RevisãoÁcidos Nucleicos

Antonio FigueiraCENA

Nucleotídeos e Ácidos Nucleicos

• Papel de nucleotídeos no metabolismo celular:– constituinte dos ácidos nucleicos -

RNA e DNA– fonte de energia no metabolismo -> ATP– molécula-sinal em respostas celulares -

> cAMP– componente estrutural de enzimas e co-

fatores -> NAD, FAD, etc

Nucleotídeos e Ácidos Nucleicos

• DNA: Armazenamento da informacão genética– estabilidade

• RNA: várias funções– RNA ribossomal (rRNA) - componentes estruturais

de ribossomos– RNA mensageiro (mRNA) - intermediário– RNA transferência (tRNA) - moléculas adaptadoras

que traduzem informação do mRNA em amino ácidos

– snRNA, microRNA, etc

Dogma Central

Ácidos Nucleicos

RNA e DNA

Unidades: • Pentose (5 C)• Base nitrogenada – pirimidinas

purinas• Fosfato - C - 5’

Nucleotídeos

• Base nitrogenada + Pentose + Fosfato• Nucleosídeo = Base nitrogenada +

Pentose

Pentoses

• Ribose em RNA• 2’-deoxi-ribose em DNA• -furanose

NucleotídeosBase nitrogenadas• Pirimidina: Timina, Uracil e Citosina• Purina: Adenina e Guanina

Ácidos Nucleicos

Numeração: • Pentose = Carbonos – 1’ a 5’• Base nitrogenada – pirimidinas = 1 a 6

purinas = 1 a 9• Ligação pentose – pirimidina – C 1’ N-1

pentose – purina – C 1’- N-9

• Fosfato 5’: mono-, di-, tri- = fósforo ligação éster (baixa energia)ligação fosfoanidro (alta energia)

NucleotídeosBase Nucleosídeo Nucleotídeo Adenina Adenosina Adenilato RNA

Deoxiadenosina Deoxiadenilato DNAGuanina Guanosina Guanilato RNA

Deoxiguanosina Deoxiguanilato DNACitosina Citidina Citidilato RNA

Deoxicitidina Deoxicitidilato DNATimina Timidina Timidilato DNAUracil Uridina Uridilato RNA

Bases modificadas

Bases modificadas

Ligação Fosfodiester

Polaridade5’ -> 3’

pH 7 = fosfatosc/ carga negativa

neutralizados porinterações iônicascom ptn, ions, poliaminas

Estrutura do DNA• 2 cadeias independentes • Dupla hélice, sentido direito• Hélices anti-paralelas• Complementariedade das bases• Eixo externo hidrofílico - deoxiribose + fosfato• Bases hidrofóbicas (planas) no interior• Bases ligadas pontes de H + empilhadas

(stacking)• Major groove e Minor groove (ondulação)

Estrutura do DNA

• Bases hidrofóbicas, relativamente insolúveis em água pH neutro

• > solublidade em pH + ácido ou + básico

• interações hidrofóbicas por “empilhamento” (base stacking) - duas bases planas sobrepostas

• stacking função de força van der Waals e interação dipolo-dipolo entre bases

• minimiza contato com água

Estrutura do DNA

Estabilidade da estrutura secundária:1. Pontes de H – pareamento Watson e

Crick função de forma tautômero – distância correta entre C-1’ -> A -T e G - C

2. Interações hidrofóbicas1. Empilhamento (base stacking) = interação de

nuvens de elétrons

2. Hidrofobicidade (cavitation energy) = quebra de pontes de H da água – força bases internamente

Estrutura do DNA

Pareamento de bases crítico:1. Biológico – replicação, transcrição,

controle expressão gênica

2. Análise – Hibridização, PCR, microarranjo, seqüenciamento

Propriedades de Nucleotídeos• moléculas altamente conjugadas

afetando estrutura, distribuição de elétrons e absorção de luz UV

• moléculas planas (pirimidina) ou quase (purina)

• absorbância máxima - cerca 260 nm

Espectro de absorbância de nucleotídeos

Química de Ácidos NucleicosEstabilidade do DNA - depósito genético!Propriedades• Desnaturação = separação da dupla fita

– quebra das pontes de H– causado por calor ou pH (e proteínas in vivo)

• Renaturação ou anelamento– decréscimo da temperatura ou pH

• Alteração na Absorbância (UV) Abs 260 nm– hipocromicidade: renaturação– hipercromicidade: desnaturação

