RESÍDUOS AGROINDÚSTRIAIS: FONTE ALTERNATIVA PARA A

RESÍDUOS AGROINDÚSTRIAIS: FONTE ALTERNATIVA PARA A PRODUÇÃO DE BIOMOLÉCULAS

Giselle Aparecida Nobre CostaGláucia Maria Pastore

ICTR 2004 – CONGRESSO BRASILEIRO DE CIÊNCIA E TECNOLOGIA EM RESÍDUOS E DESENVOLVIMENTO SUSTENTÁVEL

Costão do Santinho – Florianópolis – Santa Catarina

Realização:

ICTR – Instituto de Ciência e Tecnologia em Resíduos e Desenvolvimento SustentávelNISAM - USP – Núcleo de Informações em Saúde Ambiental da USP

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RESÍDUOS AGROINDUSTRIAIS: FONTE ALTERNATIVA PARA A PRODUÇÃO DE BIOMOLÉCULAS

Giselle Aparecida Nobre Costa, Gláucia Maria Pastore2

RESUMO Na busca de fontes alternativas para a produção de compostos de interesse biotecnológico, o uso de subprodutos de processamento agrícola ou industrial apresenta um vasto campo a ser explorado. A manipueira, um resíduo líquido altamente tóxico, gerado pelas indústrias processadoras de farinha e fécula, foi investigada como meio de cultivo para a produção de biosurfactantes por Bacillus subtilis LB5a. Para avaliar a produção do surfactante, efetuou -se medidas de concentração (m/v). A tensão superficial e interfacial do meio de fermentação livre de células pelo método da placa de Wilhelmy, foi avaliado. Para os testes de estabilidade, a manipueira fermentada sofreu variações de temperatura, pH e concentrações de NaCl. A atividade emulsificante foi realizada contra hidrocarbonetos e ácidos graxos e teve o índice E24 determinado. Para a atividade antibiótica frente a bactérias gram positivas e negativas, utilizou-se o método de difusão em ágar. A fermentação foi conduzida em fermentador de bancada Bioflo IIc New Brunswick, utilizando 1,5 L de meio. Definidas as condições e cinética da fermentação, foi obtido uma produção de 2,1 g/L de surfactante em 36 h. ; o surfactante obtido foi capaz de reduzir a tensão superficial do meio para 25 mN/m , com tensão interfacial de 0,93 mN/m. O composto apresentou capacidade de formar emulsões estáveis com óleos e hidrocarbonetos, estabilidade a altas concentrações de sal (25%), elevadas temperaturas (135ºC) e ampla faixa de pH (5-12), assim como atividade antimicrobiana. Estes resultados evidenciam a manipueira como um excelente substrato para a produção de biosurfactante pela cepa estudada. PALAVRAS - CHAVE: Biosurfactante, manipueira, Bacillus subtilis, resíduo. 1 Aluno Mestrado, Faculdade de Engenharia de Alimentos- Departamento de Ciência de Alimentos; Laboratório de Bioquímica FEA/UNICAMP - Campinas SP- Brasil e-mail:[email protected] 2 Professor Associado, Faculdade de Engenharia de Alimentos FEA/UNICAMP; Campinas SP- Brasil e-mail:[email protected]

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ABSTRACT In the search for alternative sources to the production of biotecnological interesting compounds, the use of agricultural or the industrial byproducts is a wide field to be explored. The manipueira (cassava wastewater) is a highly toxic industrial liquid residue produced during the manufacturing of flour and starch. In this work we determined the potential of Cassava wastewater as a culture medium for the production of biosurfactants by Bacillus subtilis. The superficial and interfacial tension of the cell free medium were determined by the Wilhelmy plate method. To the stability tests, the substrate cassava wastewater was submitted under several conditions of temperature, pH and NaCl concentrations. The emulsification activity against hydrocarbons and fatty acids was determined via its E24 values. To the antimicrobial activity against bacteria the agar diffusion method has been used. The optimal conditions and kinetics of the production of the biosurfactants were determined and a 2,1g/L was obtained in 36h. The surfatant obtained was able to reduce the superficial tension of the medium to 25 mN/m with interfacial tension of 0,93 mN/m. The compound produced stable emulsions with oils and hidrocarbons and show high stability at high temperatures and salt concentrations, pH intervals 5 to 12 and high antimicrobial activity. These results show the good potential of manipueira as a substrate to production of biosurfactant by the studied strain. key-words: Biosurfactant, cassava waste, Bacillus subtilis

