Resistência de genótipos de berinjela à murcha bacteriana

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Programa de Pós-Graduação em Fitossanidade

Tese

Caracterização da resistência de genótipos de berinjela à murcha bacteriana

Ivani Teixeira de Oliveira

Pelotas, 2011

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Ivani Teixeira de Oliveira

Caracterização da resistência de genótipos de berinjela à murcha bacteriana

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Fitossanidade, da Universidade Federal de Pelotas como requisito à obtenção do título de Doutor em Ciências (área do conhecimento: Fitopatologia).

Orientadora: Dra. Andréa Bittencourt Moura

Co-orientador: Dr. Carlos Alberto Lopes

Pelotas, 2011

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Dados de catalogação na fonte: ( Marlene Cravo Castillo – CRB-10/744)

O48c Oliveira, Ivani Teixeira de

Caracterização da resistência de genótipos de berinjela à murcha bacteriana / Ivani Teixeira de Oliveira ; orientador Andréa Bittencourt Moura; co-orientador Carlos Alberto Lopes - Pelotas,2012.-82f. : il..- Tese (Doutorado ) –Programa de Pós-Graduação em Fitossanidade. Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel . Universidade Federal de Pelotas. Pelotas, 2012.

1.Ralstonia solanacearum 2.Solanum melongena

3.Resistência 4.Interação patógeno-hospedeiro 5.Perda de produção I.Moura, Andréa Bittencourt(orientador) II. Título.

CDD 635.646

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Banca Examinadora:

Dra. Andréa Bittencourt Moura (Orientadora)

Dr. Valmir Duarte

Dr. Willian Silva Barros

Dr. Carlos Rogério Mauch

Dra. Danielle Ribeiro de Barros

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A meus filhos, Gabriel, Miguel e Ana Rosa,

DEDICO

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Agradecimentos

A Deus por ter me dado saúde e força para esta longa jornada;

A minha mãe Dalva Teixeira de Oliveira, pelo exemplo e incentivo que sempre me

acompanham;

A Professora Dra. Andréa Bittencourt Moura, pela orientação, disposição, apoio,

amizade, confiança e oportunidade de conclusão deste trabalho na UFPel;

Ao Dr. Carlos Alberto Lopes, pela orientação, disposição, apoio e todos os

ensinamentos e exemplos transmitidos durante o trabalho na Embrapa Hortaliças;

Ao Dr. Leonardo de Brito Giordano pela orientação, apoio e convívio;

Aos amigos Valácia Lemes, Murillo Lobo, Luciana Pozzer, Gilmar Henz e Adriana

Nascimento pelo convívio na Embrapa e UnB;

Aos amigos Ismail, Tânia, Jaqueline, Bianca, Dediel, Carine e Monalize pelo apoio e

carinho em minha estada em Pelotas;

Aos funcionários da Embrapa Hortaliças e UnB pelo apoio e carinho;

Aos funcionários Mariane, Rosária e Sérgio, do Laboratório de Patologia de

Sementes, pela amizade e auxílio durante meu trabalho em Pelotas;

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Aos professores da UnB e da UFPel, pelo convívio e ensinamentos;

A Embrapa Hortaliças, pelo suporte estrutural e pessoal para realização do trabalho

experimental;

Ao CNPq e à Capes pelo apoio financeiro em Brasília e Pelotas;

A todos que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho;

Agradeço.

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Resumo

OLIVEIRA, Ivani Teixeira de. Caracterização da resistência de genótipos de berinjela à murcha bacteriana. 2011. 82f. Tese (Doutorado). Programa de Pós-Graduação em Fitossanidade. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas. A murcha bacteriana, causada por Ralstonia solanacearum, é uma das doenças mais importantes para a cultura da berinjela e não existem variedades resistentes a esta doença disponíveis para comercialização no Brasil. Neste trabalho foram avaliadas fontes de resistência à murcha bacteriana, dentre genótipos previamente existentes no banco de germoplasma da Embrapa Hortaliças e genótipos depositados, oriundos do AVRDC (Asian Vegetable Research and Development Center – Taiwan), utilizando-se as estirpes CHPH19 e CNPH152 de R. solanacearum, raça 1, ambas pertencentes à biovar I, selecionados em ensaio de virulência com estirpes de diversas procedências e de três diferentes biovares (I, II e III), todos pertencentes à raça 1. As avaliações da doença foram por notas aos 10 e 21 dias após a inoculação (DAI) e alteração de massa seca da parte aérea em relação à testemunha não inoculada (AMS). Com a utilização de análise multivariada, com agrupamento por dissimilaridade, baseada nas notas aos 10 e 21 DAI e alteração de AMS, as respostas dos genótipos à estirpe CNPH19 permitiram a separação em cinco grupos de diferentes níveis de resistência, e dois grupos para o isolado CNPH152. Em ensaio para estudo de interação isolado-genótipo, foram inoculados seis isolados em oito genótipos, cujos resultados obtidos confirmaram a existência de interação patógeno-hospedeiro e evidenciaram virulência elevada da estirpe CNPH19 e alto nível de resistência dos genótipos CNPH778 e CNPH785. Estes genótipos e outros quatro (CNPH006, CNPH171, CNPH658 e CNPH783) foram cultivados em solo naturalmente infestado por Ralstonia solanacearum, raça 1, biovar III, para quantificação de perdas causadas pela infecção bacteriana e observação dos sintomas apresentados. Com exceção do genótipo CNPH778, todos apresentaram ao menos uma planta com murcha típica da doença. Além de murcha, foram observados os sintomas de seca e morte de plantas, nos genótipos CNPH006 e CNPH658, amarelecimento de folhas, no genótipo CNPH785; e menor crescimento de plantas, em todos os genótipos. A ocorrência de fluxo bacteriano foi constatada em todas as plantas cultivadas nos canteiros infestados, inclusive as que não apresentaram sintomas. Foi calculada a perda percentual de produção de cada genótipo conduzido em solo infestado em relação à produção da área sem ocorrência de murcha. Os genótipos foram agrupados (Scott-Knott

