Título: Mecanismo de Hepatotoxicidade do Paracetamol

Miguel António Mendes Pereira, aluno do 6ºano de Mestrado Integrado em

Medicina da Faculdade de Medicina da Universidade do Porto

miguelantoniompereira@gmail.com

Resumo

A intoxicação pelo paracetamol, ou acetaminofeno, constitui uma das principais

causas de insuficiência hepática aguda, no entanto, o mecanismo preciso de

hepatotoxicidade deste fármaco ainda possui muitas questões em aberto.

Na intoxicação pelo paracetamol, é formado um metabolito extremamente

reativo, a N-acetil-p-benzoquinonaimina (NAPQI), que se acumula em

quantidades de tal ordem, que superam a capacidade das vias inativadoras, nos

hepatócitos. A NAPQI é particularmente tóxica para as mitocôndrias,

desacoplando a cadeia respiratória, levando ao stress oxidativo e à disfunção

mitocondrial. A disfunção destes organelos, combinada com a fragmentação

nuclear associada, culminam na necrose dos hepatócitos. Ao mesmo tempo, o

stress oxidativo ativa as vias de sinalização c-jun-N-terminal kinase (JNK), p53,

fissão mitocondrial, stress do retículo endoplasmático e aumento do cálcio

citoplasmático, que exacerbam a toxicidade hepática do paracetamol, enquanto

que vias de sinalização, como a nuclear factor-like 2 (Nrf2) e a mitofagia,

mostraram um papel de contrarregulação deste mecanismo.

A seguir à necrose dos hepatócitos, o sistema imune é chamado a intervir e cada

um dos tipos de células efetoras poderá ter um papel potenciador ou protetor da

lesão hepática.

Palavras-chave: paracetamol, hepatotoxicidade, hepatócito

Abstract

Acetaminophen or paracetamol overdose is a main cause of acute liver failure,

however the precise hepatotoxicity’s mechanism of this medicine still has

questions to be answered.

In acetaminophen overdose, is formed one extremely reactive metabolite, N-

acetyl-p-benzoquinoneimine (NAPQI), which accumulates so much that

overcome the capacity of the inactivation pathways, in the hepatocytes. NAPQI

is particularly toxic to mitochondria, uncoupling the respiratory chain, leading to

oxidative stress and mitochondrial dysfunction. The dysfunction of this

organelles, combined with the associated nuclear fragmentation, culminates in

hepatocyte necrosis. Meanwhile, oxidative stress activates metabolic pathways

such as c-jun-N-terminal kinase (JNK), p53, mitochondrial fission, endoplasmic

reticulum stress and increasing cytoplasmic calcium, which promotes

acetaminophen hepatic toxicity, on the other hand, metabolic pathways such as

nuclear factor-like 2 (Nrf2) and mitophagy, that have demonstrated a

contrarregulatory role of this mechanism.

Next to hepatocyte necrosis, the immune system is called to intervene and each

one of the cells types could have a damaging or a protecting role on the liver

failure.

Keywords: acetaminophen, hepatotoxicity, hepatocyte

1. INTRODUÇÃO

O paracetamol (para-acetil-aminofenol) também designado por

acetaminofeno (N-acetil-para-aminofenol) ou, mais corretamente, por N-(4-

hidroxifenil)-etanamida segundo a União Internacional de Química Pura e

Aplicada (IUPAC)1. O paracetamol é um dos fármacos mais usados em todo o

Mundo, devido à sua ação antipirética e analgésica2. Contém, ainda, uma

modesta ação anti-inflamatória3, atravessando a barreira hematoencefálica4, 5,

inibindo a via das cicloxigenases (COX) no sistema nervoso central6, 7.

É considerado um fármaco seguro quando usado em doses terapêuticas

comparado com outros fármacos com a mesma ação. Contudo, a intoxicação

pelo paracetamol constitui a principal causa de insuficiência hepática aguda nos

Estados Unidos da América8, contando com 30.000 hospitalizações anuais9.

Existem inúmeras combinações de outros fármacos com o paracetamol e estima-

se que a população idosa use mais do que um para síndromes de dor crónica ou

aguda10. Apesar da dose máxima ter sido fixada nos 4 gramas diários para

adultos, a 6% dos adultos americanos são prescritas doses superiores 9. Cerca

de metade dos casos de intoxicação pelo paracetamol são provocados por

overdose acidental11. Em Portugal, é o medicamento não sujeito a receita médica

mais vendido12.

Após a intoxicação, no tratamento recorre-se à administração do antídoto: a

N-acetil-cisteína. . A ação farmacológica da N-acetil-cisteína consiste na síntese

de glutationa por doação do seu substrato, uma molécula fulcral para a

inativação dos metabolitos reativos formados na intoxicação pelo paracetamol13,

14. Atua, também, através da doação de intervenientes no ciclo de Krebs,

atenuando a disfunção mitocondrial provocada por esses metabolitos reativos do

paracetamol. A eficácia do antídoto é tanto maior quanto menor o tempo entre o

momento da intoxicação e administração de NAC15. Se tardar o acesso aos

cuidados de saúde, resta apenas o transplante hepático16.

Apesar da sua dimensão no panorama global de saúde, o mecanismo de

toxicidade hepática causada pelo paracetamol tem ainda muitas questões em

aberto. Esta revisão tem como objetivos: determinar o consenso da literatura em

relação ao mecanismo de hepatotoxicidade do paracetamol até ao momento e,

ainda, apresentar as diferentes posições relativamente ao papel controverso das

várias células efetoras do sistema imune após a lesão hepatocitária.

2. MATERIAIS E MÉTODOS

Pesquisa bibliográfica realizada na base de dados online Pubmed, usando a

query “Acetaminophen [ti] AND (hepatocytes [tiab] OR hepatocyte [tiab] OR

hepatotoxicity [tiab])” desde 2012. Dos 574 artigos que preencheram estes

requisitos, foram rejeitados 451 artigos que, após leitura do resumo e/ou do texto

integral, não se adequavam ao âmbito desta monografia. Aos 123 artigos

restantes, foram adicionados os artigos originais com relevo para a monografia.

3. MECANISMO DE HEPATOTOXICIDADE

3.1. Generalidades

O paracetamol em excesso satura as vias normais de metabolização hepática,

levando à formação de N-acetil-p-benzoquinonaimina (NAPQI), um composto

altamente reativo que se liga a todo o tipo de moléculas, inativando-as (Figura

1). O principal alvo da NAPQI é a mitocôndria, destruindo os mecanismos

normais de produção de energia, provocando a sua disfunção. A disfunção

mitocondrial ativa uma via de sinalização chamada c-jun-N-terminal kinase (JNK)

e, juntas, provocam o fenómeno de transição de permeabilidade mitocondrial

(MPT), que consiste na abertura de poros nas mitocôndrias. O efluxo de

moléculas através destes poros é responsável pela necrose dos hepatócitos e,

também, provoca a ativação do sistema imune. Consoante a célula do sistema

imunitário e as substâncias que liberta, esta pode potenciar a hepatotoxicidade

do paracetamol ou promover a regeneração dos hepatócitos necrosados.

Ao longo dos próximos capítulos, serão explicitados em pormenor cada um

destes passos.

3.2. Metabolização do paracetamol

A metabolização do paracetamol é feita no fígado. A maior parte é

metabolizada por glicuronidação (40-67%) ou sulfatação (20-46%)17, 18 (Figura

2). Uma pequena parcela (5-15%) é metabolizada pela família do citocromo P450

(CYP450), principalmente pelos CYP2E1 e CYP3A4. Daí resulta um

intermediário, denominado N-acetil-p-benzoquinonaimina (NAPQI)19.

Em condições normais, a NAPQI é reduzida pela glutationa em conjugados

não tóxicos, que são eliminados na bílis e urina20. Pelo contrário, numa

intoxicação por paracetamol, a metabolização por glicuronidação e sulfatação

fica saturada 21 22, 23. O paracetamol é então metabolizado pelo CYP450,

formando quantidades crescentes de NAPQI. A própria glutationa acaba também

por saturar e não consegue metabolizar toda a NAPQI formada.

A NAPQI é um composto ativo, que reage com ácido desoxirribonucleico

(ADN), proteínas e lípidos insaturados24. Como as reservas de glutationa

diminuem muito mais na mitocôndria, do que no citoplasma do hepatócito, é na

mitocôndria que predominam os efeitos nefastos da intoxicação pelo

paracetamol25.

3.3. Disfunção mitocondrial

Na mitocôndria, a NAPQI reage com a peroxidase do glutatião (GPx) e com a

subunidade α da sintetasede adenosina trifosfato (sintetasede ATP)26. A redução

de atividade da GPx leva à diminuição da regeneração da glutationa e, por

conseguinte, à acumulação de espécies reativas de oxigénio (ROS) e de azoto

(RNS). Por outro lado, a diminuição da atividade da sintetasede ATP leva à

diminuição da produção de ATP. 27-29Ambos têm como consequência a disfunção

mitocondrial.

Uma das ROS formadas é o ião superóxido (O2•-). Este radical livre pode ser

metabolizado enzimaticamente pela manganésio-dismutase do superóxido

(MnSOD ou SOD2) em peróxido de hidrogénio (H2O2). O peróxido de hidrogénio

formado pode ser inativado por outros membros do sistema antioxidante, além

da SOD2, tais como a glutationa 30, 31, catálase ou peroxirredoxinas32. Se o

peróxido de hidrogénio não for imediatamente inativado, sofre uma reação não

enzimática que resulta na formação do radical livre hidroxilo (HO•)33, que

posteriormente é metabolizado enzimaticamente pela catálase34.

O radical superóxido pode também reagir com outro radical livre, o óxido

nítrico (NO•), e formar o ião peroxinitrato (ONO2−)30, 31. No entanto, o peroxinitrato

inibe a enzima MnSOD35, diminuindo a dismutação do superóxido em peróxido

de hidrogénio, aumentando a parcela de superóxido que se transforma em

peroxinitrato. O ião peroxinitrato tem um elevado poder oxidante e de nitração,

constituindo um estímulo lesivo importante ao hepatócito 30, 36, 37.

3.4. Amplificação pela via de sinalização JNK

As ROS decorrentes da disfunção mitocondrial ativam uma via de sinalização

citoplasmática que amplifica o dano mitocondrial, denominada c-jun-N-terminal

kinase (JNK), que faz parte da família das mitogen-activated protein kinase

(MAPK)38 (Figura 3).

Os alvos diretos das ROS são três cinases: a mixed-lineage kinase 3

(MLK3)39, a glycogen synthase kinase-3β (GSK-3β)40 e a apoptosis signal-

regulating kinase 1 (ASK1)41. A MLK3 e a GSK-3β tendem a ser ativadas numa

fase inicial, enquanto a ASK1 numa fase mais tardia da intoxicação pelo

paracetamol42.

A MLK3 e a GSK-3β formam um circuito de retroação positiva, ativando-se

uma à outra, ao mesmo tempo que ativam a JNK39.Ao contrário das anteriores,

a ASK1 encontra-se dimerizada com outra ASK1 e ligada a uma tiorredoxina

(Trx), num complexo chamado signalossoma43. Em condições normais, a

tiorredoxina encontra-se na sua forma reduzida e inibe a atividade da ASK144.

Todavia, neste contexto de stress oxidativo, a tiorredoxina é oxidada e liberta a

ASK1 do signalossoma45.

Destas três cinases, só a GSK-3β e a ASK1 é que fosforilam e ativam a MAPK

kinase kinase 4 (MKK4) e é a MKK4 que participa ativamente na fosforilação e

ativação da JNK46, 47.

