REMOÇÃO DE HORMÔNIOS SEXUAIS ... - repositorio.bc.ufg.brrepositorio.bc.ufg.br/tede/bitstream/tede/4271/5/Dissertação... · interferentes endócrinos, os hormônios sexuais sintéticos

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

ESCOLA DE ENGENHARIA CIVIL

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA DO MEIO AMBIENTE

RUITER LIMA MORAIS

REMOÇÃO DE HORMÔNIOS SEXUAIS SINTÉTICOS POR

CARBONIZAÇÃO HIDROTERMAL E POR FUNGOS DE

DECOMPOSIÇÃO BRANCA

GOIÂNIA-GO

2012

Termo de Ciência e de Autorização para Disponibilizar as Teses e Dissertações Eletrônicas (TEDE) na Biblioteca Digital da UFG

Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade Federal de Goiás–UFG a

disponibilizar gratuitamente através da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações – BDTD/UFG, sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o documento conforme permissões assinaladas abaixo, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.

1. Identificação do material bibliográfico: [ X ] Dissertação [ ] Tese 2. Identificação da Tese ou Dissertação

Autor: Ruiter Lima Morais

CPF: 003.221.441-32 Email: [email protected]

Seu e-mail pode ser disponibilizado na página? [ X ]Sim [ ] Não

Vínculo Empregatício do autor:

Agência de fomento: Sigla:

País: UF: CNPJ:

Título: Remoção de hormônios sexuais sintéticos por carbonização hidrotermal e por fungos de decomposição branca

Palavras-chave: 1. Hormônios sexuais sintéticos. 2. Carbonização hidrotermal. 3. Fungos de decomposição branca.

Título em outra língua: Removal of synthetic sex hormones by hydrothermal carbonization and fungal decomposition white

Palavras-chave em outra língua: 1. Synthetic Sex Hormones. 2. Hydrothermal Carbonization. 3. White Decomposition Fungal.

Área de concentração: Recursos Hídricos e Saneamento Ambiental

Data da defesa: 29/08/2012

Programa de Pós-Graduação: PPGEMA-UFG

Orientadora: Drª. Mariângela Fontes Santiago


Coorientador: Dr. Joachim Werner Zang


3. Informações de acesso ao documento: Liberação para disponibilização?1 [ ] total [ X ] parcial

O Sistema da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações garante aos autores, que os arquivos contendo eletronicamente as teses e ou dissertações, antes de sua disponibilização, receberão procedimentos de segurança, criptografia (para não permitir cópia e extração de conteúdo, permitindo apenas impressão fraca) usando o padrão do Acrobat. ________________________________ Data: _____/_____/_____ Assinatura do autor 1 Em caso de restrição, esta poderá ser mantida por até um ano a partir da data de defesa. A extensão deste prazo suscita justificativa junto à coordenação do curso. Todo resumo e meta dados ficarão sempre disponibilizados.

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

ESCOLA DE ENGENHARIA CIVIL

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA DO MEIO AMBIENTE

RUITER LIMA MORAIS

REMOÇÃO DE HORMÔNIOS SEXUAIS SINTÉTICOS POR

CARBONIZAÇÃO HIDROTERMAL E POR FUNGOS DE

DECOMPOSIÇÃO BRANCA

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação Stricto

Sensu em Engenharia do Meio Ambiente da Escola de

Engenharia Civil da Universidade Federal de Goiás, como

requisito para obtenção do título de Mestre em Engenharia do

Meio Ambiente.

Área de Concentração: Recursos Hídricos e Saneamento

Ambiental.

Orientadora: Profª. Drª. Mariângela Fontes Santiago.

Coorientador: Prof. Dr. Joachim Werner Zang.

GOIÂNIA-GO

2012

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação na (CIP) GPT/BC/UFG

M827r

Morais, Ruiter Lima.

Remoção de hormônios sexuais sintéticos por carbonização hidrotermal e por fungos de decomposição branca [manuscrito] / Ruiter Lima Morais. – 2012.

xv, 117 f. : il., figs, quads. Orientadora: Profª. Drª. Mariângela Fontes Santiago;

Coorientador: Prof. Dr. Joachim Werner Zang. Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de

Goiás, Escola de Engenharia Civil, 2012. Bibliografia.

Inclui lista de figuras, abreviaturas, siglas e quadros. Apêndices. 1. Hormônios sexuais sintéticos. 2. Carbonização

hidrotermal. 3. Fungos de decomposição branca.

CDU: 577.171.7

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RUITER LIMA MORAIS

REMOÇÃO DE HORMÔNIOS SEXUAIS SINTÉTICOS POR CARBONIZAÇÃO

HIDROTERMAL E POR FUNGOS DE DECOMPOSIÇÃO BRANCA

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Engenharia do Meio Ambiente da Escola de Engenharia Civil da Universidade Federal de Goiás, como requisito para obtenção do título de Mestre em Engenharia do Meio Ambiente, aprovada em 29 de agosto de 2012, pela banca examinadora:

______________________________________________________________ Profª. Drª. Mariângela Fontes Santiago

FF – UFG – Presidente da Banca e Orientadora

______________________________________________________________ Prof. Dr. Alexandre Nunes Ponezi

UNICAMP, Campinas - SP – Examinador Externo

______________________________________________________________ Prof. Dr. Eduardo Queija de Siqueira

EEC – UFG – Examinador Interno

______________________________________________________________ Prof. Dr. Joachim Werner Zang

IFG – Membro da Banca e Coorientador

iv

DEDICATÓRIA

À Deus, à minha família e a todos que de forma direta ou indireta contribuíram

para o desenvolvimento deste trabalho.

v

AGRADECIMENTOS

À Profª. Drª. Mariângela Fontes Santiago meu agradecimento especial pela oportunidade,

orientação e desenvolvimento deste trabalho, e também pela confiança e por acreditar e apoiar

minhas ideias. Ao Prof. Dr. Joachim Werner Zang pela co-orientação, dedicação e

entusiasmo. Deixo aqui registrado de forma muito carinhosa minha admiração pessoal e

profissional por vocês.

À Universidade Federal de Goiás pela oportunidade.

À minha mãe por toda preocupação e paciência. Ao meu pai pela dignidade, caráter, esforço e

trabalho. À minha querida vovó por todas as orações. À minha irmã pelo apoio, admiração e

paciência.

À todos os familiares que de alguma forma me ajudaram a concluir mais um dos meus

inúmeros objetivos.

Aos colegas de mestrado, em especial à Yara pelas ideias, oportunidades e entusiasmo. Aos

colegas de trabalho, em especial: Danillo Fernando, Leonardo Becker, Valquíria, Olívia,

Michele, Werslândia. Aos colegas de pesquisa Jhéssica e Stefan, em especial ao Eurico, por

toda a ajuda e à Luane por toda confiança, companheirismo e boas risadas no Laboratório de

Enzimologia e Biocatálise Ambiental – FF - UFG. À Dra. Marize Campos e a técnica

Rosineide.

À Cifarma, em especial à Dona Sônia Braga, pela confiança e oportunidade de crescimento

profissional.

Ao Adriano dos Reis e Silva por toda admiração, força, entusiasmo, carinho e paciência.

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MORAIS, R. L. Remoção de Hormônios Sexuais Sintéticos por Carbonização Hidrotermal e por Fungos de Decomposição Branca. Dissertação de Mestrado. Engenharia de Meio Ambiente – Escola de Engenharia Civil, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 2012. 117p.

RESUMO

A contaminação de águas e esgotos com interferentes endócrinos proveniente de lançamentos domésticos e industriais tem sido comprovada em diversas regiões do planeta. Entre os interferentes endócrinos, os hormônios sexuais sintéticos causam grande preocupação, pois a presença de anéis fenólicos nas suas estruturas, os tornam estáveis e recalcitrantes no meio ambiente. Em Goiás, a presença do hormônio sexual sintético Etinilestradiol em concentrações de µg.L-1 no Rio Meia Ponte, que corta a região metropolitana de Goiânia, foi confirmada recentemente. Estudos mostraram que concentrações de ng.L-1 podem afetar a diferenciação sexual e causar sérios danos ao sistema reprodutor em peixes e humanos. Existem, ainda, poucas técnicas comprovadamente eficazes na remoção desse tipo de substância. O objetivo desta pesquisa foi avaliar a remoção dos hormônios sexuais sintéticos Etinilestradiol, Gestodeno e Acetato de Ciproterona através do processo de carbonização hidrotermal e por enzimas oxidativas produzidas pelos fungos de decomposição branca Pycnoporus sanguineus e Trametes villosa. Para tanto, foram preparadas soluções, individuais e em mistura, com concentração de 1,0 µg.mL-1 e correção de pH para a faixa de 2-3, com soluções de ácido fosfórico ou ácido cítrico, para o tratamento com carbonização hidrotermal. Para o tratamento com os fungos, em meio de cultura líquido e sob a condição de agitação, foi preparada uma solução contendo os três hormônios (Etinilestradiol, Acetato de Ciproterona e Gestodeno) em concentração de 0,333 µg.mL-1. O tratamento pelo processo de carbonização hidrotermal dos três hormônios com correção de pH feita com ácido fosfórico e tempo de reação de 90 minutos apresentou resultados satisfatórios de remoção do Etinilestradiol e do Gestodeno, acima de 90%. Já nos tratamentos individuais, a remoção alcançada foi maior que 99% para os três hormônios. O tratamento biológico com Pycnoporus sanguineus e Trametes villosa apresentou resultados significativos de remoção dos hormônios Etinilestradiol e Acetato de Ciproterona, acima de 99% e 78,9% para o Gestodeno, para ambos os fungos. Foi possível notar ainda que a presença dos hormônios aumentou a produção enzimática de Lacase, com pico de produção antecipado para o fungo Pycnoporus sanguineus. No teste de toxicidade com Artemia salina observou-se que a solução com os três hormônios após o tratamento com carbonização hidrotermal apresentou menor número de larvas mortas de Artemia salina, do que a solução com os hormônios sem tratamento. No teste de germinação de sementes de Allium cepa, a solução de hormônios tratada com carbonização hidrotermal apresentou a mesma taxa de germinação do Grupo Controle, no entanto, menor vigor dos brotos. Assim como o Grupo Controle, a solução com os três hormônios do antes do tratamento e que após o tratamento biológico, a 9,09% de concentração, não apresentaram mortalidade de larvas de Artemia salina. Esses resultados mostram que tanto o processo de carbonização hidrotermal quanto o fúngico com Pycnoporus sanguineus e Trametes villosa, apresentam potencial para futuras aplicações de remoção de hormônios sexuais sintéticos de águas e efluentes contaminados. Palavras–chave: Hormônios Sexuais Sintéticos, Carbonização Hidrotermal, Fungos de Decomposição Branca.

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MORAIS, R. L. Removal of Synthetic Sex Hormones by Hydrothermal Carbonization and Fungal Decomposition White. Master Dissertation. Environmental Engineering - Civil Engineering School, Federal University of Goiás, Goiânia, 2012. 117p.

ABSTRACT

Contaminations of water and wastewater with endocrine disrupters from domestic and industrial discharges have been proven in several regions of the planet. Among the endocrine disruptors, the synthetic sex hormones cause great concern because the presence of phenolic rings in their structures makes them stable and recalcitrant in the environment. In Goiás, the presence of synthetic sex hormone concentrations of ethinylestradiol in mg.L-1 in the Meia Ponte River, which goes accross the metropolitan area of Goiânia, was recently confirmed. Studies have shown that concentrations of ng.L-1 can affect sexual differentiation and cause serious damage to the reproductive system in fish and humans. Further, there are few techniques that are proven of being effective on removing this type of substance. The aim of this study was to evaluate the removal of synthetic sex hormones ethinylestradiol, gestodene, and cyproterone acetate by the hydrothermal carbonization process and biological treatment with fungi decomposing white Pycnoporus sanguineus and Trametes villosa. For this purpose, solutions were prepared, individually and in combination with a concentration of 1,0 µg.mL-1 and pH correction into the range of 2-3 with solutions of phosphoric acid or citric acid for treatment with hydrothermal carbonization. For the treatment with the fungus in liquid culture medium and under the condition of stirring, a solution was prepared containing all three hormones (ethinyl estradiol, cyproterone acetate and gestodene) in concentrations of 0,333 µg.mL-1. The carbonization treatments by the process of hydrothermal three hormones with pH correction made with phosphoric acid and reaction time of 90 minutes showed satisfactory removal of Ethinylestradiol and Gestodene, above 90%. Already in the individual treatments, removal achieved was higher than 99% for all three hormones. The biological treatment with Pycnoporus sanguineus and Trametes villosa show significant removal of hormones and cyproterone acetate Ethinylestradiol above 99% and 78.9% for Gestodene for both fungi. It was possible to notice that the presence of hormones increased the enzymatic production of laccase, with peak production anticipated for the fungus Pycnoporus sanguineus. The toxicity test with Artemia salina was observed that the solution with the three hormones after carbonization hydrothermal treatment had fewer dead larvae of Artemia salina, than the solution with hormones without treatment. In test germination of Allium cepa, the solution treated with hormones hydrothermal carbonization showed the same germination rate of the control group, however, less vigor of the shoots. As the control group, the solution to the three hormones before treatment and after biological treatment, the 9.09% concentration, showed no mortality of larvae of Artemia salina. These results show that both the hydrothermal carbonization process as with the fungus Pycnoporus sanguineus and Trametes villosa, show potential for future applications of synthetic sex hormones removal of contaminated waters and effluents. Key–Words: Synthetic Sex Hormones, Hydrothermal Carbonization, White Decomposition Fungal.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 01: Estrutura química básica dos esteróides....................................................... 7

Figura 02: Estrutura química do Gestodeno e da impureza 5487RC10 (álcool vinílico), formada após exposição à condição de estresse em meio ácido... 18

Figura 03: Possíveis rotas de fármacos no meio ambiente............................................ 20

Figura 04: Imagem do Reator de Carbonização Hidrotermal em Valência, Espanha... 28

Figura 05: Comparação de diferentes energias e esquemas de transformação do carbono a partir de carboidratos, baseada na energia de combustão armazenada e na eficiência de transformação do carbono (CE)................... 29

Figura 06: Imagem do Pycnoporus sanguineus em seu habitat natural......................... 32

Figura 07: Imagem do Trametes villosa em seu habitat natural.................................... 32

Figura 08: Artemia salina............................................................................................... 37

Figura 09: Sistema de CHT em funcionamento............................................................. 42

Figura 10: Vista frontal e lateral do reator de CHT montado (recipiente + tampa)....... 42

Figura 11: Vista superior da tampa, do recipiente e dos acessórios (anel de vedação, parafusos e chave) do reator de CHT........................................................... 43

Figura 12: Desenho com as dimensões do recipiente do reator de CHT em cm (corte e planta)........................................................................................................ 43

Figura 13: Desenho com as dimensões da tampa do reator de CHT em cm (corte e planta)........................................................................................................... 44

Figura 14: Cuba para eclosão dos ovos de Artemia salina............................................ 54

Figura 15: Placa de Petri contendo 100 sementes de Allium cepa para o experimento de toxicidade................................................................................................. 55

Figura 16: Cromatograma de Etinilestradiol antes o tratamento por carbonização hidrotermal.................................................................................................... 57

Figura 17: Cromatograma de Etinilestradiol após o tratamento por carbonização hidrotermal.................................................................................................... 57

Figura 18: Aspecto da solução antes e depois do tratamento de carbonização hidrotermal. .................................................................................................. 58

Figura 19: Aspecto das soluções efluentes do Experimento Nº. 02 após passarem por tratamento de CHT. ..................................................................................... 59

Figura 20: Aspecto das soluções efluentes do Experimento Nº. 04 após passarem por tratamento com o reator de CHT. ................................................................ 60

Figura 21: Comportamento de temperatura das amostras Nº. 01, 02, 03, 04, 05 e 06 durante do Experimento Nº. 04 com o reato de CHT (valores médios)....... 61

Figura 22: Comportamento de temperatura das amostras Nº. 01, 02, 03, 04, 05 e 06 durante do Experimento Nº. 04 com o reator de CHT (valores médios)...... 61

Figura 23: Reator de CHT e acessórios utilizados durante o Experimento Nº. 01. ...... 62

ix

Figura 24: Aspecto das soluções de Etinilestradiol do Experimento Nº. 05, após passarem por tratamento de CHT. ............................................................... 64

Figura 25: Aspecto das soluções com Gestodeno do Experimento Nº. 06, após passarem por tratamento de CHT. ............................................................... 64

Figura 26: Aspecto das soluções com Acetato de Ciproterona do Experimento Nº. 07, após passarem por tratamento de CHT. ................................................. 64

Figura 27: Gráfico da produção enzimática de Lacase durante o tratamento dos hormônios com T. villosa (valores médios com desvio padrão). ................ 66

Figura 28: Desenvolvimento em meio líquido de T. villosa no 7º dia. A: Grupo Controle; B: Grupo com Hormônios. .......................................................... 66



Figura 31: Gráfico da produção enzimática de Lacase durante o tratamento com P. saguineus (valores médios com desvio padrão). ......................................... 68

Figura 32: Desenvolvimento em meio líquido de P. sanguineus no 7º dia. A: Grupo Controle; B: Grupo com Hormônios. .......................................................... 68



Figura 35: Cromatograma da solução padrão de Etinilestradiol, Gestodeno e Acetato de Ciproterona. ............................................................................................ 71

Figura 36: Cromatograma da solução com Etinilestradiol, Gestodeno e Acetato de Ciproterona após tratamento com T. villosa. ............................................... 71

Figura 37: Cromatograma da solução de Etinilestradiol, Gestodeno e Acetato de Ciproterona após tratamento com P sanguineus. ........................................ 72

Figura 38: Germinação das sementes de Allium cepa. .................................................. 73

Figura 39: Placa de Petri contendo as sementes de Allium cepa após germinação com água mineral (Controle). ...................................................................... 74

Figura 40: Placas de Petri contendo as sementes de Allium cepa após germinação com solução contendo os três hormônios antes e após o tratamento com CHT (antes do tratamento à esquerda e após o tratamento à direita)........... 75

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APÊNDICE A – LISTA DE FIGURAS

Figura A - 01: Cromatograma da solução padrão de Etinilestradiol + Gestodeno + Acetato de Ciproterona utilizada no Experimento Nº. 02. ..................... 94

Figura A - 02: Cromatograma da solução de Etinilestradiol + Gestodeno + Acetato de Ciproterona após tratamento de CHT utilizada no Experimento Nº. 02 – Amostra Nº. 02. ................................................................................... 95

Figura A - 03: Cromatograma da solução de Etinilestradiol + Gestodeno + Acetato de Ciproterona após tratamento de CHT utilizada no Experimento Nº. 02 – Amostra Nº. 03. ................................................................................... 96

Figura A - 04: Cromatograma da solução padrão de Etinilestradiol + Gestodeno + Acetato de Ciproterona utilizada no Experimento Nº. 04. ..................... 99

Figura A - 05: Cromatograma da solução de Etinilestradiol + Gestodeno + Acetato de Ciproterona após tratamento de CHT utilizada no Experimento Nº. 04 – Amostras Nº. 04, 05 e 06. .................................................................... 100

Figura A – 06: Cromatograma da solução padrão de Etinilestradiol utilizada no Experimento Nº. 05. ............................................................................... 104

Figura A - 07: Cromatograma da solução de Etinilestradiol após tratamento de CHT utilizada no Experimento Nº. 05 – Amostras Nº. 01, 02 e 03. ............... 105

Figura A - 08: Cromatograma da solução padrão de Gestodeno utilizada no Experimento Nº. 06. ............................................................................... 107

Figura A - 09: Cromatograma da solução de Gestodeno após tratamento de CHT utilizada no Experimento Nº. 06 – Amostras Nº. 01, 02 e 03. ............... 108

Figura A - 10: Cromatograma da solução padrão de Acetato de Ciproterona utilizada no Experimento Nº. 07. .......................................................................... 110

Figura A - 11: Cromatograma da solução de Acetato de Ciproterona após tratamento de CHT (Experimento Nº. 07 – Amostras Nº. 01, 02 e 03). ................... 111

APÊNDICE B – LISTA DE FIGURAS

Figura B - 01: Cromatograma da solução padrão de Etinilestradiol + Gestodeno + Acetato de Ciproterona utilizada nos experimentos com P. saguineus e T. villosa. ................................................................................................. 115

Figura B - 02: Cromatograma da solução de Etinilestradiol + Gestodeno + Acetato de Ciproterona após tratamento com P. saguineus. ..................................... 116

Figura B - 03: Cromatograma da solução de Etinilestradiol + Gestodeno + Acetato de Ciproterona após tratamento com T. villosa. .......................................... 117

xi

LISTA DE QUADROS

Quadro 01: Características físico-químicas do Etinilestradiol, do Acetato de Ciproterona e do Gestodeno. .................................................................... 11

Quadro 02: Dados do estudo de estabilidade de longa duração e acelerada do Etinilestradiol. ........................................................................................... 13

Quadro 03: Dados do comportamento do Etinilestradiol quando exposto aos testes de estresse. ................................................................................................ 14

Quadro 04: Fórmula estrutural e/ou nome IUPAC de algumas impurezas e possíveis produtos de degradação do Etinilestradiol. ............................................... 15

Quadro 05: Dados do estudo de estabilidade de longa duração e acelerada do Acetato de Ciproterona. ............................................................................ 16

Quadro 06: Dados do comportamento do Acetato de Ciproterona quando exposto a situações de estresse. ................................................................................ 16

Quadro 07: Fórmula estrutural e nome IUPAC de algumas impurezas e possíveis produtos de degradação do Acetato de Ciproterona. ................................ 17

Quadro 08: Dados do estudo de estabilidade e estabilidade acelerada do Gestodeno.. 18

Quadro 09: Dados do comportamento do Gestodeno quando exposto a situações de estresse. ..................................................................................................... 18

Quadro 10: Fórmula estrutural e/ou nome IUPAC de algumas impurezas e possíveis produtos de degradação do Gestodeno. .................................................... 19

Quadro 11: Condições do experimento realizado para avaliação do potencial do reator de carbonização hidrotermal na degradação de hormônios sexuais sintéticos. .................................................................................................. 45

Quadro 12: Condições dos experimentos realizados com o reator de carbonização hidrotermal para degradação dos hormônios Etinilestradiol, Gestodeno e Acetato de Ciproterona (juntos em solução). ......................................... 46

Quadro 13: Condições dos experimentos realizados com o reator de carbonização hidrotermal para degradação dos hormônios Etinilestradiol, Gestodeno e Acetato de Ciproterona (soluções individuais). ..................................... 47

Quadro 14: Meios de cultura utilizados nos experimentos biológicos. ....................... 50

Quadro 15: Experimentos realizados com Pycnoporus sanguineus e Trametes villosa na presença dos hormônios sintéticos: Acetato de Ciproterona, Etinilestradiol e Gestodeno. ...................................................................... 51

Quadro 16: Valores médios de degradação e concentração resultante (ng.mL-1) dos hormônios Etinilestradiol, Gestodeno e Acetato de Ciproterona após experimentos de degradação com carbonização hidrotermal. .................. 58

Quadro 17: Produção de Lacase (U.mL-1) na presença e na ausência (controle) dos hormônios Etinilestradiol, Gestodeno e Acetato de Ciproterona. ............ 65

Quadro 18: Valores médios de degradação e concentração resultante (ng.mL-1) dos hormônios Etinilestradiol, Gestodeno e Acetato de Ciproterona após 69

xii

tratamento com P. sanguineus e T. villosa. ..............................................

