1

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO DIRETORIA DE PESQUISA

PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA – PIBIC: CNPq, CNPq/AF, UFPA, UFPA/AF, PIBIC/INTERIOR, PRODOUTOR, PIBIT E FAPESPA

RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO

Período: agosto/2016 a fevereiro/2017.

(X) PARCIAL ( ) FINAL

IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO

Título do Projeto de Pesquisa: Oxidação de carotenoides por espécies reativas de

oxigênio e de nitrogênio: análise química e atividade biológica (Portaria 035.2016-

ITEC-UFPA).

Nome do Orientador: Renan Campos Chisté.

Titulação do Orientador: Professor Adjunto.

Faculdade: Faculdade de Engenharia de Alimentos (FEA).

Instituto/Núcleo: Instituto de Tecnologia (ITEC).

Laboratório: Laboratório de Tecnologia de Alimentos (LTA).

Título do Plano de Trabalho: Cristais de β-caroteno de elevado grau de pureza

isolados a partir da polpa e da casca de tucumã (Astrocaryum aculeatum).

Nome do Bolsista: KEVIN ALBERT NORONHA MATOS.

Tipo de Bolsa: ( ) PIBIC/ CNPq ( ) PIBIC/CNPq – AF ( ) PIBIC /CNPq- Cota do pesquisador ( ) PIBIC/UFPA ( ) PIBIC/UFPA – AF ( ) PIBIC/ INTERIOR (X) PIBIC/PRODOUTOR ( ) PIBIC/PE-INTERDISCIPLINAR ( ) PIBIC/FAPESPA ( ) PIBIC/PIBIT

2

1. INTRODUÇÃO

A Amazônia possui uma biodiversidade muito grande, ao qual muitas destas espécies

são pouco exploradas ou nem sequer são conhecidas. Nesse caso, as pesquisas científicas

na área podem vir a fortalecer o cenário da fruticultura nacional.

O tucumã (Astrocaryum aculeatum) é uma espécie nativa da região amazônica,

sendo uma espécie com elevado teor de carotenoides com grande potencial pró vitamínico

A, fazendo com que ele seja um alimento de estimável valor nutritivo. O fruto é uma drupa

globosa ou ovoide, de 5-6 cm de diâmetro pesando 70-75g com epicarpo verde amarelado

(CAVALCANTE et al., 1991; RODRIGUEZ-AMAYA, 2008). O tucumã pertence à família

Aracaceae e seus frutos são pequenos (20 a 100 g) com polpa que representa cerca de

22% do peso total do fruto (MAIA et al., 2014). A polpa do fruto é carnosa, de coloração

que varia do amarelo ao laranja, devido à presença de elevados teores de carotenoides (β-

caroteno como carotenoide majoritário), com elevado teor de atividade provitamina A (De

Rosso & Mercadante, 2007).

Os carotenoides são pigmentos naturais que estão entre os constituintes de

alimentos mais importantes por serem substâncias bioativas com efeitos benéficos a saúde

(AMAYA, 2008). Eles são responsáveis pelas cores amarelo, laranja e vermelho de muitas

frutas, hortaliças dentre outros. Um dos carotenoides mais pesquisados por seus benefícios

com a saúde humana é o β-caroteno, que é o carotenoide mais abundante do tucumã (DE

ROSSO & MERCADANTE, 2007; AMAYA, 2008).

Os carotenoides são compostos bioativos lipossolúveis presentes em plantas, animais

e também em micro-organismos, como por exemplo cianobactérias, algas, bactérias e fungos

e leveduras. Além de seu amplo uso como corante alimentício (β-caroteno, licopeno, luteína,

astaxantina, bixina), os carotenoides também são importantes para a saúde pois o aumento

da ingestão frequente desse tipo de composto bioativo vem sendo associado ao

fortalecimento do sistema imunológico e também à diminuição do risco de desenvolvimento

de diversas doenças crônico-degenerativas, tais como câncer, inflamações, doenças

cardiovasculares, cataratas, degeneração macular e outras (LAVECCHIA et al., 2013).

2. JUSTIFICATIVA

Neste projeto, os frutos do tucumã (Astrocaryum aculeatum) serão o objeto de

estudo.