Alternativamente, a fosforilação da JNK pode ser levada a cabo pelas

cinasesreceptor interacting protein kinase (RIPK) 1 e 3, que são ativadas no

decorrer da acumulação de ROS48, 49. Apesar de estas duas proteínas

normalmente se associarem a outras num complexo intitulado necroptossoma,

na intoxicação pelo paracetamol não formam o dito complexo, tal como é

classicamente descrito50.

Ao mesmo tempo, o stress oxidativo ativa a fosfatase mitogen-activated

protein kinase phosphatase 1 (MKP1)51-55. A MKP1 contraria a fosforilação da

JNK, a fim de diluir a ativação da JNK40, 56.

A JNK é capaz de ativar a sintetasede óxido nítrico indutível (iNOS)57,

representando uma fonte de NO• e consequente formação de peroxinitrato30, 31.

Assim, além da amplificação do efeito das ROS, a JNK participa, de igual forma,

na sua formação.

Por fim, a ativação da JNK leva à sua translocação do citoplasma para a

membrana externa da mitocôndria, onde ativa a SH3 domain-binding protein that

preferentially associates with Btk (Sab), também designada Src homology 3

domain binding protein 5 (Sh3bp5)58.

3.5. Transição de permeabilidade mitocondrial (MPT)

O stress oxidativo, causado pela acumulação de ROS, provoca um fenómeno

que se designa por transição de permeabilidade mitocondrial (MPT)59, 60 (Figura

4). A MPT consiste na abertura de um poro na membrana mitocondrial e no

desacoplamento da cadeia respiratória, o que potencia um aumento ainda maior

da formação de ROS61.

Contudo, o stress oxidativo não é suficiente para o aparecimento da MPT,

sendo necessária a sua amplificação pela via de sinalização JNK, cuja ativação

é da responsabilidade do próprio stress oxidativo38. A ativação da Sab/Sh3bp5

leva à formação de um poro Bcl2-associated X protein (Bax) na membrana

externa da mitocôndria62.

O aumento da permeabilidade membranar permite a libertação para o

citoplasma de proteínas que se localizam no espaço intermembranar

mitocondrial, tais como a endonuclease G e apoptosis inducing factor (AIF).

Ambas chegam ao núcleo do hepatócito e levam à fragmentação do ADN da

célula 63, 64.

No seu conjunto, a fragmentação do material genético e a disfunção

mitocondrial 65 provocam a necrose do hepatócito48.

Com a necrose dos hepatócitos, há um extravasamento para o espaço

extracelular de diversos constituintes celulares, tais como ADN nuclear50,

histonas66, ADN mitocondrial67, microRNA-122 (miR-122)68, sintetase da

arginino-succinase69, peptídeos N-formil mitocondriais70, heat shock proteins

(HSPs)71, citoqueratina-18 não truncada (CK-18), high mobility group box-1

(HMGB1) 72e ATP73. As moléculas mencionadas pertencem ao grupo das

damage associated molecular patterns (DAMPs) 71, 74.

3.6. Vias de sinalização complementares

Além do mecanismo principal anteriormente descrito, a intoxicação pelo

paracetamol ativa outras vias de sinalização que podem potenciar ou inibir a sua

hepatotoxicidade (Figura 5). O stress do retículo endoplasmático, o metabolismo

do cálcio, a via de sinalização do p53 e a fissão mitocondrial contribuem para a

necrose dos hepatócitos. A via de sinalização do Nrf2 e a mitofagia constituem

vias contrarreguladoras, que atenuam a necrose hepatocitária.

Cada uma destas vias sinalizadoras vai ser descrita, individualmente, de

seguida.

3.6.1. Stress do retículo endoplasmático (RE)

As ROS formadas no decorrer da intoxicação pelo paracetamol desencadeiam

o stress do retículo endoplasmático (RE) (Figura 6). O stress do RE ocorre

quando existe uma incapacidade de atribuir às proteínas a sua conformação

final, provocando uma resposta designada por unfolded protein response

(UPR)75.

O stress do RE e o próprio stress oxidativo convergem na fosforilação da

proteína Eukaryotic Initiation Factor 2 (eIF2)76, 77, que participa numa via de

sinalização chamada de Resposta integrada de stress (IRS)78. A fosforilação da

eIF2 leva à inibição da entrada proteica no RE, de modo a inibir a formação de

mais proteínas malconformadas, impedindo a propagação da UPR.

Contudo, como a produção de ROS é cada vez maior e, por conseguinte,

também o stress do RE aumenta, este mecanismo protetor deixa de ser

suficiente. As consequências são a amplificação da disfunção mitocondrial e a

saída de cálcio (Ca2+) do RE. O incremento na disfunção mitocondrial, promove

uma maior produção de ROS, fechando um circuito de ampliação da toxicidade

hepática79-83.

3.6.2. Metabolismo do cálcio (Ca2+)

Devido à disfunção mitocondrial, os hepatócitos estão privados de ATP e para

aumentar a sua produção, aumentam a expressão de recetores membranares

purinérgicos P2R (Figura 7). Os P2R têm como função a passagem de Ca2+ do

espaço extracelular para o citoplasma do hepatócito84-86.

A produção excessiva de ROS leva à expressão, nos hepatócitos, de outra

família de recetores de membrana, designados por Transient Receptor Potential

Melanostatine 2 (TRPM2). Os TRPM2 têm a mesma função dos P2R,

favorecendo o aumento da concentração de Ca2+ no citoplasma dos

hepatócitos87.

Existe ainda uma ATPase dependente de cálcio e magnésio (Ca2+-Mg2+-

ATPase), situada na membrana do hepatócito, que é inativada pela NAPQI e

contribui também para a acumulação de Ca2+ dentro da célula88.

Todo este Ca2+ em excesso ativa proteínas denominadas calpaínas89 e

endonucleases dependentes de Ca2+90 que provocam a degradação proteica 89

e fragmentação do material genético90, respetivamente. Uma dessas

endonucleases é a desoxirribonuclease dependente de Ca2+ e Mg2+ (DNase1).

A DNase1 ativa uma enzima com o propósito de reparo do ano: a poly-adenosine

diphosphate-ribose polymerase-1 (PARP-1)91. No entanto, a PARP-1 utiliza uma

quantidade excessiva de Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) +, o que

acaba por exacerbar a necrose dos hepatócitos92.

Além disso, o aumento citosólico da concentração de Ca2+, aliado ao stress

oxidativo, provoca a translocação, para a membrana, da Proteína cínase C-α

dependente de Ca2+ (PKC-α). Os efeitos da PKC-α são a desagregação de

junções apertadas (tight-junctions) entre os hepatócitos93, bem como a ativação

da via de sinalização JNK94. Todos estes fatores contribuem, de forma mais ou

menos direta, para a necrose dos hepatócitos.

3.6.3. Supressor tumoral p53

O gene supressor tumoral p53 leva à expressão da proteína p53. No contexto

da intoxicação pelo paracetamol, a p53 é ativada tanto pelo dano no ADN95,

como pelo stress oxidativo96-98 ou pela via de sinalização JNK99 (Figura 8).

A p53 ativa a proteína p21, cujo efeito é a inibição de ciclinas e outros

reguladores do ciclo celular, com o consequente envelhecimento e morte dos

hepatócitos100, 101.

3.6.4. Fissão mitocondrial

As mitocôndrias são organelos com divisão independente da divisão celular.

À divisão da mitocôndria dá-se o nome de fissão mitocondrial. Na fissão

mitocondrial, intervém a proteína dynamin-related protein 1 (Drp1)102 (Figura 9).

A proteína RIPK3, já referida anteriormente, além de fosforilar a proteína

JNK, também despoleta a translocação da Drp1 para a mitocôndria48. A fissão

mitocondrial em que a Drp1 participa, promove a produção de ROS em maior

quantidade, exacerbando o stress oxidativo103.

3.6.5. Via de sinalização Nuclear factor-like 2 (Nrf2)

As ROS ativam a via de sinalização que pertence ao Nuclear factor-like 2

(Nrf2) (Figura 10). A ativação do Nrf2 ocorre através da desconexão do seu

inibidor, a kelch-like ECH associating protein-1 (keap-1). A esta separação,

segue-se a translocação do Nrf2 desde o citoplasma até ao núcleo. No interior

do núcleo do hepatócito, o Nrf2 liga-se à região reguladora de diversos genes, a

que se dá o nome de antioxidant response element (ARE)104.

O Nrf2 promove a transcrição dos genes correspondentes à NAD(P)H quinone

oxidoreductase 1 (NQO1), glutamate cysteine ligase catalytic subunit (GCLC),

glutamate cysteine ligase modifier subunit (GCLM)105, dismútase do superóxido

(SOD) 1 e 2, peroxirredoxina 1 (Prdx1)106, 107, heme oxygenase-1 (HO-1) 105e

multidrug resistance–associated protein transporter (Mrp) 3 e 4108.

A NQO1 é capaz de inativar a próprio NAPQI109. A GCLC e a GCLM são as

duas subunidades da glutamate cysteine ligase (GCL), que equivale ao substrato

na produção de glutationa110. Tanto a SOD1 e 2111, como a Prdx1 são outros

agentes do sistema antioxidante das células que contraria o stress oxidativo112.

A HO-1 metaboliza o grupo heme libertado durante a metabolização de

xenobióticos, diminuindo a formação de ROS94. Os Mrp 3 e 4 participam na

expulsão e conjugação de xenobióticos em compostos inertes108.

Aparentemente, a via de sinalização Nrf2 é um dos mecanismos

compensatórios presentes para proteger o hepatócito do dano causado pelo

stress oxidativo113, 114. Porém, esta via contrarreguladora pode estar

comprometida, visto que os alvos moleculares do Nrf2 (NQO1, GLC, HO-1, etc.)

são alvo de inibição por parte da p5396-98.

3.6.6. Mitofagia

Uma das consequências do stress do RE é a translocação da Parkina do RE

para a mitocôndria (Figura 11). Na matriz mitocondrial, a Parkina ativa a proteína

Tensin Homolog PTEN-induced Kinase 1 (PINK1), resultando na indução de um

fenómeno designado por mitofagia. A mitofagia consiste num subtipo da

autofagia, na qual as mitocôndrias disfuncionais são eliminadas dentro de uma

vesícula, à qual se fundem lisossomas. Assim, a mitofagia leva à atenuação da

disfunção mitocondrial115, 116.

4. SISTEMA IMUNE

4.1. Generalidades

Um grande tópico em que encontramos disparidade nos resultados é no

papel do sistema imunitário na hepatotoxicidade do paracetamol. Nos próximos

capítulos, descrever-se-à a posição dos diferentes autores relativamente a

cada uma das células efetoras do sistema imune e à sua influência na necrose

hepatocitária (Figura 12).

4.2. Inflamossoma

4.2.1. Formação do complexo Inflamossoma

As DAMPs atuam em recetores do tipo TLR (Toll-like receptors), sendo o mais

relevante o TLR4, que se encontra em células do sistema imune, como os

macrófagos 72 (Figura 13). Os principais ligandos do TLR4 são a proteína

HMGB1 e os LPS (lipopolissacarídeos). A HMGB1 é uma das DAMPs libertada

durante a necrose dos hepatócitos117. Enquanto que os LPS estão presentes na

superfície de bactérias gram-negativas, que podem entrar no fígado através do

sistema venoso porta118.