Quadro 19: Toxicidade com Artemia salina para o tratamento com CHT. ................. 76

Quadro 20: Toxicidade de Artemia salina para o tratamento biológico. ..................... 77

APÊNDICE A – LISTA DE QUADROS

Quadro A - 01: Resultado do cromatograma da solução padrão de Etinilestradiol + Gestodeno + Acetato de Ciproterona utilizada no Experimento Nº. 02. ......................................................................................................... 94

Quadro A - 02: Resultado do cromatograma da solução de Etinilestradiol + Gestodeno + Acetato de Ciproterona após tratamento de CHT utilizada no Experimento Nº. 02 – Amostra Nº. 02. ............................ 95

Quadro A - 03: Resultado do cromatograma da solução de Etinilestradiol + Gestodeno + Acetato de Ciproterona após tratamento de CHT utilizada no Experimento Nº. 02 – Amostra Nº. 03. ............................ 96

Quadro A - 04: Comparativo dos resultados médios das Amostras Nº. 02 e Nº. 03 utilizadas no Experimento Nº. 02. ....................................................... 97

Quadro A - 05: Dados do comportamento da temperatura das Amostras Nº. 01, 02 e 03 do Experimento Nº. 02, durante o processo de CHT. ..................... 97

Quadro A - 06: Dados do comportamento da pressão das Amostras Nº. 01, 02 e 03 do Experimento Nº. 02, durante o processo de CHT. .......................... 98

Quadro A - 07: Resultado do cromatograma da solução padrão de Etinilestradiol + Gestodeno + Acetato de Ciproterona utilizada no Experimento Nº. 04. ......................................................................................................... 99

Quadro A - 08: Resultado do cromatograma da solução de Etinilestradiol + Gestodeno + Acetato de Ciproterona após tratamento de CHT utilizada no Experimento Nº. 04 – Amostras Nº. 04, 05 e 06. ............. 100

Quadro A - 09: Dados do comportamento da temperatura das Amostras Nº. 01, 02, 03, 04, 05 e 06 do Experimento Nº. 02, durante o processo de CHT. . 101

Quadro A - 10: Dados do comportamento da pressão das Amostras Nº. 01, 02, 03, 04, 05 e 06 do Experimento Nº. 04, durante o processo de CHT. ....... 102

Quadro A - 11: Quantidade de sementes de Allium cepa germinadas durante o experimento de toxicidade com solução de Etinilestradiol + Gestodeno + Acetato de Ciproterona, antes e após* o tratamento com CHT. ..................................................................................................... 103

Quadro A - 12: Quantidade de náuplios vivos de Artemia salina durante o experimento de toxicidade com solução padrão de Etinilestradiol, Gestodeno e Acetato de Ciproterona. .................................................. 103

Quadro A - 13: Quantidade de larvas vivas de Artemia salina durante o experimento de toxicidade com solução de Etinilestradiol + Gestodeno + Acetato de Ciproterona após* o tratamento com o reator de CHT. .................. 103

xiii

Quadro A - 14: Resultado do cromatograma da solução padrão de Etinilestradiol, utilizada no Experimento Nº. 05. ......................................................... 104

Quadro A - 15: Resultado do cromatograma da solução de Etinilestradiol após tratamento de CHT utilizada no Experimento Nº. 05 – Amostras Nº. 01, 02 e 03. ........................................................................................... 105

Quadro A - 16: Dados do comportamento da temperatura e da pressão das Amostras Nº. 01, 02 e 03 do Experimento Nº. 05, durante o processo de CHT. . 106

Quadro A - 17: Resultado do cromatograma da solução padrão de Gestodeno utilizada no Experimento Nº. 06. ......................................................... 107

Quadro A - 18: Resultado do cromatograma da solução de Gestodeno após tratamento de CHT utilizada no Experimento Nº. 06 – Amostras Nº. 01, 02 e 03. ........................................................................................... 108


Quadro A - 20: Resultado do cromatograma da solução padrão de Acetato de Ciproterona, utilizada no Experimento Nº. 07. .................................... 110

Quadro A - 21: Resultado do cromatograma da solução de Acetato de Ciproterona após tratamento de CHT (Experimento Nº. 07 – Amostras Nº. 01, 02 e 03). .................................................................................................... 111


APÊNDICE B – LISTA DE QUADROS

Quadro B - 01: Atividade Enzimática de Lacase do Pycnoporus saguineus e Trametes villosa no Grupo Controle. ................................................... 114

Quadro B - 02: Atividade Enzimática de Lacase do Pycnoporus saguineus e do Trametes villosa no Grupo com Hormônios (Etinilestradiol, Gestodeno e Acetato de Ciproterona). ................................................. 114

Quadro B - 03: Resultado do cromatograma da solução padrão de Etinilestradiol + Gestodeno + Acetato de Ciproterona, utilizada nos experimentos com P. saguineus e T. villosa. .............................................................. 115

Quadro B - 04: Resultado do cromatograma da solução de Etinilestradiol + Gestodeno + Acetato de Ciproterona após tratamento com P. saguineus. ............................................................................................. 116

Quadro B - 05: Resultado do cromatograma da solução padrão de Etinilestradiol + Gestodeno + Acetato de Ciproterona após tratamento com T. villosa.. 117

xiv

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AC Acetato de Ciproterona ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária BGA Batata, Glicose e Agar CAS Chemical Abstracts Service CHT Carbonização Hidrotermal CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência CONAMA Conselho Nacional do Meio Ambiente DAD Detector de Arranjos de Diodo DDE Dichloro-Diphenyldichloro- Ethylene DDT Dicloro-Difenil-Tricloroetano EE2 Etinilestradiol EPI Equipamento de Proteção Individual ETA Estação de Tratamento de Água ETE Estação de Tratamento de Efluente FF Faculdade de Farmácia GTD Gestodeno HPLC High-performance Liquid Chromatography IE Interferente Endócrino IFG Instituto Federal de Goiás IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry LCC Lacase LD Limite de Detecção LQ Limite de Quantificação pH Potencial Hidrogeniônico PPB Parte por Bilhão PPM Parte por Milhão PPT Parte por Trilhão RE Resolução rpm Rotação por Minuto T Temperatura UFG Universidade Federal de Goiás UR Umidade Relativa USP United States Phamacopeia UV Ultravioleta WWF World Wilde Found

xv

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................................. 1

2 JUSTIFICATIVA .......................................................................................................................... 2

3 OBJETIVOS .................................................................................................................................. 4

3.1 OBJETIVO GERAL .................................................................................................... 4

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...................................................................................... 4

4 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ..................................................................................................... 5

4.1 SISTEMA ENDÓCRINO ............................................................................................ 5

4.2 INTERFERENTES ENDÓCRINOS ........................................................................... 5

4.2.1 Estrogênios ........................................................................................................... 7

4.2.1.1 Etinilestradiol (EE2) .............................................................................................. 8

4.2.2 Progestagênios ...................................................................................................... 9

4.2.2.1 Acetato de Ciproterona (AC) ................................................................................ 9

4.2.2.2 Gestodeno (GTD) ............................................................................................... 10

4.2.3 Características Físico-Químicas dos Hormônios Sexuais Sintéticos ................. 10

4.2.4 Estabilidade dos Hormônios Sexuais Sintéticos ................................................. 11

4.2.4.1 Etinilestradiol ..................................................................................................... 13

4.2.4.2 Acetato de Ciproterona ....................................................................................... 16

4.2.4.3 Gestodeno ........................................................................................................... 17

4.3 CONTAMINAÇÃO AMBIENTAL .......................................................................... 20

4.3.1 Efeitos na Vida Animal e na Saúde Humana ..................................................... 22

4.4 TRATAMENTO DE ÁGUA E ESGOTO ................................................................. 23

4.4.1 Degradação de Interferentes Endócrinos ............................................................ 24

4.5 CARBONIZAÇÃO HIDROTERMAL ...................................................................... 26

4.6 POTENCIAL DOS MICRORGANISMOS NA BIORREMEDIAÇÃO ................... 30

4.6.1 Fungos de Decomposição branca ....................................................................... 32

4.6.1.1 A Enzima Fúngica Lacase (Lcc) ........................................................................ 33

4.7 ANÁLISE DAS ESPÉCIES QUÍMICAS .................................................................. 35

4.8 EXPERIMENTOS COM ORGANISMOS-TESTE .................................................. 36

4.8.1 Allium cepa ......................................................................................................... 36

4.8.2 Artemia salina .................................................................................................... 36

5 MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................................ 39

xvi

5.1 HORMÔNIOS SEXUAIS SINTÉTICOS ................................................................. 39

5.1.1 Soluções dos Hormônios Sexuais Sintéticos ...................................................... 40

5.2 PROCESSO DE CARBONIZAÇÃO HIDROTERMAL .......................................... 41

5.3 CROMATÓGRAFO LÍQUIDO DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE) ......................... 47

5.3.1 Quantificação e Detecção dos Hormônios.......................................................... 48

5.4 TRATAMENTO BIOLÓGICO ................................................................................. 49

5.4.1 Microrganismos .................................................................................................. 49

5.4.2 Meio de Cultura .................................................................................................. 49

5.4.3 Manutenção dos Microrganismos ....................................................................... 50

5.4.3.1 Tratamento dos hormônios em meio de cultura líquido ..................................... 50

5.4.4 Determinação da Atividade Enzimática ............................................................. 52


5.5.1 Artemia salina .................................................................................................... 53

5.5.2 Allium cepa ......................................................................................................... 54

6 RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................................................. 56

6.1 EXPERIMENTOS COM CARBONIZAÇÃO HIDROTERMAL ............................ 56

6.1.1 Amostras individuais de Etinilestradiol, Gestodeno e Acetato de Ciproterona . 63

6.2 TRATAMENTO BIOLÓGICO COM P. SANGUINEUS E T. VILLOSA .............. 65

6.2.1 Trametes villosa .................................................................................................. 65

6.2.2 Pycnoporus sanguineus ...................................................................................... 67

6.2.3 Análise dos Hormônios Após o Tratamento Biológico ...................................... 69


6.3.1 Allium cepa ......................................................................................................... 73

6.3.2 Artemia salina .................................................................................................... 75

7 CONCLUSÕES E RECOMENDAÇÕES ................................................................................. 78

8 REFERÊNCIAS .......................................................................................................................... 82

1

1 INTRODUÇÃO

O desenvolvimento industrial ocorreu de forma acelerada a partir da revolução

industrial. À partir deste período, a poluição ambiental causada pelo homem aumentou e de

modo descontrolado, de forma que a relação entre o homem e o seu meio ambiente se

modificou. Existem atualmente mais de 46 milhões de produtos e substâncias produzidas

industrialmente, sendo os dejetos e as emissões no meio ambiente igualmente

diversificados, que necessitam de tratamento específico.

Um dos campos mais proeminentes da área ambiental é o estudo de

micropoluentes orgânicos presentes em ambientes aquáticos. Recentemente, estudos

mostraram mudanças na reprodução de animais e humanos, possivelmente devido à

presença de alguns micropoluentes específicos (interferentes endócrinos) em águas

superficiais e subterrâneas (FERREIRA, 2008).

Substâncias sintéticas com ação desreguladora são geralmente persistentes no

ambiente, acumulam-se no solo e nos sedimentos, são transportadas para outras regiões

pela atmosfera e podem acumular-se ao longo da cadeia trófica, expondo os animais

superiores a riscos. Várias destas substâncias podem ser excretadas por meio do leite

materno, como por exemplo constituindo-se, assim, uma fonte de contaminação para

recém-nascidos (MEYER et al., 1999).

O esgoto municipal é a principal fonte de interferentes endócrinos no meio

ambiente. Consequentemente, técnicas eficientes de tratamentos devem ser desenvolvidas

para prevenir a propagação desse tipo de poluição (FERREIRA, 2008), principalmente em

fontes geradoras como indústrias de medicamentos, cosméticos, produtos de limpeza, etc.

O principal fator que influencia a remoção de poluentes presentes em amostras

aquosas é a habilidade dos poluentes em interagir com partículas sólidas, naturais (lodo,

sedimentos ou microrganismos) ou adicionadas ao meio (carvão ativo ou coagulantes),

pois isto facilita a remoção por processos físico–químicos (coagulação) ou processos

biológicos (Ex. biodegradação) (CARBALLA et al., 2004).

Processos como a oxidação por complexo enzimático produzido a partir de

microrganismos têm se mostrado bastante promissor na degradação de micropoluentes

presentes em amostras ambientais (JARDIM, 2010) e novas tecnologias como a

carbonização hidrotermal, necessitam ser melhor estudadas, pois podem apresentar grande

potencial na tratabilidade de interferentes endócrinos como hormônios sintéticos.

2

2 JUSTIFICATIVA

Diversos compostos orgânicos presentes em corpos d`àgua, embora não

contemplados na legislação ambiental brasileira, como os hormônios sexuais sintéticos,

necessitam ser melhor estudados por apresentarem a capacidade de perturbar o sistema

endócrino e inibir ou alterar as funções regulares dos sistemas imunológicos e nervoso

central.

Uma das principais razões para que haja uma preocupação sobre este tema está

nos possíveis efeitos dos interferentes endócrinos na saúde humana e no meio ambiente,

incluindo várias espécies animais. Substâncias químicas suspeitas de causar alteração no

sistema endócrino estão potencialmente associadas a várias doenças, como o câncer de

testículo, de mama e de próstata, à queda da taxa de espermatozóides, deformidades dos

órgãos reprodutivos, disfunção da tireóide e alterações relacionadas com o sistema

neurológico (GHISELLI e JARDIM, 2007).

No Brasil, as Estações de Tratamento de Água (ETAs) e de Efluentes (ETEs)

não têm por rotina detectar a presença de fármacos, como hormônios, apesar de estudos

como o de Portuguez (2012) em Goiânia – GO; de Guimarães (2008) em São Carlos – SP;

de Torres em Piracicaba – SP de Raimundo (2007) em Campinas – SP, terem confirmado a

presença de hormônios sexuais naturais e/ou sintéticos em águas superficiais locais. Tal

fato pode ser explicado pela falta de cobrança dos órgãos de fiscalização, que ainda não

estabeleceram os valores máximos para lançamento dessas substâncias nos corpos hídricos.

Os hormônios sexuais, excretados através da urina e fezes de humanos e de

outros animais, ou provenientes de industriais, preocupam os sanitaristas porque o

lançamento de efluentes in natura ou tratados são as principais vias de contaminação do

ambiente aquático quer pelo déficit de infraestrutura em saneamento, quer pela não

eficiência tecnológica e/ou operacional das estações de tratamento de água ou de efluentes

em remover esses hormônios (GUIMARÃES, 2008).

Segundo Fernandes (2008) existe em nível mundial, um número reduzido de

grupos de pesquisa estudando a remoção dos diferentes grupos de fármacos presentes no

esgoto e em águas de abastecimento, sendo a aquisição de dados intrínsecos às condições e

realidade brasileiras de vital importância na formação de base para futuras soluções

dedicadas ao problema.

3

Entre as tecnologias que se mostram promissoras na degradação de fármacos,

como hormônios sexuais sintéticos estão a biorremediação por meio de microrganismos

como fungos de decomposição branca e a carbonização hidrotermal.

Originalmente utilizada na produção de carvão a partir de biomassa, a

carbonização hidrotermal tem encontrado inúmeras aplicações como tecnologia limpa na

transformação de resíduos orgânicos em forma renováveis de energia, condicionadores de

solo, e fertilizantes, entre outras. As peculiaridades desse processo, principalmente por não

utiliza elevadas temperaturas e pressões (FRAUNHOFER, 2011), levantaram a hipótese de

que também poderia ser utilizado na remoção e/ou na degradação de químicos tóxicos e

interferentes endócrinos presentes em águas e efluentes.

Os Fungos de decomposição branca apresentam capacidade degradativa de

compostos químicos orgânicos, por meio das suas enzimas lignolíticas, como a Lacase e as

Peroxidases (Manganês e Lignina Peroxidase), uma vez que a degradação de certos

compostos tóxicos pelo complexo enzimático se deve à utilização de elementos como

carbono e nitrogênio presentes em compostos como fontes nutricionais primárias

(JARDIM, 2010). Utilizar o potencial remediador das enzimas fúngicas para reduzir ou até

mesmo remover a toxicidade de substâncias como os hormônios sexuais sintéticos, pode

ser uma tecnologia vantajosa em relação às existentes, uma vez que esses microrganismos

fazem parte da biodiversidade brasileira e são de fácil manipulação e reprodução.

O presente trabalho é justificado pela comprovação da contaminação de águas

superficiais e subterrâneas com hormônios sexuais sintéticos em diversos países, inclusive

o Brasil, pela dificuldade de remoção desses compostos em efluentes industriais, esgotos e

águas de abastecimento e pela carência de estudos de remoção desses compostos pelo

processo de carbonização hidrotermal e por fungos de decomposição branca.

4

3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar a eficiência do processo de carbonização hidrotermal e de enzimas

oxidativas produzidas pelos fungos de decomposição branca Pycnoporus sanguineus e

Trametes villosa na degradação dos hormônios sexuais sintéticos: Acetato de Ciproterona,

Etinilestradiol e Gestodeno, para futuras aplicações de descontaminação de águas e

efluentes.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Avaliar dentro das condições de trabalho o potencial de um sistema de

carbonização hidrotermal no tratamento dos hormônios sexuais sintéticos

selecionados e determinar quais as condições de temperatura e pressão no

tratamento desses hormônios;

• Avaliar o potencial das espécies de fungo de decomposição branca

Pycnoporus sanguineus e Trametes villosa, na condição de cultivo em

meio líquido, na biorremediação dos hormônios sexuais sintéticos:

Etinilestradiol, Acetato de Ciproterona e Gestodeno;

• Avaliar a eficiência da enzima Lacase (Lcc), produzida pelos fungos na

degradação dos hormônios sexuais sintéticos selecionados.

• Avaliar o potencial de germinação de sementes de Allium cepa quando

expostas ao efluente hormonal antes e após o tratamento por

carbonização hidrotermal;

• Realizar teste de toxicidade do efluente pós-tratamento fúngico e

carbonização hidrotermal com larvas de Artemia salina.

5

4 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

4.1 SISTEMA ENDÓCRINO

O sistema endócrino é um mecanismo complexo que coordena e regula a

comunicação entre as células, constituído por combinações de glândulas e hormônios,

sendo responsável pelas funções biológicas, como reprodução, desenvolvimento

embrionário, crescimento e metabolismo (REIS FILHO, 2006).

Hormônios são mensageiros químicos que respondem pela comunicação entre

diferentes tipos de células, as quais identificam os hormônios através de receptores que são

estruturas proteicas especializadas em reconhecimento molecular. Depois da aproximação

e interação (hormônio-receptor) ocorre uma série de reações bioquímicas, levando a

respostas biológicas específicas, entre elas a atividade de órgãos completos, os níveis de

sais, açúcares e líquidos no sangue, o uso e armazenamento de energia, o crescimento e

desenvolvimento de um determinado organismo, sua reprodução, suas características

sexuais, etc. Por exemplo, na falta dos hormônios sexuais, não haveria desenvolvimento

sexual, e as funções sexuais se tornariam ausentes (REIS FILHO, 2006; GHISELLI, 2006;

GUYTON, 2002).

4.2 INTERFERENTES ENDÓCRINOS

Alguns pesquisadores definem um interferente endócrino (IE) com base nos

seus efeitos, ou seja, trata-se de uma substância química que, mesmo presente em

concentração baixa, é capaz de interferir no funcionamento natural do sistema endócrino

(GHISELLI e JARDIM, 2007), comprometendo, desta forma, os processos reprodutivos,

de desenvolvimento e de manutenção da homeostase celular (SADIK e WITT, 1999).

A Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos (USEPA) alternativamente

define os interferentes endócrinos como sendo agentes químicos que conduzem a

resultados tóxicos como vários tipos de câncer e a uma vasta gama de efeitos adversos no

sistema reprodutivo (KAVLOCK et al., 1996).

De acordo com Markey et al. (2003) e World Wild Found (WWF, 2000), os

prováveis mecanismos de ação dos intereferentes endócrinos são:

6

• Mimetizando o próprio hormônio, ou seja, interagindo com o receptor, a

nível celular, específico para desencadear as alterações que seriam provocadas pelo

hormônio naquele sitio de atuação;

• Afetando o Sistema Nervoso Central, onde está o principal controle de

produção hormonal, a hipófise, que, por sua vez, é regulada principalmente pelo

hipotálamo. Todos os hormônios são regulados também por mecanismos de

retroalimentação, isto é, são produzidos de acordo com os níveis detectados na corrente

sanguínea, constantemente monitorados pelo hipotálamo. Por isso uma interferência em

nível central afeta o controle de diversos hormônios. Esse mecanismo de controle pode

estar alterado tanto por receber informação errada quanto a níveis sanguíneos, como por

ações deletérias sofridas diretamente pelo próprio sistema nervoso central;

• Bloqueando a ação do hormônio ao ocupar os receptores que seriam

destinados especificamente a ele, impedindo, desta forma, que sua função seja exercida.

Assim agem os agentes químicos que interferem na ação do hormônio masculino,

impedindo a sua ação androgênica. Exemplo: DDE (metabolito do DDT);

• Causando danos no metabolismo dos hormônios, isto é, na sua síntese ou na

sua destruição e eliminação fisiológica ou natural. Os organoclorados, como o DDE, por

exemplo, podem alterar, dessa forma, o metabolismo dos estrógenos.

Ghiselli (2006) diz que existem basicamente duas classes de compostos que

podem alterar o funcionamento do sistema endócrino: (1) os hormônios naturais, que

incluem o estrogênio, a progesterona e a testosterona, presentes no corpo humano e nos

animais, e os fitoestrogênios, compostos presentes em algumas plantas e nas sementes de

soja, e que a apresentam uma atividade semelhante aos esteróides hormonais quando

ingeridos por um determinado organismo; e (2) os compostos sintéticos ou de origem

antrópica que incluem os hormônios sintéticos (hormônios idênticos aos naturais,

fabricados pelo homem que são utilizados como contraceptivos e/ou aditivos na

alimentação animal), bem como os xenoestrogênios, produzidos para a utilização nas

indústrias, na agricultura e para bens de consumo. Estão incluídos nesta categoria os

pesticidas e os aditivos plásticos (ftalatos), compostos de organoestanho, alquilfenóis, as

bifenilas policloradas, os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos, retardantes de chama

(éteres difenílicos polibromados) e ainda subprodutos de processos industriais, como

dioxinas e furanos.

7

Meyer et al. (1999) afirmam que embora algumas substâncias naturais de

origem vegetal (os fitoestrogênios) possuam propriedades endócrinas, estas geralmente não

causam tantos problemas ao homem quanto aquelas de origem antropogênica, uma vez que

essas substâncias não se ligam fortemente aos receptores hormonais, sendo facilmente

excretadas e consequentemente, não se acumulam nos tecidos corpóreos.

Por outro lado, as substâncias sintéticas com ação desreguladora são

geralmente persistentes no ambiente, acumulam-se no solo e nos sedimentos, são

transportadas para outras regiões pela atmosfera (dioxinas e furanos) e podem acumular-se

ao longo da cadeia trófica, expondo os animais superiores a riscos maiores. Várias destas

substâncias, como por exemplo, hormônios sintéticos, podem ser excretadas por meio do

leite materno, constituindo-se, assim, uma fonte de contaminação para recém-nascidos

(MEYER et al., 1999).

Para este estudo foram selecionados um estrogênio sintético (17-α-

etinilestradiol) e dois progestagênios sintéticos (Acetato de Ciproterona e Gestodeno),

hormônios sexuais amplamente utilizados pela indústria farmacêutica.

4.2.1 Estrogênios

Os estrogênios apresentam em sua estrutura um grupo fenólico e em alguns

casos um grupo hidroxila alifático, conforme Figura 01. Como são os principais

responsáveis pelo crescimento e pela reprodução de espécies animais, incluindo os seres

humanos, seus derivados sintéticos são bastante empregados em contraceptivos (hormônios

inibidores do processo de ovulação), ao passo que os estrogênios são também

administrados no controle de sintomas que envolvem a menopausa, distúrbios fisiológicos

e no tratamento e câncer de próstata e de mama (GHISELLI E JARDIIM, 2007).

Figura 01: Estrutura química básica dos esteróides.

Fonte: Sodré et al. (2007).

8

Os estrogênios têm sido classificados como os maiores contribuidores, dentre

os interferentes endócrinos, em provocar alterações endócrinas em organismos presentes

em águas superficiais (GOMES et al., 2004; LAI et al., 2002; JOHNSON e SUMPTER,

2001). Isso ocorre porque os estrogênios naturais e sintéticos são efetivos em níveis de

ng.L-1, enquanto que a maioria dos compostos químicos apresenta atividade estrogênica em

níveis de µg.L-1 e o sistema hormonal dos organismos é estimulado por baixíssimas

concentrações de esteróides, da ordem de partes por bilhão (ppb) ou partes por trilhão (ppt)

(NOGUEIRA, 2003; ROUTLEDGE et al., 1998).

Estrogênios naturais e sintéticos exibem atividade estrogênica na faixa de cem

a um milhão de vezes maior que a apresentada por outros compostos químicos

(ROUTLEDGE e SUMPTER, 1996; TANAKA et al., 2001), razão pela qual esses

estrogênios em baixíssimas concentrações causam vitelogenina em peixes, um

biomarcador de exposição estrogênica em machos ou jovens, ou anti-estrogênica em

fêmeas ovíparas, e alteração do sistema reprodutor de ratos (KRAMER et al., 1998;

FERREIRA, 2008 ).

4.2.1.1 Etinilestradiol (EE2)

O Etinilestradiol ou 17α-etinilestradiol é o principal estrogênio sintético, sendo

encontrado nas pílulas anticoncepcionais e aplicado nas terapias de reposição hormonal.

Esse estrogênio é um dos interferentes endócrinos mais importantes encontrado no

ambiente aquático, devido ao fato de ser altamente estrogênico e resistente à

biodegradação (FERREIRA, 2008).

O uso cada vez maior de pílulas anticoncepcionais resulta em uma maior

preocupação em relação aos problemas causados pelos interferentes endócrinos, uma vez

que concentrações muito baixas de 17α-etinilestradiol têm provocado efeitos alarmantes

como disfunção do sistema hormonal, deformidades de nascimento, diminuição da

fertilidade, anormalidades metabólicas e feminilização de aves, peixes, répteis e mamíferos

aquáticos (FERREIRA, 2008; SANTAMARTA, 2001).