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P≤0,05) quanto à sua capacidade de manter a produção de frutos em uma área com solo naturalmente infestado por R. solanacearum. O genótipo CNPH785 foi considerado o mais resistente por não ter apresentado perda na produção em relação à média obtida em área livre do patógeno, seguido dos genótipos CNPH783, CNPH778 e CNPH171, com perdas médias em relação à média obtida na área livre do patógeno de 19,3, 11,4 e 10,1%, respectivamente. Os genótipos CNPH658 e CNPH006 foram os mais suscetíveis, com perda quase total. Para complementar a caracterização de resistência dos genótipos CNPH785 e CNPH785, foram avaliadas curvas de titulação de resistência, utilizando-se suspensões bacterianas das estirpes CNPH19 e CNPH182, com concentrações de 104 a 109, e também a capacidade de colonização pelas estirpes CNPH19 e CNPH182 (isolada do solo do ensaio de campo) de R. solanacearum aos tecidos destes genótipos, em um período de zero a 48h. O genótipo CNPH778 foi o mais resistente à estirpe CNPH182, mas não manteve sua posição como genótipo resistente à estirpe CNPH19, previamente observada, pela titulação de resistência. O genótipo CNPH785 apresentou menor resistência quando comparado ao genótipo CNPH778, destacando-se apenas em relação à estirpe CNPH19. Os genótipos CNPH778 e CNPH785 apresentaram o mesmo desempenho quanto à colonização de tecidos do caule, alcançando valores de log(ufc/g) de 7,83 e 7,95, respectivamente, segundo análise de regressão, e valores de 8,63 e 8,36 para os genótipos CNPH171 e CNPH658, respectivamente, para o período estudado.

Palavras-chave: Ralstonia solanacearum, Solanum melongena, resistência, interação patógeno-hospedeiro, perda de produção

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Abstract

OLIVEIRA, Ivani Teixeira de. Characterization of resistance of eggplant genotypes to bacterial wilt. 2011. 82p. Tese (Doutorado) - Programa de Pós-graduação em Fitossanidade. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas The bacterial wilt caused by Ralstonia solanacearum is one of the most important diseases for the eggplant and no commercial resistant varieties to this disease are available in Brazil. In this work, brinjal genotypes resistance reactions to inoculating CHPH19 and CNPH152 strains of R. solanacearum, biovar I, race 1, were evaluated. The evaluated accessions belong to Embrapa Hortaliças germplasm collection, including recently accessions arrived from AVRDC (Asian Vegetable Research and Development Center - Taiwan). The strains used in this assay were selected by virulence and collected from different Brazil locations and biovars I, II and III, race 1. The wilt severity was recorded following a grade scale at 10 and 21 days after inoculation (DAI) and alteration shoot dry mass of inoculated plants compared with noninoculated (AMS). Using multivariate analysis, based on the bacterial wilt index at 10 and 21 DAI and AMS, the genotypes inoculated with CNPH19 strain were discriminated in five groups of different levels of resistance, and in two groups when inoculated with CNPH152 strain. To investigate strain-genotype interaction, six strains were inoculated into eight genotypes, whose results confirmed the existence of strain-genotype interaction and showed high virulence of CNPH19 strain and high resistance of the genotypes CNPH778 and CNPH785. These and four other genotypes (CNPH006, CNPH171, and CNPH658 CNPH783) were grown in soil naturally infested with R. solanacearum, race 1, biovar III to quantify the losses caused by bacterial colonization and observing symptoms in this condition. With the exception of genotype CNPH778, all had at least one plant with typical wilt disease. In addition to wilting, were observed symptoms of leaves fall and death of plants to CNPH006 and CNPH658, leaf yellowing, to CNPH785, and low development of plants in all genotypes. The occurrence of bacterial flow was found in all plants grown in infested plots including those that showed no symptoms. The percentage of yield loss in the plant cultivated on infested soil in relation to the production on free bacterial soil was calculated. The genotypes were grouped by Scott-Knott test, p≤0.05, for its ability to maintain fruit yield in naturally infested soil by R. solanacearum. CNPH785 genotype was considered the best one for not having shown loss in fruit yield compared to the average obtained in the free pathogen soil, followed by CNPH783, CNPH778 and CNPH171 with average losses of 19.3, 11.4 and 10.1%,

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respectively. CNPH658 and CNPH006 accessions were the most susceptible, with almost total loss. To complement CNPH785 and CNPH785 resistance characterization, these accessions were evaluated for resistance titration, using CNPH19 and CNPH182 strains at 104 to 109 cfu/mL, and also the ability of CNPH19 and CNPH182 tissue colonization by R. solanacearum after zero to 48h after inoculation. CNPH778 was the most resistant accession to CNPH182 strain, but not maintained the same behavior show resistance to CNPH19 strain by resistance titration, at despite of to had shown resistance to CNPH19 strain previously. CNPH785 showed resistance to CNPH19 strain, only, in despite of to had shown resistance to CNPH182 strain previously. CNPH778 and CNPH785 accessions showed the same performance as the colonization of stem tissue, according to regression analysis, reaching values of log (cfu/g) of 7.83 and 7.95, respectively, and values of 8.63 and 8,36 for genotypes CNPH171 and CNPH658, respectively, for the assayed period.

Key words: Ralstonia solanacearum, Solanum melongena, resistance, pathogen-host interaction, loss yield

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Lista de Figuras

Figura 1 Dendrogramas de dissimilaridade das distâncias de Malahanobis das reações de genótipos de berinjela inoculados com as estirpes CNPH19 (A) e CNPH152 (B) de Ralstonia solanacearum, expressas pelo índice de murcha bacteriana aos 10 e 21 dias após a inoculação e alteração de massa seca na parte aérea em relação à testemunha não inoculada aos 21dias após a inoculação.................. 33

Figura 2 Dendrograma de dissimilaridade das distâncias de Mahalanobis das

reações de oito genótipos de berinjela causadas pela inoculação de seis estirpes de Ralstonia solanacearum (CNPH13, CNPH19, CNPH47, CNPH56, CNPH71 e CNPH152) e expressas pelo índice de murcha bacteriana aos 10 e 21 dias após a inoculação e alteração de massa seca na parte aérea em relação à testemunha não inoculada aos 21 dias após a inoculação............................................................. 38

