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ÉRIKA GOMES SARMENTO
EFEITO DE PETIT SUISSE POTENCIALMENTE PROBIÓTICO NA MICROBIOTA DA SALIVA DE
CRIANÇAS: ESTUDO IN VITRO E IN VIVO
Dissertação apresentada ao Campus Rio Pomba, do Instituto Federal de Educação Ciência e Tecnologia do Sudeste de Minas Gerais, como requisito parcial para a conclusão do curso de Pós-Graduação Stricto Sensu em Ciência e Tecnologia de Alimentos para a obtenção do título de Mestre.
RIO POMBA MINAS GERAIS – BRASIL
2016
i
ÉRIKA GOMES SARMENTO
EFEITO DE PETIT SUISSE POTENCIALMENTE PROBIÓTICO NA MICROBIOTA DA SALIVA DE
CRIANÇAS: ESTUDO IN VITRO E IN VIVO
Dissertação apresentada ao Campus Rio Pomba, do Instituto Federal de Educação Ciência e Tecnologia do Sudeste de Minas Gerais, como requisito parcial para a conclusão do curso de Pós-Graduação Stricto Sensu em Ciência e Tecnologia de Alimentos para a obtenção do título de Mestre.
Orientadora: Aurélia Dornelas de Oliveira Martins
RIO POMBA MINAS GERAIS – BRASIL
2016
Ficha Catalográfica elaborada pela Biblioteca Jofre Moreira – IFET/RP Bibliotecária: Tatiana dos Reis Maciel CRB 6 / 2711
S246e Sarmento, Érika Gomes Sarmento. Efeito de petit suisse potencialmente probiótico na microbiota da saliva de crianças: estudo in vitro e in vivo. / Érika Gomes Sarmento. – Rio Pomba, 2016.
85f. : il. Orientador: Prof.ª Dsc. Aurélia Dornelas de Oliveira Martins. Trabalho de Conclusão de Curso de Pós Graduação Stricto Sensu
em Ciência e Tecnologia de Alimentos - Instituto Federal do Sudeste de Minas Gerais - Campus Rio Pomba. 1. Alimentos. 2. Produtos lácteos - queijo petit suisse. 3. Alimento probiótico. 4. Saúde bucal. I. Martins, Aurélia Dornelas de Oliveira (orient.). II. Título.
CDD: 637.3
ii
iii
Dedico este trabalho a meus filhos Beatriz e Marcelo, dádiva de Deus em minha vida. Aos meus pais Jovelina e Hélio, pelo amor incondicional e ao meu querido companheiro Renato.
iv
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, que, em sua infinita bondade, concedeu-me saúde e
entusiasmo, além de fortalecer minha fé para que eu pudesse concluir este trabalho.
Agradeço-O, também, pelos anjos que colocou em meu caminho, pelas portas que
se abriram, por tudo que aprendi, pelos erros e acertos. Foi uma etapa bem vivida e
Ele, certamente, foi meu impulso.
Ao Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Sudeste de Minas
Gerais (IF Sudeste MG), Campus Rio Pomba, pela estrutura e oportunidade dadas
para a realização do Mestrado.
À FAPEMIG - Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais,
pela concessão de bolsa para que o trabalho pudesse ser realizado.
À FIOCRUZ - Fundação Oswaldo Cruz pela doação de algumas culturas de
microrganismos utilizadas neste trabalho.
Ao Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos, em especial aos
professores, verdadeiros mestres, excelentes na arte que exercem. Vocês me
encantaram com tanto comprometimento e amor à profissão que escolheram.
Saibam que levarei um pouco de cada um em minha caminhada.
À minha orientadora, Aurélia Dornelas de Oliveira Martins, por aceitar o
desafio de me conduzir neste projeto e de sonhar ao meu lado... Agradeço-a pela
sutileza com que me corrigiu, por me mostrar o caminho e acreditar em mim. Pela
paciência, disponibilidade, atenção e carinho. Você foi excelente!
À minha coorientadora, professora Dionéia Evangelista Cesar, sempre
atenciosa e por me receber tão bem em seu laboratório, na família LEBIOMM... Sem
dúvida sua contribuição foi imensurável para a qualidade deste trabalho. Saiba que
seus questionamentos nos desafiam a buscar por respostas e por conhecimento e
esse é o verdadeiro papel de um educador. Foi um prazer tê-la conhecido, ter
trabalhado ao seu lado e ter aprendido tanto com você!
Ao meu coorientador, professor Maurilio Lopes Martins, obrigada por ter
colocado os probióticos em minha vida, pela sugestão do tema para a pesquisa, por
dividir seu conhecimento, pelos seus exemplos de disciplina e humildade. Suas
aulas são um legado para o Instituto e para quem teve o prazer de assistí-las!
À professora Eliane Maurício Furtado Martins, minha professora-amiga,
v
grande incentivadora e que tanto contribuiu para que o trabalho se concretizasse.
Obrigada por sanar minhas dúvidas, por enxugar minhas lágrimas e por me corrigir
com tanta paciência! Eterno reconhecimento!
Ao professor Elton Geraldo de Oliveira Góis, minha gratidão por sua
generosidade em aceitar compartilhar seu conhecimento para o enriquecimento
desta pesquisa. Você foi meu professor durante a graduação e esteve na minha
banca da especialização. Saiba que me alegro em tê-lo em minha banca de
mestrado!
Ao professor André Narvaes, pela contribuição na análise estatística e
aconselhamento durante o trabalho. Muito obrigada!
Agradeço também ao professor Alessandro Del’Duca do IFSudeste MG,
Campus Juiz de Fora, atencioso e que tanto colaborou na etapa de contagem de
microrganismos em microscopia de epifluorescência.
Sempre aprendi muito com meus colegas de mestrado e construímos uma
convivência de amizade e companheirismo. Não poderia deixar de agradecê-los por
tudo o que fizeram por mim! Aprendi muito com cada um de vocês!
Agradeço à equipe técnica dos laboratórios de Microbiologia de Alimentos do
IF Sudeste MG, Campus Rio Pomba, Jonathan, Patrícia, Renata e Rosélio, sempre
prestativos.
Agradecimento especial ao Pelé e demais funcionários do laticínio do
Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos do IF Sudeste MG, Campus
Rio Pomba, por toda a colaboração durante a etapa de processamento do petit
suisse e pelo cuidado e responsabilidade com que me auxiliaram.
À Taisa, ex-aluna do Instituto e à Scarlet, aluna de graduação, pelo auxílio no
processamento e análises microbiológicas e a todos os alunos que utilizam os
laboratórios do IF Sudeste MG, Campus Rio Pomba e que contribuíram de alguma
forma com o trabalho... somos uma família!
À toda a equipe da Escola Municipal São José, à Secretária de Educação,
Viviane Gomes Vieira, e aos voluntários que contribuíram para a realização do
estudo in vivo.
Aos meus pacientes, minhas auxiliares, aos amigos e familiares que torceram
por mim. Agradecimento especial aos meus irmãos Nádia, Rodrigo e Hermann que
vi
tanto me incentivaram durante esses dois anos. Vocês são muito especiais!
Mãe, pai, Beatriz, Marcelo e Maria não há palavra que defina meu amor por
vocês! Mãe, como sempre tão zelosa, amiga e me ajudando com as crianças. Meus
filhos, raios de sol em minha vida e Maria, delicada flor de laranjeira, desculpem-me
pela ausência em muitos momentos...