Etinilestradiol é rapidamente absorvido a partir do trato gastrintestinal. O pico

plasmático ocorre cerca de 30 a 120 minutos após a administração oral. A ligação às

proteínas plasmáticas varia de 97% a 98%, especialmente à albumina. Esse hormônio Sofre

extenso metabolismo hepático de primeira passagem, com biodisponibilidade variando

entre 40% a 45% da dose, sendo o 2-hidróxi-etinilestradiol o principal metabólito

9

formando. Ele também origina numerosos metabólitos hidroxilados e metoxilados,

encontrados na forma livre ou como sulfatos e glicuronídeos conjugados. A meia-vida de

eliminação varia de 13 a 27 horas, sendo excretado por urina e fezes (MARTINDALE,

2007).

4.2.2 Progestagênios

Progestagênios são empregados nos tratamentos de infertilidade e descontrole

do ciclo menstrual. Em geral são rapidamente obsorvidos pelo organismo, e então,

metabolizados no fígado (GHISELLI e JARDIM, 2007).

Segundo Sousa Filho e Silva (2010) os progestagênios podem ser divididos em

três grupos: pregnanas, estranas e gonanas.

• Pregnanas: São derivados do acetato de 17-α-hidroxiprogesterona, obtido à

custa de modificações da progesterona.

• Estranas: Na composição das estranas, ausência do radical metil angular no

C-19 entre os anéis A e B. A colocação do radical etinil (C=CH) ao C-17

torna o componente mais potente.

• Gonanas: Não possuem radical angular no C-18 e C-19, mas têm um grupo

etil entre os anéis C e D em C-13; nessa posição esta o grupo etinil em vez

de metil, modificações que tornam as gonanas mais ativas do que as

estranas.

Desde 2003, os progestagênios mais usados são o Levonorgestrel,

Noretindrona, Desogestrel, Gestodeno e Acetato de Ciproterona.

4.2.2.1 Acetato de Ciproterona (AC)

O acetato de ciproterona é um progestogênio com propriedades anti-

androgênicas. Ele é usado no controle da libido em homens com desvios sexuais e

hipersexualidade e em mulheres pode ser usado com o etinilestradiol para o controle de

acne e hirsutismo e também como contracepção. (MARTINDALE, 2007).

A absorção digestiva de acetato de ciproterona é pequena. O pico plasmático

após administração oral de 50 mg é de 285 ng.mL-1, ocorrendo em 3 a 4 horas. Para dose

de 100 mg, o pico plasmático é atingido em 5 a 10 horas, e o nível plasmático é de 100 a

150 ng.mL-1. O acetato de ciproterona acumula-se no tecido adiposo, daí se liberando por

10

período de duas semanas após a suspensão da terapia. Apresenta taxa de ligação às

proteínas plasmáticas de 96%. O metabolismo é hepático. Seu principal metabólito é o

15β-hidroxiciproterona que possui atividade anti-androgênica. A excreção se faz pela

urina, cerca de 35%. Não há dados quando à excreção no leite materno. Aproximadamente

90% de uma dose oral foram detectados nas fezes em oito dias. Resíduos de metabólitos

sofrem excreção biliar. O tempo de meia vida de eliminação é de 38 horas (DRA.

SHIRLEY CAMPOS, 2007).

4.2.2.2 Gestodeno (GTD)

Gestodeno é um progestagênio estruturalmente relacionado com o

levonorgestrel. Ele é usado como o componente progestagênico de contraceptivos orais

combinados; uma dose diária típica é de 7,0 µg em preparações monofásicas e de 50 a 100

µg em preparações trifásicas. Gestodeno também é usado como o componente

progestogênico da terapia de reposição hormonal na menopausa. (MARTINDALE, 2007).

Gestodeno é bem absorvido com uma biodisponibilidade elevada quando

administrada por via oral. É extensivamente ligado às proteínas plasmáticas (75 a 87% para

a globulina de ligação dos hormônios sexuais e de 13 a 24% à albumina). O Gestodeno é

metabolizado no fígado, menos de 1% da dose é excretada inalterada na urina.

(MARTINDALE, 2007).

4.2.3 Características Físico-Químicas dos Hormônios Sexuais Sintéticos

Hormônios sexuais sintéticos são substâncias lipossolúveis de baixa

volatilidade, suas propriedades físico-químicas determinam não apenas sua capacidade de

alteração endócrina, mas também seu comportamento no meio ambiente. As principais

características físico-químicas dos hormônios de interesse podem ser observadas no

Quadro 01.

11

Quadro 01: Características físico-químicas do Etinilestradiol, do Acetato de Ciproterona e do Gestodeno.

Hormônio Etinilestradiol Acetato de Ciproterona Gestodeno

Estrutura

Molecular

Fórmula

Molecular C20H24O2 C24H29ClO4 C21H26O2

Peso Molecular 296.4034 416.9377 310.4299 Densidade 1.21g.cm-3 1.27g.cm-3 1.15g.cm-3 Ponto de Ebulição 457.2°C a 760 mmHg 525.9°C a 760 mmHg 462.7°C a 760 mmHg

Ponto de Fusão 182-183 ºC 200-201 º C 190-192 ºC Solubilidade

(Estimada pelo Log Kow)

116,4 mg.L-1 0,649 mg.L-1 56,21 mg.L-1

Número CAS 57-63-6 427-51-0 60282-87-3 Número

ChemSpider 5770 9496 39417

Solubilidade

Praticamente insolúvel em água, solúvel em acetona,

clorofórmio, dioxano, etanol e éter etílico. Solúvel em

hidróxido de sódio diluído

Praticamente insolúvel em água, muito solúvel em

cloreto de metileno, facilmente solúvel em acetona, solúvel em

metanol, ligeiramente solúvel em etanol absoluto

Praticamente insolúvel em água, facilmente solúvel em cloreto de metileno.

Solúvel em metanol, ligeiramente solúvel em

etanol 96%

Aparência Pó cristalino claro, levemente amarelado

Pó cristalino branco ou quase branco

Pó cristalino branco ou quase branco

Fonte: Adaptado de Chemical Abstracts Service (CAS) e Chemspider (2012).

4.2.4 Estabilidade dos Hormônios Sexuais Sintéticos

A estabilidade é definida como o tempo durante o qual a especialidade

farmacêutica ou mesmo a matéria-prima considerada isoladamente, mantém dentro dos

limites especificados e durante todo o período de estocagem e uso, as mesmas condições e

características que possuía quando da época de sua fabricação. Pode também ser definida

como o período de tempo compreendido entre o momento no qual o produto está sendo

fabricado àquela que sua potência está reduzida a não mais do que 10%, desde que os

produtos de alteração estejam todos seguramente identificados e previamente reconhecidos

seus efeitos (TABORIANSKI, (2003); VEHABOVIC et al., (2003); STULZER e SILVA,

(2006) apud SILVA et al., (2009)).

O estudo de estabilidade descrito pela RE Nº. 1/2005 (Brasil, 2005) possui

como principal aplicabilidade a determinação do prazo de validade do produto

12

farmacêutico. Porém, também determina a quantificação dos produtos de degradação e o

método analítico correspondente, que resultou na publicação de um Informe Técnico nº

1/2008, com o objetivo de esclarecer procedimentos nos casos em que a impureza ou o

padrão do produto de degradação não estão disponíveis. Estes procedimentos envolvem a

realização de testes de estresse sob condições variadas (BRASIL, 2008).

O teste de estresse é definido como um teste de estabilidade para fármacos e

medicamentos sob condições extremas. Este também fornece informações sobre as rotas de

degradação e dos produtos formados, que poderiam ser produzidos durante o período de

armazenamento (REYNOLDS et al., 2002).

Brasil (2005) diz que para o procedimento dos ensaios de estabilidade

realizados no Brasil, de zona climática IV, as indústrias farmacêuticas seguem a RE Nº.

1/2005 da ANVISA que define três estudos:

• Estudo de Estabilidade Acelerada: estudo projetado para acelerar a

degradação química e/ou mudanças físicas de um produto farmacêutico em condições

forçadas de armazenamento;

• Estudo de Estabilidade de Longa Duração: estudo projetado para verificação

das características físicas, químicas, biológicas e microbiológicas de um produto

farmacêutico durante e, opcionalmente, depois do prazo de validade esperado. Os

resultados são usados para estabelecer ou confirmar o prazo de validade e recomendar as

condições de armazenamento;

• Estudo de Estabilidade de Acompanhamento: estudo realizado para verificar

se o produto farmacêutico mantém suas características físicas, químicas, biológicas, e

microbiológicas conforme os resultados obtidos nos estudos de estabilidade de longa

duração.

Com base nos dados fornecidos pela empresa Cifarma é possível observar o

comportamento dos compostos de interesse (Etinilestradiol, Acetato de Ciproterona e

Gestodeno) durante os testes de estabilidade de longa duração e estabilidade acelerada e

também os resultados e produtos de degradação quando passam pelo teste de estresse. As

análises, tanto de identificação quando de doseamento, durante os testes foram realizados e

fornecidos pelos respectivos fornecedores de matéria-prima. O doseamento dos compostos

foi realizado através de cromatografia líquida de alta eficiência e/ou cromatografia gasosa,

com métodos de análise validados.

13

4.2.4.1 Etinilestradiol

O Quadro 02 a seguir apresenta dados do etinilestradiol durante os testes de

estabilidade de longa duração e estabilidade acelerada, realizado pela empresa Schering-

Plough Research Institute no ano de 2009.

Quadro 02: Dados do estudo de estabilidade de longa duração e acelerada do etinilestradiol.

Condições: T = 25± 2º C; UR = 60±5% Amostra\Meses 0 12 24 36 48 60

Nº. 01 100,2% 100,0% 99,5% 99,7% 99,6% 100,1% Nº. 02 100,2% 99,7% 100,0% 99,9% 100,0% 99,8% Nº. 03 99,4% 100,1% 99,9% 100,2% 99,5% -

Condições: T = 40± 2º C; UR = 75±5%Amostra\Meses 0 3 6 - -

Nº. 01 101,0% 100,2% 100,1% - - Nº. 02 101,5% 101,1% 102,0% - - Nº. 03 101,7% 100,6% 100,4% - -

Fonte: Cifarma (2011) e Schering-Plough Research Institute (2009).

O padrão de referência da United State Phamacopeia (USP) foi padronizado

como sendo 100%. O fato de alguns dos resultados de análises apresentarem níveis >

100% sugere falta de pureza do padrão utilizado. Este fator, combinado com a variação do

método de ensaio (incerteza), pode ocasionalmente causar níveis de doseamento que

excedam o limite máximo.

Pelos dados expostos no Quadro 02 é possível observar que mesmo após 60

meses estocado em condições amenas (T = 25± 2º C; UR = 60±5%) o etinilestradiol

apresenta uma boa estabilidade e que quando colocado condições mais extremas (T = 40±

2º C; UR = 75±5%) , durante o teste de estabilidade acelerada, também apresentou uma

boa estabilidade após 6 meses.

O Quadro 03 a seguir apresenta os dados do composto etinilestradiol quando

exposto à diferentes condições do teste de estresse.

14

Quadro 03: Dados do comportamento do etinilestradiol quando exposto aos testes de estresse.

Situação de Estresse Pureza do Etinilestradiol Antes Após

Degradação Térmica (150 ºC por 72 horas) 99,8% 99,9%

Degradação Térmica (108 ºC por 72 horas e Umidade Relativa de 75%) 99,8% 99,8%

Degradação em Solução Ácida (HCl 1M por 72 horas) 99,8% 99,8%

Degradação em Solução Alcalina (NaOH 1 M por 72 horas) 99,8% 99,8%

Degradação Fotoquímica (Luz de Lâmpada de Xenon com intensidade não

menor que 700W/m² - 300 – 800 nm, por 72 horas) 99,8% 99,9%

Degradação Oxidativa (H2O2 3% por 72 horas) 99,8% 99,8%

Fonte: Cifarma (2011) e Schering-Plough Research Institute (2009).

De acordo com os documentos consultados, todas as condições de estresse,

exceto as de meio ácido e básico, produziram produtos de degradação desconhecidos, no

entanto, é importante observar que mesmo em condições de estresse o composto apresenta

estabilidade considerável.

A fórmula estrutural e/ou nome IUPAC (International Union of Pure and

Applied Chemistry) de algumas impurezas e produtos de degradação do Etinilestradiol são

relatadas pela British Pharmacopeia (2010), conforme Quadro 04.

15

Quadro 04: Fórmula estrutural e/ou nome IUPAC de algumas impurezas e possíveis produtos de degradação do etinilestradiol.

19-nor-17α-pregna-

1,3,5(10),9(11)-tetraen-20-yne-3,17-diol

R1 = R2 = R3 = R4 = R5 = H, R6 + R7 = O: 3-hydroxyestra-1,3,5(10)-trien-17-one (estrone)

19-nor-17α-pregna-1,3,5(10),6-tetraen-20-yne-3,17-diol

- -

R1 = R2 = R3 = R4 = H, R5 = OH, R6 = C≡CH: 19-norpregna-1,3,5(10)-trien-20-

yne-3,17-diol (17β-ethinylestradiol)

R1 = R2 = R4 = R5 = H, R3 = R7 = OH, R6 = C≡CH: 19-nor-17α-pregna-1,3,5(10)-trien-20-

yne-3,6β,17-triol (6β-hydroxy-ethinylestradiol)

R1 = R2 = R3 = H, R4 + R5 = O, R6 = C≡CH, R7 = OH: 3,17-dihydroxy-19-nor-17α-pregna-1,3,5(10)-trien-20-yn-16-one (16-

oxo-ethinylestradiol)

- - -

R1 = CH3, R2 = R3 = R4 = R5 = H, R6 = C≡CH, R7 = OH: 4-methyl-19-nor-17α-pregna-1,3,5(10)-trien-20-yne-3,17-

diol (4-methyl-ethinylestradiol)

R1 = R2 = R3 = R4 = R5 = H, R6 = OH: estradiol

R1 = R2 = R4 = H, R3 = R6 = OH, R5 = C≡CH: 19-nor-17α-pregna-1,3,5(10)-trien-20-

yne-3,6α,17-triol (6α-hydroxy-ethinylestradiol)

- - -

R1 = R2 = H, R3 + R4 = O, R5 = C≡CH,

R6 = OH: 3,17-dihydroxy-19-nor-17α-pregna-1,3,5(10)-

trien-20-yn-6-one (6-oxo-ethinylestradiol)

R1 = CH3, R2 = R3 = R4 = H, R5 = C≡CH, R6 = OH: 1-methyl-19-nor-17α-pregna-1,3,5(10)-trien-

20-yne-3,17-diol (1-methyl-ethinylestradiol)

R1 = R2 = R3 = R4 = R6 = H, R5 = OH: estra-1,3,5(10)-triene-

3,17α-diol (17α-estradiol)

- - -

R1 = R3 = R4 = H, R2 = CH3, R5 = C≡CH,

R6 = OH: 2-methyl-19-nor-17α-pregna-1,3,5(10)-trien-20-yne-3,17-diol (2-methyl-

ethinylestradiol

- -

Fonte: British Pharmacopeia (2010).

16

4.2.4.2 Acetato de Ciproterona

O Quadro 05 apresenta dados do acetato de ciproterona durante os testes de

estabilidade de longa duração e estabilidade acelerada, realizado pela empresa Newchem

S.p.A. no ano de 2002.

Quadro 05: Dados do estudo de estabilidade de longa duração e acelerada do Acetato de Ciproterona.

Condições: T = 25± 2º C; UR = 60±5% Amostra\Meses 0 3 6 9 12

Nº. 01 99,87% 99,80% 99,80% 99,78% 99,78% Nº. 02 99,87% 99,80% 99,80% 99,80% 99,79% Nº. 03 99,60% 99,54% 99,53% 99,57% 99,53%

Condições: T = 40± 2º C, UR = 75±5% Amostra\Meses 0 1 3 6 -

Nº. 01 99,87% 99,80% 99,80% 99,80% - Nº. 02 99,87% 99,60% 99,80% 99,80% - Nº. 03 99,60% - 99,55% 99,53% -

Fonte: Cifarma (2011) e Newchem S.p.A. (2002).

É possível notar através do Quadro 06 que o composto apresentou boa

estabilidade após os testes.

Quadro 06: Dados do comportamento do Acetato de Ciproterona quando exposto à situações de estresse.

Condição de Estresse Pureza do Acetato de Ciproterona

Antes Após Degradação Térmica (80 ºC por 24 horas) > 99,2% 100,2%

Degradação em Solução Ácida (HCl 1N por 24 horas em TA) > 99,2% 99,3%

Degradação em Solução Alcalina (NaOH 1 N por 24 horas em TA) > 99,2% 92,8%

Degradação Fotoquímica (Luz Ambiente por 16 horas) > 99,2% 100,1%

Degradação Fotoquímica (Luz UV 254 nm por 24 horas) > 99,2% 100,5%

Degradação Oxidativa (H2O2 30% por 24 horas em TA) > 99,2% 100,3%

Fonte: Cifarma (2011) e Newchem S.p.A. (2002).

De acordo com os documentos internos fornecidos pela empresa Cifarma, a

degradação em condições ácidas do Acetato de Ciproterona produziu um pico

desconhecido com tempo de retenção de cerca de 38 minutos. Já em condições básicas,

17

produziu um pico com tempo de retenção de cerca de 10 minutos, conhecido como

Ciproterona. Em relação às demais condições de estresse, é possível notar através do

Quadro 06 que o composto apresentou um grau de pureza maior após os testes. Tal fato

pode ser explicado pela possível presença de impurezas, que apresentam uma estabilidade

menor em relação ao composto de interesse, quando expostas a tais condições.

A fórmula estrutural e nome IUPAC de algumas impurezas e produtos de

degradação do acetato de Ciproterona são relatados pela British Pharmacopeia (2010),

conforme Quadro 07.

Quadro 07: Fórmula estrutural e nome IUPAC de algumas impurezas e possíveis produtos de degradação do Acetato de Ciproterona.

3,20-dioxo-1β,2β-dihydro-3′H-cyclopropa[1,2]pregna-1,4,6-

trien-17-yl acetate

6-methoxy-3,20-dioxo-1β,2β-dihydro-3′H-

cyclopropa[1,2]pregna-1,4,6-trien-17-yl acetate

6-chloro-1α-(chloromethyl)-3,20-dioxopregna-4,6-dien-17-yl

acetate

1α-(chloromethyl)-3,6,20-trioxopregn-4-en-17-yl acetate

3,6,20-trioxo-1β,2β-dihydro-3′H-cyclopropa[1,2]pregna-1,4-dien-

17-yl acetate

6-chloro-17-hydroxy-1β,2β-dihydro-3′H-

cyclopropa[1,2]pregna-1,4,6-trien-3,20-dione

6β-chloro-7α-hydroxy-3,20-dioxo-1β,2β-dihydro-3′H-

cyclopropa[1,2]pregna-1,4-dien-17-yl acetate

3,20-dioxopregna-1,4-dien-17-yl acetate

6-chloro-3,20-dioxopregna-1,4,6-trien-17-yl acetate (delmadinone acetate)


4.2.4.3 Gestodeno

O Quadro 08 a seguir apresenta dados do composto Gestodeno durante os

testes de estabilidade de longa duração e estabilidade acelerada, realizado pela empresa

18

Industriale Chimica S.r.I. no ano de 2009 e o Quadro 09 os dados do seu comportamento

em condições de estresse.

Quadro 08: Dados do estudo de estabilidade e estabilidade acelerada do Gestodeno. Condições: T = 25± 2º C; UR = 60±5%

Amostra\Meses 0 3 6 9 12 18 24 36 Nº. 01 99,8% 99,6% 99,3% 99,4% 99,9% 100,5% 100,3% 99,3% Nº. 02 99,8% 99,6% 99,7% 99,6% 99,7% 99,4% 99,9% 99,4% Nº. 03 100,3% 100,1% 99,9% 99,9% 99,7% 100,5% 100,7% 99,5%

Condições: T = 40± 2º C; UR = 75±5% Amostra\Meses 0 1 3 6 - - - -

Nº. 01 99,8% 100,1% 99,6% 99,8% - - - - Nº. 02 99,8% 100,1% 99,8% 99,9% - - - - Nº. 03 100,3% 99,9% 100,0% 100,0% - - - -

Fonte: Cifarma (2011) e Industriale Chimica S.r.I. (2009).

Quadro 09: Dados do comportamento do Gestodeno quando exposto a situações de

estresse.

Condição de Estresse Pureza do Pico de Gestodeno Antes Após

Degradação Térmica (105 ºC por 18 horas) 99,9% 100,0%

Degradação em Solução Ácida (HCl 0,1N a 80º C por 02 horas) 99,9% 98,4%

Degradação em Solução Alcalina (NaOH 0,1 N por 02 horas) 99,9% 98,8%

Degradação Fotoquímica (Luz a 22º C por 32 horas 99,9% 99,8%

Degradação Oxidativa (H2O2 30% a 22º C por 01 hora) 99,9% 99,8%

Degradação Oxidativa (H2O2 30% a 22º C por 03 hora) 99,9% 99,3%

Fonte: Cifarma (2011) e Industriale Chimica S.r.I. (2009).

Nas condições de tratamento com HCl 0.1 N, temperatura = 80 ° C e tempo = 3

horas foi notada a formação de uma impureza com um tempo de retenção de 33,9 minutos

(5487RC10), exposta na Figura 02.

Figura 02: Estrutura química do Gestodeno e da impureza 5487RC10 (álcool vinílico),

formada após exposição à condição de estresse em meio ácido. Fonte: Cifarma (2011) e Industriale Chimica S.r.I. (2009).

19

A fórmula estrutural e nome IUPAC de outras impurezas e produtos de

degradação do Gestodeno são relatados pela British Pharmacopeia (2010), conforme

Quadro 10.

Quadro 10: Fórmula estrutural e/ou nome IUPAC de algumas impurezas e possíveis produtos de degradação do Gestodeno.

13-ethyl-17-hydroxy-18,19-dinor-17α-pregna-4,6,15-trien-

20-yn-3-one (∆6-gestodene)

13-ethyl-17-hydroxy-18,19-dinor-17α-pregna-5(10),15-dien-20-yn-3-one (∆5(10)-gestodene)

13-ethyl-17-hydroxy-2α-(1-hydroxy-1-methylethyl)-18,19-dinor-17α-pregna-4,15-dien-20-

yn-3-one (2-isopropanol-gestodene)

13-ethyl-6β,17-dihydroxy-18,19-dinor-17α-pregna-4,15-dien-20-

yn-3-one (6β-hydroxy-gestodene)

13-ethyl-17-hydroxy-18,19-dinor-17α-pregna-4,15-dien-20-

yne-3,6-dione (6-keto-gestodene)

13-ethyl-17-hydroxy-3-oxo-18,19-dinor-17α-pregn-4-en-20-yn-15α-yl acetate (15α-acetoxy-

gestodene)

13-ethyl-3-methoxy-18,19-

dinor-17α-pregna-1,3,5(10),15-tetraen-20-yn-17-o1 (A-

aromatic-gestodene)

13-ethyl-3-ethynyl-18,19-dinor-17α-pregna-3,5,15-trien-20-yn-

17-o1 (diethynyl-gestodene)

13-ethyl-17-hydroxy-5-methoxy-18,19-dinor-5α,17α-pregn-15-en-20-yn-3-one (5-

methoxy-gestodene)

13-ethylspiro(18,19-dinor-17α-pregna-5,15-dien-20-yne-3,2′-[1,3]dioxolan)-17-ol and 13-ethylspiro(18,19-dinor-17α-

pregna-5(10),15-dien-20-yne-3,2′-[1,3]dioxolan)-17-ol

(gestodene ketal)

13-ethyl-3,17-dihydroxy-18,19-dinor-17α-pregna-1,3,5(10),15-

tetraen-20-yn-6-one (aromatic 6-keto-gestodene)

13-ethyl-17-hydroxy-18,19-dinor-17α-pregna-5,15-dien-20-

yn-3-one (∆5(6)-gestodene)


20

4.3 CONTAMINAÇÃO AMBIENTAL

Os esgotos são a principal fonte de contaminação ambiental por hormônios

sexuais sintéticos. Segundo Carlsson et al. (2006) os produtos farmacêuticos, seus

metabólitos e conjugados, são excretados principalmente na urina ou fezes entrando nos

sistemas de tratamento de esgotos onde podem ser degradados, adsorvidos no lodo de

esgoto, ou eventualmente diluído em águas superficiais. Para Vulliet e Cren-Olivé (2011)

está bem estabelecido que o principal meio de entrada desses compostos no meio ambiente

é por meio de efluentes de estações de tratamento de esgoto.

Bila et al. (2007), dizem que fármacos podem ser lançados continuamente nos

sistemas aquáticos e podem ser encontrados nas águas superficiais, muitas vezes usados

como suprimento de água potável.

Técnicas analíticas tornam-se mais sensíveis, largamente abrangentes e, devido

a este fato, um número crescente de drogas humanas e veterinárias têm sido detectadas em

amostras ambientais (ANKLEY et al., 2007). Contudo, sabe-se pouco sobre os possíveis

riscos ecológicos e as rotas desses compostos no meio ambiente. A Figura 03 apresenta um

esquema que sugere os possíveis caminhos de fármacos, quando descartados no meio

ambiente.

Figura 03: Possíveis rotas de fármacos no meio ambiente.

Fonte: Bila e Dezotti (2003).