No macrófago, a ativação do TLR4 leva à transcrição do precursor da

interleucina-1β (IL-1β): a pro-IL-1β119-121. O TLR4 provoca a fosforilação do fator

inibidor-kappaB (I-kB), um inibidor que se encontra ligado ao fator nuclear-kappa

B (NF-kB). A desconexão do NF-kB permite a migração para o núcleo e a

transcrição da pro-IL-1β. A função da IL-1β é o de recrutamento de outras células

do sistema imunitário, como os neutrófilos e monócitos. No entanto, a IL-1β para

poder exercer a sua ação necessita de ser clivada a partir da pro-IL-1β122.

A clivagem da pro-IL-1β necessita da formação prévia de um complexo

enzimático denominado inflamossoma. Para que este se forme, ATP ativa

recetores purinérgicos P2XR7 na membrana dos macrófagos. Como

consequência, há uma saída do catião potássio (K+) da célula e, por

conseguinte, é ativado o inflamossoma123, 124.

O inflamossoma é composto pela proteína NACHT, LRR and PYD domains

containing protein 3 (Nalp3)125, pela apoptosis-associated speck-like protein

containing a CARD (ASC) e pela pro-caspase-1. Este complexo é responsável

pela clivagem da pro-caspase-1 em caspase-1126. É a caspase-1 a enzima

responsável pela clivagem e ativação da IL-1β122.

No entanto, para que a IL-1β possa sair da célula, é formado um poro

membranar, através da translocação da proteína gasdermina-D-NT do

citoplasma para a membrana celular, onde se liga ao fosfatidilinositol,

fosfatidilserina e cardiolipina. A gasdermina-D-NT foi previamente clivada a partir

da gasdermina-D pela caspase-1 já referida. Todavia, a gasdermina-D pode

também ser clivada pelas caspases 4/5 ou 11, cuja ativação depende dos LPS

127, 128.

4.2.2. Papel do Inflamossoma e da IL-1β

Na ativação pelas DAMPs libertadas pela necrose dos hepatócitos parece não

haver dúvidas, porém no que acontece de seguida há um grande debate. O papel

do próprio inflamossoma e da IL-1β formada é posto em causa.

Há autores que revelam o seu efeito hepatotóxico: com o recurso de

inibidores dos TLR9, observou-se uma mortalidade inferior à do grupo

controlo119. O knockout dos recetores P2X7 revelou uma diminuição da necrose

dos hepatócitos129. A inibição dos recetores da IL-1β (IL-1R) demonstrou que os

níveis das transaminases hepáticas e a necrose dos hepatócitos é inferior à do

grupo controlo130.

Enquanto outros autores revelam um efeito hepatoprotetor: Ishibe T et al

demonstraram que o knockout dos antagonistas dos IL-1R (permitindo a ação

dos IL-1R) verificou-se uma diminuição das transaminases hepáticas e da

necrose hepatocitária131.

Outros autores não encontram qualquer efeito: Williams CD et al

demonstraram que o knockout dos componentes do inflamossoma (Nalp3, ASC

e caspase 1), não se registaram diferenças no recrutamento de neutrófilos ou na

necrose dos hepatócitos, comparativamente com o grupo controlo132. O uso de

um inibidor da caspase-1, não registou nenhuma diferença significativa na

produção de IL-1β. Para além do mais, o knockout dos IL-1R não revelou

nenhuma diferença na ativação de neutrófilos, nem na necrose dos hepatócitos.

Williams CD et al realizaram a administração de IL-1β e apesar de ter encontrado

uma maior ativação dos neutrófilos, não houve alteração na necrose dos

hepatócitos133.

4.3. Células de Kupffer

Em relação aos macrófagos que ocupam o fígado, estes podem também ser

apelidados de células de Kupffer71. As células de Kupffer reduzem em número

no estadio agudo da intoxicação pelo paracetamol e o seu número volta a

aumentar na fase de regeneração hepática. A recuperação das células de

Kupffer deve-se aos monócitos que são recrutados, bem como à própria auto-

renovação134, 135.

As DAMPs ativam as células de Kupffer através do recetor TLR472. A ativação

das células de Kupffer tem como consequência a produção de citocinas anti e

pró-inflamatórias. No ramo das citocinas anti-inflamatórias, destaca-se a

interleucina-10 (IL-10) 136, 137. Ao mesmo tempo, são sintetizadas citocinas pró-

inflamatórias: interleucina-6 (IL-6), IL-1β e o fator de necrose tumoral-α (TNF-

α)136.

Apesar da associação da IL-10 a uma diminuição do stress oxidativo em

certos estudos136, 137, noutros a frenação de citocinas pró-inflamatórias pela IL10

leva à ativação da sintetasede óxido nítrico induzível (iNOS). A produção de NO

por esta enzima pode aumentar a produção de ROS e aumentar a necrose dos

hepatócitos137.

4.3.1. Papel da TNF-α

Em relação ao TNF-α, a definição clássica de citocina pró-inflamatória torna-

seduvidosa.

Há autores que apoiam o seu papel na potenciação da hepatoxicidade: após

a administração de anticorpos anti-TNF-α, observou-se uma diminuição das

transaminases hepáticas, da desidrogénase láctica (LDH) e da necrose dos

hepatócitos, bem como uma diminuição do tempo de recuperação hepática,

quando comparado com o grupo controlo130. 138. O nível de TNF-α associou-se

a um aumento dos níveis das transaminases hepaticas e da LDH, indicando a

função pró-inflamatória desta citocina139.

Outros autores apoiam o papel na proteção contra a hepatotoxicidade: o

knockout dos recetores do TNF-α 1 (TNFR1) levou a uma ativação mais rápida

e prolongada da iNOS, em relação ao grupo controlo. Ao mesmo tempo, a

expressão de macrophage chemotactic protein-1 (MCP-1), matrix

metalloproteinase-9 (MMP-9) e connective tissue growth factor (CTGF), entre

outros mediadores anti-inflamatórios, ocorreu muito mais tarde e em menor

extensão140. O knockout dos TNFR1 revelou uma diminuição na proliferação de

hepatócitos. Além disso, os níveis de citocinas pró-inflamatórias, tais como a

macrophage inhibitory protein-2 (MIP-2), interferon-gamma-inducible protein-10

(IP-10) e monocyte chemoattractant protein 1 (MCP-1), eram superiores no

grupo com o knockout dos TNFR1141. O knockout dos TNFR1 prejudicou a

proliferação hepática, observando-se menor expressão de ciclina A e D1 e de

cinases dependentes de ciclinas (CDK) 2 e 4142. O knockout dos TNFR1 revelou,

ainda, uma mortalidade e necrose dos hepatócitos superior138. Yang R et al

demonstraram que induzindo farmacologicamente um aumento da concentração

de TNF-α no plasma sanguíneo, as transaminases hepáticasdiminuíram. Ao

mesmo tempo, a proliferação dos hepatócitos e os níveis de ciclina D1

aumentaram143.

Outros autores não encontram diferenças significativas: com recurso a

anticorpos anti-TNF-α e TNFR1 solúveis, não se detetaram diferenças

significativas na mortalidade, transaminases hepáticas ou na necrose dos

hepatócitos, em comparação com o grupo controlo144. Usando a interleucina-13,

um inibidor dos TNFR1, não se registou alteração na hepatotoxicidade com ou

sem uso dos anticorpos anti-TNF-α145. Connolly MK et al constataram que

osanticorpos anti-TNF-α não demonstraram nenhuma alteração no nível de

necrose dos hepatócitos146. O knockout dos TNFR1 não provocou um grau de

necrose significativamente distinto do grupo controlo147. Chiu H et al verificaram

que o knockout dos TNFR1, observou-se uma diminuição das transaminases

hepáticas e da necrose dos hepatócitos, além de um maior nível de glutationa148.

4.3.2. Papel das células de Kuppfer

Em relação ao papel das células de Kupffer, este é, de igual modo, discutível.

Há autores que afirmam que agravam o dano hepático: Michael SL et al

afirmaram que após a inativação farmacológica das células de Kupffer, observa-

se uma diminuição das transaminases hepáticas e dos marcadores de stress

oxidativo, comparativamente ao grupo controlo149. A depleção farmacológica das

células de Kupffer revelou uma diminuição significativa do grau de necrose.

Observou-se ainda que esta diminuição ocorre entre 0,5 a 2 horas após a

administração de paracetamol, confirmando a ativação das células de Kupffer

num estadio inicial da necrose150. A ativação das células de Kupffer associou-se

a um aumento das transaminases hepáticas, indicando um papel hepatotóxico

deste grupo de células do sistema imune151.

Outros autores sugeremque protegem do dano hepático: Jaeschke H et al

descrevem que a distribuição das células de Kupffer concentra-se na zona

periportal, enquanto que a necrose dos hepatócitos ocorre na zona centrilobular

já que aí existe maior densidade de CYP45071. Com recurso à depleção

farmacológica das células de Kupffer, observou-se um atraso na proliferação dos

hepatócitos. Além disso, observou-se uma associação das células de Kupffer

com a produção de fatores angiogénicos e de crescimento152. Após a depleção

farmacológica das células de Kupffer, ocorre uma diminuição da expressão de

Mrp4, um dos alvos da via de sinalização Nrf2153. Stutchfield BM et al

demonstraram que após a indução farmacológica das células de Kupffer, se

observou um aumento da proliferação dos hepatócitos, em comparação com o

grupo controlo 154 .

Enquanto noutros parece não haver influência no dano hepático: a gp91phox

é uma subunidade fulcral para a função da NADPH oxidase, uma enzima

característica dos macrófagos, como as células de Kupffer. Não se observou

qualquer alteração nas transaminases hepaticas, nem na necrose dos

hepatócitos, em nenhum dos dois grupos155, 156.

4.4. Macrófagos derivados de Monócitos (MoMF)

Além dos macrófagos residentes no fígado (células de Kupffer), ocorre

ativação de macrófagos derivados de monócitos (MoMF). As células de Kuppfer

chamam monócitos circulantes por quimiotaxia, por meio da libertação de

chemokine C-C motif ligand 2 (CCL2)157.

Dambach DM et al e Holt MP et al revelaram que o recetor C-C chemokine

receptor 2 (CCR2) a que liga a CCL2, pode também ligar-se ao ligando monocyte

chemoattractant protein-1 (MCP-1) produzido pela necrose dos hepatócitos, sem

a intervenção das células de Kupffer158, 159. Assim, o recrutamento dos MoMF

pode ser feito diretamente pelos hepatócitos.

No entanto, a maturação dos monócitos circulantes imaturos em MoMF

maduros deve-se ao conjunto da ação da CCL2 e da IL-6160. Os monócitos

infiltrantes imaturos têm uma elevada expressão de lymphocyte antigen 6

complex, locus C (Ly6C) - Ly6Chigh - enquanto os MoMF maduros têm uma baixa

expressão de Ly6C - Ly6Clow. Esta diferença tem implicações na expressão de

citocinas. Os monócitos infiltrantes Ly6Chigh expressam sobretudo citocinas pró-

inflamatórias: interferão-γ (IFN- γ), IL-6, a IL-1β e o TNF-α. Enquanto que os

MoMF Ly6Clow expressam sobretudo citocinas anti-inflamatórias, destacando-se

a IL-10161.

Apesar da classificação clássica de citocinas pró-inflamatórias, em relação à

IL-6 162 e MCP-1, o seu papel revelou-se benéfico para a regeneração dos

hepatócitos, mostrando um efeito protetor da lesão hepática163.

O papel dos MoMF na hepatotoxicidade é discutível.