Enfim, agradeço ao Renato que me deu suporte para que eu pudesse me
dedicar ao mestrado, que dividiu comigo as dificuldades, os porquês e que se
alegrou com minhas conquistas. Você, como sempre, foi muito companheiro!
vii
“...Queda prohibido no sonreír a los problemas, no luchar por lo que quiero, abandonarlo todo por tener miedo, no convertir en realidad mis sueños...” Alfredo Cuervo Barreiro
viii
SUMÁRIO
RESUMO................................................................................................................ x
ABSTRACT............................................................................................................ xi
LISTA DE FIGURAS.............................................................................................. xii
LISTA DE QUADROS ........................................................................................... xiii
LISTA DE TABELAS............................................................................................. xiv
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ............................................................... xv
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................. 1
2. OBJETIVOS....................................................................................................... 3
2.1. Objetivo geral ................................................................................................. 3
2.2. Objetivos específicos ...................................................................................... 3
3. REVISÃO DE LITERATURA.............................................................................. 4
3.1. Alimentos probióticos e seus efeitos na saúde............................................... 4
3.2. Alimentos prebióticos e seus benefícios ........................................................ 6
3.3. Efeito de alimentos probióticos na saúde bucal ............................................ 8
3.3.1. Potencial de bactérias probióticas na prevenção de lesões cariosas.......... 15
3.3.2. Efeito de alimentos probióticos na saúde periodontal ................................. 18
3.3.3. Influência dos probióticos na prevenção e tratamento de candidíase na
cavidade bucal ....................................................................................................... 22
3.4. A técnica de hibridização in situ fluorescente para identificação e
quantificação de microrganismos da saliva ........................................................... 24
4. MATERIAL E MÉTODOS................................................................................. 27
4.1. Ensaio in vitro.................................................................................................. 27
4.2. Elaboração do queijo petit suisse.................................................................. 30
4.2.1. Aquisição da farinha de banana verde ....................................................... 30
4.2.2. Preparo da cultura lática probiótica............................................................. 31
4.2.3. Elaboração do queijo petit suisse potencialmente probiótico acrescido de
farinha de banana verde...................................................................................... 31
4.3. Avaliação microbiológica dos queijos elaborados........................................... 32
4.3.1. Coliformes a 30 oC e a 45 oC ...................................................................... 32
4.3.2. Listeria monocytogenes ............................................................................ 33
ix
4.3.3. Salmonella sp. ......................................................................................... 33
4.3.4. Fungos filamentosos e leveduras ............................................................. 33
4.3.5. Estafilococos coagulase positiva ............................................................... 34
4.3.6. Determinação da viabilidade de bactérias láticas em queijo petit suisse
por meio da técnica de cultivo convencional em placas ....................................... 34
4.4. Seleção e avaliação clínica das crianças para o teste in vivo......................... 34
4.5. Estudo in vivo da influência do consumo de petit suisse potencialmente
probiótico na microbiota da saliva de crianças ..................................................... 38
4.5.1. Avaliação da aceitação sensorial ............................................................... 39
4.5.2. Coleta das amostras .................................................................................. 39
4.6. Identificação e quantificação da microbiota da saliva: S. mutans, S.
sobrinus, P. gingivalis, A. actinomycetemcomitans, C. albicans e L. casei............ 41
4.7. Análises estatísticas ...................................................................................... 43
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO......................................................................... 44
5.1. Antagonismo in vitro........................................................................................ 44
5.2. Qualidade microbiológica do queijo Petit suisse............................................ 47
5.3. Viabilidade das bactérias láticas................................................................... 48
5.4. Aceitação sensorial dos produtos pelas crianças........................................... 50
5.5. Identificação e quantificação de microrganismos na saliva de voluntários
pela técnica de FISH............................................................................................ 51
6. CONCLUSÃO..................................................................................................... 60
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................. 61
8. APÊNDICES ...................................................................................................... 77
9. ANEXO .............................................................................................................. 85
x
RESUMO
SARMENTO, Érika Gomes, Mestrado Profissional, Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Sudeste de Minas Gerais, setembro de 2016. Efeito de petit suisse potencialmente probiótico na microbiota da saliva de crianças: estudo in vitro e in vivo Orientadora: Aurélia Dornelas de Oliveira Martins. Coorientadores: Dionéia Evangelista Cesar e Maurilio Lopes Martins.
Probióticos são amplamente utilizados na indústria de alimentos e podem interferir na microbiota bucal. O presente estudo teve por objetivo avaliar o efeito de petit
suisse acrescido de probiótico na microbiota da saliva de crianças. Um ensaio in
vitro foi realizado para avaliar o antagonismo de bactérias láticas frente a potenciais patógenos por meio do teste da gota. Lactobacillus casei-01(CHR HANSEN) foi identificado com maior potencial para inibir Streptococcus mutans, Eikenella
corrodens, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Candida albicans e Streptococcus sobrinus. Em seguida, petit suisse sabor morango acrescido de farinha de banana verde (Controle) e com adição da bactéria com melhor resultado no teste de antagonismo (L. casei) foram preparados. A viabilidade do probiótico adicionado ao petit suisse foi avaliada em diferentes tempos de armazenamento. As bactérias láticas foram viáveis entre 108 a 109 UFC.g-1 durante 28 dias de armazenamento à 4 oC. A aceitação sensorial do queijo petit suisse foi avaliada por meio de questionários aplicados em crianças da Escola Municipal São José, na cidade de Rio Pomba – MG. Estas crianças, 41 voluntários na faixa etária de 10-12 anos, participaram do ensaio in vivo consumindo petit suisse com e sem probióticos. O estudo foi randomizado e a saliva dos voluntários foi coletada antes do período de consumo dos produtos (T0), no último dia de consumo do petit suisse (T1) e duas semanas após a interrupção do consumo (T2 - pós tratamento). As amostras de saliva foram imediatamente fixadas com paraformaldeído à 20%, numa concentração final de 2% e armazenadas em refrigerador até o momento da identificação e quantificação da microbiota pela técnica de Hibridização in situ Fluorescente (abreviatura do inglês – FISH). A contagem dos microrganismos foi realizada em microscópio de epifluorescência. A adição do microrganismo não interferiu na aceitabilidade do produto. Ambos os produtos (controle e com adição de L. casei) foram capazes de reduzir significativamente (p<0,05) o número total de microrganismos e de S. mutans na saliva dos voluntários. Apenas o produto acrescido de L. casei diminuiu a densidade de A. actinomycetemcomitans, assim como mostrou-se capaz de manter a redução de P. gingivalis no pós tratamento.
Portanto, o queijo petit suisse desenvolvido apresenta capacidade para carrear microrganismo probiótico, sendo uma alternativa em potencial para reduzir a microbiota potencialmente patogênica da cavidade bucal.
Palavras-chave: Patógenos bucais, queijo, teste de antagonismo, saúde bucal, farinha de banana verde.
xi
ABSTRACT
SARMENTO, Érika Gomes, Mestrado Profissional, Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Sudeste de Minas Gerais, September 2016. Effect of a potentially probiotic petit suisse cheese on the microbiota of children’s saliva: an invitro and in vivo study Advisor: Aurélia Dornelas de Oliveira Martins. Coadvisors: Dionéia Evangelista Cesar and Maurilio Lopes Martins.
Probiotics are widely used in the food industry, and they may interfere with the oral microbiota. The present study was conducted to evaluate the effect of a petit suisse cheese with addition of a probiotic on the saliva microbiota of children. An in vitro trial was carried out to evaluate the antagonism of lactic bacteria against potential pathogens by the drop test. Lactobacillus casei-01 (CHR HANSEN) was identified as having the greatest potential to inhibit Streptococcus mutans, Eikenella corrodens, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Candida albicans and Streptococcus
sobrinus. Next, strawberry-flavored petit suisse cheese with addition of green banana flour (control) and cheese with addition of the bacterium with the best result in the antagonism test (L. casei) were prepared. The viability of the probiotic added to the petit suisse cheese was assessed at different storage times. Lactic bacteria were viable between 108 to 109 cfu.g−1 for 28 days of storage at 4 ºC. The sensory acceptance of the petit suisse cheese was evaluated by questionnaires applied to children enrolled in the São José Municipal School, located in Rio Pomba - MG, Brazil. These children ― 41 volunteers in the age range of 10-12 years ― participated in the in vivo trial consuming the cheese with and without probiotics. The study was randomized, and the volunteers’ saliva was collected before the period of consumption of the products (T0), on the last day of consumption of the petit suisse cheese (T1), and two weeks after consumption interruption (T2 - post-treatment). Saliva samples were immediately fixed with 20% paraformaldehyde at a final concentration of 2% and kept in a refrigerator until the moment of identification and quantification of the microbiota by the Fluorescent In Situ Hybridization (FISH) technique. Microorganism count was performed using an epifluorescence microscope. Addition of the microorganism did not interfere with the acceptability of the product. Both products (control and with addition of L. casei) were able to significantly reduce (p<0.05) the total number of microorganisms and S. mutans in the saliva of the volunteers. Only the product with addition of L. casei reduced A.
actinomycetemcomitans density as well as showed ability to maintain P. gingivalis post-treatment. Therefore, the petit suisse cheese developed has the ability to carry probiotic microorganisms, which makes it an alternative to reduce the potentially pathogenic microbiota in the oral cavity.
