RESUMO LEHNINGER (4ed.) PROTEINAS E AMINOCIDOS PROVA II QUMICA BIOLGICA 4 DE NOVEMBRO DE 2011 CAPITULO 3 AMINOCIDOS, PEPTDIOS E PROTENAS As protenas so as macromolculas biolgicas mais abundantes que ocorrem em todas as clulas e em todas as partes das clulas. Tambm ocorrem em grande variedade e exibem uma enorme diversidade de funes biolgicas, alm de serem os produtos finais mais importantes. So tambm os instrumentos moleculares por meio dos quais a informao gentica expressa. Subunidades monomricas relativamente simples fornecem a chave para a estrutura de milhares de protenas diferentes. Tais unidades se resumem a 20 aminocidos que se ligam de maneira covalente em seqncias lineares caractersticas. Podem atuar como enzimas, hormnios, anticorpos, transportadores, fibras musculares, protena do cristalino do olho, penas, teia de aranha, chifre de rinoceronte, protenas do leite, antibiticos, venenos de cogumelos, etc. AMINOCIDOS As protenas so polmeros de aminocidos, com cada resduo de aminocido (perda dos elementos da gua quando um aminocido unido a outro) unido ao seu vizinho por um tipo especfico de ligao covalente. As protenas podem ser degradadas (hidrolisadas) aos seus aminocidos constituintes atravs de diversos mtodos. O nome protenas dado com base na fonte em que foi primeiramente isolado e em suas caractersticas, como asparagina (primeiramente encontrada no aspargo) e glicina (grego glykos que significa doce). Os aminocidos compartilham caractersticas estruturais comuns Todos os aminocidos comuns so -aminocidos. Eles possuem um grupo carboxila e um grupo amino ligados ao mesmo tomo de carbono (carbono ). E diferem um dos outros nas suas cadeias laterais (grupos R), que variam em estrutura, tamanho e carga eltrica e que influenciam a solubilidade dos aminocidos em gua. Alm destes, existem tambm aminocidos menos comuns que podem ser resduos de protenas j sintetizadas ou estarem presentes em organismos vivos, mas no como constituintes de protenas. O carbono quiral devido ao arranjo tetradrico dos orbitais de ligao em volta do tomo de carbono , os quatro grupos distintos podem ocupar dois arranjos espaciais nicos e, portanto, so ismeros. Tais formas representam enantimeros e so opticamente ativas, isto rodam o plano da luz polarizada. Devido a isso, desenvolveu-se uma nomenclatura para especificar a configurao absoluta dos quatro constituintes do carbono quiral. Tal configurao especificada pelo sistema D,L desenvolvido por Fischer em 1891. Para isso, foi analisada a rotao da luz, o que levou nomenclatura, de L-aminocidos e D- aminocidos.

Os resduos de

aminocidos nas protenas so L estereoismeros

Os resduos de aminocidos nas molculas proticas so exclusivamente L estereoismeros. Os resduos D-aminocidos so encontrados geralmente em poucos peptidios, incluindo alguns peptdios das paredes celulares bacterianas e antibiticos. Os aminocidos podem ser classificados pelo grupo R Os aminocidos so agrupados em 5 classes principais baseadas nas propriedades de seus grupamentos R, principalmente a polaridade ou tendncia de interagir com gua em pH biolgico (pH prximo de 7,0). Tais classes so: 1) Grupos R alifticos e no polares: os grupos R so no polares e hidrofbicos; as cadeias laterais da alanina, valina, leucina e isoleucina tendem a se agrupar dentro das protenas, estabilizando as estruturas proticas por meio de interaes hidrofbicas; a glicina no apresenta contribuo real nas interaes hidrofbicas por apresentar cadeia lateral muito pequena e ser muito simples; a metionina contm enxofre (grupo tioter) em sua cadeia lateral; e a prolina apresenta uma cadeia lateral aliftica com grupo amino secundrio (imino) que reduz a flexibilidade das regies polipeptdicas em que se encontra e confere rigidez molecula. 2) Grupo R aromtico: so hidrofbicos e relativamente no polares; a tirosina apresenta um grupo hidroxila que pode formar pontes de hidrognio; o triptofano apresenta nitrognio em seu anel indlico; e a fenilalanina a menos polar entre os trs; alm disso absorvem luz ultravioleta (fenilalanina com maior intensidade) 3) Grupo R no carregados e polares: so mais solveis em guas (mais hidroflicos) pois apresentam grupos funcionais que formam pontes de hidrognio com a gua; serina e treonina tm sua polaridade oferecida pelo grupo hidroxila, cistena pelo grupo sulfidrila e asparagina e glutamina pelo grupo amida; asparagina e glutamina so amida de dois outros aminocidos encontrado em protenas, o aspartato e o glutamato; a cistena pode ser oxidada para formar cistina (duas molculas ou resduos de cistenas unidas por ponte dissulfeto, fortemente hidrofbica e no polar). 4) Grupo R positivamente carregados (bsico): incluem lisina (segundo grupo amino primrio), arginina (grupo guanidino carregado positivamente) e histidina (grupo imidazol, cadeia lateral ionizvel com pKa prximo da neutralidade, facilita a reao funcionando com doador ou receptor de prton) 5) Grupo R negativamente carregados (acdico): incluem aspartato e glutamato (segundo grupo carboxila)