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1- INTRODUÇÃO A sociedade contemporânea está aberta à evolução tecnológica, contudo, a

responsabilidade na manutenção e preservação dos recursos naturais esgotáveis deve ser uma preocupação constante e esta deve estar baseada em uma legislação coerente, que atenda, sobretudo às necessidades das gerações futuras sem comprometer a evolução natural da humanidade. Assim; os efluentes produzidos em cada setor devem ter um tratamento ou fim adequado e receberem tanta atenção quanto o produto alvo.

Neste contexto, as agroindústrias, reconhecidas por gerarem grandes volumes de resíduos geralmente não esgotados, têm em seus processos um alto custo, agregado pelo tratamento destes subprodutos e em casos mais graves um comprometimento da produtividade em virtude do excesso de poluição que impossibilita o cultivo da matéria prima próximo à área de manufatura. A mandioca (Manihot esculenta crantz) raiz muito utilizada como fonte de alimentação em países tropicais da Ásia, África e América Latina, ocupa a sexta posição no ranking de alimentos cultivados e é considerada a base alimentar por mais de 700 milhões de pessoas nesses paises (SOCOL, 19961; KATO e SOUZA, 19872; CEREDA e colaboradores, 19963). O cultivo desta raiz aumentou de 75 milhões de toneladas em 1965 para 166 milhões em 1999 (FAO/GIEWS,1999)4. Dentre os cinco maiores produtores mundiais, o Brasil é o segundo, com um total de 23 milhões de toneladas/ano e o primeiro da América Latina (SOCOL, 1996). A industrialização da mandioca, em farinha e fécula, gera aproximadamente 240.000 L de resíduo/mês a partir do processamento de 700 toneladas de raiz (DEL BIANCHI,1998)5. Este resíduo, a manipueira, proveniente da prensagem das raízes da mandioca, com vista à obtenção da fécula ou farinha, é um subproduto que se apresenta na forma de suspensão aquosa constituído por macro e micronutrientes vegetais, é altamente poluente devido a suas concentrações de matéria orgânica não esgotada, que pode atingir 100 g DQO/L. Além de poluente, o resíduo é tóxico pela presença de glicosídeos cianogênicos, como a linamarina e lataustralina, potencialmente hidrolisáveis a cianeto e ácido cianídrico em presença de ácidos ou enzimas (CEREDA,1994)6. A manipueira, apesar do potencial poluente, é um resíduo constituído por carboidratos, nitrogênio e diversos sais minerais o que a torna passível de ser aproveitada em processos biotecnológicos como na produção de biomassa oleaginosa (EFFING & WOSIACK, 1998)7 bioaromas (DAMASCENO, 1999)8, biogás (BARANA, 2000)9 e biosurfactante (SANTOS et al10; NITSCHKE & PASTORE, 200311) A utilização deste efluente como substrato para microrganismos além de contribuir com a redução da poluição ambiental, proporciona uma drástica redução de gastos na produção de substâncias de interesse como os biosurfactantes. Biosurfactantes são compostos anfipáticos de origem biológica que apresentam tanto fração hidrofílica como hidrofóbica numa mesma molécula, sendo que o caráter apolar lipofílico é dado pela cadeia de ácidos graxos e a parte polar hidrofílica, por grupamentos carboidratos, aminoácidos, peptídeos cíclicos, fosfatos, ácidos carboxílicos ou álcoois (MULLIGAN & GIBBS,1993)12. Estes compostos ditos tensoativos, agem diminuindo a tensão superficial e interfacial de líquidos. (DESAI & BANAT, 1997)13

Os compostos biosurfactantes estão em evidencia por apresentarem características desejáveis se comparada aos surfactantes sintéticos convencionais, dentre as quais destacam -se:

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Baixa toxicidade, permitindo sua utilização para consumo humano em alimentos, produtos cosméticos e fármacos ( FLASZ, 1998)14;

Biodegradabilidade: são facilmente degradáveis na água ou no solo potencializando seu uso em biorremediação e tratamento de resíduos; (MULLIGAN & GIBBS, 1993).

