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UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO NÚCLEO DE PESQUISAS CIÊNCIAS BIOLÓGICAS – NUPEB
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIENCIAS BIOLÓGICAS
Resposta ao estresse ácido em Saccharomyces cerevisiae e efeito protetor do íon sódio na
morte celular induzida por ácido
AUTORA: GILZEANE DOS SANTOS SANT’ANA
ORIENTADOR: PROF. Dr. IESO DE MIRANDA CASTRO
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, como parte integrante dos requisitos para a obtenção do Título de Doutor(a) em Ciências Biológicas, área de concentração: Biologia Molecular
Ouro Preto – Minas Gerais Maio de 2009
II
RESUMO
Saccharomyces boulardii é usada como probiótico para previnir ou tratar distúrbios
gastrointestinais ocasionados pelo uso excessivo de antibióticos, ou em enterites agudas. A
fim de exercer os efeitos benéficos, os probióticos devem ter um mecanismo que os
protegem do estresse do ambiente gástrico intestinal. Neste trabalho analisamos as
diferenças metabólicas na resposta ao estresse ácido de S. boulardii comparativamente a S.
cerevisiae W303, bem como a proteção conferida pela adição do íon sódio nesta condição.
Como esperado, S. boulardii exibiu maior tolerância ao meio gástrico simulado frente às
outras linhagens de S. cerevisiae. Sob estas condições o baixo pH (pH 2) foi o principal
fator responsável pela diminuição da viabilidade celular. Neste trabalho observamos que a
adição de baixas concentrações de cloreto de sódio foi mais eficaz do que a adição de
outros sais na proteção das células em condições de estresse ácido. O efeito protetor do Na+
na viabilidade de leveduras, sob condições ácidas, foi testado utilizando cepas de S.
cerevisiae com deleções nos genes que codificam proteínas envolvidas na homeostase de
sódio, como por exemplo, os genes que codificam para a bomba Na+ATPase (ena1-4∆) e
genes codificadores dos canais trocadores Na+/H+ (nha1∆) e Na+/H+ pré-vacuolar (nhx1∆).
O efeito protetor de NaCl está relacionado à influência do íon Na+ no potencial elétrico de
membrana citoplasmática. Além disso, a ausência ou baixa expressão do gene que codifica
para a proteína Ena1-4p sugere uma relação direta com os níveis basais do potencial de
membrana citoplasmática das células de leveduras. É provável que a resistência de S.
boulardii e do mutante ena1-4∆ ao estresse ácido (na ausência ou presença de NaCl), deve-
se ao elevado potencial basal da membrana destas células e ao fato do íon sódio retardar a
despolarização da membrana induzida pelo pH 2.0. Além disso, o maior conteúdo de
trealose observado em S. boulardii pode ter contribuído para a resposta mais eficiente
frente ao estresse ácido dos sinais metabólicos avaliados.
III
ABSTRACT
Saccharomyces boulardii as a probiotic is used to prevent or treat gastrointestinal disorders
caused by excessive use of antibiotics, or in acute enteritis. In order to exert beneficial
effects, the probiotic must have a mechanism that protects the gastric intestinal stress
environment. We examined the differences in metabolic response to acid stress in
S. boulardii compared with S. cerevisiae W303 and the protection conferred by the addition
of sodium ion in this condition. As expected, S. boulardii exhibited higher tolerance to
simulated gastric environment facing the other strains of S. cerevisiae. Under these
conditions the low pH (pH 2) was the main factor responsible for the decrease in cell
viability. In this work we observed that the addition of low concentrations of sodium
chloride was more effective than the addition of other salts in the protection of cells under
conditions of acid stress. The protective effect of Na + on the viability of yeast cells under
acidic conditions, was tested using using S. cerevisiae null mutants for Na+-ATPases (ena
1-4 null mutant), for Na+/H+ antiporter (nha1∆) and Na+/H+ antiporter prevacuolar (nhx1∆).
The protective effect of NaCl relates with the effect of ion Na+ in electric membrane
potential. Additionally, the absence or low expression/activity of Ena proteins seems to be
closely related to basal membrane potential of yeast cells. Moreover, the absence or low
expression of the gene coding for protein Ena1-4p suggests a direct relationship with the
levels of membrane potential of yeast cells. It is likely that the resistance of S. boulardii
and ena1-4∆ mutant to acid stress (in the absence or presence of NaCl), due to the high
potential of the basal membrane of these cells and because of the ion slowing of membrane
depolarization induced by pH 2.0. Furthermore, the highest concentration of trehalose
observed in S. boulardii may have contributed to a more efficient response against the
stress of acid metabolic signals evaluated.
IV
Trabalho desenvolvido no Laboratório de Biologia Celular e Molecular do Núcleo de
Pesquisas em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, sob a orientação
do Professor Dr. Ieso de Miranda Castro e com auxílio financeiro da Coordenadoria de
Aperfeiçoamento de Pessoal do Ensino Superior (CAPES), da Fundação de Amparo a
Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG), do Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e da Universidade Federal de Ouro
Preto (UFOP).
V
ÍNDICE
RESUMO
II
ABSTRACT III
LISTA DE ABREVIAÇÕES
X
LISTA DE TABELAS
XIII
LISTA DE FIGURAS
XIV
Introdução............................................................................................
1
1 Introdução 2
1.1 A levedura do gênero Saccharomyces................................................... 2
1.1.1 Saccharomyces cerevisiae..................................................................... 2
1.1.2 Saccharomyces boulardii...................................................................... 4
1.2 Mecanismos envolvidos em resposta a estresse em leveduras.............. 7
1.3 Mecanismo de resposta ao estresse ácido.............................................. 14
Objetivos.............................................................................................
18
2 Objetivos............................................................................................. 19
2.1 Objetivo Geral...................................................................................... 19
VI
2.2 Objetivos Específicos........................................................................... 19
Material e métodos.............................................................................
21
3 Material e métodos.............................................................................. 22
3.1 Cepas Saccharomyces utilizadas nos experimentos.............................. 22
3.2 Meios de cultura e condições de cultivo................................................ 23
3.3 Condições de estresse............................................................................ 24
3.3.1 Teste de Viabilidade.............................................................................. 24
3.4 Reação em cadeia da polimerase em tempo
real.................................................................................................
25
3.4.1 Extração e preparação de RNA total de levedura.................................. 25
3.4.2 Obtenção do cDNA............................................................................... 26
3.4.3 Reação em cadeia da polimerase em tempo real.…………….....……. 29
3.5 Medidas do pH interno.......................................................................... 29
3.6 Conteúdo intracelular de sódio e potássio............................................. 30
3.7 Atividade H+-ATPásica......................................................................... 32
3.7.1 Obtenção das membranas citoplasmáticas............................................ 32
3.7.2 Ensaio da atividade H+-ATPásica.......................................................... 33
3.7.3 Dosagem de proteína....................................................................................... 35
3.8 Determinação do potencial de membrana............................................. 35
3.8.1 Aquisição e análise dos dados em citômetro de fluxo.......................... 35
3.8.2 Curva padrão de potencial com células fixadas.................................... 36
3.9 Medida de cálcio celular total................................................................ 37
3.10 Atividade Ca+2-ATPásica...................................................................... 39
3.10.1 Obtenção da fração de membrana subcelular para o estudo do perfil
de atividade da Ca+2 – ATPase vacuolar (Pmc1 p)...............................
39
VII
3.10.2 Identificação das frações contendo membrana subcelular de vacúolo.. 40
3.10.3 Ensaio da atividade Ca2+ - ATPásica .................................................... 40
3.10.4 Dosagem de proteína............................................................................. 41
3.11 Monitoramento in vivo da concentração de cálcio citosólico livre....... 41
3.11.1 Transformação de levedura................................................................... 41
3.11.1.1 Preparo de células de levedura competentes......................................... 41
3.11.1.2 Transformação de levedura................................................................... 42
3.11.2 Concentração de cálcio citosólico livre em estresse ácido.................... 43
3.12 Capacidade tamponante de células e extrato celular..........................… 44
3.13 Análise Lipídica por Cromatografia Gasosa......................................... 44
3.14 Dosagem de reservas energéticas.......................................................... 45
3.14.1 Dosagem de trealose e glicogênio......................................................... 46
3.14.2 Dosagem de níveis de ATP.................................................................. 47
3.15 Estatística…………......................................................……………… 47
Resultados.................................................................….....….....….....
48
4. Resultados............................................................................................ 49
4.1 Tolerância das cepas Saccharomyces ao suco gástrico e a seus
componentes..........................................................................................
49
4.1.1 Efeito do estresse pH ácido em cepas Saccharomyces
cerevisiae......................
49
4.1.2 Efeito protetor de íons na viabilidade sob o estresse
ácido.......................
52
4.2 Viabilidade ao estresse ácido em cepas Saccharomyces selvagens e
com deleções nos genes que codificam proteínas envolvidas na
homeostase do sódio..............................................................................
55
VIII
4.2.1 Variações do pH intracelular em cepas Saccharomyces selvagens e
com deleções nos genes que codificam proteínas envolvidas na
homeostase do sódio..............................................................................
60
4.3 Participação da H+- ATPase de membrana plasmática em resposta ao
estresse gástrico....................................................................................
63
4.4 Potencial de membrana das células submetidas ao estresse ácido........ 65
4.5 Análise de alterações metabólicas que podem esclarecer a maior
resistência da cepa Saccharomyces boulardii sob o estresse ácido.......
77
4.5.1 Avaliação da homeostase do cálcio em cepas Saccharomyces sob o
estresse ácido.........................................................................................
67
4.5.2 Capacidade tamponante das cepas S. boulardii sob o estresse ácido ... 72
4.5.3 Análise qualitativa das alterações na composição lipídica de
membrana das cepas Saccharomyces sob o estresse ácido....................
74
4.5.4 Análise quantitativa das reservas energéticas durante a exposição ao
estresse ácido.........................................................................................
76
Discussão.............................................................................................. 79
5 Discussão.............................................................................................. 80
Conclusões............................................................................................ 90
6 Conclusões............................................................................................ 91
Perspectivas.......................................................................................... 93
IX
7 Perspectivas.......................................................................................... 94
Referências Bibliográficas..................................................................
95
8 Referências Bibliográficas..................................................................
96
X
LISTA DE ABREVIAÇÕES
ACT1 Gene que codifica para a actina
ADP Adenosina 5´ bifosfato
AMPc Adesosina 5´ monofosfato cíclico
ANSA 1-Amino- 2- hidroxi- 4 - ácido naftaleno sulfônico
ATP Adenosina 5´ Trifosfato
cDNA DNA complementar
DAA Diarréia associada ao uso de antimicrobianos
DiBAC4(3) Bis-oxonol trimetina (1,3- ácido dibutilbarbitúrico)
DNA Ácido desoxirribonucléico
DNTPs Desoxinucleotídeos 5´ trifosfato
EDTA “Ethylene diamine tetraacetic acid” ou ácido etileno diamino tetra-
acético
EGTA “Ethylene glycol tetraacetic acid” ou ácido etileno glicol tetra-
acético
ENA1 Gene que codifica para a bomba de Na+K+ de membrana
citoplasmática Ena1p
Ena1p Bomba de Na+K+ de membrana citoplasmática
FDA Food and drug administration
GRAS Generally recognized as safe ou Geralmente reconhecido como
seguro
HEPES Ácido N-2-HidroxietilPiper, P.azina-N'-2'-Etanossulfônico
HSP Heat schock proteins ou proteínas de choque térmico
HSP70 Heat schock protein family 70 ou família 70 de proteínas de
choque térmico
XI
KDa Quilodáltons
Kha1p Canal antiporter K+/H+ na membrana do complexo de golgi
Km Constante de Michaelis-Menten
MIDI Microbial identification system ou Sistema de identificação
microbiana
NHA1 Gene que codifica para o canal antiporter de membrana
citoplasmática Na+K+/H+
Nha1p Canal antiporter de membrana citoplasmática Na+K+/H+
Nhx1p Canal antiporter de membrana pré-vacuolar Na+K+/H+
NSC1 Gene que codifica para o canal de influxo de Na+ e K+
OLE1 Gene que codifica para a desaturase de ácidos graxos Delta(9)
PB Pares de bases
Pdr12p Transportador ABC de membrana citoplasmática
PDR12 Gene que codifica para o transportador ABC de membrana
citoplasmática Pdr12p
PMA1 Gene que codifica para H+-ATPase de membrana citoplasmática
Pma1p H+-ATPase de membrana citoplasmática
PMA2 Gene que codifica uma isoforma da H+-ATPase de membrana
citoplasmática
Pma2p Isoforma da H+-ATPase de membrana citoplasmática
PMC1 Gene que codifica para a Ca+2- ATPase de membrana vacuolar em
leveduras
Pmc1p Ca+2- ATPase de membrana vacuolar de leveduras
PMR2 Gene que codifica para isoformas distintas da bomba de Na+ de
membrana citoplasmática, Ena.
PMSF Phenylmethylsulphonyl fluoride ou fluoreto de fenilmetil sulfonil
RNA Ácido ribonucléico
XII
ROS Espécies reativas de oxigênio
RT-PCR Real time PCR ou PCR em tempo real
SSA1 Proteína chaperonina membro da subfamília SSA de proteínas
HSP70
SSA2 Proteína chaperonina membro da subfamília SSA de proteínas
HSP70
SSA3 Proteína chaperonina membro da subfamília SSA de proteínas
HSP70
SSA4 Proteína chaperonina membro da subfamília SSA de proteínas
HSP70
TCA Ácido tricloroacético
TM Temperatura ótima de anelamento
Trk1p/Trk2p Canal de influxo de K+ na membrana citoplasmática
UFC Unidade formadora de colônia
URL Unidade relativa de luminescência
Vmax Velocidade máxima
Vma1p H+-ATPase de membrana vacuolar
XIII
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Viabilidade das cepas Saccharomyces em pH 2 na presença ou ausência
de íons Na+.
57
Tabela 2 pH intracelular de cepas Saccharomyces e mutantes envolvidos no
transporte de sódio, submetidos ao estresse ácido (pH 2 + 85 mM de
NaCl).
61
Tabela 3 Potencial de membrana das cepas Saccharomyces
66
XIV
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Principais sistemas de transporte responsável pela homeostase de K+/Na+
em S. cerevisiae.
13
Figura 2 (A) Viabilidade das cepas de Saccharomyces em ambiente gástrico
simulado. (B) Efeito isolado dos componentes do ambiente gástrico
simulado na presença de NaCl.
51
Figura 3 Viabilidade sob estresse ácido na presença de NaCl na viabilidade de S.
boulardii e S. cerevisiae W303
53
Figura 4 Efeito de sais na tolerância ao pH 2 em S. boulardii (A) e W303 (B). 54
Figura 5 Efeito de 5 µg/mL de cicloheximida na viabilidade de Saccharomyces
crescidas em meio YPD 4% e expostas em estresse ácido. S.boulardii
(Painel A) e S. cerevisiae W303 (Painel B).
58
Figura 6 Nível de transcrição dos genes ENA1 e NHA1 em S. boulardii e S.
cerevisiae W303 por RT-PCR.
59
Figura 7 Alterações no conteúdo intracelular de Na+ (Painel A) e K+ (Painel B) em
cepas Saccharomyces.
62
XV
Figura 8 Ativação da H+-ATPase de membrana plasmática.. 64
Figura 9 Medida de cálcio celular total, em cepas Saccharomyces. 69
Figura 10 Atividade Ca+-ATPásica das cepas Saccharomyces. 70
Figura 11 Sinal de cálcio das cepas Saccharomyces crescidas em YPD e submetidas
ao pH 2
71
Figura 12 Capacidade tamponante das cepas Saccharomyces crescidas em meio YPD
e submetidas ao estresse ácido. Painel A: Capacidade tamponante das
células; Painel B: Capacidade tamponante dos extratos celulares.
73
Figura 13 Dendograma da análise lipídica da membrana plasmática de S. cerevisiae
W303 e S. boulardii.
75
Figura 14
Conteúdo de trealose, glicogênio e ATP em cepas Saccharomyces crescidas
em meio YPD 4% até D.O.600nm 1,0 e submetidas ao estresse ácido pH 2.
78
Introdução
2
1.- Introdução
A levedura Saccharomyces cerevisiae var. boulardii têm sido amplamente
estudada de acordo com suas propriedades probióticas e mecanismos de ação contra
vários patógenos causadores de diarréias. Objetivando alcançar o intestino do
hospedeiro em número satisfatório para exercer o papel probiótico, S. boulardii
necessita resistir as condições inóspitas enfrentadas no decorrer do trato digestivo,
dentre elas, a resistência ao pH ácido, devido a presença do ácido clorídrico no
estômago.
Os mecanismos pelos quais a cepa probiótica S. boulardii apresenta maior
resistência frente às diversas condições de estresse, ainda não estão bem esclarecidos,
principalmente no que diz respeito ao estresse ácido.
A utilização de Saccharomyces cerevisiae como modelo de estudo para elucidar
os mecanismos de resposta ao estresse ácido tem sido quase que exclusivamente
estudado em estresse com ácidos orgânicos, e há poucos estudos com respostas ao
estresse com ácido inorgânico e mecanismos de proteção nestas condições.
As leveduras pertencentes ao gênero Saccharomyces são classificadas como
fungos do filo Ascomicota, ordem Saccharomycetalia, família Saccharomycetacea e
gênero Saccharomyces (Bisby, F. A. et.al., 2006).
1.1.1 - Saccharomyces cerevisiae
A levedura Saccharomyces cerevisiae é reconhecida como um organismo
modelo é um eucarioto simples cujo genoma pode ser facilmente manipulado. Estudos
sobre a função de genes de mamíferos são frequentemente feitos em S. cerevisiae, que
ao contrário da maioria dos microrganismos, pode ser tanto haplóide, diplóide ou
mesmo poliplóide.
Algumas propriedades que tornam as leveduras bastante adequadas para estudos
biológicos incluem o rápido crescimento celular, rápido crescimento, segurança na
manipulação (GRAS – Generally Recognized as Safe), facilidade no isolamento de
3
mutantes, além de possuir um sistema de transformação de DNA bastante versátil
(Goffeau, A. et. al, 1996; Hughes, T. et.al., 2004; Stambuk, B. U. A., 1999). S.
cerevisiae foi o primeiro organismo eucarioto em que o genoma foi completamente
sequenciado e depositado em bancos de dados públicos como
http//www.yeastgenoma.org, o que permitiu a clonagem de diferentes genes, sua rápida
identificação e caracterização, bem como a melhor compreensão da sua função celular.
S. cerevisiae tornou-se modelo eucarioto ideal, com ferramentas moleculares
apropriadas para manipulação gênica e estudos de expressão, como o transcriptoma,
proteoma, metaboloma, que propiciam esclarecimento de diversas rotas metabólicas (Da
Silva, M. E. e cols., 1990; Murphy, A. e cols.,1999; Zigova, J., 2000; Pena-Castillo e
Hughes, T., 2007; Jones, G.M. e cols., 2008; Maya, D. e cols.,2008; Schuster, S. e cols.,
2008).
A célula de levedura possui mecanismos de adaptação eficientes para
manutenção da alta taxa de crescimento, mesmo após as mudanças promovidas pelo
próprio metabolismo, o que está diretamente relacionado à capacidade de regular a
expressão de genes apropriados ao regime nutricional em que a célula se encontra. A
expressão de genes e a consequente síntese de proteínas são diretamente influenciadas
pelas condições nutricionais (KruckeBerg, R., R. e cols., 1998).