Aminocidos incomuns tambm possuem funes importantes So modificados de resduos j incorporados dentro de um polipeptdio. Destacam-se o 4hidroxiplrolina (derivado da prolina e encontrado na parede celular de plantas e no colgeno) e o 5-hidroxilisina (colgeno), alm do 6-N-metil-lisina (constituinte da miosina), do Kcarboxiglutamato (protrombina e outras proteinas que ligam Ca2+ ), da desmosina (quatro resdos de lisina, constituinte da elastina) e da selenocistena (contm selnio ao invs de enxofre da cistena, derivada da serina). Podem ser tambm encontrados nas clulas como mas no constituindo protenas, tais como a ornitina e a citrulina que so metablitos na biossnte de da arginina e no ciclo da uria. Os aminocidos podem atuar como cidos e bases Quando dissolvido em gua, existe em soluo como um on dipolar (zwitterion) que pode atuar tanto como cido (doador de prton) quanto como base (receptor de prton). So substncias anfotricas.

Um -aminocido simples monocarboxilico e monoamino um cido diprtico quando totalmente protonado, pois possui dois grupos (-COOH e NH3+ que produzem prtons. Os aminocidos possuem curvas de titulao caractersticas A titulao cido-base envolve a adico ou remoo gradual de prtons. Como observado no exemplo da glicina, o diagrama possui dois estgios diferentes que correspondem desprotonizao de dois grupos diferentes da glicina. Em pH muito baixo a glicina totalmente protonada, na primeira etapa da titulao, o grupo carboxila perde seu prton e as concentraes das espcies doadoras e receptoras de prton so equimolares. No ponto mdio da titulao, observa-se um ponto de inflexo, neste o pH igual ao pKa do grupo protonado. Seguindo-se a titulao observa-se outro ponto de inflexo em que o primeiro prton foi totalmente retirado e teve inicio a remoo do segundo prton. Este, por sua vez, removido do grupo amino. Pode-se concluir, portanto, que o pKa de qualquer grupo funcional grandemente afetado pelo seu ambiente qumico e que um aminocido possuim duas regies tamponantes.

As curvas de titulao predizem as cargas eltricas dos aminocidos No ponto de inflexo entre os dois estgios em sua curva de titulao, observa-se uma formal totalmente ionizada, mas sem nenhuma carga eltrica lquida, ou seja, zero. O pH nessa regio o pH isoeltrico (pI), o qual calculado por: . Como se pode observar no exemplo da glicina, esta possui carga negativa liquida em qualquer pH acima do seu pI e se movimentar para o nodo (eletrodo +) e em qualquer pH abaixo de seu pI sua carga lquida ser positiva e se movimentar para o ctodo (eletrodo -), assim, quanto mais distante estiver o pH do pI, maior a carga eltrica lquida da populao de molculas de glicina.

Os aminocidos diferem nas suas propriedades cido-base Todos os aminocidos com apenas um grupo -amino e um grupo carboxila e um grupo R que no se ioniza apresentam curvas de titulao semelhante a da glicina. Entretanto, quando o grupo R ionizvel, apresenta 3 estgios de titulao.

PEPTDIOS E PROTENAS Peptdios so polmeros de aminocidos que variam em tamanho de pequenos a muito grandes, consistindo de dois ou trs at milhares de resduso de aminocidos ligados. Os polipeptdos so cadeias de aminocidos Duas molculas de aminocidos podem estar de forma covalentemente unidas por meio de uma ligao amida substituda, chamada de ligao peptdica, para produzir um dipeptdio. Tal ligao formada pela remoo de elementos da gua (desidratao)de um grupo -carboxila e o grupo -amino de outro. Dessa forma, o grupo carboxila quimicamente modificado ou ativado de forma que o grupo hidroxila seja facilmente eliminado. Assim, trs aminocidos podem se unir atravs de duas ligaes peptdicas e formar um tripeptdio, quatro aminocidos formam um tetrapetdio, cinco um pentapeptdio e assim em diante. Quando poucos aminocidos so unidos em cadeia forma-se um oligopeptdio, j quando muitos so unidos, forma-se um polipeptdio. Sabe-se que a unidade de aminocido em um peptdio denominada resduo, baseado nisso, o resduo de aminocido na extremidade com o grupo amino o resduo terminal amino (N-terminal) e o resduo da outra exrremidade, que apresenta um grupo carboxila livre o resduo terminal carboxila (C-terminal). Os aminocidos podem ser distinguidos pelo seu comportamento de ionizao