Atividade superficial e interfacial mais eficiente que os surfactantes usuais, pois reduzem mais a tensão superficial com uma menor concentração de produto; ( BOGNOLO, 199915 ; COOPER & PADDOCK, 1984)16.

São mais tolerantes a variações de temperaturas, pH e força iônica, suportando condições drásticas. ( HOROWITZ et al, 1990)17. O quadro 1 ilustra as principais funções e aplicações dos biosurfactantes. Quadro 1. Principais aplicações comerciais dos biosurfactantes

Funções Campos de aplicação Emulsionantes e dispersantes Cosméticos, tintas, biorremediação, óleos,

alimentos Solubilizantes Produtos farmacêuticos e de higiene Agentes molhantes e penetrantes

Produtos farmacêuticos, têxteis e tintas

Detergentes Produtos de limpeza, agricultura Agentes espumantes Produtos de higiene, cosméticos, flotação de

minérios Agentes espessantes Tintas e alimentos Sequestrantes de metais Mineração Formadores de vesículas Cosméticos e sistemas de liberação de drogas Fator de crescimento microbiano

Tratamento de resíduos oleosos

Demulsificantes Tratamento de resíduos, recuperação de petróleo Redutores de viscosidade Transporte em tubulações, oleodutos Dispersantes Misturas carvão-água, calcáreo-água Fungicida Controle biológico de fitopatógenos Agente de recuperação Recuperação terciária de petróleo (MEOR)

Fonte: BANAT et al., 200018. Aplicações como biorremediação, dispersão no derramamento de óleos,

remoção e mobilização de resíduos de óleo em tanques de estocagem e recuperação terciária de petróleo, fazem estes tipos de compostos merecerem especial atenção, além disso são associados a aplicações ecologicamente corretas.

No entanto, os altos custos de produção e métodos ineficientes de recuperação envolvidos na obtenção de biosurfactantes tornam sua utilização limitada. Estes custos podem ser significativamente reduzidos através do uso de fontes alternativas de nutrientes facilmente disponíveis e de baixo custo; a utilização destes recursos, além de contribuir com a redução da poluição ambiental, permite o desenvolvimento de biotecnologias capazes de beneficiar o homem e a natureza. Este trabalho objetivou a investigação do emprego do resíduo manipueira como meio de cultivo para microrganismos visando a obtenção de biosurfactante, a caracterização do composto obtido e aplicações.

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2- MATERIAIS E MÉTODOS 2.1- CARACTERIZAÇÃO DA MANIPUEIRA A manipueira foi coletada na fábrica, homogeneizada e mantida a -18ºC. Para utilização, foi fervida e centrifugada (NITSCHKE E PASTORE (2004)19 , submetida a esterilização e utilizada como meio de cultivo para a bactéria Bacillus subtilis LB5a, pertencente a coleção de culturas do laboratório de Bioquímica de Alimentos/ FEA-UNICAMP. A composição do meio foi determinada conforme a legislação vigente pelo Instituto Agronômico de Campinas. 2.2- PREPARO DO INÓCULO E CONDIÇÕES DE CULTIVO