21

Estudos relativos à hipótese de que substâncias químicas no ambiente podem

estar relacionadas a efeitos estrogênicos vêm sendo relatados desde 1923 (ALLEN e

DOISY, (1923); BURLINGTON e LINDEMAN, (1950) apud Baker, (2001)).

Fernandes (2007) explica que a escassez de dados de eficiência dos processos

de tratamento de águas de abastecimento e de esgoto, comumente empregados no Brasil,

frente à redução da concentração dos fármacos, onde pode-se incluir os hormônios sexuais

sintéticos, contribui com o reduzido grua de divulgação e discussão da questão, perante os

diversos segmentos da população brasileira. A carência de informação também dificulta o

posicionamento legislativo local, frente a elaborações de leis para a proteção, tanto do

meio ambiente quanto da população exposta. A aquisição de dados de dados intrínsecos às

condições e realidade brasileiras é de vital importância na formação de base para futuras

soluções dedicadas ao problema.

No corpo humano, cerca de 15% do etinilestradiol é metabolizada enquanto o

restante é eliminado no esgoto, por isso, este hormônio também é considerado um

indicador de contaminação fecal (RAIMUNDO, 2007). O resíduo deste composto em água

tratada é indesejável e tem-se a preocupação em minimizar a exposição de possíveis

consumidores susceptíveis, como crianças. Contudo, a concentração de exposição ao

etinilestradiol via água potável (1,0–2,0 çg.dia-1) pode ser comparada com uma dose diária

de esteroides, a qual é de 0,1 çg.dia-1 (HARTMANN et al.,(1998); FRIETSCHE;

STEINHART, (1999) apud TORRES (2009)).

Estudos relatados na literatura revelam a ocorrência do estrogênio sintético

17α-etinilestradiol em águas superficiais dos Estados Unidos 4,7 ng.L-1 (ZUO et al.,2006), da

Itlália < 1,0 ng.L-1 (LAGANA et al., 2004), da França 1,1 – 2,9 ng.L-1 (CARGOUET et al.,

2004) e da Áustria 0,33 ng.L-1 (HOHENBLUM et al., 2004), em águas subterrâneas 2,4 ng.L-1

(ADLER et al. (2001) apud HEBERER (2002)) e potável 0,15 – 0,50 ng.L-1 (KUCH E

BALLSCHMITTER, 2001) da Alemanha.

Em estações de tratamento de esgoto, o estrogênio foi detectado em afluentes na

Alemanha 1,4 ng.L-1 e no Brasil 6,0 ng.L-1 (TERNES et al., 1999), na Itália 3,0 ng.L-1 e <10,0

ng.L-1 (BARONTI et al., 2000 e JOHNSON et al., 2000) e em efluentes da Noruega, da

Suécia, da Finlândia, dos Países Baixos, da Bélgica, da Alemanha, da França e da Suíça 1,1

ng.L-1 (JOHNSON et al.,2005) e do Reino Unido 7,0 ng.L-1 (DESBROW et al., 1998). Estes

resultados indicam que este contaminante não é completamente removido durante processo

de tratamento de águas residuais, sendo transportado ao longo do meio aquático e mesmo

após a passagem pelo solo, ele pode, eventualmente, ser encontrado na água subterrânea.

22

No Brasil, estudos realizados por Torres (2009) em amostras de águas dos Rios

Corumbatái e Piracicaba e água de abastecimento urbano de Piracicaba, coletadas no

período de estiagem, acusaram a presença de resíduos de etinilestradiol na faixa de 190-

300 ng.L-1. Reis Filho (2008), constatou a presença do hormônio natural estriol e

principalmente do sintético etinilestradiol (30,1 ± 3,41 ng.L-1) e indução do efeito de

vetelogenina em peixes em amostras de água superficial e sedimentos do Rio Monjolinho

em São Carlos, São Paulo.

No Estado de São Paulo, Ghiselli (2006) e Raimundo (2007) encontraram o

hormônio sintético etinilestradiol em águas superficiais destinadas ao abastecimento da

população da região metropolitanta de Campinas, nas concentrações entre 1,6 – 1,9 µg.L-1

e 0,11 – 4,4 µg.L-1, respectivamente.

No estado de Goiás, poucos são os estudos voltados para essa identificação.

Portuguez et al. (2012) avaliaram a água do Rio Meia Ponte, no perímetro urbano da

capital do Estado de Goiás, Goiânia, detectando os hormônios sintéticos etinilestradiol e

gestodeno em concentrações médias de 1,485 e 1,561 µg. L-1, respectivamente.

4.3.1 Efeitos na Vida Animal e na Saúde Humana

A exposição de diversas espécies animais a um ou mais compostos químicos

estrogênicos é capaz de induzir uma gama de efeitos adversos como hermafroditismo,

hipospadia, criptorquidismo, redução do tamanho normal dos testículos, comprometimento

do funcionamento normal das células de Leydig, redução da qualidade e quantidade de

espermatozoides, alteração do ciclo estral, entre outros (WITORSCH (2002); LATHERS

(2003) apud FERREIRA (2008)).

Trabalhos encontrados na literatura mostram que uma concentração de 0,1

ng.L-1 de 17α-etinilestradiol induz a expressão da vitelogenina em peixes (PURDOM et al.,

1994), que a faixa de concentração de 0,1 a 15,0 ng.L-1 pode afetar a diferenciação sexual e

que a faixa de concentração de 2,0 a 10,0 ng.L-1 pode afetar negativamente a fecundidade.

Uma longa exposição a uma concentração de 5,0 ng.L-1 leva a uma redução significativa na

fecundidade dos descendentes (NASH et al., 2004). Dessa forma, a concentração de 17α-

etinilestradiol encontrada no meio ambiente entre 0,5 e 7,0 ng.L-1, (BILA e DEZOTTI,

2003) representa uma significante contribuição para a disfunção no sistema reprodutivo de

peixes (FENT et al., 2006).

23

Estudos in vivo mostraram que a exposição de peixes a concentrações de 1,0 a

10,0 ng.L-1 de 17β-estradiol e 0,1 ng.L-1 de etinilestradiol provocaram feminização de

algumas espécies de peixes (ROUTLEDGE et al., 1998). As fêmeas do peixe Japanese

medaka apresentaram menor fecundidade quando expostas a 17β-estradiol. Os estrogênios

não induzem efeitos adversos somente em animais, mas também interferem no crescimento

e desenvolvimento de plantas (LAI et al., 2002).

Muitos estudos têm revelado que, nos últimos 60 anos, a contagem média de

espermatozóides em alguns países diminuiu pela metade e dobrou a incidência de

malformações do sistema reprodutivo masculino, como hipospadias. A exposição de

homens adultos a substâncias estrogênicas pode resultar em ginecomastia (crescimento das

mamas) e interferência no funcionamento do sistema glandular associado ao hipotálamo-

hipófise-gônadas, resultando em diminuição da libido, impotência, diminuição dos níveis

de androgênios no sangue e diminuição na contagem de espermatozóides (WARING e

HARRIS, 2005).

Waring e Harris (2005), explicam que em humanos, os hormônios esteróides

(androgênios e estrogênios) regulam o processo de desenvolvimento fetal, como a

diferenciação sexual. Androgênios, incluindo a testosterona, regulam o desenvolvimento

do fenótipo masculino e um distúrbio no nível de esteróide pode causar feminização de

fetos masculinos, caso exista um excesso de compostos estrogênicos ou uma deficiência de

androgênios. Por outro lado, fetos femininos podem se tornar masculinizados devido ao

excesso de androgênio ou pela falta de estrogênio durante o período de diferenciação

sexual do feto.

4.4 TRATAMENTO DE ÁGUA E ESGOTO

Os processos de tratamentos convencionais em uma ETE consistem em:

tratamento preliminar (gradeamento e caixa de areia), tratamento primário (sedimentação

primária, remoção de óleos e graxas) e tratamento secundário (tratamento biológico). No

tratamento preliminar os sólidos grosseiros são retirados e micropartículas são retiradas

com menor eficiência. No tratamento primário, há a adsorção dessas substâncias sobre os

sólidos do lodo primário. Substâncias hidrofóbicas, como muitos interferentes endócrinos,

são removidas junto com o lodo primário. A remoção de compostos orgânicos é

dependente da remoção de sólidos suspensos pelo processo de sedimentação (BILA, 2005).

24

No Brasil, dentre as diversas técnicas de tratamento de água para

abastecimento público, destaca-se a conhecida como tratamento de ciclo completo, e a

filtração direta. As técnicas de tratamento de água distinguem-se em função dos processos

e operações unitárias por elas empregadas. As etapas envolvidas, resumidamente, são a

clarificação, a desinfecção, a fluoretação e a estabilização química (HELLER e PÁDUA,

2006).

Heller e Pádua (2006) dizem ainda que a clarificação, responsável pela

remoção de sólidos e material orgânico presentes na água, ocorre nos floculadores,

decantadores e filtros. A desinfecção destina-se à inativação de microrganismos

patogênicos, normalmente feita através da adição de cloro, e a fluoretação constitui-se na

adição de flúor à água para prevenção da cárie dentária infantil. Por fim, a estabilização

química é usada para o controle da corrosão e da incrustação em tubulações e concretos

expostos à água. Portanto, tem caráter de proteção das instalações.

Apesar da confirmação da presença de interferentes endócrinos, como

hormônios sexuais, em águas superficiais utilizadas para o abastecimento, por estudos e

pesquisas científicas como a Portuguez (2012), a de Guimarães (2008) e a de Raimundo

(2007), ainda não foram definidas pelos órgãos de fiscalização ambiental e de saúde, as

concentrações de lançamento dessas substâncias em níveis que não apresentem riscos ao

meio ambiente e à população. O que se sabe é que o sistema hormonal em organismo pode

ser estimulado com concentrações muito baixas de esteróides, da ordem de partes por

bilhão (ppb – µg.L-1) ou mesmo partes por trilhão (ppt – ng.L-1), sendo esta a principal

razão porque traços ou vestígios de substâncias químicas exógenas podem ser muito

maléficos (VERBINNEM, 2009).

Sabendo dos efeitos provocados pelos interferentes endócrinos em animais e

humanos e da ocorrência dessas substâncias em águas superficiais e subterrâneas, verifica-

se a necessidade de estudos relativos a métodos de degradação dessas substâncias.

4.4.1 Degradação de Interferentes Endócrinos

A contaminação dos ambientes hídricos por interferentes endócrinos se deve,

principalmente, ao lançamento de efluentes domésticos e industriais. Estudos relatam que,

mesmo após o processamento do afluente em estações de tratamento de esgotos (ETE),

esses compostos não são completamente eliminados dos efluentes, indicando que as

25

tecnologias mais empregadas não suprem a necessidade de tratamento destes até então

contaminantes “ignorados” (ERICKSON, (2002) apud REIS FILHO, (2006)).

O principal fator que influencia a remoção de poluentes presentes em amostras

aquosas é a habilidade dos poluentes em interagir com partículas sólidas, naturais (lodo,

sedimentos ou microrganismos) ou adicionar ao meio (carvão ativo ou coagulantes), pois

isto facilita a remoção por processos físico–químicos (floculação) ou processos biológicos

(biodegradação). Entretanto, compostos com baixos coeficientes de adsorção tendem a

permanecem na fase aquosa, o que favorece a mobilidade pelo sistema de tratamento de

esgoto e pelas águas receptoras. Deste modo, muitos produtos farmacêuticos permanecem

na fase aquosa, como os anti-inflamatórios e os antibióticos, enquanto outros podem ser

adsorvidos no lodo, como os hormônios sintéticos (CARBALLA et al., 2004).

Dentre os processos biológicos, o de lodo ativado, foi capaz de remover 40,2%

do 17α- Etinilestradiol em uma matriz de efluente e 50% em efluente sintético segundo

Esperanza et al. (2007), mas com longos tempos de detenção hidráulica e retenção do lodo,

essa remoção pode atingir mais de 90% (JOHNSON et al.,2007). Com o processo de lodo

ativado e uma matriz de efluente de ETE, Joss et al. (2004) conseguiram uma remoção de

17α- Etinilestradiol superior a 71%. Já Johnson e Sumpter (2001), com uma matriz de esgoto,

conseguiram uma remoção de aproximadamente 85%.

Dentre as técnicas oxidativas utilizadas, a ozonização e os processos oxidativos

avançados têm-se mostrado como tecnologias promissoras na remoção de micropoluentes

(como os estrogênios) presentes em matrizes aquosas, como águas e efluentes, uma vez

que utilizam fortes agentes oxidantes: ozônio molecular e radicais OH (CAMEL e

BERMOND, 1998).

O trabalho realizado por Fernandes (2007) mostrou que o Hipoclorito de Sódio foi

efetivo na oxidação do 17α- Etinilestradiol. Sua maior ação foi observada sob dosagens de

5 e 10 mg. L-1 e tempos de oxidação entre 3 e 5 horas. Esta combinação de parâmetros

experimentais impactou na redução da concentração do estrogênio na água, em níveis

superiores a 97,5%. Este nível de remoção também foi observado, quando aplicado carvão

ativado em pó, sob dosagens a partir de 50 mg L-1 e tempo de contato de 60 minutos.

HUBER (2004), estudando os efeitos da préoxidação do 17α- Etilnilestradiol pelo dióxido

de cloro a 0,1 mg.L-1, obteve remoção superior a 99,85% para o composto em 30 minutos

de contato.

Estudos realizados por Ferreira (2008) mostraram que quando os estrogênios

17β-estradiol e 17α-etinilestradiol foram ozonizados separadamente, as remoções alcançadas

26

para 17β-estradiol e 17α-etinilestradiol em pH 11 foram superiores a 99,7 e 98,8 %, enquanto

que em pH 3, foram praticamente 100 % e de 99,5 %, o que corresponde a concentrações

residuais de 17β-estradiol e 17α-etinilestradiol inferiores a 30 ng. L-1 e 120 ng.L-1,

respectivamente. O processo de O3/H2O2 também foi efetivo, uma vez que quando oxidados

separadamente em pH 7, as remoções dos estrogênios 17β-estradiol e 17α-etinilestradiol foram

superiores a 99,7 e 98,9 %, enquanto que em pH 3 foram praticamente de 100,0 e de 99,7%.

Quando em mistura em pH 7, as remoções dos estrogênios 17β-estradiol e 17α-etinilestradiol

foram superiores a 99,0 e 98,0 %, enquanto que em pH 3 foram praticamente de 100,0 e de

99,2 %, respectivamente.

Nelson et al. (2007) verificaram que os tratamentos primário e secundário não

foram suficientes para remover interferentes endócrinos ou traços de substâncias orgânicas

como fármacos e pesticidas em esgoto doméstico.

4.5 CARBONIZAÇÃO HIDROTERMAL

A produção de carvão a partir de biomassa é um processo natural que necessita

de uma escala de tempo de centenas de milhões de anos. Com o processo de CHT, que

imita o processo natural, é possível fazer isso em 4 horas, a partir de biomassa úmida (IFG,

2010).

Por volta do ano de 1592, Valério Coderius, um cientista alemão, explicou o

processo natural da formação do carvão. Ele descobriu que o carvão marrom e o carvão

antracito evoluíram a partir da madeira. Mas até o período medieval, acreditava-se que a

formação do carvão era baseada somente em minerais (SCHMOLKE, 2009).

O Prêmio Nobel Friedrich Bergius descreveu o processo da avaliação de carvão em

sua "Teoria da formação do carvão" no ano de 1913. Ele aqueceu diferentes tipos de

biomassa em um recipiente com água, em diferentes escalas de tempo (1-230 horas) e com

temperaturas diferentes (170 a 340 ° C). Consequentemente, Bergius pode examinar e

produzir artificialmente os diversos estágios da carbonização (BERGIUS, (1928) apud

SCHMOLKE, (2009)).

Seguindo o modelo de Bergius, Markus Antonietti, do Instituto Max-Planck em

Potsdam – Alemanha, apresentou o seu conceito de CHT no ano de 2006. Ele encheu um

pressurizador com água, biomassa e um catalisador. O frasco, hermeticamente fechado, foi

pressurizado e aquecido durante 4 - 24 horas, a temperatura de cerca de 200 °C. O processo

27

é extremamente simples, facilmente reprodutível e barato. Este método foi escolhido para

este trabalho, porque o equipamento necessário pode também ser instalado nos países em

desenvolvimento, como o Brasil, por exemplo (SCHMOLKE, 2009).

A carbonização hidrotermal (CHT) é um processo que transforma resíduos

orgânicos, como cascas, bagaços, resíduos industriais, lodo de estação de tratamento de

esgoto, dentre outros tipos de biomassa (de origem vegetal) em um sólido semelhantes ao

linhito, uma espécie de carvão. Diferentemente de outros processos tais como a pirólise, a

CHT se dá em meio aquoso. Com isso, não há necessidade de secagem da matéria-prima

com alto gasto de energia. A CHT também opera em temperaturas consideravelmente

baixas de apenas 200 °C, comparadas as da pirólise, de 500 °C. O método não utiliza

elevadas temperaturas e pressões, apresenta melhor desempenho na presença de

catalisadores, mas é necessário o uso de um reator de carbonização hidrotermal para que as

condições ideais sejam alcançadas (IFG, 2011; FRAUNHOFER, 2011).

Após os estudos em laboratório, a fase industrial desse processo poderá

possibilitar o aproveitamento de resíduos da agricultura para a produção sustentável de

carvão, que é um produto utilizado em grande quantidade nas indústrias de ferro e aço

(IFG, 2010) e também possibilitar a aplicação da técnica em áreas como tratamento de

efluentes contaminados com compostos de estabilidade elevada.

A técnica de CHT tem sido citada por autores como Titirici et al. (2007) como

alternativa na redução de até 10% na emissão de CO2 para atmosfera em países como a

Alemanha, apenas com o tratamento da biomassa de resíduos da indústria de beterraba,

canola e lodos de ETEs. O material resultante do processo de carbonização desses resíduos

pode ser utilizado como fertilizante, pois além de ser livre de substâncias tóxicas e

cancerígenas é poroso e rico em carbono. Outros autores como Orikasa (2007) apud Bo Hu

(2008) dizem ainda, que as aplicações existentes para os materiais de carbono e

carbonáceos híbridos feitos a partir do processo CHT são muito promissoras e incluem a

fixação de carbono, cromatografia, suportes de catalisadores, adsorventes seletivos,

distribuição de medicamentos e eletrodos.

No município de Náquera em Valência - Espanha, a empresa Ingelia instalou

no ano de 2010 o primeiro reator de carbonização hidrotermal em escala industrial para

avaliar a viabilidade comercial da tecnologia (Figura 04). Com capacidade de tratamento

de 2.000 toneladas por ano de restos de podas e jardinagem, o fundamento da tecnologia é

simples: desidratar a biomassa para concentrar o carbono da matéria orgânica e assim obter

um combustível de alto poder calorífico, 6.000 kcal.kg-1. Neste caso, o processo é efetuado

28

em um reator de fluxo invertido em meio líquido e condições de processo de 20 bar de

pressão, temperatura na faixa de 180 – 200 ºC e um catalisador específico para cada tipo de

biomassa. As condições de processo são atingidas graças a uma caldeira alimentada com

carvão produzido na própria instalação. Nestas condições, ocorre uma fase de

monomerização da matéria orgânica, seguida de um processo de polimerização após o qual

se obtém um carvão desidratado com um elevado poder calorífico e água por união das

moléculas de hidrogênio e oxigênio que perderam as cadeias de hidrocarbonetos

(EXPOBIOENERGIA, 2011).

Figura 04: Imagem do Reator de Carbonização Hidrotermal em Valência, Espanha.

Fonte: Expobioenergia (2011).

Ao finalizar o processo, que pode durar 10 horas, o carvão inerte sai do reator

misturado com água. Após a separação da água, o carvão continua “molhado” mas

molecularmente seco. Não é necessário aplicar nenhuma fonte de calor para que termine de

secar, mas com uma secagem mecanizada é possível reduzir a umidade para 5%. O carvão

seco é muito leve e fácil de moer, é apto para combustão em caldeiras industriais, para co-

combustão em centrais térmicas. Também se pode peletizar, sozinho ou com serradura para

aumentar o seu poder calorífico. O único subproduto obtido do processo é água apta para

fertilização agrícola (EXPOBIOENERGIA, 2011).

Segundo Titirici et al. (2007), uma vez ativada, a CHT é um processo

espontâneo e exotérmico. Ele libera um terço da energia de combustão armazenada no

carboidrato (devido à estabilidade termodinâmica elevada da água). Uma comparação

esquemática dos fluxos de massa e energia da CHT com os processos mais comuns de

biomassa de fermentação e digestão anaeróbia é mostrado na Figura 05. É visto que a CHT

29

é a mais exotérmica dos três processos de transformação, explicando a facilidade com que

ela é realizada quimicamente e também o mais eficiente para a fixação de carbono, tal

como expresso pelo termo CE “eficiência de carbono”.

Para a produção de carvão, o recipiente é cheio com água, biomassa e um

catalisador. Este último acelera a transformação das moléculas de açúcar em carbono e

água. Assim, é necessário menos energia. Quando o sistema é fechado, uma pressão de

cerca de 20 bares é aplicado. Durante o processo, um agitador garante a dissipação de calor

constante e evita a acumulação de partes do material na parte inferior. Depois de quatro

horas, um fluido hidratado preto é produzido, que contém carvão poroso (TITIRICI et al.,

2007).

Figura 05. Comparação de diferentes energias e esquemas de transformação do carbono a

partir de carboidratos, baseada na energia de combustão armazenada e na eficiência de transformação do carbono (CE). A fórmula de carbonização do material vegetal é uma

simplificação esquemática. Fonte: Adaptado de TITIRICI (2007).

Estudos realizados por Schmolke (2009) mostraram que é possível acoplar um

sistema de aquecimento via energia solar ao sistema de CHT em quase todas as áreas do

Brasil e do sul da Europa, pois nesses locais é possível atingir as temperaturas necessárias

para a reação. Schmolke (2009) explica ainda, que seria preferível utilizar um sistema com

uma temperatura de trabalho de aproximadamente 260 °C para compensar perdas (por

exemplo, as perdas de condução) e para manter um nível de temperatura constante durante

trabalho.

30

Por ser um processo ainda pouco estudado, não se conhece as potencialidades

de aplicação que a CHT oferece. É necessário investigar e aperfeiçoar seu uso, que pode ir

além da reciclagem de resíduos provenientes das indústrias agrícola e alimentícia e de mais

uma técnica para fazer substâncias ricas em carbono.

4.6 POTENCIAL DOS MICRORGANISMOS NA BIORREMEDIAÇÃO

As tecnologias biológicas de biorremediação disponíveis estão fundamentadas

nas atividades de biodegradação dos microrganismos. Vários são os microrganismos

degradadores e por isso diferentes reações de transformação, catalisadas por eles, estão

envolvidas no processo de degradação. Dentre as reações existentes, a reação oxidativa é

caracterizada por usar o oxigênio molecular como reagente no metabolismo de

xenobióticos, o que concede aos microrganismos uma faixa de utilização do substrato

muito maior, sendo uma reação eficiente (SILVA e FAY, 2004).

A biorremediação utiliza as funções naturais dos microrganismos de

transformação, mineralização ou complexação de compostos, direcionando-as para o

controle de poluentes ambientais orgânicos ou inorgânicos. O baixo custo operacional e a

relativa facilidade de aplicação aumentam a possibilidade do uso eficiente de

microrganismos no tratamento degradativo de contaminantes diversos (KUNZ et al., 2002;

FREIRE et al. 2000).

Segundo Morais (1999), no tratamento de efluentes por microrganismos,

ocorre a mudança de compostos orgânicos tóxicos para CO2, H2O e CH4. Os compostos

são substratos para a manutenção do crescimento dos microrganismos.

A chave para o processo de degradação está na formação do oxigênio ativo,

assim, ele pode induzir o primeiro passo para a quebra de compostos estáveis. Os fungos

de degradação branca, por exemplo, produzem enzimas capazes de catalisar a formação do

oxigênio ativo para iniciar o processo de degradação. As madeiras em estágio final de

decomposição ou deterioração podem apresentar lacases fúngicas de diferentes gêneros de

ascomicetos, deuteromicetos e basiodiomicetos. Estes últimos são os melhores produtores

de lacase, também conhecidos como fungos de degradação branca, já que degradam

madeira. A lacase oxida os anéis fenólicos em radicais fenoxílicos (GARCIA, 2006).

Dentre os microrganismos conhecidos como biorremediadores, Phanerochaete

chrysosporuim é um fungo filamentoso cujas reações de degradação contam com as

31

hemeperoxidades: Lignina Peroxidase e Manganês Peroxidase, além de um sistema

gerador de água oxigenada e de possíveis enzimas intracelulares envolvidas, também na

degradação de compostos tóxicos. Isso faz com que Phanerochaete chrysosporium possua

rara capacidade de mineralização de xenobióticos considerados recalcitrantes (VALLI e

GOLD, 1991) apud (SILVA e FAY, 2004).