Key words: oral pathogens, cheese, antagonism test, oral health, green banana flour.
xii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Etapas básicas da FISH.................................................................... 25
Figura 2. Códigos para os dentes decíduos.................................................... 38
Figura 3. Códigos para os dentes permanentes............................................... 38
Figura 4. Representação esquemática dos tempos de coleta das amostras
de saliva............................................................................................. 40
Figura 5. Contagem de bactérias láticas nas amostras de queijo petit suisse
ao longo da vida de prateleira........................................................... 49
Figura 6. Contagem total de microrganismos (DAPI) em saliva de crianças
antes do consumo (Tempo 0) de petit suisse adicionado de L.
casei (PROB) ou não adicionado de L. casei (CONT), no último dia
de consumo (Tempo 1 - 11o dia) e após 15 dias de sua interrupção
(Tempo 2 - 26 o dia). ......................................................................... 52
Figura 7. Contagens de L. casei (A) e microrganismos potencialmente
patogênicos bucais S. mutans (B); S. sobrinus (C); P. gingivalis
(D); A. actinomycetemcomitans (E); C. albicans (F) em saliva de
crianças nos diferentes tempos do consumo de petit suisse
adicionado (PROB) ou não de probiótico (CONT). ........................... 54
xiii
LISTA DE QUADROS
Quadro 1. Resumo de potenciais probióticos, veículos de base láctea
utilizados e resultados encontrados em diferentes estudos.............. 12
Quadro 2. Resumo de potenciais probióticos veiculados por produtos não
lácteos e resultados encontrados em diferentes estudos.................. 13
Quadro 3. Códigos para a condição da dentição permanente e decídua
(coroa e raiz)...................................................................................... 36
Quadro 4. Sondas de olinucleotídeo de RNAr utilizadas para a identificação
de microrganismos bucais em saliva pela técnica de FISH.............. 42
xiv
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Microrganismos utilizados para o ensaio in vitro no teste de
antagonismo.................................................................................. 28
Tabela 2. Condições de ativação utilizadas previamente ao teste de
antagonismo.................................................................................. 29
Tabela 3. Valores médios dos halos de inibição (mm) de microrganismos
bucais potencialmente patogênicos por bactérias láticas probióticas
(estirpes ATCC)............................................................................. 45
Tabela 4. Valores médios dos halos de inibição (mm) de microrganismos
bucais potencialmente patogênicos por bactérias láticas
comerciais..................................................................................... 45
Tabela 5. Qualidade microbiológica das amostras de queijo petit suisse........... 47
Tabela 6. Aceitação sensorial das amostras de queijo petit suisse.................... 50
xv
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
µL Microlitro µM Micrômetro ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária APHA American Public Health Association BPF Boas Práticas de Fabricação DAPI 4’,6-diamidino-2-phenylindole EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético FBV Farinha de banana verde FIESP Federação das Indústrias do Estado de São Paulo FISH Fluorescence in situ Hybridization(Hibridização in situ
fluorescente) FAO Food and Agriculture Organization
g Grama GRAS Generally Recognised As Safe (Geralmente reconhecido como
seguro) GSRS Gastrointestinal Symptom Rating Scale
IF SUDESTE MG Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Sudeste de Minas Gerais
IP Índice de Placa ISG Índice de Sangramento Gengival ITAL Instituto de Tecnologia de Alimentos LEBIOMM Laboratório de Ecologia e Biologia Molecular de Microrganismos Log Logaritmo LST caldo Lauril Sulfato de Sódio mg Miligrama mL Mililitro mm Milímetro NMP Número mais provável OMS Organização Mundial de Saúde pH Potencial hidrogeniônico SDS Dodecil sulfato de sódio TNF Fator de necrose tumoral UFC Unidades Formadoras de colônias WHO World Health Organization
1
1. INTRODUÇÃO
No Brasil, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) definiu, por
meio das Resoluções n° 18 e 19, de 30 de abril de 1999, que a alegação de
propriedade funcional de um alimento refere-se ao seu potencial metabólico ou
fisiológico, em que o nutriente ou não nutriente acarreta no crescimento,
desenvolvimento, manutenção ou em outras funções normais do organismo. Ainda,
na mesma resolução, a alegação de propriedade de saúde é aquela que determina a
existência de uma relação entre o alimento ou seu ingrediente, com a condição de
saúde ou doença (BRASIL, 1999a; BRASIL, 1999b). O termo “alimentos funcionais”
foi originalmente definido como alimento de uso específico de saúde, no Japão, na
década de 1980 (GRANATO et al., 2010).
Assim, os alimentos funcionais são uma alternativa para a promoção da
saúde, pois apresentam, além da função nutricional, benefícios fisiológicos que
reduzem a ocorrência de doenças crônicas (SOUZA, 2008).
Dentre eles, incluem-se aqueles adicionados de microrganismos probióticos,
definidos pela Organização Mundial de Saúde (FAO/WHO, 2001) como
microrganismos vivos que, quando consumidos em quantidades adequadas,
conferem benefícios à saúde do hospedeiro.
A matriz mais estudada para carrear os microrganismos probióticos consiste
no leite e seus derivados. A indústria láctea tem aplicado os conhecimentos das
propriedades funcionais e de saúde no desenvolvimento de novos produtos, o que é
um desafio para os produtores de alimentos, à medida que procura atender à
demanda dos consumidores por produtos que sejam, concomitantemente, saudáveis
e atrativos (DELFINO, 2013). Segundo a Federação das Indústrias do Estado de
São Paulo e Instituto de Tecnologia de Alimentos, o leite está entre os produtos com
maior perspectiva de consumo até 2020 e, particularmente, o queijo é o produto
mais promissor entre os avaliados (FIESP/ITAL, 2010).
Dentre os diversos tipos de queijo, encontra-se o Petit Suisse que é definido
como queijo fresco, não maturado, obtido por coagulação do leite com coalho e/ou
de enzimas específicas e/ou de bactérias específicas, adicionado ou não de outras
2
substâncias alimentícias (BRASIL, 2000). A incorporação de probióticos ao queijo
pode agregar valor ao produto.
Os probióticos representam grande oportunidade para prevenção e
tratamento de doenças de uma maneira natural e não-invasiva. A influência dessas
bactérias sobre a saúde bucal tem sido estudada, sobretudo como uma alternativa
para a prevenção de cárie dentária (FERNANDES et al., 2010; PINTO, 2011;
BASTOS et al., 2012; VISHNU, 2012). Acredita-se que outras patologias bucais
também poderiam ser evitadas com o consumo desses alimentos (WHELTON,
2009), uma vez que sua utilização parece ser uma forma natural para manuteção da
saúde e proteção dos tecidos bucais de doenças.
Diferentes técnicas têm sido empregadas para a detecção de microrganismos
presentes na cavidade bucal. A técnica de FISH (Fluorescence in situ Hybridization)
pode ser utilizada com essa finalidade, pois permite a avaliação da microbiota
normal ou alterada por infecções microbianas mistas (MOTER; GÖBEL, 2000) e
consiste em uma ferramenta da biologia molecular na qual as bactérias são
identificadas e quantificadas com a utilização de sondas específicas para cada
espécie ou grupo de microrganismos, com marcadores que emitem fluorescência
sem que haja necessidade de cultivo prévio (MOTER; GÖBEL, 2000; DEL’DUCA;
CÉSAR, 2007; DEL’DUCA, 2013).