A proposta científica e o impacto do projeto estão baseados na utilização do tucumã,

uma fruta de origem Amazônica amplamente difundida na região Norte do Brasil, para

obtenção de cristais de β-caroteno de alto grau de pureza. A importância da obtenção de

β-caroteno com elevado grau de pureza reside nas mais diversas finalidades: utilização

para estudos de aplicação do β-caroteno como corante alimentício natural; a possibilidade

3

de obtenção de padrão analítico de mais baixo custo, se comparado às alternativas

comerciais (síntese química), e por fim, utilização como padrão analítico para as diversas

metodologias científicas utilizadas na área da Ciência e Tecnologia de Alimentos

(quantificação de carotenoides e avaliação do potencial antioxidante de frutas e outros

vegetais) no Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos

(PPGCTA) da UFPA. Dessa forma, este projeto possui aplicação em pesquisas futuras e

possibilidade de criação de patentes através do desenvolvimento de ingredientes e

produtos com alegação funcional.

3. OBJETIVOS

3.1. Geral

O objetivo principal do trabalho será a otimização das condições de extração de

carotenoides a partir da polpa e da casca (resíduo) de tucumã para obtenção de cristais de β-

caroteno com elevado grau de pureza.

3.2. Objetivos específicos

Para atingir tais objetivos, serão traçadas as seguintes metas:

- Determinar o teor de carotenoides totais na polpa e na casca de tucumã; (realizado)

- Identificar e quantificar os carotenoides majoritários da parte do tucumã com maior teor de

carotenoides totais por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada aos detectores de

arranjo de diodos e espectrômetro de massas (HPLC-DAD-MS/MS); (parcialmente

realizado)

- Avaliar a eficiência da extração dos carotenoides da parte do tucumã com maior teor de

carotenoides, avaliando diferentes parâmetros para otimização da extração: tipo de solvente,

massa de amostra e tempo de agitação; (realizado)

- Obter extratos de tucumã com elevados teores de carotenoides para isolamento e

cristalização do β-caroteno; (realizado)

- Determinar o grau de pureza dos cristais de β-caroteno obtidos e realizar uma segunda

cristalização, se for necessário; (a ser realizado)

- Avaliar a estabilidade dos cristais de β-caroteno armazenados sob condições de

congelamento (- 20 °C). (a ser realizado)

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1. Materiais e equipamentos utilizados

Os reagentes utilizados foram: éter de petróleo, acetona, celite, sulfato de sódio anidro,

água destilada, éter Etílico, hidróxido de potássio, nitrogênio puro e metanol. Os

equipamentos utilizados foram: bomba de vácuo, evaporador rotativo, balança analítica,

4

espectrofotômetro UV-Visível, embaladora a vácuo, agitador magnético, sistema de agitação

com controle de temperatura (shaker).

4.2. Fruto (amostra)

O tucumã foi obtido na feira local (feira do Ver-o-Peso, Belém-PA) e os frutos maduros

foram descascados. A casca foi separada da polpa, e ambas as partes foram embaladas a

vácuo e armazenadas em temperatura -18 ºC até o momento da análise.

4.3. Determinação do teor de carotenoides totais

A análise foi iniciada com a pesagem das amostras (1-3 g de polpa ou casca ou

polpa+casca), e em seguida colocava-se a amostra pesada em um almofariz junto com celite

e acetona para dar início ao processo de maceração. Este processo foi realizado até a

extração exaustiva dos carotenoides. Em seguida, este extrato foi filtrado à vácuo em funil de

Büchner para um kitassato, e este processo foi realizado até que toda a amostra que estivesse

no filtro perdesse sua coloração (coloração esbranquiçada). Logo após, a solução obtida da

filtração foi direcionada para o processo de partição líquido-líquido em funil de separação com

éter de petróleo e éter etílico na proporção de 1:1 (v/v) na qual a quantidade de cada um

utilizado foi em média de 10 mL. Feito isto, o processo de lavagem do extrato foi iniciado, que

consistia em adicionar lentamente a água destilada no funil de separação para não formar

emulsão na solução e, em seguida, a água foi removida do sistema arrastando a acetona para

o descarte. Normalmente, eram realizadas de 4 a 5 lavagens que utilizavam em média 400

mL de água/cada. Após o processo de lavagem, a solução foi transferida para um erlenmeyer

para que fosse feita a remoção da água remanescente na solução, com o auxílio do sulfato

de sódio anidro. Logo após, com o auxílio de uma pipeta, o extrato de carotenoides foi retirado

do erlenmeyer (cuidadosamente para que o sulfato de sódio cristalizado não fosse arrastado

juntamente com o extrato) e transferido para um balão de fundo redondo para que o mesmo

fosse levado para o evaporador rotativo (T < 38 °C) para a remoção do solvente orgânico. Em

seguida, o extrato de carotenoides foi re-solubilizado em éter de petróleo, transferido para um

balão volumétrico de 10 mL e diluído (10 vezes) para a quantificação por espectrofotometria