Os peptdios contem apenas um grupo -amino e um grupo -carboxila livres, nas extremidades opostas da cadeia. Eles se ionizam, como nos aminocidos livres, mas com diferentes constantes de ionizao pois um grupo carregado nas extremidades no est mais ligado ao carbono . Os grupos -amino e -carboxila de todos os aminocidos no terminais esto ligados de maneira covalente nas ligaes peptdicas, que no se ionizam e, portanto no contribuem para o comporatmento cido-base total dos peptdos. Entretanto, os grupos R de alguns aminocidos podem se ionizar e dessa forma, contribuem para as propriedades cido-base globais da molcula. Dessa forma, o comportamento cido base de um peptdio pode ser predito a partir dos seus grupos -amino e -carboxila, bem como da natureza e numero dos seus grupos R ionizveis. Do mesmo modo que os aminocidos, os peptdios possuem curvas caractersticas de titulao e um pH isoeltrico (pI). Nesse caso, deve-se enfatizar o valor do pKa para cada grupo R ionizvel, pois estes podem alterar-se muito quando um aminocido se torna um resduo em um peptdio. A pperda de carga dos grupos -amino e -carboxila, as interaes com outros grupos R e outros fatores ambientais podem alterar o valor do pKa. Peptdios e polipeptdos biologicamente ativos ocorrem em uma ampla variedade de tamanhos Algumas protenas consistem de uma cadeia polipeptdica nica, mas outras, chamadas de subunidades mltiplas, possuem dois ou mais polipeptdios associados de forma no covalente. As cadeias polipeptidicas individuais em uma nica protena de subunidades mltiplas podem ser idnticas ou diferentes. Se pelo menos duas so idnticas, a protena dita oligomrica, e as unidades idnticas ( consistindo de uma ou mais cadeias de polipeptdios) so ditas protomeros. Exemplo: HEMOGLOBINA possui 4 subunidades polipeptdicas (duas cadeias idnticas e duas cadeias idnticas, todas as quais mantidas juntas por interaes no covalentes. Cada subunidade pareada de maneira idntica com a subunidade dentro da estrutura dessa protena de subunidades mltiplas, de forma que a hemoglobina pode ser considerada um tetrmero de quatro subunidades polipeptdicas e um dmero dos protomeros . So poucas as protenas que apresentam duas ou mais cadeias unidade de forma covalente. Exemplo: INSULINA - as duas cadeias polipeptdicas da insulina so ligadas por pontes de dissulfeto. Nesse caso, os polipeptdios individuais no so considerados como subunidades, mas so comumente referidos como cadeias. Pode-se calcular o numero de resduos de aminocidos em uma protena simples , sem nenhum outro constituinte qumico, dividindo-se seu peso molecular por 110. Os polipeptdios possuem composies de aminocidos caractersticas A hidrolise de peptidios ou protenas com cidos produz uma mistura de -aminoacidos livres. Quando completamente hidrolisada, cada tipo de protena produz uma proporo ou mistura de diferentes aminocidos.

Em uma protena, os 20 tipos de aminocidos quase nunca ocorrem em quantidades iguais. Alguns, podem aparecer apenas uma vez ou mesmo nem aparecer em determinado tipo de protena, outros podem ocorrer em grandes quantidades. Algumas protenas contm outros grupos qumicos alm dos aminocidos Algumas protenas contem permanentemente associados outros componentes qumicos alem dos aminocidos, tais protenas so denominadas protenas conjugadas e a parte noaminoacido o grupo prosttico. A natureza qumica desse grupo serve como critrio de classificao pra as protenas conjugadas. s vezes podem aparecer mais de um grupo prosttico. Estes, desempenham um papel importante na funo biolgica das protenas. H vrios nveis de estrutura protica Estrutura primria: descrio de todas as ligaes covalentes( principalmente ligaes peptdicas e ligaes dissulfeto) unindo resduos de aminocidos em uma cadeia polipeptdica. O mais importante nesse tipo de estrutura a sequencia de resduos de aminocidos Estrutura secundria: arranjos particularmente estavveis de resduos aminocidos dando origem a padres estruturais recorrentes Estrutura terciaria: descreve todos os aspectos do enovelamento tridimensional de um polipeptdio Estrutura quaternria: a protena apresenta duas ou mais subunidades polipeptdicas

TRABALHANDO COM AS PROTEINAS (ver anexo 1) As protenas podem ser separadas e purificadas Antes que as propriedades e a s atividades de uma proteina possam ser determinadas, essencial uma preparao pura. A primeira etapa em qualquer procedimento de purificao romper as clulas (fonte de protena) e liberar suas protenas em soluo (extrato bruto). Assim que esse extrato for obtido, ele submetido ao fracionamento (separao baseada no tamanho e na carga). Tal procedimento utiliza das diferenas de solubilidades entre as protenas (funo complexa do pH, temperatura, concentrao salina etc). A solubilidade das protenas

geralmente diminuda medida que a concentrao salina aumenta (efeito salting out), com isso algumas protenas iro precipitar enquanto que outras continuaro em soluo. Uma soluo que apresente uma protena de interesse frequentemente deve ser alterada antes que as etapas seguintes da purificao sejam realizadas. Pode-se separar as protenas por exemplo, atravs da dilise (se beneficia do tamanho maior das protenas) que atua como uma peneira. Os melhores mtodos fazem uso das colunas de cromatografia, que se beneficia das diferenas de carga, tamanho, afinidade de ligao e outras propriedades da protena. Nesse mtodo, um material slido poroso com propriedades qumicas apropriadas (fase estacionaria) mantido em coluna, e uma soluo tamponada (fase mvel) passa atravs dele. A soluo contendo a protena, adicionada no topo da coluna, percorre a

matriz solida como uma banda em continua expanso pela fase mvel. Proteinas individuais

migram mais rpido ou mais lentamente atravs da coluna, dependendo de suas propriedades.