Alguns autores apontam um efeito prejudicial: no grupo em que se inativaram

farmacologicamente os MoMF, observou-se uma diminuição das transaminases

hepáticas e dos marcadores de stress oxidativo, em comparação com o grupo

controlo149. A inibição farmacológica do CCL2 ou do recetor CCR2/CCR5,

revelou níveis inferiores de transaminases hepáticas e de necrose dos

hepatócitos164.

Outros autores indicam um efeito benéfico: a ativação dos MoMF associou-

se a um aumento de citocinas com papel regenerativo nos hepatócitos, tais como

a chemokine (C-C motif) ligand (CCL) 2 e 3, o transforming growth factor-β1

(TGF-β1), a IL-6 e a IL-10, comparativamente ao grupo controlo162. Com recurso

à depleção farmacológica das MoMF, observou-se um atraso na proliferação dos

hepatócitos. Além disso, observou-se uma associação dos MoMF com a

produção de fatores angiogénicos e de crescimento, tais como o vascular

endotelial growth factor (VEGF) e as matrix-metalloproteinases (MPP) e

promovem a limpeza de resíduos necróticos152. O knockout dos CCR2

demonstrou um atraso na resolução do dano hepático. Além disso, este estudo

revelou a capacidade dos MoMF fagocitarem resíduos necróticos e induzirem a

apoptose dos neutrófilos159. Stutchfield BM et al afirmaram que após a indução

farmacológica do recrutamento de MoMF, se observou um aumento da

proliferação dos hepatócitos154. O knockout dos CCR2 revelou uma diminuição

dos níveis de mediadores anti-inflamatórios, tal como a matrix metalloproteinase-

9 (MMP-9) e connective tissue growth factor (CTGF)134. A depleção

farmacológica dos MoMF resultou num atraso na proliferação dos hepatócitos135.

Enquanto outros estudos não identificaram nenhum efeito: uma das enzimas

características dos macrófagos, tal como os MoMF, é a NADPH oxídase. Nem

James LP et al ou Williams CD et al observaram qualquer alteração nas

transaminases hepaticas, nem na necrose dos hepatócitos155, 156.

Diversos autores justificam a divergência entre o efeito prejudicial e benéfico

dos MoMF com o tipo de população e a temporalidade. A população de

monócitos infiltrantes Ly6Chigh que chega primeiro ao fígado terá um papel

prejudicial, enquanto que os MoMF Ly6Clow que chegam depois terão um efeito

benéfico 165-168.

4.5. Neutrófilos

As células de Kupffer são capazes de realocar neutrófilos circulantes para o

fígado por quimiotaxia, recorrendo às citocinas chemokine C-X-C motif ligand

(CXCL) 1, 2 e 8169. Para chegar às zonas de necrose propriamente dita, os

neutrófilos seguem um gradiente de peptídeos N-formil mitocondriais170. A

ativação pelos peptídeos N-formil recorre à ligação aos recetores formyl peptide

receptor-1/CXC chemokine receptor-2 interaction (FPR1/CXCR2) dos

neutrófilos70.

À semelhança dos MoMF, os neutrófilos podem ser recrutados diretamente

pelos hepatócitos. Um estudo mostrou que na ausência de sinalização pelo

TLR4, as DAMPs, neste caso concreto, o HMGB1 liga-se ao recetor receptor for

advanced glycation endproducts (RAGE) presente nas membranas dos

neutrófilos, ativando-os171.

A participação dos neutrófilos na lesão hepática é controversa.

Certos autores afirmam que agravam: com o uso de anticorpos contra os

recetores FPR1/CXCR2, registou-se uma diminuição da necrose dos

hepatócitos, em relação ao grupo controlo70. Liu ZX et al revelaram que após a

depleção farmacológica dos neutrófils se observou uma diminuição das

transaminases hepáticas, da necrose dos hepatócitos e da mortalidade172.

Recorrendo ao knockout do CXCR2, o recetor da CXCL2, observou-se uma

diminuição da expressão da iNOS173. A ativação farmacológica dos neutrófilos

demonstrou um aumento das transaminases hepáticas e da necrose

hepatocitária174.

Ao mesmo tempo, outros autores não detetam este impacto: com o knockout

da CD18, uma integrina responsável pela adesão dos neutrófilos, não se

demonstrou nenhuma diferença significativa na necrose dos hepatócitos, nem

nos marcadores de stress oxidativo, em comparação com o grupo controlo175.

Williams CD et al revelaram que após a administração de IL-1β se registou maior

ativação dos neutrófilos, mas não houve diferença no que toca à necrose dos

hepatócitos133. A neutralização com anticorpos anti-neutrófilos, não demonstrou

diferenças nos níveis das transaminases hepáticas ou na necrose dos

hepatócitos176. A depleção farmacológica de neutrófilos não resultou em

alteração nos níveis das transaminases hepaticas, nem da necrose dos

hepatócitos177. Williams CD et al observaram que apesar de existir ativação dos

neutrófilos após a intoxicação pelo paracetamol, este aumento encontra um

plateau que persiste mesmo após a saída dos doentes do hospital. Concluindo-

se que os neutrófilos não têm um papel na hepatotoxicidade156.

4.6. Linfócitos T

Os linfócitos T subdividem-se em diferentes populações, de entre as quais os

linfócitos T citotóxicos (Tc), os linfócitos T auxiliares/helper (Th), os linfócitos T

γδ e os linfócitos T Natural Killer (NKT)178.

Os linfócitos Tc favorecem a necrose dos hepatócitos, por intermédio de

citocinas pró-inflamatórias, entre as quais, o TNF-α, a perforina e a granzima179

(Figura 12).

O grupo dos linfócitos Th pode ser subdividido em Th1 e Th2. Os linfócitos

Th1 caracterizam-se por um perfil de citocinas pró-inflamatórias, tendo como

exemplo o interferão-γ (IFN- γ). No outro espetro, temos os linfócitos Th2 que

segregam citocinas anti-inflamatórias, como as interleucinas (IL) 4, 5 e 13178. A

sobrevida é superior quando favorecida laboratorialmente a resposta Th2, em

relação à resposta Th1180.

As células de Kupffer ativam a população de linfócitos T γδ, com recurso à

libertação da interleucina-23 (IL-23). Por sua vez, os linfócitos T γδ têm a

capacidade de chamar neutrófilos para o local de necrose, servindo-se da

interleucina-17 (IL-17)181.

Wang X et al observaram um efeito hepatotóxico, em que a depleção

farmacológica de linfócitos T γδ levou à atenuação da lesão hepática182.

As células de Kupffer são capazes de chamar os NKT por quimiotaxia, através

da secreção de chemokine C-X-C motif ligand 16 (CXCL16)183. A ativação dos

NKT despoleta a secreção de interleucina-4 (IL-4) e de IFN-γ. A IL-4 tem o poder

de conseguir ativar os neutrófilos, enquanto o IFN-γ tem o poder de os inibir184.

Ainda assim, o IFN-γ é uma citocina pró-inflamatória que contribui para a necrose

dos hepatócitos185.Neste caso, os NKT são o tipo de linfócitos T mais frequente

que existem em volta dos sinusóides hepáticos186.

Martin-Murphy BV et al constataram o efeito protetor das NKT, utilizando o

knockout destas células que se associou a um aumento dos níveis das

transaminases hepáticas e da mortalidade187.

No entanto, Liu ZX et al verificaram o efeito oposto, utilizando anticorpos anti-

NKT, registou-se uma diminuição das transaminases hepáticas, da necrose dos

hepatócitos, enquanto a mortalidade foi superior à do grupo controlo188. Todavia,

Masson MJ et al replicaram a mesma experiência, utilizando um solvente

diferente nas preparações, e não conseguiram observar estas diferenças189.

À imagem dos NKT, as células Natural Killer (NK) também libertam IFN-γ, para

além de outras citocinas pró-inflamatórias, como o TNF-ɑ, a perforina e

granzima. Apesar disso, as NK segregam igualmente citocinas anti-inflamatórias,

tal como a IL-10190.

O estudo de Liu ZX et al que revelou a hepatotoxicidade das NKT188 e o estudo

de Masson et al que não observou diferenças significativas alterando o solvente

utilizado revelaram os mesmos resultados para as NK189.

5. CONCLUSÕES

Em suma, a toxicidade hepática provocada pela intoxicação pelo paracetamol

assenta na disfunção das mitocôndrias dos hepatócitos, que combinada com a

destruição subsequente do material genético nuclear, origina a necrose

hepatocitária. Em paralelo, a disfunção mitocondrial é capaz de ativar diversas

vias de sinalização complementares que interagem, positiva ou negativamente,

em diferentes passos deste mecanismo.

Após a necrose dos hepatócitos, são chamados distintos tipos de células

efetoras do sistema imune, cujo papel na proteção ou potenciação do dano

hepático permanece controverso.

Nesta revisão, possíveis alvos farmacológicos foram explorados e, com o

aumento dos estudos nesta matéria, espera-se que surjam cada vez mais e

melhores estratégias terapêuticas para lidar com uma etiologia de insuficiência

hepática tão prevalente no Mundo desenvolvido.

REFERÊNCIAS

1. Panico R, Powell WH, Richer J-C, Chemistry IUoPaACCotNoO. A guide to

IUPAC nomenclature of organic compounds : recommendations 1993. Oxford; 1993. 2. Brodie B, Axelrod J. The fate of acetanilide in man. J Pharmacol Exp Ther 1948;94:29–38. 3. Brune K, Hinz B, Otterness I. Aspirin and acetaminophen: should they be available over the counter? Curr Rheumatol Rep 2009;11:36-40. 4. Courad J, Besse D, Delchambre C, Hanoun N, Hamon M, Eschalier A, et al. Acetaminophen distribution in the rat central nervous system. Life Sci 2001;69:1455–64. 5. Kumpulainen E, Kokki H, Halonen T, Heikkinen M, Savolainen J, Laisalmi M. Paracetamol (acetaminophen) penetrates readily into the cerebrospinal fluid of children after intravenous administration. Pediatrics 2007;119:766–71. 6. Flower R, Vane J. Inhibition of prostaglandin synthetase in brain explains the anti-pyretic activity of paracetamol (4-acetamidophenol). Nature 1972;240:410–1. 7. Engstrom R, Wilhelms D, Eskilsson A, Vasilache A, Elander L, Engblom D, et al. Acetaminophen reduces lipopolysaccharide-induced fever by inhibiting cyclooxygenase-2. Neuropharmacology 2013;71:124–9. 8. Ostapowicz G, Fontana R, Schiodt F, Larson A, Davern T, Han S, et al. Results of a prospective study of acute liver failure at 17 tertiary care centers in the United States. Ann Intern Med 2002;137:947–54. 9. Blieden M, Paramore L, Shah D, Ben-Joseph R. A perspective on the epidemiology. Expert Rev Clin Pharmacol 2014;7:341–8. 10. Larson A, Polson J, Fontana R, al e. Acetaminophen-induced acute liver failure: results of a United States multicenter, prospective study. Hepatology 2005;42:1364-72. 11. Michna E, Duh M, Korves C, Dahl J. Removal of opioid/acetaminophen combination prescription pain medications: assessing the evidence for hepatotoxicity and consequences of removal of these medications. Pain Med 2010;11:369–78. 12. Borja-Santos R. Portugal vende paracetamol em doses consideradas perigosas. Público; c2009; [consultado 2018 Jan 30]. https://www.publico.pt/2009/06/11/sociedade/noticia/portugal-vende-paracetamol-em-doses-consideradas-perigosas-1386127. 13. Chun L, Tong M, Busuttil R, Hiatt J. Acetaminophen hepatotoxicity and acute liver failure. J Clin Gastroenterol 2009;43:342–9. 14. Pumford N, Halmes N, Martin B, Cook R, Wagner C, Hinson J. Covalent binding of acetaminophen to N-10-formyltetrahydrofolate dehydrogenase in mice. J Pharmacol Exp Ther 1997;280:501–5. 15. Yoon E, Babar A, Choudhary M, Kutner M, Pyrsopoulos N. Acetaminophen-Induced Hepatotoxicity: a Comprehensive Update. J Clin Transl Hepatol 2016;4:131–42. 16. Larsen F, Wendon J. Understanding paracetamol-induced liver failure. Intensive Care Med 2014;40:888-90. 17. Davis M, Labadarios D, Williams R. Metabolism of paracetamol after therapeutic and hepatotoxic doses in man. J Int Med Res 1976;4:40–5.