(em triplicata). O comprimento de onda utilizado na quantificação foi 450 nm e o teor de

carotenoides (g/g, base úmida) foi calculado conforme a equação:

𝐶 (𝜇𝑔

𝑔) =

𝐴𝑏𝑠 𝑥 104 𝑥 𝐹𝑑 𝑥 𝑉

𝑚 𝑥 2592 (Equação 1)

Onde, C = Concentração; Fd= Fator de diluição; V= Volume inicial do extrato antes da diluição

(mL); m = massa (g) e 2592 = coeficiente de absortividade molar do β-caroteno em éter de

petróleo (MELÉNDEZ-MARTINEZ et al., 2007)

5

4.4. Análise do perfil de carotenoides por HPLC-DAD na casca do tucumã

Até o momento, foram realizadas apenas a confirmação da identidade dos

carotenoides da parte do tucumã com maior teor de carotenoides totais (casca) por HPLC-

DAD, com base no perfil de carotenoides reportado por De Rosso & Mercadante (2007). A

quantificação e a análise por espectrometria de massas ainda será realizada.

Os carotenoides foram extraídos da casca do tucumã seguindo as mesmas etapas da

análise anterior (4.3. Determinação de carotenoides totais), até o momento da etapa de

partição líquido-líquido. Após a partição, foi realizada uma etapa de saponificação do extrato

de carotenoides. A saponificação foi realizada da seguinte maneira: foi adicionada uma

solução de KOH 10% em metanol no extrato (1:1, v/v) após a partição e deixado em repouso

por 24 horas. Após a etapa de saponificação, o extrato foi direcionado para uma nova partição

líquido-líquido em um funil de separação com éter de petróleo e éter etílico na proporção de

1:1 (v/v) e deu-se início ao processo de lavagem com água destilada acompanhando o pH da

água que era removida do funil até a completa remoção do álcali. Logo após a água

remanescente da etapa de lavagem foi removida com o auxílio de sulfato de sódio anidro. Em

seguida, com o auxílio de uma pipeta, o extrato foi transferido para um balão de fundo redondo

para que o solvente fosse removido em um evaporador rotativo (T < 38 °C) e re-solubilizado

em éter de petróleo. O extrato foi transferido para um frasco de vidro aonde a amostra seria

armazenada e a pequena alíquota de solvente orgânico foi removida em fluxo de nitrogênio.

O extrato seco de carotenoides foi armazenado em um freezer a -18 ºC até o momento da

injeção no sistema cromatográfico (HPLC-DAD.

O extrato de carotenoide foi solubilizado em metanol (MeOH)/éter metil-terc-butílico

(MTBE) na proporção 70:30 (v/v), filtrado (0,22 μm) e injetado no HPLC (Agilent Technologies

1260 Infinity, USA) equipado com bomba quaternária, desgaseificador, injetor Rheodyne com

capacidade para 20 μL e um detector de arranjo de diodos (DAD). Os carotenoides foram

separados em uma coluna C30 YMC (5 μm, 4.6 x 250 mm, Waters, USA) a 29 ºC, fluxo de

0,9 mL/min, com gradiente linear composto de MeOH/MTBE na proporção de 95:5 para 70:30

em 30 min, seguido de 50:50 em 20 min (CHISTÉ & MERCADANTE, 2012). O cromatograma

foi processado a 450 nm e os espectros UV-Visível foram adquiridos entre 200 e 600 nm. Os

carotenoides foram identificados de acordo com as seguintes informações combinadas:

ordem de eluição em coluna C30, características dos espectros UV-Vis [λmáx, estrutura fina

(%III/II), intensidade do pico cis (%AB/AII)] e dados disponíveis na literatura (DE ROSSO &

MERCADANTE, 2007; CHISTÉ & MERCADANTE, 2012).