Cinética de fermentação foi previamente definida para o cultivo e produção do composto de interesse. A partir de uma cultura estoque, mantida em geladeira preparou-se uma placa com ágar nutriente incubando-se por 24 h a 30°C. Três alçadas desta cultura foram transferidas para um frasco erlenmeyer de 250 mL contendo 100 mL de caldo nutriente, incubando-se a 30ºC, 150 rpm por 8-12 h até a cultura atingir 108 ufc/mL. Após a incubação, a cultura foi inoculada em fermentador de bancada Bioflo II New Brunswick, capacidade de 3,6 L, contendo 1,5 L do meio estéril e incubando-se a 30°C, 150 rpm e 1vvm ar/min./L meio durante 36 h. 2.3- DETERMINAÇÃO DA TENSÃO SUPERFICIAL

A medida da tensão superficial foi realizada em tensiômetro Krüss Processor Tensiometer modelo K12 . As análises foram realizadas pelo método de placa, utilizando uma placa de platina-irídio com perímetro molhado de 40,0 mm, comprimento de 19,9 mm e espessura de 0,10 mm, denominada placa de Wilhelmy. Utilizou-se um volume de 10 mL da amostra, temperatura de 20-25°C, intervalos de medidas 15s, e desvio padrão referente a 5 medidas ≤ 0,20 mN/m. 2.4- DETERMINAÇÃO DA DILUIÇÃO MICELAR CRÍTICA (CMD)

Alíquotas de 0,1ml e 1ml dos meios de cultura centrifugados foram diluídos 10 vezes (CMD-1) e 100 vezes (CMD-2) em água destilada, sendo as tensões superficiais das respectivas diluições determinadas conforme descrito em 2.3. 2.5- CONCENTRAÇÃO DO BIOSURFACTANTE BRUTO

O biosurfactante produzido foi recolhido na forma de espuma por uma saída lateral no fermentador ( figura 1), esta espuma rapidamente liquefeita foi centrifugada a 10000 rpm/15 minutos a 5º C, o meio de cultivo livre de células foi adicionada de HCl 6N até pH 2,0 e mantida por aproximadamente 12 ha 4°C. O precipitado foi coletado após centrifugação a 10.000 rpm por 20 minutos e recuperado com água destilada (pH 2,0). O precipitado obtido foi redissolvido em água destilada ajustando-se o pH da solução para 7,0. Colocou-se a solução em estufa a 50 °C até secagem. O produto obtido foi extraído com clorofórmio/metanol (65:15 v/v) e filtrado em papel filtro comum. A mistura solvente filtrada foi colocada em cápsula de porcelana e levada à estufa 50°C até secagem por 24 h e dessecador, até peso constante. O peso foi determinado por diferença calculando-se posteriormente a concentração do biosurfactante bruto.

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Fig. 1 - Fermentador de bancada em funcionamento, a seta destaca a espuma coletada em Kitassato, indicativo de produção de tensoativos pelo Bacilo LB5a. 2.6- CARACTERIZAÇÃO QUANTO ÀS PROPRIEDADES E COMPOSIÇÃO QUÍMICA: 2.6.1- ESTUDOS DE ESTABILIDADE

Após cultivo por 36 horas a espuma coletada liquida e livre de células foi submetido a testes de estabilidade. 2.6.2- ESTABILIDADE DE PH

O pH do meio foi ajustado para valores entre 2 a 14 com NaOH ou HCl 1N. Após 1 hora a tensão superficial e CMD foram determinadas. 2.6.3- ESTABILIDADE DE TEMPERATURA

O meio fermentado foi aquecido a 100 °C durante 15, 30, 60, 90 e 120 min., a 135 ºC durante 15, 30 e 60 min., a 121°C/1atm por 30 min. e sob congelamento a -15°C por 1 ano. Cada ensaio sofreu tratamento térmico, e após atingir temperatura ambiente a tensão superficial e CMD foram observadas. 2.6.4- ESTABILIDADE FRENTE À FORÇA IÔNICA

O meio foi adicionado de NaCl em concentrações variáveis, entre 0 a 25% , e teve a tensão superficial e a CMD avaliadas. 2.7- DETERMINAÇÃO DA TENSÃO INTERFACIAL