18. Steventon G, Mitchell G, Waring R. Human metabolism of paracetamol (acetaminophen) at different dose levels. Drug Metabol DrugInteract 1996;13:111–7. 19. Corcoran G, Mitchell J, Vaishnav Y, Horning E. Evidence thatacetaminophen and N-hydroxyacetaminophen form a common arylating intermediate, N-acetyl-p-benzoquinoneimine. Mol Pharmacol 1980;18:536–42. 20. Miller R, Roberts R, Fischer L. Acetaminophen elimination kinetics in neonates children, and adults. Clin Pharmacol Ther 1976;19:284–94. 21. Zaher H, Buters J, Ward J, Bruno M, Lucas A, Stern S, et al. Protection against acetaminophen toxicity in CYP1A2 and CYP2E1 double-null mice. Toxicol Appl Pharmacol 1998;152:193–9. 22. Raucy J, Lasker J, Lieber C, Black M. Acetaminophen activation by human liver cytochromes P450IIE1 and P450IA2. Arch Biochem Biophys 1989;271:270–83. 23. Mitchell R, Jollow D, Potter W, Davis D, Gillette J, Brodie B. Acetaminophen-induced hepatic necrosis. I. Role of drug metabolism. JPharmacol Exp Ther 1973;187:185–94. 24. Jollow D, Mitchell J, Potter W, Davis D, Gillette J, Brodie B. Acetaminophen-induced hepatic necrosis. II. Role of covalent binding in vivo. J Pharmacol Exp Ther 1973;187:195–202. 25. Tirmenstein M, Nelson S. Subcellular binding and effects on calcium homeostasis produced by acetaminophen and a non hepatotoxic regioisomer 3'-hydroxyacetanilide, in mouse liver. J Biol Chem 1989;264:9814–9. 26. Qiu Y, Benet L, Burlingame A. Identification of the hepatic protein targets of reactive metabolites of acetaminophen in vivo in mice using two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry. J Biol Chem 1998;273:17940–53. 27. Tirmenstein M, Nelson S. Acetaminophen-induced oxidation of protein thiols. Contribution of impaired thiol-metabolizing enzymes and the breakdown of adenine nucleotides. J Biol Chem 1990;265:3059–65. 28. Jaeschke H. Glutathione disulfide formation and oxidant stress during acetaminophen-induced hepatotoxicity in mice in vivo: the protective effect of allopurinol. J Pharmacol Exp Ther 1990;255:935–41. 29. Saito C, Zwingmann C, Jaeschke H. Novel mechanisms of protection against acetaminophen hepatotoxicity in mice by glutathione and N-acetylcysteine. Hepatology 2010;51:246–54. 30. Knight R, Ho Y, Farhood A, Jaeschke H. Peroxynitrite is a critical mediator of acetaminophen hepatotoxicity in murine livers: protection by glutathione. J Pharmacol Exp Ther 2002;303:468–75. 31. Liu P, Vonderfecht S, Fisher M, McGuire G, Jaeschke H. Priming of phagocytes for reactive oxygen production during hepatic ischemia-reperfusion potentiates the susceptibility for endotoxin-induced liver injury. Circ Shock 1994;43:9–17. 32. Jaeschke H. Antioxidant Defense Mechanisms. C.A. McQueen (Ed.), Oxford: Academic Press; 2010. 33. Haber F, Weiss J. Über die Katalyse des Hydroperoxydes. Naturwissenschaften 1932;20 (51):948–50. 34. Scott M, Lubin B, Zuo L, Kuypers F. Erythrocyte defense against hydrogen peroxide: preeminent importance of catalase. J Lab Clin Med 1991;118:7–16. 35. Agarwal R, MacMillan-Crow L, Rafferty T, Saba H, Roberts D, Fifer E, et al. Acetaminophen-induced hepatotoxicity in mice occurs with inhibition of activity

and nitration of mitochondrial manganese superoxide dismutase. J Pharmacol Exp Ther 2011;337:110-8. 36. Hinson J, Pike S, Pumford N, Mayeux P. Nitrotyrosine-protein adducts in hepatic centrilobular areas following toxic doses of acetaminophen in mice. Chem Res Toxicol 1998;11:604–7. 37. Knight T, Kurtz A, Bajt M, Hinson J, Jaeschke H. Vascular and hepatocellular peroxynitrite formation during acetaminophen toxicity: role of mitochondrial oxidant stress. Toxicol Sci 2001;62:212–20. 38. Hanawa N, Shinohara M, Saberi B, Gaarde W, Han D, Kaplowitz N. Role of JNK translocation to mitochondria leading to inhibition of mitochondria bioenergetics in acetaminophen-induced liver injury. J Biol Chem 2008;283:13565–77. 39. Sharma M, Gadang V, Jaeschke A. Critical role for mixed-lineage kinase 3 in acetaminophen-induced hepatotoxicity. Mol Pharmacol 2012;82:1001– 7. 40. Shinohara M, Ybanez M, Win S, Than T, Jain S, Gaarde W, et al. Silencing glycogen synthase kinase-3beta inhibits acetaminophen hepatotoxicity and attenuates JNK activation and loss of glutamate cysteine ligase and myeloid cell leukemia sequence. J Biol Chem 2010;285:8244–55. 41. Nakagawa H, Maeda S, Hikiba Y, T O, W S, Yanai A, et al. Deletion of apoptosis signal-regulating kinase 1 attenuates acetaminophen-induced liver injury by inhibiting c-Jun N-terminal kinase activation. Gastroenterology 2008;135:1311–21. 42. Xie Y, Ramachandran A, Breckenridge D, al e. Inhibitor of apoptosis signal-regulating kinase 1 protects against acetaminophen-induced liver injury. Toxicol Appl Pharmacol 2015;286:1–9. 43. Takeda K, Noguchi T, Naguro I, Ichijo H. Apoptosis signal-regulating kinase 1 in stress and immune response. Annu Rev Pharmacol Toxicol 2008;48:199–225. 44. Saitoh M, Nishitoh H, Fujii M, Takeda K, Tobiume K, Sawada Y, et al. Mammalian thioredoxin is a direct inhibitor of apoptosis signal-regulating kinase (ASK) 1. EMBO J 1998;17:2596–606. 45. Noguchi T, Takeda K, Matsuzawa A, Saegusa K, Nakano H, Gohda J, et al. Recruitment of tumor necrosis factor receptor-associated factor family proteins to apoptosis signal-regulating kinase 1 signalosome is essential for oxidative stress-induced cell death. J Biol Chem 2005;280:37033-40. 46. Win S, Than T, Han D, Petrovic L, Kaplowitz N. c-Jun N-terminal kinase (JNK)-dependent acute liver injury from acetaminophen or tumor necrosis factor (TNF) requires mitochondrial sab protein expression in mice. J Biol Chem 2011;286:35071–8. 47. Win S, Than T, Min R, Aghajan M, Kaplowitz N. C-Jun N-terminal kinase mediates mouse liver injury through a novel Sab (SH3BP5)-dependent pathway leading to inactivation of intramitochondrial Src. Hepatology 2016;63:1987–2003. 48. Ramachandran A, McGill M, Xie Y, Ni H, Ding W, Jaeschke H. Receptor interacting protein kinase 3 is a critical early mediator of acetaminophen-induced hepatocyte necrosis in mice. Hepatology 2013;58:2099–108. 49. Zhang Y, He W, Zhang C, Liu X, Lu Y, Wang H, et al. Role of receptor interacting protein (RIP)1 on apoptosis-inducing factor-mediated necroptosis during acetaminophen-evoked acute liver failure in mice. Toxicol Lett 2014;225:445–53.

50. Guicciardi M, Gores G, Jaeschke H. Acetaminophen knocks on death’s door and receptor interacting protein 1 kinase answers. Hepatology 2015;62:1664–6. 51. Chi H, Barry S, Roth R, Wu J, Jones E, Bennett A, et al. Dynamic regulation of pro- and anti-inflammatory cytokines by MAPK phosphatase 1 (MKP-1) in innate immune responses. Proc Natl Acad Sci U S A 2006;103:2274–9. 52. Salojin K, Owusu I, Millerchip K, Potter M, Platt K, Oravecz T. Essential role of MAPK phosphatase-1 in the negative control of innate immune responses. J Immunol 2006;176:1899–907. 53. Zhao Q, Wang X, Nelin L, Yao Y, Matta R, Manson M, et al. MAP kinase phosphatase 1 controls innate immune responses and suppresses endotoxic shock. J Exp Med 2006;203:131–40. 54. Lau L, Nathans D. Identification of a set of genes expressed during the G0/G1 transition of cultured mouse cells. EMBO J 1985;4:3145–51. 55. Wang X, Meng X, Kuhlman J, Nelin L, Nicol K, English B, et al. Knockout of Mkp-1 enhances the host inflammatory responses to gram-positive bacteria. J Immunol 2007;178:5312–20. 56. Keyse S. Protein phosphatases and the regulation of mitogen-activated protein kinase signalling. Curr Opin Cell Biol 2000;12:186–92. 57. Kim K, Ko Y, Kang M, Yang H, Roh S, Oda T, et al. Anti-inflammatory effects of trans-1,3-diphenyl-2,3-epoxypropane-1-one mediated by suppression of inflammatory mediators in LPS-stimulated RAW 264.7 macrophages. Food Chem Toxicol 2013;53:371–5. 58. Win S, Than T, Han D, Petrovic L, Kaplowitz N. c-Jun N-terminal kinase (JNK)-dependent acute liver injury from acetaminophen or tumor necrosis factor (TNF) requires mitochondrial Sab protein expression in mice. J Biol Chem 2011;286:35071–8. 59. Bajt M, Knight T, Lemasters J, Jaeschke H. Acetaminophen-induced oxidant stress and cell injury in cultured mouse hepatocytes: protection by N-acetyl cysteine. Toxicol Sci 2004;80:343–9. 60. Kon K, Kim J, Jaeschke H, Lemasters J. Mitochondrial permeability transition in acetaminophen-induced necrosis and apoptosis of cultured mouse hepatocytes. Hepatology 2004;40:1170–9. 61. Kim J, He L, Lemasters J. Mitochondrial permeability transition: a common pathway to necrosis and apoptosis. Biochem Biophys ResCommun 2003;304:463–70. 62. Bajt M, Farhood A, Lemasters J, Jaeschke H. Mitochondrial bax translocation accelerates DNA fragmentation and cell necrosis in a murine model of acetaminophen hepatotoxicity. J Pharmacol Exp Ther 2008;324:8–14. 63. McGill M, Jaeschke H. Metabolism and disposition of acetaminophen: recent advances in relation to hepatotoxicity and diagnosis. Pharm Res 3 2013;30:2174–87. 64. Jaeschke H, McGill M, Ramachandran A. Oxidant stress, mitochondria, and cell death mechanisms in drug-induced liver injury: lessons learned from acetaminophen hepatotoxicity. Drug Metab Rev 2012;44:88–106. 65. Gujral J, Knight T, Farhood A, Bajt M, Jaeschke H. Mode of cell death after acetaminophen overdose in mice: apoptosis or oncotic necrosis? Toxicol Sci 2002;67:322–8. 66. Xu J, Zhang X, Monestier M, Esmon N, Esmon C. Extracellular histones are mediators of death through TLR2 and TLR4 in mouse fatal liver injury. J Immunol 2011;187(5):2626–31.