4.5. Otimização da extração de carotenoides da casca de tucumã

Para a otimização da extração de carotenoides da casca de tucumã foi proposto um

6

Delineamento Composto Central (DCC) do tipo 2³, com dois níveis (+1 e -1) e 3 repetições no

ponto central, totalizando 11 experimentos. Foram selecionadas 3 variáveis independentes

(proporção de acetato de etila em acetona, razão sólido-líquido e tempo de agitação) (Tabela

1).

Tabela 1. Delineamento Central Composto (DCC): níveis das variáveis independentes

(originais e codificadas).

Variável independente Nível

-1 0 +1

Proporção de acetato de etila em acetona

(Acetona: X) X1 30% 50% 70%

Razão sólido-líquido (1:X) X2 3 5 7

Tempo de agitação (min) X3 40 60 80

A resposta do planejamento experimental foi o teor de carotenoides totais para

obtenção dos coeficientes de regressão e os dados experimentais foram ajustados a um

modelo linear. A adequação ao modelo foi determinada pela avaliação da falta de ajuste ao

modelo proposto, pelo coeficiente de determinação (R2) e pelos valores do teste de Fisher (F-

value) obtida pela análise de variância (ANOVA) gerada pelo software Statistica. A

significância estatística dos resultados dos modelos e das variáveis foram determinadas a 5%

(=0.05).

Durante a execução dos experimentos, 1 g de amostra foi pesada transferida para um

erlenmeyer e adicionado acetona e acetato de etila com proporções que variaram de acordo

com a Tabela 1. Após a adição do solvente, a vidraria era lacrada com papel filme e levado a

um shaker orbital, ao qual a amostra era agitada na velocidade de 114 rpm na temperatura

ambiente e com o tempo variando de acordo com o delineamento proposto na Tabela 1. Após

o tempo de agitação no shaker, o extrato seguia para o processo de partição líquido-líquido

em funil de separação com adição de éter de petróleo e éter etílico na proporção de 1:1 (v/v),

conforme o volume do extrato, e então dava-se início ao processo de lavagem com água

destilada. Logo após a partição, a água foi removida com o auxílio de sulfato de sódio anidro.

Em seguida, o extrato de carotenoide foi transferido para um balão de fundo redondo,

evaporado em evaporador rotativo (T < 38 °C), re-solubilizado em éter de petróleo e

transferido para um balão volumétrico, na qual ele seria diluído 10 vezes ou 5 vezes, para que

pudesse ser feita a quantificação do teor de carotenoides totais por espectrofotometria,

conforme procedimento descrito no item 4.3 (Determinação de carotenoide totais).

7

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. Determinação do teor de carotenoides totais na polpa e na casca do tucumã

Conforme os dados obtidos nas análises (Tabelas 2), pôde-se concluir que a casca do

fruto é a que possui o maior teor de carotenoides. Esta resposta é promissora, afinal, do fruto

geralmente só se utiliza a polpa, a casca é tida como um resíduo, ou seja, este estudo poderá

valorizar ainda mais o fruto fazendo proveito de todas as suas partes.

Tabela 2. Teor de carotenoides totais nas diferentes partes do tucumã.

Partes do tucumã Teor de carotenoides totais (g/g)*

Polpa+Casca 80,37 + 13,59

Polpa 48,62 + 17,76

Casca 132,73 + 25,00

*base úmida.

Em comparação com o teor de carotenoides na polpa de outros frutos encontrados na

literatura, como o buriti que possui concentração de β-caroteno de 360 g/g (AMAYA, 2001),

o tucumã no presente estudo apresentou um menor teor de carotenoides. No entanto, em

comparação com a bocaiúva (49,0 μg/g) (RAMOS, 2007), mamão (1,2 μg/g), pêssego (0,40

μg/g) (SENTANIN et al., 2007), abobrinha iltaliana (2,66 μg/g) (TAWATA, 2010), cenoura (10,0

μg/g) (ZERALK et al., 2008), tucumã-do-Pará (99 g/g) (AMAYA et al., 2008), o tucumã

apresentou maior teor de carotenoides totais, até mesmo em comparação com a outra espécie

do fruto estudada por outro autor.

Como a casca apresentou o maior teor de carotenoides totais nesta etapa, foi decidido

utilizar somente a mesma durante os outros processos.

