EL ESTADO ACTUAL DE LA RESISTENCIA A HERBICIDAS EN EL MUNDO

Bernal E. Valverde1,2 y Ian M. Heap3 1Investigación y Desarrollo en Agricultura Tropical (IDEA Tropical)

P.O. Box 2191, Alajuela 4050, Costa Rica. E-mail: ideatrop@ice.co.cr 2Faculty of Life Sciences, The University of Copenhagen

Hojebakkegaard Allé 13, Taastrup, DK-2630, Denmark. E-mail: bev@life.ku.dk 3Weedsmart, P.O. Box 1365, Corvallis, OR 97339, U.S.A. E-mail:

IanHeap@weedsmart.com Resumen: Actualmente hay 332 biotipos de malezas resistentes a herbicidas pertenecientes a 189 especies (113 dicotiledóneas y 75 monocotiledóneas) en 60 países. Nueve de ellos (Alemania, Australia, Brasil, Canadá, España, Estados Unidos, Francia, Israel, y el Reino Unido) contribuyen el 60% de los casos de resistencia registrados. Por muchos años las malezas resistentes a triazinas constituyeron el grupo más numeroso de malezas que evolucionaron resistencia a herbicidas pero fueron sobrepasadas por aquellas que evolucionaron resistencia a los herbicidas inhibidores de la enzima acetolactato sintasa (ALS), con un total de 102 biotipos. Otros modos de acción o grupos de herbicidas relevantes para los cuales un número importante de malezas se han vuelto resistentes son los inhibidores de la acetil coenzima A carboxilasa (ACCasa), las auxinas sintéticas, bipiridilos, úreas y amidas, y el herbicida derivado de glicina, glifosato. Sólo unos pocos herbicidas no han sido afectados por el problema de la resistencia. El modo de acción más reciente se introdujo hace 18 años y las compañías de agroquímicos carecen de modos de acción novedosos que puedan alcanzar el mercado en un futuro cercano. Las regulaciones más estrictas para el registro de plaguicidas limitan la disponibilidad de herbicidas con modos de acción alternativos para combatir la resistencia. Se debe realizar esfuerzos mayores para preservar los herbicidas disponibles y para evitar y contener la diseminación de malezas resistentes a herbicidas. Palabras claves: malezas resistentes, modo de acción, resistencia cruzada, resistencia múltiple, presión de selección. Summary: Current Status of Herbicide Resistance in the World. Currently there are 332 herbicide resistant weed biotypes belonging to 189 species (113 dicotyledonous and 75 monocotyledonous) in 60 countries. Nine of them (Australia, Brazil, Canada, France, Germany, Israel, Spain, United Kingdom and United States) contribute 60% of the herbicide resistance cases registered. For several years, triazine-resistant weeds comprised the largest group of weeds evolving herbicide resistance but they were surpassed by weeds resistant to herbicides that inhibit the acetolactate synthase (ALS) enzyme (currently 102 biotypes). Other relevant modes of action or herbicide groups to which an important number of weeds have become resistant are Acetyl Coenzyme-A Carboxylase (ACCase) inhibitors, synthetic auxins, bipyridiliums, ureas and amides, and the glycine herbicide glyphosate. Only a few herbicides have not been affected by

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having resistant weeds. The newest herbicide mode of action was introduced 18 years ago and no new modes of action are in the pipeline of agrochemical companies for near future introduction. More stringent registration also limits the availability of herbicides with alternative modes of action to combat resistance. Major efforts should be devoted to preserve available herbicides and to prevent and contain the spread of herbicide resistant weeds. Keywords: cross resistance, mode of action, multiple resistance, resistant weeds, selection pressure. Introducción Los herbicidas constituyen el 45% del mercado de plaguicidas valorado en USD 35.000 millones (UTTLEY, 2009). Sin duda alguna estos agroquímicos, entre cuyos primeros representantes selectivos estuvieron el 2,4-D y MCPA introducidos a mediados de los 1940s, revolucionaron el control de malezas y han contribuido aumentar el rendimiento de las cosechas y a acrecentar el bienestar general. En la actualidad, unos 260 ingredientes activos, pertenecientes a 70 familias químicas, con unos 13 modos de acción reconocidos, contribuyen a la producción agrícola (QUADRANTI, comunicación personal). Su uso generalizado y gran dependencia para el control de malezas, sin embargo, no ha estado exento de problemas, en particular por la selección de malezas resistentes. En este trabajo se documenta la situación actual de las malezas resistentes a herbicidas en el mundo. Resistencia a herbicidas La definición de resistencia ha sido objeto de mucha discusión. Se entiende por resistencia la capacidad evolucionada de una población de una maleza anteriormente susceptible a un herbicida de soportarlo y completar su ciclo de vida cuando el herbicida se emplea a su dosis normal en una situación agrícola (HEAP and LEBARON, 2001). Esta definición tiene un carácter general y de uso práctico que sirve de base para la inclusión de casos de resistencia en el Registro Internacional de Malezas Resistentes a Herbicidas (International Survey of Herbicide-Resistant Weeds) disponible en www.weedcience.org. La Weed Science Society of America define resistencia como “la capacidad hereditaria de una planta de sobrevivir y reproducirse después de ser expuesta a una dosis de herbicida que normalmente es letal para el tipo silvestre. En una planta, la resistencia puede ocurrir de forma natural o inducida por técnicas como la ingeniería genética o la selección de variantes producidas por cultivo de tejidos o mutagénesis” (WSSA, 1998). Con mucha frecuencia se emplean los términos resistencia y tolerancia indistintamente. Sin embargo, es pertinente hacer la distinción. De nuevo, la Weed Science Society of America define tolerancia como “la capacidad hereditaria de una especie de sobrevivir y reproducirse después del tratamiento con un herbicida. Esto implica que no hubo selección o manipulación genética para hacer la planta tolerante; la planta es

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naturalmente tolerante” (WSSA, 1998). La tolerancia tiene una relación directa con la selectividad de los herbicidas. En el desarrollo de estos agroquímicos se procura seleccionar compuestos que no afecten a los cultivos pero que sean letales a las malezas. Otros términos relevantes son los de resistencia cruzada y resistencia múltiple. La resistencia cruzada ocurre cuando un mecanismo de resistencia individual confiere resistencia a varios herbicidas. La resistencia cruzada de sitio activo está conferida por una modificación en el sitio de acople común (enzima o proteína específica) a varios herbicidas, como en el caso de los herbicidas pertenecientes a las familias químicas de las sulfonilúreas, imidazolinonas, triazolopirimidinas y piridinil benzoatos que inhiben la enzima acetolactato sintasa (ALS). Dependiendo de la mutación presente en la enzima ALS, así se observarán distintos patrones de resistencia cruzada a estas familias de herbicidas o a herbicidas individuales dentro de cada familia (LAPLANTE et al., 2009). También puede presentarse resistencia cruzada fuera del sitio activo en cuyo caso un único mecanismo confiere resistencia a diversos herbicidas con distintos modos de acción. Estos mecanismos de resistencia usualmente no tienen relación con el mecanismo de acción del herbicida y más bien dependen de la capacidad acrecentada de la maleza para metabolizar al herbicida, por ejemplo a través de citocromos P450 o mediante la participación de transferasas de la glutationa (GRAY et al., 1996; SIMINSZKY, 2006). Aunque no se ha documentado todavía, es probable que mecanismos que involucren transportadores tipo ABC (BUSS and CALLAGHAN, 2008; CABRITO et al., 2009; ITO and GRAY, 2006; YAZAKI et al., 2009) puedan conferir resistencia cruzada fuera del sitio activo a diversos herbicidas sistémicos, tal como sucede con la resistencia múltiple a medicamentos (LINTON, 2007; PORCELLI et al., 2009). La resistencia múltiple se presenta cuando una planta o población acumula dos o más mecanismos de resistencia. Cuantos más mecanismos estén presentes, mayor diversidad de familias químicas y modos de acción resultarán ineficaces para controlar la maleza. Por ejemplo, un biotipo de Lolium rigidum de Australia es resistente a glifosato debido a que al transporte limitado de este herbicida en la planta y a herbicidas inhibidores de la enzima acetil coenzima A carboxilasa (ACCasa) y ALS por metabolismo acelerado de los herbicidas que involucra distintas enzimas del grupo de los citocromos P450 (YU et al., 2009). En Oregon, EE.UU., se encontró un biotipo de Bromus tectorum resistente a triazinas (por la mutación Ser264Gly del sitio de acción, proteína D1) que también es resistente a herbicidas ALS (primisulfurón, sulfosulfurón, propoxicarbazone-sodio e imazamox) por metabolismo acelerado. Este biotipo, además, fue moderadamente resistente etofumesate, cletodim, fluazifop, diuron, y terbacil (PARK and MALLORY-SMITH, 2005; PARK et al., 2004; PARK and MALLORY-SMITH, 2004). Un caso extremo es el de otro biotipo de L. rigidum que evolucionó resistencia a nueve clases de herbicidas después de ser tratado por 21 años con cinco herbicidas pertenecientes a distintas familias químicas. Las plantas de este biotipo son resistentes a úreas sustituidas (diurón y clorotolurón), inhibidores de ALS (incluidos clorsulfurón, triasulfurón, sulfometurón, imazaquin e imazapir), triazinas simétricas (atrazina, simazina y ametrina) y la asimétrica metribuzina, e inhibidores de ACCasa (varios ariloxi-fenoxipropanoatos incluido el diclofop y ciclohexanedionas como tralkoxidim y setoxidim). El biotipo también es resistente a metolaclor y propaclor (cloroacetamidas) y ligeramente resistente a paraquat (bipiridilo) y a tridifano (BURNET et al. 1994;

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BURNET et al.,1994). Necesariamente varios mecanismos confieren resistencia a herbicidas en este biotipo. Una forma resistente de ACCasa provee resistencia a diclofop, fluazifop y haloxifop pero no a tralkoxidim y setoxidim; la planta también metaboliza rápidamente al diclofop y tralkozidim, a los inhibidores del Fotosistema II clorotolurón y simazina y al inhibidote de la ALS clorsulfurón. Aproximadamente el 5% de la población también posee una ALS resistente (PRESTON et al. 1996). Evolución de la resistencia a herbicidas Varios factores determinan la evolución de resistencia a herbicidas en las malezas. El herbicida, en virtud de su eficacia biológica, ejerce presión de selección sobre las poblaciones de malezas de modo que los individuos que naturalmente poseen un mecanismo que les permite soportar el efecto del producto sobreviven y se reproducen. Conforme pasan las generaciones expuestas al herbicida, el número de individuos resistentes se incrementa hasta que llegan a estar en mayor proporción en la población haciéndose entonces notoria la falta de eficacia del herbicida. La aplicación de dosis altas y el uso frecuente del mismo herbicida o de productos que poseen el mismo mecanismo de acción o de metabolización en la planta o ambos tiende a seleccionar poblaciones resistentes por sitio activo. Los herbicidas persistentes, al permanecer activos en el suelo por largos períodos ejercen mayor presión de selección que los que rápidamente se inactivan al entrar en contacto con los coloides del suelo. Sin embargo, el uso persistente de un herbicida sin efecto residual surte el mismo efecto: rápidamente selecciona individuos resistentes en la población. Por tal razón hay 24 especies de malezas resistentes a paraquat. Algunos herbicidas son más propensos que otros a seleccionar poblaciones resistentes. Se destaca en el grupo de los más propensos los inhibidores de la ALS y la ACCasa. Otros, como los inhibidores de la protoporfirinógeno oxidasa (Protox) y el glufosinato de amonio tienen menor riesgo de seleccionar malezas resistentes. Aunque la aplicación de dosis bajas disminuye la presión de selección de resistencia por sitio activo, selecciona plantas con niveles bajos de resistencia que pueden proliferar paulatinamente y acrecentar su grado de resistencia gracias a la hibridación y recombinación y a la acumulación de varias mutaciones. En estos casos, la resistencia puede ser conferida por varios genes (resistencia poligénica), cada uno con un efecto parcial, por amplificación de genes o por mutaciones secuenciales en alelos de un mismo gene, cada uno adicionando incrementos en la resistencia. Para referirse a este tipo de resistencia se propuso el término resistencia multifactorial (GRESSEL, 2002). Individuos susceptibles de L. rigidum sometidos a selección recurrente con dosis bajas de glifosato progresivamente aumentaron su nivel de resistencia al herbicida, duplicándolo tan solo después de tres generaciones. La polinización cruzada fue un factor determinante en el incremento del nivel de resistencia mediante la acumulación de posibles genes que confieren apenas un nivel bajo de resistencia al herbicida (BUSI and POWLES, 2009). En biotipos de Conyza canadensis y C. bonariensis la resistencia a glifosato se asocia con un transporte alterado del herbicida y un incremento en los niveles de transcripción de la EPSPS (DINELLI et al., 2008; DINELLI et al., 2006). Las dosis bajas también podrían propiciar un incremento en las tasas de mutación, incluidas las que confieren resistencia (GRESSEL, 2009).

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Las características de la especie de maleza también influyen sobre la evolución de la resistencia. Uno de los atributos de las malezas es su variabilidad genética, la cual comprende la presencia de mutaciones, incluidas las que pueden conferir resistencia a herbicidas. Las mutaciones responsables de la resistencia a herbicidas no son inducidas por el herbicida sino que ocurren de forma espontánea (JASIENIUK et al., 1996). La frecuencia inicial de estas mutaciones determina el número de generaciones requeridas para que la resistencia sea evidente. La frecuencia de las mutaciones que confieren resistencia a herbicidas depende de varios factores incluidos el número de genes (monogénicas versus poligénica y nivel de ploidía), mecanismo de herencia, tipo de gene y naturaleza de la modificación del gene (WARWICK, 1991). Así, esta frecuencia no es la misma para todos los herbicidas o modos de acción ni para todas las especies de plantas. La gran propensión de los inhibidores de ALS a seleccionar poblaciones resistentes se relaciona con la frecuencia con que el gene nuclear que codifica la enzima puede mutar, la cual se estima en alrededor de 10-6, y a la posibilidad de que distintas mutaciones semi-dominantes, pero funcionalmente dominantes en condiciones de campo, puedan alterar el sitio de acople del herbicida en la enzima y confieran resistencia (DELYE et al., 2009; LAPLANTE et al., 2009; TRANEL and WRIGHT, 2002; GRESSEL, 2002). La frecuencia de individuos resistentes a sulfometurón-metilo y a imazapir varió entre 2.2 x 10-5 y 1.2 x 10-4 y entre 1.0 x 10-5 y 5.8 x 10-5, respectivamente, en tres poblaciones de L. rigidum nunca antes expuestas a herbicidas inhibidores de la ALS (PRESTON and POWLES, 2002). La resistencia de sitio activo a las triazinas se hereda de manera recesiva en el ADN del cloroplasto. La mutación que confiere esta resistencia por ser cloroplástica aparece con frecuencias mucho más bajas, posiblemente del orden de 10-20 (GRESSEL, 2002). Esto, junto con el hecho de que su transmisión es predominantemente materna, ayuda a explicar por qué la resistencia a inhibidores de ALS apareció mucho más rápido que la resistencia a triazinas. Para algunos herbicidas como los inhibidores de las elongasas de los ácidos grasos de cadena muy larga (VLCFAE), entre los que se incluyen los tiocarbamatos, cloroacetanilidas y cloroacetamidas, no se conoce la frecuencia de posibles mutaciones que confieran resistencia. Al menos 21 genes codifican VLCFAEs y estos herbicidas inhiben más de una elongasa, las cuales también difieren en su sensibilidad a dichos productos (TRENKAMP et al., 2004). Esta situación explica por qué la tasa de evolución de resistencia a estos herbicidas es baja dado que probablemente se requiera mutaciones en varios genes que codifican elongasas (GRESSEL, 2009). Un caso único de resistencia de sitio activo es el de la resistencia a inhibidores de Protox en A. tuberculatus (=A. rudis), conferido no por una mutación en el sitio de acción del herbicida sino a la pérdida por completo de un aminoácido (Gly210) que provoca un cambio en la conformación del sitio de acople del herbicida (PATZOLDT et al., 2006; HAO et al., 2009). La manera en que se hereda de la resistencia también influye en su tasa de evolución y establecimiento. Una mutación dominante es más proclive a establecerse en la población de la maleza después de la aplicación del herbicida que un alelo recesivo (JASIENIUK et al., 1996). De hecho, de las mutaciones que confieren resistencia a los herbicidas son pocas las que tiene carácter recesivo. Uno de estos casos es el de la resistencia a dinitroanilinas en Eleusine indica. La resistencia, asociada con la modificación de un

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aminoácido en la α-tubulina (ANTHONY et al., 1998), está controlada por único gene nuclear recesivo (ZENG and BAIRD, 1997). Las plantas que son muy prolíficas, de polinización cruzada y que ocupan grandes extensiones a altas densidades son más propensas a evolucionar resistencia a herbicidas. Un ejemplo de una especie que reúne estas características es L. rigidum, la cual ha evolucionado resistencia a herbicidas en cinco continentes y presenta los problemas más serios de manejo por la evolución de resistencias múltiples. La presencia de un banco de semillas en el suelo es una característica de las malezas que afecta la tasa de evolución de la resistencia y la dinámica de las poblaciones resistentes si se deja de emplear el herbicida selector. Las semillas almacenadas en el suelo cumplen una función amortiguadora por cuanto antes de la aplicación recurrente del herbicida corresponden predominantemente a plantas susceptibles. Plántulas susceptibles que emerjan de este banco de semillas después de aplicado el herbicida y perdido su efecto (ausencia de persistencia) “diluyen” la frecuencia de individuos resistentes en la población. El manejo de los herbicidas en función de la dinámica del banco de semillas es fundamental para la prevención y mitigación de la resistencia. En un estudio de cuatro años realizado en Canadá con la maleza del trigo Thlaspi arvense, se comprobó el impacto de la mezcla y rotación de herbicidas en la prevención de la resistencia al inhibidor de ALS etametsulfurón (BECKIE and REBOUD, 2009). Los tratamientos consistieron en la aplicación una vez por año de etametsulfurón o una mezcla formulada de bromoxynil más MCPA en rotación, considerando todas las posibles combinaciones en el tiempo (desde la aplicación del inhibidor de ALS en uno de los cuatro años hasta en tres de ellos complementado según correspondiera en los otros años con el la mezcla de herbicidas alternativos). Además se incluyeron los tratamientos correspondientes a etametsulfurón y bromoxynil más MCPA aplicados anualmente por cuatro años (ausencia de rotación), ambos herbicidas en mezcla de tanque en cada uno de los cuatro años (tratamiento de mezcla) y dos testigos para comparaciones (absoluto y deshierbado manualmente). El banco de semillas de T. arvense inicialmente tenía un 5% de individuos resistentes a etametsulfurón. El porcentaje de control de la maleza decreció de un 92% con una aplicación de la sulfonilúrea (independientemente del año en que se aplicó) a un 31% luego de la aplicación consecutiva por cuatro años. Cuando los herbicidas se aplicaron en mezcla o sólo se usó el tratamiento alternativo se obtuvo un control promedio del 96% al 97% por año. La producción total de semilla aumentó conforme se incrementó el número de aplicaciones anuales de etametsulfurón y la proporción de plántulas resistentes proveniente de semilla producida por la maleza expuesta a la sulfonilúrea se incrementó de un 2% cuando no se utilizó el etametsulfurón a 60% después de una sola aplicación y a 92% si se aplicó dos o más veces. Cuando se aplicó el etametsulfurón en mezcla con el tratamiento alternativo la proporción de semilla resistente a la sulfonilúrea fue de un 3%; en ausencia de herbicidas, se mantuvo en el 5% original. De manera similar pero reflejando un grado importante de amortiguamiento por la semilla susceptible, la proporción de individuos resistentes en el banco de semillas del suelo aumentó con el incremento en el uso del etametsulfurón de un 29% a un 85% después de una o cuatro aplicaciones, respectivamente. El nivel de resistencia en el banco de semillas permaneció invariable cuando se aplicó la mezcla de los herbicidas o

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solo el tratamiento alternativo por la duración del experimento. Bajo las condiciones de este estudio se demostró cuán rápidamente puede evolucionar la resistencia a inhibidores de ALS y se dedujo que las mezclas son más útiles para mitigarla que las rotaciones. La adaptabilidad al medio o fitness es la capacidad que tiene un genotipo de establecerse, sobrevivir y reproducirse exitosamente en competencia con el biotipo normal o silvestre en un ambiente particular (MENCHARI et al., 2008; GRESSEL, 2002). Esta adaptabilidad está determinada por la distribución de recursos a la supervivencia y reproducción a través del ciclo de vida de la planta. En algunas malezas, la mutación que confiere resistencia acarrea efectos pleiotrópicos que pueden afectar su desempeño en el campo en ausencia del herbicida. Los primeros estudios comparativos sobre fitness se realizaron con malezas resistentes y susceptibles a las triazinas. Puesto que la mutación que confiere resistencia a estos herbicidas reduce la tasa de transferencia de electrones en el Fotosistema II, los biotipos resistentes a triazinas poseen tasas fotosintéticas reducidas que los ponen en desventaja competitiva. Aunque la idea de que las mutaciones que confieren resistencia causan pérdida de adaptabilidad en las malezas se generalizó, diversos estudios han demostrado que en muchos otros casos los efectos pleiotrópicos asociados con la resistencia tienen poco significado práctico en el campo y que deben estudiarse por separado en cada caso (HOLT and THILL, 1994). También es importante recalcar que en muchos estudios se mide la productividad de plantas que crecen individualmente (en ausencia de competencia) y se infiere y generaliza sin el sustento apropiado acerca de su adaptabilidad. Genes o mutaciones diferentes pueden asociarse con costos de adaptabilidad diferentes y el nivel de dominancia de la resistencia como atributo no está necesariamente relacionado con el nivel de dominancia de la posible penalización en fitness (ROUX et al., 2004). En un trabajo reciente, (MENCHARI et al., 2008) estudiaron los efectos pleiotrópicos asociados con tres alelos mutantes que causan las sustituciones Ile1781Leu, Ile2041Asn y Asp2078Gly en la ACCasa de A. myosuroides. Para lograr un fondo genético homogéneo se emplearon poblaciones segregantes de la maleza. La biomasa, altura y producción de semilla de las plantas con ACCasa Leu-1781 y Asn-2041 fue similar a la de las plantas silvestres, mientras que las plantas con ACCasa homozigota para Gly-2078 sufrieron notorias reducciones (42%, 6% y 36%, respectivamente) en dichas características. En muchos casos de resistencia a inhibidores de la ALS, la penalización en adaptabilidad al medio resultante es mínima (TRANEL and WRIGHT, 2002). Por tal razón no es sorprendente que los alelos de resistencia persistan en las poblaciones que dejan de exponerse al herbicida. Tal es el caso del Ixophorus unisetus que evolucionó resistencia a imazapir a finales de los 1980s en Costa Rica (VALVERDE et al., 1993). Estudios en proceso indican que las poblaciones resistentes conservan dichos alelos después de más de 15 años de que se dejó de emplear el herbicida (VALVERDE, datos no publicados). En contraste, una penalización severa en adaptabilidad al medio puede anular la ventaja conferida por la mutación responsable por la resistencia en la persistencia del alelo resistente (PARIS et al., 2008). El impacto de la resistencia a herbicidas sobre la adaptabilidad de las malezas es tratado en detalle por (VILA-AIUB et al., 2009). Todos los factores que determinan la resistencia discutidos en esta sección interactúan de manera compleja en el campo dictando la dirección que sigue el proceso evolutivo. Un

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modelo reciente predice que el tiempo requerido para que una población evolucione resistencia depende del tipo de reproducción y de la dominancia del alelo de resistencia en presencia del herbicida, así como del costo en adaptabilidad al medio y la dominancia de este costo (ROUX et al., 2008). Resistencia sin presión de selección impuesta por el herbicida En la evaluación del riesgo como requisito previo a la introducción de cultivos resistentes a herbicidas o con otros atributos novedosos, uno de los temas que ha acaparado la discusión es la posible diseminación de estos genes novedosos, particularmente los transgenes (los cultivos resistentes a herbicidas producidos por inducción de mutaciones están exentos de este análisis de riesgo en la mayoría de los países) a especies emparentadas compatibles (malezas y silvestres e incluso otras variedades del cultivo). Diversas publicaciones tratan el tema del flujo de genes (WARWICK et al., 2009; CHANDLER and DUNWELL, 2008; CHAPMAN and BURKE, 2006; ELLSTRAND, 2003; POPPY and WILKINSON, 2005), el cual está fuera de alcance de este trabajo. De hecho, el factor principal que ha limitado la liberación de arroz transgénico resistente a herbicidas (nótese que el arroz resistente a imidazolinonas comercializado bajo el nombre de arroz Clearfield® se origina de inducción de mutaciones) es el riesgo de que tales genes se diseminen al arroz maleza que es conespecífico con el arroz cultivado (GRESSEL and VALVERDE, 2009a). Muchas de estas malezas conespecíficas son formas no completamente domesticadas o cultivos que se de-domesticaron a sus formas ferales (GRESSEL, 2005). Los casos de resistencia en malezas emparentadas con cultivos que se originan del flujo de genes desde cultivos resistentes o estas malezas como puente para transferir el gene a otras no directamente expuestas al cultivo resistente no se incluyen en el Recuento. Sin embargo, es pertinente mencionar que hay casos de relevancia comercial, en particular, el flujo de genes del arroz Cleafield al arroz maleza (OLOFSDOTTER et al., 2000; MADSEN et al., 2002; VALVERDE and GRESSEL, 2005; GRESSEL and VALVERDE, 2009a; GRESSEL and VALVERDE, 2009b; SHIVRAIN et al., 2007; BURGOS et al., 2008). El flujo de genes también puede contribuir a la aparición y diseminación de la resistencia en malezas en ausencia de la presión de selección impuesta por el herbicida y no puede descartarse a priori aun en malezas que crecen en cultivos tratados con herbicidas (ASHIGH et al., 2008). Por ejemplo, se determinó que los genes de resistencia de L. rigidum se pueden mover hasta 3 km a plantas receptoras de la misma especie (BUSI et al., 2008). Esto podría contribuir a la aparición de plantas con resistencia múltiple o con resistencia a herbicidas nunca antes usados en ese lote o predio en particular. Otro caso muy interesante es el de A. tuberculatus. Esta especie que hasta hace pocos años pasaba desapercibida se ha convertido en un serio problema en áreas productoras de soya en EE.UU. Hay poblaciones de A. tuberculatus con resistencia múltiple por acúmulo de varios mecanismos de sitio activo, incluida la ya mencionada resistencia a herbicidas Protox (PATZOLDT et al., 2005). Se ha propuesto que A. tuberculatus puede obtener genes de resistencia de otras especies de Amaranthus con las cuales establece un intercambio de genes unidireccional. Así, A. hybridus puede fácilmente transferirle

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alelos a A. tuberculatus pero el intercambio recíproco es prácticamente nulo aun cuando las dos especies coexistan en el mismo campo (TRUCCO et al., 2009). L. multiflorum y la especie emparentada, Festuca rubra pueden hibridar en forma natural. F. rubra es naturalmente tolerante a graminicidas pues su ACCasa es insensible a estos herbicidas (PRICE et al., 2003; HERBERT et al., 1996) en contraste con F. arundinacea que es susceptible a setoxidim y haloxifop (STOLTENBERG et al., 1989). La ACCasa de F. rubra tiene un codón Leu1781 que se conoce la torna insensible a graminicidas en algunas malezas que han evolucionado resistencia de sitio activo en lugar de Ile1781 presente en la ACCasa susceptible (DELYE and MICHEL, 2005). En un estudio realizado en Argentina, se sembró L. multiflorum, proveniente de un pastizal nunca tratado con herbicidas, en monocultivo y en mezcla con F. rubra y sometidas a dosis crecientes de diclofop en cada ciclo cuando tenían 2-3 hojas Dos años después, se encontró una alta incidencia de Lolium resistente a diclofop proveniente de parcelas con las dos especies en mezcla y asperjadas con dosis bajas del herbicida, las cuales fueron suficientes para seleccionar las plantas resistentes que posiblemente se originaron por hibridación (MARTINEZ-GHERSA et al., 1997). El experimento se continuó hasta completar cinco años y los materiales expuestos a las distintas condiciones de selección se sembraron en forma individual en pequeñas parcelas durante tres años más. Al finalizar este período, se recolectó semilla y las plántulas obtenidas a partir de ellas se trataron con diclofop para determinar su resistencia al herbicida. Las selecciones presentaron variación en sus niveles de resistencia; sin embargo, éstos no se relacionaron directamente con el nivel de exposición histórica al herbicida ni a la presencia o ausencia de F. rubra en las parcelas de L. rigidum por lo que los resultados no fueron concluyentes (GUNDEL et al., 2008). Registro histórico de la resistencia a herbicidas Heap (HEAP, 1997; HEAP, 1994) presentó relatos detallados de cómo se inició el registro histórico de los casos de resistencia a herbicidas en el mundo. Después de que se documentó el primer caso de resistencia a herbicidas (RYAN, 1970) iniciaron investigaciones para determinar por qué Senecio vulgaris era capaz de sobrevivir después de recibir dosis elevadas de simazina. Estudios pioneros de Radosevich determinaron que una alteración en el sitio de acción era el mecanismo de la resistencia a triazinas en S. vulgaris y otras especies resistentes que aparecieron poco después (RADOSEVICH and DEVILLIERS, 1976; RADOSEVICH, 1977). En la década de los 1970s se documentaron muchos otros casos de malezas resistentes a triazinas las cuales en 1980 sumaban 26 especies de hoja ancha y 6 gramíneas. A mediados de los 1970s el Dr. Homer LeBaron de Ciba-Geigy, con quien Radosevich había tenido contactos desde el inicio de sus investigaciones, se involucró de lleno en el tema de la resistencia organizando actividades científicas, recopilando información y promoviendo la investigación. En 1982 publicó junto con el Dr. Jonathan Gressel el libro Herbicide resistance in plants (LEBARON and GRESSEL, 1982) que puso en perspectiva el conocimiento acumulado a la fecha y contribuyó al avance de la investigación en esta importante área de la malherbología. Durante dos décadas, el Dr. LeBaron recopiló información acerca de casos reconocidos de resistencia. En 1990 informó que el número

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de especies resistentes a triazinas había aumentado a 40 dicotiledóneas y 15 gramíneas. Además, sus registros ya daban cuenta de casos de resistencia a otros herbicidas incluidos 11 especies resistentes a paraquat, cinco a clortolurón, cuatro a diclofop-metilo, y un incipiente problema de resistencia a inhibidores de ALS con seis casos reconocidos, para un total de 99 especies resistentes (HOLT and LEBARON, 1990). Registro Internacional de Malezas Resistentes a Herbicidas. En 1995 y 1996 se enviaron 430 cuestionarios a investigadores y extensionistas de 53 países para determinar cuáles especies habían evolucionado resistencia a herbicidas. La información requerida incluía especie y herbicida involucrado, fecha y lugares en que se identificó, método de confirmación de resistencia, cultivo o condición en la que se presentó la resistencia, número de localidades, área infestada e importancia económica (HEAP, 1997). Con base en las respuestas obtenidas más la información recopilada previamente por LeBaron, el co-autor de este trabajo elaboró una base de datos que dio inicio al Registro Internacional de Malezas Resistentes a Herbicidas (International Survey of Herbicide-Resistant Weeds), disponible en forma electrónica en www.weedscience.org. La información presentada aquí en relación con la situación actual de la resistencia a herbicidas en el mundo, se origina de esta fuente. Criterios para inclusión en el Registro. Para que un caso de resistencia sea incluido en el Registro, debe de cumplir con varios criterios descritos en detalle y disponibles en su portal (HEAP, 2005):

• Cumplir con la definición de resistencia a herbicidas de la WSSA descrita previamente.

• Confirmación de la resistencia empleando protocolos científicos reconocidos. Para la confirmación inicial de resistencia se prefiere los bioanálisis comparativos (posible resistente versus susceptible conocido) empleando plantas enteras. Las verificaciones posteriores rutinarias pueden hacerse con métodos más rápidos y apropiados para el manejo de un número elevado de muestras. Cada caso se valora cuidadosamente, especialmente aquellos en los que se informan niveles bajos de resistencia siendo importante proveer información que verifique que los biotipos que exhiben este tipo de respuesta ofrecen problemas de control en el campo.

• La resistencia debe ser hereditaria. • Demostración de impacto práctico en el campo. Si no hay problemas de control

con las dosis recomendadas en el campo, el caso no se incluye en el Registro. • La planta debe de ser una maleza reconocida e identificada a nivel de especie. En

el Registro no se incluyen plantas resistentes seleccionadas deliberadamente como las plantas espontáneas de los cultivos resistentes a herbicidas. Por el momento, tampoco se incluyen malezas emparentadas con estos cultivos que se han vuelto resistentes por flujo de genes.