Machado et al. (2006), em seu estudo sobre a capacidade degradativa de

corantes da indústria têxtil por Basidiomicetos, apontam os basidiomicetos Trametes

versicolor e Pycnoporus sanguineus como alternativas na biorremediação de cor de

efluentes. O estudo mostra as diferenças entre os microrganismos: Trametes villosa

descoloriu completamente 17 corantes enquanto Pycnoporus sanguineus descoloriu apenas

9. Porém, o melhor resultado foi obtido quando as duas culturas fúngicas foram

misturadas, evidenciando pela rápida descoloração dos corantes, aproximadamente 80% de

redução em sete dias de tratamento. Os autores afirmam que o consórcio de culturas é uma

alternativa interessante de tratamento, que deve ser investigada para que a interação entre

os complexos enzimáticos dos microrganismos envolvidos seja melhor aproveitada.

Estudos realizados por Ponezi et al. (2009), mostraram que um consórcio de

microrganismos isoladas do solo apresentaram potencial para bioremediação do

interferente endócrino sintético 17α-etinilestradiol, utilizando-o como única fonte de

carbono e energia.

Moreno, Becerra e Santos (2004), ressaltam que os Basidiomicetos são os

fungos com mais possibilidades de serem aplicados em processos de biorremediação,

devido a sua capacidade de solubilizar compostos mais complexos que a própria lignina.

Estudos realizados por Jardim (2010) mostraram que entre as espécies de

fungos de decomposição branca estudas, a de Pycnoporus sanguineus e a de Trametes

villosa foram as que apresentaram melhor potencial para biorremediação do agrotóxico

organofosforado Acefato. Tais microrganismos apresentaram capacidade adaptativa e

tolerância à toxicidade do Acefato.

A Figura 06 ilustra o Pycnoporus sanguineus e a Figura 07 o Trametes villosa,

ambos em seu habitat natural, troncos de árvores em fase de decomposição.

32

Figura 06: Imagem do Pycnoporus sanguineus em seu habitat natural.

Fonte: Marcos Luiz de Britto (2011).

Os tratamentos biológicos por fungos e outros microrganismos podem

contemplar uma série de compostos orgânicos, inorgânicos e até os xenobióticos,

reduzindo-os a formas químicas menos tóxicas, podendo inclusive, ser aplicados à

descontaminação de águas superficiais (MORENO, BECERRA e SANTOS, 2004;

BALLAMINUT e MATHEUS, 2007).

Figura 07: Imagem do Trametes villosa em seu habitat natural.

Fonte: Jörn Germer (2010).

4.6.1 Fungos de Decomposição branca

Os fungos de decomposição branca são conhecidos por sua capacidade de

degradar compostos lignocelulósicos na natureza, principalmente a madeira. As enzimas

fúngicas produzidas extracelularmente podem ser consideradas vantajosas do ponto de

vista da manipulação e utilização. As principais são: Lacase (Lcc); Manganês Peroxidase

(MnP) e Lignina Peroxidase (LiP). Dentre as enzimas fúngicas a Lacase se destaca por

33

apresentar um largo espectro de substratos, ou seja, possui capacidade oxidativa mais

ampla, o que ambientalmente se reflete em uma vantagem (BALDRIAN, 2006).

McMullan et al., (2001) dizem que os fungos fazem parte do centro do ciclo do

carbono devido a sua capacidade de mineralizar a lignina presente na madeira, cuja

molécula é uma complexa estrutura polimérica. Assim, estes organismos tem sido capazes

de mineralizar também uma diversa gama de poluentes orgânicos persistentes, devido a

não-especificidade da natureza de suas enzimas lignolíticas.

Os fungos podem produzir metabólitos tais como ácidos cítricos, proteínas

homogêneas, proteínas heterogenias e peroxidases. Tais autores têm demonstrado também

a capacidade e eficiência dos fungos em reduzir a toxicidade de substâncias presentes em

efluentes industriais (TRIPATHI et al. 2007).

Uma tecnologia para tratamento de efluentes é a aplicação de enzimas, sendo

que a lacase (Lcc), lignina peroxidase (LiP) e manganês peroxidase (MnP) podem degradar

grande número de substâncias tóxicas e persistentes. O uso de fungos capazes de degradar

compostos orgânicos parece ser um método promissor para o tratamento de efluentes, em

particular, os fungos de decomposição branca que possuem um sistema enzimático que os

torna capazes de tolerar altas concentrações de poluentes tóxicos (BARR e AUST, 1994).

Para este estudo foram considerados e analisados apenas os valores da enzima

da Lacase.

4.6.1.1 A Enzima Fúngica Lacase (Lcc)

Segundo Windsten e Kandelbauer (2008), a Lcc é uma glicoproteína

extracelular produzida por fungos de degradação branca, que prestam importante papel no

ciclo do carbono, através da degradação de material lignolítico, tal como a madeira.

A lacase conhecida também como enzima p-difenol (dioxigênio

oxidoredudase) foi primeiramente descrita em 1883, descoberta no Japão. Depois, em

1896, foi confirmada sua presença também em fungos. Deste modo, trata-se de uma das

enzimas mais antigas que vem sendo estudadas desde o fim do século passado

(THURSTON, 1994). Este mesmo autor classifica a lacase como pertencente ao grupo das

oxidases azuis, e afirma que a grande quantidade de estudos acerca delas não se dá apenas

pelo fato de reduzirem o oxigênio molecular em água, mas sim devido ao conhecimento

acerca destas proteínas ainda ser restrito.

34

As lacases catalisam a oxidação de uma grande variedade de compostos tais

como difenóis, polifenóis, diaminas, fenóis substituídos e aminas aromáticas, através da

transferência de um elétron, onde o oxigênio molecular é o aceptor de elétrons. Assim, um

único elétron é perdido pelo substrato, formando um radical livre, que por sua

instabilidade, pode sofrer oxidação catalisada pela lacase ou reações não enzimáticas

(KIISKINEN et al., 2004; EDENS et al., 1999; THURSTON, 1994).

Mayer e Staples (2002) afirmam que as enzimas produzidas por fungos são

muito utilizadas na degradação de vários compostos ambientais persistentes. As lacases

podem ser usadas no melhoramento da eficiência dos processos de biorremediação.

Os fungos de degradação branca também são produtoras, além da lacase, de

outras enzimas como a lignina peroxidase (LiP) e a manganês peroxidase (MnP).

Juntamente com a LiP e a MnP, a Lcc oxida a lignina, um polímero aromático que junto

com polissacarídeos como a celulose e hemicelulose, compõem a madeira. A lacase do

Trametes versicolor é capaz de oxidar modelos de lignina não fenólicos na presença de

2,2-azinobis-3ethylbenzthiazoline-6-sulfonade (ABTS) ou seringalzida em forma similar a

lignina peroxidase (BOURBONNAIS et al., 1995). A lacase possui cobre no seu sítio ativo

e catalisa a redução do O2 para água com simultânea oxidação de substratos fenólicos.

Além disso, as moléculas que possuem quatro átomos de cobre por molécula de enzima,

não somente oxida ácidos fenólicos e metoxifenólicos, mas também os descarboxila e

ataca seus grupos metoxila através de desmetilação ou demetoxilação. Essas moléculas

ainda excitam enzimas com dois, três ou seis átomos de cobre (LEONOWICZ e

GRZYWNOWICZ, 1981).

A seleção de meios de cultura que proporcionem ótimas condições de produção

enzimática vem sendo bastante pesquisada, bem como o uso de formas indutoras, já que

isso permite a caracterização e purificação das enzimas produzidas, ampliando o seu uso

(JARDIM, 2010).

O etanol é considerado um importante indutor enzimático, principalmente por

ser de baixa toxicidade e de baixo custo quando comparado à xilidina. Os resultados

apresentados pelo etanol também são satisfatórios no que diz respeito ao incremento da

produção enzimática: o fungo Pycnoporus cinnabarinus chegou a produzir nove vezes

mais Lacase na presença do etanol quando comparado com a sua produção na presença do

indutor ácido ferúlico (LOMASCOLO et al., 2003).

Outro aspecto importante do uso do etanol como indutor é sua capacidade de

proporcionar descoloração do meio. Valeriano et al. (2007) obteve bons resultados de

35

acréscimo de produção de Lacase em Pycnoporus sanguineus com 50 g.L-1 de etanol e

inibição do pigmento alaranjado do fungo, o que não ocorreu na presença de xilidina,

sugerindo que o etanol inibe a síntese de melanina pelo fungo.

O uso de indutores para potencializar a atividade enzimática fúngica é um

importante mecanismo para o desenvolvimento de tecnologias de remediação. Bollag e

Leonowicz (1984) afirmam que as formas induzidas de Lacase são mais ativas que as

formas constitutivas, reforçando a informação de que a indução enzimática é uma

ferramenta potencializada.

4.7 ANÁLISE DAS ESPÉCIES QUÍMICAS

Há uma variedade de métodos disponíveis para a determinação dos

interferentes endócrinos. Se o objetivo for identificar e quantificar compostos particulares

que estão presentes em uma matriz aquosa, a análise química é mais apropriada. Dentre as

análises químicas, têm-se a cromatografia gasosa e a líquida associadas à espectrometria de

massas (FERREIRA, 2008).

Os métodos descritos na literatura para detecção de interferentes em ambiente

aquático na faixa de µg.L-1 e ng.L-1 são baseados na extração, em alguns casos

derivatização do hidrogênio ácido e determinação por cromatografia gasosa acoplada à

espectrometria de massas (CG/EM) ou cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à

espectrometria de massas (CLAE/EM) (Hernando et al., (2004); Brossa et al.,(2002) apud

FERREIRA (2008)).

Alguns estudos mostram que o 17 α-etinilestradiol pode ser detectado por

cromatografia por bioafinidade e alcançando bons níveis de detecção (ng.L-1) em diversos

tipos de matrizes como água tratada, água superficial e efluentes (AHERNE, ENGLISH, e

MARKS, 1985; AHERNE e BRIGGS,1989; HINTEMANN et al., 2006; MARTÍNEZ et

al., 2010).

A CLAE é uma importante técnica de separação que consegue separar misturas

que contêm um grande número de compostos similares. Ela é um tipo de cromatografia

líquida que emprega colunas recheadas com materiais especialmente preparados e uma

fase móvel, eluída a altas pressões (COLLINS, BRAGA e BONATO, 2006). Em seu

estudo Alda e Barceló (2001) evidenciaram que as separações por CLAE de estrogênios e

36

progestágenos são comumente realizadas com coluna em sílica octadecil e fase móvel

composta por água e acetonitrila em gradiente.

A CLAE é uma técnica com boa detectabilidade e muito difundida quando se

trata de análises de hormônios em águas e efluentes (JURGENS et al., 2002;

RAIMUNDO, 2007; MACHADO, 2010; JARDIM et al.,2012).

4.8 EXPERIMENTOS COM ORGANISMOS-TESTE

4.8.1 Allium cepa

A espécie Allium cepa Lineu havia sido classificada dentro da Família

Liliaceae e atualmente está incluída na Família Alliaceae, dentro da Ordem Liliales. Esta

espécie tem sido utilizada em ensaios toxicológicos que consistem em expôr a base de

bulbos às substâncias poluentes ou aos efluentes para se efetuar o monitoramento da

toxicidade dos mesmos (CHANDRA et al., (2005); FISKESJO, (1988) (1993) apud

GRINEVICIUS (2006)).

Por outro lado, através da exposição de sementes pode-se verificar a

fitotoxicidade de substâncias ou de efluentes. Este método consiste na exposição de

sementes, em substrato sólido umedecido com a substância que se deseja testar para

verificar a porcentagem de germinação, bem como o vigor do crescimento da raiz das

plântulas. Trata-se de uma técnica simples, rápida, segura e de fácil reprodução, além de

permitir a avaliação de danos causados por substâncias tóxicas (TÍQUIA, TAM e

HODGKISS, (1996); WANG e KETURY, (1990) apud GRINEVICIUS (2006)).

4.8.2 Artemia salina

Uma forma de complementar os estudos de degradação de fármacos é associá-

los a ensaios de toxicidade, para avaliar se os subprodutos formados a partir da degradação

apresentam algum grau de toxicidade ou atividade.

Dentre esses ensaios, encontra-se a toxicidade sobre Artemia salina. A

simplicidade com que pode ser manuseada, a rapidez dos ensaios e o baixo custo favorece

a sua utilização rotineira em diversos estudos, além do que, tais ensaios de letalidade são

37

muito utilizados em análises preliminares de toxicidade geral, principalmente estudos

fitoquímicos (LUNA et al., 2005).

Artemia salina (Figura 08) é um microcrustáceo sem carapaça, da classe

Anostracea, e apreciável fonte de alimento para peixes e outros crustáceos, tanto em

ecossistemas marinhos quanto em aquários marinhos. Fotossensível, como muitos outros

organismos aquáticos primitivos, essa larva apresenta sensibilidade a substâncias tóxicas,

sendo considerada, então, indicador de toxicidade em um bioensaio, usando a dose letal

média (DL50) como parâmetro de atividade biológica (MILANI e ZIOLLI, 2008).

Figura 08: Artemia salina. Fonte: Viktor Sykora (2010).

Extensivamente utilizada como alimento vivo para peixes e outros crustáceos,

seus ovos são encontrados facilmente em lojas de aquaristas. Os ovos não eclodidos são

metabolicamente inativos e, desidratados, em baixas temperaturas e de preferência em

vácuo, se conservam por longos períodos (MILANI e ZIOLLI, 2008).

Quando rehidratos e em condições ambientais ajustadas ao ambiente marinho,

os ovos de Artemia salina eclodem em cerca de 24 horas, chegando à fase adulta com 20 a

30 dias de vida. Esse ciclo de vida relativamente curto favorece seu uso em testes de

toxicidade (MILANI e ZIOLLI, 2008).

Popularizado, sobretudo a partir da década de 90, o bioensaio baseia-se na

possibilidade de imobilizar náuplios de Artemia salina em culturas laboratoriais. O ensaio

de letalidade com o microcrustáceo foi desenvolvido para revelar compostos bioativos em

extratos vegetais (LHULLIER et al., 2006; RUIZ et al., 2005).

Tais ensaios são comumente empregados em análises prévias de toxicidade

geral ou como primeira análise do potencial citotóxico de novos compostos e alguns

estudos correlacionam o ensaio de toxicidade com larvas de Artemia salina com atividades

fungicida, vuriscida, bactericida e parasiticida, por exemplo. Além disso, apresentam

rapidez, baixo custo, eficiência, simplicidade, exigem pequena quantidade de amostra e

38

não requerem ambientes assépticos e equipamentos especiais (MACHADO, 2005;

MILANI e ZIOLLI, 2008).

39

5 MATERIAL E MÉTODOS

A parte experimental da pesquisa foi realizada no laboratório de Enzimologia e

Biocatálise Ambiental da Faculdade de Farmácia – FF, da Universidade Federal de Goiás –

UFG, no laboratório de química tecnológica do Instituto Federal de Goiás - IFG e nos

laboratórios de controle de qualidade físico-químico, desenvolvimento analítico e da

Estação de Tratamento de Efluentes da indústria Cifarma Científica Farmacêutica Ltda.

A pesquisa foi divida em 05 etapas: (1) Cultivo e preparo dos fungos

selecionados em meio sólido, (2) Tratamento com os fungos selecionados em meio de

cultura líquido, (3) Tratamento tecnologia de carbonização hidrotermal, (4) Avaliação do

tratamento por meio de leitura em cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), (5)

Experimentos de toxicidade do efluente após os tratamentos com os fungos e com o reator

de CHT.

5.1 HORMÔNIOS SEXUAIS SINTÉTICOS

Os hormônios sexuais sintéticos que foram utilizados nesta pesquisa são

compostos químicos que requerem certo cuidado na sua manipulação, principalmente por

sua atividade de desregulação endócrina, sendo assim, todos os experimentos ou atividades

laboratoriais foram realizadas conforme as boas práticas de segurança e de biossegurança

do laboratório, do fabricante e do doador das amostras. O uso de equipamentos de Proteção

Individual (EPIs), tais como, máscara, luvas, óculos de proteção e jaleco, fizeram parte da

prática microbiológica e química.

A pesquisa foi realizada com padrões primários e secundários dos hormônios

sexuais sintéticos, gentilmente doados pela indústria farmacêutica Cifarma Científica

Farmacêutica Ltda. Foram utilizados: Acetato de Ciproterona Padrão Primário

(100,28%); Etinilestradiol Padrão Secundário (98,90%) e Gestodeno Padrão

Primário (99,93%).

Estes hormônios estão entre os ativos mais utilizados pela indústria

farmacêutica, individualmente ou em combinações, para a produção de medicamentos

anticoncepcionais e/ou de reposição/controle hormonal, apresentando assim, maior

possibilidade de ir parar meio ambiente, seja por excreção dos usuários, descarte

40

inadequado dos resíduos ou lançamento de efluentes industriais sem tratamento adequado

ou imcompleto.

5.1.1 Soluções dos Hormônios Sexuais Sintéticos

Para esta pesquisa foi padronizada a concentração de 1.000,0 ng.mL-1 para

todas as soluções de hormônios, seja individual ou em conjunto. Esta concentração foi

escolhida em decorrência dos valores encontrados em águas superficiais por pesquisadores

como Portuguez (2012), Torres (2009), Guimarães (2008) e Ghiselli (2006) e em

decorrência do limite de quantificação e detecção do equipamento de CLAE utilizado

(µg.mL-1 e ng.mL-1).

Primeiramente preparou-se uma “solução estoque” de cada um dos três

hormônios estudados e também uma “solução estoque” dos três juntos. Conhecendo

algumas propriedades físico-químicas desses hormônios e um pouco sobre metabolismo

dos fungos selecionados, optou-se por solubilizar os hormônios em álcool etílico absoluto,

uma vez que a solubilidade dos mesmos é muito baixa em água e o álcool etílico não é

tóxico para os fungos e ainda funciona como um indutor de produção de enzimática,

conforme estudos de Valeriano et al. (2007).

A “solução estoque” de cada hormônio foi preparada pesando-se,

separadamente, em balança analítica Modelo AR 2140 da fabricante Ohaus, 10,0 mg de

Acetato de Ciproterona, 10,1 mg de Etinilestradiol e 10,0 mg de Gestodeno.

Posteriormente, essa massa foi transferida para um balão volumétrico de 50,0 mL. Em

seguida, o balão volumétrico foi completado com álcool etílico absoluto e agitado para que

o hormônio ou a mistura deles pudesse ser solubilizada.

Ao todo foram preparadas quatro “soluções estoque”: (1) Acetato de

Ciproterona, (2) Etinilestradiol, (3) Gestodeno e (4) Acetato de Ciproterona +

Etinilestradiol + Gestodeno, com concentração igual a 200 µg.mL-1.

As soluções nas concentrações iniciais desejadas para cada experimento foram

preparadas a partir da solução estoque e de água Mili-Q ultrapurificada (praticamente livre

de matéria orgânica, sais e microrganismos) obtida pelo sistema de tratamento de água Q-

Gard®1 Purification Pack da Millipore. Para preparar essas soluções, utilizou-se 10,0 mL

da “solução estoque” e colocou-se em um balão volumétrico de 2.000,0 mL, em seguida

completou-se o volume com água ultrapurificada, alcançando assim a concentração inicial

desejada 1.000,0 ng.mL-1.

41

Para a realização dos experimentos com reator de CHT foi preciso ajustar o

valor do pH das soluções da faixa de 6 – 7 para a faixa de 2 – 3. Este fator interfere

diretamente no desempenho do reator, uma vez que o pH nesta faixa (ácido) funciona

como catalisador das reações durante o processo. Para isso, foram preparadas soluções

ácidas com dois ácidos diferentes. Um solução de ácido cítrico 5%, foi preparada através

da dissolução de 12,5 g de ácido cítrico P.A., pesados em balança analítica, em água

ultrapurificada dentro de um balão volumétrico de 250,0 mL. Uma segunda solução de

ácido fosfórico 10% foi preparada com 11,8 mL de ácido fosfórico 85%, com auxílio de

pipetas volumétricas, diluídos com água ultrapurificada em um balão volumétrico de 100,0

mL. Foi dada preferência para utilização dos ácidos cítrico e fosfórico nestes experimentos,

por serem menos agressivos ao meio ambiente, tanto in natura quando seus possíveis

produtos de degradação, e também por não causarem danos à coluna cromatográfica e

pouca interferência nas leituras com CLAE, como por exemplo, sobreposição com os picos

das substâncias de interesse.

A correção do pH das soluções foi realizada com auxílio de um pHmetro

digital modelo 8010 do fabricante Qualxtron.

5.2 PROCESSO DE CARBONIZAÇÃO HIDROTERMAL

O reator de carbonização hidrotermal (CHT) utilizado nos experimentos foi

desenvolvido em 2010 na área de química tecnológica do Instituto Federal de Goiás - IFG,

que cedeu o direito de uso do equipamento desde que mantido o sigilo de informações

quanto às especificações técnicas e de condições ideais de uso. Os experimentos foram

realizados no laboratório de química do Instituto Federal de Goiás – IFG, campus Goiânia,

e no laboratório da Estação de Tratamento de Efluentes da Cifarma.

O sistema de CHT é composto por um reator, uma chapa de aquecimento e um

termômetro manual, conforme Figura 09.

O reator é composto por um recipiente e uma tampa, feitos em aço inox 304,

sendo a tampa composta por um manômetro, que mede a pressão interna do recipiente

durante os experimentos, uma válvula automática de escape para gases, caso a pressão

interna atinja um limite crítico (sistema de segurança), conforme é possível observar na

Figura 10. Para encaixe e vedação da tampa sob o recipiente são utilizados um anel de

vedação feito em Teflon (estável entre –180 e + 260 ºC) e seis parafusos de aço inox 304

42

(Figura 11). O volume interno total do recipiente é de 256,6 mL e o volume útil de 150,0

mL.

Figura 09: Sistema de CHT em funcionamento.

Figura 10. Vista frontal e lateral do reator de CHT montado (recipiente + tampa).

43

Figura 11. Vista superior da tampa, do recipiente e dos acessórios (anel de vedação,

parafusos e chave) do reator de CHT.

Dados técnicos do reator de carbonização hidrotermal (recipiente e tampa)

podem ser vistos nas Figuras 12 e 14.

Figura 12. Desenho com as dimensões do recipiente do reator de CHT em cm (corte e

planta).

44

Figura 13. Desenho com as dimensões da tampa do reator de CHT em cm (corte e planta).

A operação do reator foi realizada da seguinte forma: após lavagem e

sanitização do recipiente, da tampa e do anel de vedação, colocou-se 150,0 mL da solução

do(s) hormônio(s) estudado(s), com pH corrigido para a faixa de 2 – 3, colocou-se o anel

de vedação e a tampa. Em seguida os seis parafusos foram colocados nos orifícios que

unem a tampa ao recipiente e com auxilio de uma chave, eles foram apertados para que a

vedação fosse completa. Para apertar os parafusos, apertava-se o primeiro parafuso e o

imediatamente oposto era apertado em seguida, dessa maneira até que todos estivessem

bem firmes.

O recipiente foi colocado sobre a chapa de aquecimento. Como o reator não

possui um dispositivo para medir a temperatura interna durante a operação, optou-se por

colocar um termômetro manual, apoiado na parte superior da tampa, para estimar a

temperatura superficial do reator. A chapa de aquecimento foi, então, ligada e a pressão

interna e a temperatura superficial do reator eram coletadas em intervalos de cinco minutos

durante os experimentos que variaram de 60 a 90 minutos, conforme Quadro 11. A chapa

de aquecimento com temperatura máxima de 300 ºC, era ligada no início do experimento e

por medida de segurança sempre que a pressão interna do reator passava 20 bar a mesma

era desligada até o que a pressão voltasse a ficar abaixo de 20 bar.

Após o término do processo de CHT, esperou-se o reator esfriar, em seguida

abriu-se a válvula de escape de gases para que a pressão dentro reator ficasse igual à

pressão externa e para possibilitar a saída de gases e vapor de água gerado durante o

45

processo. Um a um, os parafusos foram desapertados, ou seja, quando um parafuso era

desapertado ou outro imediatamente à sua frente também o era, até todos tivessem sido

desapertados e removidos dos orifícios. Após a remoção da tampa e do anel de vedação, o

efluente foi coletado em um béquer plástico de 500,0 mL e transferido para um frasco de

vidro do tipo Schott de 250,0 mL, anteriormente limpo (água ultrapurificada e sabão

levemente alcalino) e sanitizado (álcool etílico 70%). O frasco foi então, fechado,

identificado e armazenado em geladeira a 4 ºC.

Quadro 11. Condições do experimento realizado para avaliação do potencial do reator de carbonização hidrotermal na degradação de hormônios sexuais sintéticos.

EXPERIMENTO Nº. 01 ETINILESTRADIOL Condições Iniciais:

Volume = 150 mL ; Concentração = 0,133 mg.mL-1; pH = 2,10 (Solução de Ácido Cítrico 10%) Amostra Tempo de Reação (min) Temperatura Máx. (ºC) Pressão Máx. (Bar)

Nº. 01 320 190,0 20,0

O reator (recipiente e tampa), assim como o anel de vedação e demais

utensílios utilizados foram devidamente lavados, sanitizados e secos para que outra

amostra pudesse ser tratada.