Figura 3 Dendrograma de dissimilaridade das distâncias de Mahalanobis da

severidade de murcha bacteriana causada por seis estirpes de Ralstonia solanacearum em oito genótipos de berinjela (CNPH006, CNPH171, CNPH407, CNPH658, CNPH778, CNPH782, CNPH783 e CNPH785), expressa pelo índice de murcha bacteriana aos 10 e 21 dias após a inoculação e alteração de massa seca na parte aérea em relação à testemunha não inoculada................................... 38

Figura 4 Manutenção na produção (peso) de frutos por genótipos de

berinjela em plantas cultivadas em solo naturalmente infestado por Ralstonia solanacearum, raça 1, biovar 3, em relação à média de produção em uma área livre do patógeno. Os valores das colunas com mesmas letras formam grupos que não se diferenciam entre si, segundo o teste de agrupamento de Scott-Knott (P≤ 0,05)................. 48

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Figura 5 Reações dos genótipos CNPH171, CNPH658, CNPH778 e

CNPH785 de berinjela à inoculação no caule e nas raízes com as estirpes CNPH19 e CNPH182 de Ralstonia solanacearum, expressas na forma de área abaixo da curva de progresso da doença (AACPD), alteração percentual de massa seca da parte aérea em relação à testemunha não inoculada (AMS) e número de plantas mortas (NPM) aos 30 (inoculação no caule) e 50 (inoculação nas raízes) dias após a inoculação com concentrações crescentes de suspensões bacterianas...................................................................... 60

Figura 6 Colonização de tecidos de quatro genótipos de berinjela, inoculados

com os isolados R19, biovar I, e R182, biovar III, ambos da raça 1 de Ralstonia solanacearum ao longo do tempo........................................ 66

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Lista de Tabelas

Tabela 1 Hospedeiro, instituição doadora, estado brasileiro de coleta e biovar das estirpes de Ralstonia solanacearum, raça 1, avaliados quanto à virulência em Solanum melongena.......................................... 25

Tabela 2 Denominações, países de origem e reações previamente

conhecidas de resistência à murcha bacteriana de genótipos de Solanum melongena............................................................................... 27

Tabela 3 Virulência de estirpes de Ralstonia solanacearum (raça 1) em plantas

de berinjela dos genótipos CNPH110 (suscetível) e CNPH171 (resistente), expressa em índice de murcha bacteriana aos 10 e 21 dias após a inoculação (IMB10 e IMB21, respectivamente) e alteração de massa seca na parte aérea em relação à testemunha não inoculada (AMS) aos 21 DA....................................................... 30

Tabela 4 Severidade de murcha bacteriana em plantas de 21 genótipos de

berinjela, expressa pelo índice de murcha bacteriana aos 10 e 21 dias após a inoculação (IMB10 e IMB21, respectivamente) com as estirpes CNPH19 e CNPH152 de Ralstonia solanacearum (raça 1, biovar I) e alteração de massa seca na parte aérea em relação à testemunha não inoculada (AMS) aos 21 dias após a inoculação... 32

Tabela 5 Grupos de classificação de genótipos de berinjela obtidos por

análise de agrupamento multivariada para as estirpes CNPH19 e CNPH152 e suas respectivas faixas de índice de murcha bacteriana aos 10 e 21 dias após a inoculação (IMB10 e IMB21) e alteração de massa seca na parte aérea em relação à testemunha não inoculada (AMS)......................................................................... 34

Tabela 6 Virulência de seis estirpes de Ralstonia solanacearum, raça 1, em oito

genótipos de berinjela, expressa em logaritmo do índice de murcha bacteriana aos 10 e 21 dias após a inoculação (IMB10 e 21), e alteração de massa seca na parte aérea em relação à testemunha não inoculada (AMS) aos 21 dias após a inoculação........................ 37

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Tabela 7 Genótipos de Solanum melongena avaliados em campo: procedência e reações a três estirpes de Ralstonia solanacearum, raça 1................. 45

Tabela 8 Incidência de sintoma de murcha (S) e morte (M) de plantas de

seis genótipos de berinjela, em percentagem, aos 10, 50, 90 e 130 dias após o transplantio em área infestada naturalmente com Ralstonia solanacearum, raça 1, biovar 3................................................ 47

Tabela 9 Produção (kg de frutos/planta sobrevivente) de seis genótipos de

berinjela em área livre e em área infestada por Ralstonia solanacearum, raça 1, biovar 3............................................................. 47

Tabela 10 Genótipos de Solanum melongena avaliados em casa de vegetação e

a campo: procedência e reações a duas estirpes de Ralstonia solanacearum, raça 1............................................................................ 54

Tabela 11 Resistência dos genótipos CNPH171, CNPH658, CNPH778 e

CNPH785 de berinjela à murcha-bacteriana, expressa por coeficientes de curvas de resposta de área abaixo da curva de progresso da doença (AACPD), após inoculação por ferimento no caule ou nas raízes da estirpe CNPH19, biovar I ou CNPH182, biovar III, ambas pertencentes à raça 1 de Ralstonia solanacearum...... 61


CNPH785 de berinjela à murcha-bacteriana, expressa por coeficientes de curvas de resposta1 de alteração percentual de massa seca da parte aérea em relação à testemunha não inoculada (AMS), após inoculação por ferimento no caule ou nas raízes da estirpe CNPH19, biovar I ou CNPH182, biovar III, ambas pertencentes à raça 1 de Ralstonia solanacearum.................................. 62


CNPH785 de berinjela à murcha-bacteriana, expressa por coeficientes de curvas de resposta1 de contagem de plantas mortas (NPM), após inoculação por ferimento no caule ou nas raízes da estirpe CNPH19, biovar I ou CNPH182, biovar III, ambas pertencentes à raça 1 de Ralstonia solanacearum, aos 30 (caule) ou 50 dias (raízes) da inoculação........................................................... 63

Tabela 14 Colonização de tecidos de plantas de berinjela de quatro

genótipos, expressa em logaritmo do número de unidades formadoras de colônia por grama de tecido – log(ufc/g), nos dois centímetros acima do ponto de inoculação no caule, em plantas inoculadas com os isolados R19, biovar I, e R182, biovar III, ambos da raça 1 de Ralstonia solanacearum.......................................... 65