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Situación actual de la resistencia a herbicidas en el mundo A septiembre de 2009, el Registro lo componen 332 biotipos resistentes a herbicidas en 60 países (Cuadro 1). Es importante aclarar que un biotipo resistente se registra la primera vez que una especie de maleza evoluciona resistencia a uno o más herbicidas pertenecientes a un grupo específico. Por ejemplo, C. bonariensis resistente a bipiridilos en tres países se registra como un único biotipo resistente; la misma especie resistente a glifosato (grupo denominado como glicinas) en seis países se registra como otro biotipo resistente. Hay 189 especies (113 dicotiledóneas y 76 monocotiledóneas) que han evolucionado resistencia a herbicidas en unos 300.000 predios. Cuadro 1. Biotipos de malezas resistentes a herbicidas de acuerdo con el grupo a que pertenece el producto químico.

Biotipos resistentes Grupo de herbicida

Código de HRAC1

Ejemplo Dicot. Monocot. Total

No. de países

Inhibidores de ALS B Clorsulfurón 65 37 102 34 Inhibidores de Fotosistema II C1 Atrazina 47 21 68 26

Inhibidores ACCasa A Diclofop-metilo 0 36 36 30 Auxinas sintéticas O 2,4-D 21 7 28 15 Bipiridilos D Paraquat 16 8 24 13 Úreas y amidas C2 Clorotolurón 8 13 21 27 Glicinas G Glifosato 9 7 16 14 Dinitroanilinas y otras K1 Trifluralina 2 8 10 6 Tiocarbamatos y otros N Trialato 0 8 8 6 Triazoles, úreas, isoxazolidionas F3 Amitrol 1 3 4 2

Inhibidores de Protox E Oxifluorfén 3 0 3 2 Cloroacetamidas y otros K3 Butaclor 0 3 3 5 Inhibidores de biosíntesis de carotenoides F1 Flurtamone 1 1 2 2

Ácidos arilaminopropiónicos Z Flamprop-metilo 0 2 2 3

Nitrilos y otros C3 Bromoxinil 1 0 1 1 Inhibidores mitóticos K2 Profam 0 1 1 1 Inhibidores de síntesis de celulosa L Diclobenilo 0 1 1 1

Desconocidos Z (cloro) - flurenol 0 1 1 2 Organoarsenicales Z MSMA 1 0 1 1 Total 175 157 332

1 Clasificación de los herbicidas según el Herbicide Resistance Action Committee. Disponible de HRAC: www.hracglobal.com/Publications/ClassificationofHerbicideModeofAction/tabid/222/Default.aspx. 2 Un mismo país puede ser contado en más de un grupo de herbicidas por lo que esta columna supera los 60 países indicados en el texto en los que ha evolucionado la resistencia a herbicidas.

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Nueve países (Alemania, Australia, Brasil, Canadá, España, Estados Unidos, Francia, Israel, y el Reino Unido) contribuyen el 60% de los casos de resistencia registrados. Sólo los Estados Unidos, Australia y Canadá, con la mayor incidencia de casos, contribuyen el 35% de los registros (Cuadro 2). Esta misma proporción existía en 1995, excepto que Brasil, el país latinoamericano que tiene el mayor número de casos de resistencia, no figuraba entre los países con más casos (HEAP, 1997). El incremento cronológico en el número de casos de resistencia a herbicidas en el mundo se ilustra en la Figura 1. Después del descubrimiento de resistencia a triazinas en S. vulgaris y hasta finales de la década de los 1970s se reportaba en promedio un caso por año. Desde entonces el incremento promedio ha sido de 10 casos anuales pero su composición ha variado puesto que a partir de 1998 la supremacía de la resistencia a las triazinas fue cedida a los inhibidores de ALS y otros grupos también se hicieron más notorios (Figura 2). Cuadro 2. Distribución de casos de resistencia a herbicidas por país.

País No País No País No País No Alemania 21 Dinamarca 3 Hungría 1 Paraguay 2 Arabia Saudita 1 Ecuador 1 India 3 Polonia 10 Argentina 3 Egipto 1 Indonesia 1 Portugal 2 Australia 53 El Salvador 1 Irán 7 Reino Unido 24 Austria 2 Eslovenia 1 Irlanda 1 República Checa 16 Bélgica 18 España 31 Israel 23 Sri Lanka 2 Bolivia 3 Estados Unidos 126 Italia 19 Sudáfrica 14 Brasil 21 Etiopia 1 Japón 16 Suecia 2 Bulgaria 4 Fiji 1 Kenya 1 Suiza 14 Canadá 46 Filipinas 3 Malasia 16 Tailandia 5 Chile 7 Francia 32 México 3 Taiwán 1 China 9 Grecia 6 Nicaragua 1 Túnez 1 Colombia 6 Guatemala 1 Noruega 5 Turquía 3 Corea del Sur 10 Holanda 7 Nueva Zelanda 10 Venezuela 1 Costa Rica 5 Honduras 1 Panamá 1 Yugoslavia 6

La predominancia inicial de casos de resistencia a triazinas es producto de su gran eficacia y amplio uso, principalmente de atrazina en maíz y simazina en cultivos de plantación. A inicios de la década de los 1980s las malezas resistentes a las triazinas contribuían el 67% de los casos documentados de resistencia; entre 1985 y el 2000 este grupo representó sólo el 11% de los nuevos casos ingresados al Registro, mientras los inhibidores de la ALS aportaban el 38% de los casos nuevos. Otros grupos que adquirieron mayor relevancia por su aporte de casos nuevos en este período fueron los inhibidores de ACCasa (13%), fenilúreas/amidas (10%), bipiridilos (8%), y auxínicos (8%).

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Grupos de herbicidas más importantes. En la actualidad, los grupos más importantes de herbicidas que se ven afectados por el problema de la resistencia, por número de casos, son los inhibidores de ALS, inhibidores de Fotosistema II, inhibidores ACCasa, auxinas sintéticas, bipiridilos, úreas y amidas, y el glifosato.

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1960 1970 1980 1990 2000 2010

Año

Núm

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os re

sist

ente

ss

Figura 1. Incremento cronológico en el número de casos de resistencia a herbicidas en el mundo.

Inhibidores de ALS. Las sulfonilúreas, primera familia de herbicidas inhibidores de la ALS, fueron descubiertas por DuPont en 1975 y se empezaron a comercializar en trigo y cebada en 1982. Su gran eficacia a dosis extremadamente bajas, gran selectividad a diversos cultivos y baja toxicidad para mamíferos las convirtió en uno de los grupos más importantes de herbicidas en el mercado. Muchas compañías desarrollaron herbicidas pertenecientes a esta familia; más de 20 de ellas lograron patentar herbicidas de este grupo químico. Su importancia comercial se mantiene. Desde 1995 se han comercializado más de una docena de nuevas sulfonilúreas y otras están en proceso de desarrollo (ORT, 2007). En la misma década, American Cyanamid trabajaba en el desarrollo de las imidazolinonas, un grupo de herbicidas también muy potentes y de amplio espectro, partiendo de una molécula sintetizada en los años 1950s por un químico de su División Médica que trabajaba en productos anticonvulsivos. A través de la exploración y optimización se desarrollaron estos herbicidas que, teniendo una estructura química diferente a las sulfonilúreas, también inhiben la ALS (SHANER et al., 2007). Ingresan en el mercado en 1986. Más recientemente (a mediados de los 1990s) se unen las triazolopirimidinas y pirimidinil(oxi/tio)benzoatos a los herbicidas que tienen este mecanismo de acción. La alta presión de selección impuesta por estos herbicidas tan eficaces y la propensión de su sitio de acción a mutar, hicieron que rápidamente aparecieran malezas resistentes. El

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crecimiento exponencial del número de casos de resistencia es muy notorio (Figura 2), superando el centenar y abarcando 34 países, entre los que se destacan los EE.UU. con 126 casos, Australia con 53 y Canadá con 46. La resistencia a inhibidores de ALS ha ocurrido en cereales, rotaciones de maíz/soya, arroz, bordes de carretera y plantaciones forestales. En América Latina es uno de los principales grupos a los que las malezas han evolucionado resistencia, con 16 especies confirmadas.

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1960 1970 1980 1990 2000 2010

Núm

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spec

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resi

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tes

Inhibidores de ACCasaInhibidores de ALSTriazinasUreas, AmidasBipiridilosGlicinasDinitroanilinasAuxinas sintéticas

102

68 36

28

211610

24

Año Figura 2. Incremento cronológico en el número de malezas resistentes a herbicidas pertenecientes a distintos grupos.

Inhibidores del Fotosistema II. La principal familia de herbicidas pertenecientes al grupo C1 de herbicidas inhibidores del Fotosistema II (inhibidores del transporte fotosintético de electrones) es la de las triazinas. La mayoría de las malezas resistentes a este grupo de herbicidas (48 especies) son malezas dicotiledóneas que evolucionaron resistencia principalmente en el cultivo de maíz en EE.UU. y Europa y en huertos en Europa. Entre las malezas más importantes se encuentran nueve especies de Amaranthus, seis de Polygonun y cinco de Chenopodium. Senecio vulgaris, la primera maleza resistente a triazinas, se registra en 10 países, incluidos cuatro estados de los EE.UU. La especie resistente que se presenta en más países (18) es C. album seguida de A. retroflexus presente en doce países. Inhibidores ACCasa. Los herbicidas que poseen este mecanismo de acción pertenecen a las familias químicas denominadas ariloxifenoxipropanoatos (“fops”), ciclohexanodionas (“dims”) y fenilpirazolinas (“dens”, representada por el pinoxaden). Los dos primeros

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grupos ingresaron al mercado a finales de los 1970s. Estos herbicidas se emplean en el control de malezas gramíneas en cultivos de dicotiledóneas y cereales. En algunos casos, cuando se destinan a cereales, se les agrega antídotos o safeners en la formulación para mejorar su selectividad al cultivo. Tal es el caso del pinoxaden, introducido al mercado en 2006, que incluye al cloquintocet-mexilo para mejorar su selectividad en trigo y cebada (HOFER et al., 2006; MUEHLEBACH et al., 2009). Treinta y seis gramíneas han evolucionado resistencia a inhibidores de la ACCasa (Cuadro 1); los primeros casos se asociaron con el uso del diclofop-metilo en trigo. La resistencia a estos herbicidas tiene gran importancia económica en virtud de su distribución a través de grandes áreas y por las limitaciones de controlar económicamente las gramíneas resistentes con herbicidas alternativos. Lolium spp. han evolucionado resistencia a diclofop-metilo u otros inhibidores de ACCasa en 15 países: Alemania, Arabia Saudita, Australia, Canadá, Chile, EE.UU., España, Francia, Grecia, Irán, Israel, Italia, Reino Unido, Sudáfrica, y Túnez. En varios de estos países, notablemente en Australia, hay biotipos de Lolium spp. con resistencia múltiple. En Australia el primer caso de resistencia que se confirmó fue el de L. rigidum resistente a diclofop (HEAP and KNIGHT, 1982). Actualmente, la resistencia de L. rigidum a estos herbicidas es generalizada. Una evaluación reciente basada en más de 3000 muestras representativas de la zona triguera del sur de Australia que cubre 40 millones de ha determinó que el 77% era resistente a fops y el 22% a dims. Hubo poca correlación de resistencia cruzada entre ambos grupos a pesar de que comparten el mismo mecanismo de acción. Sin embargo, el 95% de los biotipos resistentes a dims también lo fueron a fops. En el grupo de los dims el 78% de los biotipos probados con tralkoxidim (160 análisis) fueron resistentes, mientras que sólo el 50% (de 117 pruebas) y 17% (de 2670 pruebas) de los biotipos probados con setoxidim y cletodim resultaron resistentes (BROSTER and PRATLEY, 2006). De manera similar, Avena spp. (principalmente A. fatua) ha evolucionado resistencia a inhibidores de ACCasa en trece países (Australia, Bélgica, Canadá, Chile, EE.UU., Francia, Irán, Israel, Italia, México, Reino Unido, Sudáfrica y Turquía), diez de ellos en común con Lolium spp. Varios biotipos, principalmente los canadienses, exhiben resistencia múltiple. Un censo de malezas resistentes en 786 campos en las Praderas Canadienses, cuya superficie cultivada es de 39 millones de ha, realizado entre 2001 y 2003 determinó que 565 (72%) tenían A. fatua resistente a herbicidas. De ellos, el 15% (83 campos) estaban contaminados con A. fatua resistente a herbicidas inhibidores de ACCasa, predominantemente resistentes a herbicidas de las dos familias principales (fops y dims). En 16 campos se encontró poblaciones de esta maleza resistentes tanto a inhibidores de ACCasa como de ALS (BECKIE et al., 2008). En Latinoamérica, se ha confirmado 16 malezas gramíneas resistentes a inhibidores de ACCasa, la mayoría en cultivos de cereales (Valverde, 2007). En Chile, se estima que un 25% de las 400.000 ha sembradas de trigo tienen malezas resistentes a inhibidores de ACCasa, incluyendo L. rigidum y L. multiflorum (75.000 ha), A. fatua (40.000 ha) y Cynosurus echinatus (25.000 ha), seleccionadas principalmente por el empleo recurrente de diclofop. Es interesante que muchos de estos biotipos resistentes pueden ser controlados con herbicidas del grupo de los dims como cletodim y tepraloxidim (N. Espinoza, comunicación personal). Otros casos importantes en la región son los de

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Phalaris paradoxa, P. minor y A. fatua en cereales en México. Completa la lista Brachiaria plantaginea, Digitaria ciliaris y Eleusine indica en Brasil, Eriochloa punctata, tres sorgos maleza o maicillos (Sorghum verticilliflorum, S. saccharatum y S. sudanense) y Rottboellia cochinchinensis en Bolivia, y malezas asociadas al arroz: Echinochloa colona en América Central, Colombia y Venezuela, e Ischaemum rugosum en Colombia (VALVERDE, 2007). Auxinas sintéticas. Los herbicidas auxínicos, introducidos a finales de la década de los 1940s, fueron los primeros herbicidas orgánicos selectivos y como tales revolucionaron el control de malezas, principalmente el de especies de hoja ancha en cereales. Pocas malezas han evolucionado resistencia a estos herbicidas si se toma en consideración que continúan siendo usados ampliamente después de más de 60 años. En el Registro se incluyen dos casos de resistencia a 2,4-D reportados antes de que se diera a conocer la resistencia a las triazinas. En Canadá (sur de Ontario), se informó acerca de poblaciones de Daucus carota resistentes a 2,4-D en bordes de carretera en 1957, las cuales al ser tratadas experimentalmente con 2,4-D a dosis elevadas fueron poco afectadas. El 2,4,5-T solo o en mezcla con 2,4-D provocó la muerte de las plantas. Estudios de invernadero corroboraron los resultados: todas las plantas del biotipo resistente tratadas con 2,4-D sobrevivieron mientras que la mortalidad de plantas testigo alcanzó el 85% (SWITZER, 1957). En un estudio subsiguiente, tanto las plantas susceptibles como las resistentes desarrollaron síntomas de toxicidad severos después de ser tratadas con herbicidas auxínicos, pero el biotipo resistente logró recuperarse posteriormente (WHITEHEAD and SWITZER, 1963). En 1957 también se informó acerca de poblaciones de Commelina diffusa en plantaciones de caña de azúcar en Hawaii resistentes a herbicidas auxínicos. Una de estas poblaciones tenía un nivel de resistencia de cinco veces en comparación con la población susceptible (HILTON, 1957). Además de estos dos casos de importancia histórica, el Recuento incluye otras 26 especies con biotipos resistentes a herbicidas auxínicos. La mayoría de ellas tiene un solo biotipo reportado en un único país. Ningún caso es considerado como crítico desde el punto de vista económico puesto que su distribución es limitada y porque hay herbicidas alternativos que permiten su control. Un nuevo tipo de herbicida con efecto auxínico y representante de la famila de los ácidos quinolinecarboxílicos se introdujo en 1989 con el nombre de quinclorac. Este producto tiene la particularidad de controlar gramíneas selectivamente en el cultivo del arroz, aunque también es eficaz en un número limitado de especies de hoja ancha (GROSSMANN, 1998). Tres especies de Echinochloa (E. colona, E. crus-galli y E. crus-pavonis) asociadas al cultivo del arroz, Digitaria ischaemum en céspedes (ABDALLAH et al., 2006) y la rubiácea Galium spurium han evolucionado resistencia a este herbicida. Bipiridilos. A pesar de que los bipiridilos (paraquat y diquat) no son persistentes, el uso persistente de ellos ha provocado la selección de biotipos de malezas resistentes. En 1980 se reportó resistencia a paraquat en tres especies de Conyza (C. canadensis, C.

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philadelphicus y C. sumatrensis) y en la también asterácea, Youngia japonica en huertos en Japón. A la fecha, un total de 24 malezas son resistentes a estos herbicidas, en su mayoría seleccionadas por el paraquat. Biotipos de dos especies resistentes Arctotheca calendula y Monochoria korsakowii fueron seleccionados por diquat, mientras que siete especies fueron seleccionadas por ambos. En Latinoamérica no se informa ninguna especie resistente a estos herbicidas. Úreas y amidas. Los herbicidas pertenecientes a estas dos familias, al igual que las triazinas, también son inhibidores del transporte de electrones en el Fotosistema II. Dieciocho especies han evolucionado resistencia a las fenilúreas y tres especies de Echinochloa al propanil (amida). La mayoría de los casos de resistencia a fenilúreas se han presentado en Europa, seleccionados principalmente por el clorotolurón e isoproturón. Los documentados en América mayoritariamente han tenido al linurón y diurón como selectores. Entre los casos más importantes sobresalen los de Alopecurus myosuroides en varios países europeos y el de Phalaris minor en India. A. myosuroides evolucionó resistencia a clorotolurón en España, Holanda y el Reino Unido y a isoproturón en Bélgica y Suiza. Además, hay poblaciones con resistencia múltiple (principalmente fenilúreas más inhibidores de ACCasa) en varios de estos países. Esta especie es considerada como la maleza resistente más importante en Europa; Inglaterra, Francia y Alemania son los países más afectados. El mecanismo principal de resistencia es la metabolización acelerada del herbicida, lo que le confiere a las plantas que lo poseen la capacidad de evitar el daño de un amplio grupo de herbicidas; la resistencia de sitio activo a herbicidas inhibidores de ACCasa también se presenta ampliamente (MOSS et al., 2007). Esta situación se torna más seria en virtud de que ya se ha encontrado una población de esta especie en Inglaterra que también posee resistencia de sitio activo (mutación Pro197Thr) a inhibidores de ALS, puesto que la mezcla formulada de mesosulfurón más iodosulfurón , en combinación con el antídoto mefenpir-dietil, se emplea ampliamente como tratamiento alternativo desde 2003 (MOSS et al., 2007; MARSHALL and MOSS, 2008). P. minor, la principal maleza del trigo en India, tradicionalmente se ha controlado con isoproturón. A partir de 1990, sin embargo, los agricultores empezaron a quejarse de la falta de control con este herbicida. Estudios con biotipos selectos confirmaron la resistencia a isoproturón evolucionada principalmente en los sistemas de rotación arroz-trigo del noroeste de la India en los que por 10-15 años se había usado el herbicida a dosis inferiores a las recomendadas, aplicado tardíamente al voleo en mezcla con arena y úrea como fertilizante (MALIK and SINGH, 1995; SINGH et al., 1998a). Para finales de la década de los 1990s, unas 800.000 ha de trigo estaban infestadas con P. minor resistente a isoproturón en los estados de Haryana y Punjab (SINGH et al., 1999). Las infestaciones han sido tan severas que los productores se han visto forzados a cosechar sus campos antes de que el trigo alcance su madurez y utilizarlos para alimentación animal (CHHOKAR and SHARMA, 2008). La resistencia a isoproturón en P. minor en India no es de sitio activo sino metabólica. Los inhibidores de monooxigenasas citocromo P450, 1-aminobenzotriazol (ABT) y butóxido de piperonilo (PBO) aumentan la fitotoxicidad del isoproturón en biotipos resistentes al disminuir su degradación

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metabólica acelerada, que es el mecanismo que confiere resistencia al herbicida (SINGH, 1998a; SINGH et al., 1998b). A finales de los 1990s, los productores comenzaron a depender del inhibidor de ALS sulfosulfurón y de los inhibidores de ACCasa, principalmente clodinafop, así como de fenoxaprop, y tralkoxidim, para el control de P. minor resistente a isoproturón. La presión de selección ejercida por estos dos grupos de herbicidas en la mayoría de los campos por 6 a 8 ciclos de cultivo resultó en la selección de biotipos de la maleza con resistencia múltiple. Se han encontrado biotipos con niveles bajos de resistencia a sulfosulfurón y muy altos a clodinafop y fenoxaprop. Biotipos altamente resistentes a clodinafop también son altamentente resistentes a fenoxaprop pero solo tienen resistencia marginal al pinoxaden (CHHOKAR and SHARMA, 2008). La resistencia múltiple en P. minor limita sustancialmente las opciones de manejo químico de esta especie en trigo. Las poblaciones que son resistentes a las cuatro familias químicas (fenilúreas, sulfonilúreas, fops y dens todavía mantienen su susceptibilidad a triazinas y dinitroanilinas de uso en el cultivo. El propanil es el herbicida selectivo que por más tiempo ha permanecido asociado al cultivo del arroz en todo el mundo. E. colona evolucionó resistencia a propanil en las Américas y E. crus-galli en tres continentes (VALVERDE et al., 2000; VALVERDE and ITOH, 2001). Echinochloa es la maleza más problemática por ser muy competitiva con el arroz y por lo difícil y oneroso que resulta su control, especialmente en los casos en que ha evolucionado resistencia múltiple a herbicidas (GRESSEL and VALVERDE, 2009b). Glifosato. La resistencia a glifosato se documentó por primera vez en 1996 en L. rigidum en Australia en una población expuesta al herbicida por 15 años (Pratley et al., 1999; Pratley et al., 1996), irónicamente al mismo momento en que se sugería que la naturaleza difícilmente sería capaz de lograr lo que con tanta dificultad había realizado el hombre con el desarrollo de los cultivos resistentes a glifosato (BRADSHAW et al., 1997). Pronto se descubrió E. indica resistente a glifosato en Malasia (LEE and NGIM, 2000) y en adelante otras gramíneas y malezas de hoja ancha para alcanzar las 16 especies (7 poáceas y 9 dicotiledóneas) incluidas en el Recuento hasta la fecha (Cuadro 3). L. multiflorum resistente se ha reportado en Argentina, Brazil, Chile, EE.UU. y España. Otra gramínea resistente que debe destacarse es S. halepense en Argentina, la cual infesta muchas localidades en el área productora de soya en Argentina. Detalles acerca de cómo evolucionó la resistencia y su diagnóstico inicial pueden obtenerse de (VALVERDE and GRESSEL, 2006). En 2006, cuando el S. halepense resistente a glifosato se había confirmado sólo en las provincias de Salta y Tucumán en el Norte de Argentina, su área de dispersión se estimó en 91.700 ha, con un área de infestación propiamente dicha de 17.000 ha. En la actualidad los biotipos resistentes se encuentran en ocho provincias (Buenos Aires, Chaco, Córdoba, Corrientes, Salta, Santa Fe, Santiago del Estero, Tucumán) productoras de soya transgénica “Roundup Ready.” La situación actual de la resistencia a glifosato en el mundo ha sido revisada recientemente (POWLES and PRESTON 2006; POWLES, 2008); en el caso de América Latina de discute en detalle en (VALVERDE, 2010). Otros casos importantes son los de Amaranthus spp. en EE.UU. y de Conyza spp. principalmente en América. En el Cuadro 3 se citan tres casos más de

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resistencia que aun no se incluyen en el Recuento: E. indica en Bolivia y Costa Rica y Paspalum paniculatum en Costa Rica.

Especie País Año1 Cultivo o condición Especie País Año Cultivo o condición

Poáceas Dicotiledóneas

Digitaria insularis Paraguay 2006 soya Amaranthus palmeri EE.UU. 2005 Algodón, soya, Brasil 2008 soya maíz, huertos Echinochloa colona Australia 2007 Barbechos químicos A. tuberculatus (=A. rudis) EE.UU. 2005 Maíz, soya Eleusine indica Malasia 1997 Palma de aceite) Ambrosia artemisiifolia EE.UU. 2004 Soya Colombia 2006 Café Bolivia2 2007 Soya A. trifida EE.UU. 2004 Soya, algodón Costa Rica2 2007 Pejibaye para palmito Conyza bonariensis Sudáfrica 2003 Huertos y viñedos Lolium multiflorum Chile 2001 Viñedos, barbecho España 2004 Huertos químico (trigo) Brasil 2005 Maíz, frutales, soya, Brazil 2003 Huertos, soya trigo, huertos EE.UU. 2004 Huertos, soya, algodón Colombia 2006 Café España 2006 Huertos EE.UU. 2007 Bordes de carretera, Argentina 2007 Barbecho químico viñedos L. rigidum Australia 1996 Sorgo, trigo, huertos, C. canadensis EE.UU. 2000 Soya, algodón, maíz, viñedos, vías férreas arroz, borde de EE.UU. 1998 Huerto almendras carretera, viveros Sudáfrica 2001 Viñedos Brasil 2005 Frutales, huertos, Francia 2005 Espárragos, huertos, soya viñedos China 2006 Huertos España 2006 Huertos España 2006 Huertos Italia 2007 Huertos, viñedos Rep. Checa 2007 Vías férreas Paspalum paniculatum Costa Rica2 2007 Pejibaye para palmito Euphorbia heterophylla Brasil 2006 Soya Sorghum halepense Argentina 2005 Soya EE.UU. 2007 Soya Parthenium hysterophorus Colombia 2004 Frutales Urochloa panicoides Australia 2008 Sorgo, trigo Plantago lanceolata Sudáfrica 2003 Huertos y viñedos

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Cuadro 3. Malezas que han evolucionado resistencia a glifosato

1 Año de confirmación del primer caso en el país. 2 Com. pers. de P. Franco (E. indica, Bolivia) y datos no publicados (E. indica, Bolivia y Costa Rica y P. paniculatum, Costa Rica).

En la gran mayoría de casos de resistencia a glifosato, los niveles de resistencia observados son relativamente bajos, con índices de resistencia usualmente menores de cinco. En algunos biotipos resistentes, la resistencia a este herbicida se debe a la contribución de varios mecanismos. Por ejemplo, la resistencia a glifosato en un biotipo de L. rigidum de Sudáfrica la confiere una mutación (Pro106Ala) en la EPSPS y el transporte limitado del herbicida dentro de la planta. Para agravar el problema, este biotipo es también resistente a paraquat y a inhibidores de ACCasa (YU et al., 2007). Cultivos que contribuyen más a la resistencia a herbicidas. Los casos de resistencia más importantes se presentan en los cultivos de trigo, maíz, arroz y soya (Cuadro 4). El trigo y el maíz contribuyen 96 y 76 biotipos resistentes, respectivamente, en ambos pertenecientes a 53 especies. En el arroz, el 60% de los biotipos resistentes son plantas acuáticas. Los factores más relevantes en relación con la resistencia de malezas en estos cultivos en particular son tratados en detalle en sendos capítulos del libro Herbicide Resistance and World Grains editado por (POWLES and SHANER, 2001).

Cuadro 4. Casos de resistencia a herbicidas en los cultivos más importantes1.

Cultivo No. de biotipos No. de especies

Trigo 96 53 Maíz 76 53 Soya 60 41 Arroz 51 35 Huertos 50 35 Pasturas 33 24 Hortalizas 30 21 No agrícola 45 32

1 Compilado de (HEAP, 2009). La resistencia a herbicidas también se presenta en áreas no agrícolas, las cuales aportan 45 biotipos resistentes pertenecientes a 32 especies. Malezas resistentes más perniciosas Como se ha mencionado, algunas malezas tienen una mayor propensión a evolucionar resistencia que otras. En el Cuadro 5 se listan las 10 peores malezas resistentes del mundo. La lista se deriva de analizar y sopesar varios factores, incluidos el número de países afectados, modos de acción a los que la especie ha evolucionado resistencia, área que infesta y sistemas de cultivo en que se la encuentra. Las malezas L. rigidum y A. fatua continúan a la cabeza de la lista comparada con hace ocho años. Estas malezas son

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particularmente problemáticas en cultivos de cereales puesto que han evolucionado resistencia generalizada a herbicidas inhibidores de las ACCasa y ALS en una docena de países. Amaranthus palmeri y Conyza canadensis han crecido en importancia en años recientes debido a las amplias áreas infestadas con biotipos resistentes a glifosato. Chenopodium album ha disminuido en importancia aunque existe mucha preocupación de que poblaciones de esta especie pronto evolucionen también resistencia a glifosato, lo que puede volver a ubicarla en un sitio preponderante.

Cuadro 5. Relación de las diez peores malezas resistentes a herbicidas en el mundo.

Posición Especie Familia

1 Lolium rigidum Poaceae 2 Avena fatua Poaceae 3 Echinochloa crus-galli Poaceae 4 Amaranthus palmeri Amarantaceae 5 Conyza canadensis Asteraceae 6 Amaranthus rudis Amarantaceae 7 Amaranthus retroflexus Amarantaceae 8 Eleusine indica Poaceae 9 Chenopodium album Chenopodiaceae 10 Kochia scoparia Chenopodiaceae

Perspectivas

Está demostrado que las malezas tienen la capacidad de evolucionar resistencia a herbicidas, sin importar su modo de acción, cuando se someten a suficiente presión de selección bajo condiciones apropiadas. Sin embargo, también es claro considerando la prevalencia de algunos modos de acción sobre otros en la evolución de resistencia que hay algunos que tienen un menor riesgo. Por ejemplo, dos de los grupos más antiguos de herbicidas, las triazinas y los auxínicos, se han empleado comercialmente en millones de ha de maíz y cereales por más de medio siglo, muchas veces en ausencia de rotación. Sin embargo, 68 especies evolucionaron resistencia a triazinas y solo 23 lo ha hecho a las auxinas sintéticas (excluido el quinclorac). Pocas especies han evolucionado resistencia a cloroacetamidas y inhibidores de Protox. Sin embargo, una especie que evolucionó resistencia al segundo grupo, lo hizo por un mecanismo que no se conoce en organismo alguno resistente a un xenobiótico: pérdida por completo de un codón (PATZOLDT et al., 2006; GRESSEL and LEVY, 2006). La resistencia a glifosato que se consideraba improbable ahora ocupa la atención de decenas de científicos y nos enseña formas novedosas de evitar el daño por un herbicida. Hasta ahora, ninguna maleza ha evolucionado resistencia al glufosinato de amonio.

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Los agricultores han sido muy afortunados hasta ahora por contar con herbicidas alternativos que les permite controlar las malezas resistentes. Sin embargo, las perspectivas de que en los próximos años se comercialicen herbicidas con modos de acción totalmente novedosos son ínfimas. De hecho, el último modo de acción descubierto que permitió la comercialización de herbicidas novedosos se introdujo en 1991 con los inhibidores de la hydroxifenil piruvato dioxigenasa (HPPD) entre los que se encuentran la sulcotriona y mesotriona (RUEGG et al., 2007). La tendencia de la agroindustria en años recientes ha sido la de desarrollar productos similares a los ya existentes (los llamados “me too”) que imponen presión de selección adicional sobre sitios de acción sujetos a ella por años. El aumento en la regulación de los plaguicidas, principalmente en Europa, hace disminuir la disponibilidad de herbicidas y con ello limita las posibilidades de rotación y mezcla de herbicidas con modos de acción diferentes. Las áreas dedicadas a la producción de cultivos transgénicos resistentes a glifosato continúan en aumento (James, 2008) y no se vislumbra la introducción de cultivos resistentes a herbicidas novedosos. Como se ha discutido, las áreas dedicadas a la siembra de cultivos transgénicos resistentes a glifosato, en especial aquellas donde la producción además se realiza en regímenes de labranza de conservación, han brindado las condiciones adecuadas para que evolucione la resistencia a glifosato. La resistencia a glifosato, sin embargo, ha estimulado a las compañías de agroquímicos a posicionar productos con antiguos modos de acción alternativos como opciones para el combate de la resistencia en mezcla con otros herbicidas y hasta con el mismo glifosato o en nuevas formulaciones o presentaciones. En un afán por descubrir nuevos productos, las compañías de agroquímicos hacen ahora un mayor uso de las herramientas que provee la biotecnología y de sistemas de escrutinio de alta capacidad. De su éxito va a depender la posibilidad de que se ponga a disposición de los agricultores herbicidas con nuevos modos de acción; pero es en los agricultores en quienes recae la responsabilidad de hacer un uso racional de los productos existentes y de los nuevos que logren ingresar al mercado para no agravar aun más los problemas causados por las malezas resistentes. Bibliografía ABDALLAH, I.; FISCHER, A.J.; ELMORE, C.L; SALTVEIT, M.E.; ZAKI, M (2006) Mechanism of Resistance to Quinclorac in Smooth Crabgrass (Digitaria Ischaemum). Pesticide Biochemistry and Physiology 84, 38-48.