A medida da tensão interfacial foi realizada em tensiômetro, como descrito em 2.3. Foi utilizado o meio de cultura isento de células contra hexadecano como meio imiscível. Inicialmente, o aparelho foi zerado com hexadecano, que constitui a fase leve da mistura; em seguida 10 ml do meio de cultura contendo o biosurfactante foi adicionado no aparelho, a placa foi ajustada e 10 mL de hexadecano foi adicionado cuidadosamente procedendo à medida nas mesmas condições estabelecidas para tensão superficial. 2.8- ATIVIDADE EMULSIFICANTE (E24):

A atividade emulsificante foi avaliada conforme COOPER & GOLDENBERG (1987)20. Em tubos de ensaio com tampa de rosca foram distribuídos 4 mL de solução aquosa (1mg/mL) do biosurfactante, adicionando-se 6 mL de diferentes hidrocarbonetos ou óleo a serem testados. Cada tubo foi submetido à vortex máximo por 2 min. deixando-se em repouso por 24 h. O índice E24 foi determinado medindo-se a altura da camada emulsionada (cm) dividido pela altura total de líquido x 100.

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2.9- ATIVIDADE ANTIMICROBIANA: A atividade antibiótica do biosurfactante foi testada contra bactérias pelo

método de difusão em ágar (BARRY & THORNSBERRY, 1991)21. Uma solução estoque de biosurfactante (20mg/mL) foi preparada utilizando clorofórmio/metanol (65:15 v/v) como diluente; 5µL da solução foi aplicada em discos de papel filtro (Whatman 3, diâmetro 0,5 cm). Os discos foram colocados na superfície da placa com ágar nutriente previamente inoculado com os microrganismos a serem testados. A inibição do crescimento foi medida através do diâmetro dos halos formados ao redor dos discos. Em todos os ensaios, um disco controle com apenas solvente foi utilizado. 3- RESULTADOS 3.1- MEIO DE CULTURA

O substrato manipueira utilizado, foi caracterizado quanto à composição química cujos resultados são apresentados na tabela 1. Tabela 1 - Caracterização química da manipueira Parâmetro Quantidade pH 5,3 DQO 60,0 g/L Açúcares totais 42,13 g/L Matéria orgânica 50,5 g/L Nitrogênio 0,61 g/L Fósforo 161,3 mg/L Potássio 2,9 g/L Cádmio 0,06 mg/L Chumbo 0,01 mg/L Cobre 0,67 mg/L Cromo 0,01 mg/L Níquel 0,78 mg/L Zinco 1,1 mg/L Boro 0,32 mg/L Enxofre 69,0 mg/L Magnésio 366,8 mg/L Cálcio 122,8 mg/L Alumínio 8,2 mg/L NH4+ 36,2 mg/L NO3- 5,2 mg/L

Estes resultados, assim como o elevado índice de carboidratos, nitrogênio e sais minerais evidenciam a manipueira como excelente meio de cultivo sem requerer qualquer suplementação. 3.2- PRODUÇÃO DO BIOSURFACTANTE A Figura 2A apresenta os resultados dos estudos de cinética de produção do biosurfactante, crescimento do microrganismo e evolução do pH no substrato manipueira. A maior produção do biosurfactante 2,1g/L se deu em 36 h de fermentação permanecendo constante até 84 h; o pH do meio aumentou sensivelmente e se manteve constante entre 24 e 72 h de cultivo, já o crescimento do microrganismo atingiu o máximo em 24 h e se manteve constante até 36 h

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culminando com a produção máxima; a partir de 48 h o número de células viáveis decai até o final da fermentação caracterizando o período de morte celular.

O meio de cultivo estéril, (tempo 0) apresentou tensão superficial de 47,74 mN/m, este parâmetro foi reduzido gradativamente com a produção de tensoativos pela cultura, atingindo um valor mínimo de 25,96 mN/m em 24 h de fermentação. Os valores de CMD-1 e CMD-2 foram acompanhados a partir de 24 h de cultivo, pois nos tempos anteriores estes valores estão muito próximos daquele apresentado pelo meio em tempo zero. A tensão superficial e diluições micelares (CMD-1 e CMD-2), mostrados na figura 2 B, ilustram tanto a tensão superficial quanto CMD-1 em valores inferiores a 26 mN/m a partir de 24 h de cultivo, permanecendo sem maiores variações até 84h. O valor de tensão interfacial do meio livre de células contra hexadecano neste tempo foi de 0,93 mN/m.