5.2. Identificação dos carotenoides por HPLC-DAD

Até o presente momento, apenas a identificação provisória dos carotenoides da casca

do tucumã foi realizada por comparação dos picos encontrados neste estudo com os picos de

carotenoides já identificados e reportados por De Rosso & Mercadante (2007) em condições

idênticas de separação cromatográfica. Além disso, as características espectrais [λmáx,

estrutura fina (%III/II), intensidade do pico cis (%AB/AII)] também foram comparadas.

O cromatograma da casca de tucumã pode ser visualizado na Figura 1. O pico

correspondente ao β-caroteno elui a 33,6 min e o espectro UV-Vis apresentou absorbância

nas bandas 421, 452, 478 nm, com %III/II ≈ 25 e %AB/AII = 0, conforme reportado por De

Rosso & Mercadante (2007) e Chisté & Mercadante (2012).

8

Figura 1. Cromatograma da casca de tucumã obtido a 450 nm (HPLC-DAD) sem

saponificação (esquerda) e após a saponificação (direita).

A saponificação é uma etapa analítica que tem por objetivo a quebra da ligação éster

entre os carotenoides e os ácidos graxos presentes nas amostras vegetais, liberando o

carotenoide. Essa estratégia é útil quando há a necessidade de identificação e isolamento de

compostos em matrizes complexas. No caso da casca do tucumã, quanto mais eficiente for a

saponificação, mais livre estará o carotenoide para o processo de cristalização, que depende

de um grau de pureza mais elevado. Após análise dos cromatogramas (Figura 1), foi possível

verificar a presença de ésteres de carotenoides mesmo após o processo de saponificação, o

que indica que o processo não foi realizado com eficiência. Este procedimento e a análise de

HPLC-DAD do extrato saponificado será repetido para que seja obtido o maior rendimento de

β-caroteno para o processo de cristalização.

5.3. Otimização da extração de carotenoides da casca de tucumã

De acordo com os resultados descritos na Tabela 3, o menor teor de carotenoides foi

obtido no experimento 2 e o que obteve maior teor de carotenoides foi o experimento 3, e a

partir deles percebemos um contraste relacionado à razão solido-líquido (X2). Os

experimentos com maior teor de carotenoides foram 3, 8 e 4, respectivamente, se observamos

o delineamento, veremos que um fator se repetiu nos três, este fator foi a razão solido-líquido

(1:7). Percebemos isso também nos experimentos com um menor teor de carotenoides 2, 7,

6 e 5 respectivamente, em todos eles foram utilizados a menor razão solido-líquido (1:3).

Quanto ao tempo de agitação, não se pode chegar a uma resposta concreta apenas a

partir da observação dos dados obtidos, entretanto, se não levarmos em consideração o ponto

central, é visível que as melhores extrações foram feitas no menor tempo de agitação (40

min). O procedimento de extração pode ser considerado reprodutível, uma vez que as

repetições no ponto central apresentaram resultado médio de 15,85 1,65 g/g de

carotenoides totais e coeficiente de variação igual a 10,6 %.

Minutes

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

mA

U

0

100

200

300

400

mA

U

0

100

200

300

400DAD: Sinal A, 450,0 nm/Lb:4,0 nm Ref 600,0 nm/Lb:20,0 nm

Casca de tucumã (sem saponificação)

-caroteno(33,6 min)

Ésteres de carotenoide

Minutes

10 20 30 40 50 60

mA

U

0

20

40

60

80

100

mA

U

0

20

40

60

80

100DAD: Sinal A, 450,0 nm/Lb:4,0 nm Ref 600,0 nm/Lb:20,0 nm

Casca de tucumã (saponificado)-caroteno(33,6 min)

Ésteres de carotenoide

9

Tabela 3. Teor de carotenoides totais obtidos pelo Delineamento Composto Central (DCC).

Experimento

Níveis das variáveis

independentes Teor de carotenoides

totais (g/g)*

X1 X2 X3

1 30 3 40 9,69

2 70 3 40 7,77

3 30 7 40 30,49

4 70 7 40 19,25

5 30 3 80 9,24

6 70 3 80 9,04

7 30 7 80 8,67

8 70 7 80 19,88

9 (PC) 50 5 60 15,85

10 (PC) 50 5 60 17,08

11 (PC) 50 5 60 13,81

X1 = acetato de etila em acetona (%), X2 = razão sólido-líquido, X3 = tempo de

agitação magnética (min). PC: ponto central. *base úmida.