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Sumário

RESUMO ..................................................................................................................... 8 ABSTRACT ............................................................................................................... 10 LISTA DE FIGURAS ................................................................................................. 12 LISTA DE TABELAS ................................................................................................ 14 1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 18 2 CAPÍTULO I - RESISTÊNCIA EM GENÓTIPOS DE BERINJELA À MURCHA BACTERIANA ........................................................................................................... 20

2.1 RESUMO .......................................................................................................... 20 2.2 INTRODUÇÃO ................................................................................................. 21 2.3 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................ 23

2.3.1 Seleção de estirpes .................................................................................... 23 2.3.2 Avaliação de genótipos .............................................................................. 26 2.3.3 Interação genótipos e estirpes ................................................................... 28 2.3.4 Procedimentos estatísticos ........................................................................ 28

2.4 RESULTADOS ................................................................................................. 29 2.4.1 Seleção de estirpes .................................................................................... 29 2.4.2 Avaliação de genótipos .............................................................................. 31 2.4.3 Estudo da interação entre genótipos e estirpes ......................................... 35

2.5 DISCUSSÃO .................................................................................................... 39 2.6 CONCLUSÕES ................................................................................................ 41

3 CAPÍTULO II - PRODUÇÃO DE FRUTOS E SINTOMAS EM GENÓTIPOS DE BERINJELA CULTIVADOS EM SOLO INFESTADO POR Ralstonia solanacearum .. 42


3.3.1 Área dos ensaios e genótipos avaliados .................................................... 44 3.3.2 Registro de plantas sintomáticas, fluxo bacteriano e produção de frutos .. 45 3.3.3 Procedimento estatístico ............................................................................ 45

3.4 RESULTADOS ................................................................................................. 46 3.4.1 Descrição sintomatológica e diagnose ....................................................... 46 3.4.2 Produção de frutos ..................................................................................... 47


4 CAPÍTULO III - TITULAÇÃO DE RESISTÊNCIA E COLONIZAÇÃO DE TECIDOS POR DUAS ESTIRPES DE Ralstonia solanacearum EM GENÓTIPOS DE BERINJELA COM DIFERENTES NÍVEIS DE RESISTÊNCIA ................................. 51

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4.3.1 Titulação de resistência .............................................................................. 54 4.3.1.1 Genótipos de berinjela e estirpes do patógeno .................................... 54 4.3.1.3 Avaliação .............................................................................................. 55 4.3.1.4 Procedimentos estatísticos .................................................................. 56

4.3.2 Estudo da colonização de tecidos .............................................................. 57 4.3.2.1 Genótipos de berinjela e estirpes do patógeno .................................... 57 4.3.2.2 Inoculação ............................................................................................ 57 4.3.2.3 Avaliação .............................................................................................. 57 4.3.2.4 Procedimentos estatísticos .................................................................. 58

4.4 RESULTADOS ................................................................................................. 58 4.4.1 Titulação de resistência .............................................................................. 58 4.4.2 Colonização de tecidos .............................................................................. 64


5 CONCLUSÕES ...................................................................................................... 70 6 REFERÊNCIAS ...................................................................................................... 71 APÊNDICES ............................................................................................................. 78

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1 Introdução

A berinjela (Solanum melongena L.) é uma planta solanácea nativa de regiões

tropicais do Oriente, cultivada há séculos por chineses, indianos e árabes. Foi

introduzida no Brasil no século XVI durante a colonização portuguesa (RIBEIRO;

BRUNE; REIFSCHNEIDER, 1998). É uma planta autógama (FILGUEIRA, 2000) com

taxa de polinização cruzada natural de 0,7 a 30%, ocasionada pela ação de insetos

(KALLOO, 1993)

A cultura tem período de 57 a 90 dias entre o transplantio e o início da

frutificação e requer temperaturas elevadas para o crescimento da planta e

desenvolvimento dos frutos, com ótimo de 27ºC e limite inferior de 16ºC

(GRANBERRY, 1990). S. melongena é uma planta arbustiva de caule semilenhoso e

ereto, que alcança 0,5 a 1,8 m de altura apresenta frutos do tipo baga, geralmente

brilhantes que apresentam ampla variação de tamanho, formato e cor (RIBEIRO,

2007). Entre as variedades da espécie se apresentam frutos de tamanho pequeno a

grande, com variações de 6 a 30 cm de comprimento e 3 a 10 cm de diâmetro

(GRANBERRY, 1990), coloração branca, rosada, zebrina, amarela, púrpura ou preta

e formato oval, oblongo, redondo, oblongo-alongado ou alongado (RIBEIRO, 2007).

Sua produtividade, no Brasil, alcança 30 a 65 t/ha no campo e 60 a 95 t/ha em

cultivo protegido (MOREIRA et al., 2006). A preferência do mercado brasileiro é pelo

fruto roxo escuro com formato alongado a oblongo (RIBEIRO; BRUNE;

REIFSCHNEIDER, 1998). No Brasil, é cultivada em maior escala nos estados de

São Paulo, Minas Gerais e na região Sul (RIBEIRO, 2007).

O volume de comercialização de frutos de berinjela vem aumentando

continuamente nas últimas décadas, em virtude da divulgação de seu valor como

alimento funcional, que entre diversos benefícios alegados, atuaria na redução do

colesterol (DERIVI et al., 2002). A área plantada da cultura em São Paulo, maior

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produtor e consumidor de berinjela, subiu de 559 ha, em 1984, para 1.946 ha, em

2008, elevando a comercialização no estado de 15.534 t para 51.185 t (IEA/CATI -

SAAESP, 2010).

Entre as doenças de importância econômica para a berinjela, a murcha

bacteriana, causada por Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., é um dos

fatores limitantes para a produção em regiões tropicais e subtropicais no mundo (LI;

GOTH; BARKSDALE, 1988) e no Brasil (COELHO NETTO et a., 2004).