A B

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

0 12 24 36 48 60 72 84Tempo (h)

pH; L

og. (

UFC

/mL)

0,000,501,001,502,002,503,00

Bio

surfa

ctan

te (g

/L)

log. ufc/mL pH Conc.(g/L)

0,010,020,030,040,050,060,070,0

0 12 24 36 48 60 72 84

Tempo (h)

Tens

ão s

uper

ficia

l; C

MD

-1;

CM

D-2

(mN

/m)

Tensão superficial CMD-1 CMD-2

Fig.2. Cinética de produção de surfactante por B. subtilis LB5a em manipueira. A) pH, crescimento celular e concentração de biosurfactante ; B) atividade tensoativa

3.3- CARACTERIZAÇÃO DO BIOSURFACTANTE O surfactante produzido demonstrou estabilidade frente a tratamento a térmico, variação da força iônica e pH (figuras 3, 4, e 5 respectivamente). Os valores de tensão superficial, CMD-1 e CMD-2 do meio fermentado submetido a 100 e 135 ºC em diferentes tempos não sofreu alterações significativas, assim como no tratamento em autoclave (121 ºC 1 atm/30 min.) cuja tensão superficial foi de 26,77; CMD-1 =26,98 e CMD-2 = 31,18 mN/m ; o meio congelado a -18ºC durante 1 ano obteve variação similar para os mesmos parâmetros.

2022242628303234

15 30 45 60

Tempo (min.)

TS, C

MD-

1, C

MD-

2 (m

N/m

)

Tensão CMD-1 CMD-2

05

1015202530354045

0 1 10 15 20 25 30

% NaCl

Tens

ão, C

MD

-1, C

MD

-2 (m

N/m

)

Tensão CM D-1 CM D-2

Fig.3. Efeito da temperatura (135ºC) em diferentes tempos sobre o surfactante

Fig.4. Efeito da adição de NaCl em diferentes% sobre o surfactante

No efeito da força iônica determinado pela adição de NaCl (figura 4), não se observa variações nas atividades tensoativas para quantidades de até 20% de sal no meio fermentado.

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A atividade superficial foi mantida a pHs entre 5,0 e 12 (Fig.5) com variações muito sutís na CMD-2. Para valores de pH ≤ 4,0 a tensão superficial aumenta devido a precipitação do surfactante.

010203040506070

2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0

pH

Tens

ão, C

MD

-1, C

MD

-2

(mN

/m)

Tensão CMD-1 CMD-2 Fig.5. Efeito da alteração do pH sobre o surfactante

3.4- APLICAÇÃO DO BIOSURFACTANTE A Tabela 2 mostra os resultados da atividade de emulsificação do biosurfactante obtido pelo resíduo manipueira. O surfactante foi capaz de formar emulsões estáveis com todos os compostos testados. Tabela 2 - Atividade emulsificante do biosurfactante de LB5a obtido em manipueira Hidrocarbonetos ou óleo testados E24 (%) Emulsões (esquerda p/ direita

em ordem de citação) Querosene 46,30 Tetradecano 69,81 Decano 62,96 Hexano 61,54 Tolueno 48,15 Óleo de soja 68,63

Além da atividade emulsificante, avaliou-se o potencial antimicrobiano do surfactante, cujos resultados estão demonstrados na Tabela 3. Todas as bactérias testadas, exceto o próprio B. subtilis e Candida glabrata, demonstraram susceptibilidade ao produto. Pseudomonas aeruginosa foi a bactéria gram-negativa mais sensível, enquanto que E. coli, S. choterasius, S. aureus e S. marcescens foram inibidas em menor grau. O biosurfactante também afetou o crescimento de bactérias gram-positivas principalmente M. luteus e B. cereus. Tabela 3- Atividade antimicrobiana do biosurfactante de B. subtilis LB5a