A levedura é uma fonte biológica para obtenção de produtos de interesse na
indústria farmacêutica e de alimentos, como por exemplo, invertase, hexoquinase,
glicose-6-fosfato desidrogenase, glicose oxidase, proteases e outras, além da possível
utilização de sua própria biomassa celular como fonte de proteínas na alimentação
animal e humana (Pessoa Jr e cols., 1996; Silva, M. E., 1998; Benítez e cols., 1996).
Diferentes modificações genéticas podem gerar efeitos no metabolismo de
S. cerevisiae, obtendo-se assim cepas específicas para a produção de substâncias de
valor comercial. Por ser um organismo eucarioto, é um hospedeiro adequado para
produção elevada de proteínas citosólicas solúveis e secretadas, do mesmo modo são
capazes de promover modificações pós-traducionais em proteínas, como a glicosilação
e/ou outras modificações necessárias para a ótima atividade biológica e estabilidade
protéica (Zigova, J., 2000).
4
1.1.2 - Saccharomyces boulardii
A levedura S. boulardii não patogênica foi isolada da fruta lichia (Litchi
chinensis) na Indochina. Desde o início dos anos oitenta esta levedura tem sido
amplamente estudada quanto a sua ação no tratamento e prevenção a DAA (Diarréia
Associada a Antibióticos), para avaliação dos benefícios de S. boulardii no organismo
hospedeiro e descrição do mecanismo de ação (Mccullough, M. J. e cols., 1998).
Um aspecto controverso, relativo à levedura S. boulardii, diz respeito à sua
taxonomia (Mccullough, M. J. e cols., 1998; Van Der AA Kuhle, A., A. e Jespersen, L.,
2003). Inicialmente foi classificada por Cardinali, G. e Martini, A. em 1994, por meio
da cariotipagem eletroforética comparativa e análise multivariada do polimorfismo, a
cepa S. boulardii não pertencente à espécie S. cerevisiae e também das outras espécies.
O progresso no desenvolvimento da filogenia molecular permitiu a classificação de
muitas espécies de leveduras por técnicas como, polimorfismo de microssatélite,
amplificação aleatória de polimorfismo e análise polimórfica de fragmento de restrição.
Dessa forma, Edwards Ingram e cols. (2007) analisando o genoma pela hibridização
genômica comparativa concluiu que S. cerevisiae e S. boulardii são membros da mesma
espécie, entretanto geneticamente foram detectadas características como trissomia do
cromossomo IX e números de cópias dos genes alteradas em S. boulardii que a diferem
de S. cerevisiae.
Estudos de caracterização molecular, desenvolvidos em nosso laboratório,
sugerem que S. boulardii é uma cepa da espécie S. cerevisiae. No entanto, S. boulardii e
cepas de S. cerevisiae apresentam diferenças fisiológicas importantes (Fietto, J. L. R. e
cols., 2004). Estas diferenças incluem respostas a situações de estresses, como
resistência a altas temperaturas e ao estresse ácido.
S. boulardii é utilizada como probiótico devido a sua capacidade de atingir
rapidamente altas concentrações no cólon, manter níveis constantes, não colonizar
permanentemente o intestino e não translocar facilmente para fora do trato intestinal
(Berg, R. e cols., 1993; Boddy, A. V. e cols., 1991). S. boulardii quando introduzida na
terapia não promove um desequilíbrio da microbiota, mas reduz a concentração dos
5
vários agentes etiológicos da diarréia e bem como das toxinas associadas a estes agentes
(Elmer, G.W. e cols., 1987).
A partir de 1960 iniciou-se a comercialização da levedura liofilizada pelo
“Laboratoires Biocodex” (Paris, França). Desde então, o uso comercial de S. boulardii
como medicamento no combate às diarréias foi difundido em toda Europa e está
disponível no mercado sob diversos nomes comerciais, tais como: Ultra-Levure®
(França), Florastor® (Estados Unidos), Precosa® (Dinamarca), Levucell® (Lallemand,
Canadá), Perenterol® (Alemanha), Perenteryl® (Chile), Codex® (Itália), Floratil®
(Brasil). Atualmente, a levedura é comercializada na Europa, América do Sul e do
Norte, Ásia e África (McFarland e Bernasconi, 1993), tendo sido a sua utilização
liberada pela FDA (Food and Drug Administration) nos Estados Unidos (Florastor,
2007). Os direitos de comercialização para a América do Sul foram adquiridos pelas
indústrias químicas da MERCK S.A., e no Brasil outras preparações contendo
S. boulardii encontram-se disponíveis (Martins, F. S. e cols., 2005).
A palavra probiótico que significa “para vida” é um termo derivado da língua
grega (Neves, M. J., 2005). A terminologia conceitual foi inicialmente proposta por
Fuller (1991), após os primeiros ensaios clínicos. Probióticos podem ser definidos como
suplementos alimentares que contêm microrganismos vivos, ou componentes
microbianos que, quando ingerido em determinado número, apresentam efeito benéfico
sobre a saúde e bem-estar do hospedeiro (Salminem e cols., 1999; Dupont, 2001;
FAO/WHO, 2001; Isoulari, E., 2001; Reid, G. et al, 2001; Sanders, D., 2003).
As células probióticas depois de ingeridas devem ser capazes de sobreviver às
condições de estresse presentes no trato gastrointestinal, como suco gástrico, presença
de sais biliares, enzimas digestivas e manter sua viabilidade e atividade metabólica no
intestino para exercerem os efeitos benéficos aos hospedeiros. Quanto aos desafios
tecnológicos para a produção industrial de células, estas devem manter-se estáveis e
viáveis em níveis satisfatórios durante todo o prazo de validade do produto (Saad, 2006;
Araújo, 2007).
Vários mecanismos protetores têm sido propostos para explicar o controle de
diarréias por S. boulardii. Pothoulakis, C. e cols. (1993) verificaram experimentalmente
6
que S. boulardii inibe a ligação e a enterotoxicidade da toxina A de Clostridium difficili
em íleo de ratos. Dias, R. S. e cols. (1995) comprovaram a capacidade desta levedura de
inibir e neutralizar a enterotoxicidade das toxinas de Escherichia coli e Vibrio cholerae.
Czerucka, D. e cols. (1994) demonstraram que S. boulardii produz uma proteína
de 120 kDa capaz de neutralizar o efeito da toxina do cólera, propondo que este efeito
esteja relacionado à habilidade desta proteína de se ligar a sítios preferenciais nas
células intestinais do paciente e desta forma regular os níveis intracelulares de AMPc,
visto que o aumento de AMPc promovido pela ação da toxina gera, de forma indireta, a
perda de água pelas células intestinais.
Outro mecanismo protetor importante é o aumento da resposta imunológica do
hospedeiro contra as toxinas diarréicas mediado pelo uso de S. boulardii (Qamar, A. e
cols., 2001). Em trabalho realizado por Brandão, R. L. et al (1998) no nosso laboratório
propõe-se um mecanismo protetor no qual a levedura atuaria competindo pela ligação
com a toxina. Os resultados sugerem a adesão da toxina do cólera à levedura pela
subunidade B, seguida da internalização da subunidade A, similarmente ao que acontece
nas células intestinais. Esta internalização eleva os níveis de AMPc na célula e
desencadeia cascatas de fosforilações dependentes de AMPc. Resultados posteriores de
Neves, M. J. e cols. (2002), também obtidos pelo grupo de pesquisa no nosso
laboratório, mostraram que a toxina do cólera se liga, de forma específica, a células de
S. boulardii e sugerem que a atividade patogênica desta toxina (e provavelmente de
outras toxinas) pode ser neutralizada por esta ligação. Os estudos de ligação com 25I –
toxina do cólera, assim como o sinal de AMPc, dependente da integridade da molécula,
sugerem fortemente a presença de receptores mais ou menos específicos na superfície
da levedura (similar a situação observada em células de mamíferos).
Para garantir um efeito contínuo os probióticos devem ser ingeridos diariamente.
Alterações favoráveis na composição da microbiota intestinal foram observadas com
doses de 100g de produto alimentício contendo 108-109 UFC de microrganismo
probiótico (106 a 107 UFC/g de produto) e administração durante o período de 15 Dias,
R. S. (Blanchette e cols., 1996; Jelen e Lutz, 1998).
7
A grande maioria dos probióticos que são comercializados é composta por
bactérias. As leveduras que são utilizadas como probiótico ficam limitadas por
S. boulardii na medicina humana e S. cerevisiae na medicina veterinária. A utilização
de leveduras como probiótico é um investimento rentável e seguro, pois as mesmas
podem ser comercializadas liofilizadas, são rapidamente eliminadas pelo organismo
após interrupção da terapia e não são afetadas pelo uso de antimicrobianos (Blehaut e
cols., 1989; Boddy, A. V. e cols., 1991).
Resposta a estresses constitui um requerimento funcional para a escolha de um
probiótico (Matilla-Sandholm e cols., 2002). Para atingir o intestino, o probiótico
precisa transpor diversas situações de estresses. Após a ingestão por via oral, o
microrganismo tem que se manter viável numa temperatura interna do hospedeiro de
37°C. Adicionalmente, o microrganismo entra em contato com o estômago, um
ambiente inóspito devido ao pH ácido, e em seguida alcança o intestino encontrando um
ambiente totalmente adverso em situação de pH básico.
Dentre os fatores que possam levar a diminuição do número de células
probióticas ingeridas pelo hospedeiro tem-se ainda, a ação dos sucos intestinais (sais
biliares e pancreáticos) e menor tensão de oxigênio no trato gastrointestinal. Além
destas variações, existe a competição entre a microbiota nativa e o probiótico. Neste
caso, microrganismos com maior flexibilidade nutricional levam vantagem. Sendo
assim, é essencial que microrganismos potencialmente selecionados para serem
utilizados como probióticos sejam tolerantes aos produtos secundários (água oxigenada,
gazes e ácidos) do metabolismo do hospedeiro e substâncias antagônicas gerados por
outros microrganismos (Holzapfel, W. H., 1998).
1.2 - Mecanismos envolvidos em resposta a estresse em leveduras
Para manutenção de condições ótimas de crescimento, os organismos
unicelulares, necessitam de um ambiente intracelular específico e balanceado. Qualquer
flutuação no ambiente interno pode resultar em uma variedade de perturbações que
8
podem reduzir a atividade enzimática, interromper o fluxo metabólico, danificar as
estruturas celulares e alterar os gradientes químicos levando a célula a uma condição de
instabilidade (Ferreira e Mager, 1993). Porém, as células são capazes de manter a
homeostase interna mesmo diante de um ambiente externo variado (Hohmann, S. e
Mager, W. H., 1997; Gasch, 2001).
A resposta aos diferentes tipos de estresse é uma característica fundamental na
adaptação dos organismos vivos às condições adversas do ambiente. As células de S.
cerevisiae, quando submetidas à condição de estresse, desenvolvem uma rápida resposta
molecular para reparar danos e proteger as estruturas celulares dos efeitos causados pelo
estresse (Ruis, H. e Schuller, C., 1995; Swan, T.M. e Watson, K., 1998; Estruch, F.,
2000). Essa resposta é caracterizada pela síntese de proteínas específicas, aumento do
nível celular de trealose e glicerol, alteração da composição lipídica da membrana
plasmática e da atividade da H+ - ATPase, modulação do processo de troca iônica e no
caso de estresse oxidativo produção de glutationa e de enzimas superóxido dismutase
(Birch, R. M. e Walker, G. M., G. M., 2000).
Os mecanismos de resposta ao estresse são evolutivamente conservados em
todos os organismos (eucariotos e procariotos), e as repostas protetoras de organismos
vivos foram inicialmente identificados em estudos de reposta a choque térmico. A
resposta ao choque térmico é caracterizada pela síntese de proteínas específicas
denominadas de proteínas de choque térmico ou Hsp (heat shock proteins), que
funcionam como chaperonas nos processos de desnaturação e renaturação de proteínas
danificadas (Jakobsen, B. K. e Pelham, H. R. B., 1991; Maresca, B. e Lindquist, S.,
1991; Nover e Scharf, 1991; Craig, E. A., 1992; Morimoto, 1993). As Hsp são
encontradas em células eucariotas e procariotas, são altamente conservadas e
desempenham funções importantes em condições normais de crescimento (Kiang, J. G.
e Tsokos, G. C., 1998). Além de choque térmico, estas proteínas são induzidas por
outras formas de estresses como altas concentrações salinas e de etanol, estresse
oxidativo, baixos pHs, escassez de nutrientes e presença de metais pesados no meio
(Kiang, J. G. e Tsokos, G. C., 1998; Estruch, F., 2000). Os genes que codificam as Hsp
são divididos em famílias, os genes da família HSP70 são divididos nos subgrupos A,
9
B, C e D (Estruch, F., 2000; Baumann, F. e cols., 2000). O subgrupo A é o mais
complexo, contendo quatro genes, SSA1, SSA2, SSA3 e SSA4. Embora os genes da
família HSP70 codifiquem proteínas que desempenham funções semelhantes, eles
diferem no grau de expressão em condições de estresse (Estruch, F., 2000).
Em leveduras, dois aspectos da resposta ao estresse por choque térmico têm sido
bem analisados: a síntese de proteínas de resposta ao estresse ou relacionada ao
acúmulo de trealose (Swan, T.M. e Watson, K., 1998). Em culturas de S. cerevisiae
ocorre o acúmulo de trealose em resposta a uma mudança na temperatura de 30°C para
44°C, é quando a concentração de trealose atinge valores intracelulares máximos
(Cavalheiro e cols., 1999).
As leveduras quando expostas a um estresse osmótico perdem água dando início
a uma série de mecanismos, principalmente relacionados com a síntese de trealose e de
glicerol, isto ocorre para resguardar as células da desidratação e proteger as estruturas
celulares dos possíveis efeitos da condição de estresse (Estruch, F., 2000; Mager, W. H.
e Siderius, M., 2002). Durante muito tempo sustentou-se a hipótese de que a trealose era
somente um carboidrato de reserva (Singer, M. A. e Lindquist, S., 1998), entretanto o
papel mais importante que ela desempenha nas células de levedura é de estabilizar a
membrana celular em condições de estresse (Singer, M. A. e Lindquist, S., 1998; Fujii,
S. e cols., 1996). Demonstrada a sua relação com a termotolerância de fungos e
leveduras, o papel do açúcar ganhou importância. Em leveduras a síntese e o acúmulo
de trealose estão diretamente relacionados com o aumento de sua sobrevivência quando
submetidas a diferentes situações de estresse, como desidratação, congelamento, alta
concentração de etanol, oxigenação e CO2 (Shima, J. e cols., 1999; Majara, M. e cols.,
1996; Paredes, V. e cols., 2003).
Muitos estudos têm documentado a alteração da composição lipídica celular em
resposta a outro tipo de estresse, a exposição ao etanol, por exemplo. Desde que
membranas celulares têm sido consideradas como alvos primários do estresse com
etanol, muitos pesquisadores têm sugerido uma relação entre a composição de ácidos
graxos de membranas lipídicas e a tolerância ao estresse com etanol (You, K. M. e cols.,
2003). O efeito primário do etanol sobre a membrana mitocondrial foi observado por
10
Chi e Arneborg (1999), que demonstraram que uma linhagem de S. cerevisiae tolerante
ao etanol possuía elevados níveis de ácido oléico e uma significativa redução de
deficiência respiratória induzida pelo etanol, em comparação com uma linhagem
sensível ao álcool.
Em S. cerevisiae, ácidos graxos insaturados são formados na superfície do
retículo endoplasmático pela enzima desaturase, que é codificada pelo gene OLE1. Essa
enzima converte ácidos graxos saturados a espécies monoinsaturadas, pela introdução
de uma dupla ligação entre os carbonos 9 e 10 dos ácidos palmítico (C16:1) e esteárico
(C18:0) para formar os ácidos palmitoléico (C16:1) e oléico (C18:1), que são os ácidos
graxos insaturados predominantes em S. cerevisiae (Stukey e cols., 1989). As
características dinâmicas e estruturais da membrana podem mudar pelas alterações das
condições ambientais, ou seja, mudança na composição molecular da membrana ou
adição de moléculas estranhas que interagem com os constituintes da mesma. Isso
explica porque mudanças na fluidez da membrana são observadas em resposta a muitos
estresses ambientais, e porque as células mantêm um ótimo nível de fluidez dentro da
matriz lipídica (Beney, L. e Gervais, P. , 2001).
Células de leveduras crescendo em condições de aerobiose produzem espécies
reativas de oxigênio (ROS) como peróxido de hidrogênio, radicais hidroxilas e ânions
superperóxidos, provenientes de processos metabólicos normais como respiração e β-
oxidação de ácidos graxos (Gordon, C. e cols., 1999; Estruch, F., 2000; Costa, V. e
Moradas-Ferreira, P., 2001). Esses compostos constituem fatores de estresse oxidativo,
induzindo um grupo de genes que codificam proteínas antioxidantes (Estruch, F., 2000).
Embora as linhagens industriais sejam normalmente resistentes ao estresse oxidativo,
esse tipo de estresse pode afetar a produção de biomassa de leveduras de vinificação,
processo este realizado em aerobiose (Carrasco, P. e cols., 2001). Linhagens de S.
cerevisiae tolerantes ao estresse oxidativo também apresentam tolerância a outras
formas de estresse, porém essa co-tolerância não é comum a todas as linhagens e
depende do tipo e da intensidade do estresse (Lewis, J. G. e cols., 1997).
Duas estratégias para adaptação na presença de altas concentrações de sal têm
sido identificadas nos diferentes organismos. O mecanismo mais conhecido consiste na
11
extrusão de sódio do citoplasma e o acúmulo simultâneo de concentrações elevadas de
solutos compatíveis para evitar a perda de água (Organismos excluder), em
contrapartida existem os organismos que acumulam altas concentrações de sódio,
conseguindo evitar a intoxicação (Organismos includer) (Ramos e cols., 1999).
S. cerevisiae é uma levedura excluder por manter níveis citoplasmáticos baixos de sódio
através do processo de extrusão ou dirigindo-o para o vacúolo. Em ensaios de
resistência ao estresse causado por elevada concentração de sal no meio, linhagens de
panificação de S. cerevisiae apresentam resistência a até 1,5 M de NaCl (Lewis, J. G. e
cols., 1997) enquanto que em linhagens de vinificação foram encontradas leveduras
resistentes a 3 M de KCl (Carrasco, P. e cols., 2001).
As diferentes vias metabólicas são coordenadas por uma série de genes que
codificam proteínas reguladoras da expressão gênica. A integração entre as várias vias
metabólicas mostra que muitos genes estão envolvidos em diferentes respostas celulares
e são regulados por um conjunto de proteínas regulatórias que atuam em mais de uma
via.
Em S. cerevisiae, mais de 70% dos genes envolvidos na biogênese de
ribossomos foram reprimidos após a adição de 0,5 M de NaCl ao meio de crescimento,
porém vários genes envolvidos no metabolismo de glicose, no transporte de elétrons e
na resposta ao estresse foram induzidos. A redução da expressão gênica dos genes
envolvidos na biogênese dos ribossomos resulta em uma redução na síntese protéica.