3
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral
Avaliar o efeito de queijo petit suisse potencialmente probiótico na microbiota
da saliva de crianças com idades entre 10 e 12 anos e que estudam na Escola
Municipal São José, no município de Rio Pomba, MG.
2.2. Objetivos específicos
• Verificar o antagonismo, in vitro, de bactérias ácido láticas frente a
microrganismos potencialmente cariogênicos, periodontopatogênicos e à
levedura Candida albicans;
• Elaborar petit suisse sabor morango, acrescido de farinha de banana verde e
de Lactobacillus casei selecionado no ensaio in vitro, e verificar a qualidade
microbiológica dos produtos obtidos;
• Determinar a viabilidade de L. casei no queijo petit suisse ao longo do
armazenamento;
• Avaliar a aceitação sensorial dos produtos;
• Identificar e quantificar em amostras de saliva, pela técnica FISH,
Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus, Porphyromonas gingivalis,
Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Candida albicans e L. casei antes,
após o período de consumo do produto potencialmente probiótico pelas
crianças e depois de 15 dias de interrompido o consumo do queijo petit
suisse (pós tratamento);
• Avaliar a ação de L. casei selecionado no ensaio in vitro e veiculado por
queijo petit suisse na microbiota da saliva de crianças.
4
3. REVISÃO DE LITERATURA
3.1. Alimentos probióticos e seus efeitos na saúde
Segundo a World Gastroenterology Organisation (2011), há um século, o
cientista russo Elie Metchnikoff, professor do Instituto Pasteur em Paris, sugeriu que
as bactérias ácido-láticas ofereciam benefícios à saúde, com potencial para
modificar a microbiota intestinal, substituindo microrganismos produtores de
substâncias tóxicas. No entanto, o termo “probiótico” foi introduzido por Lilly e
Stillwell em 1965. Eles ressaltaram que, diferente dos antibióticos, os probióticos são
capazes de estimular o crescimento de outros microrganismos.
A Organização de Alimentos e Agricultura das Nações Unidas (Food and
Agriculture Organization – FAO) e a Organização Mundial da Saúde (World Health
Organization - WHO) definiram probiótico como microrganismos vivos que, quando
ingeridos em quantidades adequadas, conferem benefícios à saúde de quem os
consome (FAO/WHO, 2001).
Microrganismos probióticos devem possuir resistência às operações de
processamento e manter sua viabilidade durante o período de estocagem do produto
para serem utilizados em alimentos com alegação de propriedade funcional (AKIN;
AKIN; KIRMACI, 2007; SHORI, 2016).
Um alimento funcional probiótico deve apresentar uma contagem de células
viáveis de, pelo menos, 106 a 107 UFC.g-1 (FAO, 2001), sendo recomendada
ingestão diária de 108 a 109 UFC por dia (KRASAEKOOP; BHANDARI; DEETH,
2003; BRASIL, 2008; REID, 2008; BANSAL et al., 2016), valores inferiores podem
ser aceitos desde que comprovada a eficácia do produto (BRASIL, 2008).
A documentação necessária para tal comprovação, de acordo com Brasil
(2008), consiste em um laudo de análise do produto que demonstre a viabilidade
mínima do microrganismo até o fim da vida de prateleira do produto, assim como, o
teste de resistência da cultura às condições adversas do trato gastrointestinal, como
à acidez gástrica e aos sais biliares.
Dentre as espécies bacterianas, as listadas como probióticas são
Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei shirota, Lactobacillus casei variedade
5
rhamnosus, Lactobacillus casei variedade defensis, Lactobacillus paracasei,
Lactococcus lactis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium animallis (incluindo a
subespécie B. lactis), Bifidobacterium longum e Enterococcus faecium (BRASIL,
2008).
L. casei é um bastonete Gram-positivo membro da família Lactobacillaceae e
da ordem Lactobacillales. As espécies L. casei, L. paracasei e L. rhamnosus
compõem o grupo taxonômico L. casei (TIEN et al., 2006; SATO et al., 2012).
Apresentam importante valor comercial para a indústria de alimentos, devido
a seu emprego na produção de leites fermentados e como culturas starters na
fabricação de queijos. As referidas espécies são potenciais colonizadoras de uma
diversidade de ambientes naturais ou não, tais como, cavidade bucal, tratos
intestinal e vaginal, produtos de laticínios, produtos vegetais, ensilagem, esgoto e
alimentos deteriorados e têm sido amplamente estudadas com relação a suas
propriedades promotoras de saúde, efeito antinflamatório e melhoria da imunidade,
sendo frequentemente empregadas como probióticos em alimentos industrializados
(TIEN et al., 2006; BURITI; SAAD, 2007; SATO et al., 2012).
A variedade de espécies terapêuticas utilizadas em suplementos probióticos é
restrita e é limitada a espécies tipicamente de origem gastrointestinal. Embora seja
um campo relativamente novo, o potencial para a identificação de novos agentes
terapêuticos baseados na microbiota humana é significativo (NAGALINGAM; COPE;
LYNCH, 2013).
Uma série de efeitos benéficos tem sido atribuídos aos probióticos, sobretudo
a capacidade de adesão à superfície de mucosas e às células epiteliais, prevenindo
a instalação de microrganismos potencialmente patogênicos (MAKINO et al., 2014).
Os efeitos benéficos desses microrganismos foram descritos inicialmente para o
intestino, na prevenção e tratamento de diarréias e de outras patologias do sistema
gastrointestinal (PETROF, 2009; REBOLLEDO; ROJAS; SALGADO, 2013; TIAN,
2014; VANDENPLAS; HUYS; DAUBE, 2015).
No entanto, a literatura descreve, ainda, outros benefícios, como o
fortalecimento do sistema imunitário (BOIRIVANT; STROBER, 2007; REBOLLEDO;
ROJAS; SALGADO, 2013; AOUDIA et al., 2016), melhor síntese e biodisponibilidade
de nutrientes, menor sensibilidade à lactose, redução da prevalência de reações
6
alérgicas, prevenção e redução do risco de certos cânceres e redução do colesterol
(PARVEZ et al., 2006; SHAH, 2007).
Também apresentam efeito antinflamatório (BOIRIVANT; STROBER, 2007) e
tem sido indicados no tratamento de doenças inflamatórias crônicas de mucosas do
trato respiratório e trato vaginal, por meio da colonização e produção de ácido lático
e de bacteriocina, o que permite o controle do ecossistema das mucosas
(NAGALINGAM; COPE; LYNCH, 2013). Tais benefícios é dependente da estirpe
bacteriana (AOUDIA et al., 2016) e têm sido atribuídos, principalmente a L.
acidophilus, L. casei e Bifidobacterium ssp.(SHAH, 2007).
Lactobacillus sp. representam 1% da microbiota bucal de humanos, sendo
que as espécies L. acidophillus, L. casei, L. fermentum, L. plantarum, L. rhamnosus,
e L. salivarius são as espécies encontradas com maior frequência na saliva
(TEANPAISAN; DAHLEN, 2006).
Os probióticos são competitivos e dessa forma são antagonistas de potenciais
patógenos. Promovem saúde por meio de múltiplos mecanismos como: fagocitose,
inibição do crescimento bacteriano, modulação local da resposta imune e
competição por sítios de ligação. Todos esses mecanismos provêm de estudos
realizados no trato gastrointestinal, porém, considerando-se que a cavidade bucal
representa a primeira parte desse sistema, acredita-se que mecanismos
semelhantes a esses também possam ocorrer na boca (REID, 2005; MEURMAN;
STAMATOVA, 2007; HAUKIOJA, 2010).