As proteinas podem ser separadas e caracterizadas pela eletroforese Essa tcnica consite na migrao de protenas carregadas em um campo eltrico. Permite que as protenas sejam vizualizadas e separadas,

possibilitando a um pesquisador a estimao do numero de diferentes proteinas na mistura ou o grau de pureza de uma preparao proteica particular. Permite tambm determinar o ponto isoeltrico e o peso molecular aproximado da protena. geralmente realizada em gis de poliacrilamida, o qual atua como uma peneira molecular, diminuindo a migrao das proteinas em proporo aproximadamente sua razao carga-massa. A migrao tambm pode ser afetada pela forma da proteina. Tem como fora para mover a macromolcula o potencial eltrico E. A mobilidade eletrofortica da molcula a razo da velocidade da particula da molcula V em relao ao potencial eltrico E. A mobilidade, tambm igual a carga lquida da molcula Z, dividida pelo coeficiente friccional f (reflete em parte a forma da proteina): O mtodo mais empregado de eletroforese utiliza o detergente dodecil sulfato de sdio (SDS). Este se liga maior parte das protenas em quantidades aproximadamente proporcionais ao peso molecular da protena, cerca de uma molcula de SDS para cada dois resduos de aminoacidos. O SDS ligado contribui com uma carga liquida negativa, tornando a carga intrinseca da proteina em razao carga-massa semelhante. Em adio, a conformaao nativa da proteina de uma protena alterada quando o SDS est ligado, e a maioria das proteinas assume uma forma semelhante. Portanto, a eletroforese na presena de SDS separa as proteinas quase exclusivamente na base de uma massa (peso molecular), com os polipeptidios menores migrando mais rapidamente. Se a proteina analisada possuir duas ou mais subunidades diferentes, as subunidades sero geralmente separadas pelo tratamento SDS e uma banda separada aparecer pra cada uma. Outro mtodo a focalizao isoeletrica, este permite determinar o ponto isoeltrico (pI) de uma proteina. Um gradiente de pH foi estabelecido, permitindo que uma mistura de acidos e bases organicos de baixo peso molecular (anfolitos) se distribua em um campo eletrico gerado ao longo do gel. Aplica-se entao uma mistura de poteinas e cada proteina migra ate que alcance o pH que se iguala o seu pI, dessa forma, as proteinas com ponto isoeltricos diferentes so distribuidas diferentemente ao longo do gel.

Combinando-se ambos os processos, tem-se a eletroforese bidimensional que permite a resoluo de misturas complexas de protenas. A eletroforese bidimensional separa proteinas de peso molecular identico que diferenciam no pI, ou proteinas com valores de pI semelhantes e pesos moleculares diferentes. ANEXO 1: TCNICAS DE ANLISE DE PROTENAS Cromatografia A coluna de Cromatografia um dos mtodos mais comuns de purificao de protenas. Esta tcnica consiste na passagem da protena atravs de uma coluna (fase estacionria) que desenhada para reter ou diminuir a velocidade da passagem da fase mvel onde esto as macromolculas (protenas) e a tcnica baseia-se numa propriedade particular, como o tamanho, carga ou afinidade qumica. A soluo a analisar deve conter a protena concentrada e o mtodo deve ser rpido para evitar a degradao da mesma, devendo no entanto, utilizar-se inibidores de proteases. Dependendo da escolha da coluna, as protenas podem ser separadas de acordo com a sua carga (IEX cromatografia de troca inica), sua hidrofobicidade (HIC cromatografia de interaco hidrofbica), seu tamanho (GF filtrao em gel) ou pela sua capacidade de se ligar a grupos qumicos particulares. IEX Cromatografia de troca Inica Baseia-se na carga da protena que estamos a tentar isolar. Se esta possuir carga positiva, a soluo deve passar por uma coluna com carga negativa (impedindo a passagem das protenas com carga positiva). Depois de fazer passar a soluo pela coluna recorre-se ao procedimento salting out para separar a protena, com carga positiva, da coluna com carga negativa (este tipo de

coluna denominado coluna de troca de caties e possui ies de sulfato, imobilizados na fase estacionrio). Para impedir a passagem de uma protena com carga negativa utiliza-se uma coluna de carga positiva designada por coluna de troca de anies que, geralmente, possui ies de amnio. Salting out Esta tcnica usa uma soluo de elevada concentrao de sal que compete com a protena na ligao coluna. Como esta tem maior afinidade para a carga dos sais do que para a das protenas, estas acabam por ser libertadas, mantendo-se os sais ligados coluna. As protenas com fracas interaces inicas sero libertadas com uma concentrao baixa de sal. A adio de sal dever ser feita de uma forma gradual e, no final, para ter a certeza que todas as protenas foram libertadas da coluna, deve ser colocado nesta uma soluo de concentrao de sal de 23mol/L. Para remover os sais da soluo de protenas deve ser feita uma dilise contra tampo. As mudanas no pH alteram a carga das protenas, por isso necessrio conhecer o seu ponto isoeltrico (pH a que a carga da protena 0) e certificar-se de que o pH do sistema est convenientemente ajustado e tamponado. HIC Cromatografia de Interaco hidrofbica O HIC baseia-se nas propriedades hidrofbicas de algumas protenas. As protenas devem ser colocadas na presena de elevada concentrao de sulfato de amnio, o qual aumenta a entropia da gua, aumentando, assim, as interaces hidrofbicas. Este tambm estabiliza as protenas. As pores hidrofbicas da coluna so colocadas com uma matriz de agarose de fenil. Na presena de elevadas concentraes de sal, os grupos de fenil da matriz impedem a passagem de pores das protenas hidrofbicas. Pode-se controlar a separao de diferentes ligaes coluna das protenas, reduzindo a concentrao do sal ou adicionando solventes. GF Cromatografia de filtrao em gel A cromatografia de filtrao em gel separa as protenas com base no seu tamanho. A coluna constituda por uma matriz de pequenas esferas porosas empacotadas. Ao fazer passar a soluo de protenas pela matriz da coluna, as molculas pequenas entram nos poros das esferas demorando a atravess-los, enquanto que as grandes passam entre as esferas sendo separadas primeiro. Outro tipo de coluna o AC (Cromatografia de Afinidade), que um procedimento mais eficiente que os outros, acima citados.