67. McGill M, Sharpe M, Williams C, Taha M, Curry S, Jaeschke H. The mechanism underlying acetaminophen-induced hepatotoxicity in humans and mice involves mitochondrial damage and nuclear DNA fragmentation. JClin Invest 2012;122:1574–83. 68. Starkey L, Dear J, Platt V, Simpson K, Craig D, Antoine D, et al. Circulating microRNAs as potential markers of human drug-induced liver injury. Hepatology 2011;54:1767–76. 69. McGill M, Cao M, Svetlov A, Sharpe M, Williams C, Curry S, et al. Argininosuccinate synthetase as a plasma biomarker of liver injury after acetaminophen overdose in rodents and humans. Biomarkers 2014;19:222–30. 70. Marques P, Amaral S, Pires D, Nogueira L, Soriani F, Lima B, et al. Chemokines and mitochondrial products activate neutrophils to amplify organ injury during mouse acute liver failure. Hepatology 2012;56:1971–82. 71. Jaeschke H, Williams C, Ramachandran A, Bajt M. Acetaminophen hepatotoxicity and repair: the role of sterile inflammation and innate immunity. Liver Int 2012;32:8–20. 72. Antoine D, Jenkins R, Dear J, Williams D, McGill M, Sharpe M, et al. Molecular forms of HMGB1 and keratin-18 as mechanistic biomarkers for mode of cell death and prognosis during clinical acetaminophen hepatotoxicity. J Hepatol 2012;56:1070–9. 73. Hoque R, Sohail M, Salhanick S, Malik A, Ghani A, Robson S, et al. P2X7 receptor-mediated purinergic signaling promotes liver injury in acetaminophen hepatotoxicity in mice. Am J Physiol Gastrointest LiverPhysiol 2012;302:1171–9. 74. Kubes P, Mehal W. Sterile inflammation in the liver. Gastroenterology 2012;143:1158–72. 75. Ron D, Walter P. Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response. Nat Rev Mol Cell Biol 2007;8:519–29. 76. Sitia R, Molteni S. Stress, protein (mis)folding, and signaling: the redox connection. Sci STKE 2004;2004:pe27. 77. Merksamer P, Trusina A, Papa F. Real-time redox measurements during endoplasmic reticulum stress reveal interlinked protein folding functions. Cell 2008;135:933–47. 78. Harding H, Zhang Y, Zeng H, Novoa I, Lu P, Calfon M, et al. An integrated stress response regulates amino acid metabolism and resistance to oxidative stress. Mol Cell 2003;11:619–33. 79. Kim I, Xu W, Reed J. Cell death and endoplasmic reticulum stress: disease relevance and therapeutic opportunities. Nat Rev Drug Discov 2008;7:1013–30. 80. Harding H, Zhang Y, Ron D. Protein translation and folding are coupled by an endoplasmic-reticulum-resident kinase. Nature 1999;397:397. 81. Salem I, Prola A, Boussabbeh M, Guilbert A, Bacha H, Lemaire C, et al. Activation of ER stress and apoptosis by alpha- and beta-Zearalenol in HCT116 cells, protective role of Quercetin. Neurotoxicology 2016;53:334–42. 82. Zhong D, Wang H, Liu M, Li X, Huang M, Zhou H, et al. Ganoderma lucidum polysaccharide peptide prevents renal ischemia reperfusion injury via counteracting oxidative stress. Sci Rep 2015;5:16910. 83. Egnatchik R, Leamy A, Jacobson D, Shiota M, Young J. ER calcium release promotes mitochondrial dysfunction and hepatic cell lipotoxicity in response to palmitate overload. Mol Metab 2014;3:544–53.

84. Bravo R, Gutierrez T, Paredes F, Gatica D, Rodriguez A, Pedrozo Z, et al. Quest AF, Rothermel BA, Lavandero S: Endoplasmic reticulum: ER stress regulates mitochondrial bioenergetics. Int J Biochem Cell Biol 2012;44:16–20. 85. Grimm S. The ER-mitochondria interface: the social network of cell death. Biochim Biophys Acta 2012;1823:327–34. 86. Glancy B, Balaban R. Role of mitochondrial Ca2+ in the regulation of cellular energetics. Biochemistry 2012;51:2959–73. 87. Kheradpezhouh E, Ma L, Morphett A, Barritt G, Rychkov G. TRPM2 channels mediate acetaminophen-induced liver damage. PNAS 2014;111(8):3176–81. 88. Tsokos-Kuhn J, Hughes H, Smith C, Mitchell J. Alkylation of the liverplasma membrane and inhibition of the Ca2+ATPase by acetaminophen. Biochem Pharmacol 1988;37:2125–31. 89. Liu X, Van V, Schnellmann R. The role of calpain in oncotic cell death. Annu Rev Pharmacol Toxicol 2004;44:349–70. 90. Ray S, Sorge C, Raucy J, Corcoran G. Early loss of large genomic DNA in vivo with accumulation of Ca2+in the nucleus during acetaminophen-induced liver injury. Toxicol Appl Pharmacol 1990;106:346–51. 91. Napirei M, Basnakian A, Apostolov E, Mannherz H. Deoxyribonuclease 1 aggravates acetaminophen-induced liver necrosis in male CD-1 mice. Hepatology 2006;43:297–305. 92. Ha H, Snyder S. Poly(ADP-ribose) polymerase is a mediator of necrotic cell death by ATP depletion. Proc Natl Acad Sci USA 1999;96:13978–82. 93. Gonzalez-Mariscal L, Tapia R, Chamorro D. Crosstalk of tight junction components with signaling pathways. Biochim Biophys Acta 2008;1778(3):729–56. 94. Saberi B, Ybanez M, Johnson H, Gaarde W, Han D, Kaplowitz N. Protein kinase C (PKC) participates in acetaminophen hepatotoxicity through c-jun-N-terminal kinase (JNK)-dependent and -independent signaling pathways. Hepatology 2014;59(4):1543–54. 95. Bensaad K, Vousden K. Savior and slayer: the two faces of p53. Nat Med 2005;11:1278–9. 96. Faraonio R, Vergara P, Di Marzo D, Pierantoni M, Napolitano M, Russo T, et al. p53 suppresses the Nrf2-dependent transcription of antioxidant response genes. J Biol Chem 2006;281:39776–84. 97. You A, Nam C, Wakabayashi N, Yamamoto M, Kensler T, Kwak M. Transcription factor Nrf2 maintains the basal expression of Mdm2: An implication of the regulation of p53 signaling by Nrf2. Arch Biochem Biophys 2011;507:356–64. 98. Chen W, Jiang T, Wang H, Tao S, Lau A, Fang D, et al. Does Nrf2 contribute to p53-mediated control of cell survival and death? Antioxid Redox Signal 2012;17:1670–5. 99. Fuchs S, Adler V, Pincus M, Ronai Z. MEKK1/JNK signaling stabilizes and activates p53. Proc Natl Acad Sci USA 1998;95:10541–6. 100. Lehmann K, Tschuor C, Rickenbacher A, Jang J, Oberkofler C, Tschopp O, et al. Liver failure after extended hepatectomy in mice is mediated by a p21-dependent barrier to liver regeneration. Gastroenterology 2012;143:1609–19. 101. Buitrago-Molina L, Marhenke S, Longerich T, Sharma A, Boukouris A, Geffers R, et al. The degree of liver injury determines the role of p21 in liver regeneration and hepatocarcinogenesis in mice. Hepatology 2013;58:1143–52.

102. Frank S, Gaume B, Bergmann-Leitner E, Leitner W, Robert E, Catez F, et al. The role of dynamin-related protein 1, a mediator of mitochondrial fission, in apoptosis. Dev Cell 2001;1:515–25. 103. Nguyen D, Alavi M, Kim K, Kang T, Scott R, Noh Y, et al. A new vicious cycle involving glutamate excitotoxicity, oxidative stress and mitochondrial dynamics. Cell Death Dis 2011;2:e240. 104. Nguyen T, Sherratt P, Pickett C. Regulatory mechanisms controlling gene expression mediated by the antioxidant response element. Annu Rev Pharmacol Toxicol 2003;43:233–60. 105. Aleksunes L, Manautou J. Emerging role of Nrf2 in protecting against hepatic and gastrointestinal disease. Toxicol Pathol 2007;35:459–73. 106. Kim J, Bogner P, Ramnath N, Park Y, Yu J, Park Y. Elevated peroxiredoxin 1, but not NF-E2-related factor 2, is an independent prognostic factor for disease recurrence and reduced survival in stage I non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res 2007;13:3875-82. 107. Reszka E, Wieczorek E, Jablonska E, Janasik B, Fendler W, Wasowicz W. Association between plasma selenium level and NRF2 target genes expression in humans. J Trace Elem Med Biol 2015;30:102-6. 108. Aleksunes L, Slitt A, Maher J, Augustine L, Goedken M, Chan J, et al. Induction of Mrp3 and Mrp4 transporters during acetaminophen hepatotoxicity is dependent on Nrf2. Toxicol Appl Pharmacol 2008;226:74–83. 109. Moffit J, Aleksunes L, Kardas M, Slitt A, Klaassen C, Manautou J. Role of NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 in clofibrate-mediated hepatoprotection from acetaminophen. Toxicology 2007;230:197–206. 110. Gum S, Cho M. The amelioration of N-acetyl-p-benzoquinone imine toxicity by ginsenoside Rg3: the role of Nrf2-mediated detoxification and Mrp1/Mrp3 transports. Oxid Med Cell Longevity 2013;2013:957947. 111. McCord J, Fridovich I. Superoxide dismutase: an enzymatic function for erythrocuprein (hemocuprein). JBiol Chem 1969;244(22):6049-55. 112. Rhee S, Chae H, Kim K. Peroxiredoxins: a historical overview and speculative preview of novel mechanisms and emerging concepts in cell signaling. Free Radical Biol Med 2005;38(12):1543-52. 113. Okawa H, Motohashi H, Kobayashi A, Aburatani H, Kensler T, Yamamoto M. Hepatocyte-specific deletion of the keap1 gene activates Nrf2 and confers potent resistance against acute drug toxicity. Biochem Biophys Res Commun 2006;339:79-88. 114. Klaassen C, Reisman S. Nrf2 the rescue: effects of the antioxidative/electrophilic response on the liver. Toxicol Appl Pharmacol 2010;244:57-65. 115. Williams J, Ding W. Targeting Pink1-Parkin-mediated mitophagy for treating liver injury. Pharmacol Res 2015;102:264–9. 116. Ni H, Bockus A, Boggess N, Jaeschke H, Ding W. Activation of autophagy protects against acetaminophen-induced hepatotoxicity. Hepatology 2012;55:222–32. 117. Tsung A, Hoffman R, Izuishi K, Critchlow N, Nakao A, Chan M, et al. Hepatic ischemia/reperfusion injury involves functional TLR4 signaling in non parenchymal cells. J Immunol 2005;175:7661–8. 118. Kayagaki N, Wong M, Stowe I, Ramani S, Gonzalez L, Akashi-Takamura S, et al. Noncanonical inflammasome activation by intracellular LPS independent of TLR4. Science 2013;341:1246–9.