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A EXPERIÊNCIA DOS CULTIVOS TRANGENICOS RESISTENTES AO GLIFOSATE E SEU IMPACTO NA AGRICULTURA BRASILEIRA

P. J. Christoffoleti 1 ESALQ – Universidade de São Paulo – Brasil, Av. Pádua Dias, 11 – CEP 13.418-900 –

Piracicaba – SP – Brasil. e-mail: pjchrist@esalq.usp.br

Resumo: O cultivo de culturas resistentes ao glifosate (CRG) no Brasil foi feito em 15,8 milhões de hectares com sementes de soja e algodão transgênico em 2008, com um crescimento de 5,3% em relação ao ano anterior. É bem provável que com a liberação do milho resistente a glifosate no país, que ocorreu em 2008, a tendência é que o Brasil ultrapasse em área cultivada com transgênicos a Argentina, ficando apenas atrás dos Estados Unidos da América do Norte. Apesar dos constantes debates acalorados, os cultivos denominados “transgênicos” são uma realidade, e não possuem retorno, dada a gama de vantagens que podem proporcionar aos produtores, consumidores e meio ambiente, desde que tomados os cuidados inerentes a toda inovação tecnológica. O sistema de produção agrícola sustentável no Brasil está baseado em sistemas de plantio direto, com CRG sendo o principal componente. Dentre os benefícios sociais trazidos pelo uso do glifosate nos sistemas de produção, inclui-se maior uso de cultivo conservacionista que reduz erosão do solo e carga de pesticidas, nutrientes, e sedimento no ambiente. No entanto, a dependência no glifosate e sistemas de produção mais simples têm incrementado o risco de seleção de plantas daninhas tolerantes ao glifosate (PDTG) através da mudança de flora, e de biótipos de PDRG. Delinear estratégias com herbicidas ou sem herbicidas, que efetivamente retarda e/ou maneja a seleção de PDRG e de PDTG em sistemas de produção baseados no uso recorrente de glifosate é um desafio no Brasil. Os objetivos deste trabalho foram de (i) descrever alguns aspectos que influenciam a seleção de PDRG e PDTG no Brasil; (ii) discutir a viabilidade da rotação de culturas e/ou culturas de cobertura como medida integrada de sustentabilidade do sistema e prevenção e manejo da seleção de resistência; (iii) sumarizar os resultados de uma pesquisa feita sobre a percepção dos produtores brasileiros de soja sobre os problemas de PDRH e PDTG, e o nível de adoção de boas práticas agrícolas a fim de prevenir ou manejar estas plantas. Palavras clave: Glifosate, resistência a herbicidas, mudança da população, culturas resistentes a herbicidas. Resumen: La experiencia de los cultivos trangénicos resistentes a glifosato y su impacto en la agricultura brasileña. En 2008 la superficie con cultivos resistentes a glifosato (CRG) en Brasil alcanzó a 15.8 millones de hectáreas de soya y algodón, lo que representa un incremento de 5,3% con respecto al año anterior. Es muy probable que con la liberación del maíz resistente a glifosato, lo que ocurrió en 2008, la superficie cultivada con trangénicos en Brasil sea superior a la de Argentina, y sólo levemente inferior a la de EE.UU. A pesar de los constantes debates en torno a los cultivos denominados “trangénicos”, esto es una realidad sin retorno, debido a las numerosas ventajas que pueden proporcionar a los productores, consumidores y al medio ambiente, aunque deberían considerarse los cuidados inherentes a cualquier nueva tecnología.

El sistema de producción agrícola sustentable en Brasil se basa en la siembra directa, siendo el CRG el principal componente. Dentro de los beneficios sociales del uso de glifosato en este sistema se incluye el mayor uso de la labranza conservacionista, mediante la cual se reduce la erosión del suelo, cantidad de pesticidas, y se evita la pérdida de nutrientes y sedimentos del medio ambiente. Por otra parte, la dependencia del glifosato y de sistemas de producción más simple ha incrementado el riesgo de selección de malezas tolerantes a glifosato (PDTG) y de biotipos resistente a glifosato (PDRG). El desarrollo de estrategias con o sin uso de herbicidas, para retardar y/o manejar eficazmente la selección de PDRG y PDTG en sistemas de producción basados en el uso frecuente de glifosato, es un desafio en Brasil. Los objetivos de este trabajo fueron: (i) describir algunos aspectos que influencian la selección de PDRG y PDTG en Brasil; (ii) discutir la viabilidad de rotar de cultivos y/o cultivos de cobertura como medida integrada de sustentabilidad del sistema, y de prevención y manejo de la resistencia; (iii) resumir los resultados de una investigación hecha sobre la percepción de los productores brasileros de soya en relación a los problemas de malezas resistentes a herbicidas (PDRH) y PDTG, y el nivel de adopción de nuevas prácticas para prevenir o manejar estas plantas. Palabras clave: glifosato, resistencia a herbicidas, cambio en la población y cultivos resistentes a herbicidas. Summary: The experience of cultivation of resistant crop to glyphosate and its impact on the Brazilian Agriculture. The cultivation of resistant crop to glyphosate in Brazil was 15.8 million of hectares in 2008, with an increase of 5.3% compared to the previous year. It is very likely that with the release of the permission to cultivate corn resistant to glifosate in 2008, the tendency is that Brazil will grow more RCG than Argentina. Despite the constant debates, the “transgenic” are a reality with no return, due to the several advantages that the it can bring to producers, consumers and environment, but some care must be taken related to all new innovative technology. The major sustainable agricultural system in Brazil is based on a no-tillage cropping system with glyphosate-resistant crops (GRCs) predicted as a major component. Societal benefits of glyphosate in the system include greater use of conservation tillage which reduces soil erosion and associated loading of pesticides, nutrients, and sediments into the environment. However, over-reliance on glyphosate and simpler cropping systems has increase the risk to select tolerant weed species through weed shift (WS) and herbicide-resistant weed (HRW) biotypes to glyphosate. Designing herbicide and non-herbicide strategies that effectively delay and/or manage HRWs to glyphosate selection and WS to tolerant weeds to glyphosate in cropping systems based on recurrent glyphosate application is a challenge in South America. The objectives of this paper are (i) to overview some aspects that influence of WSs and HRW to glyphosate in South America, especially in Brazil, Argentina and Paraguay soybean cropped areas; (ii) to discuss the viability of using crop rotation and/or cover crop that might be integrated with forage crop in a sustainable economically and environmentally system. (iii) to summarize the results of a survey about the perceptions of the Brazilian farmers to problems with WSs and HRWs to glyphosate, and the level of adoptions of good agricultural practices in order to prevent or manage it. Key words: Glyphosate; herbicide resistance; herbicide tolerance; weed population shifts, herbicide tolerant crops.

Introdução As plantas daninhas são organismos evolutivos em resposta a mudanças no ambiente e/ou stress. Sendo assim, o intenso uso de herbicidas na agricultura, sendo um processo intensivo de distúrbio, proporciona pressão de seleção nas comunidades de plantas daninhas, resultando em seleção intra-específica de biótipos de plantas daninhas para produzir plantas daninhas resistentes aos herbicidas (PDRH) e seleção inter específica para causar mudança de flora entre espécies, weed shift (WS) devido ao controle efetivo e seletivo. Outras importantes forças seletivas são a escolha do herbicida, sistemas de cultivo, escolha da cultura, padrões de mudanças climáticas e a introdução de novas espécies de plantas daninhas (CARDINA et. al., 2002; SHANER, 2000).

Para a prática de agricultura em plantio direto, o herbicida glifosate é uma ferramenta fundamental para promover a proteção do solo através da palhada obtida da vegetação nativa ou de culturas de cobertura cultivada durante o período invernal (TRIGO y CAP, 2003). Esta prática tem sido adotada por muitos dos produtores brasileiros conscientes da conservação dos recursos naturais. No entanto, alguns problemas com o uso intensivo e repetitivo do glifosate têm ocorrido tais como a seleção de PDRG e WS para espécies tolerantes ao glifosate, que pode impor certas limitações no uso da tecnologia. Portanto, os produtores devem prestar atenção para fatores que impõe esta pressão de seleção, e delinear estratégias herbicidas e não herbicidas que efetivamente retarda ou maneja as PDRG e WS na comunidade de planta daninha.

Pesquisas estão sendo desenvolvidas com o objetivo de melhor entender os fatores que impõem a seleção para fazer recomendações para retardar a emergência de PDRG e WS (SEVERINO et al., 2005; JAKELAITIS et al., 2005). Dentre as propostas está a integração lavoura-pecuária de rotação de cultura e intercalar com culturas forrageiras, aumentando assim a diversidade do sistema, portanto minimizando as mudanças para espécies tolerantes ao glifosate e a evolução de biótipos de PDRG, e assim tornando o glifosate e culturas resistentes ao glifosate viáveis aos produtores por mais tempo.

Existe uma grande preocupação a nível mundial em relação ao uso intensivo do glifosate e de culturas resistentes ao glifosate (CRG) e seus efeitos na WS e especialmente na evolução de PDRG (OWEN, 2001). Há preocupação também para os impactos no uso de glifosate além das CRG. Extensionistas, cosultores agrícolas e produtores estão todos interessados em saber como será a evolução futura de PDRG pode afetar a sustentabilidade do glifosate na agricultura brasileira.

Sistemas de produção conservacionistas no Brasil e o glifosate

Atualmente, no Brasil, cerca de 22 milhões de hectares são ocupados pelo sistema de plantio direto, com expectativa de expansão da área agrícola sob esse sistema (CHRISTOFFOLETI et al., 2007a). Esse fato deve-se às inúmeras vantagens decorrentes da utilização do plantio direto, como a sustentabilidade agrícola devido à conservação dos recursos naturais e preservação da biodiversidade do solo, podendo aumentar a produtividade das culturas, além, segundo GAJRI et al. (2002), da possibilidade de contribuir para a redução do aquecimento

global mediante o seqüestro de carbono. Entretanto, para o estabelecimento do sistema de plantio direto são necessários cuidados específicos de gerenciamento, dentre os quais se destaca o eficiente controle das plantas daninhas.

A avaliação das necessidades de controle das plantas daninhas é função da taxa de emergência das espécies presentes no banco de sementes do solo, e deve ser estabelecida para cada sistema de manejo da cultura implantada (VOLL et al., 2003). Além disso, seria praticamente impossível estabelecer o sistema de plantio direto como uma prática economicamente viável e ecologicamente correta sem a integração dos métodos de controle das plantas daninhas. Conforme RUEDELL (1995), o sucesso dessa operação depende principalmente do planejamento na propriedade, levando-se em conta um sistema de rotação de culturas e não apenas uma cultura isoladamente.

A conservação dos recursos naturais no Brasil é prioridade nacional nos sistemas de produção adotado na agricultura, especialmente nas áreas de soja da região sul e central do país. A sociedade tem influenciado produtores a adotar sistemas de produção conservacionistas, e assim reduzindo os danos ao ambiente agrícola de produção (agroecossistemas) como um todo. Estes sistemas são baseados na cobertura do solo com resíduos de culturas (palhada), com o mínimo possível de distúrbio do horizonte superficial do solo. Estes sistemas, quando comparado com sistemas convencionais, reduzem variações de temperatura do solo diurna e noturna, diminui a evaporação de água da superfície do solo, aumenta o conteúdo de matéria orgânica e atividade dos microrganismos, e na camada superficial de solo, aumenta tanto as propriedades físicas quanto químicas, proporcionando assim melhor controle da erosão, e reduzindo a infestação de plantas daninhas.

Uma das discussões inevitáveis na agricultura brasileira está relacionada com o potencial de aumento de área plantada com CRG (culturas resistentes ao glifosate) no país e o uso do herbicida glifosate em larga escala (CHRISTOFFOLETI et al., 2005). Esta discussão não se restringe ao uso de glifosate em áreas com CRG, mas estende se desde o uso intensivo de glifosate nas áreas de sistemas de plantio direto, até áreas onde o uso de glifosate é feito para o controle não seletivo de plantas daninhas, tais como em fruticultura e florestas. Recentemente, o primeiro caso de uma PDRG (planta daninha resistente ao glifosate) no Brasil foi relatado com a planta daninha azevém (Lolium multiflorum L.) (CHRISTOFFOLETI e LOPEZ-OVEJERO, 2003; ROMAN et al., 2004). Duas espécies de buva foram também relatadas como resistente ao glifosate no Brasil. Curvas de dose-resposta foram publicadas para Conyza canadensis L. Cronq. e C. bonariensis L. Cronq. Selecionadas em áreas de citrus, foram também conduzidos experimentos para indicar tratamentos alternativos para estes biótipos (CHRISTOFFOLETI et al., 2007b). Populações de biótipos resistentes ao glifosate de ambas as espécies foram encontradas, cada uma com diferentes níveis de resistência.

A adoção de um sistema de cultura de cobertura intercalar à cultura principal é com certeza uma das práticas de sustentabilidade do sistema, que tem sido adotada no Brasil (Tabela 1). O objetivo é de reduzir a infestação de plantas daninhas, e aumentar a diversidade da flora através da redução da pressão de seleção (TSUMANUMA, 2004). O sistema está baseado no uso de culturas de cobertura intercalares ao milho ou na soja, sendo que a cultura de cobertura é depois utilizada como forrageira para alimentação do gado, ou como cobertura do solo

depois da dessecação por um herbicida (MERCANTE, 2003). O sistema é viável para as regiões sudeste e centro-oeste do Brasil, e traz diversos benefícios agronômicos de seu uso: (i) incremento da material orgânica no sistema, (ii) maior retenção de água no solo, (iii) supressão e diversificação da infestação de plantas daninhas, (iv) seqüestração do carbono do ambiente, (v) redução da compactação do solo e (vi) aumento da produtividade e sustentabilidade do sistema.

Tabela 1. Densidade das plantas daninhas (plantas m-2) na intereação entre os tratamentos com culturas forrageiras e especies de plantas daninhas, intercalada com a cultura de milho 60 dias após a semeadura. Adaptado de Severino et al. (2006).

Densidade da planta daninha (plantas m-2) Gramíneas forrageiras I. grandifolia A. hybridus D. horizontalis Brachiaria decumbens 33,52 aA 18,8 bB 5,6 bC Brachiaria brizantha 3,6 cA 4,3 cA 3,4 bA Panicum maximum 12,4 bA 3,6 cB 4,3 bB No intercropping1 36,3 aB 72,2 aA 37,3 aB C.V. (%)3 13,08 1 Testemunha sem cultura intercalar e plantas daninhas; 2 Números seguidos de letras distintas, maiúscula nas linhas e minúsculas nas colunas, diferem entre si ao nível de 5% de significância, de acordo com o teste de Tukey; 3 Coeficiente de variação do experimento.

Percepções dos produtores de soja Brasileiros sobre a influência das CRG na sustentabilidade do glifosate

Apesar do fato de que o Brasil oficialmente aprovou o cultivo da soja resistente ao glifosate (CRG) no final de setembro de 2003, logo após o início do período de plantio daquele ano, a adoção de CRG pelos produtores brasileiros pode sem dúvida aumentar o potencial de seleção de plantas daninhas tolerantes ao glifosate e/ou populações de PDRG, portanto é importante a entender como os produtores estão agindo e as percepções sobre PDRG e tolerantes ao glifosate. Isto é essencial para guiar futuras pesquisas e ações para informar os produtores das melhores alternativas para controle de plantas daninhas em sistemas de cultivo conservacionistas. Portanto, foi conduzida uma pesquisa no Brasil durante os meses de Janeiro e Fevereiro de 2007, baseado em um questionário aplicado para produtores de soja nos estados do Mato Grosso do Sul e São Paulo. Este levantamento de informações foi baseado nas questões e resultados obtidos no trabalho desenvolvido com milho e soja no estado da Indiana, Estados Unidos da América do Norte, durante o inverno de 2003/2004 para acessar suas percepções sobre a importância de plantas daninhas resistentes ao glifosate e táticas de manejo para prevenir o desenvolvimento de populações resistentes.

Um questionário de duas páginas foi diretamente preenchido pelos consultores de soja de duas regiões no Brasil, Naviraí – MS, localizada na região central do país, na área de Cerrado (28 questionários foram preenchidos), e Orlândia – SP, localizada na região Sudeste do Brasil, estado de São Paulo (96 questionários preenchidos). Nove questões foram perguntadas sobre aspectos agronômicos que poderiam afetar a seleção de PDRH e espécies tolerantes ao

glifosate, e questões sobre o sistema de produção usado, desenvolvimento e percepção dos produtores. Algumas das respostas são analisadas neste artigo.

Os resultados mostraram que a maioria dos produtores relataram alto potencial de risco de seleção de PDRG, e que é variável de acordo com a o tamanho da área do produtor (tamanho da propriedade), cujos resultados são semelhantes aqueles obtidos no levantamento feito em Indiana. Os produtores com áreas de soja <100 ha não estão muito preocupados com o problema de PDRG (50,5%), no entanto em média 94,2% dos produtores com áreas maiores tem no mínimo algum nível de preocupação sobre PDRG em suas propriedades (Tabela 2). A partir destes resultados pode ser concluído que os produtores com áreas mais extensivas podem estar mais conscientizados do impacto que PDRG, e isso é provável ser devido ao nível de tecnologia e informação que não está disponível para produtores de soja menores.

Tabela 2. Nível de preocupação relatado sobre PDRG de acordo com o tamanho da área de soja cultivada no Brasil.

Nível de preocupação sobre PDRG (%) Tamanho da area de soja cultivada (ha) Alto Moderado Baixo Nenhum <100 18,2 16,1 15,2 50,5

100 - 200 50,0 27,3 18,2 4,5 201 - 500 52,6 26,3 10,5 10,6

501 - 1000 19,3 53,8 23,1 3,8 >1000 54,2 33,3 8,3 4,2

As principais razões dos produtores adotarem CRG, independentemente da área de soja cultivada estão na Tabela 3. A mesma importância foi dada para três fatores que influenciam a adoção de CRH: experiência com a tecnologia pela primeira vez (21,8%); devido ao manejo de PDRH (20,2%) com as sulfoniluréias, imidazolinonas e inibidores da ACCase com o glifosate como herbicida alternativo; redução de custos (36,3%), maior flexibilidade e simplicidade da tecnologia comparado com o cultivo convencional e poucos por outras razões foram listadas pelos produtores. Tabela 3. Principais razões para os produtores adotarem a tecnologia de CRG independentemente do tamanho das propriedades no Brasil.

Razões %* Experimentando a technologia 21,8 Manejo de PDRH 20,2 Redução de custos 36,3 Maior flexibilidade 23,4 Outras razões 5,7 Não cultiva soja resistente ao glifosate 27,4 * % do total de todas as razoes é maior que 100% pois pois foi permitido que os entrevistados respondessem mais de uma razão.

Um outro fator que influencia a resposta dos produtores de áreas pequenas de soja é a porcentagem de área na propriedade que é semeada com CRG, que é muito maior em produtores que cultivam > 1000 ha que pequenos produtores (Tabela 4).

Tabela 4. Área cultivada com CRG de acordo com o tamanho da propriedade no Brasil.

% de soja cultivada com CRG Área de soja cultivada de acordo com o tamanho da

propriedade (ha) 0 <10 10-20 20-50 50-70 70-100 Sem

resposta*

<100 54,5 9,1 9,1 0,0 0,0 27,3 0,0 100 - 200 50,0 9,1 4,6 9,0 9,1 13,7 4,4 201 - 500 48,7 5,1 12,8 15,4 7,7 10,3 0,0

501 - 1000 37,1 7,4 14,8 29,7 0,0 11,1 0,0 >1000 4,2 16,7 20,8 25,0 12,5 16,7 4,1

* Porcentagem de produtores que recusaram a responder o questionário.

As plantas daninhas tolerantes ao glifosate selecionadas devido ao uso repetitivo de glifosate em áreas causando a mudança de flora é também uma preocupação dos produtores que cultivam mais de áreas extensivas (Tabela 5). Os produtores que cultivam áreas com > 1000 ha com soja tem alta a moderada preocupação neste aspecto. Portanto, no Brasil a seleção de espécies de plantas daninhas tolerantes pelo glifosate é uma preocupação muito maior para produtores que plantas PDRH, especialmente para produtores que cultivam a cultura em áreas extensivas, pois o sistema é baseado mais em herbicidas que nas áreas de pequenos produtores. As maiores proporções de pequenos produtores que não responderam o questionário é provavelmente pelo fato de não estarem conscientes do problema e não compreenderam a diferença entre PDRH e plantas daninhas tolerantes ao glifosate.

Tabela 5. Nível de preocupação relatado sobre plantas daninhas tolerantes ao glifosate de acorodo com o tamanho da propriedade cultivada no Brasil.

Nível de preocupação sobre plantas daninhas tolerantes ao glifosate (%) Tamanho da

propriedade (ha) Alto Moderado Baixo Nenhum

Sem respostas*

<100 27,3 27,7 18,2 0,0 26,8 100- 200 68,2 22,7 4,6 0,0 4,6 201- 500 64,1 23,1 2,6 5,1 5,1

501 - 1000 44,4 40,8 11,1 0,0 3,7 >1000 75,0 25,0 0,0 0,0 0.0

* Produtores que não responderam o questionário principalmente porque não sabia diferenciar PDRG de plantas tolerantes ao glifosate.

Uma outra questão perguntada foi sobre as razões para a medidas de não adoção de prevenção e manejo de biótipos de PDRH e/ou tolerantes ao glifosate (Tabela 6). Surpreendentemente pequenos produtores responderam que eles adotam na taxa de 5,6% do total das propriedades,

e que somente 27,3% tem restrições com relação ao custo, e que somente 9,1% não acredita que em suas propriedades seriam selecionadas PDRG. Nenhum dos grandes produtores responderam que eles adotam medidas de prevenção ou manejo na propriedade com um todo sendo que os altos custos a razão para isso, no entanto, surpreendentemente 20,8% dos produtores que cultivam soja em áreas de > 1000 ha não acreditam na possibilidade de seleção de PDRG em suas propriedades, e isso evidencia o problema da falta de conscientização que deveria ser dada a fim de dar suporte aos produtores, e que requer ações efetiva dos serviços de extensão, consultores agrícolas que trabalham com manejo de plantas daninhas.

Tabela 6. Razões de não adotarem medidas de prevenção em manejo de PDRG de acordo com o tamanho da propriedade cultivada com soja no Brasil.

Tamanho da area da propriedade cultivada com soja (ha) 1 2 3 4 5 6

<100 27,3 9,1 18,2 9,1 54,6 18,2 100- 200 22,7 40,9 18,2 0,0 0,0 18,2 201- 500 41,0 15,4 0,0 5,1 0,0 38,5

501 - 1000 51,8 14,8 7,4 3,7 0,0 22,2 >1000 50,0 20,8 8,3 8,3 0,0 12,5

1: Alto custo para a adoção. 2: Produtores não acreditam na possibilidade de seleção de PDRG em áreas cultivadas. 3: Quando PDRG forem selecionadas na area, a indústria de agroquímicos e os services de extensão encontrarão maneiras para resolver o problema. 4: Já adota medidas em parte para prevernção e manejo em suas áreas de soja. 5: Já adota medidas em toda a propriedade. 6: Marcou mais de uma alternative. Bibliografía CARDINA, J.; HERMS, C.P.; DOOHAN, D.J. (2002). Crop rotation and tillage system

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ESTADO DE LA RESISTENCIA A HERBICIDAS EN TRIGO Y OTROS CULTIVOS EXTENSIVOS EN EL SUR DE CHILE

N. Espinoza1, J. Díaz1, R. Galdames1, C. Rodríguez1, N. Gaete1 y R. De Prado2 1 INIA Carillanca, Temuco, Chile, email: nespinoz@inia.cl

2 Universidad de Córdoba, Córdoba, España

Resumen: En el sur de Chile, principal zona productora de trigo, cebada, avena, lupino y canola (36° a 42° lat. Sur), el surgimiento de biotipos de malezas gramíneas resistentes a herbicidas ha sido un proceso muy frecuente a partir de la década del noventa, inicialmente la resistencia fue a los inhibidores de ACCasa, posteriormente a los inhibidores de ALS y más recientemente a glifosato. A la fecha, se han descrito 50 biotipos de malezas gramíneas resistentes a herbicidas, correspondientes a cuatro especies, específicamente a ballica (Lolium multiflorum y L. rigidum), avenilla (Avena fatua) y cola de zorro (Cynosurus echinatus). Todos los biotipos se originaron en campos de agricultores ubicados en diferentes localidades de las regiones Del Bio Bio, La Araucanía, Los Rios y Los Lagos, cuyo sistema de cultivo se caracteriza por un uso intensivo del suelo con cultivos anuales, principalmente trigo, siembra con labranza cero y una alta dependencia del herbicida glifosato antes de la siembra y de los herbicidas ACCasa y ALS después de la siembra. En los biotipos de A. fatua la resistencia es a herbicidas ACCasa, mientras que en los bitipos de C. echinatus y L. rigidum la resistencia es a herbicidas ACCasa y ALS, y en los biotipos de L. multiflorum la resistencia es a herbicidas ACCasa, ALS y glifosato. Palabras claves: avenilla, ballica, cola de zorro, resistencia, biotipos. Summary: Status of herbicide resistance in wheat and others extensive crops in South of Chile. In the south of Chile, the main area for wheat, oat, barley, lupine and canola cropping (36° a 42° lat. Sur), the presence of resistant weed to herbicide has become frequent since de nineties. Initially the resistance was to the herbicides inhibitors of the ACCasa, then to the inhibitors of the ALS and more recently to glyphosate. Up to day more than 50 byotipes of gramineae resistant weed, belonging to four species, specifically to ryegrass (Lolium multiflorum y L. rigidum), wild oat (Avena fatua) and hedgehog (Cynosurus echinatus). All the biotypes have their origin in farms located in the regions of Del Bio Bio, La Araucanía, Los Rios y Los Lagos, that have a crop system characterized by an intensive use of the soil with annual crops mainly wheat, non-tillage and high dependency of glyphosate before seeding and ACCasa and ALS herbicides after the seeding. In the biotypes of A. fatua the resistance is to ACCasa herbicides, while in the biotypes of C. echinatus and L. rigidum the resistance is to ACCasa and ALS herbicides, and in the biotypes of L. multiflorum the resistance is to ACCasa, ALS and glyphosate. Keywords: wild oat, ryegrass, hedgehog dogtail, resistance, biotypes.

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Introducción Las malezas son un continuo problema en la agricultura en el mundo. La introducción de los herbicidas selectivos a fines de la década del 40 facilitó significativamente el trabajo de los agricultores para controlarlas. Sin embargo, la alta dependencia de los herbicidas se tradujo en cambios en la flora de malezas y en el surgimiento de biotipos resistentes (DELYE, 2005). Se entiende por resistencia a la habilidad heredable de una población o biotipo de maleza para sobrevivir y reproducirse después de la aplicación de un herbicida en la dosis a la que la población original era sensible (POWLES et al., 1997; GRESSEL, 2002). Desde que se reportó el primer caso de resistencia a herbicidas en el mundo (RYAN, 1970), esta se ha expandido con rapidez. Así, a la fecha, se han confirmado 332 biotipos resistentes pertenecientes a 189 especies de malezas, de las cuales 113 son dicotiledóneas y 76 monocotiledóneas (HEAP, 2009). En el sur de Chile, el surgimiento de biotipos resistentes a herbicidas ha sido un proceso muy frecuente a partir de la década de los noventa. Los primeros casos de resistencia se confirmaron a los herbicidas ACCasa y en las malezas gramíneas L. rigidum, L. multiflorum y A. fatua (ESPINOZA y ZAPATA, 2000; ESPINOZA et al., 2003). Todos estos biotipos fueron colectados en cultivos anuales extensivos, principalmente trigo, en la zona sur. A partir de esta fecha la resistencia ha sido creciente, ya que se ha expandido a otras áreas y confirmado en otra especie gramínea como C. echinatus (ESPINOZA et al., 2005; VALVERDE, 2007) y a otros herbicidas como los ALS y a glifosato (ESPINOZA et al., 2008). En el presente trabajo se presenta el estado de la resistencia a herbicidas ACCasa, ALS y glifosato en las 4 especies de malezas gramíneas antes señalas en el sur de Chile. Importancia de las especies de malezas gramíneas resistentes En el sur del país, la evolución de resistencia en avenilla (A. fatua), ballica (L. multiflorum y L. rigidum) y cola de zorro (C. echinatus) (Figura 1), tiene gran importancia por diversas razones. Las especies A. fatua y L. rigidum constituyen las malezas más importantes en muchas áreas de cultivos en el mundo (LORRAINE-COLWILL et al., 2001; YU et al., 2009). HEAP (2009) incluye a ambas entre las 10 especies de malezas resistentes a herbicidas más importantes económicamente en el mundo (Tabla 1). En Canadá, la avenilla es la gramínea anual más nociva en la región Northern Great Plain (BECKIE y KIRKLAND, 2003). En Australia, L. rigidum es la que ocasiona los mayores daños económicos en la agricultura (ALEMSEGED et al., 2001; LLEWELLYN y POWLES, 2001; LORRAINE-COLWILL et al., 2001). En EE.UU., L. multiflorum es considerada la maleza más problemática en diversas regiones del país (LIEBEL y WORSHAM, 1987). Cola de zorro (C. echinatus), al contrario de lo ocurre en Chile, no es una maleza importante en la agricultura en el mundo, lo que probablemente explica que todos los biotipos de cola de zorro resistentes reportados a la fecha sean chilenos (HEAP, 2009; VALVERDE, 2007). Sin embargo, de las cuatro especies, actualmente la más importante en el sur del país es L. multiflorum, debido a su mayor distribución (MATHEI, 1995), se presenta más frecuentemente y en mayores densidades en trigo y otros cultivos extensivos (Figura 2) y porque la superficie comprometida con biotipos resistentes es mayor. Se estima que del total de la superficie sembrada con trigo, avena, cebada, canola y lupino en el país, aproximadamente 100

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mil hectáreas se encuentran infestadas con biotipos resistentes de avenilla, ballica y cola de zorro (ESPINOZA y DÍAZ, 2005).

Ballica (Lolium multiflorum y L. rigidum) Avenilla (A. fatua)

Cola de zorro (C. echinatus) Figura 1. Malezas gramíneas que ha desarrollado resistencia a herbicidas en el sur de Chile. Las cuatro malezas gramíneas que han desarrollado resistencia en el sur del país, corresponden a especies anuales de invierno, por lo que su presencia en los cultivos sembrados en esta época, es casi obligada, presentándose en algunos casos como única especie de maleza y en otros casos, asociadas, dependiendo de la localidad (PEDREROS, 2001). Su presencia año tras año en los cultivos, se debe a que la mayoría producen una gran cantidad de semillas, lo que bajo las condiciones edafoclimáticas de la zona sur se ha estimado en 1.700 semillas por planta de ballica (L. multiflorum), 600 semillas por planta de cola de zorro y 330 semillas por planta de avenilla. La ballica (L. multiflorum y L. rigidum) (BOSQUE et al., 2002) y avenilla (NAYLOR, 1983) presentan una amplia variabilidad genética, lo que les permite una mayor capacidad de adaptación y supervivencia. Además, ambas especies de ballica presentan polinización cruzada (TERRELL, 1968), lo que implica que la resistencia puede trasmitirse no sólo a través de la semilla sino que también mediante el polen (WAKELIN, 2004). Esto no ocurre en avenilla (RUNZHI, 2007) y cola de zorro por tratarse de especies de autofecundación.

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Tabla 1. Principales especies de malezas resistentes a herbicidas en el mundo. (HEAP, 2009).

Especie Tipo Nº de biotipos resistentes

Lolium rigidum Avena fatua Amaranthus retroflexus Chenopodium album Setaria viridis Echinochloa crus-galli Eleusina indica Kochia scoparia Conyza canadensis Amaranthus hybridus

Gramínea Gramínea

Hoja ancha Hoja ancha Gramínea Gramínea Gramínea

Hoja ancha Hoja ancha Hoja ancha

36 37 36 42 15 26 14 33 41 23

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Frecue

ncia  (%)

Figura 2. Frecuencia con que se presentan diversas malezas gramíneas en trigo y otros cultivos extensivos en el sur de Chile. (DÍAZ y ESPINOZA, 2006). Los datos fueron obtenidos de una encuesta realizada a agricultores con malezas gramíneas resistentes en sus campos de las regiones Del Bio Bio, La Araucanía, Los Rios y Los Lagos. Distribución de los biotipos resistentes

Durante 1998-2007 se colectaron semillas de avenilla (Avena fatua), ballica (Lolium multiflorum y L. rigidum) y cola de zorro (Cynosurus echinatus), desde campos de agricultores ubicados en diferentes localidades de las regiones Del Bio Bio, La Araucanía, Los Rios y Los Lagos, en los que se sospechaba la existencia de resistencia. Del material colectado, 14 biotipos correspondieron a A. fatua, 17 biotipos a C.