A bactéria R. solanacearum apresenta grande variabilidade na patogenicidade

e virulência, o que fez com que, ao longo de mais de um século, fossem propostos

diferentes sistemas de classificação desse patógeno, de maior ou menor

complexidade, aos níveis específico e sub-específico. Dois sistemas são

amplamente utilizados para diferenciação de isolados, por serem simples e práticos:

um sistema que separa cinco raças, baseado em diferenças na gama de espécies

hospedeiras (BUDDENHAGEN; SEQUEIRA; KELMAN, 1962; HE, SEQUEIRA;

KELMAN, 1983); e o outro que separa seis biovares, baseado na capacidade de

utilização ou oxidação de diferentes fontes de carbono (HAYWARD, 1964, 1991,

1994a, b).

Embora a identificação por raça e biovar seja muito utilizada, novas formas

de classificação foram apresentadas, em função da heterogeneidade e

complexidade encontrada nesta espécie bacteriana. Foi proposta em 2005, a divisão

da espécie em quatro filotipos e 23 sequevares. A separação em filotipo se

fundamenta em filogenia por análise de sequência genética de regiões determinadas

do genoma da espécie e tem correspondência com o provável local de origem. Cada

filotipo se divide em sequevares, cuja separação se baseia em agrupamentos de

isolados com semelhanças em sequências do gene de endoglucanase (FEGAN;

PRIOR, 2005).

No Brasil, a bactéria está amplamente distribuída em todo território nacional,

onde ocorrem as raças 1, 2 e 3 e as biovares I, II e III (COELHO NETTO et al., 2004;

MARIANO; MICHEREFF, 1994; REIFSCHNEIDER; TAKATSU, 1985; SILVEIRA et

al., 2005). A berinjela é atacada pela raça 1 e pelas três biovares que ocorrem no

Brasil (LOPES, 1992; MORGADO; LOPES; TAKATSU, 1992a; b).

O patógeno penetra na planta por meio de ferimentos do sistema radicular e

nos pontos de emergência de raízes secundárias, vindo a colonizar o xilema

(KELMAN, 1953). Existem variações nos sintomas que diferem da murcha típica. A

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diagnose da murcha bacteriana geralmente é feita cortando-se uma seção

longitudinal contendo tecido vascular infectado e colocando-o em um recipiente

transparente contendo água em repouso (“teste-do-copo”). Em poucos minutos,

finos fios esbranquiçados fluem das margens do tecido, sendo esta a resposta

positiva para a doença (LOPES; QUEZADO-SOARES, 1997; LOPES, 2009).

O controle da murcha bacteriana é muito difícil, principalmente quando as

condições ambientais são favoráveis à doença. No caso da cultura da berinjela, as

condições de crescimento da cultura coincidem com as condições ambientais

favoráveis à doença, o que aumenta sua gravidade para a cultura. O controle

também é dificultado pela grande capacidade de sobrevivência da bactéria no solo e

por seu amplo círculo de hospedeiras (BUDDENHAGEN; KELMAN, 1964). Várias

estratégias de controle têm sido estudadas nos diferentes hospedeiros e,

potencialmente, o controle mais eficiente seria a utilização de variedades resistentes

(BI-HAO et al., 2009).

Fontes de resistência em berinjela já são conhecidas há bastante tempo

(NOLLA, 1931), entretanto, a reação de resistência de diferentes genótipos podem

se alterar em função da extrema variabilidade do patógeno (GRIMAULT; PRIOR,

1994) e da interação do genótipo com um ambiente muito conducivo à murcha

bacteriana (SHARMA; KUMAR, 2007). Há relatos de que a genética da resistência

de berinjela à murcha bacteriana pode ser simples, com a ação de um gene

dominante (AKIBA et al., 1972; GOPINATH; MADALAGERI, 1986; YANG et al.,

2006), mas também há aqueles que a descrevem como de herança complexa,

envolvendo vários genes com dominância parcial ou recessiva (LI; GOTH;

BARKSDALE, 1988; TANIMOTO; NAKASONE, 2002), com interferência por fatores

citoplasmáticos (GOUSSET et al., 2004, citado por BI-HAO et al., 2009).

A forma de avaliação da murcha bacteriana para resistência de plantas à

doença mais utilizada é a escala de notas, adaptada de Nielsen e Haynes (1960),

utilizada em quase todos os estudos. Outras formas propostas de avaliação de

resistência são a titulação de resistência e índice de colonização. No caso da

titulação, observam-se o DE50 (dose média efetiva), em termos de concentração

bacteriana da suspensão inoculada, e a inclinação da curva de resposta

(ERCOLANI, 1984; KNOCHE; CLAYTON; FULTON, 1987). No caso do índice de

colonização, observam-se a quantidade de crescimento de R. solanacearum nos

tecidos e a tolerância das plantas a este crescimento (PRIOR et al., 1996).

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Com o propósito de obter mais informações sobre a resistência de berinjela

a estirpes de R. solanacearum de diversas localidades do Brasil e suas implicações no

processo de melhoramento, este trabalho visou: I) Avaliação de virulência e seleção

de estirpes de R. solanacearum para utilização na caracterização da resistência de

genótipos de S. melongena, em busca de fontes de resistência; II) Avaliação da

resistência dos materiais selecionados em campo naturalmente infestado com R.

solanacearum; III) Titulação de resistência à murcha bacteriana e avaliação da

colonização de tecidos de plantas de berinjela por R. solanacearum.