AC Cromatografia de Afinidade A cromatografia de afinidade baseia-se nas funes biolgicas da protena que se liga coluna. O tipo mais comum envolve um ligando (pequena biomolcula especfica por exemplo anticorpo), que imobilizado e ligado a uma matriz da coluna, como a celulose ou poliacrilamida. A protena a analisar passa depois atravs da coluna e liga-se a ela pelo seu ligando, enquanto que outras protenas sero libertadas. A separao da protena alvo normalmente feita, passando atravs da coluna uma soluo que contenha uma elevada concentrao de ligando livre. Isto um mtodo muito eficiente de purificao, uma vez que se baseia numa especificidade biolgica da protena que se pretende analisar, tal como a afinidade de uma enzima a um substrato ou a ligao entre antignio e anticorpo. Contudo, apesar das inmeras vantagens que a cromatografia convencional oferece, esta est limitada pela no homogeneidade nas matrizes (como celulose), que causa uma desigual fluidez do solvente atravs da coluna. Com o objectivo de colmatar esta falha foi desenvolvida uma nova cromatografia, o HPLC (High Performance Liquid Cromatography). Para alm disso tambm permite que as protenas sejam separadas mais rapidamente do que pelos mtodos convencionais e separar molculas com estruturas e tamanhos muito semelhantes. Electroforese A electroforese uma tcnica de separao de molculas que consiste na migrao de molculas com carga, numa soluo, em funo da aplicao de um campo elctrico. A velocidade da migrao depende da fora do campo aplicado, da carga, do tamanho e da forma das molculas e tambm da fora inica, viscosidade e temperatura do meio, onde estas se movem. De um modo geral, no transporte electrofortico, fora do campo ope-se a resistncia do meio, produzindo, quando se igualam, uma velocidade constante das partculas. uma tcnica que pode ser usada para anlise de protenas. As protenas so molculas anfotricas, cuja carga determinada pelo pH do meio onde esto suspensas. Numa soluo com pH acima do ponto isoelctrico, a protena negativamente carregada migra para o nodo do campo elctrico. Abaixo do ponto isoelctrico, a protena positivamente carregada e migra para o ctodo. H diversos tipos de electroforese como: Electroforese livre (frente mvel) Electroforese de zona

Electroforese em papel Electroforese em acetato de celulose Electroforese em gel (SDS-PAGE)

Focagem isoelctrica Electroforese bidimensional

Dentro desta variedade centraremos a nossa ateno no SDS-PAGE. SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polycrylamide Gel Electrophoresis Laemmli, 1970) O objectivo do SDS desnaturar a protena, isto , converter a protena numa estrutura linear (a sua forma nativa , geralmente, globular) e conferir-lhe densidade de carga uniforme, de forma a poderem ser separadas por electroforese, somente, em funo do tamanho (massa molecular). O SDS tem uma alta carga negativa e pH 7 e tem uma cauda hidrofbica que interactua com as cadeias das protenas (polipeptdeos). O nmero de molculas de SDS que se ligam s protenas proporcional ao nmero de aminocidos que constituem as mesmas, pois liga-se na razo de uma molcula por ligao peptdica. Se as protenas desnaturadas so postas num campo elctrico, todas elas se movero para o plo positivo, na mesma proporo, sem possibilidade de avaliar a distncia migrada. Ento, necessrio coloc-las num ambiente que permita que protenas de variados tamanhos se desloquem a velocidades diferentes, sendo o meio adequado o gel de poliacrilamida (polmero de monmeros de acrilamida). De seguida, aplica-se uma corrente elctrica e, como tal, as molculas movem-se ao longo do gel de poliacrilamida (a todo este processo chama-se Electroforese em Gel de Poliacrilamida), migrando mais rapidamente as de menores dimenses. Aps as protenas terem corrido o gel, preciso fix-las, para evitar que difundam quando se procede colorao do mesmo. O cido actico a 25% em H2O um bom fixador, alm de que mantm as protenas desnaturadas. O gel , tipicamente, corado com azul de Coomasie (a fixao e colorao podem ser preparadas na mesma soluo, usando como solvente o metanol ou sais de prata) e depois descorado. Focagem isoelctrica Esta tcnica baseia-se nas diferenas dos pontos isoelctricos das protenas para as separar. As protenas possuem uma carga nativa que pode ser positiva, negativa ou nula dependendo do pH do meio e para cada protena existe um valor de pH do meio para o qual a carga da mesma 0 (pI, ponto isoelctrico), que geralmente se situa entre 3 12. Quando uma protena colocada num tubo estreito de gel de poliacrilamida no qual o gradiente de pH estabelecido pela mistura de solues tampo especiais e sujeita a um campo elctrico ir inicialmente mover-se em direco ao elctrodo com carga oposta. Durante a