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echinatus, 15 biotipos a L. multiflorum y 4 biotipos de L. rigidum. Posteriormente, los biotipos se caracterizaron en términos de su resistencia a los herbicidas inhibidores de ACCasa, inhibidores de ALS y a glifosato, encontrándose que todos todos los biotipos (50 biotipos) presentaron resistencia a uno o más herbicidas. La mayoría de los biotipos provino de las regiones de La Araucanía (68%) y Del Bío Bío (22%), lo que sugiere que en estas regiones la resistencia está más ampliamente distribuida. Además, ambas regiones aportaron más diversidad en cuanto al número de especies de malezas gramíneas con biotipos resistentes. Así, la región Del Bio Bio aportó con biotipos de A. fatua, C. echinatus y L. rigidum, mientras que la región de La Araucanía con biotipos de A. fatua, C. echinatus y L. multiflorum (Tabla 2). En las regiones Del Bío Bío, La Araucanía y Los Lagos, respectivamente, la resistencia se concentra en la Precordillera Andina, Valle Central y Litoral (Figura 3), áreas que se caracterizan por el uso intensivo del suelo con cultivos anuales, principalmente trigo, y siembra con labranza cero durante un periodo relativamente largo de tiempo, en algunos casos, por más de veinte años, lo que probablemente explica el mayor aporte de biotipos.

Figura 3. Distribución de los biotipos resistentes.

Tabla 2. Origen de los biotipos resistentes.

Maleza gramínea

Del Bio Bio 36° a 38° lat S

La Araucanía 38° a 39° lat S

Los Ríos 39° a 40° lat S

Los Lagos 40° a 44° lat S

Biotipos/ especie

A. fatua 2 10 0 2 14 C. echinatus 5 12 0 0 17 L. multiflorum 0 12 1 2 15 L. rigidum 4 0 0 0 4 Total/región 11 (22%) 34 (68%) 1 4 (8%) 50

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Resistencia de los biotipos a herbicidas selectivos

Avenilla (A. fatua) y cola de zorro (C. echinatus). En bioensayos realizados en plantas, con 14 biotipos de avenilla (AF-1, AF-2, AF-3, AF-4, AF-7, AF-8, AF-12, AF-13, AF-14, AF-17, AF-18, AF-21, AF-22, AF-23) y aplicando cada herbicida inhibidor de ACCasa e inhibidor de ALS en una dosis superior al 50% de la recomendada, se encontró resistencia sólo a los ACCasa. La resistencia a los ACCasa se caracterizó porque un alto porcentaje de los biotipos de avenilla presentó resistencia a los herbicidas del grupo químico de los FOP como diclofop, clodinafop y haloxyfop, mientras que un bajo porcentaje fue resistente a tepraloxydim (grupo químico DIM) y pinoxaden (grupo químico DEN) (Tabla 3). En bioensayos de dosis respuesta y utilizando el modelo de regresión log-logística propuesto por SEEFELDT et al. (1995) y los biotipos de avenilla AF-2, AF-3 y AF-14, se confirmó en todos la resistencia a los herbicidas ACCasa clodinafop y haloxyfop. Por otra parte, ningún biotipo presentó resistencia a tepraloxydim y pinoxaden y al herbicida ALS flucarbazone (Tabla 4). Estos resultados indican la existencia de diferentes patrones de resistencia cruzada a los herbicidas ACCasa. Respecto a los niveles de resistencia a los ACCasa, se encontró que los tres biotipos de avenilla exhibieron alta resistencia a clodinafop y baja resistencia a haloxyfop (Tabla 4). Estos resultado son similares a los obtenidos en A. fatua por MANSOOJI et al. (1992); SEEFELDT et al. (1994); COCKER et al. (2000); BECKIE et al. (2002), quienes encontraron que la resistencia fue más generalizada a FOP que a DIM. En EE.UU., ULUDAG et al. (2008), trabajando con 5 biotipos de A. fatua, tres herbicidas FOP, tres herbicidas DIM y un DEN, encontraron que todos los biotipos fueron resistentes a los FOP y sensibles a los DIM y DEN, excepto un biotipo que fue resistente a todos. Los resultados obtenidos en los biotipos de avenilla provenientes del sur del país, sugieren que la resistencia ha evolucionado básicamente a los ACCasa del grupo químico FOP, razón por la que herbicidas ACCasa de grupos químicos distintos como los DIM y DEN deberían ser herramientas eficaces para controlar los biotipos resistentes a FOP. En cola de zorro, trabajando con 17 biotipos (CE-3, CE-4, CE-6, CE-7, CE-10, CE-12, CE-13, CE-14, CE-15, CE-16, CE-17, CE-18, CE-19, CE-20, CE-21, CE-22, CE-23) y aplicando también cada herbicida inhibidor de ACCasa e inhibidor de ALS en una dosis superior al 50% de la recomendada, se encontró resistencia a ambos mecanismos de acción. La resistencia se caracterizó porque un alto porcentaje de los biotipos de cola de zorro presentaron resistencia a los tres herbicidas ACCasa evaluados, esto es, a clodinafop (FOP), haloxyfop (FOP) y a tepraloxydim (DIM), y al herbicida ALS flucarbazone (Tabla 3). En bioensayos de dosis respuesta en los biotipos de cola de zorro CE-10, CE-17, CE-18 y CE-19, se confirmó en todos la resistencia a los herbicidas ACCasa clodinafop haloxyfop y tepraloxydim, y al herbicida ALS flucarbazone (Tabla 4). Sin embargo, mientras los biotipos exhibieron alta resistencia a clodinafop y a haloxyfop, el nivel de resistencia a tepraloxydim fue variable según el biotipo, fluctuando entre baja y alta y la mayoría de los biotipos presentaron una baja resistencia al herbicida ALS flucarbazone (Tabla 4). Los resultados obtenidos en estos biotipos de cola de zorro sugieren que la resistencia a herbicidas ACCasa está más extendida a los FOP que a DIM y que ha evolucionado menos a los ALS. No obstante, de continuar desarrollándose a los ACCasa y ALS, podría llegar a significar una disminución importante de los herbicidas disponibles para su control.

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Tabla 3. Porcentaje de los biotipos de avenilla y cola de zorro resistentes a los herbicidas inhibidores de ACCasa y ALS. ACCasa ALS

FOP DIM DEN SU ST Maleza gramínea dic clo hal tep pin iod+mes flu A. fatua 100 71 64 7 14 0 0 C. echinatus n.e 100 94 94 n.e. n.e. 94 dic: diclofop; clo: clodinafop; hal: haloxyfop; tep: tepraloxydim; pin: pinoxaden; iod+mes: iodosulfuron+mesosulfuron; flu: flucarbazone; n.e: indica no evaluado.

Tabla 4. Índices de resistencia de los biotipos de avenilla y cola de zorro a los herbicidas inhibidores de ACCasa y ALS.

ACCasa ALS

clodinafop haloxyfop tepraloxydim pinoxaden Flucarbazone A. fatua DL50 IR DL50 IR DL50 IR DL50 IR DL50 IR Sensible 11 - 18,1 - 9,8 - 11 - 7,3 - AF-2 >216 > 20 71,4 3,9 42 2,2 29 2,6 7,7 1,1 AF-3 >216 > 20 84,8 4,7 14 1,4 14 1,3 6,2 0,8 AF-14 >216 > 20 90,6 5,0 12 1,2 18 1,6 6,4 0,9 C. echinatus DL50 IR DL50 IR DL50 IR DL50 IR DL50 IR Sensible 12,3 - 18 - 32 - - - 13,6 - CE-10 187 15 198 11 150 4,7 - - 27,2 3 CE-17 >216 >18 265 14,7 448 14 - - 65,3 5,8 CE-18 176 14 252 14 269 8,4 - - 20,4 2,5 CE-19 >216 >18 254 14,1 307 9,6 - - 68,4 2,9

DL50: dosis letal media; IR: índice de resistencia Ballica (L. multiflorum y L. rigidum). En ballica, trabajando con 15 biotipos de L. multiflorum ( LM-6, LM-16, LM-19, LM-20, LM-22, LM-26, LM-27, LM-28, LM-29, LM-30, LM-31, LM-33, LM-34, LM-45, LM-54) y 4 de L. rigidum (LR-10, LR-23, LR-24, LR-25) y aplicando cada herbicida inhibidor de ACCasa e inhibidor de ALS en una dosis superior al 50% de la recomendada, se encontró resistencia a ambos grupos de herbicidas (Tabla 5). La mayoría de los biotipos de L. multiflorum presentaron resistencia a los herbicidas ACCasa del grupo FOP diclofop, clodinafop y haloxyfop, aproximadamente la mitad presentó resistencia a los herbicidas del grupo DIM tepraloxydim y clethodim, mientras que un bajo porcentaje de biotipos fue resistente a pinoxaden (grupo DEN). Más de la mitad de los biotipos de L. multiflorum también presentó resistencia a los ALS, aunque fue más generalizada a los herbicidas iodosulfuron y iodosulfuron+mesosulfurons del grupo de las sulfonilureas que al herbicida flucarbazone del grupo de las sulfonilcarbonil-triazolinonas (Tabla 5). En bioensayos de dosis respuesta en los biotipos de L. multiflorum LM-16, LM-19 y LM-20, se confirmó en todos la resistencia al herbicida ACCasa clodinafop (FOP), sin embargo todos fueron sensibles a tepraloxydim (DIM) y sólo uno de los tres biotipos fue resistente a pinoxaden (DEN). Por otra parte, dos de los tres biotipos fueron resistentes a los herbicidas ALS flucarbazone y iodosulfuron+mesosulfuron. El nivel de resistencia fue alto a diclofop y

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flucarbazone y más bajo a iodosulfuron+mesosulfuron, mientras que leve a pinoxaden (Tabla 6). KUK et al. (2008) trabajando con 25 biotipos de L. multiflorum provenientes del Sur de EE.UU. encontraron que la mayoría de los biotipos fueron resistentes a los FOP, un 20% a pinoxaden (DEN) y sensibles a los DIM. Sólo un biotipo fue resistente a ALS. En los biotipos de L. rigidum también se encontró resistencia a los ACCasa y ALS. Sin embargo, los cuatro biotipos fueron resistentes a los herbicidas ALS flucarbazone y iodosulfuron+mesosulfuron y a los herbicidas ACCasa diclofop (FOP) y haloxifop (FOP) (Tabla 5). En bioensayos de dosis respuesta en los biotipos de LR-10 y LR-25, se confirmó en ambos la resistencia a diclofop, flucarbazone y iodosulfuron + mesosulfuron. Cabe destacar que el biotipo LR-25 presentó un alto nivel de resistencia a todos los herbicidas ACCAsa y ALS evaluados (Tabla 6). HEAP y KNIGHT (1990) señalan que una característica de la resistencia en L. rigidum, es la resistencia cruzada a herbicidas con otro modos de acción. BROSTER y PRATLEY (2006), en la principal zona productora de trigo en el sur Australia, encontraron que la mayoría de los biotipos de L. rigidum (77%) fueron resistentes a FOP y un porcentaje menor (22%) resistente a DIM. Los resultados obtenidos en los biotipos de L. multiflorum y L. rigidum provenientes de la zona sur tienen gran importancia, ya que de continuar la evolución de resistencia a ACCasa y ALS, las opciones de herbicidas disponibles para controlar los biotipos resistentes podrían llegar a ser muy limitadas en el corto plazo en trigo y otros cultivos extensivos. Tabla 5. Porcentaje de los biotipos de ballica resistentes a los herbicidas inhibidores de ACCasa y ALS. ACCasa ALS

FOPs DIMs DEN Sulfunilureas ST Maleza gramínea dic clo hal tep cle pin iod iod+mes flu L. multiflorum 85 92 100 57 60 33 80 73 50 L. rigidum 100 75 100 50 50 50 100 100 100 dic: diclofop; clo: clodinafop; hal: haloxyfop; tep: tepraloxydim; cle: clethodim; pin: pinoxaden; iod: iodosulfuron; iod+mes: iodosulfuron+mesosulfuron; flu: flucarbazone. n.e: indica no evaluado.

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Tabla 6. Índices de resistencia de los biotipos de ballica a los herbicidas inhibidores de ACCasa y ALS.

ACCasa ALS diclofop tepraloxydim pinoxaden Flucarbazone Iod+mes

L. multiflorum DL50 IR DL50 IR DL50 IR DL50 IR DL50 IR Sensible 26,2 - 7,08 - 6,6 - 2,6 2,5 - LM-16 >3360 128 6,3 0,9 12,6 1,9 2,9 1,1 2,76 1,1 LM-19 >3360 128 5,6 0,8 25,0 3,8 >632 >243 21,4 8,6 LM-20 2470 94 4,8 0,7 13,6 2,1 >632 >243 96,6 39 L. rigidum DL50 IR DL50 IR DL50 IR DL50 IR DL50 IR Sensible 28 - 14,5 16,6 - 37,2 - 7,2 - LR-10 >3360 128 20,6 1,4 18,6 1,2 130 3,5 >144 5,1 LR-25 >3360 128 740 51 >300 18 >632 17 37 20 DL50: dosis letal media; IR: índice de resistencia; iod+mes: iodosulfuron+mesosulfuron. Resistencia a glifosato Antes de la siembra de los cultivos, el herbicida más utilizado durante muchos años para controlar malezas gramíneas y hoja ancha, anuales y perennes, ha sido glifosato, un inhibidor de la enzima 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSFs) introducido a fines de los setenta. La inhibición de la EPSFs reduce la síntesis de los aminoácidos aromáticos (fenilalanina, tirosina y triptófano), lo cual altera la producción de proteínas y previene la formación de compuestos secundarios. Durante muchos años se pensaba que la resistencia a glifosato nunca iba a ocurrir, atribuible a sus propiedades únicas, tales como mecanismo de acción, metabolismo, estructura química y falta de actividad residual en el suelo (BRADSHAW et al, 1997). Sin embargo, desde que se confirmó el primer caso de resistencia a glifosato en Lolium rigidum, en Australia (PRATLEY et al., 1996), se han reportado nuevos casos en 16 especies de malezas en diversos países (HEAP, 2009). En Chile, se han documentado siete biotipos resistentes a glifosato, todos en ballica (L. multiflorum). Los primeros biotipos (dos) se detectaron en viñedos en la zona central (PÉREZ y KOGAN 2003) y en barbecho químico (uno) para cereales en la zona sur (ESPINOZA et al., 2005). Los otros biotipos (cuatro) se detectaron en cultivos de trigo en la zona sur (ESPINOZA et al., 2008) (Tabla 7). En la zona sur, el primer biotipo de L. multiflorum resistente a glifosato fue Vil-1, detectado en la localidad de Vilcún, Región de La Araucanía, desde un sitio con un historial de aplicaciones reiteradas de glifosato (12 veces durante el periodo 1989-2001), antes de sembrar trigo o avena con labranza cero y mínima. En bioensayos de dosis respuesta este biotipo presentó resistencia a los herbicidas ALS iodosulfuron y flucarbazone (ESPINOZA et al., 2005; VALVERDE, 2007). Los últimos biotipos de L. multiflorum resistente a glifosato corresponden al LM-30, LM-33, LM-45 y LM-54 (Tabla 7). En bioensayos de dosis respuesta realizados en LM-30, LM-33, LM-45, se encontró que los tres biotipos fueron resistentes a haloxyfop, dos biotipos fueron resistentes a tepraloxydim y un biotipo fue resistente a clethodim. Los tres biotipos fueron resistentes al ALS iodosulfuron, aunque la resistencia fue baja, excepto en un biotipo. Ninguno de los biotipos fue resistente a la mezcla de herbicidas ALS imazamox+imazapyr. La resistencia múltiple a glifosato y a herbicidas con otros

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mecanismos de acción les confiere a estos biotipos de L. multiflorum chilenos una característica particular, ya que en el mundo no se ha reportado (HEAP, 2009). Tabla 7. Biotipos de L. multiflorum resistentes a glifosato en el sur de Chile. Biotipo Ubicación Situación

de colecta Año de colecta

Año de confirmación

Nivel de resistencia

Vil-1 Vilcún, Región de La Araucanía

Barbecho químico

2000 2002 4,6

LM-30 Purranque, Región de los Lagos

Trigo 2006 2008 > 68

LM-33 San Juan de la Costa, Región de Los Lagos

Trigo 2006 2008 22

LM-45 Perquenco, Región de La Araucanía

Cebada 2007 2008 9

LM-54 Lautaro, Región de La Araucanía

Trigo 2007 2008 9,2

Tabla 8. Índices de resistencia a herbicidas inhibidores de ACCasa y ALS de los biotipos de ballica (L. multiflorum) resistentes a glifosato.

ACCasa ALS haloxyfop tepraloxydim clethodim iodosulfuron Imax+imar

Biotipo

DL50 IR DL50 IR DL50 IR DL50 IR DL50 IR Sensible 13,3 - 14 - 18,4 - 3.5 - 0.2 -

LM-30 >248 >19 63 4,5 205 11 10.1 2,9 0.23 1,2

LM-33 71 5,4 15 1,1 20 1,1 9.6 2,8 0.28 1,4

LM-45 >248 >19 134 9,6 140 7,4 21.1 6 0.2 1,1

DL50: dosis letal media; IR: índice de resistencia; imax+imar: imazamox+imazapyr Principales causas

Sistema de cultivo. El sistema de cultivo practicado por los agricultores durante las dos últimas décadas, se ha caracterizado fundamentalmente por un uso intensivo de cultivos anuales, tendencia al monocultivo de cereales principalmente trigo y siembra con labranza cero (Figura 5). Esto ha implicado una dependencia absoluta del herbicida glifosato para controlar malezas antes de la siembra y de los herbicidas ACCasa y ALS después de la siembra. Lo anterior ha significado incrementar la frecuencia de uso de los mismos herbicidas o con igual modo de acción para controlar malezas gramíneas. En Chile, el trigo es el cultivo anual más importante, sin embargo la superficie sembrada se concentra entre las regiones del Bio Bio y La Araucanía (Figura 6), cultivándose casi en su totalidad bajo condiciones de secano. En la actualidad, la superficie sembrada alcanza las 280.00 ha (ODEPA, 2009).

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Figura 5. Sistema de siembra más utilizada en los últimos 5-10 años en el sur de Chile. (DÍAZ y ESPINOZA, 2006). Los datos fueron obtenidos de una encuesta realizada a agricultores con malezas gramíneas resistentes en sus campos de las regiones Del Bio Bio, La Araucanía, Los Rios y Los Lagos.

0

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20

30

40

50

60

70

80

90

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Labranza Cero labranza Mixto

Frecue

ncia (%)

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

Del Bío Bío La Araucanía Los Rios Los Lagos

Supe

rficie con

 cultivos anu

ales (H

ectáreas)

Trigo Avena Cebada Raps Lupino

Figura 6. Superficie sembrada con cultivos anuales en la zona sur. Cifras obtenidas del VII Censo nacional agropecuario.

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Características de los herbicidas ACCasa y ALS. En muchos casos, las malezas han evolucionado resistencia a los herbicidas inhibidores de la enzima acetil-CoA carboxilasa (ACCasa) e inhibidores de la enzima acetolactato sintasa (ALS), después de cinco e incluso menos años de uso (MALLORY-SMITH et al., 1990; TARDIF, 1993). Durante los últimos 27 años se han reportado 36 especies de malezas gramíneas resistentes a herbicidas ACCasa en el mundo (HEAP, 2009). Por otra parte, en sólo 22 años, 102 especies desarrollaron resistencia a ALS, de las cuales 21 son gramíneas. El gran número de especies y la velocidad con que se ha desarrollado resistencia a los ACCasa y ALS explican que estos herbicidas sean considerados de alto riesgo para el desarrollo de resistencia (MOSS, 2007). Según FISHER et al. (2008) la resistencia a ACCasa y ALS es frecuente y rápida de seleccionar debido a que son posibles muchas mutaciones. Desde su introducción, a fines de los 70, los herbicidas ACCasa se han utilizado ampliamente para el control pos-emergente de malezas gramíneas en trigo, cebada, lupino y canola en el país (Tabla 9). Antes de que se confirmara la resistencia a ellos, los más utilizados en trigo fueron diclofop y clodinafof, y en cultivos de dicotiledóneas como canola y lupino fueron haloxyfop y fluazifop butil, entre otros ACCasa. Los herbicidas ALS con acción de control de malezas gramíneas en pos-emergencia y recomendados en trigo y otros cereales, son de reciente introducción, ya que el primero fue iodosulfuron, introducido recién en 2001 (Tabla 10). Los ALS también se han empleado masivamente desde su introducción al país debido a que representan una alternativa para el control eficaz de biotipos de malezas gramíneas resistentes a los ACCasa. Lamentablemente, las malezas gramíneas no sólo han evolucionado resistencia a ALS sino que también más rápidamente. Al respecto, es importante señalar que en el sur del país tardó aproximadamente 10 años de uso continuado para que se desarrollara resistencia a ACCasa en ballica y avenilla. Por el contrario, antes de la comercialización del ALS iodosulfuron, ya existian algunos biotipos de ballica resistentes a él. Tabla 9. Herbicidas ACCasa utilizados en cereales y otros cultivos.

Nombre común

Nombre comercial Grupo químico

Año de introducción

diclofop Cascabel 28 EC, Iloxan 28 EC FOP 1978 haloxyfop Galan Plus FOP 1985 fluazifop Hache Uno 2000 175 EC FOP 1987 clodinafop Topik 240 EC, Hummer 240 EC FOP 1990 clethodim Centurión 240 EC DIM 1998 tepraloxydim Aramo DIM 2005 pinoxaden Axial 050 EC DEN 2007

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Tabla 10. Herbicidas ALS utilizados en cereales.

Nombre común

Nombre comercial

Grupo químico Año de introducción

iodosulfuron metil sodio Hussar 20 WG, Ovassion 5.26 WP

Sulfunilureas (SU) 2001

flucarbazone Vulcano 70% WG

Sulfonil-aminocarbonil-triazolinona

2002

iodosulfuron metil sodio + mesosulfuron

Cossack 150 WG Sulfunilureas (SU) 2004

imazamox+Imazapyr Eurolightning Imidazolinonas (IMI) 2008 pyroxulam Admitte Triazolopirimidinas 2008

Características de las malezas. Las caracteristicas inherentes a cada especie de msaleza gramínea (A. fatua, L. multiflorum, L. rigidum y L. multiflorum), las que ya fueron analisadas, han contribuido también de modo importante en la evolución de resistencia. Agradecimientos Parte de los trabajos realizados fueron financiados por el Proyecto FONDEF D04i1022. Bibliografia ALEMSEGED Y, JONES, R.E.; MEDD, R.W. (2001). A farmer survey of weed management and herbicide resistance problems of winter crops in Australia. Plant Protection Quarterly 16, 21–25. BECKIE, H.J.; THOMAS, A.G.; STEVENSON, F.C. (2002). Survey of herbicideresistant wild oat (Avena fatua) in two townships in Saskatchewan. Can. J. Plant Sci. 82:463–471. BECKIE, H.; KIRKLAND, K. (2003). Implication of Reduced Herbicide Rates on Resistance Enrichment in Wild Oat (Avena fatua). Weed Technology 17(1): 138-148. BOSQUE, J.L.; RECASENS, J.; PLANES, J.; TABERNER, A. (2002). La resistencia a herbicidas en poblaciones de vallico (Lolium rigidum) I: tipología y distribución. Phytoma España (143):46-51. BRADSHAW, L.D.; PADGETTE, S.R.; Kimball, S.L.; WELLS, B.H. (1997). Perspectives on glyphosate resistance. Weed Technology 11:189–198. BROSTER, JC.; PRATLEY, J.E. (2006). A Decade of Monitoring Herbicide Resistance in Lolium Rigidum in Australia. Australian Journal of Experimental Agriculture 46, 1151-1160.

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MECANISMOS DE RESISTENCIA DE LAS MALEZAS A LOS HERBICIDAS

J. L. De Prado, H. Cruz-Hipolito y R. De Prado Universidad de Córdoba, Campus de Rabanales, Córdoba, España qe1pramr@uco.es Resumen: La introducción de las auxinas sintéticas fue una revolución en la agricultura mundial para controlar las malas hierbas dicotiledóneas en cereales. A partir de ese momento las compañías de agroquímicos invirtieron cuantiosas sumas en producir nuevos herbicidas para controlar diferentes especies de malas hierbas en distintos cultivos. Sin embargo, una de las desventajas del uso de estos productos es la evolución de malas hierbas resistentes a herbicidas. La última revisión realizada por el Dr. Ian Heap (2009) señala 331 biotipos resistentes pertenecientes a 189 especies, de las cuales 113 son dicotiledóneas y 76 monocotiledóneas, distribuidas en más de 300.000 campos. El conocimiento de los procesos biológicos responsables de la resistencia a herbicidas en una determinada mala hierba es fundamental para el diseño de una estrategia de control. Dependiendo del tipo de mecanismo de resistencia detectado, la mala hierba presentará un patrón específico en su tolerancia a herbicidas que podrá variar desde un alto grado de resistencia a determinados compuestos de una misma familia química, a una moderada resistencia a un amplio espectro de herbicidas. La resistencia a herbicidas puede deberse a dos mecanismos básicos, aquellos referidos al sitio de acción por pérdida de afinidad entre la proteína de enlace y el herbicida o por una sobreexpresión de esa proteína. El segundo grupo de mecanismos básicos pertenecen a aquellos donde no está involucrado el sitio de acción, también llamados mecanismos por exclusión del herbicida, principalmente debido a un incremento de la detoxificación metabólica del herbicida en productos no tóxicos y en una falta de absorción / penetración del herbicida y posterior pérdida de transporte vía xilema / floema del herbicida a la proteína de enlace. En el presente capitulo se realiza una revisión de los mecanismos involucrados en la resistencia de las plantas a los herbicidas, haciendo mayor referencia a aquellos que no están involucrado al sitio de acción. Palabras clave: Resistencia, herbicidas, malezas, mecanismos, sitio de acción. Summary: Mechanism of herbicide resistance in weeds. The introduction of synthetic auxins caused a revolution in the agricultural world in the effective and economic control of broad-leaved weeds in cereals. From that moment on, agrochemical companies invested huge sums in producing new herbicides to control different weed species in different crops. However, one of the disadvantages of the continued use of these products was the evolution/selection of weeds tolerant/resistant to herbicides. The last review made by Dr. Ian Heap (2009) pointed to 331 resistant biotypes belonging to 189 species, 113 of which are dicotyledons and 76 monocotyledons, distributed over more than 300,000 places in the world. Knowledge of the biological processes responsible for resistance to herbicides in a specific weed is fundamental for the design of a control strategy. Depending on the type of resistance mechanism detected, the weed will present a certain pattern in its tolerance to herbicides, which may vary from a high degree of resistance to specific compounds of a chemical family to a moderate resistance to a wide spectrum of herbicides. Herbicide resistance may be due to two basic mechanisms; those referring to the target site, either from a loss of affinity

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between the linking protein and the herbicide, or from an overexpression of that protein. The second group of basic mechanisms belong to those in which the target site is not involved, also called herbicide exclusion mechanisms, mainly because of an increase in the metabolic detoxification of the herbicide in non toxic products and of a lack of absorption/penetration of the herbicide and a subsequent loss of transport via the xylem/phloem of the herbicide at the linking protein. In this chapter a review of the mechanisms involved in the resistance of plants to herbicides is made, making a greater reference to those not involved in the target site. Key words: Resistance, herbicides, weeds, mechanisms, target sites. Introducción Durante la década de 1940, la introducción de los herbicidas auxínicos, mostró a los agricultores el potencial de los herbicidas para controlar las malas hierbas de hoja ancha en cultivos herbáceos. El uso de estas auxinas sintéticas indujo a las compañías de agroquímicos, a invertir en investigación para sintetizar nuevas moléculas para distintos cultivos y malas hierbas. La comprobada eficacia de los herbicidas modernos les permite a los agricultores producir sus cultivos de forma reiterada y rentable en los mismos terrenos y optimizar sus ingresos. Sin embargo, una de las desventajas del uso de estos productos es la evolución de malas hierbas resistentes a herbicidas. Aunque existen un número de herbicidas generales o totales que resultan activos frente a cualquier tipo de planta, no cabe duda que, hoy día, los más importantes tanto cualitativa como cuantitativamente, son los herbicidas específicos o productos capaces de controlar un amplio espectro de malas hierbas sin afectar a los cultivos a los que se aplican. La selectividad puede deberse a causas físicas o, más frecuentemente, bioquímicas (JÄGER, 1983), siendo en este último caso consecuencia de las diferencias genéticas existentes entre distintas especies vegetales. Tal acción selectiva supone que determinadas especies de plantas cultivadas, y también de malas hierbas, son capaces de vivir y crecer a las dosis recomendadas de aplicación agrícola del herbicida, aunque puedan ser controladas a dosis varias veces superiores. Este tipo de respuesta se conoce generalmente como tolerancia natural y ha sido definida por la HRAC (Herbicide Resistance Action Committee) como la habilidad/aptitud heredable de una especie vegetal a sobrevivir y reproducirse después de un tratamiento, pudiendo considerarse como una característica a nivel de especie. Sin embargo, la variabilidad genética puede darse de forma intraespecífica. Debido a este hecho y como consecuencia de la presión selectiva impuesta por la aplicación continuada de herbicidas que caracteriza a los modernos sistemas de producción agrícola, es posible el desarrollo de biotipos de malas hierbas que dejan de ser controlados por un determinado producto al que originalmente eran susceptibles. Tal respuesta se conoce generalmente como resistencia, siendo una característica adquirida por una población (biotipo) de una especie que carecía de ella y ha sido definida por la HRAC como la habilidad/aptitud heredable de una especie vegetal a sobrevivir y reproducirse después del tratamiento de un herbicida a dosis normalmente letales para la misma especie susceptible. En una planta, la resistencia puede ocurrir de una forma natural o puede ser inducida por técnicas como la ingeniería genética o selección de variantes resistentes obtenidas por cultivos de tejidos o mutagénesis. Esta definición, bastante completa en sí, presenta el problema de que se asume que la resistencia está asociada únicamente a factores de tipo fisiológico y/o morfológico (MAXWELL y MORTIMER, 1994). A diferencia de las plantas tolerantes,

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las resistentes suelen sobrevivir no sólo a las dosis de aplicación agrícola del herbicida sino a otras bastante superiores (DE PRADO et al., 1996). El término de tolerancia se usa frecuentemente no sólo para referirse a variaciones entre especies, sino también en relación con la variabilidad dentro de una especie (LEBARON y GRESSEL, 1982). En este caso, tolerancia y resistencia son expresiones que denotan diferencias en intensidad de un mismo fenómeno, considerándose la resistencia como un caso extremo y menos frecuente de tolerancia (HOLT y LEBARON, 1990) o considerando la tolerancia un mecanismo poligénico y la resistencia uno monogénico (GRESSEL, 1985). El término resistencia suele ir adjetivado con diversos modificadores que hacen alusión a la posible pluralidad existente tanto en los mecanismos de resistencia que posee un individuo como en los herbicidas a los que éste es resistente. Surgen así los conceptos de resistencia cruzada y resistencia múltiple. Dependiendo de los autores consultados, estas definiciones se asociarán a mecanismos de resistencia (JUTSUM y GRAHAM, 1995): - Resistencia cruzada: Aquella por la que un individuo es resistente a dos o más

herbicidas debido a un solo mecanismo de resistencia. - Resistencia múltiple: Aquella por la que un individuo posee más de un mecanismo

de resistencia a uno o varios herbicidas. La resistencia cruzada negativa se refiere a aquellos casos en que un biotipo resistente a un herbicida exhibe un aumento en la sensibilidad a otros herbicidas con distinto modo de acción o de degradación (DE PRADO et al., 1992). Por último, los cultivos resistentes a herbicidas, son cultivos que poseen genes insertos que les confieren resistencia a cierto herbicida al que habían sido previamente sensibles. Las características de las malas hierbas y del herbicida influyen en la tasa de evolución de la resistencia. En el caso de la mala hierba, las características más importantes son la frecuencia de genes, el tamaño y la viabilidad del banco de semillas del suelo y la adaptabilidad al medio. En el herbicida se deben considerar factores como eficacia, dosis, frecuencia de aplicación y persistencia en el suelo. La importancia relativa de estos factores se ha tratado de determinar mediante el uso de modelos (GRESSEL y SEGEL, 1990; MORRISON y FRIESEN, 1996). Estos modelos y la experiencia práctica indican que el factor principal en la evolución de la resistencia es la presión de selección impuesta por el herbicida. En la práctica, la presión de selección depende de la dosis de herbicida utilizada, su eficacia y la frecuencia de aplicación. Por lo tanto, se puede disminuir la presión de selección mediante la aplicación de mezclas de herbicidas con distintos mecanismos de acción y degradación que sean eficaces contra el mismo espectro de malas hierbas (WRUBEL y GRESSEL, 1999). La rotación de herbicidas basados en estos mismos criterios también atenúa la presión de selección. Los herbicidas persistentes imponen una mayor presión de selección que los no persistentes. La disminución de la dosis de herbicida puede agravar los problemas en vez de disminuirlos porque puede propiciar la selección de resistencia poligénica, es decir la resistencia que depende de más de un gen y se manifiesta como un incremento progresivo en el grado de resistencia de la planta de una generación a la siguiente (COUSENS y MORTIMER, 1995).