20

2 Capítulo I

Resistência em genótipos de berinjela à murcha bacteriana

2.1 Resumo A murcha bacteriana é uma das doenças mais importantes para a cultura da berinjela e não existem variedades resistentes a esta doença disponíveis para comercialização. Neste trabalho foram avaliadas as reações de 21 genótipos de berinjela a dois isolados de Ralstonia solanacearum. As avaliações da doença foram por notas aos 10 e 21 dias após a inoculação (DAI) e alteração de massa seca da parte aérea em relação à testemunha não inoculada (AMS) aos 21 DAI. Para seleção das estirpes utilizadas para a avaliação de resistência foi avaliada a virulência de 21 estirpes de diversas procedências e de três diferentes biovares (I, II e III), todos pertencentes à raça 1, inoculados em plantas dos genótipos CNPH110 (suscetível) e CNPH171 (resistente). A variação de virulência foi independente da biovar, do local de procedência ou do hospedeiro de origem. Dentre as estirpes testadas foram selecionadas CNPH19 e CNPH152 (raça 1, biovar I), para identificação e caracterização de resistência à murcha bacteriana em berinjela. Com a utilização de análise multivariada, com agrupamento por dissimilaridade, baseada nas notas aos 10 e 21 DAI e alteração de AMS, as respostas dos genótipos à estirpe CNPH19 permitiram a separação em cinco grupos: Grupo 1 (muito suscetíveis) - CNPH777, CIÇA, PROVS75, CNPH006, CNPH130, CNPH658 e CNPH171; Grupo 2 (suscetíveis) - CNPH780, CNPH783, CNPH786, CNPH784, CNPH781, CNPH782, CNPH407 e CNPH779; Grupo 3 (medianamente suscetível) - PROVTS3; Grupo 4 (medianamente resistentes) - CNPH788, CNPH778, CNPH787 e CNPH776; Grupo 5 (resistente) - CNPH785, e dois grupos para a estirpe CNPH152: Grupo 1 (suscetível) - CNPH658, CNPH777 e PROVS75; Grupo 2 (resistentes) - CNPH407, CNPH171, CNPH781, CNPH784, CNPH785, CNPH006, PROVTS3, CNPH779, CNPH788, CNPH783, CNPH782, CNPH778, CNPH780, CNPH786, CNPH776 e CNPH787. Em ensaio para estudo de interação estirpe-genótipo, foram inoculadas seis estirpes em oito genótipos, cujos resultados obtidos confirmaram a existência de interação estirpe-genótipo e evidenciaram virulência elevada da estirpe CNPH19 e a alto nível de resistência dos genótipos CNPH778 e CNPH785.

Palavras-chave: Ralstonia solanacearum, Solanum melongena, interação patógeno-hospedeiro

21

2.2 Introdução

A murcha bacteriana, causada por Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et

al., é uma das doenças mais importantes para berinjela (Solanum melongena L.) nas

regiões tropicais e subtropicais. É considerada a principal doença de origem

bacteriana no mundo (HAYWARD, 1991). No Brasil, esta bacteriose tem-se

apresentado como um sério problema principalmente nas regiões Nordeste e Norte

(REIFSCHNEIDER; TAKATSU, 1985; COSTA; FERREIRA; LOPES, 2007). Na

região Amazônica, se constitui uma limitação para o cultivo de solanáceas e a

produção local fica quase que restrita a pequenas hortas caseiras (COELHO NETTO

et al., 2004; LIMA et al., 2010).

O controle da murcha bacteriana é difícil devido ao grande círculo de

hospedeiros do patógeno, à sua diversidade genética e à prolongada sobrevivência

no solo (BUDDENHAGEN; KELMAN, 1964). Medidas de controle químico são

inviáveis economicamente, além de nocivas ao ambiente e ao homem (LOPES,

2009). O uso de microrganismos antagonistas e proteção cruzada são medidas que

podem contribuir para o controle da murcha bacteriana (TRIGALET; FREY;

TRIGALET-DEMERY, 1994; FREY et al., 1994). A escolha de terrenos bem

drenados e época de plantio, correção do solo, utilização de água não contaminada,

manejo da água de irrigação e rotação de culturas são medidas utilizadas para

reduzir a incidência de murcha bacteriana em solos infestados (HARTMAN;

ELPHINSTONE, 1994; MARIANO; SILVEIRA; MICHEREFF, 1998). No entanto, a

utilização de variedades com elevado nível de resistência, como parte das medidas

de manejo integrado seria a estratégia de controle mais promissora para a murcha

bacteriana.

Todo hospedeiro tem algum nível de resistência não específica que é efetiva

contra seus patógenos. Essa resistência é chamada de parcial, inespecífica,

quantitativa, poligênica, adulto planta-campo, resistência durável, mas ou horizontal.

Em geral, a resistência parcial não protege as plantas contra a infecção pelo

patógeno, mas atrasa a sua colonização, diminuindo a propagação da doença e o

desenvolvimento de epidemias. Todavia, variedades ou genótipos de uma espécie

hospedeira podem se apresentar muito resistentes a uma raça do patógeno, mas

suscetíveis a uma outra raça, em geral, dependendo das condições ambientais.

Essa resistência é chamada de forte, raça específica, qualitativa, diferencial ou

22

vertical. O hospedeiro pode parecer imune, responder com uma reação de

hipersensibilidade ou inibir a reprodução do patógeno. A resistência raça específica

pode inibir o desenvolvimento de epidemias, limitando o inóculo inicial ou limitando a

reprodução após a infecção (AGRIOS, 2005). A resistência vertical e horizontal

coexistem e podem ocorrer em qualquer proporção mista (VANDERPLANK, 1982).

Existem poucos relatos sobre a natureza e a genética da resistência de

berinjela à murcha bacteriana. Alguns trabalhos indicam que o controle da

resistência deve-se à ação de um único gene dominante (AKIBA et al., 1972;

GOPINATH; MADALAGERI, 1986); outros mencionam uma ação complexa

envolvendo vários genes com dominância parcial ou recessiva (LI et al., 1988). Tem

sido observada a ocorrência de segregação transgressiva em cruzamentos

envolvendo linhagens resistentes à murcha (GOTH; HAYNES; BARKSDALE, 1991),

indicando que esta característica seria controlada por um número maior de genes de

resistência, sendo necessária a utilização de métodos mais complexos de

melhoramento para a obtenção de variedades resistentes.

No Brasil, ainda não existem variedades resistentes de berinjela disponíveis

para uso comercial. Com a intenção de desenvolver variedades resistentes sob

condições brasileiras, foram iniciados trabalhos de pesquisa com berinjela visando à

resistência à murcha bacteriana na Embrapa Hortaliças. Para tanto, 15 genótipos de

vários países, anteriormente classificados como medianamente resistentes ou

resistentes (CHEN; LI; WANG, 1997), foram cedidos pelo Asian Vegetable Research

and Development Center (AVRDC - Taiwan) e integrados ao banco de germoplasma

da Embrapa Hortaliças. Assim, este trabalho teve como objetivo selecionar estirpes

de R. solanacearum adequadas para o estudo de resistência em berinjela, avaliar a

reação dos genótipos provenientes do AVRDC e do banco de germoplasma da

Embrapa Hortaliças quando inoculados com estirpes com diferentes níveis de

virulência, bem como verificar a existência ou não de interação entre genótipos e

estirpes.