119. Imaeda A, Watanabe A, Sohail M, Mahmood S, Mohamadnejad M, Sutterwala F, et al. Acetaminophen-induced hepatotoxicity in mice is dependent on Tlr9 and the Nalp3 inflammasome. J Clin Invest 2009;119:305–14. 120. Schroder K, Zhou R, Tschopp J. The NLRP3 inflammasome: a sensor for metabolic danger? Science 2010;327:296–300. 121. Iracheta-Vellve A, Petrasek J, Satishchandran A, Gyongyosi B, Saha B, Kodys K, et al. Inhibition of sterile danger signals, uric acid and ATP, prevents inflammasome activation and protects from alcoholic steatohepatitis in mice. J Hepatol 2015;63:1147–115. 122. Martinon F, Burns K, Tschopp J. The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of pro-IL-beta. Mol Cell 2002;10:417–26. 123. Mariathasan S, Weiss D, Newton K, McBride J, O’Rourke K, Roose-Girma M, et al. Cryopyrin activates the inflammasome in response to toxins and ATP. Nature 2006;440:228–32. 124. Katsnelson M, Rucker L, Russo H, Dubyak G. K+ efflux agonists induce NLRP3 inflammasome activation independently of Ca2+ signaling. J Immunol 2015;194:3937–52. 125. Broz P, Dixit V. Inflammasomes: mechanism of assembly, regulation and signalling. Nat Rev Immunol 2016;16:407–20. 126. Srinivasula S, Poyet J, Razmara M, Datta P, Zhang Z, Alnemri E. The PYRIN-CARD protein ASC is an activating adaptor for caspase-1. J Biol Chem 2002;277:21119–22. 127. Sborgi L, Rühl S, Mulvihill E, Pipercevic J, Heilig R, Stahlberg H, et al. GSDMD membrane pore formation constitutes the mechanism of pyroptotic cell death. EMBO J 2016;35:1766–78. 128. Liu X, Zhang Z, Ruan J, Pan Y, Magupalli V, Wu H, et al. Inflammasome-activated gasdermin D causes pyroptosis by forming membrane pores. Nature 2016;535:153–8. 129. Hoque R, Sohail M, Salhanick S, Malik A, Ghani A, Robson S, et al. P2X7 receptor-mediated purinergic signaling promotes liver injury in acetaminophen hepatotoxicity in mice. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2012;302:G1171–G9. 130. Blazka M, Elwell M, Holladay S, Wilson R, Luster M. Histopathology of acetaminophen-induced liver changes: role of interleukin 1 alpha and tumor necrosis factor alpha. Toxicol Pathol 1996;24(2):181–9. 131. Ishibe T, Kimura A, Ishida Y, Takayasu T, Hayashi T, Tsuneyama K, et al. Reduced acetaminophen-induced liver injury in mice by genetic disruption of IL-1 receptor antagonist. Lab Invest 2009;89:68–79. 132. Williams C, Antoine D, Shaw P, Benson C, Farhood A, Williams D, et al. Role of the Nalp3 inflammasome in acetaminophen-induced sterile inflammation and liver injury. Toxicol Appl Pharmacol 2010;252:289–97. 133. Williams C, Farhood A, Jaeschke H. Role of caspase-1 and interleukin-1beta in acetaminophen-induced hepatic inflammation and liver injury. Toxicol Appl Pharmacol 2010;247:169–78. 134. Dambach D, Watson L, Gray K, Durham S, Laskin D. Role of CCR2 in macrophage migration into the liver during acetaminophen-induced hepatotoxicity in the mouse. Hepatology 2002;35:1093-103. 135. Zigmond E, Samia-Grinberg S, Pasmanik-Chor M, Brazowski E, Shibolet O, Halpern Z. Infiltrating monocyte-derived macrophages and resident kupffer

cells display different ontogeny and functions in acute liver injury. J Immunol 2014;193:344-53. 136. Ju C, Reilly T, Bourdi M, Radonovich M, Brady J, George J, et al. Protective role of Kupffer cells in acetaminophen-induced hepatic injury in mice. Chem Res Toxicol 2002;15:1504-13. 137. Bourdi M, Masubuchi Y, Reilly T, Amouzadeh H, Martin J, George J, et al. Protection against acetaminophen-induced liver injury and lethality by interleukin 10: role of inducible nitric oxide synthase. Hepatology 2002;35:289-98. 138. Ishida Y, Kondo T, Tsuneyama K, Lu P, Takayasu T, Mukaida N. The pathogenic roles of tumor necrosis factor receptor p55 in acetaminophen-induced liver injury in mice. J Leukoc Biol 2004;75(1):59–67. 139. Toklu H, Sehirli A, Velioglu-Ogunc A, Cetinel S, Sener G. Acetaminophen-induced toxicity is prevented by β-D-glucan treatment in mice. Eur J Pharmacol 2006;543:133–40. 140. Gardner C, Laskin J, Dambach D, Chiu H, Durham S, Zhou P, et al. Exaggerated hepatotoxicity of acetaminophen in mice lacking tumor necrosis factor receptor-1. Potential role of inflammatory mediators. Toxicol Appl Pharmacol 2003;192:119–30. 141. James L, Kurten R, Lamps L, McCullough S, Hinson J. Tumour necrosis factor receptor 1 and hepatocyte regeneration in acetaminophen toxicity: a kinetic study of proliferating cell nuclear antigen and cytokine expression. Basic Clin Pharmacol Toxicol 2005;97(1):8–14. 142. Chiu H, Gardner C, Dambach D, Durham S, Brittingham J, Laskin J, et al. Role of tumor necrosis factor receptor 1 (p55) in hepatocyte proliferation during acetaminophen-induced toxicity in mice. Toxicol Appl Pharmacol 2003;193:218-27. 143. Yang R, Zhang S, Kajander H, Zhu S, Koskinen M, Tenhunen J. Ringer’s lactate improves liver recovery in a murine model of acetaminophen toxicity. BMC Gastroenterol 2011;11:125. 144. Simpson K, Lukacs N, McGregor A, Harrison D, Strieter R, Kunkel S. Inhibition of tumour necrosis factor alpha does not prevent experimental paracetamol-induced hepatic necrosis. J Pathol 2000;190(4):489–94. 145. Yee S, Bourdi M, Masson M, Pohl L. Hepatoprotective role of endogenous interleukin-13 in a murine model of acetaminophen-induced liver disease. Chem Res Toxicol 2007;20(5):734–44. 146. Connolly M, Ayo D, Malhotra A, Hackman M, Bedrosian A, Ibrahim J, et al. Dendritic cell depletion exacerbates acetaminophen hepatotoxicity. Hepatology 2011;54:959–68. 147. Boess F, Bopst M, Althaus R, Polsky S, Cohen S, Eugster H, et al. Acetaminophen hepatotoxicity in tumor necrosis factor/lymphotoxin-alpha gene knockout mice. Hepatology 1998;27:1021-9. 148. Chiu H, Gardner C, Dambach D, Brittingham J, Durham S, Laskin J, et al. Role of p55 tumor necrosis factor receptor 1 in acetaminophen-induced antioxidant defense. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2003;285:G959–G66. 149. Michael S, Pumford N, Mayeux P, Niesman M, Hinson J. Pretreatment of mice with macrophage in-activators decreases acetaminophen hepatotoxicity and the formation of reactive oxygen and nitrogen species. Hepatology 1999;30:186–95.

150. Goldin R, Ratnayaka I, Breach C, Brown I, Wickramasinghe S. Role of macrophages in acetaminophen (paracetamol)-induced hepatotoxicity. J Pathol 1996;179:432–5. 151. Ito Y, Bethea N, Abril E, McCuskey R. Early hepatic microvascular injury in response to acetaminophen toxicity. Microcirculation 2003;10:391–400. 152. You Q, Holt M, Yin H, Li G, Hu C, Ju C. Role of hepatic resident and infiltrating macrophages in liver repair after acute injury. Biochem Pharmacol 2013;86:836-43. 153. Campion S, Johnson R, Aleksunes L, Goedken M, Rooijen V, N S, GL, et al. Hepatic Mrp4 induction following acetaminophen exposure is dependent on Kupffer cell function. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2008;295:G294–304. 154. Stutchfield B, Antoine D, Mackinnon A, Gow D, Bain C, Hawley C, et al. CSF1 restores innate immunity after liver injury in mice and serum levels indicate outcomes of patients with acute liver failure. Gastroenterology 2015;149:1896-909. 155. James L, McCullough S, Knight T, Jaeschke H, Hinson J. Acetaminophen toxicity in mice lacking NADPH oxidase activity: role of peroxynitrite formation and mitochondrial oxidant stress. Free Radic Res 2003;37:1289–97. 156. Williams C, Bajt M, Sharpe M, McGill M, Farhood A, Jaeschke H. Neutrophil activation during acetaminophen hepatotoxicity and repair in mice and humans. Toxicol Appl Pharmacol 2014;275:122–33. 157. Holt M, Cheng L, Ju C. Identification and characterization of infiltrating macrophages in acetaminophen-induced liver injury. J Leukoc Biol 2008;84:1410-21. 158. Dambach D, Watson L, Gray K, Durham S, Laskin D. Role of CCR2 in macrophage migration into the liver during acetaminophen-induced hepatotoxicity in the mouse. Hepatology 2002;35:1093–103. 159. Holt M, Cheng L, Ju C. Identification and characterization of infiltrating macrophages in acetaminophen-induced liver injury. J Leukoc Biol 2008;84:1410–21. 160. Sierra-Filardi E, Nieto C, Domínguez-Soto A, Barroso R, Sánchez-Mateos, P P-K, et al. CCL2 shapes macrophage polarization by GM-CSF and M-CSF: identification of CCL2/CCR2-dependent gene expression profile. J Immunol 2014;192:3858-67. 161. Tacke F, Zimmermann H. Macrophage heterogeneity in liver injury and fibrosis. J Hepatol 2014;60:1090-6. 162. Antoniades C, Quaglia A, Taams L, Mitry R, Hussain M, Abeles R, et al. Source and characterization of hepatic macrophages in acetaminophen-induced acute liver failure in humans. Hepatology 2012;56:735–46. 163. James L, Simpson P, Farrar H, Kearns G, Wasserman G, Blumer J, et al. Cytokines and toxicity in acetaminophen overdose. J Clin Pharmacol 2005;45:1165–71. 164. Mossanen J, Krenkel O, Ergen C, Govaere O, Liepelt A, Puengel T, et al. Chemokine (C–C motif) receptor 2-positive monocytes aggravate the early phase of acetaminophen-induced acute liver injury. Hepatology 2016;64:1667–82. 165. Krenkel O, Mossanen J, Tacke F. Immune mechanisms in acetaminophen-induced acute liver failure. Hepatobiliary surgery and nutrition 2014;3:331–43.