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Cada especie tiene una constitución genética particular y se considera que los genes de resistencia están presentes en las poblaciones silvestres, aunque en una proporción muy baja. Si la presión de selección asociada a la frecuencia de uso es la misma para dos herbicidas, entonces la frecuencia inicial de genes influirá sobre el tiempo requerido para que se detecten individuos resistentes. Se estima que la frecuencia de genes de resistencia a las triazinas, que se heredan a través del genoma de los plástidos, es de aproximadamente 10-8 (GRESSEL, 1991), mientras que la de las sulfonilureas es de alrededor 10-6 (CHALEFF y DAY, 1984). Esta proporción se incrementa conforme la presión de selección aumenta por el uso continuado del mismo herbicida o de compuestos que pertenecen a la misma familia química o que comparten el mismo modo de acción, o de herbicidas que son metabolizados de manera similar en la planta. A medida que aumenta la tasa de mortalidad obtenida con el herbicida, aumenta también la presión de selección. El tiempo requerido para que se reconociera la resistencia a clorsulfurón y simazina en el campo fue de 3-5 años y 10 años, respectivamente, lo que refleja la estimación inicial de la frecuencia de genes (MAXWELL y MORTIMER, 1994). La última revisión realizada por HEAP (2009) (www.weedscience.com) señala 331 biotipos resistentes pertenecientes a 189 especies, de las cuales 113 son dicotiledóneas y 76 monocotiledóneas distribuidas en más de 300.000 campos (Tabla 1). Tabla 1. Resumen de malezas resistentes a herbicidas (HEAP, 2009). Grupo de herbicidas Modo de Acción Grupo

HRAC Ejemplo de Herbicidas

Total

Inhibidores de la ALS Inhibición de la acetolactato sintetasa ALS (acetohidroxiácido sintetasa AHAS)

B

Clorsulfuron 101

Inhibidores del Fotosistema II

Inhibición de la fotosíntesis en el fotosistema II

C1

Atrazina 68

Inhibidores de la ACCasa

Inhibición de la acetil coenzima carboxilasa (ACCasa)

A

Diclofop-metil

36

Auxinas Sintéticas Auxinas sintéticas (como la acción del ácido indolacético AIA)

O

2,4-D 28

Bipiridilos Desviación del flujo electrónico en el fotosistema I

D

Paraquat 24

Ureas y Amidas Inhibición de la fotosíntesis en el fotosistema II

C2

Clorotoluron 21

Glicinas Inhibición de la EPSP sintasa G Glifosato 16 Dinitroanilinas y otros

Inhibición de la unión de los microtúbulos en la mitosis

K1

Trifluralina 10

Tiocarbamatos y otros

Inhibición de la síntesis de los lípidos (no ACCasa)

N

Trialato 8

Triazoles, Ureas, Isoxazolidionas

Decoloración: inhibición de la síntesis de los carotenoides (punto desconocido)

F3

Amitrol 4

Inhibidores de la PPO Inhibición de la protoporfirinógeno oxidasa (PPO)

E

Oxifluorfen 3

Cloroacetamidas y otros

Inhibición de la división celular K3

Butaclor 3

4

Inhibidores de la biosíntesis de Carotenoides

Decoloración: inhibición de la síntesis de los carotenoides a nivel de la fitoeno desaturasa (PDS)

F1

Flurtamon 2

Acidos arilaminopropiónicos

Desconocido Z

Flamprop-metil

2

Nitrilos y otros Inhibición de la fotosíntesis en el fotosistema II

C3

Bromoxinil 1

Inhibidores de la Mitosis

Inhibición de la mitosis K2

Profam 1

Inhibidores de celulosa

Inhibición de la síntesis de la pared celular (celulosa)

L

Diclobenil 1

Desconocido Desconocido Z (cloro) - flurenol

1

Organoarsenicales Desconocido Z MSMA 1 Número total de biotipos resistentes. 331

El conocimiento de los procesos biológicos responsables de la resistencia a herbicidas en una determinada mala hierba es fundamental para el diseño de una estrategia de control (FISCHER, 2008; POWLES, 2009). Dependiendo del tipo de mecanismo de resistencia detectado, la mala hierba presentará un patrón específico en su tolerancia a herbicidas que podrá variar desde un alto grado de resistencia a determinados compuestos de una misma familia química, a una moderada resistencia a un amplio espectro de herbicidas. Asimismo el conocimiento de estos mecanismos nos permitirá prever la posible respuesta de la población resistente al conjunto de mecanismos químicos/mecánicos/culturales seleccionados para su control, la efectividad a corto y largo plazo de los mismos y la posible aparición de nuevos problemas. Actualmente hay más de 900 plaguicidas y casi 600 ingredientes activos en el mercado (HALL et al., 2001). Millones de toneladas de plaguicidas se aplican anualmente, se ha estimado que un pequeño porcentaje de estos productos alcanzan el organismo diana depositando el resto en el suelo y en otros organismos, así como a la atmósfera y al agua (PIMENTAL y LEVITAN, 1986).

La degradación abiótica es debida a una transformación química y física del plaguicida por procesos como la fotólisis, hidrólisis, oxidación y reducción. Además, los plaguicidas pueden no estar disponibles biológicamente debido a la compartimentalización que ocurre como resultado de una adsorción del plaguicida al suelo y a los coloides sin alterar la estructura original de la molécula plaguicida. Sin embargo, las reacciones enzimáticas que son principalmente el resultado de procesos bióticos mediados por plantas y microorganismos es la ruta de detoxificación más importante. Existen al menos cinco mecanismos generales, no necesariamente excluyentes que podrían justificar la resistencia a herbicidas (SHERMAN et al., 1996). De todos los mecanismos detectados en malezas el/los cambio/s aminoacidico/s que conlleva un cambio estructural en el sitio de acción (proteína) y una perdida de afinidad por el herbicida, es el mecanismo más determinante en malezas resistentes (Figura 1). La sobreexpresion de esta proteína no es un mecanismo bien conocido y de forma natural no ha sido detectado en malezas. Sin embargo si ha sido utilizado en OMG (Organismos Modificados Genéticamente), en cultivos resistentes a glifosato.

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Figura 1. Mecanismos de resistencia de las plantas a los herbicidas dependiente del sitio de acción. En la figura: representa la proteína diana, la proteína diana modificada y la molécula herbicida. La figura 2 muestra el diferente comportamiento de un herbicida entre una planta sensible y una resistente (R), pudiéndose observar que en la maleza R cambios fisiológicos (cambios en la cutícula y/o menor movimiento del herbicida vía xilema o floema) y/o una mayor actividad enzimática capaz de inactivar el herbicida hacen que la maleza sobreviva al herbicida.

Figura 2. Mecanismos de resistencia de las plantas a los herbicidas independiente del sitio de acción.

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Resistencia de sitio de acción Pérdida de afinidad por el sitio de acción. Los herbicidas resultan letales para las plantas debido a su actuación sobre un sitio de acción primario, generalmente una proteína, de especial relevancia biológica (Figura 3 y 5). Este sitio primario suele ser específico y la acción del herbicida sobre él (efecto primario), suele conducir al desarrollo de efectos secundarios, de naturaleza mucho más general que normalmente acaban produciendo la muerte de la planta (CORBETT et al., 1994). Una o varias mutaciones en la secuencia aminoacídica del sitio primario de acción pueden resultar en una pérdida de afinidad del herbicida por éste, imposibilitando la unión efectiva de ambos e impidiendo así la continuidad del proceso vital mediado por dicho sitio (GRONWALD, 1994, DÉLYE et al., 2005, WHALEY et al., 2007). Este tipo de mecanismo, caracterizado en la mayoría de los biotipos resistentes descritos hasta el momento, se caracteriza por conferir un alto grado de resistencia al herbicida empleado, pudiéndose extender ésta a otras moléculas pertenecientes a la misma familia química (CRUZ-HIPOLITO et al., 2009a). Resistencia fuera del sitio de acción Metabolización a compuestos no tóxicas. La degradación de los herbicidas a compuestos no fitotóxicos es la base de la selectividad que presentan muchas materias activas en cultivos tolerantes frente a las malas hierbas sensibles (Figura 3). En los procesos de detoxificación metabólica, entendido como aquellos procesos biológicos en los que las moléculas fitotóxicas son metabolizadas a compuestos inocuos o menos tóxicos, los biotipos resistentes son capaces de degradar el herbicida antes de que éste cause daños irreversibles. La velocidad de degradación enzimática puede variar con factores endógenos y exógenos, tales como el estadío de crecimiento de la planta y las condiciones climáticas.

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Figura 3. Esquema de secuencias de la entrada de un herbicida desde su absorción / penetración hasta la unión a la proteína de enlace y posterior muerte de la planta (Adaptado de DEVINE et al., 1993). Los procesos de detoxificación metabólica de herbicidas en tejidos vegetales pueden dividirse en tres fases (SHIMABUKURO, 1985; HATZIOS, 1991) (Tabla 2). En la fase I (conversión) las propiedades iniciales del plaguicida de partida son transformadas a través de reacciones de oxidación, reducción o hidrólisis para producir un compuesto más soluble en agua y menos tóxico. La segunda fase implica la conjugación del herbicida o sus metabolitos con un azúcar, aminoácido o glutatión, incrementando su solubilidad en agua y reduciendo la toxicidad del compuesto. Generalmente, los metabolitos formados en la fase II tienen poca o nula fitotoxicidad y pueden ser almacenados en orgánulos celulares. La fase III implica la transformación de los metabolitos de la fase anterior a conjugados secundarios con nula fitotoxicidad (HATZIOS, 1991). Esta división no constituye una regla general dado que alguna de las fases puede no estar presente en los procesos de detoxificación; o la molécula herbicida puede ser un pro-herbicida inactivo que debe ser enzimáticamente convertido en un compuesto activo; o a veces ciertos procesos de conjugación son de carácter reversible, por lo que sólo afectan de manera parcial a la cantidad de herbicida libre intracelular.

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Tabla 2. Resumen de las tres fases del metabolismo de plaguicidas (Adaptado de SHIMABUKURO, 1985; DE PRADO et al., 2004) Características Propiedades

iniciales Fase I Fase II Fase III

Reacciones Compuesto inicial Oxidación, hidrólisis, reducción

Conjugación Conjugación secundaria o incorporación a biopolímeros

Solubilidad

Lipofílico

Anfofílico

Hidrofílico

Hidrofílico o insoluble

Fototoxicidad Tóxico Modificado o menos tóxico

Muy reducida o no tóxico

No tóxico

Movilidad Selectiva Modificada o reducida

Limitada o inmóvil

Inmóvil

Fase I o conversión. Si bien algunos herbicidas pueden ser conjugados directamente, muchos otros no poseen sustituyentes disponibles en sus moléculas (grupos amino, hidroxilo, sulfihidrilo, etc.) que pueden reaccionar para formar conjugados con constituyentes celulares. Dichos herbicidas deberán ser convertidos en metabolitos mediante algunas de las siguientes reacciones:

1. Hidrólisis: Estas reacciones están catalizadas por enzimas hidrolíticas

(esterasas, fosfatasas o amidasas, dependiendo del sustrato). En las transformaciones hidrolíticas se rompen los enlaces de un sustrato por adición a cada producto de H u OH proveniente del H2O. Hay muchas enzimas hidrolíticas capaces de metabolizar una gran variedad de sustratos particularmente aquellos que contienen grupos funcionales amida, carbamatos o éster. Estas enzimas pueden estar compartimentalizadas o ser extracelulares y las reacciones pueden ocurrir tanto en condiciones aerobias como anaerobias. La hidrólisis de enlaces éster de herbicidas han sido ampliamente estudiadas y revisadas en plantas y microorganismos (INCLEDON y HALL, 1997; HOAGLAND y ZABLOTOWICZ, 2001). La hidrólisis del enlace éster es llevada a cabo por esterasas y en menor medida por lipasas y proteasas. Con respecto a la hidrólisis de enlaces amida el propanil es el herbicida más estudiado. La base de la selectividad del arroz (Oryza sativa L.) es debida a los altos niveles que posee de la enzima aril acilamidasa, las cuales rompen el enlace amida formando ácido propiónico y 3,4-dicloroanilina (FREAR Y STILL, 1968).

2. Reducciones: La metabolización reductora de herbicidas es un proceso que

raramente se da en plantas, pudiéndose destacar únicamente la desaminación reductora de las s-triazinonas (metamitrona y metribuzina), en cultivos tolerantes y malas hierbas resistentes (FEDTKE, 1983).

3. Oxidaciones, oxigenaciones e hidroxilaciones: Todas ellas se pueden incluir

dentro del grupo denominado transformaciones oxidativas. La oxigenación es el primer paso más frecuente en la biotransformación de herbicidas siendo las hidroxilaciones las más observadas en plantas. La detoxificación por hidroxilación y la posterior formación

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de un conjugado glicósido son especialmente importantes como mecanismo de selectividad y resistencia a herbicidas en monocotiledóneas. Muchas de estas reacciones están mediadas por enzimas oxidativas por ejemplo. citocromo P450, que son las enzimas más importantes en la primera fase del metabolismo de un herbicida (BARRETT, 2000) (Figura 4). La regulación y expresión de P450 no se conocen bien en plantas, principalmente porque en las células que no están expuestas a ningún tipo de estrés fisicoquímico, fisiológico o xenobiótico las cantidades que se encuentran de esta enzima son muy pequeñas. Los agroquímicos pueden influir en los sistemas citocromo P450 actuando como efectores, modificando o regulando así el metabolismo de los herbicidas en una planta.

Figura 4. Ruta metabólica de detoxificación de isoproturon en Lolium rigidum. Además de las enzimas citocromo P450 las plantas producen otras enzimas oxidativas (peroxidasas, polifenoloxidasas, lacasas y tirosinasas) las cuales catalizan la polimerización de varias anilinas y fenoles (DEC y BOLLAG, 2001). Por ejemplo, las peroxidasas que median el metabolismo de herbicidas que funcionan de manera similar a las P450 incluye descarboxilaciones, oxidaciones sulfúricas, N-desmetilaciones, hidroxilaciones del anillo y oxidaciones aromáticas del grupo metilo (LAMOUREUX y FREAR, 1979). En plantas, a menudo las enzimas peroxidasas funcionan en la tercera fase del metabolismo por ejemplo. formación de residuos ligados. Amorocia lapathifolia Gilib. contiene en las raíces gran cantidad de peroxidasas.

Fase II ó conjugación. Los conjugados suelen ser los metabolitos finales en los procesos de detoxificación de herbicidas. La naturaleza de estos conjugados suele ser muy diversa, con azúcares, aminoácidos, péptidos y lignina como grupos orgánicos y enlaces de tipo éster, éter, tioéter, amida o glicosídico.

1. Conjugación con glutatión: Constituye un mecanismo de detoxificación de

gran importancia en muchos tejidos vegetales. Se trata de una sustitución nucleofílica en el que el anión glutatión GS- sirve de nucleófilo, actuando los grupos cloro, p-nitrofenol o alquil-sulfóxido como posibles grupos a sustituir en la molécula herbicida (LAMOUREUX y FREAR, 1987).

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La conjugación con glutatión está catalizada por una familia de enzimas glutatión-S-transferasas más o menos específicas que se encuentran de manera constitutiva o inducible en muchos tejidos vegetales (DEVINE et al., 1993) (Figura 5).

Figura 5. Ruta metabólica de detoxificación de fenoxaprop-etilo en Lolium rigidum.

2. Conjugación con aminoácidos: De forma general, la hidrólisis del glutatión en este tipo de conjugados suele producir un conjugado de cisteína, el cual puede ser posteriormente malonizado. Sin embargo, en el caso del herbicida clorfemprop sólo el conjugado de cisteína y no el de glutatión ha sido descrito en trigo (PONT Y COLLET, 1980), siendo posible que la císteína pueda actuar como nucleófilo en una reacción de conjugación similar a la descrita en el glutatión.

3. Conjugación con azúcares: Los conjugados glicósidos más frecuentemente

encontrados en plantas son los ß-D-glucopiranósidos, junto con los N-glicósidos, O-glicósidos y ésteres de glucosa (Fig. 6). Este tipo de reacciones está catalizada por glucosil-transferasas que utilizan UDP-glucosa como donante de glucosa (MANSAGER et al., 1983). De todas estas reacciones, la formación de O-glucósidos es la más común, la cual sigue normalmente a la introducción de grupos hidroxilo en la molécula herbicida por monooxigenación.

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Figura 6. Ruta metabólica de detoxificación de pendimetalina en Lolium rigidum resistente a dinitroanilinas. Fase III o deposición. La ruta metabólica seguida por un herbicida afecta de gran manera el uso final de los metabolitos terminales y conjugados. Los conjugados glicósidos son depositados en la vacuola donde quedan almacenados, mientras que los conjugados de origen aminoacídico son excretados a la pared celular donde se integran en el componente de lignina de éstas, formando un residuo insoluble (PILLMOOR et al., 1984) (Figura 7). Si bien estos procesos de deposición no son completamente irreversibles, la reentrada de los aglicones herbicidas o sus productos de conversión en el pool de herbicida activo intracelular es muy lenta (DEVINE et al., 1993). Como puede observarse en la figura el herbicida una vez que entra en la planta puede ser metabolizado (activando o desactivando el herbicida) y posteriormente pasar a la vacuola como material de deshecho o bien directamente pasar a la vacuola donde queda secuestrado y lentamente degradado. La resistencia a herbicidas por detoxificación es un proceso muy frecuente. Sin embargo, este mecanismo suele venir asociado a fenómenos de resistencia cruzada, lo que implica que un mismo individuo tiene la capacidad de metabolizar moléculas muy diferentes pertenecientes a diversas familias químicas. Esta moderada resistencia a un amplio espectro de productos hace extremadamente difícil el control de estos biotipos de malas hierbas mediante el sólo uso de métodos químicos. Resistencia asociada a procesos de secuestración o compartimentación. Los fenómenos de compartimentación entendidos como la secuestración del herbicida o sus metabolitos en un lugar específico de la célula, son mecanismos de resistencia/tolerancia poco conocidos debido a que las evidencias que los apoyan son en muchos casos circunstanciales (COUPLAND, 1991; OWEN, 1991). Los escasos casos en la bibliografía relacionan este tipo de mecanismos de resistencia con herbicidas de acción hormonal e inhibidores del fotosistema I, justificando la resistencia tanto en líneas de cultivos celulares como en plantas enteras como un incremento en la capacidad de secuestrar el herbicida o los metabolitos potencialmente fitotóxicos dentro de la vacuola celular (Figura 7). Sin embargo, los procesos subyacentes a estos mecanismos de secuestración son todavía desconocidos.

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Figura 7. Rutas metabólicas de detoxificación de herbicidas en malezas (Adaptado de DE PRADO y FRANCO, 2004). A: reacciones no sintéticas (oxidación, reducción, hidrólisis); B: reacciones sintéticas (naturaliza química del herbicida se modifica); C: secuestración del herbicida. Cyt P450: Citocromo P450; GT: glicosil transferasas; GST: glutatión-S-transferasas; : Molécula herbicida. Reducción de la concentración de herbicida en el sitio de acción. Una condición necesaria para lograr la efectividad de un herbicida es que éste alcance su sitio de acción en una concentración suficiente como para que su efecto sea letal. La falta de movimiento de un herbicida posibilitará reducir la concentración de éste en el sitio de acción, lo que permitirá al último mantenerse funcional. Estas bajas concentraciones pueden lograrse ya sea mediante una reducción en la penetración, absorción o translocación o por la existencia de fenómenos de secuestración en orgánulos celulares más o menos translocables. La falta de absorción/penetración/translocación de herbicidas es básicamente un mecanismo de tolerancia existente en numerosos cultivos y algunas malas hierbas (HESS, 1985; DE PRADO et al., 2001; MICHITTE et al., 2004; RUIZ-SANTAELLA et al., 2006; CRUZ-HIPOLITO et al., 2009b) (Tabla 2 y Figura 8). Aun cuando pueden estudiarse por separado, estos mecanismos resultan difíciles de diferenciar entre sí, dado que una absorción diferencial suele implicar una translocación diferencial, y una translocación diferencial puede derivar de la diferente degradación del herbicida en el sitio de absorción, la cual resulta en metabolitos más o menos translocables.

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Figura 8. Penetración y translocación de 14C-glifosato en plantas sensibles (izquierda) y tolerantes (derecha) a glifosato (CRUZ-HIPOLITO et al., 2009b). Las zonas coloreadas en rojo indican el movimiento de 14C-glifosato.

Reparación de efectos fitotóxicos. Algunos herbicidas ariloxifenoxipropanoatos (inhibidores de la enzima acetil coenzima A carboxilasa), como diclofop-metil y haloxifop, despolarizan el potencial de la membrana plasmática en células parenquimáticas de Avena sativa, Triticum aestivium, Lolium rigidum, etc. La capacidad despolarizadora del diclofop-metil se atribuye al flujo específico de protones que este compuesto produce hacia el interior de la célula (SHIMABUKURO y HOFFER, 1997) (Figura 9). Recientemente han sido identificados biotipos de malas hierbas cuyo mecanismo de resistencia al diclofop-metil parece ser debido a la capacidad de recobrar el potencial de membrana una vez que se ha retirado el herbicida causante de la despolarización (DE PRADO et al., 1999).

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Figura 9. Representación grafica de los múltiples efectos ocurridos en gramíneas tratadas con diclofop-metil (Adaptado de SHIMABUKURO y HOFFER, 1997). Agradecimientos Este trabajo ha sido financiado por el M.E.C (proyecto AGL2007-0835). Parte de este capitulo pertenece a la Tesis Doctoral de Don José L. De Prado Ruiz-Santaella. Bibliografía BARRETT, M. (2000). The role of cytochrome P450 enzymes in herbicide metabolism. En: “Herbicides and Their Mechanisms of Action”, (eds. Cobbs AH y Kirkwood RC), Sheffield, Great Britain, Sheffield Academic, pp. 25-37. CORBETT, J.R.; WRIGHT, R.; BAILIE, A.C. (1994). The biochemical mode of action of pesticides, (eds. Academic Press, London), 382 pp. COUSENS, R. ; MORTIMER, M. (1995). Dynamics of weed populations, Cambridge University Press, Cambridge, England, 332 pp.

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¿SE RELACIONA LA EVOLUCIÓN DE LOS MECANISMOS MULTIFACTORIALES DE RESISTENCIA A HERBICIDAS CON LA TOLERANCIA AL ESTRÉS?

Albert J. Fischer1; Danijela Pavlovic2; Hagai Yasuor1; Aldo Merotto Jr3. 1University of California, Davis - Department of Plant Sciences, One Shields Ave., Davis, CA

95616, ajfischer@ucdavis.edu 2Institute for Plant Protection and Environment, Teodora Drajzera 9, Belgrade;

3UFRGS - Faculdade de Agronomia. Av. Bento Gonçalves, 7712. Cep 90501-970. Porto Alegre, RS.

Resumen: La Echinochloa phyllopogon es una de las principales malezas resistentes a herbicidas en cultivos de arroz en Califórnia. Esta resistencia ocurre simultáneamente para diferentes herbicidas tiocarbamatos e inhibidores de la ACCasa y ALS. Los biotipos resistentes también presentan elevada tolerancia a la inundación, resistencia baja a clomazone y menor susceptibilidad a paraquat. Un biotipo de Chenopodium album sobrevivente a atrazina en campos de maíz de Serbia expresa tolerancia al estrés hídrico y resistencia baja a atrazina. Ambos tipos de estrés causan daño fotooxidativo en plantas. La resistencia a herbicidas en estos biotipos es causada por mecanismos multifatoriales ajenos al sitio activo (ASA) que confieren elevada capacidad de detoxificación de herbicidas y posiblemente por otros mecanismos. Los sistemas cloroplásticos de fotoprotección y las enzimas detoxificadoras pueden conferir protección cruzada a estreses causados por el ambiente y por compuestos xenobióticos fotooxidativos. Por esto se hipotetiza que estos complejos mecanismos de resistencia ASA pueden representar una sobre regulación de las respuestas a estrés en biotipos adaptados a diversos ambientes estresados. Esta tolerancia cruzada puede estar sujeta a un control genético complejo, y bajos niveles de resistencia en plantas individuales pueden incrementarse por acumulación de genes menores o amplificación génica bajo selección recurrente a dosis subletales de herbicida. El manejo de malezas en ambientes estresados debe contemplar estrategias a priori a fin de contener la evolución de la resistencia causada por mecanismos ASA y para evitar que se evolucione de resistencias de bajo nivel hacia elevados niveles de resistencia ASA a herbicidas. Palabras clave: Echinochloa phyllopogon, Chenopodium album, tolerancia a la inundación, detoxificación, bajo nível de resistencia. Summary: Can the evolution of multifactorial herbicide resistance relate to stress tolerance? Echinochloa phyllopogon represents one of the worst herbicide resistance cases in a major crop weed and seriously compromises rice production in California. Resistance occurs simultaneously for several thiocarbamate, ACCase and ALS inhibitors. These R biotypes also exhibit enhanced submergence tolerance, low-level clomazone resistance, and low paraquat sensitivity. Moisture stress tolerance and low atrazine sensitivity was documented in a Chenopodium album biotype surviving in Serbian atrazine-treated corn fields. Both types of stresses cause photooxidation damage to plants. These multifactorial non target-site (NTS) herbicide resistances result from enhanced detoxification and possibly other mechanisms. Chloroplast photoprotective systems and stress-inducible detoxifying enzymes can confer cross-protection to both environmental and xenobiotic photooxidative stresses. Therefore, it could be hypothesized that these complex NTS resistances may represent a general up-regulation of stress tolerance responses in biotypes adapted to various environmental stresses. These cross tolerances may involve complex genetic control, and low level-resistance endowed by multiple genes can evolve higher resistance levels under repeated treatment with sub-lethal herbicide rates. Weed management in stressful environments should a priori contemplate strategies to delay NTS resistance evolution and to avoid low-level resistance evolution into higher NTS resistance levels.

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Keywords: Echinochloa phyllopogon, Chenopodium album, submergence tolerance, enhanced detoxification, low-level resistance. Introducción Setenta años de monocultivo continuo en California ha llevado a serias infestaciones de ciertas malezas muy dañinas de las cuales la Echinochloa phyllopogon (Stapf) Koss, E. oryzoides (Ard.) Fritsch y E. crus-galli (L.) Beauv. var. crus-galli son las más competitivas y difíciles de controlar. El control de malezas en arroz ha dependido fuertemente en el empleo repetido de los pocos ingredientes activos disponibles, lo cual ha llevado a la evolución de resistencia en la mayoría de las especies problemáticas. La resistencia de E. phyllopogon hacia la mayoría de los herbicidas que la pueden controlar representa uno de los problemas más graves para la producción de arroz en California (FISCHER et al., 2000). Varios niveles de resistencia son observables y bajos niveles de resistencia son frecuentes con clomazone que mata a las plantas al exponer a los cloroplastos a daño fotoactivo (tal como el que causan las formas de oxígeno reactivo, FOR) (FERHATOGLU y BARRETT, 2006). Recientemente se ha documentado resistencia de bajo nivel a la atrazina (cuya toxicidad es generada por daño de FOR) en Chenopodium album L. (PAVLOVIC et al., 2008), lo cual podría sugerir elementos en común con el caso de E. phyllopogon. Discutiremos aquí (a) mecanismos de resistencia ajenos al sitio activo (ASA) en E. phyllopogon proveniente de arrozales de California b) resistencia a herbicidas generadores de FOR en E. phyllopogon y C. album, y c) la hipótesis de que la resistencia tipo ASA y la tolerancia a estreses ambientales puede estar relacionada y tener implicancias para el manejo de la resistencia a herbicidas. Generación de la información Se investigaron mecanismos de resistencia en E. phyllopogon mientras se realizaban estudios paralelos relacionando características morfo-fisiológicas con sensibilidad a la atrazina en un biotipo de Chenopodium album con tolerancia a atrazina colectado en campos de maíz en Serbia. Estos trabajos involucraron estudios de análisis de crecimiento, cuantificación de absorción y translocación de herbicidas marcados con 14C, estudios de respuesta a dosis en plantas, ensayos enzimáticos de sensibilidad en el sitio activo (ALS, ACCasa) y de metabolismo de herbicidas (actividad y contenido de citocromo P450, perfiles metabolómicos). La diseminación de biotipos de E. phyllopogon con resistencia a múltiples herbicidas en California se estudió usando marcadores AFLP. Para estudiar la resistencia a herbicidas fotooxidativos se cuantificaron niveles de pigmentos foliares y la emisión de fluorescencia clorofílica (Fv/Fm). Los procedimientos detallados de estos estudios aparecen en la bibliografía oportunamente citada en este trabajo. Principales resultados y sus implicaciones Resistencia en Echinochloa phyllopogon. Varios niveles de resistencia simultánea a tiocarbamatos (molinato, tiobencarbo), inhibidores de ACCasa (cihalofop y fenoxaprop), inhibidores de ALS (bispiribac, penoxsulam, bensulfuron, orthosulfamuron), y clomazone están presentes en biotipos de E. phyllopogon (FISCHER et al., 2000). Propanil controla a la E. phyllopogon resistente (R) con menor eficacia que a los biotipos susceptible (S). Elevadas tasas de detoxificación -mediatizadas por actividad P450- le confieren resistencia a bispiribac-sódico (la cual se detectó incluso antes de que el herbicida estuviera disponible en California) así como también bajos niveles de resistencia a penoxsulam. Tasas metabólicas incrementadas (P450, conjugación con glutatión y cisteína), así como quizás también bajas tasas de absorción foliar, confieren resistencia a R-E. phyllopogon (E. phyllopogon resistente) contra herbicidas inhibidores de la ACCasa (BAKKALI et

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al., 2007; RUIZ-SANTAELLA et al., 2006). Resistencia a nivel del sitio de acción (SA) aún no se había encontrado, pero recientes estudios con quinclorac sugieren que R-E. phyllopogon tiene poca elevación de la biosíntesis de etileno en respuesta a quinclorac. Esto puede estar relacionado con alteración de la percepción y transducción de la señal auxínica de este herbicida; R-E phyllopogon también tiene elevada actividad de la enzima β-cianoalanina sintetasa encargada de detoxificar al cianuro resultante de la biosíntesis de etileno y también una elevada capacidad de detoxificar quinclorac via P450. Es decir R-E. phyllopogon exhibe una verdadera resistencia multifactorial tipo ASA hacia este herbicida (MILAN et al., 2009). El metabolismo de tiocarbamatos involucra bioactivación mediatizada por P450 hacia una forma más tóxica previa detoxificación final de este herbicida via conjugación (USUI, 2001). Estudios metabolómicos sugieren importantes diferencias fisiológicas entre biotipos R y S (Figura 1) (YASUOR y FISCHER, 2008). Dado que los biotipos R-E. phyllopogon se habrían originado de una única introducción fundacional de acuerdo a un estudio efectuado usando marcadores AFLP (TSUJI et al., 2003), todas esas plantas exhiben los mismos patrones de resistencia conferidos por esos diversos mecanismos enzimáticos mencionados, entre las que se destaca la actividad inducible de diversas isoenzimas P450 altamente activas y con especificidad hacia múltiples sustratos que son capaces de detoxificar a diversos herbicidas (YUN et al., 2005) (Tabla 1). Los bajos niveles de resistencia a clomazone en R-E. phyllopogon (Figura 2) reflejan de forma similar su baja sensibilidad al paraquat ( Figura 3) lo que resultaba en menores daños cloroplásticos en plantas R comparadas con plantas S (YASUOR et al., 2008). La presumible falta de metabolismo de paraquat en plantas no puede explicar estas respuestas. La adición de glutatión aliviaba el daño de paraquat en las plantas S mucho más que en las R, lo cual sugería que protección contra fotooxidación por FOR lograda a través del ciclo acorbato/glutatión podría estar involucrada en la baja sensibilidad al paraquat del biotipo R (FISCHER et al., 2008). La menor efectividad del propanil sobre R-E. phyllopogon ciertamente involucra mayor actividad P450 dado su participación en el metabolismo parcial de este herbicida y sería lógico también pensar que los sistemas de protección elevada contra FOR podrían estar también operando en este caso también.

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Figura 1. Gráfico de análisis canónico discriminante resultante del análisis RP-LC-MS/MS de plantas de Echinochloa phyllopogon tratadas con clomazone (50µM) mostrando la clara separación del metaboloma de un biotipo susceptible (S) y otro resistente (R) a clomazone y a múltiples herbicidas (YASUOR y FISCHER, 2008).