Essa redução é importante para que a célula redirecione seus fluxos metabólicos em
resposta à condição de estresse (Hirasawa, T. e cols., 2005).
Muitos mecanismos de resposta a estresses envolvem a participação de íons,
portanto, alterações iônicas são fundamentais para que haja um desencadeamento na
ativação das vias de sinalização. O modo de ação para que se estabeleça o efeito
positivo dos íons, deve envolver a homeostase iônica. Em leveduras, a manutenção da
homeostase de Na+ e K+ é dependente de sistemas transportadores responsáveis pelo
influxo e efluxo de sais, tais como a bomba exportadora de sódio Ena1p (Benito B. e
cols., 1997), trocadores de Na+/H+ Nha1p localizado na membrana plasmática, Nhx1p
trocador prevacuolar (Nass, R. e cols., 1998) e Vnx1p descrito como transportador
12
presente na membrana do vacúolo responsável pela homeostase de íons Na+ e K+ e
regulação do pH (Cagnac, O. e cols., 2007). Além da captação de Na+ e K+ pelos
transportadores Trk1p e Trk2p (Ko, C. H. e Gaber, R.F., 1991) existem outros canais
menos específicos como o NSC1, ainda não identificado geneticamente (Bihler, H. e
cols., 2002). Um modelo dos principais sistemas envolvidos na homeostase de K+/Na+ e
manutenção do potencial de membrana pode ser visualizado na figura 1.
A reposta a mudanças no ambiente como estresse ácido, estresse de temperatura
e estresse osmótico, bem como os mecanismos adaptativos são complexos e envolvem
vias de sinalização de forma a permitir a adaptação do crescimento e da capacidade
proliferativa das células, assim como ajuste da expressão gênica, das atividades
metabólicas e outras funções celulares.
13
Figura 1 – Principais sistemas de transporte para manutenção da homeostase de K+/Na+
em S. cerevisiae. Os transportadores Trk1/2p tem alta afinidade para K+. A Kha1p é um
provável trocador de K+/H+. A extrusão de Na+ é primariamente mediada pela ATPase
Ena1p responsável pelo bombeamento de sódio, mas também pelo Nha1p Na+/H+
antiporter. NSC1 é um canal para cátions, não seletivo. A compartimentalização de Na+
é mediada pelo antiporter pré-vacuolar Nhx1p Na+/K+. A membrana pré-
vacuolar/vacuolar é energizada pela bomba de próton ATPase tipo –V (Vmap) e a
membrana plasmática pela ATPase tipo –P (Pma1p).
Fonte: Hohmann, S. e Mager, W. H., 1997.
14
1.3 – Mecanismos de resposta ao estresse ácido
A maioria das células de eucariotos superiores possui altas concentrações de
proteínas em seu citoplasma que funcionam como ácidos ou bases orgânicas. Proteínas
contendo maior número de histidina, por exemplo, tamponam o meio intracelular em
pH próximo do neutro. Nucleotídeos semelhantes a ATP, além de outros metabólitos de
baixo peso molecular contêm grupos ionizáveis que também tamponam o citoplasma
(Nelson e Lox, 2004).
Algumas leveduras são capazes de crescer em meio com pH entre 4,5 e 6,5
(Walker, G. M., 1998), porém ácidos orgânicos como ácido sórbico, o ácido benzóico e
o ácido acético, os quais têm sido utilizados na preservação de alimentos, inibem o
crescimento de leveduras em baixo pH (Piper, P. e cols., 1998; Piper, P. e cols., 2001).
Ácidos orgânicos, quando não dissociados, são capazes de atravessar a membrana
plasmática por difusão (Cássio, F. e cols., 1987). Uma vez no citoplasma esses ácidos se
dissociam gerando o próton H+ e o ânion correspondente. Quanto maior o pH do meio,
maior o grau de dissociação do ácido. Um ácido orgânico quando se dissocia no meio
intracelular diminui o pH citosólico. O acúmulo do ânion no citoplasma pode aumentar
a produção de radicais livres, em aerobiose, induzindo o estresse oxidativo (Piper, P. e
cols., 2001).
Em S. cerevisiae a presença de ácido sórbico no meio de crescimento aumenta a
atividade da enzima H+ - ATPase, a qual catalisa a extrusão de prótons H+, e induz a
síntese da proteína Pdr12p, que age na membrana plasmática catalisando a extrusão do
íon sorbato as custas de ATP ( Piper, P. e cols., 2001). Células de S. cerevisiae
crescendo em pH 7,0 na ausência de sorbato, apresentam uma baixa concentração de
Pdr12p na membrana plasmática, porém a adição de sorbato ao meio de cultura aumenta
o grau de expressão do gene PDR12.
Mutantes pdr12∆ são muito sensíveis a sorbato em baixo pH, indicando que a
proteína Pdr12p exerce uma função essencial na adaptação dessa levedura à condição de
estresse ácido (Piper, P. e cols., 1998). O mutante pdr12∆ é resistente a 2mM de sorbato
15
em YEPD (Extrato de Levedura e Glicose) ajustado a pH 4,5 com HCl, porém essa
resistência não depende exclusivamente da atividade de Pdr12p.
Outras proteínas envolvidas em diversas funções na célula são importantes na
resposta ao estresse ácido. Células mutantes pkf1∆ e pkf2∆ (subunidades α e β da
fosfofrutoquinase, respectivamente) rpe1∆ (D-ribulose-5-fosfato 3 epimerase) gdh3∆
(uma isoenzima da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase) e tps2∆ (trealose-6-fosfato
fosfatase) são sensíveis a 2 mM de sorbato no meio de crescimento (Cheng, L. e cols.,
1999).
Os ácidos orgânicos inibem a resposta ao estresse de choque térmico e
aumentam a frequência de mutações que causam deficiência no metabolismo
respiratório de S. cerevisiae, quando cultivada a elevadas temperaturas (Cheng, L. e
cols., 1999). O tratamento de células de S. cerevisiae com ácidos orgânicos inibe a
síntese das Hsp e, consequentemente, a termotolerância (Piper, P. e cols., 1998).
A presença de ácido acético na concentração de 50 mM no meio de crescimento
(pH 3,5) semelhantemente ao ácido sórbico, diminui o pH citosólico e aumenta a
atividade da H+-ATPase na membrana plasmática de células de S. cerevisiae (Carmelo,
V. e cols., 2005). Linhagens de panificação dessa levedura foram sensíveis a 0,4% de
ácido acético (v/v) em meio YEP ágar (meio sem glicose). Nessas condições, a
sobrevivência da maioria das linhagens testadas foi inferior a 10% do total de células
inoculadas no meio (Lewis, J. G. e cols., 1997). Células de S. cerevisiae pré-adaptadas
ao estresse ácido, quando presentes em meio mínimo, sem glicose, contendo 1mM de
ácido benzóico (pH 4,5), acumulam uma grande quantidade de benzoato no meio
intracelular, porém quando a glicose é adicionada ao meio de cultura as células
eliminam cerca de 90% do ácido benzóico absorvido. Isso mostra que a célula depende
de glicose ou de outra fonte de energia, para gerar ATP e fazer funcionar a H+-ATPase e
a proteína Pdr12p, restaurando a homeostase do pH intracelular ( Henriques, M. e cols.,
1997).
Contribuindo para este conjunto de evidências, Ludovico, P. e cols. (2001)
verificou que o tratamento de S. cerevisiae com 20-200 mM de ácido acético, durante
200 minutos a pH 3,0, conduzia à perda de viabilidade das células. Contudo, a
16
concentração de ácido necessária para a ocorrência de um processo ativo de morte
celular revelou-se crítica. Com efeito, enquanto que a morte celular observada para
concentrações acima de 80 mM não era inibida pela cicloheximida (inibidor da síntese
protéica) e estava associada a alterações ultra-estruturais típicas de necrose, a morte
induzida por concentrações mais baixas de ácido acético (20-80 mM) foi parcialmente
inibida por cicloheximida. Nestas condições foi possível detectar diferentes alterações
estruturais típicas de apoptose nomeadamente: i) condensação extensiva de cromatina
na periferia do invólucro nuclear observada por microscopia eletrônica de transmissão;
ii) exposição de fosfatidilserina na superfície da membrana citoplasmática avaliada por
reação com anexina V conjugada com FITC e iii) ocorrência de quebra de DNA
avaliada por TUNEL. O fato de o ácido acético ser um subproduto da fermentação
alcoólica produzida por S. cerevisiae e, portanto, bastante corriqueiro no seu ambiente
natural, parece indicar que este processo, à semelhança do que acontece nos eucariotos
superiores, pode ter um papel fisiológico relevante no ciclo de vida da levedura.
No trabalho de Claret, S. e cols. (2005) foi avaliado o efeito da exposição de
S. cerevisiae em estresse em baixo pH (HCl) e a ativação da via PKC como resposta.
Durante condições de crescimento em baixo pH a via PKC foi ativada, e o sensor
Mid2p foi identificado como decisivo na ativação desta via, demonstrando que os
componentes Bck1p e Slt2p da cascata MAPK são essenciais em ambiente ácido. Além
desses componentes, também foi constatado o envolvimento de RGD1 na via PKC em
pH ácido, comprovando a interação de duas vias, uma envolvendo o sensor Mid2p e o
outro envolvendo Rgd1p, ambos convergem na via de integridade celular, traduzindo a
sinalização em pH baixo. Demonstraram também, que a interrupção das duas vias
envolvidas gera mutantes incapazes de sobreviver sob condições de estresse ácido.
Entretanto, em contraste do que foi observado com os mutantes bck1∆ ou slt2∆, o
suporte osmótico não eliminou a letalidade dos mutantes rgd1∆ e rgd1∆mid2∆
provocada pelo choque ácido, sugerindo que a ação mediada por Rgd1p na tolerância ao
estresse ácido não está limitada a via PKC.
Malakar, D. e cols. (2006) investigaram a função protetora da adição de S-
adenosil-L-metionina (Adomet) nas células de S. cerevisiae expostas ao estresse ácido
17
(10 mM HCl, pH∼2), demonstrando que este estresse provoca redução do espaço
periplasmático da membrana plasmática, e substancial aumento no número de vacúolos
no citoplasma, entretanto a adição de 1mM de Adomet, nesta condição, além de reduzir
o número de vacúolos formados, amenizou as variações de pH interno observadas em
estresse ácido.
Resultados preliminares no nosso laboratório demonstraram respostas a
diferentes estresses pelo probiótico S. boulardii e que esta cepa responde melhor aos
estresses de temperatura e ao ambiente gástrico simulado, quando comparado a cepas
S. cerevisiae de laboratório (Fietto, J. L. R. e cols., 2004). Neste trabalho, evidenciamos
a resistência de S. boulardii ao estresse ácido, além de observar que a adição de sódio,
um componente do suco gástrico, em pH 2, confere significativa proteção a esta cepa
probiótica. Os mecanismos pelos quais o estresse ácido afeta o metabolismo das cepas
S. cerevisiae avaliadas, e as diferenças na resposta de S. boulardii frente à proteção
conferida pela adição de íons, abrangem o que procuramos elucidar com nossos estudos.
18
Objetivos
19
2 - Objetivos
2.1 - Objetivo Geral
Caracterizar a resposta da levedura S. boulardii ao pH ácido e o efeito de NaCl,
em baixas concentrações, nesta resposta.
2.2 - Objetivos Específicos
• Comparar a viabilidade de diferentes cepas Saccharomyces cerevisiae frente a
uma simulação do ambiente gástrico;
• Identificar os componentes do ambiente gástrico responsáveis pela perda de
viabilidade celular;
• Estudar o efeito do pH ácido (HCl / pH 2) sobre a viabilidade de diferentes
cepas S. cerevisiae;
• Avaliar o efeito da adição de diferentes íons sobre a viabilidade celular em pH
ácido (HCl / pH 2);
• Investigar possíveis mecanismos envolvidos no efeito protetor de sódio, por
meio de medidas da expressão dos genes envolvidos na homeostase deste íon;
medidas de acúmulo e extrusão de sódio; medidas de potencial de membrana,
em cepas com deleções em genes que codificam proteínas envolvidas na
homeostase de sódio;
• Verificar possíveis correlações entre a resistência ao pH baixo e atividade da H+-
ATPase, o potencial de membrana e o pH intracelular;
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• Verificar a homeostase do cálcio em células submetidas ao estresse ácido (pH 2 /
HCl);
• Determinar a capacidade tamponante das células e dos extratos celulares obtidos
de células submetidas ao estresse ácido (pH 2 / HCl);
• Analisar a composição lipídica de membrana das cepas Saccharomyces, em
reposta ao estresse ácido;
• Correlacionar os níveis de reservas energéticas com a reposta ao estresse ácido.
21
Material e Métodos
22
3 - Material e Métodos
3.1 - Cepas Saccharomyces utilizadas nos experimentos
Nos experimentos foram utilizadas cepas de Saccharomyces cerevisiae e
mutantes com deleções nos genes envolvidos no transporte de sódio. As cepas utilizadas
estão demonstradas na tabela 1:
Cepas Genótipo Procedência
Saccharomyces cerevisiae var. boulardii
Selvagem Floratil®,Merck S.A.
UFMG 20 Selvagem Martins, F. S. e cols., 2008
UFMG 24 Selvagem Martins, F. S. e cols., 2008
W303 MATa leu2-3,112 ura3-1 trp1-1 his3-11,15 ade2-1 can1-100 GAL mal SUC2
Johan M. Thevelein, J.M. Laboratorium voor Moleculaire Celbiologie, Katholieke Universiteit Leuven, Belgium.
LBCM 479 W303 Matα ena1 :: HIS3 :: ena4 José Ramos Department of Microbiology, ETSIAM, Edificio Severo Ochoa, Campus de Rabanales, University of Cordoba, Spain
LBCM 511
W303 Matα nha :: LEU2 Hana Sychrová, H. Departments of Membrane Transport, Institute of Physiology,
23
Academy of Sciences CR, Prague, Czech Republic
LBCM 500 W303 Matα ena1 :: HIS3 :: ena4 nha1 :: LEU2
Hana Sychrová, H. Departments of Membrane Transport, Institute of Physiology, Academy of Sciences CR, Prague, Czech Republic
LBCM 480 W303 Matα ena1 :: HIS3 :: ena4 nha1 :: LEU2 nhx1 :: TRP1
Hana Sychrová, H. Departments of Membrane Transport, Institute of Physiology, Academy of Sciences CR, Prague, Czech Republic
3.2 - Meios de cultura e condições de cultivo
O meio de cultura utilizado nos experimentos foi YPD composto por extrato de
levedura 1% (p/v), bacto-peptona 2% (p/v) e glicose 2% (YPD). O meio sólido foi
acrescido de ágar 1,5% (p/v).
As células da levedura Saccharomyces foram pré-crescidas em tubos de ensaio
contendo 4 mL de meio de cultura YP glicose 4%, durante 16 horas, a 28oC e sob
agitação constante. Após o intervalo de tempo necessário, o pré-inóculo foi transferido
para um erlenmeyer contendo 50 mL do mesmo meio e crescidas até atingir a D.O.600nm
= 1,0, sob agitação a 200 rpm em agitador New Brunswick modelo G25.
24
3.3 - Condições de estresse
As células crescidas em meio YPD 4% até D.O.600nm = 1,0, foram coletadas por
centrifugação 3750 rpm, a 4°C, lavadas duas vezes com YP. Após a lavagem, as células
foram ressuspensas no mesmo volume de YP para coleta da condição controle. As
amostras foram centrifugadas, lavadas e ressuspensas de forma a conversar a D.O.
600nm 1,0 em solução aquosa pH 2 ajustado com HCl 1M, e em solução aquosa
contendo 85mM de NaCl, pH 2 ajustado com HCl 1M, a 37°C, sob agitação lenta.
3.3.1 - Teste de Viabilidade
As células submetidas ao estresse ácido e estresse ácido acrescido de 85mM de
NaCl foram coletadas em alíquotas de 100 µL nos tempos 0, 30 e 60 minutos. Essas
alíquotas foram lavadas 2 vezes com YP, e ao sedimento celular foram acrescentados
100µL de solução corante de azul de metileno (azul de metileno 0,01% em tampão
acetato de sódio 0,1M pH 5,0) (Mills, D.R., 1941). Após incubação por 10 minutos à
temperatura ambiente, realizou-se a contagem das células em microscópio óptico. No
campo de visualização foram contadas 300 células, em triplicata, em cada tempo
analisado. A determinação da % de células viáveis foi feita através da seguinte fórmula:
% Células Viáveis = Total de Células – Número de Células Azuis X 100
Total de Células
As células não viáveis apresentaram-se coradas em azul e as células viáveis
apresentaram-se descoradas. Todos os ensaios de viabilidade foram realizados em
triplicata.
25
3.4 - Reação em cadeia da polimerase em tempo real
3.4.1 - Extração e preparação de RNA total de levedura
As células de leveduras foram crescidas em 20 mL de meio YPD 4% até
atingirem D.O.600nm = 1,0. Após o crescimento, alíquotas da cultura foram coletadas por
centrifugação a 3750 rpm por 5 minutos a 4°C para o tempo controle, parte da cultura
foi centrifugada e submetida ao estresse ácido em igual volume, a 37°C, sob leve
agitação. As amostras foram coletadas em intervalos de 30 minutos, congeladas em
nitrogênio líquido e estocadas a -80°C para posterior extração de RNA total.
O sedimento celular congelado em -80°C foi ressuspenso em 2 mL de fenol /
água (3,75:1) e 2 mL de TES (10mM Tris:Cl; 10mM EDTA; 0,5% SDS; pH 7,5) e
agitado vigorosamente em vórtex. Os tubos foram incubados em banho-maria a 70º C
por 1 hora, e agitados vigorosamente em vórtex em intervalos de 5 minutos. Os tubos
foram centrifugados a 3000g, por 10 minutos, a 4º C e a fase superior coletada em tubos
de microcentrífuga. Foram adicionados 800 µL de solução fenol e água na proporção de
3,75:1, e após nova agitação os tubos foram centrifugados a 3000g por 10 minutos a 4º
C. O sobrenadante foi coletado e foram adicionados 600 µL de clorofórmio. Procedeu-
se à nova agitação em vórtex e em seguida, os tubos foram centrifugados a 3000g por
10 minutos a 4º C. O sobrenadante foi coletado e foram adicionados 50µL de acetato de
sódio 3M pH 5,3 e 1 mL de etanol gelado 100%, sendo incubados a –80º C por 15
minutos. Após esta incubação as amostras foram centrifugadas a 15000 rpm por 10
minutos a 4º C, o sobrenadante foi descartado e o sedimento lavado com 500 µL de
etanol 70%. As amostras foram centrifugadas e o sobrenadante novamente descartado.
O RNA foi ressuspenso em 50 µL de H2O DEPC (200mL água Mili-Q estéril, 200µL
DEPC) e armazenado a -80ºC até a utilização.
Os RNAs extraídos das amostras submetidas ou não ao estresse foram
submetidos à eletroforese em gel de agarose 1% contendo formaldeído 2,2 M e NBC
1X. Para a aplicação no gel, as amostras de RNA foram desnaturadas a 68o C por 5
minutos e adicionadas a um tubo contendo tampão de amostra para RNA (MOPS 20mM
26
pH 7.0; EDTA 0,1 M) e brometo de etídio. Após 3 horas de corrida a 70 V, o gel foi
fotografado sob luz ultravioleta.