166. Possamai L, Thursz M, Wendon J, Antoniades C. Modulation of monocyte/macrophage function: a therapeutic strategy in the treatment of acute liver failure. J Hepatol 2014;61:439-45. 167. Laskin D. Macrophages and inflammatory mediators in chemical toxicity: a battle of forces. Chem Res Toxicol 2009;22:1376–85. 168. Adams D, Ju C, Ramaiah S, Uetrecht J, Jaeschke H. Mechanisms of immune-mediated liver injury. Toxicol Sci 2010;115:307–21. 169. Zimmermann H, Tacke F. Modification of chemokine pathways and immune cell infiltration as a novel therapeutic approach in liver inflammation and fibrosis. Inflamm Allergy Drug Targets 2011;10:509-36. 170. McDonald B, Pittman K, Menezes G, Hirota S, Slaba I, Waterhouse C, et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science 2010;330:362-6. 171. Huebener P, Pradere J, Hernandez C, Gwak G, Caviglia J, Mu X, et al. The HMGB1/RAGE axis triggers neutrophil-mediated injury amplification following necrosis. J Clin Invest 2015;125:539–50. 172. Liu Z, Han D, Gunawan B, Kaplowitz N. Neutrophil depletion protects against murine acetaminophen hepatotoxicity. Hepatology 2006;43:1220–30. 173. Ishida Y, Kondo T, Kimura A, Tsuneyama K, Takayasu T, Mukaida N. Opposite roles of neutrophils and macrophages in the pathogenesis of acetaminophen-induced acute liver injury. Eur J Immunol 2006;36:1028–38. 174. Patel S, Luther J, Bohr S, Iracheta-Vellve A, Li M, King K, et al. A Novel Resolvin-Based Strategy for Limiting Acetaminophen Hepatotoxicity. Clin Transl Gastroenterol 2016;7:e153. 175. Williams C, Bajt M, Farhood A, Jaeschke H. Acetaminophen-induced hepatic neutrophil accumulation and inflammatory liver injury in CD18-deficient mice. Liver Int 2010;30:1280-92. 176. Cover C, Liu J, Farhood A, Malle E, Waalkes M, Bajt M, et al. Pathophysiological role of the acute inflammatory response during acetaminophen hepatotoxicity. Toxicol Appl Pharmacol 2006;216:98–107. 177. Hou H, Liao C, Sytwu H, Liao N, Huang T, Hsieh T, et al. Deficiency of interleukin-15 enhances susceptibility to acetaminophen-induced liver injury in mice. PLoS One 2012;7:e44880. 178. Hammerich L, Heymann F, Tacke F. Role of IL-17 and Th17 cells in liver diseases. Clin Dev Immunol 2011;2011:345803. 179. Han D, Shinohara M, Ybanez M, Saberi B, Kaplowitz N. Signal transduction pathways involved in drug-induced liver injury. Handb Exp Pharmacol 2010:267-310. 180. Masubuchi Y, Sugiyama S, Horie T. Th1/Th2 cytokine balance as a determinant of acetaminophen-induced liver injury. Chem Biol Interact 2009;179:273-9. 181. Wang X, Sun R, Wei H, Tian Z. High-mobility group box (HMGB1)-Toll-like receptor (TLR)4-interleukin (IL)-23-IL-17A axis in drug-induced damage-associated lethal hepatitis: Interaction of γδ T cells with macrophages. Hepatology 2013;57:373-84. 182. Wang X, Sun R, Wei H, Tian Z. High-mobility group box 1 (HMGB1)-Toll-like receptor (TLR)4-interleukin (IL)-23-IL-17A axis in drug-induced damage-associated lethal hepatitis: Interaction of cd T cells with macrophages. Hepatology 2013;57:373–84.

183. Wehr A, Baeck C, Heymann F, Niemietz P, Hammerich L, Martin C, et al. Chemokine receptor CXCR6-dependent hepatic NK T Cell accumulation promotes inflammation and liver fibrosis. J Immunol 2013;190:5226-36. 184. Wang H, Feng D, Park O, Yin S, Gao B. Invariant NKT cell activation induces neutrophil accumulation and hepatitis: opposite regulation by IL-4 and IFN-γ. Hepatology 2013;58:1474-85. 185. Tinel M, Berson A, Vadrot N, Descatoire V, Grodet A, Feldmann G, et al. Subliminal Fas stimulation increases the hepatotoxicity of acetaminophen and bromobenzene in mice. Hepatology 2004;39:655-66. 186. Geissmann F, Cameron T, Sidobre S, Manlongat N, Kronenberg M, Briskin M, et al. Intravascular immune surveillance by CXCR6+ NKT cells patrolling liver sinusoids. PLoS Biol 2005;3:e113. 187. Martin-Murphy B, Kominsky D, Orlicky D, Donohue TJ, Ju C. Increased susceptibility of natural killer T-cell-deficient mice to acetaminophen-induced liver injury. Hepatology 2013;57:1575–84. 188. Liu Z, Govindarajan S, Kaplowitz N. Innate immune system plays a critical role in determining the progression and severity of acetaminophen hepatotoxicity. Gastroenterology 2004;127:1760–74. 189. Masson M, Carpenter L, Graf M, Pohl L. Pathogenic role of natural killer T and natural killer cells in acetaminophen-induced liver injury in mice is dependent on the presence of dimethyl sulfoxide. Hepatology 2008;48:889–97. 190. Schuch A, Hoh A, Thimme R. The role of natural killer cells and CD8(+) T cells in hepatitis B virus infection. Front Immunol 2014;5:258. 191. Ghanem C, Perez M, Manautou J, Mottino A. Acetaminophen from liver to brain: New insights into drug pharmacological action and toxicity. Pharmacol Res 2016;109:119–31. 192. Du K, Xie Y, McGill M, Jaeschke H. Pathophysiological significance of c-jun N-terminal kinase in acetaminophen hepatotoxicity. Expert Opin Drug Metab Toxicol 2015;11:1769–79. 193. Woolbright B, Jaeschke H. Role of the inflammasome in acetaminophen-induced liver injury and acute liver failure. Journal of Hepatology 2017;66(4):836–48.

ANEXOS

Figura 1: Mecanismo de hepatotoxicidade clássico.

Figura 2: Metabolização do paracetamol. Baseado em Ghanem CI et al191.

Figura 3: Via de sinalização c-jun-N-terminal kinase (JNK). Baseado em Du K et

al192.

Figura 4: transição de permeabilidade mitocondrial (MPT). Baseado em

Woolbright BL et al193.

Figura 5: Mecanismo de hepatotoxicidade clássico e vias de sinalização

complementares.

Figura 6: Papel do stress do RE (retículo endoplasmático) na hepatotoxicidade

do paracetamol.

Figura 7: Papel do metabolismo do cálcio na hepatotoxicidade do paracetamol.

Figura 8: Papel do stress do p53 na hepatotoxicidade do paracetamol.

Figura 9: Papel da fissão mitocondrial na hepatotoxicidade do paracetamol.

Figura 10: Papel da via de sinalização Nuclear factor-like 2 (Nrf2) na

hepatotoxicidade do paracetamol.

Figura 11: Papel da mitofagia na hepatotoxicidade do paracetamol.

Figura 12: Interação do sistema imune e hepatócitos. Baseado em Krenkel O et

al165.

Figura 13: Ativação do inflamossoma. Baseado em Woolbright BL et al193.

Instruções para Autores

Regras de Formatação para Autores

Na 1ª página

a) Título conciso em português/inglês/castelhano

b) Na linha da autoria, liste o Nome de todos os Autores (primeiro e último nome) com os títulos académicos e/ou profissionais e respetiva afiliação (departamento, instituição, cidade, país)

c) Morada e e-mail do Autor responsável pela correspondência relativa ao manuscrito

d) Resumo em português/castelhano e inglês, com um número máximo de 300 palavras

e) Palavras-chave (máximo de 5).

Nas páginas seguintes:

a) Títulos 1 em maiúscula

b) Títulos 2 em minúscula

c) Títulos 3 em minúscula e itálico

d) Todas as figuras e tabelas devem estar devidamente identificadas no corpo do texto

e) Todos os estrangeirismos devem ser colocados em itálico

f) As notas de rodapé devem vir coladas ao texto correspondente em superscript. Ex: texto[1]

g) Todas as figuras e tabelas devem ser enviadas em formato editável e imagens. Estas devem ter largura máxima de 8,25 cm, com alta resolução e enviados em arquivo separado, em formato word ou excel.

h) As legendas das figuras e das tabelas não devem ultrapassar os 98 carateres (com espaços)

AGRADECIMENTOS (facultativo) Devem vir após o texto, tendo como objetivo agradecer a todos os que contribuíram para o estudo mas não têm peso de autoria. Nesta secção é possível agradecer a todas as fontes de apoio, quer financeiro, quer tecnológico ou de consultoria, assim como contribuições individuais. Cada pessoa citada nesta secção de agradecimentos deve enviar uma carta autorizando a inclusão do seu nome.

REFERÊNCIAS

Os autores são responsáveis pela exatidão e rigor das suas referências e pela sua correta citação no texto. As referências bibliográficas devem ser citadas numericamente (algarismos árabes formatados sobrescritos) por ordem de entrada no texto e ser identificadas no texto com algarismos árabes.

As referências são alinhadas à esquerda.

Não deverão ser incluídos na lista de referências quaisquer artigos ainda em preparação ou observações não publicadas, comunicações pessoais, etc. Tais inclusões só são permitidas no corpo do manuscrito.

As abreviaturas usadas na nomeação das revistas devem ser as utilizadas pelo National Library of Medicine (NLM) Title Journals Abbreviations http://www.ncbi.nlm.nih. gov/nlmcatalog/journals. Notas: Não indicar mês da publicação.

Nas referências com 6 ou menos Autores devem ser nomeados todos. Nas referências com 7 ou mais autores devem ser nomeados os 6 primeiros seguidos de “et al”.

Seguem-se alguns exemplos de como devem constar os vários tipos de referências. Artigo:

Apelido Iniciais do(s) Autor(es). Título do artigo. Título das revistas [abreviado]. Ano de publicação;Volume: páginas.

1. Com menos de 6 autores

Miguel C, Mediavilla MJ. Abordagem actual da gota. Acta Med Port. 2011;24:791-8.

1. Com mais de 6 autores

Norte A, Santos C, Gamboa F, Ferreira AJ, Marques A, Leite C, et al. Pneumonia Necrotizante: uma complicação rara. Acta Med Port. 2012;25:51-5.

Monografia:

Autor/Editor AA. Título: completo. Edição (se não for a primeira). Vol.(se for trabalho em vários volumes). Local de publicação: Editor comercial; ano.

1. Com Autores: Moore, K. Essential Clinical Anatomy. 4th ed. Philadelphia: Wolters Kluwer Lippincott Williams & Wilkins; 2011.

Com editor: Gilstrap LC 3rd, Cunningham FG, VanDorsten JP, editors. Operative obstetrics. 2nd ed. New York: McGraw-Hill; 2002.

Capitulo de monografia: Meltzer PS, Kallioniemi A, Trent JM. Chromosome alterations in human solid tumors. In: Vogelstein B, Kinzler KW, editors. The genetic basis of human cancer. New York: McGraw-Hill; 2002. p. 93-113.

Relatório Científico/Ténico:

Lugg DJ. Physiological adaptation and health of an expedition in Antarctica: with comment on behavioural adaptation. Canberra: A.G.P.S.; 1977. Australian Government Department of Science, Antarctic Division. ANARE scientific reports. Series B(4), Medical science Nº. 0126

Documento eletrónico:

1. CD-ROM Anderson SC, Poulsen KB. Anderson’s electronic atlas of hematology [CD-ROM]. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; 2002.

2. Monografia da Internet Van Belle G, Fisher LD, Heagerty PJ, Lumley TS. Biostatistics: a methodology for the health sciences [e-book]. 2nd ed. Somerset: Wiley InterScience; 2003 [consultado 2015 abril 30]. Disponível em: Wiley InterScience electronic collection

3. Homepage/Website Cancer-Pain.org [homepage na Internet]. New York: Association of Cancer Online Resources, Inc.; c2000-01; [consultado 2015 Jul 9]. Disponível em: http://www.cancer-pain.org/.