23

2.3 Material e Métodos 2.3.1 Seleção de estirpes

Para avaliar resistência em genótipos de berinjela à murcha bacteriana, 21

estirpes da coleção da Embrapa Hortaliças (Tab. 1) foram previamente selecionadas

quanto à sua virulência. Para isso, dois ensaios foram conduzidos em casa de

vegetação, sob temperaturas médias diárias de 30,1 a 34,6°C. Foi utilizado

aquecimento noturno para garantir temperatura mínima de 20°C nos períodos

noturnos.

As estirpes utilizadas foram recuperadas da coleção da Embrapa Hortaliças,

onde estavam mantidas à temperatura ambiente em água de torneira esterilizada.

As bactérias foram repicadas em meio de tetrazólio e, após incubação por 72h à

28ºC, colônias fluidas e com características típicas de virulência (KELMAN, 1954)

foram selecionadas e repicadas para placas com o mesmo meio, porém sem

tetrazólio, e incubadas por 48h na mesma temperatura. Foi preparada uma

suspensão bacteriana de cada estirpe com água de torneira, a qual teve sua

concentração ajustada para 108 unidades formadoras de colônias por mL (ufc/mL)

em espectrofotômetro (A600=0,5). As estirpes foram inoculadas em plantas dos

genótipos CNPH110 e CNPH171, considerados suscetível e resistente,

respectivamente (MORGADO; LOPES; TAKATSU, 1992a).

A inoculação de plantas com seis folhas foi feita pela deposição de uma gota

de 10 µL de suspensão bacteriana na axila da primeira folha, havendo em seguida o

trespasse da gota e do caule com um alfinete entomológico (MORGADO; LOPES;

TAKATSU, 1994). Aos 10 e 21 dias após a inoculação (DAI) foram feitas avaliações

de sintomas com atribuição de notas de 1 a 5, onde: 1 – ausência de sintoma; 2 –

planta com um terço das folhas murchas; 3 – planta com dois terços das folhas

murchas; 4 – planta totalmente murcha; 5 – planta morta (adaptado de NIELSEN;

HAYNES, 1960). Para cada época de avaliação (10 e 21 DAI), as leituras foram

transformadas em índice de murcha bacteriana (IMB) a equação:

N

PCIMB ∑ ×

=)(

24

onde: IMB: índice de murcha bacteriana; C: nota atribuída a cada classe de sintoma;

P: número de plantas em cada classe de sintoma; N: número total de plantas

infectadas em cada subparcela (EMPIG et al., 1962). Desta forma, foram obtidos o

IMB10, com as notas aos 10 DAI, e o IMB21, com as notas aos 21 DAI.

Após a atribuição das notas, aos 21 DAI, as plantas de cada subparcela

foram cortadas rente ao solo, colocadas em saquinhos de papel, secas em estufa a

60°C por 72h e feitas as medidas de massa, em gramas, com três casas decimais,

em balança digital.

Foram mantidas parcelas testemunha não inoculadas para avaliação da

alteração de matéria seca da parte aérea das plantas inoculadas em relação à

testemunha não inoculada. A alteração percentual de massa seca da parte aérea foi

calculada segundo a equação:

100×−

=PTPTPIAMS

onde: AMS: alteração percentual de massa seca da parte aérea na parcela

inoculada em relação à testemunha não inoculada; PI: massa seca da parte aérea

na parcela inoculada; e PT: massa seca da parte aérea na parcela não inoculada.

25

Tabela 1 – Hospedeiro, instituição doadora, estado brasileiro de coleta e biovar das estirpes de Ralstonia solanacearum, raça 1, avaliados quanto à virulência em Solanum melongena

Denominação Hospedeiro Instituição – Estado de coleta Biovar

CNPH131, 2 Solanum tuberosum Embrapa Hortaliças - DF I

CNPH191, 2 Solanum lycopersicum Embrapa Hortaliças - PA I

CNPH201 Capsicum annuum Embrapa Amazônia Oriental - PA III

CNPH331, 2 Solanum lycopersicum Embrapa Hortaliças - AP III

CNPH471, 2 Solanum gilo Embrapa Hortaliças - AM III

CNPH541, 2 Solanum melongena Embrapa Hortaliças - DF I

CNPH561, 2 Solanum melongena UFRPE - PE III

CNPH581, 2 Solanum melongena Embrapa Hortaliças - DF I

CNPH711, 2 Solanum melongena Embrapa Hortaliças - DF II

CNPH821, 2 Solanum melongena Embrapa Hortaliças - DF II

CNPH1042 Solanum melongena Embrapa Hortaliças - DF I



CNPH1281, 2 Marsypianthes chamaedrys Embrapa Hortaliças - DF I

CNPH1481 Solanum tuberosum Instituto Biológico - SP I

CNPH1491, 2 Solanum tuberosum Instituto Biológico - SP I

CNPH1501, 2 Solanum tuberosum Instituto Biológico - SP I

CNPH1511, 2 Agerantum conyzoides Instituto Biológico - SP I

CNPH1521, 2 Solanum lycopersicum Instituto Biológico - SP I

CNPH1582 Solanum lycopersicum Agroflora - SP I

CNPH1592 Solanum lycopersicum Agroflora - SP I 1 Estirpe utilizada no primeiro ensaio. 2 Estirpe utilizada no segundo ensaio.

26

2.3.2 Avaliação de genótipos

Para avaliação de genótipos de berinjela, dois ensaios foram conduzidos em

casa de vegetação, um foi feito com a inoculação da estirpe CNPH19 e outro com a

estirpe CNPH152 (Tab. 1), sob temperaturas médias diárias de 30,4 a 33,5°C.

Foram avaliados quinze genótipos provenientes do AVRDC e outros seis da coleção

do germoplasma da Embrapa Hortaliças (Tab. 2), cujas reações foram determinadas

por Chen, Li e Wang (1997) e Morgado (1991), respectivamente. O genótipo

CNPH658 (seleção da variedade comercial ‘Florida Market’) foi o padrão de

suscetibilidade. A inoculação e avaliações (índice de murcha bacteriana e alteração

percentual de massa seca da parte aérea) foram feitas como descrito no item 2.3.1.