3.4.2 - Obtenção do cDNA
Para síntese de cDNA foi utilizado o RNA total extraído anteriormente. 3µg de
RNA foi tratado com DNAse para remoção total de DNA genômico das amostras, na
presença da enzima RNAse OUT para proteção do RNA.
Eliminação de DNA (Promega)
RNA total (3µg) X µL
Enzima DNAseI 1 µL
Tampão da Enzima 1 µL
RNAse OUT 0,5 µL
Água DEPC 0,01% q.p. 10 µL
Total 10 µL
Manteve-se a mistura acima a 37°C por 30 minutos, em seguida, adicionou-se
1µL de EDTA (25mM) a cada amostra e a mistura foi mantida a 65°C por 10 min e
resfriada a 4°C em banho de gelo.
Desnaturação de RNA
RNA total (tratado) 10 µL
Primer oligo dT 1 µL (0,5 µg )
Total 11 µL
Incubou-se a mistura a 70°C por 5 minutos e foi resfriada a 4°C por pelo menos 5 min.
Transcrição Reversa:
27
Mistura para transcrição reversa
Tampão de enzima (5x) 4,0 µL (1X)
MgCl2 (25mM) 2,4 µL (3mM)
dNTPs (10mM) 1,0 µL (0,5mM)
RNAse OUT 0,5 µL
Enzima IMPROM II reverse 1,0 µL
Água DEPC 0,01% q.p. 20 µL
Total 20 µL
As reações foram conduzidas de acordo com a programa de síntese de cDNA descrito
abaixo:
� 25°C por5 minutos
� 42°C por 60 minutos
� 70°C por 15 minutos, inativando a enzima pelo calor.
3.4.3 - Reação em cadeia da polimerase em tempo real
Para a reação em cadeia da polimerase em tempo real os reagentes foram
acondicionados em tubos apropriados e adicionados de acordo com os procedimentos
abaixo descritos:
Iniciadores Sequências
ENA1 direto 5’- AGTTGGCGGTATTGCTTTTCTG - 3’
ENA1 reverso 5’- TTGAGAGGCCATGACGATGAT - 3’
NHA1 direto 5’- CGCGCCGCCACATTT - 3’
NHA1 reverso 5’ – CATTCCAATCTCCTCATTACGTTGT – 3’
28
Amplificou-se também o gene da actina para ser utilizado como controle
endógeno, e para isso os seguintes iniciadores foram utilizados:
Iniciadores Sequências
ACT1 direto 5’- GCCGAAAGAATGCAAAAGGA - 3’
ACT1 reverso 5’- TCTGGAGGAGCAATGATCTTGA - 3’
• 5 µL cDNA
• 5 µL de Iniciadores (direto e reverso) (150 µg/mL ou 20 µL)
• 4 µL DNTP 5 mM
• 10 µL Tampão de Amplificação 10X
• 70,5 µL H2O. A mistura foi aquecida durante 2 minutos a 94° C e centrifugada rapidamente,
antes que 0,5 µL de Taq DNA polimerase 2,5U fosse adicionada. A mistura completa
foi homogeneizada e centrifugada novamente e colocadas no aparelho, utilizando-se o
seguinte programa:
As reações foram conduzidas em um Instrumento ABI7500 (Applied
Biosystems, Foster City, CA) de acordo com as condições descritas abaixo:
• Elevação da temperatura a 50o C por 2 minutos
• 50°C por 2 minutos
• 95o C por 10 minutos
O ciclo foi repetido por 39 vezes.
• 94o C por 15 segundos
• 59o C por 1 minuto
Abaixamento da temperatura a 4o C.
Como padrão fez-se o RT-PCR também para o gene da actina para cada conjunto de
cDNAs utilizados, atuando como normalizador do experimento.
29
Para a análise dos resultados, foi utilizado o método comparativo 2^ [-∆ (∆C(T))]
descrito por Livak, K. J. e Schmittgen, T. D. ((Livak, K. J. e Schmittgen, T. D., 2001).
3.5 - Medidas do pH interno
O pH interno das cepas, que foram expostas às condições de estresse ácido e
adição de NaCl, foi avaliado através da técnica de distribuição do [2-14C] - ácido
propiônico entre o interior da célula e o meio extracelular ( Viegas, C. A. e Sá-Correia,
I., 1991). As células foram crescidas em 20 mL de meio YPD 4%, até atingirem D.O.
600nm 1,0. Após o crescimento as células foram lavadas duas vezes com YP e
ressuspensas no mesmo volume de solução pH 2 e 85mM de NaCl em presença de 4 µL
de [2-14C] - ácido propiônico 18,56 mM (Amersham), a 30°C, por um período de 25 a
45 minutos até que o ácido propiônico atingisse o equilíbrio entre o meio extracelular e
o citoplasma. Alíquotas de 4 mL foram filtradas em filtros de lã de vidro Whatmann
GFC, lavadas rapidamente com água Milli-Q gelada (10 mL) e a radioatividade
detectada em Cintilador Beckman LS 6000SC. Para determinar a concentração total de
ácido propiônico extracelular 500 µL da suspensão de células foi centrifugado por 2
minutos a 13000 rpm, e 20 µL do sobrenadante foi usado para detecção da
radioatividade. A concentração intracelular de ácido propiônico foi determinada
utilizando como medida o valor de 2,2 µL/mg de células descrito por Viegas, C. A. e
Sá-Correia, I., (1991) de volume celular interno. O pH externo foi medido usando o
pHmetro (Orion Model 720A). Os valores de pHi foram calculados da média de
duplicatas de três culturas independentes.
30
3.6 - Conteúdo intracelular de sódio e potássio
As leveduras dos mutantes de S. cerevisiae com diferentes deleções para o
transporte de sódio e a levedura S. boulardii foram crescidas em 50 mL de YP glicose
4%, foram coletadas por centrifugação a 3750 rpm por 5 minutos e expostas às
condições de estresse ácido já descritas anteriormente. Alíquotas de 4 mL da suspensão
de células foram coletadas por filtração a vácuo em filtros previamente pesados, para
que fosse possível determinar o peso seco de células. Paralelamente coletaram-se
alíquotas de células expostas e não expostas que foram filtradas e lavadas
imediatamente com abundância em solução MgCl2 20mM. Os filtros contendo as
células foram submersos em 5 mL de solução HCl 1M e após agitação em vórtex foram
incubados a 4°C “overnigth”. Para determinar os níveis de Na+ e K+ das alíquotas foi
utilizado Espectrofotômetro de Emissão Atômica Varian AA-20 e solução padrão de
Na+ e K+ com concentração 100 µg/mL, para ambos (Rodríguez-Navarro, A. e Ramos,
R., 1984) .
Para determinar a taxa de sódio total nas amostras utilizou-se a equação
matemática a seguir:
Na+ (nmoles/mg de massa seca) = Leitura x (5 x 10-6)
23
X 1000000
P.S.
Sendo que:
a) Leitura = quantidade de sódio expresso em mg/L.
b) P.S. = valor de peso seco em g.
c) 5 x 10-6 = volume do extrato de cálcio em litros.
31
d) 23 = quantidade de Na+ (em mg) presente em 1 mmol (peso molecular).
e) 1000000 = fator de correção desde que o sódio foi expresso em nmoles/mg de
célula.
Para determinar a taxa de potássio total nas amostras utilizou-se a equação
matemática a seguir:
K+ (nmoles/mg de massa seca )= Leitura x (5 x 10-6)
39,10
X 1000000
P.S.
Sendo que:
a) Leitura = quantidade de potássio expresso em mg/L.
b) P.S. = valor de peso seco em g.
c) 5 x 10-6 = volume do extrato de potássio em litros.
d) 39,10 = quantidade de K+ (em mg) presente em 1 mmol (peso molecular).
e) 1000000 = fator de correção desde que o potássio foi expresso em nmoles/mg de
célula.
32
3.7 - Atividade H+-ATPásica
As células foram crescidas em meio YPD 4% até D.O.600nm = 1,0, coletadas por
centrifugação 3750 rpm e lavadas duas vezes com YP, a 4°C e diluídas em YP na
concentração de 75 mg/mL de células para a coleta do controle (tempo 0). Em seguida,
a suspensão de células foi centrifugada novamente e diluída para exposição ao estresse
ácido acrescido de 85mM de NaCl. As células submetidas ao estresse foram coletadas
em alíquotas de 5 mL, nos tempos 30 e 60 minutos, filtradas a vácuo e acondicionadas
imediatamente em papel alumínio e congeladas em nitrogênio líquido. As amostras
foram estocadas no freezer -80°C para obtenção das membranas citoplasmáticas.
3.7.1 - Obtenção das membranas citoplasmáticas
As amostras congeladas foram transferidas para tubos de ensaio (0,5 mm de
diâmetro), contendo 1,5 g de pérolas de vidro, 0,5 mL de tampão de extração (Tris 0,1
M, EDTA 5 mM, β mercaptoetanol 1mM, pH 8,0) e homogeneizadas duas vezes por 90
segundos com intervalos de resfriamento em gelo como descrito por Becher Dos Passos,
J. e cols., (1992). Em seguida, foi adicionado 1 mL de tampão de extração (Sorbitol
0.33 M, Tris 0.1 M, EDTA 5 mM, β mercaptoetanol 1 mM, pH 8.0) e as amostras foram
novamente homogeneizadas por 30 segundos. Desta forma uma boa parte das células foi
lisada, possibilitando o isolamento de frações de membranas.
Para a obtenção das membranas citoplasmáticas foi feito uma centrifugação
fracionada do homogenato, a 1.000g por 3 minutos, sendo o sobrenadante resultante
centrifugado a 15.000g por 30 minutos. Após a centrifugação o sedimento obtido foi
ressuspenso em 1 mL de tampão glicerol (Glicerol 20 %, Tris 10 mM, EDTA 0,1 mM,
β mercaptoetanol 1 mM, pH 7,5).
Para a etapa seguinte fez-se um gradiente de sacarose da seguinte forma: 3 mL
de sacarose 53,5% (p/p) + 6 mL sacarose 43,5 %. O sedimento ressuspenso em glicerol
foi colocado neste gradiente e centrifugado a 100.000g por 2 horas. A fração de
33
membrana citoplasmática da levedura fica retida na interface das duas fases de sacarose
(Serrano, R., 1983), portanto, a interface do gradiente foi coletada, diluída em água
Mili-Q a 40C e homogeneizada. Esta nova suspensão foi centrifugada a 100.000g por 30
minutos. O sedimento final obtido, contendo a membrana citoplasmática, foi
ressuspenso em 300µL de tampão glicerol, sendo utilizado para determinação da
atividade H+- ATPásica (Becher Dos Passos, J. e cols., 1992).
3.7.2 - Ensaio da atividade H+-ATPásica
As amostras contendo frações de membrana citoplasmática relativas aos
diferentes tempos de incubação foram testadas em relação à atividade H+-ATPásica, em
duplicatas. Para cada uma delas, fez-se um branco correspondente a cada amostra,
branco em triplicata para o substrato (branco ATP) e um branco geral.
No branco geral foram adicionados 250 µL de tampão de incubação (Hepes 50
mM, NaN3 10mM - que inibe a ATPase mitocondrial e molibdato de amônio 5mM –
que inibe fosfatases ácidas, pH 6,5), nos brancos correspondentes as amostras foram
adicionados 210 µL deste tampão. Nos brancos para ATP foram adicionados 220 µL e
nos testes foram adicionados 180 µL do tampão de incubação.
Como já descrito por Dufour, J. P. e Goffeau, A., A., 1978, a atividade ATPásica
requer Mg2+, Mn2+ ou Co3+ como cofatores enzimáticos, sendo o íon Mg2+ o mais
efetivo. Desta forma, foram adicionados aos tubos testes e aos brancos ATP, 10 µL de
uma solução de MgCl2 50mM (concentração final 1mM). E, finalmente foram
adicionados 40 µL das amostras, nos testes correspondentes e nos brancos das amostras.
As amostras foram pré-incubadas a 30°C, em banho-maria por 5 minutos. Em
seguida, iniciou-se a reação pela adição de ATP 25 mM (concentração final 1 mM).
Após este período de incubação a reação foi interrompida com 250 µL de ácido
tricloroacético 10% (p/v) e nos tubos brancos ATP foram adicionados 20µL de solução
ATP 25 mM. Após interrupção da reação adicionou-se 450 µL de molibdato de amônio
34
5 mM em todos os tubos, seguidos da adição de 50 µL de reativo de cor (ANSA 2,5
mg, Na2 S2O5 1,5g, Na2 SO3 50 mg, 10 mL de água Milli-Q) recentemente preparado.
As amostras foram deixadas a temperatura ambiente por 30 minutos e, posteriormente
foi realizada a leitura a 710 nm em um espectrofotômetro (Beckman DU-68) (Becher
Dos Passos, J. e cols. 1992). Como padrão utilizou-se Na3HP04.
A atividade específica expressa em µmoles Pi/min./mg proteína foi calculada
por meio da seguinte equação:
Abs. 710nm – a1 × 4 × 6,25
Ativ. enz.específica (µmoles Pi min-1 mg-1) = b1 × 1000
Abs. 546nm – a2 × 20 ×10
b2
Sendo que:
a) Abs. 710nm = Valor da absorbância relativa à hidrólise de ATP.
b) a1 = Intercepto da curva padrão de fosfato.
c) b1 = Inclinação da curva padrão de fosfato.
d) 4 = Fator de correção (µg fosfato/ 250µL → µg fosfato/mL) desde que proteína
foi expressa em mg/mL.
e) 6,25 = Fator de diluição da amostra (40 µL da amostra diluídos para 250 µL
final do tampão de incubação).
f) Abs. 546nm = Valor em absorbância referente à dosagem de proteína.
g) a2 = Intercepto da curva padrão de proteínas.
h) b2 = Inclinação da curva padrão de proteínas.
i) 20 =Fator de diluição da amostra para dosagem de proteínas (20µL da amostra +
380 µL de água).
35
j) 10 = Tempo de reação.
3.7.3 - Dosagem de proteína
A dosagem de proteínas foi feita de acordo com o método de Lowry, O. H.
modificado (Lowry, O. H. e cols., 1951), utilizando soro albumina bovina como padrão.
3.8 - Determinação do potencial de membrana
O método para determinação do potencial de membrana foi baseado na
metodologia descrita por Krasznai, Z. e cols., (1995), com algumas modificações.
Utilizando-se técnicas de citometria de fluxo para detectar a distribuição do marcador
bis-oxonol trimetina (1,3-ácido dibutilbarbitúrico) (Di-BaC-4(3)) através da membrana
citoplasmática, que obedece a lei de Nernst, na qual explica as alterações do potencial
de membrana após aumento ou reduções das concentrações iônicas nos líquidos extra e
intracelulares.
3.8.1 - Aquisição e análise dos dados em citômetro de fluxo
As células foram crescidas em 50mL de meio YP glicose 4% a 300 rpm, a 30°C
até atingirem D.O.600nm = 1,0. As células foram coletadas e expostas às condições de
estresse de acordo com o item 3.3.
Após a exposição, cada amostra foi diluída a uma concentração final de 5 x 10-6 células/
mL em Tampão Fosfato PBS (137mM NaCl, 2,7mM KCl, 10mM Na2HPO4 e 2mM
KH2PO4 pH 7,4) esterilizado por filtração (membrana millipore 0,22µ). A marcação
para medida de fluorescência obtida para cálculo do potencial de membrana foi feita
com adição de 500 nM final (SIGMA-ALDRICH diluído em DMSO) à 500µL da
36
mesma suspensão de células em tubos de poliestireno 22 x 75 cm (Vacutainer – BD,
E.V.A.). Os tubos foram incubados em temperatura ambiente durante 30 minutos ao
abrigo da luz. Após incubação, as amostras foram lidas e analisadas em citômetro de
fluxo FACS-calibur (Becton Dickinson) utilizando o programa “BD CellQuestTM Pro
Software”.
Para determinação do valor do potencial de membrana das células
utilizou-se a equação de Nernst, descrita a seguir:
Ѱ= [(RT/F) ln(Di/De)]
Sendo que :
a) Ѱ = Potencial de membrana
b) R = Constante Universal dos Gases – 8,315 J/mol
c) T = Temperatura absoluta – 298 K
d) F = Constante de Faraday – 96480 J/Vmol
e) Di = Concentração interna de DiBA-C4-(3)
f) De = Concentração externa de DiBA-C4-(3)
3.8.2 - Curva padrão de potencial com células fixadas
As cepas de Saccharomyces utilizadas para construção da curva padrão de
DiBA-C4-(3), foram crescidas em 10 mL de YP glicose 4% sob agitação a 30°C até
atingirem D.O.600nm = 1,0. Após terem sido coletadas e lavadas com YP, as células
foram ressuspensas em PBS 1X filtrado para concentração final de células de 5 x 10-6
células/mL e mantidas em gelo. Para fixação foi adicionada a 10 mL da suspensão de
células o mesmo volume de solução de fixação (1M de NaOH, 0,33M de
Paraformaldeído, 0,05M cacodilato de sódio e 0,11M de NaCl – pH 7,2). S. cerevisiae
W303 foi fixada em banho de gelo e S. boulardii fixada em temperatura ambiente,
ambas sob agitação suave “overnigth”. O monitoramento da uma correta fixação foi
37
essencial para posterior construção da curva padrão de DiBA-C4-(3). A suspensão de
células fixadas foi então centrifugada a 3750 rpm por 5 minutos a 4°C, depois de
descartado o sobrenadante, foram lavadas duas vezes com PBS1X filtrado e
ressuspensas no mesmo tampão conservando a concentração de 5x10-6 células/mL.
Para construção da curva padrão de potencial, adicionou-se diferentes
concentrações de DiBA-C4-(3) à suspensão de células previamente fixadas. Os tubos
contendo a mistura de DiBA-C4-(3) e células foram incubadas em temperatura ambiente
durante 30 minutos ao abrigo da luz. Após incubação, as amostras foram lidas e
analisadas em citômetro de fluxo FACS-calibur (Becton Dickinson) utilizando o
programa “BD CellQuestTM Pro Software”.
Os pontos da curva padrão de potencial foram feitos em concentrações de 0, 300,
400, 500, 700 e 1000 nM de DiBA-C4-(3) e foram obtidos em triplicatas técnicas.
3.9 - Medida de cálcio celular total
As células de S. cerevisiae e S. boulardii foram crescidas em YP glicose, foram
coletadas por centrifugação a 3.750 rpm por 5 minutos e expostas às condições de
estresse ácido já descritas anteriormente. O precipitado celular foi lavado com YP e
transferido para tubos de microcentrífuga previamente pesados. As amostras foram
centrifugadas a 13.000 rpm por 5 minutos, o sobrenadante foi removido cuidadosamente
e as células foram centrifugadas novamente. Os tubos contendo as células foram
pesados para determinar o peso úmido e logo depois o precipitado celular foi secado em
Sistema Speed Vac Savant. Posteriormente, os tubos foram pesados para que fosse
possível determinar o peso seco de células. Adicionou-se aos tubos uma solução de HCl
1M e a suspensão foi homogeneizada por agitação em vórtex e incubada por pelo menos
24 horas, sob agitação constante. Após a incubação cada amostra foi centrifugada
brevemente e coletou-se uma alíquota de 1 mL do sobrenadante que foi transferido para
tubos de 15 mL e diluído cinco vezes em solução de HCl 1M. Para determinar os níveis
38
de Ca2+ das alíquotas foi utilizado Espectrofotômetro de Absorção Atômica Varian AA-
20 e solução padrão de Ca2+ com concentração de 1 µg/mL (Miseta, A. e cols., 1999).