Microorganimos Efeito de inibição 100µg* Bacillus subtilis - Bacillus cereus ++ Escherichia coli + Micrococcus luteus ++ Pseudomonas aeruginosa +++ Serratia marcescens + Staphylococcus aureus + Salmonella choterasius + Candida glabrata - *diâmetro dos halos:< 5 mm (-), 5-10 mm (+), 10-15 mm (++) >18 mm (+++).

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4- DISCUSSÕES Segundo SHEPPARD & MULLIGAN (1987)22 a composição do meio de cultura

tem uma importância crítica na determinação do rendimento e das propriedades dos biosurfactantes produzidos. As altas concentrações de carboidratos, nitrogênio e sais minerais essenciais ao cultivo de microrganismos encontram-se no efluente, demonstrando sua potencialidade como meio de cultura alternativo para produção destes compostos. Os sais minerais principalmente ferro e manganês, são considerados fatores importantes na produção de surfactantes por Bacillus (COOPER et al. 1981)23, tais componentes também se encontram na manipueira.

KIM et al. (1997)24 observaram uma relação direta entre crescimento celular e produção de surfactante quando B. subtilis C9 foi cultivado em meio sintético. Os estudos cinéticos da cepa aqui utilizada confirmam este comportamento. THOMPSON et al. (2000)25 relataram a expressão de uma α-amilase por B. subtilis 21332, que permitiu a utilização de um resíduo rico em amido de batata para a produção de biosurfactante. O bacilo LB5a similarmente utilizou substrato rico em amido para a produção do mesmo metabólito. De acordo com SANDRIN et al. (1990)26, glicose, frutose e sacarose são as melhores fontes de carbono para a síntese de surfactina; e estes açúcares também estão presentes na manipueira.

DAVIS et al. (1999)27 relataram a manutenção da concentração de surfactina no cultivo de B. subtilis 21332 em meio sintético, mesmo com a exaustão de nutrientes. No entanto, NITSCHKE & PASTORE, (2004) utilizando a mesma cepa, cultivada em manipueira, relataram uma diminuição nas concentrações deste composto a partir de 48 h, sugerindo a degradação do produto. A inibição da produção de surfactantes é descrita por alguns autores atribuindo o aumento destes a um efeito tóxico às células (SEN, 199728; COOPER et al.,1981. ) Em nosso estudo, a tensão superficial mínima, atingida após 24 h de fermentação, permanece constante até 84 horas, evidenciando a tolerância da cepa utilizada a toxicidade do biosurfactante.

A surfactina de B. subtilis, um dos mais potentes biosurfactantes conhecidos, tem tensão superficial <30 mN/m e interfacial <1 (COOPER et al, 1981) ; resultado de acordo com o obtido. A CMD (diluição micelar crítica) fornece uma indicação indireta da concentração de surfactante (MAKKAR & CAMEOTRA, 1997)29. Quanto menor o valor de CMD, maior é a diluição necessária para causar uma mudança significativa na tensão superficial e, portanto, maior é a concentração de surfactante no meio Os valores de CMD apresentados sugerem uma efetiva produção de tensoativo a partir de 36 h. de produção, confirmando a máxima concentração de produto (2,1g/L) nesse período.

É conhecido o uso de meios de cultura alternativos com rendimento similares aos apresentados para a manipueira. THOMPSON et al. (2000), observaram uma concentração máxima de 3,6 g/L de produto em resíduo de batata com baixo teor de sólidos. Para meio suplementado com melaço os valores ficaram entre 0,4-1,0 g/L (MAKKAR & CAMEOTRA, 1997). O estudo da estabilidade do meio de cultivo evidencia a termoestabilidade, tolerância a pH > 4 e a altas concentrações de sais, um indicativo de que o produto pode ser usado em condições extremas, como a recuperação de óleos e biorremediação de solos e ambientes marinhos.