Desnaturação e renaturação do DNA

Desnaturação• Calor – melting • pH extremos – DNA em pH 12

– Ácido - hidrolisa DNA e RNA– Base – hidrolisa RNA

• Processo de desnaturação altera Absorbância

– Perda de stacking – aumenta Abs 260 nm– DNA fita simples – hidroxiapatita e S1 nuclease– Alteração Hipercrômica – aprox. 30% maior

Cinética de Renaturação

1. Solução de DNA aquecida lentamente2. Medir Abs260nm

3. Gráfico Abs x Temperatura4. DNA desnatura em faixa estreita de ToC de

forma cooperativa = Tm

Tm = temp. 50% DNA desnaturado

Tm = função de [sais]

Conceito usado em sondas eprimers (estringência)

DNA RNA

Cinética de Renaturação

Renaturação não apenas reverso de desnaturação!

ocorre naturalmente 5 – 10oC abaixo Tm- Renaturação = função de [DNA] – freqüência

de bases complementares se encontrarem- Depende de complexidade do genoma

- Genoma – não retorna a Abs260nm original

- Genoma fragmentado – renatura completamente

- Renaturação = função tamanho e complexidade do genoma

- Afetado concentração de sais e temperatura

Taxa de Renaturação

- Função do tamanho do genoma- Genoma menor renatura mais rapidamente

Curvas CoT

C/Co = 1/(1 + kCoT)

C = [ssDNA]Co = [DNA]K = constante da taxa de reassociaçãoT = tempo

Cinética de Renaturação• Temperatura de desnaturação = Tm

– Função: composição G+C• Permite estimar tamanho de genoma

(CoT)1/2

• Complexidade do Genoma– soma dos comprimentos das seqüências

únicas mais as unidades de comprimento de cada família de seqüências repetitivas

– Seqüências únicas – componente cinético único

– > componente cinéticos genoma complexo

Fold-back

Highly Repetitive

Medium Repetitive

Single/Low copy

Curva Cot Cebola

Cinética de RenaturaçãoComplexidade de Seqüência: grupo mínimo

(em pb) que define o genoma;Valor Cot: definido como o produto da

concentração de nucleotídeos em moles por Litro (Co) e seu tempo de renaturação (t);

Componente Cinético: grupo de seqüências genômicas que exibem propriedades de renaturação similares, e consequentemente aparecem como região sigmoidal distinta na curva Cot.

Número de clones necessáriospara 99% certeza que todas as

seqüências estão presentesZ = tamanho médio inserto (pb)

G = tamanho 1 C do genoma (pb)

Número de clones necessáriospara 99% certeza que todas as

seqüências estão presentesconsiderando as frações de

componentes cinéticos(a, b, c e f)

Artigos publicados sobre cinética de reassociação

RNA

• 1961 - Jacob & Monod -> RNA intermediário– RNAs ocorrem no núcleo e citoplasma

• mRNA– monocistrônico - eucariotos– policistrônico - procariotos

• rRNA• tRNA

rRNA em Ribossomo

tRNA

Hidrólise espontânea de RNA em condições alcalinas

Estrutura de RNA• mRNA -> fita simples

– tendem a assumir conformação helicoidal direita dominada pelo emplihamento das bases (pur-pur)

– auto-complementariedade - estrutura mais complexas– pareamento: A-U, G-C e G-U!– estrutura 3ária função de seqüência (~ a ptn)

• interações com grupo OH de C-2’• formas A e Z, mas não ocorre forma B!

• rRNA• tRNA

Química de Ácidos Nucleicos

Transformações não -enzimáticas

• desaminação - perda de grupo amina– alterações espontâneas, baixíssima

taxa– perda de amina por C -> U -

reconhecido em DNA taxa 10-7 24 h-1

– DNA - possui T ao invés de U!

Química de Ácidos Nucleicos

Transformações não -enzimáticas• hidrólise da ligação N--glicosidil entre base e

pentose ou Depurinação– ocorre mais para purinas– acelerado em meio ácido

Química de Ácidos Nucleicos

Transformações não -enzimáticas

• radiação UV– condensação de 2 etilenos

em ciclobutano– DNA - 2 pirimidinas (T)

adjacentes -> dímeros

• agentes ambientais– deaminanntes

– alquilantes