Para determinar a taxa de cálcio celular total foi utilizada a equação matemática
descrita a seguir:
Ca+2 (mmoles/Kg de massa seca) = Leitura x (5 x 10-3)
40
X 1000
P.S.
Sendo que:
a) Leitura = quantidade de cálcio expresso em mg/L.
b) P.S. = valor de peso seco em kg.
c) 5 x 10-3 = volume do extrato de cálcio em litros.
d) 40 = quantidade de Ca2+ (em mg) presente em 1 mmol (peso molecular).
e) 1000 = fator de correção desde que o cálcio foi expresso em mmoles/kg de
célula.
39
3.10 - Atividade Ca+2-ATPásica
3.10.1 - Obtenção da fração de membrana subcelular para o estudo do perfil de
atividade da Ca+2 – ATPase vacuolar (Pmc1 p)
Para o fracionamento celular utilizou-se o protocolo descrito por Becherer, K. A.
e cols. (1996), com algumas modificações. As células foram crescidas em 500 mL de
meio YP glicose 4% até a fase logarítmica (DO600nm = 1.0) e submetidas às condições
de estresse como descrito no item 3.3, coletadas por centrifugação a 3.750 rpm e
ressuspensas em 50 mL de tampão (Tris-HCl 200mM, pH 8.0; EDTA 20mM, 1% de β-
Mercaptoetanol, NaN3 5mM e NaF 5mM). Após uma incubação de 10 minutos, a 30°C,
as células foram coletadas por centrifugação, ressuspensas em 50 mL de meio para
esferoplastos (sorbitol 1M, NaN3 5mM e NaF 5mM) suplementado com liticase (Sigma)
0.3 mg/mL e procedeu-se nova incubação a 30°C por 30 minutos. Posteriormente foram
resfriadas em gelo e lavadas duas vezes com meio para esferoplastos gelado; para
garantir a integridade das proteínas obtidas no fracionamento, as células permaneceram
a 4°C em todas as etapas.
Os esferoplastos obtidos foram lisados em 4-6 mL de tampão hipo-osmótico
gelado (Tris-HCl 50mM, pH 7.5, sorbitol 200mM e EDTA 1mM) acrescido de 1 mM
de inibidor de proteases PMSF (phenylmethylsulphonyl fluoride), através de desrupção
ultra-sônica (em sonicador Sonic Dismembrator model 500 – Fisher Scientific) com 4
pulsos de sonicação de 10 segundos, com 10 segundos de intervalo em gelo, entre cada
pulso. As células lisadas foram submetidas à centrifugação fracionada a 500g (por 5
minutos), 13.000g (10 minutos) e 100.000g (60 minutos), sendo que o precipitado final
foi ressuspenso em 2 mL de tampão hipo-osmótico (acrescido de PMSF), e adicionado
no topo de um gradiente de sacarose. Todas as soluções de sacarose que compunham o
gradiente(1.5 mL 60%, 1.0 mL 37%, 1.5 mL 34%, 2.0 mL 32%, 2.0 mL 29%, 1.5 mL
27% e 1.0 mL de sacarose 22%) foram feitas em concentrações de % p/p com sacarose
ultrapura em solução de HEPES-KOH 10 mM, pH 7.6, EDTA 1mM, sorbitol 0.8M.
40
Frações de 0.6 mL foram coletadas após centrifugação em rotor SW40Ti Beckman a
170.000g por 17 horas.
3.10.2 - Identificação das frações contendo membrana subcelular de vacúolo
Em um fracionamento de membranas subcelulares, a membrana correspondente
de cada organela está presente em maior proporção em uma faixa contínua e específica
de frações (Lisman, Q. e cols., 2004). Tendo em vista que a proteína de interesse
encontra-se na membrana do vacúolo, foi realizado um ensaio de atividade ATPásica
(item 3.4.2), na presença ou não de 500 µM de CaCl2 com cada uma das 20 frações
isoladamente. As frações selecionadas foram submetidas também a um novo ensaio de
atividade na presença de 500 µM de CaCl2 acrescidos de 2mM do quelante EGTA.
Contudo foi utilizada uma mistura das frações 15, 16 e 17, para a obtenção dos
níveis de atividade da Ca2+ – ATPase vacuolar, Pmc1 p. Optou-se pela mistura nos
ensaios para eliminar possíveis interferências devido a diferenças na migração da
suspensão de membrana subcelular durante o fracionamento no gradiente.
3.10.3 - Ensaio da atividade Ca2+ - ATPásica
A determinação da atividade da Ca2+ - ATPase vacuolar, Pmc1 p, foi realizada
utilizando-se basicamente a mesma reação descrita no item 3.7.2 (Becher Dos Passos, J.
e cols.,1992). A mistura da suspensão de membranas de vacúolo purificadas, foi
adicionado ao tampão de incubação da atividade (Hepes 50 mM, NaN3 10 mM que
inibe ATPase mitocondrial e molibdato de amônio 5 mM, pH 6.5) contendo MgCl21
41
mM. A reação iniciou-se com a adição de 2 mM de ATP após uma pré-incubação de 10
minutos, a 30°C com 500µM CaCl2 ou 500 µM CaCl2 mais 2mM de EGTA. Após 10
minutos interrompeu-se a reação pela adição de 250 µL de ácido tricloroacético (TCA)
10% (p/v), para a fixação do fosfato liberado durante a reação de hidrólise do ATP 450
µL de molibdato de amônio 5 mM em HCl 0.8 N foram usados. A mistura de reação
contendo 50 µL do reativo de cor (ANSA 1 mg, Na2SO3 20 mg , Na2S2O5 600 mg ,
água q.s.p. 4 mL) foi incubada por 30 minutos e então as absorbâncias a 720 nm foram
obtidas em um espectrofotômetro (Beckman DU-68).
A atividade ATPásica expressa em µmoles Pi/min./mg proteína foi calculada
através da equação descrita no item 3.7.2. Para obtenção da atividade Ca2+ - ATPásica,
específica, os valores obtidos na reação contendo CaCl2 + EGTA, foram subtraídos
daqueles obtidos para as reações que aconteceram apenas na presença do CaCl2. Esse
procedimento foi realizado para eliminar possíveis atividades contaminantes de outras
ATPases que não fosse a de interesse.
3.10.4 - Dosagem de proteína
A dosagem de proteínas foi feita como no item 3.7.3 (Lowry, O. H. e cols.,
1951).
3.11 – Monitoramento in vivo da concentração de cálcio citosólico livre
3.11.1 – Transformação de leveduras
3.11.1.1 – Preparo de células de levedura competentes
As cepas Saccharomyces cerevisiae submetidas ao processo de transformação,
foram pré-crescidas em 4 mL de YP glicose, a 28°C sob agitação constante (200 rpm),
durante 24 horas. Este pré-inóculo foi utilizado para inocular 100 mL do mesmo meio
42
que foi então incubado nas mesmas condições de temperatura e agitação descritas
acima, até que a cultura atingisse um valor de densidade ótica de 0.6. Após o
crescimento, as células foram coletadas por centrifugação a 3.750 rpm por 4 minutos. O
sobrenadante da cultura foi descartado e as células de leveduras foram lavadas com 20
mL de TE (Tris 10mM, EDTA 1 mM, pH 8.0) e ressuspensas em 5 mL do mesmo
tampão, acrescidos de 250 µL de LiAc 2.5 M. A suspensão de células foi incubada a
28°C sob agitação constante (200 rpm) durante no mínimo 90 minutos.
As células de levedura, então competentes pelo tratamento descrito acima, foram
aliquotadas em frações de 300 µL e usadas imediatamente para as transformações.
3.11.1.2 – Transformação de leveduras
Às frações de 300 µL da suspensão de leveduras competentes, adicionou-se 5 µg
do DNA de interesse a ser inserido e 10 µL de DNA de esperma de salmão (10 mg/mL)
previamente desnaturado a 95°C. Após uma incubação de 30 minutos em estufa a 30°C
(sem agitação) foram adicionados 700 µL de PEG 4.000 (50%). Procedeu-se a
homogeneização do conteúdo delicadamente e o mesmo foi incubado por 1 hora, sem
agitação, a 30°C. Em seguida, as células foram submetidas a choque térmico a 42°C
(banho Maria), por 10 minutos, e logo após foram centrifugadas por um minuto a 3.750
rpm. O sobrenadante foi descartado e as células foram lavadas com 1 mL de água
mili-Q ou sorbitol 1M quando necessário. Após nova centrifugação nas mesmas
condições anteriores, 900 µL do sobrenadante foram descartados e as células foram
ressuspensas no sobrenadante residual e plaqueadas com pérolas de vidro em meio
sólido seletivo (SD - marcador). As placas foram incubadas a 30°C, por 72 horas (Ito e
cols. 1983).
Como controle negativo do experimento, foram utilizados apenas os 300 µL da
suspensão de leveduras, acrescidos do DNA de esperma de salmão (10 mg/mL)
previamente desnaturado.
43
3.11.2 - Concentração de cálcio citosólico livre em estresse ácido
Para a medida da concentração de cálcio citosólico livre foi utilizado o método
da Aequorina (Tisi e cols., 2002). As cepas analisadas foram transformadas (itens
3.11.1.1 e 3.11.1.2) com o plasmídeo contendo o gene que codifica para a apoaequorina,
sob regulação do promotor ADH1. Os plasmídeos foram obtidos com base na família de
vetores de expressão de leveduras, oito séries pVT, construída e caracterizada por
Vernet e cols. (1987). Dois plasmídeos foram utilizados nestas transformações, o
pVTU-AEQ1 e o pVTW-AEQ1, sendo que a única diferença entre eles deve-se ao
marcador auxotrófico presente em cada um dos mesmos, URA3 e TRP1,
respectivamente. Diante disso, o critério utilizado para a escolha do plasmídeo em cada
uma das transformações foi a compatibilidade do genótipo das cepas com cada um dos
vetores. Os plasmideos pVTU-AEQ1 e pVTW-AEQ foram gerados pela inserção do
fragmento do gene AEQ1 obtido com PCR do vetor pYX212-AEQ (Tisi e cols., 2002).
Para o experimento de monitoramento, as células foram pré-inoculadas em 5 mL
de meio YP glicose, a 30oC sob agitação constante de 200 rpm (Incubador Rotatório
New Brunswick Model G25) até a fase exponencial (5-6 X 106). Após serem coletadas
por centrifugação (3.750 rpm por 5 minutos) e lavadas três vezes com água mili-Q, as
células foram expostas as condições de estresse segundo item 3.3. Em seguida as células
foram centrifugadas a 3.750 rpm por 2 minutos e ressuspensas então em 0.1M de
tampão MES/Tris, pH 6.5, desta vez a uma densidade de 2.5 X 109 cels/mL.
Na etapa seguinte, 50 µM de coelenterazina (Sigma; solução estoque de 1µg/µL
dissolvidos em metanol) foram adicionados a 30 µL da suspensão de células e as
mesmas foram incubadas por 20 minutos à temperatura ambiente, no escuro. Este
procedimento é essencial para a reconstituição da aequorina funcional. Para remover o
excesso de coelenterazina as células foram lavadas três vezes com tampão MES 0.1M
pH 6.5 (200 µL para cada lavagem) com centrifugação de 2 minutos a 6.000 rpm. No
procedimento de preparo das amostras para leitura em luminômetro Berthold Lumat LB
9501/16 as células foram ressuspensas em 500 µL do mesmo tampão citado
44
anteriormente (5 X 107 cels/mL) e então transferidas para um tubo de luminômetro.
Para medir o cálcio citosólico (sinal de cálcio) a luminescência emitida foi monitorada
em intervalos de 10 s, por 6 min, antes do estímulo. Os dados obtidos foram transferidos
e analisados em computador acoplado ao equipamento.
3.12 - Capacidade tamponante de células e extrato celular
As células de S. boulardii e S. cerevisiae crescidas em meio YP glicose 4% até
D.O.600nm = 1,0 e submetidas ao estresse como já descrito no item 3.3 foram avaliadas
quanto ao efeito tamponante em relação à célula íntegra e também do extrato celular, ou
seja, células que tiveram a membrana rompida por maceração em nitrogênio líquido.
A capacidade tamponante foi determinada por titulação com solução de HCl
100mM. Um volume de 50 mL de células nas condições controle, expostas a pH 2, e
expostas a pH2 + 85mM de NaCl foram centrifugadas, lavadas duas vezes com água
Milli-Q e ressuspensas em volume final de 2 mL em água. O pH foi ajustado para 6,8
imediatamente após a coleta. Em uma alíquota de 1 mL de células ou de extrato celular
eram adicionados determinados volumes (0,01 mL) de ácido clorídrico 0,8 M e o pH
registrado a cada adição do ácido, até alcançarmos pH 1,7. Os resultados foram
expressos em nmoles de H+ por miligramas de células versus pH ou em nmoles de H+
por miligramas de proteína versus pH, no caso do extrato livre de células. Determinou-
se o peso seco antes e após a exposição ao estresse.
3.13 - Análise Lipídica por Cromatografia Gasosa
As amostras foram transportadas em ambiente resfriado até o laboratório de
Biotecnologia Ambiental e Biodiversidade do professor responsável Marcos Rogério
45
Tótola, no departamento de Microbiologia da Universidade Federal de Viçosa, e os
resultados foram obtidos pelo método de análise lipídica por cromatografia gasosa
M.I.D.I. (Microbial Identification). Para serem utilizadas no aparelho de Identificação
Microbiana as amostras de membrana foram previamente submetidas às etapas de
extração de lipídeos antes da leitura no aparelho MIDI, como descrito a seguir:
Saponificação – Adicionou-se 1 mL do Reagente 1 (NaOH 3,75M em metanol e
água 1:1) em cada amostra, em seguida os tubos foram agitados em vórtex de 5 a 10
segundos e incubados em banho-maria a 100°C durante 5 minutos. Depois os tubos
foram novamente agitados em vórtex e incubados durante 25 minutos a 100°C.
Metilação – Após a etapa de saponificação os tubos foram acrescidos de 2 mL
do Reagente 2 ( 54,17% v/v de HCl 6M e 45,83% v/v de Álcool metílico ) e agitados 5
a 10 segundos em vórtex e incubados durante 10 minutos a 80°C.
Extração – Para a etapa de extração foi adicionado 1,25 mL do Reagente 3
(Hexano e Metil éter-butil éter na concentração 1:1) e centrifugados durante 10 minutos
em 200 rpm para que a fase aquosa fosse pipetada cuidadosamente e descartada.
Lavagem - Na fase orgânica restante 3 mL do Reagente 4 ( NaOH 0,3M ) foram
acrescentados e os tubos novamente centrifugados durante 5 minutos em 200 rpm.
Depois de centrifugadas a fase orgânica foi coletada e levada para análise no aparelho
de análise lipídica por cromatografia gasosa M.I.D.I.
3.14 - Dosagem de reservas energéticas
As cepas Saccharomyces foram crescidas em 200 mL de YP glicose 4%, sob
agitação, a 30°C até atingirem D.O.600nm= 1,0. O sedimento celular coletado a 3750 rpm
foi lavado duas vezes com meio YP e ressuspenso no mesmo volume de meio YP para
coleta dos controles. Para medida do peso seco foram coletados 6 mL da suspensão de
células em duplicatas. Na mesma solução coletou-se 6 mL para o tempo controle da
medida de ATP e 10 mL para o tempo controle de trealose e glicogênio. Após coleta
46
dos controles, centrifugou-se novamente e as células foram ressuspensas em igual
volume de HCl pH 2 e solução pH 2 + 85 mM de NaCl. Em seguida fez-se a coleta de
amostra para determinação de peso seco. Após o estresse, sob agitação 200 rpm, em
banho-maria a 37°C, amostras foram coletadas nos tempos 10, 30 e 60 minutos de
exposição.
3.14.1 Dosagem de trealose e glicogênio
A suspensão de células coletada nos tempos controle, 10, 30 e 60 minutos foi
centrifugada a 3750 rpm, a 4°C, por 5 minutos. Após centrifugação, desprezou-se o
sobrenadante, as células foram ressuspensas em solução de 0,25 mL de Na2CO3 0,25 M,
0,15 mL de ácido acético 1M e 0,6 mL de acetato de sódio 0,2 M, o pH final foi
ajustado para um valor em torno de 5. Depois de homogeneizadas as amostras foram
divididas em dois tubos de microcentrífuga. Em um dos tubos adicionou-se enzima
trealase (SIGMA) na concentração de 0,05 U/ mL e incubou-se em banho-maria a 37°C,
“overnigth”. No segundo tubo para medida de glicogênio adicionou-se enzima
amiloglucosidase (BOEHRINGER) na concentração de 1,2 U/ mL e incubou-se em
banho-maria a 57°C, “overnigth”. Após a incubação as amostras foram centrifugadas
por 3 minutos a 13000 rpm e o sobrenadante foi utilizado para dosagem de glicose. A
dosagem de glicose das amostras hidrolisadas com as enzimas trealase e
amiloglucosidase foi feita através do Método da Glicose-Oxidase. Alíquotas de 250 µL
de sobrenadante foram pré-incubadas durante 10 minutos, à temperatura de 30°C. Após
esta pré-incubação, adicionou-se à amostra 1 mL da mistura das soluções A (Glicose-
oxidase 100U/mg) e B (Ortodianisidine Dihydroclorid 1% p/v) na proporção de 100:1.
Depois de homogeneizadas, as amostras foram incubadas em banho-maria a 30°C
durante 10 minutos. Após esta incubação a reação de cor foi promovida pela adição de
0,5 mL de solução de H2SO4 56% e as amostras foram lidas em espectrofotômetro a 546
nm (adaptado de Parrou, J. L. et.al., 1997).
47
3.14.2 - Dosagem de níveis de ATP
Para determinação dos níveis de ATP coletou-se, por filtração, 6 mL da cultura
de células em D.O.600nm 1,0 ou da suspensão de células expostas em estresse. Aos
filtros contendo as células foi adicionado 1,5 mL de HClO4 1,2M e 1,5 mL de água
Milli-Q. Após homogeneização vigorosa, a mistura foi incubada a 4°C, “overnigth”.
Depois da incubação as amostras foram centrifugadas e uma alíquota do sobrenadante
foi diluída 125 vezes em tampão Tris-EDTA ( Tris base 0,04M e EDTA 0,001M em pH
7,5). Para preparo da reação enzimática com o complexo Luciferina-luciferase
(SIGMA), adicionou-se 100 µL do tampão Tris-EDTA a 50 µL da amostra diluída e no
momento da leitura no Luminômetro, acrescentou-se 120 µL da solução do complexo
Luciferina-luciferase. A luminescência foi detectada no Luminômetro Berthold Lumat
LB 9501/16 e expressa em URL (Unidade Relativa de Luminescência). Para conversão
da Unidade Relativa de Luminescência em concentração de ATP, foi utilizada uma
solução padrão de ATP na concentração de 2,5 x 10-5 µg/µL, onde a leitura da solução
padrão também foi feita seguindo os mesmos padrões de diluições das amostras
avaliadas (Hara, K. Y. e Mori, H., 2006).
