mL
0,168 x 0,2125= 0,0357mg/mLOu: 35,7µg/mL – quantidade de proteína por mL de solução.
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4.2 Ensaio para atividade enzimática em U/mL
Abs 1: 0,303 Abs 3: 0,286Abs 2: 0,296 Abs 4: 0,263 – descartada.Média das 3 primeiras absorbâncias: 0,295 Cálculo: abs/fator DNS (0,1113) x diluição= U/mL 0,295/0,1113 x 50: 132,52 U/mL
O método utiliza a quantificação de açúcares redutores liberados na reação para obter (quantitativamente) atividade amilolítica. Portanto 132,52 U de enzima (α-amilase) produziram 1µmol de açúcar redutor por minuto nas condições do ensaio.
4.3 Atividade Específica da enzima em U/mg de proteína
Cálculo: atividade enzimática (U/mL)/ dosagem de proteínas (mg/mL)132,52 U/mL/ 0,0357 mg/mL: 3.712 U/mg
Logo há 3.712 unidades de enzima (amilase) em 1mg de proteína da solução.
4.4 Determinação do volume morto
O cálculo do volume morto é feito, medindo-se o volume de todos os tubos até o tubo onde a A610nm foi máxima. De acordo com o gráfico 1, podemos observar que o máximo de absorbância foi na amostra 2, correspondente ao tubo número 9. Como cada tubo tem 1mL de amostra, podemos inferir que o volume morto da coluna foi de 9mL.
Gráfico 1. Determinação do volume morto.
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Fração AbsTubo 8 0,101Tubo 9 0,319
Tubo 10 0,246Tubo 11 0,234Tubo 12 0,182
4.5 Determinação do perfil proteico e localização da amilase nas frações eluídas
A absorbância de uma solução de proteínas a 280nm é diretamente proporcional ao seu conteúdo proteico, desde que estas contenham os aminoácidos aromáticos na sua composição, especialmente triptofano (Figura 4).
A vantagem desse método é que ele não é destrutivo para a proteína. Em geral, considera-se que uma leitura de 1,0 A280 equivale a uma concentração de 1mg/mL.
Figura 4. Comprimento de onda em que os aminoácidos aromáticos apresentam máximo de absorção.
O gráfico 2 mostra o perfil protéico das 15 frações eluídas da coluna (linha azul) e também mostra a atividade amilolítica testada em cada uma delas (linha vermelha). Foram lidas somente 15 amostras, pois as 30 frações iniciais eluídas foram reunidas aos pares. O mesmo gráfico nos mostra uma região, na qual o pico de absorção de proteína e o pico de atividade amilolítica se sobrepõem. Com este resultado, podemos inferir que as frações eluídas correspondentes a esta região, referem-se a proteína de nosso interesse, a amilase.
Somente com a leitura a 280nm não é possível tirar nenhuma conclusão concreta, já que três picos sobressaem no gráfico. Como o extrato utilizado foi de uma proteína comercial, esta é somente previamente purificada, apresentando outras proteínas no material. Por isso, o resultado não mostrou um único pico, pois há outras proteínas no extrato.
O teste da atividade amilolítica é importante para determinar quais picos referentes ao perfil proteico correspondem à amilase. Dessa forma, foram testadas cada fração com o substrato específico da amilase, o amido, confirmando a região em que a amilase se encontra, ou seja, as amostras que a contém.
Pela análise, foram escolhidas quatro frações, correspondentes aos tubos 5 a 8 e às amostras (9 a 16), pois apresentaram os maiores valores de atividade específica. No gráfico, são os quatro maiores pontos de atividade. Optamos por descartar os demais pontos, e, por conseguinte, as amostras para posterior liofilização e uso da enzima, para deixa-lá o mais pura
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Comprimento de onda
Ab
sort
ivid
ade
mo
lar
ɛ
possível, eliminando assim, alguns contaminantes que são considerados os outros pontos. Perde-se um pouco de material, mas isso torna-se insignificante, quando pensamos em processos posteriores, nos quais os contaminantes irão interferir.
Gráfico 2. Determinação do perfil proteico e atividade amilolítica
4.6 Recuperação
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Frações Abs Atividade amilolítica
1 0,079 0,702 0,074 0,663 0,076 0,684 0,087 0,785 0,256 2,306 0,437 3,927 0,363 3,268 0,259 2,329 0,164 1,47
10 0,163 1,4711 0,126 1,1312 0,128 1,1513 0,112 1,0014 0,101 0,9015 0,094 0,84
Durante os procedimentos de fracionamento protéico, o mais importante fator a ser seguido é a recuperação da proteína em estudo, seja pela atividade enzimática (enzima), pela bioatividade (proteína não-enzimática) ou por algum método capaz de quantificar o componente desejado, como por exemplo, a análise eletroforética. O segundo ponto mais importante é o conhecimento da quantidade total de proteínas presentes na fração da qual se coletou a proteína em estudo. A partir desses dois dados, o percentual de recuperação pode ser calculado.
Os resultados obtidos para a amilase estão dispostos nas tabelas 3 e 4, seguem abaixo.
Tabela 3. Resultados detalhados da atividade amilolítica e % de recuperação da proteína.