migrao atravs do gradiente de pH, a protena ir captar ou perder protes. Enquanto a protena migra a sua velocidade vai diminuindo at chegar ao ponto em que o valor de pH ser igual ao seu pI. Neste ponto a protena ter carga total neutra e como consequncia deixa de migrar. Se a protena se difundir para uma regio fora do seu pI, ir adquirir carga e consequentemente move-se novamente para a posio onde globalmente neutra. Pode ter grupos ionizados, mas globalmente neutra. Electroforese Bidimensional Como as bandas proteicas tendem a sobrepor-se, os mtodos unidimensionais de separao, como a electroforese em gel de poliacrilamida (SDS), podem apenas separar um nmero relativamente pequeno de protenas (geralmente menos de 50), a electroforese de um gel bidimensional, ao combinar dois processos de separao distintos, pode ser usado para separar mais de 1000 protenas. Numa primeira etapa as protenas so separadas em funo da sua carga nativa. As cadeias polipeptdicas so, ento, separadas por um processo de focagem isoelctrica. Numa etapa posterior o gel de poliacrilamida com forma de cilindro que contm as protenas separadas por focagem isoelctrica sujeito, novamente, a electroforese mas numa direco em ngulo recto quela usada na primeira etapa. O gel original mergulhado em SDS e depois colocado numa extremidade de um slab de gel de poliacrilamida SDS, atravs do qual cada cadeia polipeptdica migra em funo do seu tamanho observando-se no resultado final como um ponto sptot. As nicas protenas que no so separadas sero aquelas que tero idntico tamanho e ponto isoelctrico, uma situao relativamente rara. At quantidades vestigiais de cada cadeia polipeptdica pode ser detectada no gel por vrios processos de colorao ou por autorradiografia se a amostra da protena tiver sido previamente marcada por um radioistopo. O poder de separao to grande que duas protenas que diferem em apenas um aminocido carregado podem ser prontamente distinguidas. Western blotting O western blotting permite detectar uma protena numa mistura de protenas dando tambm informao acerca do seu tamanho. Inicialmente as protenas so separadas por SDS-PAGE e, posteriormente, so transferidas para uma membrana de nitrocelulose (do mesmo modo que foram separadas no SDS-PAGE). O polo negativo ctodo, fica do lado do gel e o positivo - nodo no lado da membrana de nitrocelulose para conduzir as protenas carregadas negativamente em direco membrana

(carregada positivamente). A razo para a transferncia das bandas de protenas para uma membrana de nitrocelulose permitir a chegada dos anticorpos s bandas com maior facilidade e eficcia, j que o gel de poliacrilamida no permite a difuso de grandes molculas. A membrana de nitrocelulose incubada com o anticorpo primrio que se liga protena que se pretende detectar, formando um complexo anticorpo-protena. Seguidamente -lhe adicionado o anticorpo secundrio conjugado, anticorpo-enzima, que se vai ligar ao anticorpo primrio. A enzima (ex. fosfatse alcalina ou peroxidase) funciona como um sinalizador molecular que permite a visualizao do local da protena detectada. No entanto, para que a enzima seja visualizada necessrio coloc-la na presena de uma mistura reactiva especfica. adicionado um substrato cromognico, que ao ser degradado pela enzima conjugada com o anticorpo dar origem a um precipitado insolvel colocalizado com o anticorpo primrio que por sua vez se ligou protena. Podem tambm ser utilizados outros tipos de marcadores como os fluorescentes ou os radioistopos (que podem ser detectados por tcnicas de autorradiografia).

A ESTRUTURA COVALENTE DAS PROTEINASA estrutura primaria de uma proteina determina como ela se enovela em uma unica estrutura tridimensional, e isso por sua vez determina a funao da proteina. Cada tipo de protena produz uma unica estrutura tridimensional, e essa estrutura confere uma unica funo. Cada tipo de protena tambm possui uma nica sequencia de aminocidos. Embora a sequencia de aminoacidos em algumas regioes da estrutura primaria possa variar consideravelmente sem afetar a funao biologica, a maior parte das proteinas contem regioes cruciais que sao essenciais para sua funao e cuja sequencia , portanto, conservada. Diferenas na funao proteica resultam das desigualdades na composiao e sequencia de aminoacidos. Algumas variaoes na sequencia sao possiveis para uma proteina particular, com pouco ou nenhum efeito na funao. As sequencias de aminoacidos sao deduzidas pela fragmentao de polipeptidios em peptidios menores usando reagentes conhecidos para clivar ligaoes peptidicas especificas; determinando a sequencia de aminoacidos de cada fragmento pelo procediimento da degradaao de Edman automatizado; depois ordenando os fragmentos peptidicos pelo encontro das sequencias superpostas entre fragmentos gerados por diferentes reagentes. Uma sequencia proteica tambem pode ser deduzida a partir da sequencia de nucleotideos do seu gene correspondente no DNA. Proteinas e peptidios pequenos (at cerca de 100 residuos) podem ser sintetizados quimicamente. O peptidio construido, um residuo de aminoacido por vez, enquanto permanece ligado a um suporte solido.