Para verificar o potencial de degradação de hormônios sexuais sintéticos do

sistema de carbonização hidrotermal, foi realizado o Experimento Nº. 01 com

Etinilestradiol nas seguintes condições: Volume da solução = 150,0 mL; pH da solução =

2,1 (corrigido com solução de ácido cítrico a 10%); Concentração de Etinilestradiol na

solução = 0,133 mg.mL-1; Tempo de reação de CHT = 320 minutos; Temperatura máxima

superficial do reator de CHT = 190 ºC e Pressão interna máxima do reator de CHT = 20

bar. Após confirmação do potencial do sistema foram realizados outros experimentos, com

tempo de reação e catalisador diferentes, de acordo com o Quadro 11.

Após a confirmação do potencial do sistema de carbonização hidrotermal na

degradação do hormônio Etinilestradiol, foram realizados outros experimentos, com tempo

de reação e catalisador diferentes, conforme condições descritas nos Quadro 12 e 13.

46

Quadro 12. Condições dos experimentos realizados com o reator de carbonização hidrotermal para degradação dos hormônios Etinilestradiol, Gestodeno e Acetato de

Ciproterona (juntos em solução).

EXPERIMENTO Nº. 02 EE2 + GTD + AC Condições iniciais:

Volume = 150 mL ; Concentração = 0,001 mg.mL-1 ; pH = 2,28 (Solução de Ácido Cítrico a 5%) Amostra Tempo de Reação (min) Temperatura Máx. (ºC) Pressão Máx. (Bar)

Nº. 01 60 150,0 17,0 Nº. 02 60 165,5 20,0 Nº. 03 60 157,0 19,0 Média 60 157,5 18,7

DP 0 7,8 1,5 EXPERIMENTO Nº. 03 EE2 + GTD + AC

Condições Iniciais: Volume = 150 mL ; Concentração = 0,001 mg.mL-1 ; pH = 2,28 (Solução de Ácido Cítrico a 5%) Amostra Tempo de Reação (min) Temperatura Máx. (ºC) Pressão Máx. (Bar)

Nº. 01 90 175,0 30,0 Nº. 02 90 165,0 25,0 Nº. 03 90 159,0 21,0 Média 90 166,3 24,3

DP 0 8,1 4,5 EXPERIMENTO Nº. 04 EE2 + GTD + AC

Condições Iniciais: Volume = 150 mL ; Concentração = 0,001 mg.mL-1 ; pH = 2,26 (Solução de Ácido Fosfórico 10%) Amostra Tempo de Reação (min) Temperatura Máx. (ºC) Pressão Máx. (Bar)

Nº. 01 90 177,0 26,0 Nº. 02 90 157,0 20,0 Nº. 03 90 162,0 22,0 Nº. 04 90 157,00 20,0 Nº. 05 90 153,00 20,0 Nº. 06 90 156,5 20,0 Média 90 160,4 21,3

DP 0 8,6 2,4 Legenda: EE2: Etinilestradiol ; GTD: Gestodeno ; AC: Acetato de Ciproterona; DP: Desvio Padrão.

47

Quadro 13. Condições dos experimentos realizados com o reator de carbonização hidrotermal para degradação dos hormônios Etinilestradiol, Gestodeno e Acetato de

Ciproterona (soluções individuais).

EXPERIMENTO Nº. 05 ETINILESTRADIOL Condições Iniciais:

Volume = 150 mL ; Concentração = 0,001 mg.mL-1 ; pH = 2,17 (Solução de Ácido Fosfórico 10%) Amostra Tempo de Reação (min) Temperatura Máx. (ºC) Pressão Máx. (Bar)

Nº. 01 90 162,0 21,0 Nº. 02 90 161,0 21,0 Nº. 03 90 180,0 27,0 Média 90 167,7 23,0

DP 0 10,7 3,5 EXPERIMENTO Nº. 06 GESTODENO


Nº. 01 90 157 20,0 Nº. 02 90 175 23,0 Nº. 03 90 161 20,0 Média 90 164,3 21,0

DP 0,0 9,5 1,7 EXPERIMENTO Nº. 07 ACETATO DE CIPROTERONA


Nº. 01 90 177,0 28,0 Nº. 02 90 173,0 20,0 Nº. 03 90 168,0 21,0 Média 90 172,7 23,0

DP 0 4,5 4,4 Legenda: EE2: Etinilestradiol ; GTD: Gestodeno ; AC: Acetato de Ciproterona ; DP: Desvio Padrão.

5.3 CROMATÓGRAFO LÍQUIDO DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE)

O cromatógrafo líquido de alta eficiência ou HPLC utilizado nas análises de

concentração inicial e final dos hormônios sintéticos foi emprestado pela empresa Cifarma

Científica Farmacêutica Ltda. Sua utilização aconteceu nas próprias dependências, no

laboratório de físico-química do setor de Controle de Qualidade, com acompanhamento de

um analista especializado. Dados do HPLC: Cromatógrafo líquido de alta eficiência da

marca Agilent, Série 1200, com Detector de Arranjos de Diodo – DAD,

Ultravioleta/Visível – UV/Vis e fluorescência.

48

5.3.1 Quantificação e Detecção dos Hormônios

A técnica de detecção e quantificação utilizada foi desenvolvida e validada

pela empresa Cifarma Científica Farmacêutica Ltda. para o processo de validação de

limpeza de equipamentos. Para tanto, é necessário amostrar as superfícies do equipamento

em contato com o produto e estabelecer o nível de resíduos presentes, ou seja, exige uma

técnica muito sensível e específica.

Para os hormônios estudados, a técnica definiu que o Limite de Quantificação

(LQ) era de 3,562 ng.mL-1 e o Limite de Detecção (LD) era de 1,068 ng.mL-1.

Condições cromatográficas:

• Coluna: Agilent Zorbax C18 (100 X 4,6 mm);

• Comprimento de onda: 254 nm;

• Detecção: Espectrofluorimetria com excitação em 285 nm e emissão em 310

nm;

• Fase móvel: Acetonitrila Grau HPLC:Água Ultrapurificada (50:50 v/v);

• Fluxo: 1,0 mL.min-1;

• Temperatura; 30 ºC;

• Volume de Injeção: 100 µL.

A solução padrão foi injetada diretamente no vial do equipamento e as

amostras, após passarem por membrana de 0,22 µm, para remoção de fungos e/ou esporos.

O próprio “software”, controlador do cromatógrafo, possui um programa

destinado à integração dos picos e ao tratamento dos dados referentes às análises. Este

programa, dotado de diversos recursos analíticos e estatísticos, corrige imperfeições na

linha de base do cromatograma, eliminar e distinguir ruídos de picos e identificar o analito

em estudo, permitindo a integração de seu pico e posterior quantificação da presença do

analito, em estudo em cada amostra.

A presença do(s) hormônio(s) em uma dada amostra foi caracterizada por

pico(s) característico(s) no cromatograma, coincidente, temporalmente, com soluções

padrões dos compostos ou da mistura deles, previamente injetados. Cada cromatograma

concluído era, automaticamente, armazenado no software gerenciador do sistema e

disponível para posterior análise e tratamento.

A análise quantitativa em cromatografia é baseada em estabelecer o valor da

área da banda cromatográfica. Quando a banda cromatográfica é registrada na forma de

49

pico, a sua área pode ser calculada pelo software instalado no computador através de

integrações eletrônicas ou manualmente. A integração picos do cromatograma tem por

finalidade transformar a intensidade do sinal emitido pelo detector em uma medida

relacionada com a quantidade da substância analisada na amostra, correspondendo neste

estudo à concentração inicial (Ci) e final (Cf) da substância de interesse, de acordo com a

amostra injetada no equipamento.

A eficiência do tratamento foi calculada de acordo com a Equação (1).

(1)

Onde:

E = Eficiência

Ci = Concentração inicial

Cf = Concentração Final

5.4 TRATAMENTO BIOLÓGICO

5.4.1 Microrganismos

Os microrganismos utilizados nesta pesquisa fazem parte da coleção do

Laboratório de Enzimologia e Biocatálise Ambiental da Faculdade de Farmácia – FF, da

Universidade Federal de Goiás – UFG, adquiridos da Fundação André Tosello – Campinas

– SP. As cepas utilizadas foram: Pycnoporus sanguineus (CCT – 4518) e Trametes villosa

(CCT – 5567).

As espécies Pycnoporus sanguineus e Trametes villosa apresentaram grande

potencial na redução de toxicidade do organofosforado Acefato em meio líquido, em

experimentos realizados por Jardim (2010).

5.4.2 Meio de Cultura

O meio de cultura do tipo BGA (Batata, Glicose, Ágar) foi utilizado como

meio basal para o desenvolvimento dos cultivos fúngicos tanto na manutenção das cepas

50

quanto nos experimentos. Os reagentes utilizados no meio sólido e líquido encontram-se

no Quadro 14.

Quadro 14: Meios de cultura utilizados nos experimentos biológicos. REAGENTES MEIO SÓLIDO MEIO LÍQUIDO

Glicose 5,0 g 20,0 g Caldo de Batata 50,0 mL 200,0 mL

Ágar 3,75 g Ausente Água Destilada para 250,0 mL para 1000,0 mL

O caldo de batata foi feito a partir do cozimento de 1,0 kg de batata inglesa,

adquirida comercialmente, em 1,0 L de água mineral.

5.4.3 Manutenção dos Microrganismos

Para manutenção das cepas e utilização dos fungos nos experimentos, o cultivo

foi realizado em placas de Petri contendo meio de cultura sólido. Os fungos foram

replicados conforme metodologia de Castellani (1967) descrita a seguir.

Após pesagem em balança analítica e mistura com reagentes, o meio de cultura

foi autoclavado a 120 ºC durante 20 minutos, para torná-lo estéril. Em seguida, cerca 15,0

a 20,0 mL de meio foram transferidos para as placas de Petri, que foram deixadas em

repouso até a solidificação do meio. Em capela de fluxo laminar, um disco de tamanho

referente à abertura maior de uma ponteira de 1,0 mL, foi inoculado em cada placa, que

foram armazenadas em uma incubadora BOD a 26 º durante 07 dias para crescimento

satisfatório dos fungos, sendo essa a idade padronizada do inóculo a ser utilizado durante

os experimentos.

5.4.3.1 Tratamento dos hormônios em meio de cultura líquido

Os experimentos em meio de cultura líquido foram realizados sob condição de

agitação e aconteceu no período de 02 a 23/04/12 no Laboratório de Enzimologia e

Biocatálise Ambiental da Faculdade de Farmácia – FF, da Universidade Federal de Goiás –

UFG. Nesta etapa foram utilizadas as duas espécies de fungos citadas no item 5.4.1.

Para o tratamento dos hormônios com os fungos, separadamente, optou-se por

utilizar a solução com os três hormônios juntos, tendo em vista a concentração muito

51

reduzida dos hormônios nas amostras individuais e a disponibilidade do equipamento

CLAE para a realização das análises finais na empresa Cifarma.

Foram retirados sete discos de tamanho referente à abertura maior de uma

ponteira de 1,0 mL, de cada espécie fúngica com 07 dias de crescimento e transferidos

separadamente para Erlenmeyers de 250,0 mL, com volume útil de aproximadamente

150,0 mL, contendo 100,0 mL de meio de cultura do tipo BGA (Água + glicose + caldo de

batata – 8% do volume final) e 50,0 mL da solução contendo os três hormônios (0,001

mg.mL-1). Os Erlenmeyers contendo apenas o meio de cultura foram previamente

autoclavados a 120°C por 20 minutos e deixados sob o fluxo laminar até que atingissem a

temperatura ambiente. O procedimento microbiológico de inoculação, assim como a adição

da solução dos hormônios foram realizadas dentro de uma capela de fluxo laminar, a fim

de manter as condições estéreis, de acordo com metodologia de Castellani (1967).

Como os fungos passam por uma fase de adaptação, optou-se por manipular

um meio de cultura pobre em nutrientes (8% de caldo de batata), mas não isento, dessa

forma eles teriam os nutrientes necessários para o desenvolvimento inicial e após esse

período utilizariam os hormônios como fonte de carbono, conforme descrito por

Verbinnem (2009).

Os Erlenmeyers foram mantidos em um agitador orbital (Shaker), em rotação

de 120 rpm por 21 dias a 26ºC. Foi definido um grupo de controle em que os hormônios

estudados não estavam presentes, sendo portanto, o controle da atividade enzimática da

Lacase produzida pelos fungos, nomeado de “Branco”, conforme Quadro 15. De acordo

com estudos realizados por Jardim (2010), o pico de produção enzimática dos fungos

Pycnoporus sanguineus e Trametes villosa ocorre por volta do 15º dia de cultivo em meio

líquido, tendo em vista este dado, optou-se por realizar o experimento em 21 dias.

Quadro 15: Experimentos realizados com Pycnoporus sanguineus e Trametes villosa na presença dos hormônios sintéticos: Acetato de Ciproterona (AC), Etinilestradiol (EE2) e

Gestodeno (GTD).

Experimento Concentração (mg.mL-1)

P. sanguineus T. villosa Amostra

Nº. 01 Amostra

Nº. 02 Amostra

Nº. 01 Amostra

Nº. 02 AC + EE2 + GTD 0,000333* 3hPS1 3hPS2 3hTV1 3hTV2

Controle 0,00 CPS CTV Legenda: *Concentração de cada hormônio na mistura; 3h: três hormônios juntos (AC + EE2 + GTD); PS: P. sanguineus; TV: T. villosa; CPS: Controle de P. sanguineus; CTV: Controle de T. villosa

52

Para padronização dos experimentos em meio líquido foram adotados: (1)

experimentos em duplicata, (2) retirada de 0,6 mL do sobrenadante de cada frasco a cada

07 dias durante os 21 dias dos experimentos, perfazendo o total de 03 coletas, para

dosagem enzimática da Lacase, (3) não houve acréscimo de meio de cultura para não

modificar a concentração dos hormônios.

Devido à disponibilidade do equipamento de CLAE na indústria Cifarma,

somente no final do experimento, ou seja, 21º dia foram retirados 10,0 mL de cada amostra

para doseamento dos hormônios. As coletas foram feitas no laboratório de Enzimologia da

Faculdade e Farmácia da Universidade Federal de Goiás – UFG, em frascos de vidro de

15,0 mL e transportadas para o laboratório de físico-química da indústria Cifarma

Científica Farmacêutica, onde foram estocados em refrigerador a 4 ºC até a realização do

doseamento. Nesse dia também foram retirados 20,0 mL para realização dos testes de

toxicidade com Allium cepa e 10,0 mL para os testes com Artemia salina, que

permaneceram estocados em refrigerador a 4 ºC, dentro do próprio laboratório de

Enzimologia até a realização dos testes.

O cálculo da eficiência do tratamento biológico na degradação dos hormônios

foi realizado conforme descrito no item 5.3.1.

5.4.4 Determinação da Atividade Enzimática

A coleta de alíquotas do sobrenadante de cada amostra foi realizada em capela

de fluxo laminar, com material estéril, no 7º, 14º e 21º dia de cultivo.

A atividade enzimática da Lacase foi determinada segundo metodologia de

Szklarz et al., (1989-modificado): a oxidação da seringaldazina é conduzida em uma

mistura de reação que continha 0,6 mL do sobrenadante dos Erlenmeyers, 0,2 mL do

tampão acetato de sódio 50 mmol.L-1 (pH 5,0) e 0,1 mL de seringaldazina 1,0 mmol.L-1

preparada em etanol. A reação foi iniciada pela adição da seringaldazina e a velocidade

desta reação acompanhada por 05 minutos, com auxílio de um cronômetro. As leituras da

atividade enzimática da Lacase foram realizadas em espectrofotômetro em comprimento de

onda de 525 nm, sendo ε = 65.000 mmol.L-1.cm-1.

Para determinação do cálculo enzimático foi utilizada a Equação 02 descrita

por Leonowicz & Grzywnowicz (1981) apud Menezes, Silva e Durrant (2009):

53

(2)

Onde:

∆E = Absorbância no comprimento de onda específico (nm);

ε = Coeficiente de extinção molar para cada substrato (mmol.L-1.cm-1);

∆t = Tempo de reação (min);

R = Quantidade de caldo enzimático (mL);

U = quantidade de enzima necessária para oxidar 1µmol de substrato por

minuto (U.mL.min-1).



Para realização do teste com Artemia salina foram adquiridos em loja

especializada em artigos para aquários e psicultura: uma bomba de aeração para aquário,

uma lâmpada de luz branca, fio com soquete para lâmpada, sal marinho e ovos de Artemia

salina.

O experimento de toxicidade com A. salina foi baseado na técnica descrita por

Meyer et al. (1982), com adaptações. Cerca de 100,0 mg de ovos de Artemia salina foram

eclodidos, durante 48 horas em uma cuba de vidro aerada com de 1,0 L de solução salina

(pH = 8), feita com água ultrapurificada e 38,0 g de sal marinho, e iluminação artificial

(Figura 14). Após a eclosão, as larvas foram transferidas em pequenas quantidades para

placas de Petri e selecionadas.

O experimento foi separado em 04 grupos, sendo que o primeiro grupo recebeu

apenas solução salina (controle); O segundo grupo recebeu solução e alíquotas da solução

de hormônios sem qualquer tratamento; O terceiro grupo recebeu a solução salina e

alíquotas da solução de hormônios após o tratamento por carbonização hidrotermal; e o

quarto grupo, a solução salina e alíquotas da solução de hormônios após tratamento com os

fungos.

54

Figura 14. Cuba para eclosão dos ovos de Artemia salina.

Da solução sem nenhum tratamento (1000,0 ng.mL-1 de cada hormônio) e da

solução após tratamento com o reator de carbonização hidrotermal (6,2 ng.mL-1 de EE2 +

56,68 ng.mL-1 GTD + 314,29 ng.mL-1 de AC) foram retiradas alíquotas de 100, 200, 300,

500 e 1000 µL. Da solução com os três hormônios após o tratamento biológico foi retira

uma alíquota de 100 µL. As alíquotas foram transferidas separadamente para tubos de

ensaio que já continham 1,0 mL de solução salina (pH = 8,0) e 10 larvas eclodidas

anteriormente de A. salina, obtendo-se concentrações de 9,09%, 16,70%, 23,10%, 33,30%

e 50,0% dos hormônios dentro dos tubos de ensaio, conforme Quadro A – 12 e A – 13 do

Apêndice A. As amostras foram submetidas à iluminação artificial durante 24 horas e após

este período foram contabilizadas as larvas, após cinco minutos de observação, que não

apresentavam qualquer tipo de movimento. O experimento foi realizado em triplicata para

cada concentração. O teste de controle também foi realizado em triplicata.

5.5.2 Allium cepa

Para realização do teste de germinação com Allium cepa, foram adquiridos em

loja especializada em artigos agropecuários, pacotes com 400,0 mg de sementes de cebola

(Allium cepa) da variedade baia periforme, marca Feltrin Sementes.

Os experimentos foram conduzidos conforme método de “blotter” utilizado por

Rodo (2002), com adaptações para este estudo. Em uma caixa de papelão foram colocadas

sementes de Allium cepa para germinar a temperatura ambiente, na ausência de luz, dentro

55

de placas Petri forradas com papel de filtro embebido com 7,5 mL das amostras de

interesse. Todos os dias, durante os 07 dias de pesquisa, eram adicionados 1,5 mL da

solução de interesse na placa Petri com as sementes, de acordo com os seguintes

experimentos:

Grupo I: Controle (água mineral);

Grupo II: Hormônios sem qualquer tratamento (solução dos três hormônios a

1000,0 ng.mL-1);

Grupo III: Hormônios após o tratamento de carbonização hidrotermal (amostra

tratada da solução dos três hormônios, concentração: 6,2 ng.mL-1 de Etinilestradiol +

56,68 ng.mL-1 Gestodeno + 314,29 ng.mL-1 de Acetato de Ciproterona);

Grupo IV: Hormônios após tratamento com os fungos.

Em cada placa foram colocadas 100 sementes para germinação, conforme

Figura 15. A contabilização das sementes germinadas, por tratamento, foi feita

diariamente, sempre à mesma hora, durante 07 dias.

Figura 15: Placa de Petri contendo 100 sementes de Allium cepa para o experimento de

toxicidade.

56

6 RESULTADOS E DISCUSSÃO

As avaliações de degradação do estrogênio Etinilestradiol e dos progestagênios

Acetato de Ciproterona e Gestodeno são muito importantes, pois concentrações da ordem

de ng.L-1 são prejudiciais a algumas espécies de peixes.

No processo de carbonização hidrotermal o material orgânico passa por uma

fase de monomerização, seguida de um processo de polimerização, após o qual se obtém

um carvão desidratado com um elevado poder calorífico e água por união das moléculas de

hidrogênio e oxigênio que perderam as cadeias de hidrocarbonetos. A ideia é encontrar

condições mais brandas de temperatura e pressão e menor tempo de reação, para que esse

processo possa ser utilizado no tratamento de efluente e águas contaminadas com

substância recalcitrantes e tóxicas, como os hormônios Etinilestradiol, Gestodeno e

Acetato de Ciproterona.

No tratamento biológico, o fungo utiliza compostos orgânicos considerados

tóxicos e/ou carcinogênicos como substrato para a produção de enzimas, que são capazes

de degradá-los e transformá-los em outros produtos.

6.1 EXPERIMENTOS COM CARBONIZAÇÃO HIDROTERMAL

O Experimento Nº. 01 para conhecer o potencial do reator de carbonização

hidrotermal na degradação do hormônio Etinilestradiol foi considerado satisfatório, uma

vez que após o tratamento o hormônio ficou abaixo dos limites de quantificação e detecção

do equipamento CLAE utilizado (Limite de Quantificação (LQ) = 3,562 ng.mL-1 e Limite

de Detecção (LD) = 1,068 ng.mL-1. O cromatograma do Etinilestradiol, antes e após o

tratamento, pode ser visualizado através das Figuras 16 e 17. O resultado obtido no

Experimento Nº. 01 foi superior ao obtido por Fernandes em 2007, com processo de

oxidação do 17α-Etinilestradiol com Hipoclorito de Sódio em água, com dosagens de 5 e

10 mg.L-1 (redução da concentração do estrogênio na água, em níveis maiores a 97,5%). É

importante ressaltar que uma redução de 97,5% de 5,0 mg.L-1 ainda resultará em uma

concentração final de 0,125 mg.L-1 e que de acordo com BILA e DEZOTTI (2003) e

FENT et al. (2006) concentrações na casa de ng.L-1 já provocam alterações endócrinas em

organismos aquáticos como peixes.

57

A Figura 16 mostra o pico característico da solução de Etinilestradiol em

leitura de CLAE, antes do tratamento. O pico do Etinilestradiol está bem definido no

tempo de retenção entre 3-4 minutos. A Figura 17 mostra o pico de Etinilestradiol após o

tratatamento, sendo possível observar que não houve a formação do pico característico do

Etilinilestradiol, mesmo após a diminuição da escala de 400 para 3,0 mV.

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 min

0

100

200

300

mVDetector B:Ex:285nm,Em:310nm

4818

3

3847

093

Figura 16: Cromatograma do Etinilestradiol antes do tratamento por carbonização

hidrotermal.

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 min

-2.5

0.0

2.5

mVDetector B:Ex:285nm,Em:310nm

6565

3

Figura 17: Cromatograma de Etinilestradiol após o tratamento por carbonização

hidrotermal.

Um detalhe importante do Experimento Nº. 01 foi a cor marrom-amarelada

resultante da amostra após passar pelo processo de carbonização (Figura 18), em

decorrência do processo de carbonização dos compostos da solução. A amostra em

questão, também apresentou odor ácido moderado, levemente irritante.

Para as condições desse experimento, uma planta em escala industrial do reator

de CHT para tratamento de efluente, deverá levar em consideração a necessidade de

implementação de um sistema de remoção de cor após o processo, como por exemplo, o

carvão ativado em pó (CAP), que aumentaria uma etapa no processo de tratamento e os

custo final e de operação do projeto.

58

Figura 18: Aspecto da solução antes e depois do tratamento de carbonização hidrotermal.

Para doseamento em CLAE, as amostras do Experimento Nº. 02 (Amostras Nº.

02 e 03) foram analisadas individualmente e com leitura em triplicata. Já no Experimento

Nº. 04, as Amostras Nº. 04, 05 e 06 foram misturadas, uma alíquota de 10,0 mL retirada e

enviada para a leitura em duplicata. O Quadro 16 apresenta a média dos resultados.

A Amostra Nº. 01 do Experimento Nº. 02 e as Amostras Nº. 01, 02 e 03 dos

Experimentos Nº. 03 e Nº. 04 foram perdidas em decorrência de descarte equivocado por

técnicos do laboratório onde estavam armazenadas.

Quadro 16. Valores médios de degradação e concentração resultante (ng.mL-1) dos hormônios Etinilestradiol, Gestodeno e Acetato de Ciproterona após experimentos de

degradação com carbonização hidrotermal.