Após a avaliação dos coeficientes de regressão (Tabela 4) do modelo matemático

proposto para predizer a extração de carotenoides totais da casca de tucumã (Equação 1) e

a ANOVA para as variáveis testadas durante o procedimento de extração (Tabela 5), foi

possível verificar que o F calculado da regressão deveria ter sido pelo ao menos 10 vezes

superior ao F tabelado para que o modelo represente um bom ajuste aos dados experimentais.

Por outro lado, o F calculado da falta de ajuste deveria ter sido menor que o F tabelado para

que o modelo seja considerado preditivo. Dessa forma, podemos concluir que o modelo

proposto pode ser considerado preditivo, mas os dados experimentais não foram ajustados

de maneira satisfatória ao modelo.

Carotenoides totais (g/g) = 14,61 – 0,27X1 + 5,32X2 – 2,54X3 + 0,26 X1X2 + 3,02X1X3 –

2,75X2X3 (Equação 1)

10

Tabela 4. Coeficientes de regressão do modelo linear predito para a extração de carotenoides

da casca do tucumã.

Carotenoides totais

Média 14.61*

X1 (L) -0,27

X2 (L) 5,32*

X3 (L) -2,54*

X1X2 0,26

X1X3 3,02*

X2X3 -2,75*

X1 = acetato de etila em acetona (%), X2 = razão sólido-

líquido, X3 = tempo de agitação magnética (min). X1X2,

X1X3, e X2X3 são interações entre as três variáveis. (L):

linear. *Estatisticamente significante (p<0.05).

Tabela 5. ANOVA para a razão sólido-líquido e tempo de agitação magnética (variáveis

independentes significativas) durante a extração de carotenoides no teor de carotenoides

totais da casca de tucumã utilizando um modelo linear do delineamento composto central

(DCC).

Fonte de

variação

Soma dos

quadrados

Graus de

liberade

Quadrados

médios Fcalculado R²

Caro

ten

oid

es

tota

is

Regressão 412,88 6 68,81 4,37

0,8676

Resíduos 63,01 4 15,75

Falta de Ajuste 57,55 2 28,77 10,58

Erro puro 5,45 2 2,72

Total 475,89 10

R² = coeficiente de determinação. F0,05; 6; 4 = 6,16; F0,05; 2; 2 = 19,00.

Com base nos resultados obtidos após os experimentos de otimização do processo

de extração de carotenoides da casca do tucumã, foram plotadas curvas de contorno com o

objetivo de apenas avaliar as tendências do processo de extração (Figura 2).

11

Figura 2 – Curvas de contorno para a extração de carotenoides totais da casca de tucumã

em função da concentração de acetato de etila em acetona (%), razão sólido-líquido (1:X, m/v)

e tempo de agitação (min).

Ao analisar a curva de contorno em função do tempo de agitação e a concentração de

acetato de etila em acetona, percebemos que a zona de melhor extração de carotenoides

possui uma tendência das curvas para as menores porcentagens de reagente e os menores

tempos de agitação. A curva de contorno em função do tempo de agitação e da razão solido-

líquido, possui a mesma tendência com relação ao tempo de agitação, entretanto, indica que

para se ter uma melhor extração deve se utilizar uma maior razão solido-liquido. O que pode

ser visto na tabela 4 no experimento 3 que demonstra exatamente o que as curvas de contorno

expressam.

Da mesma forma, foi possível plotar os gráficos de desejabilidade do processo de

extração (Figura 3), que indica a condição ótima do processo de extração para que seja obtido

o maior rendimento de carotenoides totais.

22

20

18

16

14

12

10

8 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75

Acetato de Etila em Acetona (%)

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

Te

mp

o a

gita

çã

o (

min

)

24

22

20

18

16

14

12

10 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0

Razão sólido-líquido (1:x, m/v)

40

45

50

55

60

65

70

75

80

Te

mp

o a

gita

çã

o (

min

)

12

Figura 3. Gráficos de desejabilidade para a melhor condição de extração de carotenoides

totais da casca de tucumã com base nos níveis testados: a concentração de acetato de etila

em acetona (%), razão sólido-líquido (1:x, m/v) e tempo de agitação (min) para a extração.