CAPITULO 4 A ESTRUTURA TRIDIMENSIONAL DAS PROTEINAS O esqueleo covalente de uma proteina tipica contem centenas de ligaoes individuais. Pelo fato de a rotao livre ser possivel em volta dde muitas dessas ligaoes, a proteina pode assumir um numero ilimitado de conformaoes. Entretanto, cada proteina possui uma funo estrutural e quimica especifica, sugerindo fortemente que cada uma tenha uma estrutura tridimensional unica. Considerando que o arranjo ordenado das moleculas de um cristal pode geralmente se formar apenas se as unidades moleculares forem identicas, o simples fato de que muitas proteinas possam ser cristaozadas fornece evidencia forte que mesmo proteinas grandes sao entidades quimicamente discretas com estruturas unicas. A funo proteica frequentemente

acarreta uma interconversaoentre duas ou mais formas estruturais VISO GLOBAL DA ESTRUTURA DAS PROTEINAS O arranjo espacial dos atomos em uma proteina chamado de conformao. As conformaoes possiveis de uma proteina incluem qualquer estado estrutural que possa ser alcanado sem quebrar as ligaoes covalentes. A necessidade para multiplas conformaoes estaveis reflete as alteraoes que devem ocorrer na maioria das proteinas a medida que eleas se ligam as moleculas ou reaoes catalisadas. Uma conformao protica estabilizada em grande parte por interaes fracas No contexto da estrutura proteica, o termo estabilidade pode ser definido como a tendencia a manter uma confomaao nativa. Uma certa cadeia polipeptidica pode teoricamente assumir incontaveis confomaoes diferente, e em consequencia o estado desenovelado de uma proteina caracterizado por alto grau de entropia da conformaao. Essa entropia, e as interaose de pontes de hidrogenio de muitos grupos na cadeia polipeptidica com o solvente (agua) tendem a manter o estado desenovelado. As interaoes quimicas que se contrapoem a esses efeitos e etabilizam a conformaao nativa incluem as pontes dissulfeto e as interaoes fracas (nao covalentes): ligaoes de hidrogenio, ligaoes ionicas e hidrofobicas Ligaoes covalentes indiividuais que contribuem para as conformaoes nativas das proteinas como as pontes dissulteo unido partes separadas de uma cadeia polipeptidica simples sao claramente muito mais fortes que as interaoes fracas individuais. Ainda que, pelo fato de elas serem tao numerosas, sao as interaoes fracas que predominam como fora estabilizadora na estrutura proteica. Em geral, a conformaao proteica com a menor energia livre (mais estavel) aquela com numero maximo de interaoes fracas. A estabilidade de uma proteina nao apenas a soma das energias livres de formao de muitas interaoes fracas dentro dela. Cada grupo de ponto de hidrogenio em uma cadeia

polipeptidica enovelada faz ponte de hidrgenio com a agua antes do enovelamento e, para cada ponte de hidrogenio formada em uma proteina, uma ponte de hidrogenio (de fora semelhante) entre o mesmo grupo e a agua foi quebrada. A ESTRUTURA SECUNDARIA DAS PROTEINAS A -hlice uma estrutura secundaria comum nas proteinas O arranjo mais simples que a cadeia polipeptidica poderia assumir com suas ligaoes peptidicas rigidas (mas com outras ligaoes simples livres para rodar) uma estrutura helicoidal denominada de -helice. Nessa estrutura, o esqueleto polipeptidico esta fortemente enovelado ao redor de um eixo imaginario desenhado longitudinalmente no meio da helice, e os grupos R dos residuos de aminoacidoso projetam-se para fora do esqueleto helicoidal. A unidade repetida uma simples volta da helice que se estendde sobre 5,4 e apresenta 3,6 residuos de aminoacidos. Alm disso, orientada para a direita . So facilmente formadas devido maximizaao de ligaoes de hidrogenio intracadeia (O e H das ligaoes peptidicas em passos adjacentes). Fatores como a repulso (ou atrao) eletrosttica entre residuos de aminoacidos sucessivos com grupos R carregados, o volume dos grupos R adjancentes, a s interaes entre grupos R espaando 3-4 resduos entre si, a ocorrencia de residuos de prolina e glicina e a interao entre residuos de aminoacidos nas extremidades do segmento helicoidal e oo dipolo eletrico inerente a uma -helice afetam a estabilidade das -helices. A tendencia de um dado segmento de uma cadeia polipeptidca de se enovelar com uma -helice depende, portanto, da identidade e da sequencia dos residuos de aminoacidos dentro do segmento. A conformao organiza as cadeias polipeptidicas em folhas