Experimento

Degradação Média (%) Massa Média Resultante (ng.mL-1) EE2 GTD AC EE2 GTD AC

Nº. 01 <LD - - NA - - Nº. 02 78,1 58,8 25,7 218,55 411,69 742,91 Nº. 03 AP AP AP NA NA NA Nº. 04 99,4 94,3 68,9 6,28 56,64 310,71 Nº. 05 99,8 - - 2,12 - - Nº. 06 - 99,3 - - 6,76 - Nº. 07 - - <LD - - NA

Legenda: EE2: Etinilestradiol ; GTD: Gestodeno ; AC: Acetato de Ciproterona ; NA: Não Aplicável ; AP: Amostra Perdida ; <LD: Abaixo do Limite de Detecção.

59

De acordo com o Quadro 16, anterior, o Experimento Nº. 02 apresentou melhor

média de degradação para os hormônios Etinilestradiol (78,1%) e Gestodeno (58,8%) do

que para o Acetato de Ciproterona (25,7%) Este último, quando comparado com os

demais, apresenta uma estrutura molecular mais complexa, com fortes ligações cíclicas e

também uma molécula de Cl, tornando sua degradação ainda mais difícil.

A coloração da solução efluente do Experimento Nº. 02, após o tratamento de

CHT, apresentou-se levemente amarelada (Figura 19), com odor ácido de moderado a forte

levemente irritante, aspecto semelhante ao da solução efluente do Experimento Nº. 01.

Tanto a coloração quanto o odor, possivelmente se devem ao ácido cítrico utilizado para

correção do pH nos Experimentos Nº. 01 e Nº. 02, pois nos experimentos subsequentes,

com ácido fosfórico, não foi observada nem a coloração amarelada, nem o odor ácido

moderado irritante.

Figura 19: Aspecto das soluções efluentes do Experimento Nº. 02 após passarem por

tratamento de CHT.

No Experimento Nº. 04, com ácido fosfórico e tempo de reação de 90 minutos,

foram realizadas seis repetições com o reator de CHT, sendo que as amostras (Nº. 04, 05 e

06) foram misturadas e originaram uma amostra única para leitura em CLAE (Amostra Nº.

4-6). Os resultados foram processados e analisados, obtendo-se valores médios

satisfatórios para a degradação dos hormônios Etinilestradiol e Gestodeno, conforme visto

anteriormente no Quadro 16. O hormônio Acetato de Ciproterona obteve um resultado

médio de degradação de 68,9%, confirmando a tendência dos resultados obtidos durante o

Experimento Nº. 01 e comprovando a maior estabilidade dessa molécula.

60

As soluções efluentes das três amostras do Experimento Nº. 04 podem ser

observadas na Figura 20. Diferentemente dos Experimentos Nº. 01 e Nº. 02, as soluções do

Experimento Nº. 04 visualmente não apresentaram cor e nem odor ácido irritante. Nesse

sentindo, para implantação de uma planta industrial de tratamento de efluente com a

presença dos hormônios Etinilestradiol, Gestodeno e Acetato de Ciproterona via CHT, o

ácido fosfórico apresenta mais vantagens operacionais que o ácido cítrico.

Figura 20: Aspecto das soluções efluentes do Experimento Nº. 04 após passarem por

tratamento com o reator de CHT.

A degradação incompleta dos hormônios, possivelmente está relacionada ao

tempo de reação durante a CHT. Como as condições ideias de reação não foram alcançadas

e mantidas durante o processo (±200 ºC e 20 bar), a degradação/carbonização dos

hormônios foi incompleta.

Os comportamentos da temperatura e da pressão das seis amostras do

Experimento Nº. 04 podem ser observados nos gráficos das Figuras 21 e 22.

61

Figura 21: Comportamento de temperatura das amostras Nº. 01, 02, 03, 04, 05 e 06 durante

do Experimento Nº. 04 com o reato de CHT (valores médios).

Figura 22: Comportamento de temperatura das amostras Nº. 01, 02, 03, 04, 05 e 06 durante

do Experimento Nº. 04 com o reator de CHT (valores médios).

A chapa de aquecimento utilizada como fonte de calor para o reator nos

Experimentos Nº. 02, 03, 04, 05, 06 e 07 atingia a temperatura máxima de 300 ºC, mas em

decorrência das perdas de calor para o ambiente as temperaturas superficiais do reator não

62

ultrapassaram 180 ºC, diferentemente do Experimento Nº. 01, onde a temperatura

superficial atingiu 190 ºC, mas o reator foi coberto por lã de vidro e papel alumínio (Figura

23), perdendo menos calor para o ambiente.

Figura 23: Reator de CHT e acessórios utilizados durante o Experimento Nº. 01.

Durante os Experimentos Nº. 02, 03, 04, 05, 06 e 07, observou-se que a chapa

de aquecimento entrava em standby por alguns instantes (±10 minutos), provavelmente ao

atingir a temperatura máxima ou a temperatura de segurança, equivalente a cerca de 150 ºC

na superfície do reator. Esse fator pode ter interferido no processo de degradação dos

hormônios, pois ao entrar em standby, a temperatura e a pressão no reator diminuíam, não

atingindo os valores considerados ideais para o processo de CHT que é de ±200 ºC e 20

Bar de pressão interna.

A chapa de aquecimento utilizada como fonte de calor nos experimentos

apresentou uma variação de tempo de 35 – 40 minutos até que a temperatura e a pressão

durante o processo de CHT fossem estabilizadas e mantidas durante os 50 ± 5 minutos

restantes de reação (Temperatura média = 153,5 ± 3,0 ºC e Pressão média = 18,2 ± 2,1

Bar).

Com um sistema de aquecimento fechado e adaptado ao reator de CHT, onde

as perdas de calor e as variações de temperatura são menores e onde o processo já se inicie

em temperaturas próximas à ideal, é possível inferir por regressão linear, que a degradação

total dos hormônios (Etinilestradiol, Gestodeno e Acetato de Ciproterona) aconteça entre

63

30 a 60 minutos de reação. Nas condições dos experimentos realizados, estima-se, também

por regressão linear, que a degradação total da mistura de hormônios aconteça entre 120 e

150 minutos.

O tipo de fonte de calor é fundamental para um sistema de CHT, pois refletirá

diretamente nos custos de implementação e operação, no tempo de reação e na eficiência

do processo. Estudos realizados por Schmolke (2009) mostram viabilidade na utilização de

um sistema de aquecimento solar para realização do processo de CHT em grande parte do

território brasileiro, pois em certos locais o sistema pode atingir temperaturas superiores a

260 ºC.

A utilização de um sistema de aquecimento solar para fornecer o calor

necessário, parcial ou total, diminuiria consideravelmente os custos de operação de uma

planta industrial de CHT e também tornaria o processo mais sustentável.

6.1.1 Amostras individuais de Etinilestradiol, Gestodeno e Acetato de

Ciproterona

Depois de avaliar a eficiência do sistema de CHT na degradação de amostras

com os três hormônios juntos, foram realizados estudos individuais de degradação desses

compostos.

Os resultados para as amostras individuais se mostraram mais satisfatórios que

os resultados obtidos para as amostras onde os hormônios foram misturados.

O Etinilestradiol teve índice de degradação de 99, 79%, com 2,12 ng.mL-1 de

resíduo. O Gestodeno atingiu 99,32%, com resíduo de 6,76 ng.mL-1 e, contrariando os

experimentos anteriores, a concentração final de Acetato de Ciproterona ficou abaixo do

Limite de Detecção e Quantificação da técnica utilizada por CLAE, não sendo possível

detectar e quantificar qualquer resíduo desse hormônio.

Nos cromatogramas do Apêndice A, é possível perceber que houve a

degradação dos compostos estudados, pois picos de substâncias desconhecidas foram

formados em tempos de retenção diferentes dos compostos iniciais, no entanto, nesta

pesquisa não foi possível identificar quais as substâncias formadas ou se elas apresentam

alguma ação de interferência endócrina (estrogênica ou progestagênica).

O aspecto das soluções efluentes individuais dos hormônios manteve o mesmo

padrão da solução obtida no Experimento Nº. 04, conforme é possível notar nas Figuras 24,

25 e 26. Não foi visualmente observada cor, nem odor nas amostras.

64

Figura 24: Aspecto das soluções de Etinilestradiol do Experimento Nº. 05, após passarem

por tratamento de CHT.

Figura 25: Aspecto das soluções com Gestodeno do Experimento Nº. 06, após passarem

por tratamento de CHT.

Figura 26: Aspecto das soluções com Acetato de Ciproterona do Experimento Nº. 07, após

passarem por tratamento de CHT.

65

6.2 TRATAMENTO BIOLÓGICO COM P. SANGUINEUS E T. VILLOSA

A dosagem da enzima Lacase (Lcc) ocorreu conforme descrito no item 5.4.4,

sob condição de agitação (shaker). O Quadro 17 apresenta os valores obtidos durante os

experimentos com os dois microrganismos.

Quadro 17: Produção de Lacase (U.mL-1) na presença e na ausência (controle) dos hormônios Etinilestradiol, Gestodeno e Acetato de Ciproterona.

Amostra T. villosa P. sanguineus

7º 14º 21º 7º 14º 21º CONTROLE 1,141 0,218 0,049 3,064 10,623 11,028

EE2 + GTD +AC 1,236 0,513 0,159 12,618 1,290 12,049 Legenda: EE2: Etinilestradiol ; GTD: Gestodeno ; AC: Acetato de Ciproterona.

O experimento evidenciou aspectos importantes na produção enzimática como:

picos enzimáticos antecipados na presença dos hormônios, maior produção na presença dos

hormônios. Além disso, a morfologia dos fungos sofreu influência devido a essa presença.

6.2.1 Trametes villosa

O fungo Trametes villosa, de forma geral apresentou baixa produção

enzimática e decréscimo exponencial de produção ao longo dos 21 dias de cultivo (Figura

27). O pico da Lcc ocorreu no 7º dia. Na presença dos hormônios a produção de Lacase foi

ligeiramente maior (1,236 ± 0,044 U.mL-1) que do Grupo Controle (1,141 ± 0,308 U.mL-1).

Esse resultado permite inferir que os hormônios podem exercer a função de indutor, ainda

que, proporcionando pouco acréscimo enzimático. Jardim (2010), obteve melhores

resultados na degradação do organofosforado Acefato 50%, cujo pico enzimático de

Lacase (6,27 U.mL-1) foi alcançado no 10º dia. O grupo controle apresentou maior

produção de Lcc também no 7º dia, com valores insignificantes nos dias seguintes.

Apesar de a atividade enzimática ter sido maior no Grupo com Hormônios, a

biomassa de T. villosa formada durante o período de cultivo foi visualmente mais espessa e

volumosa no Grupo Controle, conforme pode ser observado nas figuras 28, 29 e 30. Em

estudos com Acefato, Jardim (2010) afirma que a biomassa produzida durante o cultivo de

66

T. villosa em meio estático não apresentou relação com a produção enzimática, mas em

cultivo sob agitação essa relação foi confirmada.

Figura 27: Gráfico da produção enzimática de Lacase durante o tratamento dos hormônios

com T. villosa (valores médios com desvio padrão).

Figura 28: Desenvolvimento em meio líquido de T. villosa no 7º dia. A: Grupo Controle;

B: Grupo com Hormônios.



67



6.2.2 Pycnoporus sanguineus

Em Pycnoporus sanguineus, os hormônios exerceram forte influência no

desempenho de seu complexo enzimático. No gráfico da Figura 31 é possível notar que o

pico de Lcc aconteceu no 7º dia, com valores expressivos de produtividade (12,618 ± 0,453

U.mL-1), decaindo a produção no 14º dia (1,290 ± 0,417 U.mL-1) e voltando a ter um novo

pico de produção no 21º dia (12,049 ± 0,351 U.mL-1) , apresentando um comportamento

cíclico de produção. Quando comparado com o comportamento enzimático do Grupo

Controle, cuja produção maior ocorreu no 14º dia, sugere-se que a presença dos hormônios

Etinilestradiol, Gestodeno e Acetato de Ciproterona possam antecipar a produção de Lcc.

Jardim (2010) e Gomes et al. (2009), quando testaram a produção de Lcc em P. saguineus

em diferentes meios de cultivo, também constataram a influência dos componentes do

meio na antecipação da produtividade enzimática.

Houve pouca diferença de valores máximos de Lcc entre a amostra com os

hormônios, 12,618 U.mL-1, e o Grupo Controle, 11,028 ± 1,092 U.mL-1. Desta forma

considera-se que o P. sanguineus teve bom desempenho na presença dos hormônios

sexuais sintéticos estudados. Comportamento semelhante ao estudo com o organofosforado

Acefato realizado por Jardim (2010). Gonzáles et al. (2008) afirmam que essa espécie é

capaz de tolerar muito bem as condições severas de toxicidade, pois seu desenvolvimento e

produtividade foi satisfatório na presença de 30 ppm de petróleo bruto.

Na Figura 34 é possível observar que as duas amostras do Grupo com

Hormônios apresentou coloração diferenciada do Grupo Controle. Jardim (2010) também

observou no final do tratamento estático do Acefato 10% com P. sanguineus, mudanças de

coloração de uma amostra. Na natureza essa espécie de fungo muitas vezes se apresenta

com coloração bem avermelhada, por isso do nome de sanguineus (sangue). Alguns

68

microrganismos em contato com substâncias potencialmente tóxicas ou estressantes podem

alterar sua coloração.

Figura 31: Gráfico da produção enzimática de Lacase durante o tratamento com P.

saguineus (valores médios com desvio padrão).

Pelas figuras 32, 33 e 34 é possível observar que o desenvolvimento da

biomassa no Grupo Controle foi visualmente maior e mais homogênea, com formação de

inúmeras pequenas colônias.

Figura 32: Desenvolvimento em meio líquido de P. sanguineus no 7º dia. A: Grupo

Controle; B: Grupo com Hormônios.

69





6.2.3 Análise dos Hormônios Após o Tratamento Biológico

Após a finalização dos testes com meio de cultura líquido, amostras do

sobrenadante dos frascos que continham os hormônios e as mesmas enviadas para análise

em CLAE. Os resultados podem ser observados no Quadro 18.

Quadro 18. Valores médios de degradação e concentração resultante (ng.mL-1) dos hormônios Etinilestradiol, Gestodeno e Acetato de Ciproterona após tratamento com P.

sanguineus e T. villosa.

Experimento

Degradação Média (%) Concentração Média Resultante (ng.mL-1)

EE2 GTD AC EE2 GTD AC

P. sanguineus 99,39 78,93 <LD 2,05 70,20 NA T. villosa <LD 78,93 <LD NA 70,20 NA

Legenda: EE2: Etinilestradiol ; GTD: Gestodeno ; AC: Acetato de Ciproterona ; <LD: Abaixo do Limite de Detecção ; NA: Não Aplicável.

Conforme Quadro 18, é possível notar que tanto o tratamento com P. saguineus

quanto o tratamento com T. villosa se apresentaram eficientes na remoção e/ou degradação

dos hormônios Etinilestradiol e Acetato de Ciproterona e moderadamente eficientes para o

70

Gestodeno. Diferentemente do teste realizado com o reator de carbonização hidrotermal,

onde solução com a mistura de hormônios, o Acetato de Ciproterona se mostrou mais

difícil de degradar, no experimento biológico o Gestodeno se mostrou mais estável.

Mesmo com quantidades muito diferentes de produção enzimática de Lacase,

os fungos P. sanguineus e T. villosa obtiveram desempenho semelhante na degradação dos

hormônios estudados. É sabido que fungos de decomposição branca produzem outros tipos

de enzimas como a Manganês Peroxidase e a Lignina Peroxidase, que não foram

consideradas nesta pesquisa. Os valores de Manganês Peroxidase e Lignina Peroxidase

encontrados nos estudos desenvolvidos por Jardim (2010) foram insignificantes na

presença do organofosforado Acefato.

Sabendo que a densidade dos hormônios estudados é maior que da água,

naturalmente eles tendem a se acumular nos sedimentos, e conhecendo seu potencial de

bioacumulação através do Log Kow, convém deduzir que parte da massa desses hormônios

poderia ter sido acumulada na biomassa do fungo ou simplesmente adsorvidos por eles. No

entanto, ao analisar na Figura 35 o cromatograma da solução padrão dos hormônios e nas

Figuras 36 e 37, os cromatogramas das soluções após passar pelo tratamento fúngico, é

possível notar neste último a presença de picos desconhecidos, que podem ser os

subprodutos de degradação, mas também podem ser enzimas fúngicas formadas durante o

cultivo (Lacase, Manganês Peroxidase e Lignina Peroxidase). É conveniente, nesse caso,

utilizar, também, espectrometria de massa, para descobrir que substâncias são essas.

Jardim (2010) realizou estudos de adsorção do Acefato na biomassa fúngica,

mas não detectou o organofosforado na biomassa.

71

Figura 35: Cromatograma da solução padrão de Etinilestradiol, Gestodeno e Acetato de

Ciproterona.

Figura 36: Cromatograma da solução com Etinilestradiol, Gestodeno e Acetato de

Ciproterona após tratamento com T. villosa.

72

Figura 37: Cromatograma da solução de Etinilestradiol, Gestodeno e Acetato de

Ciproterona após tratamento com P sanguineus.

Comparando-se o potencial e a eficiência de ação dos dois métodos

pesquisados, percebe-se que ambos apresentaram bons resultados na degradação dos

hormônios Etinilestradiol, Gestodeno e Acetato de Ciproterona. No caso da carbonização

hidrotermal, principalmente, quando cada tipo de hormônio é tratado separadamente.

Os tratamentos por carbonização hidrotermal e fúngico se mostraram viáveis,

podendo ser empregados em conjunto para garantir a remoção e/ou degradação dos

compostos estudados.

O emprego de novas técnicas para a remoção de fármacos presentes em

efluentes e águas contaminadas, mesmo em reduzidas concentrações, deve ser empregado

com cautela, tendo em vista a existência da possibilidade de formação de subprodutos. Os

subprodutos formados são função, tanto dos grupos químicos funcionais de cada molécula,

quanto das propriedades físico-químicas da água e das outras substâncias utilizadas.

73


O objetivo de avaliar a toxicidade do efluente é averiguar se os produtos

formados pelo processo de carbonização hidrotermal da solução com a mistura dos três

hormônios estudados são mais tóxicos que os compostos na solução sem tratamento.

6.3.1 Allium cepa

No teste de germinação com Allium cepa, as sementes são colocadas à prova

frente ao possível agente tóxico, determinando quantas sementes, em cem, germinam por

dia quando expostas a este agente.

Considerando que germinação de 63 sementes do Grupo Controle com água

mineral corresponda a 100% do potencial de germinação das sementes adquiridas

comercialmente, foi possível observar que o Grupo com a Solução de Hormônios após o

tratamento de CHT apresentou a mesma quantidade de sementes germinadas (Figura 38),

ou seja, 100%. A solução de hormônios in natura, não tratada, apresentou um índice de

germinação de 33,3% e pouco vigor dos brotos das sementes. Fernandes et al. (2009)

analisando células de cebola tratadas com Trifuralina (herbicida), que também é um

interferente endócrino, verificaram a inibição do índice mitótico, além de induzir alterações

cromossômicas e nucleares.

Figura 38: Germinação das sementes de Allium cepa.

74

Diante desse fato, podemos inferir que a solução com os hormônios

Etinilestradiol, Acetato de Ciproterona e Gestodeno sem tratamento, mesmo em

concentração baixas (1.000,0 ng.mL-1), podem interferir no processo de germinação das

sementes de Allium cepa, reduzindo em 66,7% a possibilidade de germinação das

sementes, quando comparado com o grupo controle. Tal fato comprova a citação feita por

Lai et al. (2002), de que estrogênios não induzem efeitos adversos somente em animais,

mas também interferem no crescimento e desenvolvimento de plantas.

O efluente pós-tratamento com reator de CHT não interferiu quantitativamente

no processo de germinação das sementes de Allium cepa. No entanto, observou-se que as

sementes germinadas apresentaram vigor do broto inferior ao do Grupo Controle (Figuras

39 e 40).

Estudos relacionados aos mecanismos de ação dos hormônios sexuais

sintéticos sobre os vegetais ainda são escassos na literatura, no entanto, segundo FERRI

(1985), HOPKINS, (2000) e KENDE e ZEEVAART (1997) sabe-se que nesse grupo os

principais meios de comunicação intercelular são os hormônios, mensageiros químicos

primários que carregam a informação entre células e, desta forma, coordenam o seu

crescimento e desenvolvimento. Nesse sentido é possível inferir que os hormônios sexuais

sintéticos podem promover ou inibir vários aspectos do desenvolvimento da planta, ao

interferir no complexo ativo hormônio-receptor que inicia uma cascata de eventos

bioquímicos/moleculares que finalmente levam à resposta final.

Figura 39: Placa de Petri contendo as sementes de Allium cepa após germinação com água

mineral (Grupo Controle).

75

Figura 40: Placas de Petri contendo as sementes de Allium cepa após germinação com

solução contendo os três hormônios antes e após o tratamento com CHT (Grupo antes do tratamento à esquerda e Grupo após o tratamento à direita).


A Artemia salina é uma espécie que está adaptada a grandes mudanças

ambientais, como variações abruptas de salinidade, de temperatura e de oxigênio

dissolvido.

No Quadro 19 são apresentados os resultados obtidos após a exposição de

larvas de Artemia salina às diferentes diluições (9,09%, 16,70%, 23,10%, 33,30% e

50,0%) da solução de mistura de Etinilestradiol, Acetato de Ciproterona e Gestodeno, com

e sem tratamento por CHT.

Os resultados mostraram que na concentração de 16,70%, a solução de

hormônios após o tratamento por CHT reduziu discretamente em 3,34% a quantidade de

indivíduos mortos para os microcrustáceos, quando comparada com a solução de

hormônios sem tratamento.

76

Quadro 19: Toxicidade com Artemia salina para o tratamento com CHT.

Grupo Nº. 01 - Solução Padrão de Hormônios

Concentração de EE2 + GTD + AC

Larvas Vivas % de Larvas Mortas Tubo 01 Tubo 02 Tubo 03 Média DP

9,09% 10 9 10 9,7 0,58 3 16,70% 8 8 10 8,7 1,15 13 23,10% 0 0 0 0,0 0,00 100 33,30% 0 0 0 0,0 0,00 100 50,00% 0 0 0 0,0 0,00 100

Grupo Nº. 02 - Solução após Tratamento de CHT



9,09% 10 10 9 9,7 0,58 3 16,70% 8 9 10 9,0 1,00 10 23,10% 0 0 0 0,0 0,00 100 33,30% 0 0 0 0,0 0,00 100 50,00% 0 0 0 0,0 0,00 100

Grupo Nº. 03 - Controle



0,00% 10 10 10 10 0,00 0 Legenda: EE2: Etinilestradiol ; GTD: Gestodeno ; AC: Acetato de Ciproterona ; CHT: Carbonização Hidrotermal; DP: Desvio Padrão.

Na concentração de 9,09% (90,0 ng.mL-1 de cada hormônio na solução sem

tratamento e 0,56 ng.mL-1 de EE2 + 5,15 ng.mL-1de GTD + 28,57 ng.mL-1 de AC na

solução após tratamento por CHT), ambos os experimentos apresentaram 3% de indivíduos

mortos. Nas concentrações de 23,10%, 33,30% e 50,0%, tanto a solução sem tratamento

quanto a solução com tratamento apresentaram 100% de indivíduos mortos. Tal fator pode

ter sido influenciado pelo pH final do meio, pois as soluções de hormônios utilizadas

estavam com pH ácido e de acordo com literatura a Artemia salina se desenvolve melhor

em meio ligeiramente básico (pH = 8).

Neste trabalho optou-se por não corrigir o pH da solução na qual as larvas de

Artemia salina foram colocadas com o objetivo de simular o lançamento do efluente in

natura em corpo hídrico após tratamento com CHT. Esse dado é importante, pois em caso

de desenvolvimento industrial de uma planta de tratamento de efluente com CHT, será

necessário implementar uma etapa para correção de pH, também, após o tratamento, para

atender o padrão de lançamento preconizado pelo CONAMA 430/2011 (BRASIL, 2011).

77

Paralelamente, foi conduzido o experimento do grupo de controle, utilizou-se

apenas solução salina (sal marinho sintético a 38,0 g.L-1), na qual nenhum microcrustáceo

permaneceu imóvel durante a realização do experimento (0% de indivíduos mortos).

Para o tratamento biológico foi realizado o teste de toxicidade com Artemia

salina para a concentração de 9,09% da solução efluente do tratamento com P. sanguineus

e T. villosa. Nenhuma das amostras se apresentou morte de indivíduos nesta concentração,

conforme pode ser observado no Quadro 20.

Quadro 20: Toxicidade de Artemia salina para o tratamento biológico.

Grupo Nº. 03 - Controle Concentração de EE2 + GTD + AC


9,09% 10 10 10 10 0,00 0 Grupo Nº. 04 – Após Tratamento com P. sanguineus



9,09% 10 10 10 10 0,00 0 Grupo Nº. 05 – Após Tratamento com T. villosa



9,09% 10 10 10 10 0,00 0 Legenda: EE2: Etinilestradiol ; GTD: Gestodeno ; AC: Acetato de Ciproterona ; CHT: Carbonização Hidrotermal; DP: Desvio Padrão.