3.2. Alimentos prebióticos e seus benefícios
Para estimular o crescimento de bactérias probióticas, os prebióticos são
utilizados por constituírem-se de hidratos de carbono fermentáveis pelas
bifidobactérias e bactérias produtoras de ácido lático, favorecendo o sistema
gastrointestinal e o sistema imunológico. Além disso, os prebióticos têm mostrado
aumentar a absorção de cálcio e de magnésio (AL-SHERAJI et al., 2013).
Prebióticos são carboidratos não digeríveis (VAN DENDER, 2008) que possuem um
efeito significativo na saúde humana e podem ser incorporados numa grande
variedade de alimentos (AL-SHERAJI et al., 2013).
7
De acordo com Gibson; Roberfroid (1995), prebióticos são ingredientes
alimentares não digeríveis que afetam beneficamente o hospedeiro, estimulando
seletivamente o crescimento e/ou a atividade de um ou limitado número de espécies
bacterianas residentes no cólon contribuindo, assim, para a melhoria da saúde.
Para os autores, o termo simbiótico refere-se a alimentos que apresentam uma
mistura de pré e probióticos com propriedades nutricionais produzidas pelos
ingredientes alimentares funcionais, capazes de promoverem melhoria da saúde do
hospedeiro.
Segundo Kojima et al. (2016), os produtos simbióticos resultam de um
sinergismo entre prebióticos e probióticos, conhecidos por promover benefícios ao
sistema gastrointestinal. Apesar da ação dos alimentos simbióticos na cavidade
bucal ainda não ter sido estudada, há potencial para desenvolvimento de produtos
simbióticos visando o equilíbrio da microbiota e a inibição do desenvolvimento de
microrganismos patogênicos bucais.
Alimentos simbióticos tem sido citados por seus efeitos benéficos à saúde,
dentre os quais destacam-se: a redução de citocinas pró-inflamatórias, redução das
infecções intestinais, melhora do sistema imunológico, aumento da massa magra e
redução da massa gorda (RAIZEL et al., 2011). Kojima et al. (2016) mostraram que
arabinose, xilose e xilitol apresentam potencial para serem utilizados como
prebióticos associados a Lactobacillus probióticos, isolados da cavidade bucal e
capazes de inibir o crescimento de C. albicans e P. gingivalis, além de reduzirem a
produção de glucano insolúvel por S. mutans.
Dentre os prebióticos encontram-se diversas farinhas de origem vegetal,
como a farinha de banana verde. Borges; Pereira; Lucena (2009) relataram que a
farinha de banana verde é rica em amido, proteína, potássio, fósforo, magnésio,
cobre, manganês e zinco. Apresenta alto valor calórico, possui pH, acidez total
titulável e vitamina C de acordo com os limites ideais quando comparada com outras
farinhas encontradas no mercado e pode ser utilizada para o enriquecimento dos
alimentos ou para substituir parcialmente a farinha de trigo, podendo ser empregada
na panificação, confeitaria, no processamento de alimentos infantis e dietéticos.
Com o objetivo de avaliar os efeitos do consumo regular de farinha de banana
verde sobre o funcionamento intestinal, foi empregado o questionário
8
Gastrointestinal Symptom Rating Scale (GSRS), composto por questões
relacionadas com sintomas gastrointestinais antes e após um período de seis
semanas de consumo regular (três vezes por semana) de farinha de banana verde.
Após esse período, o grupo que consumiu a farinha de banana verde apresentou
redução na consistência das fezes, relatou redução de dores abdominais e redução
da sensação de esvaziamento incompleto do intestino, com diferença significativa
quando comparado ao grupo controle, sem aumento de qualquer sintoma
gastrintestinal negativo como náuseas, distensão abdominal, azia, refluxo e diarréia
(NEGRINI et al., 2013).
Menezes et al. (2013) avaliaram a influência do consumo regular de sopas
congeladas adicionadas de ingredientes funcionais como a farinha de banana verde
e inulina. Os autores observaram que a ingestão energética diária diminuiu nesses
grupos quando comparados com o grupo que não consumiu o ingrediente funcional
na sopa.
3.3. Efeito de alimentos probióticos na saúde bucal
Na última década, vários pesquisadores discutiram a relevante aplicação de
probióticos para fins de saúde bucal (HAUKIOJA, 2010; MAKINO et al., 2014; TONG
et al., 2012; BHALLA et al., 2015) e os resultados tem sugerido que eles apresentam
potencial para prevenção e tratamento de doenças bucais (BONIFAIT; CHANDAD;
GRENIER, 2009, VIVEKANANDA; VANDANA; BHAH, 2010; PINTO, 2011;
GAGETTI et al., 2013; JOSE; PADMANABHAN; CHITHARANJAN, 2013) como a
cárie, patologias periodontais, halitose, candidíase e desmineralizações dentárias.
Estudos trazem uma variedade de novas estratégias para eliminação seletiva
de espécies bacterianas que são agentes etiológicos de doenças bucais (HERRERO
et al., 2016), uma vez que alternativas precisam ser criadas para superar a
resistência bacteriana aos antibióticos (O’NEILL, 2016), sendo os probióticos uma
opção promissora (FERNANDES et al., 2010; PINTO, 2011; BASTOS et al., 2012;
VISHNU, 2012; PRITHIKASIMON; KARTHIKEYAN, 2014; GUPTA; PRABHA, 2016).
De acordo com Guarner; Malagelada (2003) e Meurman (2005), os
microrganismos probióticos produzem metabólitos extracelulares como os ácidos,
9
peróxido de hidrogênio, bacteriocinas e substâncias antimicrobianas de baixo peso
molecular inibitórias do desenvolvimento de microrganismos potencialmente
patogênicos.
As bacteriocinas consistem em peptídeos produzidos por determinadas
bactérias que estão sendo estudadas por apresentarem potencial no tratamento e
prevenção da cárie dentária (CHIKINDAS et al., 1997; LOBOS; PADILLA; PADILA,
2009; TONG et al., 2012). São constituídas, normalmente, por 30 a 60 aminoácidos
e apresentam potente atividade antimicrobiana contra bactérias Gram-positivas,
promovendo a lise da membrana de tais microrganismos (GARNEAU; MARTIN;
VEDERAS, 2002).
De acordo com Tong et al. (2012), a espécie Lactococcus lactis em situação
de estresse nutricional e na presença de metabólitos excretados por S. mutans,
aumenta a expressão de genes relacionados à síntese da bacteriocina nisina, com
grande potencial para antagonizar o microrganismo potencialmente cariogênico S.
mutans da cavidade bucal.
Andersson; Hughes; Kubicek-Sutherland (2016) observaram que as
bacteriocinas produzidas por L. lactis ssp. lactis ITAL 383 e CNRZ 150 apresentam
um mecanismo de ação semelhante ao da nisina produzida por L. lactis ATCC
11454. Elas apresentaram efeito bactericida promovendo a lise de células de L.
innocua LIN 11, sobretudo das células em fase exponencial de crescimento.
O efeito da bacteriocina PsVP-10, do triclosan e de clorexidina também foram
objeto de estudo por Lobos; Padilla; Padilla (2009). Eles constataram um
interessante efeito sinérgico quando utilizaram a bacteriocina associada a
clorexidina, resultando em redução de microrganismos cariogênicos. O mecanismo
de ação sugerido para tal efeito bactericida consistiu na formação de poros na
membrana do potencial patógeno, o que facilitou a penetração da substância
antimicrobiana clorexidina, ocasionando danos ao citoplasma e destruição celular.
Os autores também observaram que algumas estirpes de S. mutans e S.
sobrinus não formaram biofilme quando em contato com estes antimicrobianos
provavelmente porque o gene que codifica glicosiltransferase não foi espresso. Os
autores reiteram a necessidade de pesquisas envolvendo o assunto tão pertinente.
10
De acordo com Burton et al. (2013), a estirpe Streptococcus salivarius M18
produz bacteriocinas contra espécies cariogênicas importantes, como S. mutans,
além de produzirem dextranase e urease, enzimas com potencial para reduzir a
acidificação do meio bucal, assim como, diminuir o acúmulo de placa bacteriana nos
dentes. Os autores concluíram que o consumo regular de S. salivarius M18 pode ser
benéfico para a saúde bucal.