27

Tabela 2 – Denominações, países de origem e reações previamente conhecidas de resistência à murcha bacteriana de genótipos de Solanum melongena

Denominação Embrapa

Denominação de origem

País de origem Empresa/instituição

Reação1

Casa de vegetação Campo

CIÇA - Brasil (Embrapa Hortaliças) - MS2

CNPH006 Campinas Brasil (Agroflora) MR2 R2

CNPH130 - - MS2 S2

CNPH171 P12 França (INRA) R2 -

CNPH407 Nantou Nasu China R2 -

CNPH658 Flórida Market USA (Topseed) S2 S2

CNPH776 TS7 Malásia (AVRDC) R3 MR3

CNPH777 EG014 Itália (AVRDC) R3 MR3

CNPH778 EG219 Índia (AVRDC) R3 R3

CNPH779 TS47A Malásia (AVRDC) R3 R3

CNPH780 TS56B Indonésia (AVRDC) MR3 R3

CNPH781 TS64 Holanda (AVRDC) MR3 MR3

CNPH782 TS69 Indonésia (AVRDC) R3 R3





CNPH 787 EG195 Índia (AVRDC) R3 R3


PROVTS3 TS3 Malásia (AVRDC) R3 R3

PROVS75 TS75 Tailândia (AVRDC) MR3 MR3 1 R: resistente; MR: medianamente resistente; MS: medianamente suscetível; S: suscetível. 2 Inoculado com a estirpe Pss 97 (raça 1, biovar III). Fonte: CHEN; LI; WANG, 1997. 3 Inoculado com a estirpe CNPH056 (raça 1, biovar III). Fonte: MORGADO, 1991.

28

2.3.3 Interação genótipos e estirpes

Para avaliação da ocorrência ou não de interação entre genótipos de

berinjela e estirpes de R. solanacearum, foi conduzido ensaio em casa de vegetação,

sob temperaturas médias diárias de 29,5° a 34,7°C. Oito genótipos (CNPH006,

CNPH171, CNPH407, CNPH658, CNPH778, CNPH782, CNPH783 e CNPH785)

foram inoculados com as estirpes CNPH13, CNPH19, CNPH47, CNPH56, CNPH71

e CNPH152. A inoculação e avaliações (índice de murcha bacteriana e alteração

percentual de massa seca da parte aérea) foram feitas como descrito no item 2.3.1.

2.3.4 Procedimentos estatísticos

Foi utilizado delineamento em blocos inteiramente casualizados em todos os

ensaios, sendo feita a divisão de parcelas (estirpes) em subparcelas (genótipos) nos

ensaios para seleção de estirpes e no estudo de interação genótipos e estirpes, com

três e quatro blocos, respectivamente. Nos ensaios para avaliação de genótipos

foram constituídos três blocos no ensaio com a estirpe CNPH152 e cinco blocos no

ensaio com a estirpe CNPH19. As unidades experimentais foram constituídas de

dois vasos de 1,5 litros com quatro plantas por vaso.

As análises de variância foram feitas utilizando o programa estatístico

Winstat 1.0 (MACHADO; CONCEIÇÃO, 2002), sendo feita neste mesmo aplicativo a

análise de resíduos para verificação das pressuposições da análise de variância:

gráfico de caixa, distribuição normal e dispersão do erro. Para a variável AMS foi

adicionada a constante 1000, por haver resultados negativos e positivos. No caso do

ensaio para verificação de interação foi necessária transformação logarítmica

decimal dos dados IMB10 e IMB21 para atendimento das pressuposições da

análise.

O teste de agrupamento de Scott-Knott e a análise de agrupamento

multivariada foram feitas com a utilização do programa GENES (CRUZ, 2006). A

análise de agrupamento foi feita por dissimilaridade, baseada na distância euclidiana

média com nível de discriminação de 50%, pelo método UPGMA (ligação média

entre grupos – “Unweighted Pair-Group Method using arithmetic Averages”), de

acordo com os resultados de IMB10, IMB21 e AMS.

29

2.4 Resultados

2.4.1 Seleção de estirpes

As estirpes estudadas apresentaram diferentes níveis de virulência nos dois

ensaios realizados e com variação independente da biovar ou procedência (Tab. 3).

Na análise de variância foi observada interação significativa entre estirpes e

genótipos (P£0,01), o que significa que a virulência das estirpes variou conforme o

genótipo inoculado. No primeiro ensaio, as estirpes CNPH148, CNPH149 e

CNPH152 foram as que levaram as plantas do genótipo mais suscetível (CNPH110)

a murchar mais rapidamente (IMB10 e IMB21), o mesmo tendo ocorrido para as

estirpes CNPH150 e CNPH152, no segundo ensaio. As estirpes CNPH104 e

CNPH105 apresentaram-se avirulentas aos dois genótipos estudados, ressaltando o

fato de ter ocorrido aumento de massa seca na parte aérea (AMS) para o genótipo

CNPH110.

Para o genótipo CNPH171 (resistente), a estirpe CNPH19 foi

destacadamente a mais virulenta, nos dois ensaios. O comportamento esperado de

maior suscetibilidade do genótipo CNPH110 e de maior resistência do genótipo

CNPH171 se manteve para todas as estirpes, com exceção da estirpe CNPH19.

Nos dois ensaios foi possível observar que ocorreram outros sintomas além

da murcha, como encarquilhamento (Apêndice 1), amarelecimento e queda

prematura de folhas, assim como subcrescimento das plantas. A avaliação de AMS

refletiu as perdas e alterações ocasionadas pela colonização dos tecidos pela

bactéria de modo a complementar o IMB, uma vez que outras manifestações da

doença, além da murcha, não têm como ser caracterizadas nas notas.

As estirpes CNPH152 e CNPH19 foram as selecionadas para a avaliação de

genótipos, em função do elevado nível de virulência e sua diferença de efeitos sobre

os dois genótipos, respectivamente.

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Resistência de genótipos de berinjela à murcha bacteriana