3.15 - Estatística
Todos os experimentos descritos na metodologia foram feitos em duplicatas
técnicas e triplicatas biológicas, sendo que os significados estatísticos dos resultados
obtidos foram avaliados com a utilização do teste “t” de Student, utilizando 0,05 como
limiar de confiança.
48
Resultados
49
4 - Resultados
4.1 - Tolerância das cepas Saccharomyces ao suco gástrico e a seus componentes
4.1.1 – Efeito do pH ácido em cepas Saccharomyces cerevisiae
A sobrevivência de microrganismos probióticos é dependente da sua capacidade
de resistir às condições desfavoráveis pela passagem do trato gastrointestinal. Neste
contexto, a tolerância ao baixo pH gástrico e sais biliares têm sido utilizado como
critério para seleção de microrganismos potencialmente probióticos (Ouwehand, A.C. e
cols., 1999).
A tolerância de S. boulardii ao ambiente gástrico simulado (solução aquosa
contendo 85mM de NaCl, 3g/L de pepsina e pH 2), foi determinada medindo a
viabilidade ao longo do tempo de incubação em comparação com S. cerevisiae W303
(uma linhagem de laboratório) e com as linhagens selvagens provenientes de uma
coleção do laboratório da Universidade Federal de Minas Gerais, que apresentaram
tolerância significativa ao estresse de temperatura e alta capacidade de acumular
trealose em condições de estresse, UFMG 20 e UFMG 24 (Martins, F. S. e cols., 2008).
Nossos resultados demonstram que após 1 hora de exposição ao estresse gástrico
simulado, as cepas permaneceram com 25% de viabilidade, enquanto, S. boulardii
apresentou 80% de viabilidade, indicando maior tolerância em relação às outras cepas
Saccharomyces (Figura 2A).
O fluido gástrico tem grande importância como primeira defesa contra
patógenos entéricos, e pesquisas simulando este fluido tem sido bem documentada
(Smith, J. L., 2003; Tamplin, M. I., 2005). O estômago destaca-se por ter um papel
fundamental não só na digestão parcial dos alimentos, mas também na inativação e
morte de agentes patogênicos presentes nos alimentos antes da sua entrada no trato
gastrointestinal (Smith, J. L., 2003).
A resistência ácida é um importante fator na patogenicidade de bactérias
gastrointestinais e nas propriedades dos microrganismos probióticos. Portanto, a
viabilidade das células foi avaliada através da exposição dos componentes do ambiente
gástrico simulado separadamente, ou seja, 85 mM de NaCl, 3g/L de pepsina e pH 2.
50
Os resultados na figura 2B, que demonstram a viabilidade de S. cerevisiae W303
e S. boulardii expostas aos diferentes componentes do suco gástrico, constatam que,
pepsina e NaCl, não afetam significativamente a viabilidade das leveduras avaliadas.
Em contrapartida, a porcentagem de sobrevivência das células decresce drasticamente
em pH 2, e como previsto a cepa S. boulardii apresentou maior resistência frente ao
estresse ácido (Edwards-Ingram, L. e cols., 2007; Van Der AA Kuhle, A. e cols., 2005;
Fietto, J. L. R. e cols., 2004).
51
Figura 2 – (A) Tolerância das cepas Saccharomyces ao ambiente gástrico simulado. (B)
Efeito isolado dos componentes do ambiente gástrico simulado na viabilidade. S.
boulardii e S. cerevisiae W303, que foram expostas aos componentes do ambiente
gástrico simulado separadamente. Viabilidade foi avaliada durante 60-minutos de
exposição: pH 2, pepsina 3g/L e NaCl 85 mM.
0
20
40
60
80
100
120
0 20 40 60 80
% V
iab
ilid
ad
e
Tempo (min)
S. boulardii
UFMG 20
UFMG 24
w303
0
20
40
60
80
100
120
0 20 40 60 80
% V
iab
ilid
ad
e
Tempo (min)
Sb pepsina
Sb NaCl
Sb pH 2
W303 pepsina
W303 NaCl
W303 pH 2
B
A
52
4.1.2 Efeito protetor de íons na viabilidade ao estresse
Os resultados obtidos com a viabilidade das cepas Saccharomyces em pH 2 e
adição de 85 mM de NaCl (figura 3) revelaram que a adição de NaCl protegeu tanto S.
cerevisiae W303, quanto S. boulardii, dos efeitos deletérios do pH baixo. Podemos
observar este efeito protetor, após 1 hora de exposição, mais significativo em
S. boulardii (84% de sobrevivência) que em S. cerevisiae W303 (33% de
sobrevivência).
A especificidade do efeito protetor do sódio foi investigada. Diferentes íons
demonstraram efeito protetor na viabilidade de S. cerevisiae W303 e S. boulardii em
estresse ácido (Figura 3). Portanto a tolerância a ácido parece não corresponder a um
íon em específico, embora o efeito protetor do sódio tenha sido consideravelmente
maior em células de S. boulardii, e mais alta que os outros íons adicionados (Figura
4A). Em S. cerevisiae W303 (Figura 4B) podemos observar que a proteção mais
significativa, desta cepa, em pH 2 foi do íon cálcio, e que em 30 minutos de exposição a
proteção pelos íons cálcio e sódio se equivaleram. Estes resultados demonstram que
provavelmente exista algum mecanismo específico em S. boulardii em relação ao efeito
protetor do sódio que não é observado em S. cerevisiae W303.
Todos estes sais têm em comum o íon cloreto, para descartar a influência do
ânion nos diferentes íons. Estes dados corroboram com o maior efeito protetor da adição
de sódio ao pH 2, observadas na figura 3 da cepa S. boulardii em relação a W303.
Além do efeito protetor dos íons, podemos notar que avaliando a cepa
S. boulardii somente em pH 2, após 60 minutos de exposição, existe uma resistência a
esta condição que não se refere à proteções de íons, contudo esta resistência sugere
outro mecanismo de proteção por S.boulardii que não seja com o envolvimento de íons.
53
Figura 3 – Efeito protetor da adição de NaCl na viabilidade de S.boulardii e
S. cerevisiae W303.
0
20
40
60
80
100
120
0 10 20 30 40 50 60 70
% V
iab
ilid
ad
e
Tempo (min)
S. boulardii pH 2
S. boulardii pH 2 +NaCl
W303 pH 2
W303 pH 2 +NaCl
54
Figure 4 - Efeito de sais na tolerância ao pH 2 em S. boulardii (A) e W303 (B) - pH 2
(♦), NaCl (■), KCl (▲), CaCl2 (* ), MgCl2 (* ), LiCl (•).
0
20
40
60
80
100
120
0 10 20 30 40 50 60 70
% V
iab
ilid
ad
e
Tempo (min)
0
20
40
60
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100
120
0 10 20 30 40 50 60 70
% V
iab
ilid
ad
e
Tempo (min)
A
B
55
4.2 - Viabilidade ao estresse ácido em cepas Saccharomyces selvagens e com
deleções nos genes que codificam proteínas envolvidas na homeostase do sódio
O efluxo de sódio em S. cerevisiae é mediado primariamente pelas Na+-ATPase
do tipo P2 codificada pelo gene PMR2/ENA locus contendo em tandem (ENA1-5)
(Garciadeblas, B. e cols. 1993). Os resultados apresentados na tabela 1 mostram um
aumento da viabilidade celular do mutante ena1-4∆ de 5,0% de sobrevivência para
67,3% em 1 hora de exposição ao estresse ácido quando adicionamos de 85mM de NaCl
ao pH 2. Estes resultados sugerem que o silenciamento das Na+-ATPases, além de
representar um importante fator para aumento da sobrevivência em ambiente ácido,
apresenta-se intensificado, com a adição de NaCl, nestas mesmas condições.
A participação de ATPases do tipo P em geral foi testada pela adição do
vanadato ao estresse ácido/NaCl. Este inibidor não afetou de forma significativa a
viabilidade celular do mutante ena1-4∆, entretanto a viabilidade da cepa selvagem
W303 aumentou consideravelmente na presença deste inibidor (Tabela 1). Vanadato
inibe ATPase do tipo P, no qual envolve o efluxo de H+ e Na+/K+. Estudo do screening
do genoma de S. cerevisiae identificou nove P2 ATPases incluindo Pma1p, Pma2p e as
Na+-ATPase Ena1-5p (Morsomme, P. e cols., 2000).
A adição de cicloheximida no ensaio de estresse ácido mais NaCl resultou em
uma diminuição da proteção apresentada tanto em S.boulardii quanto em S. cerevisiae
W303, sugerindo uma função parcial da síntese de proteína na proteção por NaCl
(Figura 5A e B). O perfil protéico deve ser melhor investigado, principalmente porque
avaliamos viabilidade e o uso de drogas não é recomendado, para permitir identificar os
alvos protéicos envolvidos nesta resistência.
O efeito protetor do sódio está presente em todas as cepas com mutações nos
genes que codificam para proteínas responsáveis pelo efluxo e compartimentalização do
sódio. Nossa hipótese é que a manutenção de uma determinada quantidade intracelular
do íon é necessária para resistir ao pH baixo, bem como alcançar o efeito de proteção
deste sal, e que a homeostase da pequena quantidade de íons parece ser a chave para
sinalização, qualquer que seja o mecanismo molecular que permita tal resposta.
56
Uma vez que o efeito protetor da adição do sódio observado parece ser maior em
S. boulardii, e que a proteção é similar no mutante ena1-4∆, decidimos investigar a
expressão do gene ENA1-4 em S. boulardii. Nossos dados mostram baixos níveis do
transcrito ENA1 em S. boulardii, no qual possui baixos níveis de expressão quando
comparado à cepa S. cerevisiae W303 (figura 6). Além disso, a análise de RT-PCR
mostrou que a transcrição de ENA1 foi afetada pela exposição ao estresse ácido,
adicionada de sódio, nas duas cepas de Saccharomyces avaliadas.
Os dados de expressão reforçam a hipótese de uma relação inversa entre
expressão/atividade dos genes ENA e resistência ao estresse ácido na presença de sódio.
Já que proteínas Ena1-4p foram descritas por serem responsáveis pelo efluxo de sódio
em condições alcalinas (Bañuelos M.A. e cols., 1998), examinamos então paralelamente
também a transcrição do gene NHA1, que é supostamente mais importante para
extrusão de sódio em condições de pH baixo (Bañuelos M.A. e cols., 1998). Os níveis
de expressão do mesmo foram muito inferiores àqueles apresentados por ENA1 em
ambas as cepas e afetado negativamente ao longo da exposição ao estresse ácido/NaCl
(Figura 6).
57
Tabela 1 – Efeito do pH 2 e adição de Na+ e Vanadato na viabilidade das cepas
analisadas.
As células de leveduras foram crescidas em YPD 4% até fase exponencial e submetidas
até 1 hora em pH 2 na presença ou ausência de 85mM de NaCl. Os dados representam
méDias, R. S. e desvios padrões de três experimentos provenientes de diferentes
culturas de células.
58
Figura 5 – Efeito de 5 µg/mL de cicloheximida na viabilidade de Saccharomyces
crescidas em meio YPD 4% e expostas em estresse ácido. S.boulardii (Painel A) e S.
cerevisiae W303 (Painel B) – pH 2 (♦), pH 2 + 85 mM NaCl (■), pH 2 + NaCl +
Cicloxemida (▲) e controle (*).
0
20
40
60
80
100
120
0 10 20 30 40 50 60 70
% V
iab
ilid
ad
e
Tempo (min)
0
20
40
60
80
100
120
0 10 20 30 40 50 60 70
% V
iab
ilid
ad
e
Tempo (min)
B
A
59
Figura 6 – Nível de transcrição dos genes ENA1 e NHA1 em S. boulardii e
S. cerevisiae W303 por RT-PCR. Células foram crescidas em YPD 4% até fase
exponencial e expostas em pH ácido acrescidos de 85mM de NaCl. Células crescidas
em YPD (colunas não preenchidas); Células expostas a 30 minutos de estresse em pH 2
+ 85 mM NaCl (colunas preenchidas). O gene da actina (ACT1) foi utilizado como
controle pela expressão constitutiva.
mR
NA
ENA1 NHA1
60
4.2.1. Variações do pH intracelular em cepas Saccharomyces selvagem e com
deleções em genes que codificam proteínas envolvidas na homeostase do sódio
A redução da viabilidade das células de leveduras em pH baixo, mesmo na
presença de 85mM de NaCl, pode estar relacionada ao pH intracelular (Sychrova e
cols., 1999; Kinclova-Zimmermannova, O. e cols., 2006). Nestas condições S.
boulardii, a cepa selvagem W303 e ena1-4∆ apresentaram, respectivamente, um pH
interno de 6,08 ± 0,01, 6,04±0,09 e 6,04 ±0,03 (Tabela 2). Sob as mesmas condições, o
mutante nha1∆ mostrou menor valor de pH intracelular (4,98±0,20) que os mutantes
duplo e triplo (6,58±0,11 e 6,78±0,11). Os valores de pH observados no mutante nha1∆
é diferente dos valores encontrados em outras cepas, incluindo o mutante ena1-4∆, e
esta diferença pode ser deletéria para as funções vitais da célula (Fernandes, A.R. e Sá-
Correia, I., 2001; Imai, T. e Ohno, T., 1995).
Posteriormente analisamos o acúmulo intracelular de Na+ em resposta ao pH
ácido. A figura 7 mostra o conteúdo de Na+ e K+ nas diferentes células de leveduras
crescidas em meio YPD e expostas em pH 2 adicionado de 85 mM de NaCl.
S. boulardii e todas as cepas que apresentam mutações no gene ENA1-4 foram capazes
de acumular mais sódio (e também potássio), quando comparadas com a cepa selvagem
S. cerevisiae W303. Por outro lado, todas as cepas analisadas perderam íons sódio e
potássio para o meio externo quando expostas ao pH 2+ 85 mM de NaCl até atingirem o
equilíbrio ( concentração interna = concentração externa = 85 mM) (Figura 7).
Podemos observar também um efluxo considerável do mutante ena1-
4∆nha1∆, este resultado sugere o envolvimento de outra proteína responsável pelo
efluxo de Na+/K+ em S. cerevisiae, que não Nha1p e Ena 1-4p. Os dados de acúmulo
demonstram que o efeito protetor de sódio em estresse ácido possui uma relação indireta
com o aumento da viabilidade em pH 2 + NaCl, mais importante do que a capacidade de
retenção de sódio pelas cepas analisadas.
61
Tabela 2 – pH intracelular de cepas Saccharomyces e mutantes envolvidos no transporte
de sódio, submetidos ao estresse ácido (pH 2 + 85 mM de NaCl)
Cepas pH interno
S. Boulardii 6,08±0,01
W303 6,04±0,09
ena1-4∆ 6,05±0,06
nha1∆ 4,98±0,20
ena1-4∆nha1∆ 6,58±0,11
ena1-4∆nha1∆nhx1∆ 6,78±0,04
62
Figura 7 – Alterações no conteúdo intracelular de Na+ (Painel A) e K+ (Painel B) em
cepas Saccharomyces. As células foram crescidas em meio YPD 4% até fase
exponencial e submetidas ao pH 2 + 85 mM de NaCl. S. boulardii (♦), S. cerevisiae
W303 (■), ena1-4∆ (▲), nha1∆(* ), nha1∆ena1-4∆ (* ) e nha1∆ena1-4∆nhx1∆(•).
0
100
200
300
400
500
600
0 10 20 30 40 50 60 70
nm
ole
s/ m
g d
e c
élu
las
Tempo (min)
0
100
200
300
400
500
600
0 10 20 30 40 50 60 70
nm
ole
s /
mg
de
cé
lula
s
Tempo (min)
B
A
63
4.3 - Participação da H+- ATPase de membrana plasmática em resposta ao estresse
gástrico
Quando a levedura enfrenta condições de baixo pH às células necessitam do
sistema de efluxo de prótons H+. Geneticamente bem caracterizadas, as H+-ATPases de
S. cerevisiae e de Schizosacharomyces pombe são codificadas pelo gene PMA1
(Serrano, R. e cols., 1986). Um segundo gene, PMA2, codificando para a H+-ATPase e
mostrando alta homologia com PMA1, está presente em ambos os microrganismos, no
entanto, a Pma2 p é expressa em níveis muito baixos e sua função fisiológica ainda não
está bem estabelecida (Portillo, F., 2000).
Sabe-se também que Pma1p gera um gradiente eletroquímico de prótons capaz
de impulsionar transportes secundários, contribuindo para regulação do pH intracelular
e por conseqüência a viabilidade. Portanto investigamos a atividade H+-ATPase em
estresse ácido na presença de baixos níveis de sódio, em S. boulardii, S. cerevisiae
W303 e mutante correspondente ena1-4∆ (Figura 8).
A atividade H+-ATPase foi 2 vezes maior nas cepas S. boulardii e no mutante
ena1-4∆, no qual demonstra uma contribuição positiva da atividade Pma1p ao estresse
ácido submetido. Ativação da H+-ATPase in vivo é essencial para conter os efeitos de
vários tipos de estresses, incluindo o decréscimo do pH (Carmelo, V. e cols., 1996).
Apesar dos resultados de ativação da H+-ATPase terem sido maiores em resposta ao
estresse por S. boulardii, não visualizamos nenhuma correlação entre atividade e
variações no pH interno da cepa probiótica e de S. cerevisiae W303.
64
Figura 8 – Ativação da H+-ATPase de membrana plasmática nas cepas S. boulardii (♦),
S. cerevisiae W303 (■) e ena1-4∆ (▲) crescidas em YPD 4% até fase exponencial e
expostas a pH 2 + 85 mM de NaCl durante 30 e 60 minutos.
0
0,1
0,2
0 15 30 45 60 75
Ati
vid
ad
e H
+-A
TP
ase
(µm
ol.
Pi.
min
-1.m
g d
e p
rote
ína
)
Tempo (min)
65
4.4 - Potencial de membrana das células submetidas ao estresse ácido
Para verificarmos se a sensibilidade das células de leveduras ao pH ácido resulta
na despolarização da membrana plasmática, decidimos comparar o potencial de
membrana (∆ѱ) das cepas Saccharomyces. Utilizamos a distribuição de Nernstian com
o uso do marcador bis-oxonol trimetina (1,3-ácido dibutilbarbitúrico) (Di-BaC-4(3)). O
potencial de membrana plasmática descrito por Borst-Pauwels, (1981) em S. cerevisiae,
está entre -50mV a -130mV.
Os resultados de potencial de membrana obtidos antes e após a exposição das
cepas em pH 2 e adicionado de 85mM de NaCl, podem ser visualizados na tabela 3.
Observamos que os valores iniciais de potencial de membrana das cepas S. boulardii,
W303 e ena1-4∆ foram de -98,4mV, -48,7mV e -83,7mV, respectivamente. O valor de
potencial de membrana mesmo nas condições iniciais do experimento demonstra um
potencial mais negativo da cepa S. boulardii e de ena1-4∆.