78

7 CONCLUSÕES E RECOMENDAÇÕES

Diante dos resultados obtidos da parte experimental e das discussões com

informações pré-existentes, considera-se que tanto o processo de carbonização hidrotermal

quanto o processo biológico com fungos apresentam grande potencial no tratamento dos

hormônios sexuais sintéticos Etinilestradiol, Gestodeno e Acetato de Ciproterona.

Outras conclusões específicas a seguir:

• As condições mais favoráveis de degradação dos hormônios Etinilestradiol,

Gestodeno e Acetato de Ciproterona por CHT durante este estudo foram aquelas

com tempo de reação de 90 minutos e com ácido fosfórico como catalisador

(correção do pH);

• O processo de carbonização hidrotermal apresentou melhor desempenho no

tratamento isolado dos compostos estudados, com degradação de 99, 8% do

Etinilestradiol, 99,3% de Gestodeno e concentração final de Acetato de Ciproterona

abaixo do Limite de Detecção da Técnica. Para o tratamento em conjunto, de

99,4%, de Etinilestradiol, 94,3% de Gestodeno e 68,9% de Acetato de Ciproterona;

• O ácido fosfórico apresentou melhor aplicabilidade no processo de carbonização

hidrotermal, quando observados os aspectos de cor e odor das amostras efluentes;

• A solução efluente do processo de carbonização hidrotermal com ácido fosfórico

contendo os três os hormônios apresentou menor toxicidade nos testes com Artemia

salina e Allium cepa, quando comparada com a solução padrão antes do tratamento;

• No processo de tratamento biológico, os Pycnoporus sanguineus e Trametes villosa

sofreram, visualmente, influência dos hormônios Etinilestradiol, Gestodeno e

Acetato de Ciproterona no desenvolvimento de sua biomassa.

• O fungo Pycnoporus saguineus apresentou melhor desempenho de produção

enzimática de Lacase na presença dos hormônios, sendo, portanto, possível inferir

que o Etinilestradiol, o Gestodeno e Acetato de Ciproterona são indutores de

produção para enzima;

79

• Pycnoporus saguineus e Trametes villosa apresentam grande potencial remediador

de Etinilestradiol e Acetato de Ciproterona, uma vez que demonstraram bons

resultados na diminuição de sua concentração inicial (acima de 99,0%. Para o

Gestodeno o índice de remediação foi de 78,9% para ambos os fungos.

80

Para complementação dos resultados obtidos e continuidade da pesquisa,

recomenda-se:

• Caso seja confirmada a atividade estrogênica e/ ou progestagênica, analisar as

amostras efluentes do processo de carbonização hidrotermal e do tratamento

fúngico por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas a fim de

determinar qualitativamente a transformação dos hormônios Etinilestradiol,

Gestodeno e Acetato de Ciproterona;

• No processo de carbonização hidrotermal utilizar um sistema de aquecimento mais

eficiente, de forma que a perda de calor para o exterior seja a menor possível;

• Desenvolver um sistema para medida interna da temperatura do reator de CHT

durante os experimentos;

• Realizar um experimento com delineamento experimental fracionado para verificar

as melhores condições do reator de CHT;

• Analisar os gases formados durante o processo de carbonização hidrotermal dos

hormônios sexuais sintéticos;

• Realizar os testes com a CHT em efluente da indústria farmacêutica produtora de

medicamentos com hormonais sexuais sintéticos estudados;

• Realizar tratamentos fúngicos com concentrações diferentes dos hormônios

Etinilestradiol, Gestodeno e Acetato de Ciproterona, em conjunto e

individualmente;

• Realizar este mesmo estudo com o consórcio dos fungos P. sanguineus e T. villosa

e com outras espécies fúngicas;

• Realizar os testes de toxicidade específicos para compostos com atividade

estrogênica e/ou progestagênica;

81

• Estudas os mecanismos de ação dos hormônios sexuais sintéticos no crescimento e

desenvolvimento de vegetais.

82

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93

APÊNDICE – A

Resultados Obtidos com o Processo de Carbonização Hidrotermal

94

Figura A - 01: Cromatograma da solução padrão de Etinilestradiol + Gestodeno + Acetato

de Ciproterona utilizada no Experimento Nº. 02.

Quadro A - 01: Resultado do cromatograma da solução padrão de Etinilestradiol + Gestodeno + Acetato de Ciproterona utilizada no Experimento Nº. 02.

CLAE Etinilestradiol Gestodeno Acetato de Ciproterona

Tempo de Retenção (min)

Concentração (ng.mL-1)





1º Leitura 3,593 997,956 4,300 999,700 6,013 1000,000 2º Leitura 3,600 1000,000 4,313 998,050 6,027 987,834 3º Leitura 3,593 997,040 4,307 999,260 6,020 988,048 4º Leitura 3,600 987,170 4,307 1000,000 6,020 998,244 5º Leitura 3,616 990,827 4,327 998,260 6,053 979,823

Média 3,600 994,599 4,311 999,054 6,027 990,790 Desvio Padrão 0,009 5,381 0,010 0,865 0,016 8,320

95

Figura A - 02: Cromatograma da solução de Etinilestradiol + Gestodeno + Acetato de

Ciproterona após tratamento de CHT utilizada no Experimento Nº. 02 – Amostra Nº. 02.

Quadro A - 02: Resultado do cromatograma da solução de Etinilestradiol + Gestodeno + Acetato de Ciproterona após tratamento de CHT utilizada no Experimento Nº. 02 –

Amostra Nº. 02.

CLAE Etinilestradiol Gestodeno Acetato De Ciproterona


Concentração (ng/mL)





1º Leitura 3,767 154,257 4,347 314,402 6,013 718,695 2º Leitura 3,767 156,466 4,347 315,372 6,013 723,922 3º Leitura 3,767 153,890 4,347 314,202 6,013 716,703


96


Ciproterona após tratamento de CHT utilizada no Experimento Nº. 02 – Amostra Nº. 03.


Amostra Nº. 03.










97

Quadro A - 04: Comparativo dos resultados médios das Amostras Nº. 02 e Nº. 03 utilizadas no Experimento Nº. 02.

CLAE Etinilestradiol Gestodeno Acetato de Ciproterona







Amostra Nº. 02 3,767 154,871 4,347 314,659 6,013 716,773 Amostra Nº. 03 3,771 282,228 4,347 508,721 6,013 769,046


Quadro A - 05: Dados do comportamento da temperatura das Amostras Nº. 01, 02 e 03 do Experimento Nº. 02, durante o processo de CHT.

TR (min) Temperatura (ºC)

AM Nº. 01 AM Nº. 02 AM Nº. 03 Média DP 0 28,5 28 27 27,8 0,76 5 29 29 28 28,7 0,58

10 31,5 32,5 32 32,0 0,50 15 42 42,5 44 42,8 1,04 20 73 63 70 68,7 5,13 25 98 100 113 103,7 8,14 30 120 124 137 127,0 8,89 35 134 142 145 140,3 5,69 40 140 143 146 143,0 3,00 45 141 145 145,5 143,8 2,47 50 140 151 154 148,3 7,37 55 147 164 157 156,0 8,54 60 149 165,5 157 157,2 8,25

Máximos 152 165,5 157 158,2 6,83 Legenda: CHT: Carbonização Hidrotermal ; TR: Tempo de Reação; DP: Desvio Padrão.

98

Quadro A - 06: Dados do comportamento da pressão das Amostras Nº. 01, 02 e 03 do Experimento Nº. 02, durante o processo de CHT.

TR (min) Pressão (Bar)

AM Nº. 01 AM Nº. 02 AM Nº. 03 Média DP 0 0 0 0 0,0 0,00 5 0 0 0 0,0 0,00

10 0 0 0 0,0 0,00 15 0 1 1 0,7 0,58 20 0 2 4 2,0 2,00 25 1 8 8 5,7 4,04 30 5 10 10 8,3 2,89 35 8 10 10 9,3 1,15 40 9 10 11 10,0 1,00 45 9 10 11 10,0 1,00 50 9 15 17 13,7 4,16 55 11 20 19 16,7 4,93 60 12 20 18 16,7 4,16

Máximos 12 20 19 17,0 4,36 Legenda: CHT: Carbonização Hidrotermal ; TR: Tempo de Reação; DP: Desvio Padrão.

99

Figura A - 04: Cromatograma da solução padrão de Etinilestradiol + Gestodeno + Acetato

de Ciproterona utilizada no Experimento Nº. 04.

Quadro A - 07: Resultado do cromatograma da solução padrão de Etinilestradiol + Gestodeno + Acetato de Ciproterona utilizada no Experimento Nº. 04.



Concentração(ng.mL-1)







100


Ciproterona após tratamento de CHT utilizada no Experimento Nº. 04 – Amostras Nº. 04, 05 e 06.


Amostras Nº. 04, 05 e 06.








1º Leitura 3,175 6,314 3,898 56,348 8,629 308,380 2º Leitura 3,182 6,242 3,898 56,941 8,602 313,042


101

Quadro A - 09: Dados do comportamento da temperatura das Amostras Nº. 01, 02, 03, 04, 05 e 06 do Experimento Nº. 02, durante o processo de CHT.

TR (min) Temperatura (ºC)

AM Nº. 01 AM Nº. 02 AM Nº. 03 AM Nº. 04 AM Nº. 05 AM Nº. 06 Média DP 0 26,0 30,0 27,0 27,5 28 27 27,6 1,4 5 26,5 30,0 28,0 28 29 27 28,1 1,3

10 29,0 33,0 32,0 31 31 30 31,0 1,4 15 40,0 43,0 60,0 39 44 38 44,0 8,2 20 62,0 74,0 75,0 66 61 53 65,2 8,4 25 103,0 112,0 116,0 101 100 92 104,0 8,7 30 131,0 135,0 141,0 133 126 126 132,0 5,7 35 156,0 140,5 149,0 145,5 138 142 145,2 6,6 40 167,0 142,0 153,0 148 146 145 150,2 9,0 45 165,0 148,5 152,0 149 147 146 151,3 7,0 50 162,5 153,0 148,0 145 142 142 148,8 7,9 55 168,0 151,0 138,0 150 144 148 149,8 10,1 60 165,0 148,5 150,0 157 148 156 154,1 6,6 65 177,0 149,0 159,0 156 148,5 156,5 157,7 10,4 70 165,0 155,0 162,0 151 145 150,5 154,8 7,5 75 164,5 157,0 162,0 150 147 146 154,4 7,9 80 158,5 150,0 162,0 152 153 152 154,6 4,6 85 169,0 148,0 153,0 154 152 155 155,2 7,2 90 177,0 150,5 162,0 153 150 153 157,6 10,5

Máximos 177,0 157,0 162,0 157 153 156,5 160,4 8,6 Legenda: CHT: Carbonização Hidrotermal ; TR: Tempo de Reação; DP: Desvio Padrão.

102

Quadro A - 10: Dados do comportamento da pressão das Amostras Nº. 01, 02, 03, 04, 05 e 06 do Experimento Nº. 04, durante o processo de CHT.

TR (min) Pressão (Bar)

AM Nº. 01 AM Nº. 02 AM Nº. 03 AM Nº. 04 AM Nº. 05 AM Nº. 06 Média DP 0 0,0 0,0 0,0 0 0 0 0,0 0,0 5 0,0 0,0 0,0 0 0 0 0,0 0,0

10 0,0 0,0 0,0 0 0 0 0,0 0,0 15 1,0 1,0 1,0 1 1 0 0,8 0,4 20 3,0 3,0 2,0 2 3 2 2,5 0,5 25 7,0 10,0 8,0 7 8 5 7,5 1,6 30 13,0 10,0 11,0 12 10 10 11,0 1,3 35 18,0 12,0 13,0 15 15 13 14,3 2,2 40 19,0 13,0 13,0 17 14 15 15,2 2,4 45 19,0 18,0 12,0 15 14 15 15,5 2,6 50 18,0 20,0 10,0 15 13 13 14,8 3,7 55 20,0 19,0 12,0 19 17 19 17,7 2,9 60 24,0 15,0 18,0 20 19 20 19,3 2,9 65 24,0 18,0 22,0 20 19 20 20,5 2,2 70 20,0 20,0 22,0 18 16 18 19,0 2,1 75 18,0 20,0 22,0 19 19 18 19,3 1,5 80 17,0 18,0 20,0 20 20 20 19,2 1,3 85 20,0 17,0 19,0 20 20 20 19,3 1,2 90 26,0 20,0 22,0 19 18 19 20,7 2,9

Máximos 26,0 20,0 22,0 20 20 20 21,3 2,4 Legenda: CHT: Carbonização Hidrotermal ; TR: Tempo de Reação; DP: Desvio Padrão.

103

Quadro A - 11: Quantidade de sementes de Allium cepa germinadas durante o experimento de toxicidade com solução de Etinilestradiol + Gestodeno + Acetato de

Ciproterona, antes e após* o tratamento com CHT.

Grupo

Quantidade de Sementes Germinadas (Un) 1ª Dia 2ª Dia 3ª Dia 4ª Dia 5ª Dia 6ª Dia 7ª Dia

Controle 1 9 35 53 57 61 63 Antes do Tratamento de CHT 2 6 14 19 19 20 21 Após o Tratamento de CHT 0 7 28 52 57 63 63

*A solução utilizada para realização do experimento após o tratamento com reator de CHT foi a do Experimento Nº. 04 (Amostras Nº. 04, 05 e 06).

Quadro A - 12: Quantidade de náuplios vivos de Artemia salina durante o experimento de toxicidade com solução padrão de Etinilestradiol, Gestodeno e Acetato de Ciproterona.

Concentração*(ng.mL-1)

(%)* (m/v) Tubo 01 Tubo 02 Tubo 03 Média (%) IM DP

90,9 9,09% 10 9 10 9,7 3 0,58 167,0 16,70% 8 8 10 8,7 13 1,15 231,0 23,10% 0 0 0 0,0 100 0,00 333,0 33,30% 0 0 0 0,0 100 0,00 500,0 50,00% 0 0 0 0,0 100 0,00

Legenda: *Concentração e percentual de cada hormônio no teste (Etinilestradiol + Gestodeno + Acetato de Ciproterona ; (%) IM: Porcentagem de Indivíduos Mortos; m/v: massa por volume; DP: Desvio Padrão

Quadro A - 13: Quantidade de larvas vivas de Artemia salina durante o experimento de toxicidade com solução de Etinilestradiol + Gestodeno + Acetato de Ciproterona após* o

tratamento com o reator de CHT.

Concentração* (ng.mL-1) %*

(m/v) Tubo 01 Tubo 02 Tubo 03 Média (%) IM DP EE2 GTD AC 0,56 5,15 28,57 9,09% 10 10 9 9,7 3 0,58 1,04 9,47 52, 49 16,70% 8 9 10 9,0 10 1,00 1,43 13,09 72,60 23,10% 0 0 0 0,0 100 0,00 2,06 18,87 104,66 33,30% 0 0 0 0,0 100 0,00 3,10 28,34 157, 15 50,00% 0 0 0 0,0 100 0,00

Legenda: *Concentração e percentual de cada hormônio no teste (Etinilestradiol + Gestodeno + Acetato de Ciproterona ; (%) IM: Porcentagem de Indivíduos Mortos; m/v: massa por volume; DP: Desvio Padrão

*A solução utilizada para realização do teste após o tratamento com reator de CHT foi a do Experimento Nº. 04 (Amostras Nº. 04, 05 e 06).

104

Figura A – 06: Cromatograma da solução padrão de Etinilestradiol utilizada no

Experimento Nº. 05.

Quadro A - 14: Resultado do cromatograma da solução padrão de Etinilestradiol, utilizada no Experimento Nº. 05.

CLAE Tempo de Retenção (min) Concentração (ng.mL-1) 1º Leitura 3,175 996,520 2º Leitura 3,160 996,631 3º Leitura 3,175 1000,000

Média 3,170 997,717 Desvio Padrão 0,009 1,978

105

Figura A - 07: Cromatograma da solução de Etinilestradiol após tratamento de CHT

utilizada no Experimento Nº. 05 – Amostras Nº. 01, 02 e 03.

Quadro A - 15: Resultado do cromatograma da solução de Etinilestradiol após tratamento de CHT utilizada no Experimento Nº. 05 – Amostras Nº. 01, 02 e 03.

CLAE Tempo de Retenção (min) Concentração Final (ng.mL-1) 1º Leitura 3,326 2,234 2º Leitura 3,333 2,001


106

Quadro A - 16: Dados do comportamento da temperatura e da pressão das Amostras Nº. 01, 02 e 03 do Experimento Nº. 05, durante o processo de CHT.

TR (min) Temperatura (ºC) Pressão (Bar)

AM Nº. 01 AM Nº. 02 AM Nº. 03 DP AM Nº. 1 AM Nº. 02 AM Nº. 03 DP 0 30 26 30 2,31 0 0 0 0,00 5 31 27 30 2,08 0 0 0 0,00

10 34 30 33 2,08 0 0 0 0,00 15 43,5 39 46 3,55 1 1 0 0,58 20 87 64 79 11,68 3 2 2 0,58 25 104 95 115 10,02 9 8 8 0,58 30 131 127 156 15,72 14 12 18 3,06 35 149 145 167 11,72 19 17 20 1,53 40 151 148,5 170 11,76 19 17 20 1,53 45 150,5 147 163 8,41 18 17 18 0,58 50 145,5 150 165 10,21 17 20 19 1,53 55 149 157 174 12,77 20 21 24 2,08 60 152 159 178 13,45 21 21 25 2,31 65 157,5 156 170 7,69 21 19 21 1,15 70 153 151 169 9,87 18 18 19 0,58 75 151 157 171 10,26 19 21 21 1,15 80 160 161 172 6,66 21 21 24 1,73 85 162 157 180 12,10 20 20 27 4,04 90 159 155 177 11,72 20 18 21 1,53

Máximos 162 161 180 10,69 21 21 27 3,46 Legenda: CHT: Carbonização Hidrotermal ; TR: Tempo de Reação; DP: Desvio Padrão.

107

Figura A - 08: Cromatograma da solução padrão de Gestodeno utilizada no Experimento

Nº. 06.

Quadro A - 17: Resultado do cromatograma da solução padrão de Gestodeno utilizada no Experimento Nº. 06.



108

Figura A - 09: Cromatograma da solução de Gestodeno após tratamento de CHT utilizada

no Experimento Nº. 06 – Amostras Nº. 01, 02 e 03.

Quadro A - 18: Resultado do cromatograma da solução de Gestodeno após tratamento de CHT utilizada no Experimento Nº. 06 – Amostras Nº. 01, 02 e 03.

CLAE Tempo de Retenção (min) Concentração Final (ng.mL-1) 1º Leitura 3,844 6,746

109

Quadro A - 19: Dados do comportamento da temperatura e da pressão das Amostras Nº. 01, 02 e 03 do Experimento Nº. 06, durante o processo de CHT.


AM Nº. 01 AM Nº. 02 AM Nº. 03 DP AM Nº. 1 AM Nº. 02 AM Nº. 03 DP 0 29 28 28 0,58 0 0 0 0,00 5 30 29 30 0,58 0 0 0 0,00

10 32 33 34 1,00 0 0 0 0,00 15 41,5 45 48 3,25 1 1 1 0,00 20 66,5 77 85 9,28 3 3 5 1,15 25 104 132 123 14,29 8 10 10 1,15 30 134 152 142 9,02 11 13 12 1,00 35 146 165 147 10,69 15 18 15 1,73 40 150 164 147 9,07 17 18 15 1,53 45 149 156 144 6,03 15 17 12 2,52 50 147 161 147 8,08 14 17 17 1,73 55 153 168 154 8,39 19 20 20 0,58 60 157 172 155 9,29 20 21 19 1,00 65 157 171 152 9,85 19 20 17 1,53 70 150 167 148 10,44 17 18 15 1,53 75 150,5 175 151,5 13,87 19 23 19 2,31 80 155 175 157 11,02 20 22 20 1,15 85 157 175 156,5 10,54 20 22 19 1,53 90 152 171 161 9,50 18 20 18 1,15

Máximos 157 175 161 9,45 20 23 20 1,73 Legenda: CHT: Carbonização Hidrotermal; TR: Tempo de Reação; DP: Desvio Padrão.

110

Figura A - 10: Cromatograma da solução padrão de Acetato de Ciproterona utilizada no

Experimento Nº. 07.

Quadro A - 20: Resultado do cromatograma da solução padrão de Acetato de Ciproterona, utilizada no Experimento Nº. 07.



111

Figura A - 11: Cromatograma da solução de Acetato de Ciproterona após tratamento de

CHT (Experimento Nº. 07 – Amostras Nº. 01, 02 e 03).

Quadro A - 21: Resultado do cromatograma da solução de Acetato de Ciproterona após tratamento de CHT (Experimento Nº. 07 – Amostras Nº. 01, 02 e 03).

CLAE Tempo de Retenção (min) Concentração Final (ng.mL-1) 1º Leitura NA <LD 2º Leitura NA <LD

Legenda: NA: Não Aplicável ; <LD: Menor que o Limite de Detecção

112

Quadro A - 22: Dados do comportamento da temperatura e da pressão das Amostras Nº.

01, 02 e 03 do Experimento Nº. 07, durante o processo de CHT.


AM Nº. 01 AM Nº. 02 AM Nº. 03 DP AM Nº. 1 AM Nº. 02 AM Nº. 03 DP 0 28 27,5 28 0,29 0 0 0 0,00 5 29 28 28 0,58 0 O 0 0,00

10 33 31 31 1,15 0 0 0 0,00 15 43 43 44 0,58 1 1 0 0,58 20 75 88 86 7,00 3 2 3 0,58 25 109 121 120 6,66 8 5 10 2,52 30 142 142 134 4,62 17 10 12 3,61 35 161 158 151 5,13 20 16 12 4,00 40 165 159 151 7,02 21 16 12 4,51 45 165 160 146,5 9,57 22 16 10 6,00 50 159 147 147 6,93 19 14 12 3,61 55 164 157 159 3,61 21 18 19 1,53 60 169 164 168 2,65 27 20 21 3,79 65 175 163 168 6,03 24 19 21 2,52 70 171 160,5 156 7,70 20 17 19 1,53 75 165 161 151 7,21 19 17 16 1,53 80 158 168 150 9,02 17 20 18 1,53 85 164 173 155 9,00 21 20 20 0,58 90 177 168 165 6,24 28 18 20 5,29

Máximos 177 173 168 4,51 28 20 21 4,36 Legenda: CHT: Carbonização Hidrotermal ; TR: Tempo de Reação; DP: Desvio Padrão.

113

APÊNDICE – B

Resultados Obtidos com Processo Biológico

114

Quadro B - 01: Atividade Enzimática de Lacase do Pycnoporus saguineus e Trametes villosa no Grupo Controle.

Controle P. saguineus T. villosa U.mL-1 7º Dia 14º Dia 21º Dia 7º Dia 14º Dia 21º Dia

1 3,010 10,492 11,800 1,359 0,328 0,000 2 3,118 10,753 10,256 0,923 0,108 0,097


Quadro B - 02: Atividade Enzimática de Lacase do Pycnoporus saguineus e do Trametes villosa no Grupo com Hormônios (Etinilestradiol, Gestodeno e Acetato de Ciproterona).

Hormônios P. saguineus T. villosa U.mL-1 7º Dia 14º Dia 21º Dia 7º Dia 14º Dia 21º Dia

1 12,938 1,585 11,800 1,267 0,513 0,000 2 12,297 0,995 12,297 1,205 0,513 0,318


115

Figura B - 01: Cromatograma da solução padrão de Etinilestradiol + Gestodeno + Acetato

de Ciproterona utilizada nos experimentos com P. saguineus e T. villosa.

Quadro B - 03: Resultado do cromatograma da solução padrão de Etinilestradiol + Gestodeno + Acetato de Ciproterona, utilizada nos experimentos com P. saguineus e T.

villosa.










116

Figura B - 02: Cromatograma da solução de Etinilestradiol + Gestodeno + Acetato de

Ciproterona após tratamento com P. saguineus.

Quadro B - 04: Resultado do cromatograma da solução de Etinilestradiol + Gestodeno + Acetato de Ciproterona após tratamento com P. saguineus.








1º Leitura 3,348 3,543 3,398 63,206 NA <LD 2º Leitura 3,139 0,546 3,871 78,497 NA <LD

Média 3,244 2,045 3,635 70,852 NA NA Desvio Padrão 0,148 2,119 0,334 10,812 NA NA

Legenda: NA: Não Aplicável ; <LD: Menor que o Limite de Detecção.

117

Figura B - 03: Cromatograma da solução de Etinilestradiol + Gestodeno + Acetato de

Ciproterona após tratamento com T. villosa.

Quadro B - 05: Resultado do cromatograma da solução padrão de Etinilestradiol + Gestodeno + Acetato de Ciproterona após tratamento com T. villosa.








1º Leitura NA <LD 3,898 63,206 NA <LD 2º Leitura NA <LD 3,871 77,180 NA <LD

Média NA NA 3,885 70,193 NA NA Desvio Padrão NA NA 0,019 9,881 NA NA

Legenda: NA: Não Aplicável ; <LD: Menor que o Limite de Detecção.

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