De acordo com Pangsomboon et al. (2006), apesar de haver poucos estudos
sobre bacteriocinas purificadas de L. paracasei HL32 na literatura, elas são um
eficiente antimicrobiano para controle de P. gingivalis em uma concentração de 0,14
mM, eliminando o microrganismo patogênico em duas horas.
Entre os microrganismos probióticos, os dos gêneros Lactobacillus e
Bifidobacterium são os mais comumente utilizados comercialmente pela indústria de
alimentos (OUWEHAND; SALMINEN; ISOLAURI, 2002; TRIPATHI; GIRI, 2014),
sendo que ambos são considerados dominantes do intestino humano e apresentam
histórico de uso seguro, sendo conhecidos como GRAS, geralmente reconhecidos
como seguro (TRIPATHI; GIRI, 2014).
Lactobacillus e Bifidobacterium são gêneros bacterianos frequentemente
utilizados a nível tecnológico, sobretudo em produtos lácteos fermentados como o
iogurte, que em geral são boas matrizes para os probióticos (ÇAGLAR; KARGUL;
TONBOGA, 2005; SHAH, 2007; CILDIR et al., 2009), embora pesquisas também
sejam realizadas com a utilização de matrizes alimentares à base de frutas, legumes
e cereais, com resultados satisfatórios (BETORET et al., 2012; MARTINS et al.,
2013).
De acordo com Souza et al. (2011), há uma variedade de produtos
carreadores de diferentes microrganismos probióticos capazes de reduzir a
microbiota cariogênica da cavidade bucal e os alimentos funcionais podem ser uma
alternativa viável para prevenir patologias bucais. Os autores sugerem maior número
de investigações sobre o assunto para que os profissionais possam indicar os
probióticos com maior segurança.
Para se obter resultados satisfatórios com o uso de probióticos, é necessário
conhecer as melhores formas de administração e as dosagens para fins preventivos
11
ou terapêuticos, uma vez que os probióticos não podem colonizar a cavidade oral de
forma permanente e devem ser consumidos com frequência (ZAMBORI et al., 2014).
Diversos estudos têm sido realizados a fim de discutir a forma apropriada de
administração de probióticos na cavidade bucal (Quadro 1 e 2). Segundo Bastos et
al. (2012) o leite e seus derivados são os carreadores mais comuns, uma vez que
quando as bactérias são consumidas nos produtos lácteos, há uma diminuição da
produção de ácidos pela capacidade tamponante desses alimentos. Além disso, a
presença do cálcio, lactato de cálcio e outros componentes do leite são
considerados anticariogênicos e podem reduzir a colonização por patógenos
(CAGLAR et al., 2006; CILDIR et al., 2009). Assim, alimentos lácteos como queijo,
requeijão e leite podem carrear bactérias probióticas com potencial de melhorar a
saúde bucal de crianças por substituir bactérias patogênicas ali presentes (BHALLA
et al., 2015).
As principais doenças bucais são de origem infecciosa e afetam milhões de
pessoas no mundo todo. A cárie dentária, a doença periodontal e a candidíase
apresentam vários agentes etiológicos, entre eles os microrganismos S. mutans, P.
gingivalis e C. albicans. Acredita-se que a ocorrência dessas patologias deverá
aumentar na próxima década devido ao aumento da expectativa de vida das
pessoas e o aumento de pacientes imunodeficientes (KOJIMA et al., 2016).
Estudos tem sido realizados para identificar o potencial dos probióticos na
prevenção de cáries dentárias (NÄSE et al., 2001; MONTALTO, 2004; CAGLAR et
al., 2006; TONG et al., 2012; GAGETTI et al., 2013), na prevenção e tratamento da
candidíase bucal (NYANZI et al., 2014; ISHIKAWA et al., 2015), como coadjuvante
no tratamento periodontal (VIVEKANANDA; VANDANA; BHAT, 2010; BASTOS et
al., 2012; DHAWAN; DHAWAN, 2013), além de pesquisas avaliarem a contribuição
dos probióticos na redução do mau hálito (KELLER et al., 2012) e na prevenção de
desmineralizações dentárias e prevenção de lesões de manchas brancas em
pacientes em tratamento ortodôntico (PINTO, 2011; JOSE; PADMANABHAN;
CHITHARANJAN, 2013).
12
Quadro 1. Resumo de potenciais probióticos, veículos de base láctea utilizados e resultados encontrados em diferentes estudos.
Microrganismos Veículos Resultados Referências
L. rhamnosus GG Leite
Redução de S. mutans e de cáries
NÄSE et al. (2001)
L. rhamnosus GG
L. rhamnosus LC 705
Queijo
Redução do risco de altas contagens de S. mutans e de Candida sp. Redução de S. mutans no período pós-tratamento
AHOLA et al. (2002)
L. reuteri Iogurte Redução de S. mutans NIKAWA et al. (2004)
Bifidobacterium animalis ssp.
lactis DN- 173010
Iogurte de fruta
Redução de S. mutans. Não houve alteração de Lactobacillussp.
CILDIR et al. (2009)
L. rhamnosus LB2
Leite fluoretado (2,5 mg
de flúor.L)
Benefícios para a saúde Prevenção de cáries
STECKSÉN-BLICKS;
SJÖSTRÖM; TWETMAN
(2009)
Lactobacillus rhamnosus
LB21 Leite
Não se observou diferença significativa na microbiota da saliva ou da placa bacteriana supragengival
LEXNER et al. (2010)
L. casei Queijo
Não houve diferença significativa entre grupos probiótico e placebo para contagens de S. mutans e Lactobacillus sp. Queijo probiótico foi efetivo em indivíduos que inicialmente apresentavam altas contagens de S. mutans (>105 UFC.mL)
MORTAZAVI; AKHLAGHI
(2012)
Não especifica o
microrganismo probiótico
Coalhada e
dentifrício
Decréscimo na contagem de S. mutans na placa bacteriana ao redor de bráquetes ortodônticos após período de consumo de ambos os produtos probióticos
JOSE; PADMANABH
AN; CHITHARANJAN (2013)
Bifidobacterium animalis subsp.
lactis DN-173010
Iogurte
Contagens de S. mutans e de Lactobacillus sp. não alterou em pacientes ortodônticos, após consumo do produto
PINTO et al. (2014)
13
Quadro 2. Resumo de potenciais probióticos veiculados por produtos não lácteos e resultados encontrados em diferentes estudos.
Microrganismos Veículos Resultados
Referências
Lactobacillus sp.
Líquidos ou cápsulas
Não houve alteração na contagem de S. mutans. Aumento de Lactobacillus sp. na saliva.
MONTALTO et al. (2004)
Lactobacillus reuteri
ATCC 55730
Canudo e comprimido
Redução de S. mutans após consumo de probióticos por meio de ambos os veículos. Não houve alteração na contagem de Lactobacillus sp.
CAGLAR et al.
(2006)
L. reuteri ATCC 55730 e ATCC PTA
5289
Goma de mascar
Redução de citocinas pró-inflamatórias na cavidade oral.
TWETMAN et al. (2009)
Não
especifica o microrganismo probiótico
Enxaguatóri
o bucal
Produtos probióticos resultaram em menor acúmulo de placa bacteriana. Produto probiótico foi mais eficiente na redução da inflamação do que o produto com clorexidina.
HARINI;
ANEGUNDI (2010)
Lactobacillus reuteri
(Prodentis) DSM17938 e ATCC PTA
5289
Pastilhas
Efeito antinflamatório. Redução da placa bacteriana. Antimicrobiano.
VIVEKANANDA;
VANDANA; BHAT (2010)
Lactobacillus paracasei GMNL-33
Comprimido
Redução de S. mutans no período pós tratamento (após 2 semanas do consumo do probiótico).
CHUANG et al.