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Tabla 1. Metabolismo incrementado e inducido por pre-tratamiento con herbicidas: actividad de monooxigenasas P450 en fracciones microsomales aisladas de tallos de plantas E. phyllopogon susceptibles y resistentes a múltiples que fueran previamente tratadas con bispiribac-sódico, o fenoxaprop-etilo, o con tiobencarbo. (Adaptado de YUN et al., 2005).

Actividad P450 c

(pmol mg-1 protein min-1) (±SE) Pre-tratmiento Herbicida a Sustratob

plantas R plantas S Bispiribac-sódico * 33.3 ± 0.5b 11.0 ± 0.2a Fenoxaprop-etilo 0.0a 0.0a

Bispiribac-sódico

Tiobencarbo 0.0a 0.0a Bispiribac-sódico 0.0a 0.0a Fenoxaprop-etilo * 246.7 ± 5.7d 143.3 ± 14.9b

Fenoxaprop-etilo

Tiobencarbo * 37.5 ± 1.1b 22.7 ± 5.3a Bispiribac-sódico 0.0a 0.0a Fenoxaprop-etilo 0.0a 0.0a Tiobencarbo Tiobencarbo * 297.1 ± 5.5e 245.2 ± 2.6c

a Las plantas fueron pre-tratadas con 1µM de cada herbicida durante 24h antes de ser muestreadas. b Bispiribac-sódico, fenoxaprop-etilo y tiobencarbo (0.1, 0.25 and 0.25 mM, respectivamente) fueron agregados al medio como sustratos de hidroxilación. Asteriscos (*) indican significancia estadística entre un par de medias R y S dentro de una hilera según la mínima diferencia significativa protegida de Fisher para P < 0.05. c Dentro de cada column alas medias seguidas por una misma letra no difieren estadísticamente según la diferencia honestamente significativa de Tukey–Kramer para P < 0.05.

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Figura 2. Respuesta a dosis de clomazone por una accesión de Echinochloa phyllopogon susceptible y otra resistente a múltiples herbicidas. Cada punto representa una media ± ES (n = 10). Líneas punteadas representan el índice de confianza al 95% de las ecuaciones de regresión.

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Figura 3. Respuesta a dosis de paraquat en un biotipo de Echinochloa phyllopogon susceptible (S) y otro resistente (R) a multiples herbicidas que fueran tratados hidropónicamente con el herbicida al estado de 2-3 hojas (YASUOR et al., 2008) Baja sensibilidad a la atrazina y tolerancia al estrés hídrico en Chenopodium album. La atrazina era capaz de suprimir sustancialmente a este biotipo de C. album colectado en Serbia (VC), no obstante su altura, emisión Fv/Fm, y su transpiración sólo se reducían en un 60% comparado con 0% y 100% para los testigos S y R, respectivamente (PAVLOVIC et al., 2008). El fuerte decrecimiento inicial de la emisión del cociente de fluorescencia clorofílica Fv/Fm cesó en el biotipo VC tres días después del tratamiento con atrazina (Figura 4), lo cual sugería que el proceso de detoxificación de atrazina o de protección contra FOR facilitaría la sobrevivencia del biotipo VC en campos de maíz tratados con atrazina. A su vez, esta mitigación de la fotoinhibición por atrazina se aunaba a una adaptación al estrés hídrico, que seguramente este biotipo debía sufrir bajo la competencia del maíz, mediante la limitación del área foliar expuesta a la demanda evapotranspiratoria, bajas tasas transpiratorias, y un mayor control del cierre estomático (Tabla 2). La evolución de resistencia a múltiples herbicidas en E. phyllopogon se asocia a un uso prolongado de herbicidas tiocarbamato bajo estrés de submergencia dadas las condiciones del cultivo de arroz en California, donde la inundación permanente se implementa para suprimir malezas. Estos biotipos resistentes también presentan baja sensibilidad o resistencia hacia ciertos herbicidas fototóxicos (paraquat, clomazone). Se sabe que la resistencia a paraquat puede conferir a ciertas

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plantas una tolerancia cruzada al estrés fotooxidativo proveniente de la acción de herbicidas o de efectos ambientales; sistemas enzimáticos protectores o activos transportadores de membrana pudieran estar implicados en esta tolerancia cruzada (GRESSEL, 2002). La baja sensibilidad a atrazina observada en C. album, que recién comentamos, también coincidía con una adaptación al estrés ambiental evolucionada como adaptación a condiciones cálidas con probables limitaciones de humedad. E. phyllopogon ha co-evolucionado en Asia con el arroz bajo estrés de inundación por muchos años y posee un elevado nivel de tolerancia a la anoxia por sumersión comparado con otras especies del mismo género u otras malezas del arroz; recientemente hemos observado también que biotipos R de esta maleza tienen mayor tolerancia a la submersión que plantas S (FISCHER, datos sin publicar). Ambos tipos de estrés (sumersión y sequía) exponen a las plantas al daño por fotooxidación (SANTOSA et al., 2007). Sistemas enzimáticos inducidos por estrés para detoxificar FOR, transportadores de membrana, enzimas P450 y de conjugación pueden estar involucrados en conferir protección cruzada hacia estrés fotooxidativo, tanto el que proviene del ambiente como el que es causado por ciertos herbicidas (WERCK-REICHHART et al., 2000; TAKEZAWA et al., 2002). Por esta razón puede ser lógico plantearse la hipótesis de que estas resistencias tipo ASA a herbicidas comentadas puedan representar una situación de sobre-regulación general de respuestas al estrés en biotipos que han evolucionado adaptación a determinados estreses ambientales. Transportadores de membrana (como los cassettes ligados al ATP o transportadores ABC) pueden incluso conferir tolerancia a múltiples herbicidas tal como se observa en E. phyllopogon (GRESSEL, 2002). Es posible que estos mecanismos puedan estar bajo el control de varios genes. Dosis sub-letales de herbicidas aplicados recurrentemente pueden seleccionar por resistencia tipo ASA cuando individuos que sobreviven al tratamiento merced a un nivel bajo de resistencia son portadores de genes menores de resistencia, los cuales se acumulan en sus progenies gracias a la segregación y recombinación genética que ocurre cuando plantas vecinas logran hibridar (NEVE y POWLES, 2005; BUSI y POWLES, 2009). De forma similar, la resistencia multifactorial ASA puede ocurrir en especies autógamas como consecuencia de duplicaciones y amplificación génica a lo largo del tiempo (GRESSEL, 2002). Los mecanismos existentes de resistencia cruzada entre agentes xenobióticos y estreses ambientales sugieren que el manejo de malezas en ambientes estresados debe contemplar medidas para retardar la evolución de resistencia ASA de tipo multifactorial. La resistencia de bajo nivel es ignorada con frecuencia y es posible de evolucionar hacia niveles más elevados de resistencia ASA bajo el efecto de recurrentes dosis herbicídicas subletales, tal como puede ocurrir cuando se omite el control de especies de emergencia tardía al tiempo que los residuos de herbicida (pre-emergente) en el suelo han declinado, cuando se aplican herbicidas fuera de tiempo sobre plantas ya demasiado grandes (equivale a aplicar una dosis subletal), cuando no se calibran bien los equipos aspersores, o cuando se implementas programas de control a baja dosis. Por otra parte, ¿sería válido preguntarse si la selección hacia resistencia a herbicidas (por uso recurrente de herbicidas) podría favorecer al mismo tiempo la evolución de biotipos altamente tolerantes a los estreses ambientales y por consiguiente con mayor efecto nocivo de maleza? Estudios metabolómicos podrían permitirnos descubrir relevantes rutas metabólicas que estuvieran involucradas en la tolerancia a estreses y en la resistencia a herbicidas y, así, sugerir nuevas estrategias de manejo de malezas y también conducir al desarrollo de nuevos y más efectivos herbicidas. El conocimiento adicional sobre los mecanismos de resistencia ASA podría guiarnos hacia mejores formas de manejar la resistencia mediante la rotación de herbicidas, buscando aquellos que no sólo difieran en su modo de acción sino que también se detoxifiquen o sean “secuestrados” en la planta por mecanismos diferentes. A su vez, este conocimiento también podría ser útil para el desarrollo de cultivos con amplio espectro de resistencia a herbicidas, o para modificar plantas para uso en bioremediación y detoxificación ambiental de sustancias xenobióticas (MORANT et al., 2003; INUI y OHKAWA, 2005; YAZAKI , 2006). La gran complejidad de la resistencia tipo ASA en plantas (YAZAKI, 2006; YUAN et al., 2007) y en animales (HIGGINS, 2007) revela el rol esencial que cumple el manejo integrado de

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malezas, con menor dependencia en herbicidas, para retrasar la evolución de biotipos de malezas con resistencia a herbicidas.

Figura 4. Máximo rendimiento cuántico de fluoredescencia clorofílica (Fv/Fm) medido en tres biotipos de Chenopodium album (S = susceptible a atrazina, R = resistente a atrazina, y VC = proveniente de Veliki Crljeni, Serbia) varios días posteriores a un tratamiento con 2 kg i.a. ha-1 de atrazina. Las barras verticales en cada punto son ± error estándar de la media. (Adaptado de PAVLOVIC et al., 2008).

Tabla 2. Análisis de varianza y contrastes ortogonales para variables de crecimiento, mínima resistencia estomática a la difusión del vapor de agua (MRD) y tasas transpiratorias medidas 22 días después de plantar tres biotipos de Chenopodium album (S = susceptible a atrazina, R = resistente a atrazina, y VC = proveniente de Veliki Crljeni, Serbia).

Biotipo N° de hojas planta-1

Área foliar (cm2 plant-1)

MRD (s cm-1)

Tasa de traspiración (micro g cm-2 s-1)

S 8.25±0.96 a a 24.50±2.52 a 0.63±0.14 b 8.77±1.67 b

VC 6.50±0.58 b 18.00±1.63 b 2.82±1.26 a 5.98±1.32 c R 7.50±0.31 ab 23.00±1.18 a 0.67±0.04 b 17.15±0.63 a

P > F 0.038 0.011 0.003 <0.0001

Error estándar 0.400 1.230 0.367 0.767 G.L. del error= 9

a Medias (±ES) seguidas por una misma letra no difieren estadísticamente según contrastes ortogonales efectuados para P = 0.05, los cuales se condujeron solamente cuando el efecto del factor biotipo resultó significativo (P ≤ 0.05) en la prueba del análisis de varianza.

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Bibliografía BAKKALI, Y.; RUIZ-SANTAELLA, J.P.; FISCHER, A.J.; DE PRADO, R. (2007). Late watergrass (Echinochloa phyllopogon): Mechanisms involved in the resistance to fenoxaprop-p-ethyl. J. Agric. Food. Chem. 55:4052–4058. BUSI, R.; POWLES, S.B. (2009). Evolution of glyphosate resistance in a Lolium rigidum population by glyphosate selection at sublethal doses. Heredity advance online publication 3 June 2009; doi: 10.1038/hdy.2009.64. FERHATOGLU, Y.; BARRETT, M. (2006). Studies of clomazone mode of action. Pestic. Biochem. Physiol. 85:7–14. FISCHER, A.J.; ATEH, C.M.; BAYER, D.E.; HILL, J.E. (2000). Herbicide-resistant Echinochloa oryzoides and E. phyllopogon in California Oryza sativa fields. Weed Sci. 48:225-230. FISCHER, A.J.; PAVLOVIC, D.; YASUOR, H.; MEROTTO, A. (2008). Are non target-site resistance and environmental stress tolerance related? Proceedings of the 5th International Weed Control Congress, Vancouver, British Columbia, Canada, June 23-27, 2008, Abstract 101. CR ROM. GRESSEL, J. (2002). Molecular biology of weed control. London and New York, Taylor & Francis. HIGGINS, C.F. (2007). Multiple molecular mechanisms for multidrug resistance transporters. Nature. 446:749-757. INUI, H.; OHKAWA, H. (2005). Herbicide resistance in transgenic plants with mammalian monooxygenase genes. Pest Manag. Sci. 61:286-291. MILAN, M.; YASUOR, H.; ECKERT, J.W.; FISCHER, A.J. (2009). Quinclorac Resistance in California’s Late Watergrass (Echinochloa phyllopogon (Stapf) Koss.), Abstract No. 231, Weed Science Society of America Meeting, Febrero 9-13, Orlando Florida. MORANT, M.; Bak, S.; Moller, B.L.; Werck-Reichhart, D. (2003). Plant cytochromes: tools for pharmacology, plant protection and phytoremediation. Curr. Opin. Biotechnol. 14:151-162. NEVE, P.; POWLES, S. (2005). Recurrent selection with reduced herbicide rates results in the rapid evolution of herbicide resistance in Lolium rigidum. Theor. Appl. Genet. 110:1154–1166. PAVLOVIC, D.; VRBNICANIN, S.; BOZIC, D.; FISCHER, A.J. (2008). Morphophysiological traits and atrazine sensitivity in Chenopodium album L. Pest Manag. Sci. 64:101-107. RUIZ-SANTAELLA, J.P.; DE PRADO, R.; WAGNER, J.; FISCHER, A.J.; GERHARDS, R. (2006). Resistance mechanisms to cyhalofop-butyl in a biotype of Echinochloa phyllopogon (Stapf) Koss. fFrom California. J. Plant Disease Protect. 20:95-100. SANTOSA, I.E.; RAM, P.C.; BOAMFA, E.I.; LAARHOVEN, L.J.J.; REUSS, J.; JACKSON, M.B.; HARREN, F.J.M. (2007). Patterns of peroxidative ethane emission from submerged rice seedlings indicate that damage from reactive oxygen species takes place during submergence and is not necessarily a post-anoxic phenomenon. Planta 266:193-202.

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TAKESAWA, T.; ITO, M.; KANZAKI, H.; KAMEYA, N.; NAKAMURA, I. (2002). Over-expression of glutathione S-transferase in transgenic rice enhances germination and growth at low temperature Molec. Breeding 9:93–101. TSUJI, R.; FISCHER, A.J.; YOSHINO, M.; ROEL, A.; HILL, J.E.; YAMASUE, Y. (2003). Herbicide-resistant late watergrass (Echinochloa phyllopogon): Similarity in morphological and amplified fragment length polymorphism traits. Weed Sci. 51:740-747. USUI, K. (2001). Metabolism and selectivity of rice herbicides in plants. Weed Biology and Management 1:137-146. WERCK-REICHHART, D.; HEHN, A.; DIDIERJEAN, L. (2000). Cytochromes P450 for engineering herbicide tolerance. Trends in Plant Sci. 5:116-123. YASUOR, H.; FISCHER, A.J. (2008). Clomazone resistance in late watergrass (Echinochloa phyllopogon): role of herbicide metabolism. Proceedings of the 5th International Weed Control Congress, Vancouver, British Columbia, Canada, June 23-27, 2008, Abstract 89. CR ROM. YASUOR, H.; TENBROOK, P.L.; TJEERDEMA, R.S.; FISCHER, A.J. (2008). Responses to clomazone and 5-ketoclomazone by Echinochloa phyllopogon resistant to multiple herbicides in Californian rice fields. Pest Manag Sci. 64:1031-1039 YAZAKI, K. (2006). ABC transporters involved in the transport of plant secondary metabolites. FEBS Letters 580:1183-1191. YUAN, J.S.; TRANEL, P.J.; STEWART, C.N. (2007). Non-target-site herbicide resistance: a family business. Trends in Plant Science 12:6-13. YUN, M.S.; YOGO, Y.; MIURA, R.; YAMASUE, Y.; FISCHER, A.J. (2005). Cytochrome P-450 monooxygenase activity in herbicide-resistant and –susceptible late watergrass (Echinochloa phyllopogon). Pestic. Biochem. Physiol. 83:107-114.

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ESTRATEGIAS DE MANEJO DE MALEZAS GRAMÍNEAS RESISTENTES A HERBICIDAS EN TRIGO Y OTROS CULTIVOS EXTENSIVOS EN EL SUR

DE CHILE

N. Espinoza1, J. Díaz1, R. Galdames1 y C. Rodríguez1 1 INIA Carillanca, Temuco, Chile, email: nespinoz@inia.cl

Resumen: En el sur de Chile, principal zona productora de trigo (Triticum aestivum), avena (Avena sativa), cebada (Hordeum vulgare), raps canola (Brassica napus) y lupino (Lupinus angustifolius), el desarrollo de resistencia en malezas gramíneas como ballica (Lolium multiflorum y L. rigidum), avenilla (Avena fatua) y cola de zorro (Cynosurus echinatus) hacia los herbicidas ACCasa y ALS ha sido creciente a partir de la década del 90. La resistencia a glifosato en L. multiflorum es más reciente, sin embargo está aumentando rápidamente. Es muy probable que la resistencia continúe incrementándose, de no existir cambios que signifiquen uso de rotaciones adecuadas de cultivos, rotaciones o mezclas de herbicidas con diferentes mecanismos de acción, pero principalmente una menor dependencia de los herbicidas antes y después de la siembra. Para esto es fundamental que los agricultores no sigan considerando la labranza cero como algo absoluto, que nunca puede modificarse, crean más en las bondades de los herbicidas pre-emergentes para controlar malezas gramíneas como ballica y cola de zorro, incluyendo los biotipos resistentes, y que los agricultores estén realmente dispuestos a implementar programas de prevención y control integrado de malezas en sus campos. Palabras claves: avenilla, ballica, cola zorro, herbicidas, resistencia. Summary: management strategies of weeds grasses resistant to herbicides in wheat and others extensive crops in south of Chile. In the south of Chile, the main area for wheat (Triticum aestivum), oat (Avena sativa), barley (Hordeum vulgare), canola (Brassica napus) and lupine (Lupinus angustifolius), the resistance development of grass weed like ryegrass (Lolium multiflorum y L. rigidum), wild oat (Avena fatua) and hedgehog dogtai (Cynosurus echinatus) toward the herbicides ACCasa and ALS has been frequent since the nineties. In recent years, the development of L. multiflorum resistant to glifosato is acquiring a growing importance. It is very likely that the resistance continue to rise in the absence changes mean that use of appropriate rotations crop rotations, or mixtures of herbicides with different mechanisms of action, but mainly less dependence on the herbicides before and after seeding. It is also essential that farmers do not continue considering the zero tillage as something absolute, which can never be amended, create more in the virtues of herbicides pre-emerging to control weeds grasses and ryegrass and hedgehog, including biotypes resistant and farmers are really willing to implement prevention programs and integrated control of weeds in their fields. Keywords: wild oat, ryegrass, hedgehog dogtail, herbicides, resistance.

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Introducción En los sistemas de cultivos de altos insumos alrededor del mundo, generalmente los agricultores no adoptan medidas preventivas para evitar o retrasar el desarrollo de resistencia a herbicidas. Comúnmente, éstas son adoptadas sólo después que la resistencia se ha desarrollado (BECKIE y GILL, 2006). Lo anterior es debido a que los costos y esfuerzos para prevenir o retrasar el desarrollo de la resistencia a herbicidas son percibidos como similares a los relacionados con el manejo de una resistencia ya confirmada. También puede deberse al interés por parte de los agricultores de optimizar en el corto plazo el retorno económico o simplemente por la incapacidad para evaluar los riesgos asociados con las malezas resistentes (ROTTEVEEL et al., 1997). La baja adopción de prácticas de manejo también puede deberse a la ausencia de herbicidas alternativos o con diferente mecanismo de acción o de diferentes grupos químicos, para controlar las malezas problemas o por expectativas poco realistas en el sentido de que nuevas tecnologías de herbicidas podrían estar disponibles en el futuro (LLEWELLYN et al., 2002). El costo de prevenir la resistencia es significativamente menor al costo de manejarla una vez que se ha desarrollado totalmente, principalmente cuando la resistencia se presenta a diferentes grupos de herbicidas o cuando quedan pocos herbicidas disponibles para controlar las malezas resistentes (ORSON, 1999). El principal costo directo de la resistencia puede ocurrir durante el primer año de detección, debido al deficiente control de la maleza resistente y la consecuente pérdida de rendimiento del cultivo (PETERSON, 1999). Malezas con alto potencial para producir semillas como ballica (L. rigidum, L. multiflorum) (BOSQUE et. al., 2002), pueden incrementarse rápidamente en el campo como consecuencia de un deficiente control debido a la resistencia y, por lo tanto, ocasionar pérdidas importantes en el rendimiento de trigo. La resistencia dificulta el manejo adecuado de las malezas y además de incrementar los costos de producción, aumenta la carga ambiental de herbicidas cuando el deficiente control de la maleza resistente obliga a usar dosis más altas o repetir la aplicación. En el sur de Chile, principal zona productora de trigo, avena, cebada, raps canola y lupino, el desarrollo de resistencia en malezas gramíneas como ballica (Lolium multiflorum y L. rigidum), avenilla (Avena fatua) y cola de zorro (Cynosurus echinatus) hacia los herbicidas ACCasa y ALS ha sido creciente a partir de la década del 90. Por otra parte, en los últimos años también se ha confirmado la resistencia en L. multiflorum al herbicida glifosato (Espinoza et al 2005; Espinoza et al 2008). En el presente trabajo se analizan los factores de riesgo para el desarrollo de resistencia a herbicidas y las estrategias para prevenirla o atrasarla, con énfasis en el manejo de herbicidas para la agricultura con cultivos extensivos del sur del país. Factores que determinan un rápido desarrollo de la resistencia a los herbicidas El factor más importante en la evolución de resistencia de las malezas a los herbicidas es un sistema de manejo en el cual el uso repetido de un solo herbicida o de varios herbicidas con el mismo sitio de acción, proporcionan una continua presión de selección (JASIENIUK et al., 1996). Por lo tanto, para evitar o retrasar la evolución de resistencia, es necesario limitar la presión de selección, controlar las plantas resistentes antes que ellos se dispersen y disminuir la proporción de individuos resistentes del banco de semillas del suelo. Otros factores, tales como las características de los

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herbicidas y la biología de las malezas también juegan un importante rol en determinar la rapidez de la resistencia. Características de los herbicidas Herbicidas con un solo sitio de acción. Los herbicidas que tienen un solo sitio de acción tienen más probabilidades de que se genere resistencia a ellos en relación a aquellos que afectan a varios procesos. Por ejemplo, en muchos casos las malezas han evolucionado resistencia a los herbicidas inhibidores de ACCasa e inhibidores de ALS después de cinco e incluso menos años de uso (MALLORY-SMITH et al., 1990). Esto contrasta con los antiguos herbicidas reguladores del crecimiento tipo auxinas con sitios de acción menos específicos, lo que se ha traducido en poca resistencia a ellos, después de un uso prolongado (HEAP, 2009). Herbicidas muy eficaces para controlar las malezas. Cuando el nivel de control de las malezas susceptibles es alto, la presión de selección también aumenta y, por lo tanto, la probabilidad de que escapen individuos resistentes. Por ejemplo, al aplicar un herbicida que controla un 95% de las plantas susceptible mantendrá pocas de ellas para la siguiente generación, en comparación con un herbicida que controla un 70%. Esto mismo ocurre con herbicidas que tienen un largo efecto residual (POWLES et al., 1997). Aplicación frecuente. El riesgo de resistencia es mayor cuando se emplea el mismo herbicida repetidamente en el mismo cultivo, mismo potrero y las mismas malezas por un largo tiempo (GRESSEL y SEGEL, 1990). La pérdida de los beneficios normales de la labranza del suelo favorece el desarrollo de malezas resistentes, debido a que la labranza elimina a las malezas resistentes que escapan a las aplicaciones de herbicidas y proporciona un mecanismo para mezclar y diluir semillas resistentes con la población original de malezas (susceptibles) (VILA-AIUB et al., 2005). Biología de la maleza Ciclo de vida. La resistencia de los herbicidas aparece más frecuentemente en malezas anuales. Debido a que las malezas anuales sólo se reproducen por semillas el potencial para transferir la resistencia a la próxima generación es relativamente alta (OWEN, 2001). Las malezas anuales se caracterizan también por producir un elevado número de semillas por planta, lo que aumenta el material genético que está presente en el banco de semillas y, por lo tanto, la probabilidad a que aparezca un gen mutado). Longevidad de la semilla. Si el suelo es cultivado, las semillas de vida larga de poblaciones susceptibles que estaban enterradas diluirán la población de semillas resistentes y la resistencia podrá ser atrasada. Por otra parte, las semillas que permanecen en la superficie del suelo y tienen una vida corta (con o sin dormancia) morirán o germinarán dentro de unos pocos años. Por esta razón, en los sistemas con cero labranza que dejan semillas de malezas en la superficie del suelo, estas corresponden principalmente a semillas resistentes, ya que las susceptibles germinan y son controladas con el herbicida.

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Practicas de manejo para prevenir o minimizar la selección de malezas resistentes a herbicidas Las prácticas de manejo siguientes ayudaran a reducir la presión de selección ejercida por la aplicación de un solo herbicida o de herbicidas con el mismo mecanismo de acción: Alternando métodos no químicos de control de malezas con herbicidas. Ayuda a reducir la presión de selección de los herbicidas. Sin embargo, las prácticas de control no químicas de malezas pueden ser limitadas en número y/o traducirse en resultados poco eficaces de control de malezas. Mezclando herbicidas con diferentes mecanismo de acción. Las mezclas de herbicidas en el estanque del aspersor o el tratamiento secuencial (el mismo año) de herbicidas con diferentes mecanismo de acción retarda el desarrollo de resistencia (DIGGLE et al., 2003). Las plantas que escapan a un herbicida será controlado por el otro herbicida. Para implementar esta práctica se asume que ambos herbicidas tienen acción de control sobre la maleza objetivo. Rotando herbicidas con diferentes mecanismos de acción. La rotación de herbicidas con diferente mecanismo de acción año a año puede retrasar la resistencia. Sin embargo, esta técnica puede ser menos eficaz que el uso de mezclas en el estanque y/o las aplicaciones secuenciales en el mismo año, ya que parte la población sobrevivirá el año en la que se usa el otro herbicida con diferente mecanismo de acción (DIGGLE et al., 2003; POWLES et al., 1997). Rotando cultivos. Puede retrazar la resistencia siempre y cuando los herbicidas usados tengan diferentes mecanismos de acción y los otros métodos de control difieran para cada cultivo (POWLES et al., 1997). Conteniendo la infestación resistente en cuanto aparezca. Una maleza resistente presenta la misma amenaza que una maleza nueva e invasora y al no ser controlada se favorece su diseminación. Las prácticas de control diferentes a la aplicación estándar del herbicida, como por ejemplo arrancar a mano y aplicar en manchas (forma localizada) con otros herbicidas ayudarán a eliminar las plantas que escaparon. Otras prácticas. Las siguientes prácticas culturales también pueden hacer muy útiles para prevenir o atrasar la resistencia. Incluye el: uso de semilla certificada; limpieza de todo tipo de maquinaria agrícola, tanto de preparación del suelo como de cosecha, para evitar el transporte y dispersión de las semillas de malezas de un campo a otro; retraso en la siembra para que puedan emerger las malezas y poder controlarlas en una o más oportunidades, ya sea con herbicidas y/o mecánicamente; quema de rastrojo, donde sea recomendable y permitido, para reducir la viabilidad de las semillas de malezas existentes en el suelo. Un resumen de los principales factores que afectan la evolución de resistencia de las malezas a los herbicidas, se incluyen en la Tabla 1.

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Tabla 1. Prácticas agrícolas y su relación con los riesgos de desarrollo de resistencia a los herbicidas. Espinoza, N. Adaptado y traducido de HRAC. (Comité Acción de Resistencia a Herbicidas. 2002.

Riesgo de resistencia Prácticas Agrícolas Bajo Moderado Alto

Rotación de herbicidas o mezclas de herbicidas empleadas

Con más de 2 mecanismos de acción

Con 2 mecanismos de acción

Con 1 mecanismo de acción

Métodos de control de malezas utilizados

Cultural*, mecánico y químico

Cultural y químico

Solamente químico

Frecuencia de uso de herbicidas con el mismo mecanismo de acción por temporada

Una vez Más de una vez Varias veces

Rotación de cultivos utilizada Rotación amplia

Rotación limitada

Monocultivo

Referencia sobre la resistencia a ese mecanismo de acción

Desconocida Limitada Frecuente

Nivel de infestación de malezas en los potreros o cultivos

Bajo Moderado Alto

Control en los últimos 3 años Bueno Disminuyendo Deficiente

* El control cultural puede implicar labranza del suelo, quema de restrojos, cultivos competitivos, semilla certificada, etc.

Detección de malezas resistentes en el campo

Para verificar la presencia de malezas resistentes en campo, debe ponerse especial atención a las posibles fallas ocurridas durante la aplicación del herbicida, ya que normalmente tienen un patrón definido. Es lo que ocurre cuando no hay un cubrimiento completo del objetivo entre una pasada y la siguiente del equipo aspersor (Figura 1) o por la ausencia de traslape entre los abanicos de aspersión entre boquillas como consecuencia del atascamiento de las boquillas, barra porta boquillas demasiado baja o boquillas con un ángulo muy pequeño. Por otra parte, debe conocerse el espectro de control y la eficacia del herbicida, ya que el deficiente control podría deberse a que la maleza es tolerante. Si hay escapes, es importante observar si algunas plantas de la misma especie están afectadas y otras que están alrededor no. Cuando la resistencia esta comenzando es común encontrar entre plantas vecinas de la misma especie algunas severamente afectadas por el herbicida y otras no (Figura 2). La resistencia también puede manifestarse como la capacidad de rebrote de las plantas moderadamente

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afectadas, por lo tanto, es importante que la visita al campo se haga en el momento oportuno.

Figura 2. Plantas de ballicas sensible (color café) y resistente (color verde).

Figura 1. Franja de avenilla en trigo debido a la falta de traslape durante la aplicación del herbicida

Herbicidas selectivos disponibles para controlar malezas gramíneas en trigo y otros cultivos clasificados según su mecanismo de acción La rotación de herbicidas como estrategia para manejar la resistencia, se basa en que no deben usarse todos los años en el mismo campo o potrero, herbicidas con igual mecanismo de acción para controlar las mismas malezas. Por lo tanto, esta estrategia es altamente dependiente de que exista disponibilidad y diversidad de herbicidas para los agricultores. En Chile los herbicidas recomendados para controlar malezas gramíneas en trigo, cebada, avena, triticale, lupino y raps canola, agrupados según su mecanismo de acción, se indican en el Tabla 2. Esta clasificación es la propuesta por el HRAC (Herbicide Resistance Action Committee). Algunos herbicidas como los del grupo A (herbicidas ACCasa) controlan solamente malezas gramíneas, mientras que los herbicidas del grupo B (herbicidas ALS), grupo N (inhibidores de la síntesis de ácidos grasos, no ACCasa), grupo C1 (inhibidores de la fotosíntesis en el fotosistema II), grupo C2 (inhibidores de la fotosíntesis en el fotosistema II), grupo K1 (inhibidores de la unión de los microtúbulos en la mitosis) y grupo K3 (inhibidores de la división celular) controlan malezas gramíneas y de hoja ancha.

De acuerdo a la información contenida en la Tabla 2, en trigo hay más posibilidades de rotar herbicidas con diferentes mecanismos de acción para controlar malezas gramíneas que en el resto de los cereales, ya que en trigo hay seis grupos de herbicidas de los cuales elegir, mientras que en cebada y triticale hay cuatro grupos de herbicidas, y en avena sólo un grupo. Es importante señalar que, exceptuando los grupos A (ACCasa) y B (ALS) que corresponde a herbicidas pos-emergentes, el resto de los grupos (N, C1, C2, K1 y K3) corresponde a herbicidas pre-emergentes. Otro aspecto importante es que los grupos A y B están representados por numerosos herbicidas, por el contrario el grupo N por sólo prosulfocarb, el grupo C1 por simazina, el grupo C2 por diuron e isoproturon, el grupo K1 por trifluralina y pendimetalina y el grupo K3 por flufenacet. En avena, al contrario del resto de los cereales, no se recomiendan herbicidas del grupo

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A y B o pos-emergentes, y el único herbicida recomendado con acción en malezas gramíneas es diuron del grupo C2.

En cultivos de hoja ancha o dicotiledóneas como raps canola y lupino, hay dos y tres grupos de herbicidas disponibles, respectivamente (Tabla 2). Específicamente en raps canola pueden utilizarse herbicidas de los grupos A, K1 y K3. El grupo K1 está representado por trifluralina, empleado de presiembra e incorporado en el suelo y de pre-emergencia, mientras que el grupo K3 está representado por metazachlor, recomendado en pre y pos-emergencia temprano. En lupino pueden utilizarse herbicidas del grupo A y C1. El grupo C1 está representado por simazina recomendado en pre-emergencia.

En la zona sur, la resistencia de malezas gramíneas a los ACCasa es más generalizada a los herbicidas del grupo químico FOP que a los DIM y DEN. Por esta razón, la alternancia de herbicidas de grupos químicos distintos también podría ser una estrategia útil para prevenir o atrasar la resistencia. En la Tabla 3, se incluye la clasificación de los herbicidas ACCasa y ALS según su grupo químico.