Etapas Extrato bruto Após Sephadex G-50 Volume (mL) 0,2 Volume da amostra
adicionado na coluna 8 Escolhemos 4 tubos com a enzima,
cada um continha 2mL (4X2=8)
Atividade amilase 26,504
132,52 em 1 mL, mas queremos saber em 0,2 mL
23,6Pegamos os valores referentes aos 4 tubos (5 a 8) e multiplicamos por 2, pois são 2 mL em cada tubo
132,52 -- 1mLx -- 0,2mL
2,3 x 2= 4,6 x= 26,504 3,92 x 2= 7,84 3,26 x 2= 6,52 2,32 x 2= 4,64 Agora somamos: 23,6 U/mL
Recuperação (%)
100% 89% 26,504 -- 100%23,6 -- x
x= 89%
Tabela 4. Resultados apresentados resumidamente da atividade amilolítica e % de recuperação da proteína.
Etapas Volume Proteínas Atividade amilase%
Recuperação (mL) mg/mL U/mL U.T. U/mg Extrato bruto 0,2 0,0357 132,52 26,504 3.712,05 100%Após Sephadex G-50 8,0 23,600 89%
O percentual de recuperação para a amilase foi de 89%, valor considerado relativamente alto. Isso nos leva a concluir que o método de purificação utilizado para essa proteína foi eficaz e com taxa alta de recuperação.
4.7 Eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE
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A primeira banda do gel representa a enzima sem ferver, a segunda banda é o padrão de peso molecular e a terceira é a amostra fervida. Na análise do gel, foi verificado que a amostra da α-amilase continha duas bandas (figura 5).
Figura 5 – Gel de SDS-PAGE, (1) Enzima não desnaturada (sem ferver), (2) padrão de peso molecular, (3) enzima desnatura (fervida).
Pelo resultado da primeira banda, pode se inferir que não apresenta pureza, tendo em vista que a banda obtida foi consideravelmente espessa. Esta impureza foi constatada na terceira amostra, com 3 bandas, provavelmente devido aos contaminante que no processo de fervura se soltaram.
A primeira hipótese foi que a enzima em questão é dimérica, mas essa hipótese foi descartada, pois como conhecemos que a estrutura da α-amilase de suínos é monomérica. A segunda hipótese foi que a amostra não estava totalmente pura, e esta hipótese é a verdadeira, pois, tendo em vista que é uma enzima comercial, ela possui contaminantes protéicos e, por isso, apresentou duas bandas, sendo separadas pelo processo de fervura.
Esperava-se oito bandas no padrão comercial, entretanto apareceram apenas 2 bandas, fato este não elucidado, pois o mesmo encontrava-se dentro do prazo de validade e armazenado adequado.
Após a corrida eletroforética, mediu-se, com o auxílio de uma régua, a corrida total (a partir do ponto de aplicação da amostra até o fronte da corrida), sendo esta igual a 9,1 cm de
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comprimento, da enzima desnaturada (do ponto de aplicação até o meio da banda obtida) e 3,5 cm da enzima não desnaturada 2,8 cm.
Tabela 6 – Valores de pesos moleculares do padrão, log do peso molecular, distância dos padrões e Rf.
Padrão de peso molecular
Massa molecular
(KDa)
Log do peso
molecular
Distância percorrida
Rf
Albumina 66.000 4,82 2,7 0,30
Ovalbumina 45.000 4,65 3,9 0,44
G3PD 36.000 4,56 4,7 0,53
Anidrase carbônica
29.000 4,46 5,1 0,57
tripsinogênio 24.000 4,38 5,6 0,63
Inibidor da tripsina de soja
20.000 4,30 6,0 0,68
α- lactoalbumina 14.200 4,15 7,1 0,80
aprotinina 6.500 3,81 8,4 0,94
Após a análise do gel o gráfico foi plotado (gráfico 3) e o peso molecular das proteínas em questão obtido pelo cálculo do Rf de cada amostra e interpolação na equação da reta.
O Rf da amostra 1 foi de 0,3076 e o da amostra 3 foi de 0,3846.
y = -1,5441x + 5,3351
R2 = 0,981
1
1,52
2,53
3,5
44,5
55,5
6
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Rf
Log
Peso
Mol
ecul
ar (k
Da)
Série1
Linear (Série1)
Gráfico 3 - Curva de calibração usada para determinar o peso molecular da proteína.
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Para a amostra 1 temos: Rf da amostra1: 2,8/9,1 = 0,3076Amostra1: -1,5441 x + 5,3351Amostra1: - 1,5441 . 0,3076 + 5,3351Amostra1: 4,860Amostra1: antilog = 104,860 = 72.443 KDa
Para a amostra 3 temos: Rf da amostra2: 3,5/9,1 =0,3846Amostra2: -1,5441 x + 5,3351Amostra2: - 1,5441 . 0,3846+ 5,3351Amostra2: 4,741Amostra1: antilog = 104,741 = 55.080 KDa
O resultado do gel de forma geral foi bom porque este apresentou um fundo límpido e bandas nítidas. As amostras apresentaram os pesos moleculares de 72.443 KDa para a amostra 1 e 55080 KDa para a amostra 3. Esta diferença de valores pode ser atribuída a impurezas presentes na amostra visto que a amostra 1 não foi fervida, permanecendo os contaminantes, já em 3, temos apenas a enzima de interesse.
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