(2011) L. reuteri
DSM 17938 L. reuteri
ATCC PTA 5289
Goma de mascar
Redução do mau hálito - sugerido por escores sensoriais. Sugeriram que probióticos podem reduzir bactérias que produzem compostos voláteis sulfurados.
KELLER et al.
(2012)
L. reuteri DSM 17938 e
ATCC PTA 5289
Comprimido
Aumento significativo de Lactobacillus sp. após o período de consumo probiótico. Não houve alteração na contagem de S. mutans.
KELLER; TWETMAN (2012)
L. rhamnosus GG
L. reuteri Comprimido
Consumo de LGG e L. reuteri provavelmente não altera a acidogenicidade da placa bacteriana.
MARTTINEN et al. (2012)
14
Bosch et al. (2012) isolaram e caracterizaram estirpes de bactérias láticas da
cavidade bucal de crianças saudáveis, que possuíam boas propriedades probióticas,
como atividade antimicrobiana contra patógenos orais, capacidade de agregar e
aderir aos tecidos orais e alta tolerância a fatores estressantes da cavidade bucal. A
capacidade de produzir ácido lático foi descartada em tais estirpes. Os resultados
sugerem que, pelo menos sete das bactérias láticas isoladas apresentaram
propriedades promissoras para serem utilizadas como potenciais probióticos,
isoladamente ou como parte de uma fórmula para a melhoria da saúde bucal.
Koll et al. (2008), com o objetivo de caracterizar Lactobacillus sp. orais com
propriedades probióticas, isolaram e identificaram 67 Lactobacillus sp. a partir de
amostras de saliva e de amostras subgengivais de 11 indivíduos saudáveis. Foram
testadas a atividade antimicrobiana contra patógenos orais, a capacidade de tolerar
pH baixo, a presença de bile, a tolerância a lisozima e a sensibilidade a antibióticos.
Os pesquisadores demonstraram que as estirpes de L. plantarum, L. paracasei, L.
salivarius e L. rhamnosus apresentaram alta atividade antimicrobiana e alta
tolerância ao estresse da cavidade bucal. A maioria dos probióticos suprimiu o
crescimento de A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis, P. intermedia, S. mutans,
mas nenhum inibiu C. albicans. Lactobacillus toleraram uma alta concentração de
lisozima e, após quatro horas de incubação, o menor valor de pH tolerado foi de 2,5,
mas estas bactérias não cresceram neste pH. Os resultados sugeriram que alguns
Lactobacillus podem contribuir para a manutenção da saúde bucal.
A influência das bactérias probióticas na prevenção ou tratamento do mau
hálito também tem sido motivo de pesquisas na área odontológica. Keller et al.
(2012) avaliaram 25 adultos com relato de mau hálito pela manhã. Os mesmos
foram instruídos a mastigar uma goma de manhã e uma à noite, contendo L. reuteri
DSM 17938 ou L. reuteri ATCC PTA 5289 ou goma placebo. As pontuações
sensoriais foram significativamente menores no grupo que consumiu o produto
probiótico, em comparação com o grupo placebo, o que demonstrou que gomas de
mascar probióticas podem ter algum efeito benéfico sobre as bactérias que
produzem compostos voláteis sulfurados, responsável pelo mau hálito. Foi
observado também que não houve efeitos colaterais adversos.
15
3.3.1. Potencial de bactérias probióticas na prevenção de lesões cariosas
A cárie dentária é uma das doenças mais prevalentes no mundo
(REBOLEDO; ROJAS; SALGADO, 2013). Apresenta etiologia multifatorial e entre os
fatores causais estão os microrganismos, essenciais para o desenvolvimento da
lesão. S. mutans é considerado o principal responsável pela instalação do processo
de cárie na cavidade bucal, sendo que as espécies S. mutans e S. sobrinus estão
entre os microrganismos potencialmente cariogênicos em humanos. Lactobacillus
sp. estão associados com a evolução da doença (LEITES; PINTO; SOUSA, 2006).
Diversas outras patologias, além da cárie, podem ocorrer na cavidade bucal e
microrganismos distintos são responsáveis pelo seu desenvolvimento.
A prevenção da cárie dentária ocorre por meio de uma eficiente higienização
e da utilização de produtos fluorados, como o dentifrício, que interferem no processo
de desmineralização-remineralização (DES-RE) da superfície do esmalte dentário.
Outra forma de abordar a prevenção da doença, tem sido direcionado à modificação
da ecologia do biofilme, sobretudo no que se refere à S. mutans (BEIGHTON, 2009).
Caglar et al. (2006) avaliaram o efeito da ingestão diária de L. reuteri ATCC
55730 nas contagens de S. mutans e Lactobacillus sp., com a utilização de dois
veículos de administração diferentes, canudo e comprimido e verificaram redução de
S. mutans em ambos os tratamentos em contraste com o grupo controle. Resultado
semelhante foi encontrado por Çaglar et al. (2008), que observaram decréscimo
significativo na contagem de S. mutans da saliva após o consumo diário de sorvetes
contendo Bifidobacterium lactis Bb-12 por 24 adultos saudáveis.
Reboledo; Rojas; Salgado (2013) avaliaram o efeito de duas estirpes de L.
casei variedade rhamnosus LCR 32 e Lactobacillus johnsonii LA1 sobre o
crescimento in vitro de S. mutans e observaram inibição significativa da bactéria
cariogênica. Çaglar; Kargul e Tonboga (2005) relataram ter encontrado L.
rhamnosus GG na saliva de indivíduos que consumiram o probiótico após duas
semanas de interrupção do uso do mesmo.
Com o objetivo de avaliar se a estirpe de L. paracasei GMNL-33 pode reduzir
as contagens de patógenos associados à cárie, 78 adultos entre 20 a 26 anos
consumiram comprimido oral contendo o probiótico 3 vezes ao dia, por duas
16
semanas. As contagens de S. mutans, Lactobacillus sp. e a capacidade tampão da
saliva foram determinadas no início (T1), quando pararam de usar a medicação (T2),
e 2 semanas após o término de uso da medicação (T3). Entre T1 e T2 não houve
efeito inibitório contra S. mutans. No entanto, foi detectada uma redução significativa
na contagem deste microrganismo entre T2 e T3, o que sugere que um período de
duas semanas de medicação oral é necessário para se obter eficácia na ação
probiótica contra patógenos relacionados à cárie (CHUANG et al., 2011).
Caglar et al. (2007) compararam o efeito de gomas de mascar com xilitol e
gomas probióticas sobre os microrganismos S. mutans e Lactobacillus sp.. Um total
de 80 indivíduos adultos participaram do ensaio e foram divididos em 4 grupos, (a)
goma probiótica, (b) goma com xilitol, (c) goma probiótica e xilitol e (d) goma
placebo. A frequência de uso foi três vezes por dia, três vezes por semana. As
estirpes probióticas utilizadas foram L. reuteri ATCC 55730 e ATCC PTA 5289,
ambas numa população de 108 UFC por goma. A mastigação diária da goma
probiótica e da goma contendo xilitol reduziu a contagem de S. mutans de forma
significativa, sendo que o mesmo não ocorreu no grupo controle ou no grupo em que
associou-se xilitol e probiótico.
Aproximadamente um terço dos pacientes que fazem tratamento com
aparelhos ortodônticos têm pelo menos uma lesão branca de desmineralização
dentária (WILLMOT, 2008). Cerca de 25% dos pacientes submetidos a tratamento
ortodôntico avaliados por Julien; Buschang; Campbell (2013) desenvolveram lesões
de mancha branca. Apesar dos avanços na Odontologia e do desenvolvimento de
aparelhos ortodônticos com design menos retentivo e de melhor qualidade,
alternativas para evitar a ocorrência de desmineralizações dentárias são uma
necessidade para pacientes e ortodontistas.