Os gráficos da figura 2, demonstram as melhores condições de extração do

carotenoide no tempo de agitação de 40 minutos, na razão solido-líquido (1:7) e na proporção

de 30% de acetato de etila em acetona. Nestas condições, é possível obter um extrato com o

maior rendimento de carotenoides totais utilizando o procedimento de extração testado (≈90%

em relação à maior resposta obtida no planejamento).

6. PUBLICAÇÕES

Durante o período de realização do estágio de iniciação científica, o discente

participou na elaboração de dois capítulos de livro, que se encontram em fase final de

correção, e serão publicados pelo Ministério do Meio Ambiente (MMA) na série de

publicações intituladas “Espécies Nativas da Flora Brasileira de Valor Econômico Atual ou

Potencial – Plantas para o futuro – região Norte”. Os dois capítulos são:

Brenda de Nazaré Do Carmo Brito, Mayara Galvão Martins, Kevin Albert Noronha

Matos, Danielle Praia Lima, Renan Campos Chisté. Mauritia flexuosa – Buriti. Espécies

Nativas da Flora Brasileira de Valor Econômico Atual ou Potencial – Plantas para o futuro

Acetato de Etila em Acetona (%)

0.0000

28.260

40.000

Razão sólido-líquido (1:x, m/v) Tempo agitação (min) Desejabilidade

0.

.5

1.

7.7

700

19

.130

30

.490

Ca

rote

noid

es T

ota

is (

mic

rog

ram

a

/g)

30. 70.

.90187

3. 7. 40. 80.

13

– região Norte. (em fase final de correção)

Mayara Galvão Martins, Brenda de Nazaré Do Carmo Brito, Danielle Praia Lima, Kevin

Albert Noronha Matos, Renan Campos Chiste. Astrocaryum vulgare & Astrocaryum

aculeatum- Tucumã. Espécies Nativas da Flora Brasileira de Valor Econômico Atual ou

Potencial – Plantas para o futuro – região Norte. (em fase final de correção)

7. ATIVIDADES A SEREM DESENVOLVIDAS NOS PRÓXIMOS MESES

As atividades a serem desenvolvidas nos próximos meses para completar o

cronograma do projeto são:

Validação do modelo otimizado para extração dos carotenoides da casca de

tucumã: através da realização experimental do procedimento de extração nas condições

ótimas determinadas e verificação do quanto a resposta experimental pode ser predita pelo

modelo teórico.

Isolamento e cristalização do β-caroteno: o extrato rico em carotenoides será

dissolvido em diclorometano/etanol (1:4) a temperatura de 50-60 ºC, colocado em banho de

gelo para abaixamento gradual da temperatura e em seguida levado ao freezer por uma noite

para a formação dos cristais de β-caroteno. Os cristais serão filtrados (ou centrifugados),

lavados com etanol gelado, e secos em estufa a vácuo à temperatura ambiente (Nunes &

Mercadante, 2004). O procedimento de cristalização poderá ser realizado mais de uma vez

para obtenção de cristais com maior teor de pureza. O grau de pureza dos cristais será

determinado por HPLC-DAD (CHISTÉ & MERCADANTE, 2012) e o rendimento total do

processo será calculado.

Avaliação da estabilidade dos cristais sob condições de congelamento: o teor de

β-caroteno será monitorado durante o período de armazenamento sob congelamento (-20 ºC)

por HPLC-DAD (CHISTÉ & MERCADANTE; 2012), com a finalidade de avaliar a cinética de

degradação e o tempo de meia-vida dos cristais de β-caroteno obtido

8. CONCLUSÃO PARCIAL

Portanto, nas análises de determinação do teor de carotenoides totais, a casca do fruto

foi a que obteve um maior teor de carotenoides totais em comparação com a polpa.

A partir da análise do perfil de carotenoides foi possível detectar a presença do β-

caroteno como carotenoide majoritário da casca do tucumã; no entanto, serão necessárias

análises adicionais para confirmação da identidade, quantificação e correta saponificação

para isolamento do composto.

No procedimento de otimização, ao avaliar os coeficientes de regressão obteve-se

14

variáveis significativas a nível de significância de 5%, a partir de tais dados foi criado um

modelo matemático para predizer a extração dos carotenoides da casca do tucumã pelo

procedimento indicado. Todavia, ao fazer um teste estatístico (ANOVA), foi comprovado que

o modelo é preditivo, entretanto os dados do experimento não foram ajustados de maneira

satisfatória ao modelo. Também com os dados obtidos, foi possível construir uma curva de

contorno e um gráfico de desejabilidade para melhor visualização das melhores condições de

extração dos carotenoides.