Uma menor atividade emulsificante frente a hidrocarbonetos de cadeia curta para o surfactante produzido por Rhodococcus ST-5, foi relatada por ABU-RUWAIDA et al. (1991)30. A capacidade emulsificante do surfactante de B. subtilis LB5a não apresentou esta preferência. A habilidade em formar emulsões com óleo

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de soja sugere potencial para aplicação como agente de limpeza e agente emulsificante na indústria de alimentos.

A atividade antimicrobiana observada frente ao biosurfactante em estudo está de acordo com a descrita por outros autores (YAKIMOV et al.,1995)31 entretanto, P. aeruginosa demonstrou maior sensibilidade ao produto. 4 - CONCLUSÃO

A manipueira demonstrou excelente potencial como meio de cultura alternativo para produção de biosurfactante, sendo que a bactéria utilizada, Bacillus subtilis LB5a, foi capaz de produzir um biosurfactante preliminarmente caracterizado como o lipopeptideo surfactina. O surfactante obtido demonstrou capacidade para biorremediação e emulsificação de hidrocarbonetos e óleos, assim como atividade antibacteriana. 5- AGRADECIMENTOS Os autores agradecem a Plaza S.A pela doação da manipueira e ao Conselho Nacional Pesquisas (CNPQ) pelo financiamento. 6- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1 SOCOL, C. R., Biotechnological products from cassava roots by solid state fermentation. J. Sci. Indust. Res.(55), p.358-364, 1996. 2 KATO, M. S. A., SOUZA, S. M. C.; Informe agropecuário 1987, (13) p.9-16 3 CEREDA, M. P. TAKITANE, L. C., CHUZEL, G.,VILPOUX, O., Starch: Potential in Brazil. In: DUFOUR, D., O'BRIEN, G. M., BEST, R. Eds. Cassava flour and starc. CIAT, Cali Columbia, 1996, p.19-24. 4 FAO/GIEWS, Cassava. Food Outlook,1999, (2) p.6. 5 DEL BIANCHI,V. Balanço de massa e de energia do processamento de farinha de mandioca em uma empresa de médio porte do estado de São Paulo. Botucatu, 1998, 118p. Tese doutorado - Faculdade de Ciências agronômicas, Unesp. 6 CEREDA, M. P. Resíduos da industrialização da mandioca no Brasil, São Paulo, Paulicéia, 1994, 174p. 7 EFING, L.M.A .C.; WOSIACKI, G. Estabelecimento de condições de cultivo de uma cepa de Trichosporun sp. isolada de manipueira. Boletim CEPPA, 1998; 16(1):23-26. 8 DAMASCENO, S. Cultivo de Geotrichum fragrans em manipueira. Botucatu, 1999. 114p. Tese doutorado em Agronomia, Faculdade de Ciências agronômicas- Unesp 9 BARANA, A.C. Avaliação de tratamento de manipueira em biodigestores fase acidogênica e metanogênica. Botucatu, 2000,95 p. Tese doutorado - Faculdade de Ciências agronômicas, Unesp. 10 SANTOS, C.F.C.; PASTORE, G.M.; DAMASCENO, S.; CEREDA, M.P. Produção de biosurfactante por linhagens de Bacillus subtilis utilizando manipueira como substrato. Boletim do SBCTA, 33 (2): 157-161, 1999. 11 NITSCHKE, M., Pastore, G.M. Cassava Flour wastewater as a substrate for biosurfactant production. Applied Biochemistry and Biotechnology. Estados Unidos: , v.106, p.295 - 302, 2003. 12 MULLIGAN, C.N.; GIBBS, B.F. Factors influencing the economics of biosurfactants. In: Biosurfactants: production, properties, applications. KOSARIC, N. ed., Marcel Decker Inc., New York, p. 392-371, 1993. 13 DESAI,J.D.; BANAT, I.M. Microbial production of surfactants and their commercial potential. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 61(1): 47-64, 1997

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