Com a exposição ao pH 2 ocorre uma despolarização da membrana plasmática
em todas as cepas analisadas. Contudo a adição de sódio ao meio ácido retarda a
despolarização. Após 30 minutos observamos uma recuperação de potencial de
membrana de S. boulardii de -76,5 para -90,4mV. Em S. cerevisiae W303 de +24,9 para
-18,5mV e do mutante ena1-4∆ de -69,8 para -88,5mV. Estes resultados corroboram ao
efeito protetor da adição de sódio em estresse ácido, conforme dados de viabilidade
apresentadas anteriormente e, por outro lado, um potencial de membrana plasmática
mais negativo (S. boulardii) deve estar relacionado à maior resistência da cepa
probiótica ao ambiente ácido (pH 2).
66
Tabela 3 – Potencial de membrana das cepas Saccharomyces
As células de leveduras foram crescidas em YPD 4% até fase exponencial e
submetidas até 1 hora em pH 2 na presença ou ausência de 85mM de NaCl. Os dados
representam méDias, R. S. e desvios padrões de três experimentos provenientes de
diferentes culturas de células.
Potencial de membrana (mV)
67
4.5 - Análise de alterações metabólicas que podem esclarecer a maior resistência da cepa S. boulardii frente ao estresse ácido 4.5.1 - Avaliação da homeostase do cálcio em cepas Saccharomyces submetidas ao estresse ácido
O cálcio tem uma função ampla e importante na célula, como controle da
expressão gênica, exocitose, rearranjo do citoesqueleto e fisiologia celular (Iida, H. e
cols., 1990). Como para todo mensageiro secundário, a concentração de cálcio livre no
citoplasma é mantida em níveis muito baixos, variando entre 50 a 100 nM em células de
leveduras ( Halachmi, D. e Eilam, Y., 1989). O aumento da concentração interna de
cálcio pode ocorrer em resposta a diferentes sinais (Sanders, D. e cols., 2002) afetando
diversos processos celulares que incluem a regulação da expressão gênica, progressão
do ciclo celular, processamento e síntese de proteínas, apoptose, o transporte nuclear, a
segregação de cromossomos (Rudolph,H. K. e cols, 1989; Iida, H. e cols., 1990;
Okorokov, A. L. e Lehle, L., 1998; Durr, G. e cols., 1998; Yoshida, T. e cols., 1994;
Corbertt e Michalak, 2000; Carrion e cols., 1999).
Para avaliar o papel do cálcio na resposta ao estresse ácido das cepas
Saccharomyces, analisamos o acúmulo do cálcio e a atividade da Ca+2-ATPase vacuolar
(Pmc1p) nas cepas submetidas ao estresse ácido a 30°C e coletadas ao longo da
exposição. Foi possível observar que a cepa S. cerevisiae W303 acumula o dobro de
cálcio quando comparada a S. boulardii na condição controle, ou seja, cultivadas em
meio rico (YPD 4%) e que ao longo da exposição ao estresse ácido ocorre uma perda
considerável (mais de 50%) deste íon pela cepa W303. No probiótico S. boulardii houve
perda de no máximo 40% de cálcio, indicando a manutenção dos estoques do íon,
podendo contribuir para a sinalização e ativação das vias de resposta ao estresse (Figura
9).
Dos sistemas de transporte de cálcio, as Ca+2-ATPases são de interesse
especial, devido à importância do cálcio como sinalizador celular (Berridge, M. J. ,
1993). Muitas funções celulares são direta ou indiretamente reguladas pela concentração
de cálcio livre, o que faz com que mudanças drásticas na homeostase de cálcio causadas
por condições de estresse, sejam incompatíveis com a vida. Os resultados da atividade
68
da bomba Ca+2-ATPase (Pmc1p) (Figura 10) mostram que S. cerevisiae reduz o
seqüestro de cálcio em 75% em relação ao controle nos primeiros 5 minutos de
exposição, após 30 e 60 minutos a cepa S. cerevisiae recupera o seqüestro do cálcio em
cerca de 25%.
Para confirmar o perfil observado com o acúmulo e atividade da bomba
responsável pelo sequestro de cálcio, as mesmas cepas foram avaliadas quanto ao sinal
intracelular de cálcio em estresse ácido, através de um ensaio de aequorina. Os
resultados representados na figura 11, demonstram, como esperado, que a cepa S.
cerevisiae W303 possui maior nível de cálcio citosólico livre que a cepa S. boulardii,
mesmo na condição controle, e que mesmo depois da exposição em pH 2 a cepa
probiótica permanece com níveis de cálcio citosólico livre ainda menores que W303.
69
Figura 9 – Medida de cálcio celular total, em cepas Saccharomyces crescidas em YPD
4% até D.O.600nm 1,0 e submetidas ao pH 2 por 5, 15, 30 e 60 minutos. S. boulardii
(barras azuis)e S. cerevisiae (barras vermelhas). Não há diferença estatisticamente
significativa entre os tempos 5, 15, 30 e 60 minutos das cepas submetidas ao estresse,
avaliadas pelo teste t de Student (P< 0,05).
0
20
40
60
80
100
120
140
Controle 5 15 30 60
mm
ole
s d
e C
a+
2/K
g d
e m
ass
a s
eca
Tempo (min)
70
Figura 10 – Atividade Ca+-ATPásica das cepas Saccharomyces crescidas em YPD 4%
até D.O.600nm 1,0 e submetidas ao pH 2 por 5, 30 e 60 minutos. S. boulardii (barras
azuis) e S. cerevisiae W303 (barras vermelhas) - teste t de Student (P< 0,05).
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
Controle 5 30 60
Ati
vid
ad
e C
a+
2-A
TP
ási
ca
(nm
ole
s d
e P
i.m
in-1
.mg
de
pro
teín
a -
1)
Tempo (min)
71
Figura 11 – Sinal de cálcio das cepas Saccharomyces crescidas em YPD 4% até
D.O.600nm 1,0 e submetidas ao pH 2 por 30 e 60 minutos. S. boulardii (barras azuis) e S.
cerevisiae W303 (barras vermelhas).
0
100
200
300
400
500
600
700
Controle pH 2 30 pH 2 60
UR
L
72
4.5.2 - Capacidade tamponante das cepas Saccharomyces após estresse ácido
Adicionalmente com o objetivo de verificar a capacidade maior sobrevivência
demonstrada pela cepa S. boulardii, verificamos a capacidade tamponante de células e
do extrato celular quando expostos ao pH 2.
Podemos observar na figura 12 que as células de S. boulardii possuem maior
capacidade tamponante que S. cerevisiae W303, pois notamos um deslocamento para
esquerda da curva de tamponamento da cepa W303, tanto em condições controle,
quanto após 1 hora de exposição ao estresse ácido.
Como esperado, a capacidade tamponante do conteúdo intracelular é
significativamente maior que da levedura intacta. Os dados apresentados sugerem que a
maior resistência observada ao estresse ácido por S. boulardii pode estar vinculada a sua
maior capacidade tamponante do conjunto de componentes intracelulares desta cepa.
73
Figura 12 – Capacidade tamponante das cepas Saccharomyces crescidas em meio YPD
4% até D.O.600nm 1,0 e submetidas ao estresse ácido. Painel A: Capacidade tamponante
das células S.boulardii (•), S. boulardii exposta a pH 2 (○), S. cerevisiae W303 (■) e S.
cerevisiae W303 exposta a pH 2 (□); Painel B: Capacidade tamponante dos extratos
celulares S.boulardii (•), S. boulardii exposta a pH 2 (○), S. cerevisiae W303 (■) e S.
cerevisiae W303 exposta a pH 2 (□).
B A
74
4.5.3 - Análise qualitativa das alterações na composição lipídica de membrana das cepas Saccharomyces submetidas ao estresse ácido
No presente trabalho adaptou-se a Distância Euclidiana para avaliação das
diferentes porcentagens lipídicas da membrana. Desta maneira, Distâncias Euclidianas
foram calculadas entre os resultados obtidos para cada procedimento de amostragem.
Logo, quanto menor a Distância Euclidiana, menor a alteração lipídica da membrana.
Os resultados da composição lipídica da membrana de S. boulardii e
S. cerevisiae W303 podem ser observados na figura 13. Ao longo da exposição das
cepas ao estresse ácido podemos observar que, existem alterações na composição
lipídica da membrana da cepa W303, distanciando-a da composição lipídica original, ou
melhor, na condição controle.
A variação na composição lipídica da membrana em S. boulardii foram menos
drásticas que na cepa W303 em pH 2 (HCl). Entretanto a adição de sódio, ao estresse
ácido, parece ter diminuído os mecanismos que promoveram estas alterações em W303,
sugerindo que ao detectar que o estresse ácido pode levar a perda de viabilidade, esta
cepa promove modificações lipídicas na membrana na tentativa de adaptação nesta
condição.
Em porcentagem, verificamos que alterações lipídicas na membrana da cepa
W303, exposta a pH 2, foi observada em quase todos os ácidos graxos quantificados,
contudo, as principais modificações foram detectadas quanto ao ácido oléico (18:1) que
aumentou a porcentagem de 29,76 para 33,52%, após 30 minutos de exposição em pH
2, ao ácido araquídico (20:0) de 0,34 a 0,32% e também o ácido gadoléico (20:1w9) de
0,54 a 031%.
75
Figura 13 – Dendograma da análise lipídica da membrana plasmática de S. cerevisiae
W303 e S. boulardii. Células crescidas em YPD 4% até fase exponencial e submetidas
ao estresse em pH 2 e acrescidos de 85mM de NaCl.
Distância Euclidiana
76
4.5.4 - Análise quantitativa das reservas energéticas durante a exposição ao
estresse ácido
Nos resultados apresentados na figura 14A podemos notar que S. boulardii
acumula 7 vezes mais trealose do que S. cerevisiae W303 nas condições controle.
Segundo Thevelein, J.M. (1984), as células de leveduras quando se encontram em fase
de crescimento exponencial em glicose, contém baixas concentrações de trealose. Após
30 minutos de exposição ao estresse ácido S.boulardii consegue mobilizar trealose
ocorrendo perda gradual deste carboidrato. Em se tratando da cepa S. cerevisiae W303,
apesar do conteúdo inicial normal de trealose nestas condições (0,5 a 0,85 mg de
trealose/ 100mg de massa seca, segundo Alcarde e Basso, 1997), durante a exposição ao
pH 2 não observamos mobilização deste açúcar reserva. Segundo Soumalainem e Pfaffli
(1961) a maior viabilidade celular em leveduras, envolvidas no processo de panificação,
eram decorrentes do elevado teor de trealose; deste modo, a função do mesmo seria de
proteção às células contra autólise.
Os teores de glicogênio demonstram uma diferença significativa entre o
conteúdo do mesmo em S. boulardii e em S. cerevisiae W303 (Figura 14B). Durante a
exposição ao estresse ácido a cepa probiótica S. boulardii reduziu em 86% o conteúdo
de glicogênio, com a mesma tendência observamos o mutante ena1-4∆, enquanto
S. cerevisiae W303 parece manter os teores de glicogênio em 30 minutos de exposição
em pH baixo, estes dados podem estar relacionados à perda de viabilidade durante o
estresse em S. cerevisiae W303 e consumo de glicogênio pelo aumento do metabolismo
por S. boulardii.
Deste modo, segundo o consumo de glicogênio durante o estresse ácido por
S. boulardii, avaliado neste experimento, sugere a utilização deste açúcar de reserva
para atividade metabólica em defesa ao estresse submetido.
A concentração de ATP (adenosina 5’-trifosfato) foi determinada utilizando um
ensaio de geração de luminescência envolvendo o complexo luciferina-luciferase, capaz
de formar um produto eletronicamente excitado e emitir luz, e a luz da reação é medida
por fluorescência (Roucou e cols., 1999).
77
As células de leveduras são capazes de gerar ATP para preservar funções
celulares fundamentais, tais como: gradientes iônicos, que atravessam as membranas
celulares, controle na geração de sinalização intracelular, síntese de proteínas e
progressão do ciclo celular.
Os resultados apresentados na figura 14C demonstram que S. boulardii consome
o conteúdo de ATP ao longo do estresse ácido, iniciando com níveis de 1720,5 µg de
ATP por grama de células, tendo redução das taxas de ATP em até 98% após 30
minutos em pH 2. Em S. cerevisiae W303 os níveis de ATP são mantidos em torno de
1033,02 µg de ATP por grama de células, mesmo após 30 minutos de exposição. Os
níveis de ATP observados, ao longo da exposição de cepas Saccharomyces ao estresse
ácido, permite sugerir que a indução da H+-ATPase de S. boulardii (figura 8) está
diretamente relacionada com os níveis intracelulares decrescentes de ATP (figura 14C).
Entretanto, não visualizamos o mesmo perfil na cepa S. cerevisiae W303, no qual nos
permite relacionar a não mobilização dos níveis de ATP à perda de atividade metabólica
em se tratando dos parâmetros analisados neste trabalho.
78
Figura 14 – Conteúdo de trealose (A), glicogênio (B) e ATP (C) em cepas
Saccharomyces crescidas em meio YPD 4% até D.O.600nm 1,0 e submetidas ao estresse
ácido pH 2 (símbolos não preenchidos) e pH 2 + 85 mM de NaCl ( símbolos
preenchidos) durante 30 e 60 minutos. S. boulardii (□, ■), S. cerevisiae W303 (∆, ▲) e
o mutante ena1-4∆(○,•).
A
B
C
79
Discussão
80
5 - Discussão A sobrevivência de microrganismos probióticos é dependente da sua habilidade
de resistir à passagem do trato digestivo. Neste contexto, tolerância ao pH baixo e sais
biliares têm sido utilizados como critérios de seleção de microrganismos com potencial
probiótico (Ouwehand, A.C. e cols., 1999).
O fluido gástrico tem grande importância como primeira defesa contra
patógenos entéricos, e pesquisas simulando este fluido têm sido bem documentadas
(Smith, J. L., 2003; Tamplin, M. I., 2005). O estômago destaca-se por ter um papel
fundamental não só na digestão parcial dos alimentos, mas também na inativação e
morte de agentes patogênicos presentes nos alimentos antes da sua entrada no trato
gastrointestinal (Smith, J. L., 2003).
Estudos preliminares de tolerância a simulação de ambientes gástrico,
pancreático e intestinal, mostraram uma resistência maior de S. boulardii, comparado a
S. cerevisiae W303 (Fietto, J. L. R. e cols., 2004). Neste trabalho, ao avaliarmos a
tolerância de S. boulardii ao ambiente gástrico simulado (solução aquosa contendo
85mM de NaCl, 3g/L de pepsina e pH 2), em comparação com S. cerevisiae W303
(uma linhagem de laboratório) e com outras linhagens S. cerevisiae UFMG 20 e UFMG
24, depois de 1 hora de exposição ao estresse, S. boulardii apresentou maior tolerância
em relação as demais cepas estudadas, representando uma característica primordial a ser
analisada em uma cepa potencialmente probiótica.
Os efeitos dos diferentes componentes do meio gástrico simulado foram
investigados com o objetivo de esclarecer o envolvimento dos mesmos na perda de
viabilidade das células. Nós observamos que a exposição a NaCl e a pepsina,
separadamente, não são capazes de afetar significativamente a viabilidade celular. Por
outro lado, identificamos que o principal componente gástrico responsável pela
diminuição drástica da viabilidade, foi o pH ácido (pH 2), e que a adição de NaCl nesta
condição restabeleceu a resistência observada anteriormente em estresse gástrico
simulado. A resistência a baixo pH demonstrada pela cepa S. boulardii , consiste em um
importante fator para a seleção de microrganismos a serem utilizados como probióticos.
Nossos resultados estão de acordo com outros trabalhos que já comprovaram que a cepa
81
S. boulardii é altamente resistente ao ambiente ácido (Fietto, J. L. R. e cols., 2004; Van
Der AA Kuhle, A. e cols., 2005; Edwards-Ingram, L. e cols., 2007).
Após identificarmos o efeito protetor da adição de NaCl quanto a viabilidade em
pH 2, resolvemos investigar a especificidade do NaCl, nesta condição, com adição de
diferentes íons conjugados do mesmo ânion (cloreto). Os diferentes íons analisados
promoveram efeito protetor tanto em S. boulardii quanto em S. cerevisiae W303.
Observamos que na cepa S.boulardii o efeito protetor do sódio foi mais evidente que os
íons cálcio, potássio e magnésio, entretanto apenas o íon lítio não apresentou uma
proteção proeminente, provavelmente nas concentrações que utilizamos este íon pode
ter apresentado uma toxicidade maior do que o efeito protetor. Em contrapartida na cepa
W303 o efeito protetor foi mais intensa com a adição do íon cálcio em pH 2, e isto, nos
permite sugerir, que seria importante a investigação da homeostase do cálcio, em
relação a cepa W303, nestas condições.
Considerando que o ensaio foi realizado a 37°C (temperatura corporal), e que
dados na literatura demonstram que em S. cerevisiae sob pequenas elevações de
temperatura de incubação pode gerar alterações no perfil de proteínas (Miller e cols.,
1979), nós resolvemos investigar o perfil da síntese protéica neste contexto. A resposta
ao estresse não resulta somente no reparo de possíveis danos, mas também leva à
aquisição de tolerância ao estresse que o gerou e, muitas vezes a outros tipos de
estresses (Lewis, J. G. e cols., 1995).
A cicloheximida foi utilizada no trabalho de Ludovico, P. e cols., (2001), para
determinar o envolvimento de processos de apoptose em células de S. cerevisiae
expostas em ácido acético (pH ∼ 2), no qual demonstraram que a morte induzida por
concentrações mais baixas de ácido acético (20-80 mM) foi parcialmente inibida por
cicloheximida, evidenciando que nestas concentrações foi possível detectar diferentes
alterações típicas de apoptose.
A adição de cicloheximida no ensaio de pH 2 acrescido de sódio resultou em
uma diminuição da resistência apresentada por S. boulardii, sugerindo um papel, ainda
que parcial, de síntese protéica na resposta ao estresse, e descartando, de fato, processos
apoptóticos nestas condições. Diante do fato de que avaliamos viabilidade celular, a
82
utilização de uma droga como a cicloheximida não é ideal para ensaios de resistência,
sugerimos então, que o perfil protéico seja melhor investigado, para permitir identificar
os alvos protéicos envolvidos no fenômeno de resistência/susceptibilidade.
O modo de ação para que se estabeleça o efeito positivo dos íons, deve envolver
a homeostase iônica. Em leveduras, a manutenção da homeostase de Na+ e K+ é
dependente de sistemas transportadores responsáveis pelo influxo e efluxo de sais, tais
como a bomba exportadora de sódio Ena1p (Benito B. e cols., 1997), permutadores de
Na+/H+ Nha1p localizado na membrana plasmática, Nhx1p permutador prevacuolar
(Nass, R. e cols., 1998) e Vnx1p descrito como transportador presente na membrana do
vacúolo responsável pela homeostase de íons Na+ e K+ e regulação do pH vacuolar
(Cagnac, O. e cols., 2007). Além da captação de Na+ e K+ pelos transportadores Trk1p e
Trk2p (Ko, C. H. e Gaber, R.F., 1991) existem outros canais menos específicos como o
Nsc1p, ainda não identificado geneticamente (Bihler, H. e cols., 2002).
Neste trabalho, investigamos a relação da homeostase de sódio com o efeito
protetor do mesmo observado nas células submetidas ao pH 2, utilizando cepas com
deleções em genes que codificam para proteínas envolvidas no sistema de regulação
deste íon. Nossos resultados evidenciam um maior aumento da viabilidade celular do
mutante ena1-4∆ submetido ao estresse ácido na presença do íon sódio, quando
comparado à cepa selvagem. Este fenótipo é semelhante ao fenótipo observado para a
cepa S. boulardii que apresentou maior resistência a pH ácido na presença de NaCl.