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Tabla 2. Herbicidas disponibles para controlar malezas gramíneas en trigo y otros cultivos extensivos agrupados según mecanismo de acción.

TRIGO CEBADA AVENA TRITICALE LUPINO RAPS CANOLA GRUPO A (ACCasa). Pos-emergentes diclofop metil clodinafop propargil pinoxaden

diclofop metil pinoxaden

diclofop metil

Clethodim fluazifop-p-butil haloxyfop metil propaquizafop quizalofop-p-etil trepaloxydim

clethodim fluazifop-p-butil haloxyfop metil propaquizafop quizalofop-p-etil trepaloxydim

GRUPO B (ALS). Pos-emergentes idosulfuron metal-Na idosulfuron metal-Na+ mesosulfuron metil flucarbazone sódico imazamox + imazapyr pyroxulam

idosulfuron metil-Na

idosulfuron metil-Na idosulfuron metil-Na+ mesosulfuron metil

GRUPO N (Pre-emergentes) prosulfocarb prosulfocarb+(metribuzina, C1)

prosulfocarb

GRUPO C1 (Pre-emergentes) simazina

GRUPO C2 (Pre-emergentes) diuron isoproturon

diuron

diuron

GRUPO K1 (Pre-emergentes) trifluralina (pre) pendimetalina

trifluralina (pre) pendimetalina

trifluralina (pre y psi)

GRUPO K3 (Pre-emergentes)

flufenacet+(metribuzina, C1) flufenacet+(metribuzina, C1) metazachlor (pos) pre: recomendado en pre-emergencia; pos: recomendado en pos-emergencia; psi: recomendado en pre-siembra e incorporado en el suelo.

Tabla 3. Clasificación de los herbicidas ACCasa y ALS según grupo químico. Mecanismo de Acción

Grupo químico Nombre común Nombre comercial Cultivo

Clodinafop-propargil Topik 240 EC Trigo

Clodinafop-propargil Hummer 240 EC Trigso, cebada

Diclofop-metil Cascabel 28 EC Trigo, cebada

Diclofop-metil Iloxan 28 EC Trigo, cebada

Fluazifop -p-butil Hache Uno 2000 175 EC Canola, lupino

Haloxyfop-metil Galant Plus Canol, lupino

FOP

Propaquizafop Agil 100 EC Canola, lupino

Clethodim Centurión 240 EC Canola, lupino

Clethodim Centurión Super Canola, lupino DIM

Tepraloxydim Aramo Canola, lupino

ACCasa

DEN Pinoxaden Axial 050 EC Trigo

Iodosulfuron metil-Na Hussar 20 WG Trigo, cebada, triticale

Iodosulfuron metil-Na Ovassion 5.26 WP Trigo, cebada, triticale SU Iodosulfuron metil-Na+ mesosulfuron metil Cossack 150 WG Trigo, triticale

Flucarbazone Vulcano 70% WG Trigo SCT

Flucarbazone Everest Trigo

IMI Imazamox + Imazapyr Eurolightning Trigo, raps clearfield

ALS

TP Pyroxulam Admitt Trigo, cebada

FOP: ariloxifenoxipropionatos; DIM: ciclohexanodionas; DEN: fenilpirazolines; SU: sulfonilureas; SCT: sulfonil-aminocarbonil-triazolinona; IMI: imidazolinonas; TP: triazolopirimidinas.

Eficacia y espectro de control de malezas gramíneas de los herbicidas disponibles

Un aspecto que conviene destacar es que en un mismo grupo de herbicidas, por ejemplo ACCasa (igual mecanismo de acción) o entre grupos de herbicidas, por ejemplo ACCasa y ALS (diferente mecanismo de acción), pueden existir diferencias importantes en el número de especies de malezas gramíneas que controlan (espectro de control) y en el nivel de control de cada una (eficacia). Por otra parte, estas diferencias tambien pueden darse entre los herbicidas pre-emergentes o aplicados al suelo antes de la emergencia de las malezas y los cultivos.

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Herbicidas ACCasa y ALS. Se observa que todos los herbicidas ACCasa controlan eficazmente la avenilla y ballica, y la mayoría controla eficazmente cola de zorro y tembladerilla (Tabla 4). Por otra parte, la mayoría de los herbicidas ACCasa no controlan vulpia. Respecto a los ALS (Tabla 5), todos controlan eficazmente avenilla y ballica, sin embargo, sólo algunos herbicidas controlan eficazmente cola de zorro y vulpia.

Tabla 4. Eficacia de algunos herbicidas ACCasa en distintas malezas gramíneas.

Herbicidas ACCasa

FOP DIM DEN

Maleza

gramínea clod dicl flua halo prop clet tepr pino

Avenilla S S S S S S S S Ballica MS-S S S S S S S S Cola zorro S T S S S S S T Vulpia T T T T T MSS MS-S T Tembladerilla T MS S S S S S MS-S clod: clodinafop; dicl: diclofop; flua: fluazifop; halo: haloxyfop; prop: propaquizafop; clet: clethodim; tepr: tepraloxydim; pino: pinoxaden; FOP: ariloxifenoxipropionatos; DIM: ciclohexanodionas; DEN: fenilpirazolines. S = susceptible, 91 a 100% control. MS = moderadamente susceptible, 71 a 90% de control. MT = moderadamente tolerante, 50 a 70% de control. T = tolerante, control inferior a 50% o sin control. Tabla 5. Eficacia de algunos herbicidas ALS en distintas malezas gramíneas.

Herbicidas ALS

SU ST IMI TP

Maleza

gramínea iodo iodo+meso flua imaz+imar pyro

Avenilla MS-S S S S S Ballica S S MS-S S S Cola zorro T T-MT MS-S MS-S MS-S Vulpia T-MT MS-S MT S MT-MS Tembladerilla MS S MT-MS S MS iodo: iodosulfuron; iodo+meso: iodosulfuron+mesosulfuron; flua: flucarbazone; imaz+imar: imazamox+imazapyr; pyr: pyroxulam; SU: sulfonilureas; ST: sulfonil-aminocarbonil-triazolinona IMI: imidazolinonas; TP: triazolopirimidinas. S = susceptible, 91 a 100% control. MS = moderadamente susceptible, 71 a 90% de control. MT = moderadamente tolerante, 50 a 70% de control. T = tolerante, control inferior a 50% o sin control. Herbicidass pre-emergentes. Ninguno de los herbicidas pre-emergentes controla satisfactoriamente avenilla, excepto matazachlor, el cual es recomendado en raps canola. Por el contrario, la mayoría de los herbicidas pre-emergentes se destacan por su alta eficacia en ballica, cola de zorro y vulpia (Tabla 6). Es una excepción el herbicida diuron, cuya eficacia en ballica y cola de zorro es baja.

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Tabla 6. Eficacia de algunos herbicidas pre-emergentes en distintas malezas gramíneas. Herbicidas pre-emergentes

Maleza gramínea diur isop fluf+

metr meta pend pros pros+

meto sima trif

Avenilla T T T MT-MS T

T T T T

Ballica T-MT S MS S MT-MS MS MS-S MT-MS MS-S

Cola zorro T-MT S MS S MT-MS S S MT-T MT-MS

Vulpia MT-MS S S S MS-S S S MS-S MS-S

diur: diuron; isop: isoproturon; fluf+metr: flufenacet+metribuzina; meta: metazaclor; pend: pendimetalina; pros: prosulfocarb; pros+meto: prosulfocarb+metolacloro; sima: simazina; trif: trifluralina. S = susceptible, 91 a 100% control. MS = moderadamente susceptible, 71 a 90% de control. MT = moderadamente tolerante, 50 a 70% de control. T = tolerante, control inferior a 50% o sin control. Estrategias de manejo de los biotipos resistentes a glifosato

En el sur de Chile, la única especie de maleza en que se ha confirmado resistencia a glifosato es ballica (L. multiflorum). La resistencia de ballica a glifosato está significando el uso de otros herbicidas previo a la siembra para controlar las plantas resistentes, además de glifosato, lo que implica un aumento de los costos del control de malezas. En la zona sur, normalmente las plantas de ballica maduran antes que la de los cultivos de creales, por lo que gran parte de las semillas provenientes de las plantas que no son controladas caen al suelo y permanecen en la superficie durante el verano y otoño (aproximadamente tres meses), para comenzar a germinar con las primeras lluvias de otoño. Por lo tanto, antes, durante o después de la germinación de las semillas de ballica sensibles y resistentes a glifosato, se pueden realizar diversas prácticas de control mecánico o químico, las que en su mayoría están siendo adoptadas por los agricultores. Antes de la siembra Uso de glifosato. Por las características de glifosato y el amplio uso de la labranza cero, aún existiendo resistencia de ballica a este herbicida, su aplicación antes de la siembra es una práctica obligada para poder controlar las plantas de ballica sensibles y otras especies de malezas. Uso de clethodim y tepraloxydim. A la fecha, los biotipos de ballica resistentes a glifosato son sensibles a los herbicidas ACCasa clethodim y tepraloxydim. Esto ha significado que en campos con resistencia a glifosato clethodim y tepraloxydim sean usados en barbecho químico y principalmente en mezcla de estanque con glifosato. El uso de clethodim y tepraloxydim permite controlar las plantas resistentes a glifosato y decrecer la evolución de resistencia a él. Uso de paraquat. Los biotipos de ballica resistentes a glifosato son sensibles a paraquat. Sin embargo, por tratarse de un producto de contacto las plantas de ballica deben quedar

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bien mojadas con el producto y ser tratadas preferentemente antes del estado de macolla, de lo contrario el control de las plantas no es total. El grupo de trabajo para la continuidad de glifosato de Australia (GSWG) recomienda la rotación de glifosato y paraquat antes de la siembra de los cultivos o el uso de la técnica del doble golpe, es decir, la aplicación en secuencia de glifosato primero y paraquat después, durante la misma temporada. Lo anterior ha permitido controlar eficazmente malezas resistentes a glifosato en Australia y a otros herbicidas comúnmente utilizados (WEERSINK et al., 2005). Retraso en la siembra. El retraso en la fecha de siembra hace posible que exista más tiempo para la emergencia de plantas de ballica resistentes y poder controlar más de una vez, ya sea con herbicidas y/o mecánicamente.

Cultivación el suelo. Permite una mayor y más rápida emergencia de las malezas y por lo tanto, aumenta la posibilidad de poder controlarlas antes de la siembra.

Después de la siembra Herbicidas pre-emergentes. En los últimos años, este tipo de herbicidas ha tenido una amplia aceptación entre los agricultores. Los resultados de trabajos recientes indican que todos los herbicidas pre-emergentes recomendados en trigo y otros cultivos extensivos y, que naturalmente poseen acción de control de Lolium, pueden controlar los biotipos resistentes a glifosato (Tabla 7). En esta investigación, se utilizaron los biotipos de L. multiflorum resistentes aglifosato LM-30, LM-33 y LM-45 y diversos herbicidas pre-emergentes recomendados en trigo, tales como diuron, isoproturon, flufenacet+metribuzina y prosulfocarb, cada uno aplicado en la dosis técnica y en otra dosis un 50% más alta. Se encontró que todos los herbicidas disminuyeron significativamente el peso verde de la parte aérea de los diferentes biotipos de ballica en relación al tratamiento testigo sin herbicida, exceptuando diuron. El deficiente control de los biotipos con diuron, no debería atribuirse a resistencia, ya que también controló deficientemente el biotipo sensible incluido como referencia. Tabla 7. Disminución (%) del peso verde de los biotipos LM-30, LM-33 y LM-45 con herbicidas aplicados en pre-emergencia en la dosis técnica y otra dosis un 50% mayor.

Diuron Isoproturon Flufenacet + Metribuzina

Prosulfocarb

Biotipo de

ballica 1.000 g ha-1

1.500 g ha-1

2.000 g ha-1

3.000 g ha-1

120+88 g ha-1

180+132g ha-1

4.000 g ha-1

6.000 g ha-1

Sensible 29 28 100 96 72 85 79 76

LM-30 4 30 100 100 80 90 69 65

LM-33 15 33 96 100 64 96 74 76

LM-45 24 74 99 100 81 89 87 92

Agradecimientos Parte de los trabajos realizados fueron financiados por el Proyecto FONDEF D04i1022.

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Bibliografía BECKIE, H.J.; GILL, G.S. (2006). Strategies for managing herbicide-resistant weeds. In H. P. Singh, D. R. Batish, and R. K. Kohli, eds. Handbook of Sustainable Weed Management. Binghamton, NY: The Haworth Press, Inc. In press. BOSQUE, J.L.; RECASENS, J.; PLANES, J.; TABERNER, A. (2002). La resistencia a herbicidas en poblaciones de vallico (Lolium rigidum) I: tipología y distribución. Phytoma España (143):46-51. DIGGLE, A.J.; NEVE, P.B.; SMITH, F.P. (2003). Herbicides used in combination can reduce the probability of herbicide resistance in finite weed populations. Weed Res. 43:371–382. ESPINOZA, N. (2002). Avances en control de malezas en trigo. Boletín INIA N° 83. ESPINOZA, N.; DÍAZ, J. (2005). Situación de la resistencia de malezas a herbicidas en cultivos anuales en Chile. Seminario-Taller Iberoamericano. Resistencia a Herbicidas y Cultivos Transgénicos. Colonia del Sacramento. Uruguay, 72-82. ESPINOZA, N.; DÍAZ, J.; GALDAMES, R.; DE PRADO, R.; RODRÍGUEZ, C.; RUIZ, E. (2008). Resistencia múltiple a glifosato, ACCasa y ALS en biotipos de Lolium chilenos. En XVIII Congreso Latinoamericano de Malezas. XXVI Congreso Brasileiro da Ciencia das Plantas Daninhas. Ouro Preto, MG, Brasil. GRESSEL, J.; SEGEL, LA. (1990). Modelling the effectiveness of herbicide rotations and mixtures as strategies to delay or preclude resistance. Weed Technology 4, 186–198. HEAP I. (2009). The international survey of herbicide resistant weeds. URL http://www.weedscience.org. (accessed on October 10, 2009). JASIENIUK, M.; BRÛLÉ-BABEL, AL.; MORRISON, IN.; (1996). The evolution and genetics of herbicide resistance in weeds. Weed Sci. 44:176-193. LLEWELLYN, R.S.; LINDNER, R.K.; PANNELL, D.J.; POWLES. S.B. (2002). Resistance and the herbicide resource: perceptions of Western Australian grain growers. Crop Prot. 21:1067–1075. MALLORY-SMITH C., THILL, D.; DIAL, M. (1990). Identification of sulfonylurea herbicide-resistant prickly lettuce (Lactuca serriola). Weed Technology 4:163 ORSON, J.H. (1999). The cost to the farmer of herbicide resistance. Weed Technol. 13:607–611. OWEN, M.D.K. (2001). Importance of weed population shifts and herbicide resistance in the Midwest USA corn belt. Proc. Brighton Crop Prot. Conf.—Weeds. Farnham, UK: British Crop Protection Council. Pp. 407–412.

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TEST DE GERMINACIÓN in vitro PARA DETECTAR MALEZAS RESISTENTES A HERBICIDAS.

Jorge Díaz S. , N. Espinoza N. y R. Galdames G. INIA-Carillanca, Casilla 58-D, Temuco, Chile. e-mail: jdiaz@inia.cl

Resumen: Los herbicidas constituyen la principal herramienta de control de malezas en los cultivos extensivos, sin embargo, la variabilidad genética y presión de selección por la continua aplicación tiene como consecuencia el desarrollo de malezas resistentes (biotipos R). Este fenómeno de características evolutivas, estaría afectando en diferentes magnitudes a unas 100.000 ha en Chile con biotipos R de ballicas (Lolium multiflorum Lam., L. rigidum Gaudin), avenilla (Avena fatua L.) y cola de zorro (Cynosurus echinatus L.). Los herbicidas a los que se está generando resistencia son a diclofop y clodinafop (inhibidores de ACCasa), iodosulfuron y flucarbazone (inhibidores de ALS) y glifosato (inhibidor de EPSFs). La prevención mediante una precisa y oportuna detección es el primer y más importante paso en el manejo de los biotipos R, orientando las estrategias de control y evitando su diseminación. Diversas metodologías han sido desarrolladas, las que consideran evaluaciones de la planta entera, pasando por determinadas estructuras vegetativas y reproductivas, midiendo la actividad de la enzima blanco del herbicida hasta modernas técnicas biotecnológicas, todas ellas con el fin de agilizar el diagnóstico de biotipos R. En este trabajo, se discuten y comparan las principales bondades de cada uno de los métodos, prestando especial atención a bioensayos que utilizan semilla. Este último ha permitido detectar respuestas diferenciales entre biotipos sensibles y resistentes en un período corto para varios grupos de herbicidas. Se describen los principales aspectos en el desarrollo y puesta punto de un test de germinación in vitro para ballicas, avenilla y cola de zorro. Los factores considerados fueron viabilidad, dormancia, condiciones de germinación de la semilla, y su respuesta a concentraciones de herbicidas y su correlación con la respuesta en planta. Finalmente, se concluye que el test cumple con ser preciso, rápido, simple de ejecutar y evaluar, características apropiadas para constituirse como un servicio de detección de biotipos R en un número importante de herbicidas inhibidores de ACCasa, ALS y EPSFs. Palabras clave: bioensayo, biotipos R, ballica, avenilla, cola de zorro. Summary: Seed testing for detect weeds resistant to herbicides. Herbicide constitutes the main tool of weed control in the cereal crops, nevertheless, the genetic variability and pressure of selection by the continuous application has consequently developed resistant weeds (biotypes R). This phenomenon of evolutionary characteristics, is affecting in different magnitudes around 100,000 has in Chile with biotypes R of ryegrass (Lolium multiflorum Lam., L. rigidum Gaudin), wildoat (Avena fatua L.) and crested dogtailgrass (Cynosurus echinatus L.). The herbicides to which resistance is being generated are diclofop and clodinafop (inhibiting of ACCasa), iodosulfuron and flucarbazone (inhibiting of ALS) and glyphosate (inhibiting of EPSFs). The prevention by early detection is the first and more important stage of biotypes R management, orienting the control strategies and avoiding its dissemination. Diverse methodologies to detect its presence have been developed, those that consider evaluations of the whole plant, vegetative and reproductive structures; others that determined the activity of target enzyme

of herbicide up to biotechnological techniques, all of them with the purpose of making make agile the diagnosis of biotypes R. In this work, characteristics of the methods is discussed and compared, rendering special attention to seed bio-tests. This last one has allowed the detection of differentials answers between susceptible and resistant biotypes in a short time for several herbicides groups. The main aspects in the development of germination test for ryegrass, wildoat and crested dogtailgrass are described. The factors considered were viability, dormancy, conditions of seed germination, and their answer to concentrations of herbicides and their correlation with plant response. Finally, it is concluded that the test fulfills the following attribute precise, fast, simple to execute and to evaluate, and appropriate to be used in a routine service for biotypes R detection in important number of ACCase, ALS and EPSPs inhibitors herbicides. Key words: bioassay, biotype R, ryegrass, wildoat, crested dogtailgrass.

Introducción Para los agricultores es trascendente el oportuno y adecuado control de las malezas, siendo los herbicidas una de las principales herramientas por su eficacia, fácil aplicación, bajo costo y flexibilidad agronómica. Sin embargo, un inadecuado manejo de esta herramienta esta favoreciendo el desarrollo de malezas resistentes a los herbicidas (biotipos R), particularmente a malezas gramíneas (DÍAZ et al., 2006; ESPINOZA et al., 2006). Trabajos realizados por INIA Carillanca han constatado una cantidad próxima a 50 biotipos de malezas gramíneas resistentes a diversos herbicidas inhibidores de ACCasa, ALS y EPSFs (DÍAZ et al., 2005; DÍAZ et al., 2008a; DÍAZ et al., 2008), y que están afectando una superficie agrícola en torno a las 100.000 ha dedicadas principalmente al cultivo de trigo (ESPINOZA & DÍAZ, 2005). En este contexto, la detección es considerada un paso fundamental en el manejo de los biotipos R para adoptar medidas preventivas y correctivas en el uso y manejo de los herbicidas, pero también como una herramienta de monitoreo en la distribución y propagación geográfica del problema. En la actualidad se han desarrollado diversos bioensayos basados en el estudio de planta entera, órganos vegetativos, parte de tejidos, semilla, polen, actividad y mutación de la enzima blanco de los herbicidas. Cada uno de estos métodos muestran ventajas para determinadas situaciones, pero lo más importante es que deben ser precisos, rápidos y de bajo costo. En este trabajo se revisan y comparan los diversos métodos de diagnósticos, y se presenta los principales aspectos en el desarrollo de un test rápido con semilla para detectar biotipos R de malezas gramíneas. Métodos de Detección Uno de los métodos más empleado consiste en medir las diferencias en el desarrollo de las plantas sometidas a diferentes dosis de herbicidas. Estos estudios de dosis-respuesta han representado, en muchos casos, el paso inicial en la determinación de biotipos resistentes. El estudio se inicia con la colecta de semilla, para luego obtener plantas que se hacen crecer bajo condiciones de invernadero o campo, cuantificando el efecto del herbicida varias semanas después de su aplicación (MOSS, 1995; BECKIE et al., 2000). Si bien es un método preciso tiene como principales desventajas el largo tiempo de respuesta, altos requerimientos de espacio físico, muy demandante en mano de obra, y consecuentemente de alto costo.

También se han desarrollado métodos a partir de plantas enteras o de órganos vegetativos que han sobrevivido al tratamiento de control en campo, las que son trasplantadas a macetas para luego ser sometidas a evaluación con diferentes herbicidas (VALVERDE et al. 2000; BOUTSALIS, 2001). Si bien son métodos que requieren un equipamiento simple, son laboriosos y demoran aproximadamente unas 4 semanas en la respuesta. Otras técnicas están basadas en determinadas estructuras de la planta como el polen y hoja. El polen, para lo cual se debe esperar a la floración de las plantas, se hace germinar en un medio de cultivo que contiene herbicida (LETOUZÉ & GAZQUEZ, 2000). Es un método que requiere de tiempo y de personal con mayores habilidades técnicas en comparación a los anteriores. El bioensayo que utiliza tejido foliar sólo detecta resistencia al herbicida glifosato (SHANER et al., 2005), teniendo como principales limitaciones el ser aplicable a un tipo de herbicida, requiere de personal altamente calificado y de un equipamiento más sofisticado que las técnicas mencionadas anteriormente. De forma paralela se han desarrollado bioensayos que miden la sensibilidad de la enzima blanco de los herbicidas. Los herbicidas resultan letales para las plantas debido a que actúan sobre un sitio de acción primario, generalmente una enzima de especial relevancia biológica para el desarrollo y crecimiento de la maleza. En esta relación tan específica entre enzima y herbicida, cualquier modificación en la estructura de la enzima (mutación), resulta en una pérdida de afinidad por su sitio de acción y consecuentemente una disminución en la eficacia del herbicida. En estos bioensayos se considera la extracción y evaluación in vitro de la actividad de enzimas como la acetolactato sintasa (ALS) y la enolpiruvil shiquimato sintasa (EPSFs) (SIMPSON et al., 1995; LOVELL et al., 1996; SINGH & SHANER, 1998). La aplicabilidad de estos bioensayos con fines prácticos tiene la desventaja de ser muy específico en el análisis del mecanismo de resistencia. Últimamente se está desarrollando mediante marcadores moleculares la detección de mutaciones en la enzima blanco de los herbicidas, técnica que se describe en otro capítulo del libro. Bioensayos con semilla para detectar biotipos R. Como alternativa a los métodos y técnicas anteriores se han desarrollado bioensayos con semilla que se caracterizan por su relativa rapidez y bajo costo operativo. La semilla se dispone sobre un sustrato inerte impregnado del herbicida, y se determina la respuesta midiendo parámetros como longitud de coleoptilo (HEAP & KNIGHT, 1986; BOURGOIS et al., 1997; SIXTO et al., 1997; DÍAZ et al., 2005), longitud de raíz (BECKIE et al.; 1990; COLLAVO et al., 2008), longitud del primordio foliar o de hoja (DE LA CARRERA et al., 1999; LETOUZÉ & GAZQUEZ, 1999; PÉREZ & KOGAN, 2002; DÍAZ et al., 2005), combinación de parámetros (TAL et al., 2000); sobrevivencia o germinación (MURRAY et al., 1996; PÉREZ-JONES et al., 2007). Estos bioensayos han demostrado ser una importante herramienta para un numeroso grupo de malezas y herbicidas, considerándose su alto potencial para utilizarse como un servicio de detección de malezas resistentes (DÍAZ et al., 2005). En los Cuadros 1, 2 y 3 se presenta una revisión a nivel mundial de bioensayos con semilla en malezas gramíneas, para detectar biotipos resistentes a herbicidas inhibidores de ACCasa, ALS y EPSFs. Para los inhibidores de ACCasa existe información para unos 7 herbicidas de un total de 16 productos técnicos (HRAC, 2000) en especies del género Avena y Lolium, dando cuenta de las concentraciones que permiten discriminar entre un

biotipo sensible (S) del biotipo R, de los parámetros de medición y tiempos de respuesta que no superan las dos semanas (Cuadro 1). En el caso de los inhibidores de ALS, grupo conformado por 47 productos técnicos (HRAC, 2000), la información para especies del género Lolium, indican las concentraciones que permiten discriminar entre biotipo S y R para 3 productos, los parámetros de medición, y tiempos de respuesta que no superan los 10 días (Cuadro 2). Para L. multiflorum y el herbicida glifosato (Cuadro 3), también se cuenta con antecedentes de las concentraciones del herbicida, parámetros y tiempos de respuesta que permiten discriminar entre un biotipo R del S. Es importante destacar que en relación a los tiempos de respuesta, no está señalado o considerado tratamientos para la ruptura de dormancia de la semilla. Cuadro 1. Principales características de bioensayos con semilla para detectar resistencia de malezas gramíneas a herbicidas inhibidores de la ACCasa

CONCENTRACIÓN DISCRIMINATORIA

HERBICIDA

MALEZA

Cantidad (μM)

Basado en

Parámetro

Tiempo respuesta

REFERENCIA

Fenoxaprop-p A. fatua 10 DL biotipo S Sobrevivencia S/I Murray et al, 1996 Setoxidim A. fatua 5 DL biotipo S Coleoptilo S/I Bourgois et al, 1997 Clethodim A. fatua 1,5 >80% inh. biotipo S Coleoptilo S/I Bourgois et al, 1997 Clodinafop A. fatua 3 >80% inh. biotipo S Coleoptilo S/I Bourgois et al, 1997 Tralkoxidim A. fatua 5 >80% inh. biotipo S Coleoptilo S/I Bourgois et al, 1997 Clodinafop A. sterilis 1 CL50 Raíz 13 días Collavo et al. 2008 Pinoxadem A. sterilis 0,5 CL50 Raíz 13 días Collavo et al. 2008 Clethodim A. sterilis 0,25 CL50 Raíz 13 días Collavo et al. 2008 Fenoxaprop-p Avena spp 21 No indica Brote 14 días Moss, 2000. Diclofop-ácido.

L. rigidum 31 Umbral de 20 mm Coleoptilo S/I Letouzé et al, 1997 Letouzé & Gasquez 1999

Diclofop-ácido.

L. rigidum 29,1mg/L CL50 Raíz y brote S/I Tal et al., 2000

Clodinafop-ácido

L. rigidum 0,06 mg/L

CL50 Raíz y brote S/I Tal et al., 2000

tralkoxidim L. rigidum 1,15 mg/L CL50 Raíz y brote S/I Tal et al., 2000 Diclofop L. multiflorum 32 No especifica Brote > 1 cm 14 días Moss, 2000 Clodinafop Lolium spp 1 CL50 Sobrevivencia 10 días Collavo et al., 2008 Pinoxadem Lolium spp 0,2 CL50 Sobrevivencia 10 días Collavo et al., 2008 Clethodim Lolium spp 0,05 CL50 Sobrevivencia 10 días Collavo et al., 2008 DL: Dosis Letal; CL50: Concentración Letal media; S/I: sin información Cuadro 2. Principales características de bioensayos con semilla para detectar ballicas resistentes a herbicidas inhibidores de ALS.

CONCENTRACIÓN DISCRIMINATORIA

HERBICIDA

MALEZA

Cantidad (μM) Basado en

Parámetro

Tiempo respuesta

REFERENCIA

Sulfometuron L. rigidum 0,027 >DL biotipo S

hoja > 1cm No indica Burnet et al., 1994.

Iodosulfuron L. multiflorum 0,9 mg /L CL50 Coleoptilo 6-10 días Díaz et al, 2005 Flucarbazone L. multiflorum 3,6 mg /L CL50 Coleoptilo 6-10 días Díaz et al, 2005

Cuadro 3. Principales características de bioensayos con semilla para detectar resistencia en L. multiflorum al herbicida glifosato (EPSFs).

CONCENTRACIÓN DISCRIMINATORIA

Cantidad (mg /L) Basado en

PARÁMETRO

Tiempo respuesta

REFERENCIA

31,56 – 39,4 CL50 Longitud Brote 8 días Pérez y Kogan, 2002 84,1 CL50 Longitud hoja 6-10 días Díaz et al, 2005

73,8 – 160,3 CL50 Germinación 7 días Pérez-Jones et al, 2007 Estudios realizados para desarrollar un test de germinación in vitro. En la puesta a punto del método se debieron considerar varios aspectos críticos relacionados con la semilla, tales como la viabilidad, dormancia, condiciones de germinación, y relacionar la respuesta en semilla a los herbicidas con estudios en planta. Estudios en planta. Primeramente se caracterizó la respuesta de un amplio número de biotipos sospechosos de resistencia en ballicas, avenilla y cola de zorro colectados entre la VIII y X Regiones. Estos estudios se realizaron en invernadero con herbicidas inhibidores de ACCasa (diclofop y clodinafop), inhibidores de ALS (iodosulfuron y flucarbazone) e inhibidor de EPSFs (glifosato). Los herbicidas se aplicaron en una cabina de aplicación experimental a dosis crecientes de 0, X/2, X, 2X, 4X y 8X (X = dosis técnica de campo). La respuesta se evaluó entre los 18 a 21 días (Figura 1), determinándose el peso seco de la parte aérea (60° C durante 72 h). Los datos se analizaron con el modelo log-logístico (SEEFELDT et al., 1995), para determinar los valores de DL50 (Dosis Letal media) para el biotipo resistente y sensible, y los factores de resistencia (FR = DL50 R/ DL50 S). Los resultados (Cuadros 4, 5 y 6) arrojaron un total de 8 biotipos R en ballicas al herbicida diclofop, 7 a clodinafop, 8 a idosulfuron, y 4 a glifosato. En avenilla se determinaron 2 biotipos R a diclofop y clodinafop. En cola de zorro 3 biotipos R a diclofop y clodinafop y 1 a flucarbazone. Con estos biotipos caracterizados se procedió a la ejecución de los estudios de germinación en semilla.

Figura 1. Curvas de dosis-respuesta del biotipo R de ballica (LM-20) y sensible (cv. Tama). Estudios en semilla. Para estos estudios se requiere de semilla viable y sin dormancia. Una semilla es dormante cuando no tiene la capacidad para germinar en un periodo específico de tiempo bajo cualquier combinación de factores físicos ambientales normales que sean favorables para su germinación. La semilla de malezas no escapan a esta situación y es conocida la dormancia innata de duración variable en especies del género Avena y Lolium. En la literatura se describe varios tipos de dormancia, como fisiológica, morfológica, morfofisiológica y física (FINCH-SAVAGE & LEUBNER-METZGER, 2006), y para lo cual existen diversos tratamientos químicos y físicos con el fin de

incrementar la germinación (ISTA, 1976; ELLIS et al., 1985; CFIA, 1997; DÍAZ et al., 2007). La viabilidad de la semilla se determinó mediante el test de tetrazolium (ISTA, 1976; AOSA, 2000). Los resultados indicaron índices de viabilidad de 92 a 100% para la semilla de ballica, avenilla y cola de zorro. La Figura 2 presenta una semilla de avenilla viable (embrión coloreado) y otra inviable (embrión no coloreado). Posteriormente, se evaluó la germinación, determinándose que en semilla colectada durante la temporada fue la que presentó los mayores porcentajes de dormancia. Para la ruptura de la dormancia de la semilla se evaluaron diferentes tratamientos físicos (frío y descascarado) y químicos (KNO3 y ácido giberélico) (ISTA, 1976; ELLIS et al., 1985; CFIA, 1997). Se lograron adecuadas respuestas para todas las especies, cuando se utilizó una combinación óptima en base a un pre-tratamiento físico seguido de otro químico que fue coaplicado durante la prueba de germinación. Estos ensayos se realizaron en una cámara de germinación calibrada con ciclos térmicos, fotoperiodo y humedad, descritos en la literatura para ballicas y avenilla; y para cola de zorro se utilizaron los de ballica (ISTA, 1976; CFIA, 1997).