O esqueleto da cadeia polipeptidica estendido em zigue zague em vez de estrutura helicoidal. As cadeias polipeptidacas em zigue zague podem ser arranjadas lado a lado para formar uma estrutura que se assemelha a uma serie dde folhas. Nesse arranjo (folha ), as pontes de hidrogenio sao fomadas entre segmentos adjacentes da cadeia polipeptidica. Os segmentos individuais que formam uma folha estao usualmente proximos na cadeia polipeptidica, mas podem estar bem distantes entre si na sequencia linear do polipeptidio; eles podem mesmo ser segmentados em cadeias polipeptidicas diferentes. Os grupos R de aminoacidos adjacentes projetam-se da estrutura de zigue zague em direoes opostas, criando padroes alternativos. As cadeias polipeptidcas adjacentes em uma folha podem ser paralelas ou antiparalelas (possuindo a mesma orientaao amino at carboxila ou a oposta, respectivamente). AS estruturas sao semelhantes, embora o periodo de repetio seja mais curto para a confomaao paralela (6,5 ) do que para a antiparalela (7 ) e os padroes das pontes de hidrogenios sejam diferentes.A Algumas estruturas proteicas limitam as especies de aminoacidos que podem ocorrer em uma folha . Quando duas ou mais folhas sao assentadas juntas dentro de uma proteina, os grupos R dos residuos de aminoacidos nas superficies que se tocam devem ser relativamente pequenos. As dobras so comuns nas proteinas Conectam as extremidades de dois segmentos adjacentes de uma folha . uma dobra de 180 envolvendo quatro residuos de aminoacidos, com o oxigenio da carbonila do primeiro residuo formando uma ponte de hidrogenio com o hidrogenio do grupo amino do quarto. Os grupos peptidicos dos dois residuos centrais no participam de nenhuma ponte de hidrogenio entre residuos. Os residuos de glicina e prolina frequentemente aparecem nas dobras , o primeiro por ser pequeno e felcivel e o ultimo porque as ligaoes peptidicas que envolvem o nitrogenio iminico da prolina facilmente assumem a

configurao cis, uma forma que particularmente suscetivel de se dobrar. So facilmente encontradas proximo da superfice das proteinas, onde os grupos peptidicos dos residuos centrais de aminoacidos na dobra podem formar pontes de hidrogenio com a agua. Consideravelmente menos comum a dobra K, uma dobra de tres residuos com uma ligaao de hidrogenio entre o primeiro e o terceiro residuo. Estruturas secundarias comuns possuem conteudo de aminoacidos e angulos caracteristicos A -helice e a confomaao so estruturas secundarias repetitivas principais em uma ampla variedade de proteinas, embora outras estruturas repetitivas existam em algumas proteinas especializadas (colageno, por exemplo). Cada tipo de estrutura secundaria pode ser completamente descrito pelos angulos de ligaao dos valores de e e em cada residuo. A maior parte retirados de estruturas de proteinas conhecidas encontra-se em a confomaao . O unico residuo de aminoacido encontrado frequentemente em uma conformaao fora dessas regioes a glicina. Por causa de sua cadeia lateral, um unico atomo de hidrogenio, ser pequena, um residuo de glicina pode tomar parte em muitas configuraoes proibida para os demais aminoacidos. Alguns aminoacidos sao acomodados melhores que outros em diferentes tipos de estruturas secundarias. Algumas preferencias, como a presena comum de prolina e glicina nas dobras e sua relativa ausencia nas -helices, sao facilmente explicadas pelas restrioes das diferentes estruturas secundarias. Outra preferencia evidente pode ser explicada levando em consideraao o tamanho e as cargas das cadeias laterais. ESTRUTURAS TERCIRIA E QUATERNRIA DAS PROTENAS

regioes esperadas, com altas concetraoes proximas dos valores preditos para -helice e

A estrutura terciaria a estrutura tridimensional completa de uma cadeia polipeptidca. H duas classes gerais de proteinas baseadas na estrutura terciaria: as fibrosas e as globulares. As proteinas fibrosas, que servem a papeis principalemente estruturais,possuem elementos de repetiao simples de estrutura secundaria. As proteinas globulares possuem estruturas terciarias mais complesxas, frequentemente contendo varios tipos de estrutura secundaria na mesma cadeia polipeptidica. A primeira estrutura de proteina globular a ser determinada, usando os metodos da difraao de raios X, foi a mioglobulina. As estruturas complexas das proteinas globulares podem ser analisadas examinando subestruturas estaveis chamadas de estruturas supersecundarias, motivos ou dobras. As milhares de estruturas proteicas conhecidas sao geralmente montadas a partir de um repertorio de apenas umas poucas centeas de motivos. As regioes de uma cadeia polipeptidica sao chamadas de dominios. A estrutura quaternaria resulta de interaoes entre subunidades de proteinas com

subunidades multiplas ou a montagem de proteinas maiores. Algumas proteinas multimericas possuem uma unidade de repetiao consistindo dde uma subunidade unica ou um grupo de subunidades referidas como um protomero. Protomeros sao usualmente relacionados por simetria de rotaao ou helicoidal. DESNATURAO E ENOVELAMENTO DAS PROTEINAS A estrutura e a funao tridimensional das proteinas podem ser destruidas pela desnaturao, demonstrando uma relaao entre a estrutura e a funo. Algumas proteinas podem renaturar-se espontaneamente para formar proteinas biologicamente ativas, mostrando que a estrutura terciaria das proteinas determinada pela sequencia de aminoacidos. O enovelamento das proteinas nas celulas provavelmente envolve vias multiplas. Inicialmente, regioes de estrutura secundaria podem formar estruturas supersecundarias, seguidas pelo enovelamento. Grandes montagens de intermediarios de enovelamento sao rapidamente trazidas para uma conformaao nativa unica. Para muitas proteinas, o enovelamento facilitado pelas chaperonas Hsp70 e pelas chaperoninas. A formaao de pontes dissulfeto e a isomerizaao cis-trnas de ligaoes peptidicas de prolina sao catalisadas por enzimas especificas.