Este dado sugere que a baixa extrusão de sódio por Ena1-4p seja um fator importante na
resposta ao estresse ácido. A atividade e aumento de expressão de ENA1-4 têm sido
descrito na literatura em resposta ao estresse alcalino e altas concentrações de sais
(Nelson e Nelson, 1990; Haro e cols.,1991; Marquez e Serrano, R., 1996), visto que os
principais participantes da ativação deste gene compreendem, as vias de sinalização da
calcineuria, Rim101 e Snf1 (Platara e cols., 2006). Não há relatos na literatura do
envolvimento da proteína Ena1-4p em estresse ácido.
De acordo com esses resultados iniciais, determinamos a expressão do gene
ENA1-4 em S. boulardii, que apresentou níveis muito baixos deste transcrito, quando
comparada a cepa S. cerevisiae W303, mesmo nas condições controle dos ensaios S.
83
boulardii possui expressão quase nulas do gene ENA1-4, e após a exposição em pH 2
mais NaCl a transcrição deste gene foi consideravelmente reduzida em ambas as cepas
avaliadas, reforçando a hipótese de uma relação inversa entre expressão/atividade dos
genes ENA e resistência ao estresse ácido na presença de sódio. Os dados de expressão
por RT-PCR explicam também a semelhança do fenótipo observado entre S. boulardii e
o mutante ena1-4∆ sob condições de estresse ácido e adição de baixas concentrações de
sódio, presumindo um envolvimento da diminuição do efluxo de sódio para aumento da
viabilidade.
A participação de ATPases do tipo P em geral foi testada pela adição do
vanadato ao estresse ácido. Este inibidor não afetou de forma significativa a viabilidade
celular do mutante ena1-4∆ submetido ao estresse (acídico + NaCl 85 mM), mas
aumentou significativamente a viabilidade da cepa selvagem, provavelmente pela
inibição de Ena1-4p. Surpreendentemente, o vanadato exerceu um efeito contrário em S.
boulardii. Sugerimos então um possível envolvimento de outras ATPases do tipo P na
resposta, pois como demonstrado a expressão de ENA1 em S. boulardii é muito baixa.
Quando a levedura enfrenta condições de baixo pH as células necessitam do
sistema de efluxo de prótons H+. Geneticamente bem caracterizadas, as H+-ATPases de
S. cerevisiae e de Schizosacharomyces pombe são codificadas pelo gene PMA1
(Serrano, R. e cols., 1986). Sabe-se também que Pma1p gera um gradiente
eletroquímico de prótons capaz de impulsionar transportes secundários, contribuindo
para regulação do pH intracelular e por conseqüência a viabilidade.
Desta forma, o perfil de ativação da H+-ATPase nas cepas S. boulardii e
ena1-4∆ demonstrou uma contribuição positiva na proteção contra o estresse ácido
submetido, em relação a S. cerevisiae W303. Os resultados obtidos sugerem um
envolvimento na regulação negativa por Ena1-4p na ativação da H+-ATPase de
membrana plasmática sob estresse ácido adicionado de sódio.
Após as evidências de que as cepas S. boulardii e o mutante ena1-4∆ são
capazes de responder ao estresse ácido através da ativação da H+-ATPase
diferentemente de S. cerevisiae W303, decidimos verificar o pH interno das cepas
nestas condições.
84
A redução da viabilidade das células de leveduras em pH baixo, mesmo na
presença de 85mM de NaCl, pode estar relacionada ao pH intracelular (Sychrova e
cols., 1999; Kinclova-Zimmermannova, O. e cols., 2006). Nestas condições S.
boulardii, a cepa selvagem W303 e ena1-4∆ não apresentaram diferenças significativas
de pH intracelular após exposição ao pH 2 e NaCl. Estes dados permitem-nos sugerir
que provavelmente em pH ácido não há influxo indiscriminado de prótons em células
submetidas ao estresse, e que apesar dos resultados de ativação da H+-ATPase terem
sido maiores em resposta ao estresse por S. boulardii, não visualizamos nenhuma
correlação entre atividade e variações no pH interno da cepa probiótica e de S.
cerevisiae W303.
No trabalho de Malakar, D. e cols., (2006) observaram um aumento da atividade
H+-ATPásica, depois de 2 horas de exposição de S. cerevisiae, a 10 mM de HCl (pH 2)
e uma subseqüente queda dessa atividade a níveis basais após estas duas horas, e que
apesar da adição de S-adenosil-L-metionina (AdoMet), para proteção em estresse ácido,
ter diminuído a redução do pH interno, o perfil de atividade H+-ATPásica foi o mesmo
observado anteriormente.
Neste contexto, nosso próximo passo foi relacionar a ativação da H+-ATPase
observada na cepa S. boulardii e no mutante ena1-4∆ com o potencial de membrana e a
conseqüente despolarização da membrana sob estresse ácido. A membrana de S.
boulardii e do mutante ena1-4∆ são hiperpolarizadas em comparação a S. cerevisiae
W303 e com a exposição ao pH 2 observamos uma despolarização da membrana
plasmática em todas as cepas analisadas. Entretanto, demonstramos também que a
adição de sódio ao meio ácido retarda consideravelmente esta despolarização sofrida em
conseqüência da exposição ao pH 2.
Estes resultados corroboram com o efeito protetor da adição de sódio em
estresse ácido em relação aos dados de viabilidade apresentadas anteriormente e, por
outro lado, sugerimos que o potencial de membrana plasmática mais negativo
apresentados por S. boulardii deve estar relacionado à maior resistência da cepa
probiótica ao ambiente ácido (pH 2).
85
Observamos que mesmo após 1 hora de exposição em pH 2 a cepa S. boulardii
apresentou viabilidade maior que as outras cepas Saccharomyces avaliadas que não
corresponde ao efeito protetor de íons. Estes dados sugerem mecanismos de resposta ao
estresse ácido em S. boulardii que atuam de maneira independente da proteção de íons e
que não são identificadas nas cepas S. cerevisiae analisadas.
Com o intuito de esclarecer os mecanismos que envolvem esta resposta
observada na cepa S. boulardii em pH 2, inicialmente avaliamos a homeostase do íon
cálcio nestas condições. Os sistemas de transporte que retiram Ca+2 do citoplasma estão
presentes em todas as células sendo responsáveis pela manutenção da concentração de
cálcio citoplasmático em nível fisiológico (Cunningham e Fink, 1994; Clapham, 1995;
Sanders, D. e cols., 1999). Acredita-se que esses mecanismos responsáveis pela
homeostase tornaram-se ideais para subseqüente evolução de vias de sinalização,
baseados na elevação transitória da concentração de cálcio citosólico.
O aumento da concentração interna de cálcio pode ocorrer em resposta a
diferentes sinais (Sanders, D. e cols., 2002) afetando diversos processos celulares que
incluem a regulação da expressão gênica, progressão do ciclo celular, processamento e
síntese de proteínas, apoptose, o transporte nuclear e a segregação de cromossomos
(Rudolph,H. K. e cols, 1989; Iida, H. e cols., 1990; Yoshida, T. e cols., 1994;
Okorokov, A. L. e Lehle, L., 1998; Durr, G. e cols., 1998; Carrion e cols., 1999;
Corbertt e Michalak, 2000).
Os nossos resultados envolvendo a homeostase de cálcio em estresse ácido,
demonstram que a cepa S. cerevisiae W303 apresenta níveis de íons cálcio e atividade
Ca+2-ATPásica consideravelmente mais elevados que S. boulardii, e que após exposição
em estresse ácido a levedura W303 diminui a atividade da Ca+2 –ATPase vacuolar
drasticamente, perdendo cálcio do vacúolo, promovendo assim, elevações absurdas de
cálcio citosólico livre; estes fatos não são observados na cepa S. boulardii, sugerindo
que apesar da exposição ao pH 2, esta não é afetada, quando se tratando de aumento dos
níveis de cálcio citosólico livre.
Sabemos que as proteínas funcionam como ácidos e bases orgânicas
tamponando o citoplasma (Nelson e Lox, 2004). Subseqüentemente determinamos que a
86
cepa S. boulardii tem maior capacidade tamponante que S. cerevisiae W303 sob
estresse ácido, tanto da célula íntegra quanto do extrato celular, representando mais um
fator para demonstrar a maior resistência de S.boulardii frente ao estresse ácido.
Outros parâmetros foram avaliados para esclarecer os efeitos do pH ácido no
metabolismo de S. cerevisiae W303 e S. boulardii. Dentre eles, fizemos uma análise das
alterações na composição lipídica da membrana durante a exposição ao estresse ácido e
também com adição de NaCl.
As características dinâmicas e estruturais da membrana podem mudar pelas
alterações das condições ambientais, ou seja, mudança na composição molecular da
membrana ou pela adição de moléculas estranhas que interagem com os constituintes da
membrana. Isso explica porque mudanças na fluidez da membrana são observadas em
resposta a muitos estresses ambientais, e porque as células mantêm um ótimo nível de
fluidez dentro da matriz lipídica (Beney, L. e Gervais, P. , 2001).
Através da análise qualitativa das alterações lipídicas da membrana podemos
observar que a cepa S. cerevisiae W303 numa tentativa de melhor adaptação a condição
de estresse ácido na qual foi submetida, alterou consideravelmente a composição
lipídica da membrana plasmática, entretanto tais modificações não foram identificadas
na cepa S. boulardii, provavelmente devido ao fato de que esta cepa não apresenta tanta
sensibilidade ao estresse ácido que desencadeie estas alterações. Com a adição de sal,
observamos que a cepa W303 apresenta uma reversão do fenótipo detectado em estresse
ácido, sugerindo que os efeitos deletérios do estresse ácido foram amenizados com
NaCl.
Outro aspecto importante avaliado foi quanto aos níveis de reservas energéticas
das cepas durante a exposição ao estresse ácido. O conteúdo dessas reservas pode
esclarecer os mecanismos de defesa e perfil metabólito dessas cepas durante o estresse
ácido. Originalmente, a trealose, juntamente com o glicogênio era considerada
substância de reserva energética para levedura, porém, recentemente, vários autores
sugerem que a trealose possua função de proteção para a célula de levedura durante
processos de estresse, tais como altas temperaturas, choque osmótico, efeitos tóxicos do
etanol e desidratação, ficando o glicogênio como o principal carboidrato de reserva em
87
leveduras (Majara, M. e cols., 1996; Sano, F. e cols., 1999; Lodato, P. e cols., 1999;
Cerrutti, P. e cols., 2000; François, J. e Parrou, J. L., J. L., 2001; Elbein, A. D. e cols.,
2003).
A capacidade da trealose em proteger estruturas celulares da desestabilização
causada por situações de estresse ou por agentes desnaturantes está bem documentada
na literatura, onde vários estudos mostram proteção in vitro bem como in vivo de
membranas e proteínas. Ratificando que de fato, o acúmulo de trealose tem sido
relacionado com a capacidade de leveduras de tolerar condições ambientais adversas
(Majara, M. e cols., 1996; Sano, F. e cols., 1999; Lodato, P. e cols., 1999; Cerrutti, P. e
cols., 2000; François, J. e Parrou, J. L., J. L., 2001; Elbein, A. D. e cols., 2003). As
propriedades vítreas das soluções de trealose, somadas à habilidade deste açúcar em
formar ligações de hidrogênio com radicais das superfícies de biomoléculas são
características fundamentais que determinam seu efeito protetor pronunciado (Sano, F. e
cols., 1999; Anchordoquy, T. J. e cols., 2001). Por outro lado, em S. cerevisiae a
trealose é um importante carboidrato de reserva e representa cerca de 20 % do peso seco
da célula, dependendo das condições de cultivo e do estágio de vida. Foi também
sugerido que o metabolismo respiratório confere às leveduras maior tolerância ao
estresse, pois durante a respiração mais trealose pode ser sintetizada do que durante o
metabolismo fermentativo (François, J. e Parrou, J. L., J. L., 2001).
Os resultados deste trabalho permitem constatar que a capacidade de S. boulardii
para acumular muito mais trealose do que as cepas S. cerevisiae W303 e o mutante
ena1-4∆, mesmo em fase exponencial de crescimento, podem atribuir maior resistência
da cepa probiótica para enfrentar o estresse ácido avaliado, e que este mecanismo de
defesa é independente da viabilidade atribuída pelo efeito protetor de íons. Lillie e
Pringle (1980) associaram a sobrevivência de células de levedura, por períodos
prolongados de tempo, principalmente ao nível de trealose. Por outro lado os níveis de
glicogênio também seguem o mesmo perfil, nas mesmas condições. Interessantemente,
constatamos uma relação da proteína Ena1-4p com a capacidade de acúmulo deste
açúcar reserva, pois a deleção deste gene inverteu o fenótipo observado para acúmulo de
glicogênio na cepa selvagem W303.
88
Ainda no que diz respeito às análises de reservas energéticas, notamos que
quanto ao dispêndio de ATP, a cepa S. boulardii foi mais eficiente na utilização das
reservas e também na mobilização ao longo da exposição ao estresse, sugerindo que
pelo fato da cepa probiótica possuir maior resistência durante o estresse ácido,
comparativamente as outras cepas S. cerevisiae avaliadas, o perfil observado descreve o
metabolismo normal de S. boulardii ainda que em condições de estresse, em
contrapartida, devido à perda de viabilidade, notamos uma paralisação do metabolismo
durante a exposição pela cepa S. cerevisiae W303.
Estes resultados permitem-nos sugerir que a cepa S. cerevisiae é afetada
drasticamente pelo estresse ácido e que de alguma forma, ainda não esclarecida S.
boulardii possui mecanismos de defesa significativamente mais eficientes que as cepas
Saccharomyces analisadas. Dentre os efeitos de ácido clorídrico em leveduras, no
trabalho de Malakar, D., e cols., (2008) demonstraram que as células de leveduras S.
cerevisiae quando submetidas ao ácido clorídrico pH 2, apresentam características de
apoptose, incluindo condensação da cromatina, exposição da fosfatidilserina do lado
externo da membrana citoplasmática, e fragmentação do DNA. Também fazem parte
dos efeitos desencadeados pelo ácido em S. cerevisiae, o aumento dos níveis
intracelulares de espécies reativas de oxigênio (ROS), com conseqüente elevação do
nível de peroxidação lipídica, e por fim culminando na perda de potencial de membrana
mitocondrial.
Unindo todos os nossos resultados demonstram que a resistência da levedura em
meio ácido é otimizada pela presença em baixas concentrações de íons no meio. Neste
trabalho correlacionamos o efeito protetor de íons em pH ácido e a manutenção do
potencial de membrana plasmática. A verdadeira natureza do processo não foi
completamente elucidada, embora seja plausível que a homeostase iônica provoque um
efeito indireto na sinalização celular, capaz de desencadear respostas específicas quando
em estresse ácido.
Além disso, também evidenciamos as diferenças metabólicas de S. boulardii e S.
cerevisiae W303 que explicam a maior resistência dessa cepa probiótica ao pH ácido,
89
através de características que demonstram menor discrepância nas respostas em estresse
ácido.
90
Conclusões
91
6 - Conclusões
O âmbito deste trabalho incidiu no estudo de alguns aspectos relacionados ao
estresse ácido (pH 2/HCl), em cepas Saccharomyces, e a proteção da adição de sódio
neste contexto. Dentre as conclusões, destacam-se os seguintes aspectos:
� A análise comparativa da resposta das diferentes cepas Saccharomyces
cerevisiae ao ambiente gástrico simulado, sugere que S. boulardii é mais
resistente a este estresse avaliado.
� Com relação ao estresse gástrico, notamos que o pH ácido é o principal
componente envolvido na perda de viabilidade celular.
� A cepa probiótica S. boulardii exibe maior tolerância ao estresse ácido em
relação às outras cepas analisadas.
� Íons, de modo geral, conferem um papel protetor com relação ao estresse ácido
em leveduras.
� A presença de íons sódio, em baixas concentrações, confere proteção a células
de leveduras. Sugerindo o envolvimento direto ou indireto da homeostase deste
íon na resposta ao estresse ácido.
� A cepa S. boulardii possui um mecanismo protetor em pH ácido que independe
do efeito protetor de íons.
� A resposta positiva que envolve homeostase iônica e baixos níveis de expressão
e/ou atividade de Ena1-4p está diretamente correlacionado ao efeito protetor.
92
� O efeito protetor de íons sódio é parcialmente dependente de síntese protéica
(efeito de cicloheximida) e da atividade de ATPases do tipo P (efeito do
vanadato).
� Os sistemas envolvidos na manutenção do potencial de membrana, atividade H+-
ATPase e homeostase de íons, estão relacionados à resposta ao estresse ácido.
� A manutenção do potencial de membrana plasmática estabelecido pela presença
de NaCl é o principal mediador da proteção contra acidez.
� S. boulardii apresenta menores concentrações de cálcio citosólico livre quando
submetida a pH ácido se comparada à cepa S. cerevisiae.
� A cepa S. boulardii apresentou maiores níveis de trealose, possibilitando maior
resistência da mesma em estresse ácido.
� Verificamos alterações na composição lipídica da membrana por S. cerevisiae
W303 quando submetida ao estresse ácido, sugerindo que estas mudanças são
feitas como tentativa de adaptação nesta condição.
� As respostas verificadas quanto à exposição a estresse ácido por S. boulardii
apresentaram-se normais, evidenciando que esta cepa é menos afetada
metabolicamente que S. cerevisiae W303, principalmente tratando-se de
consumo das reservas energéticas.
93
Perspectivas
94
7 - Perspectivas
� Experimentos de micro arranjos de DNA usando sondas preparadas com mRNA
obtido de experimentos controle, de células expostas a pH ácido (pH 2) e pH
ácido + NaCl 85mM facilitariam a identificação de genes alvos envolvidos na
resistência.
� Com relação a resistência ao ácido clorídrico, detectar se durante a exposição
ocorre alterações estruturais típicas de apoptose nomeadamente: i) condensação
extensiva de cromatina na periferia do invólucro nuclear observada por
microscopia eletrônica de transmissão; ii) exposição de fosfatidilserina na
superfície da membrana citoplasmática avaliada por reação com anexina V
conjugada com FITC; e iii) ocorrência de quebras de DNA avaliada por
TUNEL.
� Através de técnicas de citometria de fluxo, analisar a produção de espécie
reativas de oxigênio (ROS) com adição do fluorocromo dihidroetidium (DHE)
durante o estresse ácido, e subseqüente análise do potencial de membrana
mitocondrial nestas mesmas condições.
� Análise da ocorrência de peroxidação lipídica durante a exposição ao estresse
ácido.
� Análise dos componentes da parede celular de S. boulardii e as modificações
ocorridas durante a exposição.
95
Referências Bibliográficas
96
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![Phenotypic selection of a wild Saccharomyces cerevisiae ... · S. cerevisiae [8]. Lignocellulosic biomass typically contains 15-35% of hemicellulose, which is primarily composed of](https://img.document.onl/doc/110x75/5f7f4adf354ea4757e21212f/phenotypic-selection-of-a-wild-saccharomyces-cerevisiae-s-cerevisiae-8-lignocellulosic.jpg)