Figura 2. Test de tetrazolium en avenilla, mostrando semilla (cariópside) viable con embrión de color rojizo (izquierda) e inviable con embrión sin coloración (derecha). Resuelto los aspectos más críticos de la germinación, se procedió a la ejecución de los bioensayos, evaluándose una amplia gama de concentraciones (8 a 10 en progresión geométrica) de los herbicidas diclofop, clodinafop, iodosulfuron, flucarbazone y glifosato. Las evaluaciones se realizaron en dos momentos, 6 y 10 días en ballica, 10 y 15 días en avenilla, y 10 y 21 días en cola de zorro. De cada semilla se evaluaron la longitud del coleoptilo y raíz, ajustándose los datos al modelo de regresión log-logística (SEEFELDT et al., 1995), cuya expresión matemática es Y=C+((D-C)/1+(x/ CL50)b). Para estimar los parámetros del modelo, los datos se sometieron a un análisis de regresión no lineal con un intervalo de confianza de 95% que incluía al cero y los coeficientes de determinación (R2) de cada regresión (programa SigmaPlot 8.0). El factor de resistencia se calculó mediante el cuociente de la concentración requerida para lograr una reducción del 50% (CL50) del parámetro evaluado versus la requerida para lograr este mismo efecto en el biotipo sensible (FR = CL50R/ CL50S). Se estableció como limite un valor igual o superior a 1,5 en el factor

de resistencia para designar a un biotipo como resistente. En los Cuadros 4, 5 y 6 se presentan los factores de resistencia obtenidos en planta y semilla, comprobándose la concordancia entre ambos tipos de estudio para detectar biotipos R. Los resultados obtenidos indican que las condiciones que se dieron para el manejo de la dormancia (4 días con un pre-tratamiento de frío), y posteriormente durante la germinación con un tratamiento químico para ruptura de dormancia junto a condiciones de temperatura, humedad y fotoperiodo, permitieron detectar biotipos R frente a determinadas concentraciones de herbicidas. El tiempo requerido por el test en ballica fue de 14 días para los herbicidas diclofop, clodinafop, iodosulfuron y glifosato; en avenilla el tiempo de respuesta alcanzó a 19 días para los herbicidas diclofop y clodinafop, y de 25 día en cola de zorro para los herbicidas diclofop, clodinafop y flucarbazone. En la Figura 3 se presenta un flujo con las principales etapas del test de germinación in vitro.

Figura 3. Flujo del test de germinación in vitro: pre-tratamiento de frío (1); cámara de germinación con semilla de biotipo R y S en placas petri (2); evaluación (H: hoja; C: coleoptilo) (3) y análisis estadístico (4).

Cuadro 4. Factores de resistencia (FR = DL50(R)/DL50(S)) en ballicas (LM: L. multiflorum y LR: L. rigidum) con herbicidas ACCasa, ALS y EPSFs.

Diclofop Clodinafop Iodosulfuron Glifosato Biotipo FR (P) FR (S) FR (P) FR (S) FR (P) FR (S) FR (P) FR (S)

LM-16 LM-19 LM-20 LM-22 LM-26 LM-30 LM-32 LM-33 LM-34 LM-45 LM-54

1,6 2,4 3,6

11,2 4,0 - -

2,1 4,9

- -

7,3 14,5 20,6 7,2

20,6 - -

2,1 5,0 - -

- 8,9 7,7 7,7 7,7 - -

8,3 3,9 - -

- 28,5 88,2 20,7 33,8

- -

3,8 5,9 - -

1,6 3,4 4,4 4,7 9,5 -

2,1 -

1,8 - -

1,5 21,0 22,4 6,0 2,0 -

2,3 -

1,5 - -

- - - - -

68,0 -

22,0 -

9,0 9,2

- - - - -

17,0 -

102,0 -

1.680 1.520

LR-25 5,3 27,6 2,7 188,0 5,7 2,0 - - FR (P): factor de resistencia en planta; FR(S): factor de resistencia en semilla. Cuadro 5. Factores de resistencia (FR = DL50(R)/DL50(S)) en avenilla (AF) con herbicidas ACCasa.

Diclofop Clodinafop Biotipo FR (P) FR (S) FR (P) FR (S)

AF-1 AF-2

10,6 8,2

2,7 3,3

2,7 2,2

14,9 10,7

FR (P): factor de resistencia en planta; FR(S): factor de resistencia en semilla. Cuadro 6. Factores de resistencia (FR = DL50(R)/DL50(S)) en cola de zorro (CE) con herbicidas ACCasa y ALS.

Diclofop Clodinafop Flucarbazone Biotipo FR (P) FR (S) FR (P) FR (S) FR (P) FR (S)

CE-3 CE-4

CE-10

17,2 12,9 9,2

14,9 17,4 6,8

1,8 7,8 3,2

11,9 81,0 71,0

- -

1,5

- -

1,8 FR (P): factor de resistencia en planta; FR(S): factor de resistencia en semilla. Conclusiones Para los biotipos de ballicas, avenilla y cola de zorro y herbicidas evaluados, se comprobó que existe una buena correlación entre la respuesta de germinación in vitro con la respuesta en planta para la identificación de resistencia. El test con semilla tiene un adecuado nivel de sensibilidad, dado que detecta biotipos con bajos niveles de resistencia en planta. También se comprobó la rapidez de respuesta, ya que se pudo identificar la resistencia en un plazo de 14, 19 y 25 días para ballicas, avenilla y cola de zorro, respectivamente. En consecuencia, se considera que este test cumple con las características de precisión, rapidez, simplicidad de ejecución y evaluación, y bajo requerimiento de espacio físico en comparación al bioensayo con planta. Todo lo anterior revela que este test incorpora características apropiadas para implementarse como servicio rutinario en la detección de ballicas, avenilla y cola de zorro resistentes a un número importante de herbicidas inhibidores de ACCasa, ALS y EPSFs. Agradecimiento Este trabajo fue financiado por el Proyecto FONDEF D04I1022.

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BASES MOLECULARES DE LA RESISTENCIA A HERBICIDAS Y TEST MOLECULAR PARA DETECTAR RESISTENCIA A HERBICIDAS EN BALLICAS

(Lolium multiflorum y L. rigidum)

R. Galdames, J. Díaz y N. Espinoza.

INIA, CRI-Carillanca –Temuco - Chile. e-mail: rgaldame@inia.cl

Resumen. La agricultura moderna se ha hecho dependiente de los herbicidas trayendo consigo la aparición de biotipos R de malezas. Alrededor de un 31 % y un 11% de los biotipos R conocidos a nivel mundial, que alcanzan a 332, han sido descritos para dos importantes grupos de herbicidas; los inhibidores de la ALS y ACCasa, respetivamente. En Chile esta situación pareciera no ser muy distinta, ya que recientemente se ha confirmado la presencia de 47 biotipos R. Hoy en día, importante conocimiento se ha acumulado respecto de los mecanismos involucrados en el fenómeno de la resistencia, especialmente a nivel molecular. A pesar que diversos mecanismos pueden estar asociados a la resistencia de una planta a un herbicida, aquí se describen aquellos conocidos como asociados al sitio activo, donde ciertos polimorfismos o mutaciones existentes en regiones críticas de los genes que codifican para la ALS o ACCasa explican mayoritariamente el fenotipo de resistencia. Mediante el empleo de herramientas basadas en la tecnología del ADN y particularmente mediante la técnica conocida como PCR (reacción en cadena de la polimerasa) es posible diagnosticar rápidamente la presencia de biotipos R, lo cual se considera fundamental para diseñar y/o implementar adecuadas estrategias de manejo de la resistencia. Un test de diagnóstico es descrito con ese fin.

Palabras clave: Resistencia, herbicidas, malezas, mutaciones, ACCasa, ALS, sitio de acción.

Summary: Modern agriculture has become depend of herbicides and thus have appeared the resistant biotype of weeds. About 31% and 11% of the resistant biotypes known worldwide, have been described for two important groups of herbicides: ALS- inhibitors and ACCase inhibitors, respectively. In Chile this situation seems not to be very different, as recently confirmed the presence of 47 resistant biotypes. Nowadays, important knowledge has been accumulated regarding the mechanisms involved in the phenomenon of resistance, especially at the molecular level. Although various mechanisms may be involved in the resistance of plants to herbicides, here are described those known as associated with the target site, where polymorphisms or mutations in critical regions of the genes coding for ALS or ACCasa, largely explain the resistance phenotype. Through the use of tools based on DNA technology, particularly using the technique known as PCR(polymerase chain reaction) can rapidly diagnose the presence of resistant, which are considered essential to design and / or implement appropriate strategies resistance management. A diagnostic test is described for this purpose.

Keywords: Resistance, herbicides, weeds, mutations, mechanisms, ALS-Inhibitors, ACCase-inhibitors, target sites.

Introducción

La agricultura moderna se ha hecho dependiente de los herbicidas por las reconocidas y diversas ventajas que ofrecen. Sin embargo, el uso continuo a través de los años, propio de una condición de monocultivo, se traduce normalmente en la aparición de biotipos resistentes (biotipos R). Lo anterior se considera particularmente cierto, para aquellos herbicidas en que su selectividad depende de un blanco único en la planta, como aquellos que inhiben la enzima Acetilcoenzima A carboxilasa (ACCasa) y la enzima acetolactato sintasa o ácido acetohidroxi sintasa (ALS o AHAS). Herbicidas graminicídas comercialmente muy importantes y muy efectivos se caracterizan por ser potentes inhibidores de la ACCasa y ALS.

La aparición de biotipos R ha tenido un crecimiento exponencial durante estas últimas décadas. Del total de biotipos R descritos a la fecha, que alcanza a 332 (HEAP, 2009, http://www.weedscience.com), alrededor de un 31 % presentan resistencia a herbicidas inhibidores de la ALS y un 11% a inhibidores de la ACCasa. Estos biotipos se encuentran distribuidos en 60 países, concentrándose mayoritariamente en Estados Unidos, Australia, Canadá, Francia y España (HEAP, 2009). La situación en Chile pareciera no ser diferente. Datos generados estos últimos 3 años han permitido confirmar, la existencia de al menos 47 biotipos R de gramíneas (ballicas, avenilla y cola de zorro) a herbicidas empleados normalmente en el control de malezas en trigo.

A nivel mundial y de manera simultánea a la aparición de biotipos R, se ha ido acumulando conocimiento de los diversos mecanismos bioquímicos y moleculares asociados al fenómeno de la resistencia. Entendiendo que los mecanismos que gobiernan la resistencia pueden ser múltiples, aquí se revisa y describen aquellos conocidos como asociados al sitio activo, para diferentes malezas gramineas a nivel mundial y lo que se ha logrado determinar en Chile en torno a biotipos R de ballicas en trigo. Simultáneamente, se describe un test molecular que está diseñado para identificar rápidamente los biotipos R de ballicas respecto a los sensibles, de tal forma de apoyar al agricultor, idealmente dentro de la misma temporada del cultivo para minimizar su impacto y reducir su dispersión.

Resistencia a herbicidas inhibidores de la acetil-CoA carboxilasa (ACCasa).

Los herbicidas Ariloxifenoxipropionatos (FOPs) y Ciclohexanodionas (DIMs), son fuertes inhibidores de la enzima acetyl-CoA carboxilasa (ACCasa) y se reconocen como excelentes graminicidas postemergentes. La ACCasa cumple un rol esencial en la síntesis y metabolismo de ácidos grasos y en la síntesis de importantes metabolitos secundarios, por lo que la inhibición de su actividad conduce eventualmente a la muerte de la planta. La actividad de la enzima en la planta, ocurre tanto en plástidos (se realiza la síntesis primaria de ácidos grasos) como en el citosol (síntesis de cadenas largas de ácidos grasos y de

flavonoides). La selectividad a estos herbicidas se debe a los diferentes tipos de ACCasa plastídicas. Las del tipo multidominio encontrada en el citosol de todas las plantas, y la del tipo multisubunidad encontrada en plástidos de dicotiledóneas, son resistentes a los herbicidas FOPs y DIMs. Por el contratio, la ACCasa plastídica de los pastos son sensibles a estos herbicidas. Aún cuando esto se considera la base primaria de la selectividad entre gramíneas y dicotiledoneas (Devine and Shukla,2000), algunas gramíneas dentro de las que se incluyen cereales, como el trigo, son tolerantes a estos herbicidas debido a su capacidad de metabolizar estos herbicidas a compuestos inactivos (Devine and Shimabukuro,1994).

La información disponible indica, que la región que comprende el dominio carboxil transferasa (CT) de la ACCasa plastídica posee los principales determinantes de sensibilidad a herbicidas FOPs y DIMs (NIKOLSKAYA et a.l, 1999). Evidencias adicionales señalan que estas moléculas herbicidas se unen al dominio CT de la ACCasa, lo cual ha sido inferido de la estructura tridimensional del complejo ACCasa de levadura con haloxyfop (ZHANG et al, 2004). Recientemente, fue modelada la estructura 3D del dominio CT de plantas normales y mutantes de A. myosuroides acomplejada con clodinafop, indicando que la sustitución de algunos residuos aminoacidicos normales resulta en una disminución por la afinidad del herbicida con su sitio de unión (ZHU et al., 2009) Desde principio del año 2000, diferentes sustituciones aminoacidicas en el dominio CT de la ACCasa plastídica, han sido implicadas en la resistencia a herbicidas FOPs y DIMs en distintas especies de malezas gramíneas, las que incluyen: Lolium rigidum (ZAGNITKO et al., 2001; DELYE et al., 2002; BROWN et al., 2002; TAL & RUBIN, 2004; ZHANG AND POWLES, 2006; DELYE et al.,2003; ZHANG AND POWLES,2006 ), L. multiflorum (WHITE et al., 2005); Avena fatua (CHRISTOFFERS et al.,2002), A. sterilis (LIU et al.,2007), Setaria viridis (DELYE et al., 2002) y Alopecurus myosuroides (DELYE et al., 2002, 2002; BROWN et al.,2002; DELYE et al.,2003; DELYE et al.,2005). Algunas de las mutaciones identificadas correlacionan directamente con resistencia para herbicidas FOPs y DIMs y en otros casos sólo con resistencia a representantes de algunos de ellos (Cuadro 1).

En biotipos R de ballicas (L. multiflorum y L. rigidum) detectados en Chile, se ha logrado confirmar la presencia de 7 diferentes mutaciones, sin embargo, dos no han sido descritas previamente (GALDAMES et al., 2008), por lo que su implicancia en conferir resistencia a diversos herbicidas FOP y DIM aún no ha sido determinada. Biotipos que muestras elevados niveles de resistencia a herbicidas FOPs, muestran una reducida sensibilidad al herbicidas diclofop, lo cual correlaciona directamente con la presencia de mutaciones (DÍAZ et al., 2008).

Cuadro 1. Sustituciones aminoacidicas en la ACCasa plastídica, descritas a nivel mundial en diferentes malezas gramíneas y que están asociadas a resistencia para uno o más herbicidas inhibidores de la ACCasa, determinadas mediantes bioensayos con plantas completas.

Aminoácido y posición1

Sustitución Especies de maleza

Herbicidas Referencias

Gln-1756 Leu L. rigidum FOP y DIM ZHANG & POWLES, 2006

ILe-1781 Leu A. myosuroides FOP y DIM BROWN et al, 2002; DELYE et al.,

2002 ;MOSS et al.,2003 Leu A. fatua FOP y DIM CHRISTOFFERS et al, 2002

Leu S. viridis

FOP y DIM ZHANG AND DEVINE, 2000; DELYE et al., 2002

Leu

L. rigidum

FOP y DIM ZAGNITKO et al. 2001; DELYE et al., 2002; ZHANG AND POWLES. 2006

Leu L. multiflorum FOP y DIM WHITE et al., 2005 Trp-1999 Cys A. sterilis FOP LIU et al., 2007 Trp-2027 Cys A. myosuroides FOP DÉLYE et al.,2005

Cys L. rigidum DIM QIN YU et al., 2007 A. sterilis FOP LIU et al., 2007

ILe-2041 Asn A. myosuroides FOP DÉLYE et al.,2005 Asn A. sterilis FOP LIU et al., 2007

Asn L. rigidum FOP DÉLYE et al.,2003; ZHANG AND POWLES, 2006

Val L. rigidum FOP DÉLYE et al.,2003 Asp-2078 Gly L. rigidum DIM QIN YU et al., 2007

Gly A. sterilis FOP y DIM LIU et al., 2007 Gly A. myosuroides FOPs y DIMs DÉLYE et al.,2005 Gly L. rigidum DIM QIN YU et al,.2007

Cys-2088 Arg L. rigidum DIM QIN YU et al.,2007 Gly-2096 Ala A. myosuroides FOPs DÉLYE et al.,2005

1 Posición aminoacidica de acuerdo a la secuencia de A. myosuroides  

Resistencia a herbicidas inhibidores de la enzima acetolactato sintasa o ácido acetohidroxi sintasa (ALS o AHAS).

La enzima ALS o AHAS cataliza el primer paso en la síntesis de aminoácidos ramificados en las plantas (valina, leucina e isoleucina), y es el blanco de herbicidas como las Sulfonilureas e Imidazolinonas, los cuales actúan como potentes y específicos inhibidores (DUGGLEBY et al., 2003).

Diversas características de los herbicidas inhibidores de la ALS han determinado que estén dentro de los más ampliamente empleados en el mundo. Lamentablemente, se han

caracterizado además, por su habilidad para seleccionar biotipos R de malezas (TRANEL & WRIGHT.,2002). Los casos de resistencia a este tipo de herbicidas se han incrementado en forma alarmante estos últimos años, correspondiendo mayoritariamente a malezas dicotiledóneas (TRANEL et al., 2009).

Varias mutaciones o cambios nucleotídicos en el gen que codifica para la ALS han sido asociadas a resistencia a herbicidas inhibidores de la ALS. Hasta ahora, mutaciones que conducen a sustituciones en una de 7 posiciones aminoácidicas (Ala-122, Pro-197, Ala-205, Asp-376, Trp-574, Ser-653 y Gly-654), han sido implicadas en el fenotipo de resistencia en distintas malezas (TRANEL et al, 2009).

A nivel mundial se han descrito biotipos R para 6 especies de gramíneas, las que incluyen: Bromus tectorum (PARK AND MALLORY.,2004), Scirpus juncoides (UCHINO et al.,2007), Hordeum leporinum (YU et al.,2007), Lolium rigidum (YU et al.,2008; TAN et al.,2007), Alopecurus myosuroides (DÉLYE Y BOUCANSAUD.,2008) y Setaria viridis (TAN et al.,2007; LAPLANTE et al.,2009). En estas especies, se han detectado sustituciones aminoacidicas en 4 posiciones, de las cuales cambios en Pro-197 y Trp-574 son los únicos descritos en L. rigidum.

En gramíneas, las mutaciones correlacionan mayoritaramente con resistencia a sulfonilureas y en menor grado con imidazolinonas, pyrimidinyl-(thio)-benzoatos y sulfonylamino-carbonyl-triazolinona (Cuadro 2).

En una población resistente de L. rigidum encontrada en Australia, se identificaron cinco mutaciones que conducen a sustituciones en Pro-197 y una en Trp-574; todas aquellas asociadas a Pro-197 confirieron resistencia a herbicidas sulfonylurea, en cambio la de Trp-574 confirió resistencia tanto a sulfonylurea como a imidazolinonas (YU et al, 2008).

En biotipos R de ballicas (L. multiflorum y L. rigidum) detectados en Chile, se han logrado determinar la presencia de tres diferentes mutaciones, todas ellas conducen a sustituciones en Pro-197, de las cuales una no ha sido descrita previamente. No todos lo biotipos R estudiados presentan mutaciones en el gen de la ALS, lo cual sugiere la existencia de otro mecanismo involucrado. (GALDAMES et al., 2008).

Cuadro 2. Sustituciones aminoacidicas descritas a nivel mundial en diferentes malezas gramíneas y que conducen a un fenotipo de resistencia en uno o más herbicidas inhibidores de la ALS.

Aminoácido y posición1 Sustitución Especie de maleza SU IMI PTB SC

T Referencia

Pro 197 Ser Bromus tectorum R S ND R PARK AND MALLORY His Scirpus juncoides R S S ND UCHINO et al.,2007 Ser Scirpus juncoides R S S ND UCHINO et al.,2007 Leu Scirpus juncoides R S S ND UCHINO et al. ,2007 Ser Hordeum leporinum R S ND ND YU et al.,2007 Ser Lolium rigidum R S ND ND YU et al.,2008 Ala Lolium rigidum R S ND ND YU et al.,2008 Leu Lolium rigidum R S ND ND YU et al.,2008 Gln Lolium rigidum R S ND ND YU et al.,2008. Thr Alopecurus myosuroides R ND ND ND DÉLYE AND BOUCANSAUD.,2008 Arg Lolium rigidum R S ND ND YU et al.,2008

Trp 574 Leu Lolium rigidum R R ND ND TAN et al.,2007 Leu Scirpus juncoides R R R ND UCHINO et al.,2007 Leu Alopecurus myosuroides R ND ND ND DÉLYE AND BOUCANSAUD.,2008

Ser 653 Ile Setaria viridis r R R r LAPLANTE et al.,2009 Asn Setaria viridis r R R r LAPLANTE et al.,2009 Thr Setaria viridis r R S r LAPLANTE et al.,2009

Gly 654 Setaria viridis r R S r TAN et al.,2007

1. Posición aminoacidica de acuerdo a la secuencia de Arabidopsis thaliana ; S = Biotipo susceptible; r = Resistencia moderada (< 10 veces respecto al biótipo sensible); R = Resistencia alta (> 10 veces); ND = No determinada; SU = Sulfonylureas; IMI = Imidazolinones; PTB= Pyrimidinylthiobenzoates; TP= Triazolopyrimidines; SCT=Sulfonylaminocarbonyltriazolinone Test molecular para el diagnóstico de biotipos R.

Muchas técnicas de diagnóstico han sido desarrolladas para detectar y/o confirmar la presencia de biotipos R, con la finalidad de implementar adecuadas estrategias de manejo de la resistencia. Normalmente los bioensayos con plántulas o pruebas in vitro que miden actividad enzimática, arrogan resultados confiables, pero son laboriosos y /o extenuantes por lo que normalmente no permiten ofrecer respuestas en la misma temporada de desarrollo del cultivo.

Dado que un número importante de casos de resistencia son debidos a mutaciones o polimorfismos nucleotídicos conocidos, hoy en día es posible, mediante el empleo de herramientas basadas en la tecnología del ADN y particularmente mediante la técnica conocida como PCR (reacción en cadena de la polimerasa) identificar rápidamente biotipos R. De hecho, usando esta herramienta han sido identificados biotipos R para herbicidas inhibidores de la ALS (DÉLYE AND BOUCANSAUD,2007) como para herbicidas

inhibidores de la ACCasa (DÉLYE et al.,2002; KAUNDUN AND WINDASS,2006; LIU et al., 2007).

Para fines de diagnóstico molecular existen muchas variantes de la técnica PCR, que permiten discriminar entre un alelo mutado y el normal, las que incluyen: PCR-alelo especifico (discrimina mediante el diseño de partidores específicos), RFLP- PCR o CAP-PCR (amplificación del fragmento de ADN donde está presenta la mutación y luego se corta con enzimas restricción) y dCAPS-PCR (variante del método anterior donde se crea artificialmente un sitio de reconocimiento para una enzima para luego cortar).

La reproducibilidad, robustez y rapidez son atributos básicos requeridos en el método de diagnóstico a aplicar. De acuerdo a los alelos identificados y que son predominantes en biotipos R de Lolium (L. multiflorum y L. rigidum) en el sur de Chile, se ha implementado una variante de la técnica dCAPS-PCR, que consta de cuatro pasos principales: 1) Amplificación por PCR de la (s) región (es) que abarcan los sitios que incluyen las mutaciones conocidas, 2) PCR semi-anidado con partidores dCAPS, 3) Digestión con enzima de restricción, y 4) Revelado de alelos normales y/o mutados en gel de agarosa.

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Descripción de un servicio de detección de malezas gramíneas resistentes a herbicidas (SEDBIR).

Jorge Díaz S., Rafael Galdames G. y Nelson Espinoza N.

INIA-Carillanca, Casilla 58-D, Temuco, Chile. e-mail: jdiaz@inia.cl Resumen Se describen las principales etapas de los test de detección molecular y de germinación in vitro, y una base de datos con herbicidas alternativos para el control de biotipos R, los cuales conforman un servicio de detección de malezas gramíneas resistentes a herbicidas (SEDBIR). Palabras claves: test molecular, test de germinación in vitro, ballica, avenilla, cola de zorro. Summary It describes the main steps of molecular and in vitro germination test, and a database of alternative herbicides to control biotypes R, which form a detection service of resistant grass weeds (SEDBIR). Key words: molecular test, in vitro germination test, ryegrass, wildoat, crested dogtailgrass. Introducción. La resistencia a herbicidas es un problema cada vez más creciente, estimándose que del total de la superficie sembrada con trigo, cebada, avena, lupino y raps en el país, aproximadamente 75 mil hectáreas están infestadas con biotipos resistentes (biotipos R) de ballicas, 40 mil ha con biotipos R de avenilla y 25 mil ha con biotipos R de cola de zorro. Enfrentar el problema de la resistencia exige de herramientas que permitan detectar biotipos R en forma rápida y precisa, de manera de implementar medidas oportunas de control. Las herramientas que conforman un Servicio de Detección de Biotipos R (SEDBIR) son un test molecular, que en un plazo no mayor a 48 horas entregará información sobre la existencia o no de ballicas resistentes, un test de germinación in vitro para ballicas, avenilla y cola de zorro, con un tiempo de respuesta de 2 a 4 semanas, y una base de recomendación con herbicidas alternativos para el control de biotipos R detectados. Los usuarios directos de este servicio serán los productores de trigo y de otros cultivos extensivos, técnicos, profesionales y empresas que proveen de insumos a estos rubros productivos. Descripción de los test. Test molecular. La aplicación de este test, diseñado hasta el momento sólo para ballicas (L. muliflorum y L. rigidum), incluye las siguientes etapas: colecta de plantas en campo, envío a laboratorio, recepción de la muestra para su procesamiento, análisis molecular e informe final. Colecta de plantas: Dos procedimientos de colecta son sugeridos. Para una situación de campo donde existen focos o manchones de plantas sobreviviendo a una aplicación, se recomienda la toma directa en ese sector (Figura 1A). En una situación previa a un tratamiento de control donde existe una distribución amplia de malezas, se sugiere realizar un muestreo aleatorio y que sea representativo del potrero. Se recomienda tomar plantas frescas individuales. Se requieren 100 plantas/ha, las que deben ser colectadas en grupos

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de 10. Una vez realizada la colecta se recomienda enviar la muestra lo más pronto posible y dentro de bolsas de papel. Si no es posible su envío inmediato, almacenar a 4 0C hasta su despacho. Envío a laboratorio: La muestra debe ir acompañada con una hoja de ingreso que contenga información básica como el historial de manejo del potrero (cultivos, herbicidas usados, frecuencia, dosis, niveles de control) y breve opinión del agricultor sobre la eficacia de los tratamientos en temporadas anteriores (Figura 1B). Recepción y análisis: Una vez en el laboratorio, las plantas se someterán a extracción de su ADN (Figura 1C), para efectuar los rondas de amplificación PCR, digestión con enzimas de restricción y revelado en gel de agarosa de mutaciones específicas asociadas a resistencia a herbicidas inhibidores de la ACCasa y ALS (Figura 2). Informe final: Se entregarán los resultados de presencia de mutaciones específicas y su frecuencia, indicando una recomendación de control con herbicidas alternativos dentro de 48 h de recibida la muestra.

B CA

Figura 1. Colecta de plantas (A), envío a laboratorio (B) y extracción de ADN (C).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Figura 2. Reacción PCR, digestión con enzimas, corrida electroforética y revelado en gel de agarosa (planta 3, 7 y 8 presentan una mutación específica).

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Test de germinación in vitro. El procedimiento general de este test para malezas gramíneas (avenilla, ballicas y cola de zorro), considera las etapas de colecta de la semilla en campo, despacho a laboratorio, recepción y preparación de la semilla, análisis e interpretación de resultados y entrega de informe final. Colecta de semilla: Recorrer el sitio (Figura 3A) y seleccionar puntos de muestreo (Figura 3B) en sectores donde se tenga sospecha de la presencia de malezas resistentes (muestreo dirigido). Se debe evitar aquellos sectores que no han sido pulverizados, también los deslindes, orillas de camino y en general cualquiera que no sea representativo del problema. La calidad de la muestra es esencial, para lo cual la semilla debe estar madura, y colectarse desde plantas que estén en pie. La remoción debe ser directa desde la inflorescencia a una bolsa (Figura 3C). El tamaño de la muestra para una superficie de 1 a 10 ha es de 1.000 a 3.000 semillas (20-60 g avenilla, 4-12 g ballica y 2-8 g cola de zorro) (Figura 4). Se debe evitar la colecta en momentos de alta humedad por que puede afectar a la calidad de la semilla, y enviarse lo más pronto posible al laboratorio. Si requiere ser almacenada por un periodo prolongado, utilizar bolsas de papel y en condiciones de refrigeración (4 – 5 °C). Envió a laboratorio: La muestra debe ir acompañada con una hoja de ingreso (Figura 5) que contenga información básica como el historial de manejo del potrero (cultivos, herbicidas usados, frecuencia, dosis, niveles de control) y breve opinión del agricultor sobre la eficacia de los tratamientos en temporadas anteriores. Recepción y preparación de la muestra: La muestra se limpia descartando restos o residuos vegetales y se selecciona la semilla eliminándose toda las dañadas y vana. Previo al análisis, la semilla se desinfecta y se le somete a un tratamiento de frío. Preparación y ejecución del test: Un aspecto esencial es contar con semilla sensible a herbicida (biotipo S). El test se inicia con la aplicación del herbicida y de un tratamiento químico para la ruptura de la dormancia. Las muestras del biotipo R y S se hacen germinar bajo condiciones reguladas de temperatura y fotoperiodo según especie de maleza. Los herbicidas que se utiliza son diclofop y clodinafop (inhibidores de ACCasa), iodosulfuron y flucarbazone (inhibidores de ALS) y glifosato (inhibidor de EPSFs). Evaluación e interpretación de resultados: Se mide la respuesta de la semilla, se procesan los datos y se someten a un análisis computacional (Figura 6). Informe final: El resultado de presencia o ausencia de resistencia demora entre 2 a 4 semanas según la especie de maleza (14 días para ballicas, 19 días para avenilla y 25 días para cola de zorro), y se entregará acompañándolo de una recomendación de control con herbicidas alternativos.

A B

C

Figura 3. Recorrido del sitio (A); punto de muestreo (B) y toma de muestra (C).

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Figura 5. Hoja de envío a laboratorio.

Figura 4. Semilla de ballicas (a y b); cola de zorro (c) y avenilla (d).

Figura 6. Evaluación e interpretación de resultados. Base de datos con opciones de control. Es un catálogo de uso de herbicidas como pauta para prevenir y controlar biotipos R. Esta base de datos contiene un listado de los biotipos R asociados al cultivo de trigo y a otros cultivos extensivos importantes en la zona sur, tales como raps y lupino, avena y triticale confrontado con un listado de herbicidas a los cuales se ha generado resistencia y con un listado de herbicidas alternativos para su control. El listado de biotipos R contiene una descripción de las principales características como el área geográfica (región), cultivo en que se colecto, sistema de siembra, rotación de cultivos y herbicidas a los que se ha generado resistencia, y sensibilidad a herbicidas alternativos (Tabla 1). Los biotipos R identificados por los test de detección, se confrontan con la base de datos para obtener las opciones o alternativas de herbicidas para su control.

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Tabla 1. Ejemplo de base de datos con las principales características del biotipo resistente (X) y las alternativas de control. Biotipo Año

Detección Región Situación de

colecta Sistema de

siembra Rotación de

cultivos X 2006 La Araucanía Trigo Cero labranza Trigo-avena

Continuación Tabla 1. Biotipo Resistente a

ACCasa ALS Sensible a Otras alternativas de

control

X diclofop,

clodinafop,

flucarbazone ACCasa: tepraloxydim

EPSFs: glifosato

ALS: iodosulfuron + mesosulfuron, imazamox +

imazapyr Flujo general del SEDBIR. En la Figura 7 se presenta el flujo del SEDBIR destacándose los pasos generales y tiempos de respuesta de cada test. Los resultados generados por los test se confrontan con una base de datos que contiene un listado de herbicidas alternativos para el control de biotipos R, incluyéndose en el informe final la(s) alternativa(s) más adecuada(s) para el control del biotipo R detectado.

Figura 7. Flujo que describe el SEDBIR. Agradecimiento Este trabajo fue financiado por el Proyecto FONDEF D04I1022.

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