9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

CAVALCANTE, P.B. et al. Frutas Comestíveis da Amazônia. 6º edição. Belém:

Edições CEJUP: Museu Paraense Emílio Goeldi,p. 218-220, 1991.

CHISTÉ, R.C.; MERCADANTE, A.Z. Identification and Quantification, by HPLC-DAD-

MS/MS, of Carotenoids and Phenolic Compounds from the Amazonian Fruit

Caryocar villosum. J. Agric. Food Chem. 60, 5884−5892, 2012.

DE ROSSO, V.V.; MERCADANTE, A.Z. Identification and quantification of

carotenoids, by HPLC-PDA-MS/MS, from Amazonian fruits. J. Agric. Food Chem.

55, 5062-5072, 2007.

MAIA, G.C.H.M.; CAMPOS, M.S; BARROS-MONTEIRO, J. et al. Effects of

Astrocaryum aculeatum Meyer (Tucumã) on Diet-Induced Dyslipidemic Rats. J.

Nutr. Metab, 2014 Article ID 202367.

LAVECCHIA, T.; REA, G.; ANTONACCI, A.; GIARDI, M.T. Healthy and adverse effects

of plant-derived functional metabolites: the need of revealing their content and

bioactivity in a complex food matrix. Critical Reviews in Food Science and Nutrition,

53, 198–213, 2013.

MELÉNDEZ-MARTINEZ, A.J.; BRITTON, G.; VICARIO, I.M.; HEREDIA, F.J.

Relationship between the colour and the chemical structure of carotenoid

pigments. Food Chem. 101, 1145-1150, 2007.

RAMOS, M. I. L; Polpa de bocaiúva [Acrocomia aculeata (Jacq.) Lodd.]:composição

química e biodisponibilidade de carotenóides:2007

RODRIGUEZ-AMAYA, DÉLIA B. Fontes brasileiras de carotenóides: tabela brasileira

de composição de carotenóides em alimentos / Délia B. Rodrigues-Amaya, Mieko

Kimura e Jaime Amaya-Farfan [autores]; Lidio Coradin e Vivian Beck Pombo,

Organizadores. – Brasília: MMA/SBF, 100 p. 2008.

SENTANIN, M. A; RODRIGUEZ-AMAYA, D. B. Carotenoid levels in papaya and peach

15

determined by high performance liquid chromatography, Ciênc. Tecnol. Aliment.,

Campinas, 27(1): 13-19, 2007

TAWATA, N; Determinação de carotenoides em alimentos brasileiros in natura

processados e preparados para a tabela nacional de composição de alimentos /

Natalia Tawata. -- Campinas, SP: [s.n.], 2010.

VILLACHICA, H.; CARVALHO, J. E. U.; MÜLLER, C. H.; DIAZ, S. C.; ALMANZA, M.

Frutales y hortalizas promissorios de la Amazonia. Lima: Tratado de Cooperaccion

Amazonica, Secretaria Protempore, 1996.

ZERALK. M. L; YARLWAKE. J. H; Extração de β-caroteno de cenouras: uma proposta

para disciplinas experimentais de química. Quim. Nova, Vol. 31, No. 5, 1259-1262,

2008

10. DIFICULDADES ENCONTRADAS

As dificuldades encontradas durante a realização do projeto neste primeiro

período foram relacionadas ao atraso na entrega dos reagentes necessários para a

extração de carotenoides, a recorrente falta de energia no prédio do Laboratório de

Ciência e Tecnologia de Alimentos da UFPA, e a indisponibilidade de equipamentos

para uso no laboratório devido ao grande fluxo de utilização dos equipamentos

existentes.

11. PARECER DO ORIENTADOR: O discente vem apresentando um bom

amadurecimento técnico-científico durante a execução do trabalho experimental,

além de apresentar excelentes características de convivência e trabalho em equipe.

Além disso, demonstra preocupação e responsabilidade com o andamento e

finalização do projeto. Dessa forma, meu parecer é favorável à continuidade do

bolsista até o final do prazo.

DATA: 24/02/2017.

ASSINATURA DO ORIENTADOR

ASSINATURA DO ALUNO