Jose; Padmanabhan; Chitharanjan (2013) compararam a eficácia do uso
sistêmico e da aplicação tópica de produtos veiculadores de probióticos sobre a
saúde bucal de pacientes ortodônticos. Os autores observaram uma redução
significativa de S. mutans na placa bacteriana ao redor dos bráquetes nos pacientes
que consumiram coalhada probiótica e no grupo que utilizou o dentifrício probiótico
se comparados ao grupo controle, que não utilizou nenhum produto probiótico. O
17
estudo mostrou que os probióticos podem controlar e prevenir desmineralizações
dentárias em pacientes que utilizam aparelho ortodôntico.
Cildir et al. (2009) verificaram que Bifidobacterium animalis subsp. lactis DN-
173010 consumidos no iogurte de fruta por um curto período de tempo podem
reduzir as contagens de S. mutans na saliva em pacientes submetidos a tratamento
com aparelhos ortodônticos. Os autores não encontraram alterações significativas
na contagem de Lactobacillus. Porém, Pinto (2011) não encontrou redução
significativa da contagem de S. mutans nos biofilmes dentários ou na saliva de
pacientes ortodônticos que consumiram iogurte contendo o probiótico B. animalis
subespécie lactis DN-1173010 por um período de duas semanas.
Souza (2010) que não observou redução significativa na contagem de S.
mutans em amostras de saliva de indivíduos que consumiram diariamente o
probiótico B. animalis 173010 por 36 dias.
Um estudo realizado com 594 crianças de 1 a 6 anos, em 18 creches
municipais constatou que o leite com L. rhamnosus GG apresentou um efeito
positivo sobre o risco de cárie em crianças quando comparado com o leite normal.
As crianças consumiram leite cinco dias por semana, nas creches, durante sete
meses. A saúde bucal foi avaliada no início e no final do experimento, de acordo
com critérios da Organização Mundial da Saúde. O risco de cárie foi calculado com
base em dados clínicos e microbiológicos, compreendendo contagens de S. mutans
da placa dental e saliva. Os resultados evidenciaram redução de cárie e menores
contagens do potencial patógeno no final do estudo (NÄSE et al., 2001).
Schwendicke et al. (2014) não observaram efeito inibitório contra S. mutans
por L. rhamnosus GG em estudo in vitro.
A administração de S. salivarius M18 também pode ser uma alternativa
segura para prevenir o acúmulo de placa bacteriana em crianças. Os resultados
demonstraram que, apesar de não ter havido uma redução na contagem de
microrganismos específicos, um subgrupo que apresentou uma colonização
persistente com S. salivarius M18 teve redução da contagem de S. mutans, o que
indicou a melhoria da eficácia do probiótico a partir do seu consumo regular
(BURTON et al., 2013).
18
Ahola et al. (2002) avaliaram se o consumo de queijo contendo L. rhamnosus
GGATCC 53103 e L. rhamnosus LC 705 por um curto período de tempo diminuiria a
contagem microbiana da cavidade bucal de adultos. Os resultados mostraram que
houve redução significativa de S. mutans no pós-tratamento no grupo que consumiu
o queijo probiótico em comparação com o grupo controle. Os resultados indicaram
que a utilização dos probióticos pode reduzir as contagens de S. mutans.
Steckén-Blicks; Sjöström; Twetman (2009) concluíram que o consumo a longo
prazo de leite adicionado de L. rhamnosus LB21 contendo 107 UFC.mL-1 e 2,5 mg
flúor.mL-1 reduziu em torno de 75% a ocorrência de cárie em crianças pré-escolares,
além de observarem efeitos benéficos evidentes à saúde geral das crianças.
O potencial antagonista de Lactobacillus isolados da saliva humana foi
avaliado por Samot ; Badet (2013) frente a microrganismos cariogênicos (S. mutans
e Actinomyces viscosus) e periodontopatogênicos (P. gingivalis ATCC33277 e
Fusobacterium nucleatum ATCC1095). S. mutans e A. viscosus foram inibidos por
todos os Lactobacillus testados, porém, L. plantarum (BMS2), Lactobacillus brevis
(22A, 31A, 57A1), L. rhamnosus (34A) e L. paracasei (CJS1) inibiram todos os
quatro patógenos com grandes halos de inibição.
Teanpaisan; Piwat; Dahle ́N (2011) demonstraram que determinados
Lactobacillus coletados da cavidade bucal de crianças apresentam grande
capacidade para inibir, in vitro, microrganismos cariogênicos e
periodontopatogênicos. L. paracasei SD1, L. casei SD2, L. salivarius SD3, L
plantarum SD4, L. rhamnosus SD5 e L. fermentum apresentaram grande capacidade
para inibir S. mutans, S. sobrinus, P. gingivalis e A. actinomycetemcomitans, o que
demonstrou o potencial das bactérias láticas na prevenção de patologias bucais.
3.3.2. Influência dos probióticos na saúde periodontal
As doenças periodontais são classificadas em gengivites e periodontites. A
gengivite caracteriza-se por inflamação das gengivas, enquanto que a periodontite
consiste em uma doença progressiva, que afeta destrutivamente os tecidos de
sustentação dos dentes (PRITHIKASIMON; KARTHIKEYAN, 2014). Além disso, a
periodontite crônica está relacionada com o aumento do risco de ocorrência de
19
doenças sistêmicas (PIHLSTROM; MICHALOWICZ; JOHNSON, 2005;
HAJISHENGALLIS, 2015).
Socransky et al. (1998) classificaram as espécies bacterianas envolvidas na
iniciação e progressão das desordens periodontais e as dividiram em cinco
complexos representados por cor, baseados na patogenicidade e no papel desses
microrganismos no processo de formação e desenvolvimento da placa bacteriana. O
primeiro foi o complexo vermelho representado por Porphyromonas gingivalis,
Treponema denticola, Tannerella forsythia, cujas espécies bacterianas estavam
relacionadas com lesões mais avançadas, encontradas sobretudo em bolsas
periodontais profundas de indivíduos com periodontite. Os microrganismos do
segundo complexo, denominado Complexo laranja (Fusobacterium nucleatum,
Fusobacterium periodonticum, Prevotella intermedia, Prevotella nigrescens,
Peptostreptococcus micros, Eubacterium nodatum, Campylobacter rectus,
Campylobacter showae, Streptococcus constellatus e Campylobacter gracilis)
estavam muito associados entre si e com os do complexo vermelho e relacionados
com desenvolvimento de bolsas periodontais mais profundas. Nos complexos verde
(Eikenella corrodens, Capnocytophaga sp., Campylobacter concisus, A.
actinomycetemcomitans sorotipo A), amarelo (Streptococcus mitis, Streptococcus
sanguis e Streptococcus oralis) e roxo (Actinomyces odontolyticus e Veillonella
parvula) encontram-se os microrganismos detectados na superfície dentária em
estágios precoces da formação do biofilme dental e constituem a base da pirâmide
da placa bacteriana. Actinomyces viscosus, Selenomonas noxia e A.
actinomycetemcomitans sorotipo B apresentaram-se discrepantes dos demais e não
se enquadraram em nenhum grupo.
O processo patológico da doença periodontal é induzido por uma microbiota
complexa, sobretudo bactérias do complexo vermelho P. gingivalis, T. forsythia e T.
denticola com a produção de um processo inflamatório acentuado
(PRITHIKASIMON; KARTHIKEYAN, 2014; TANAKA et al., 2015), em resposta aos
diferentes fatores de virulência que esses microrganismos apresentam e que
agridem constantemente os tecidos de suporte. Dessa forma, a resposta imune do
hospedeiro é um fator determinante na progressão da doença (HOULE; GRENIER,
2003).
20
P. gingivalis consiste em uma das bactérias bucais mais estudadas.
Apresenta-se em conformação de bastonete e caracteriza-se por ser Gram-negativa,
anaeróbia e não esporulada (HOLT et al., 1999). Devido à propriedade sacarolítica,
obtêm nutrientes a partir de pequenos peptídeos clivados de proteínas do
hospedeiro e o uso de proteases ou outros fatores de virulência beneficia-o dentro
de uma comunidade polimicrobiana (ZENOBIA; HAJISHENGALLIS, 2015).
Parece haver um consenso que a ocorrência de infecções periodontais
severas depende não somente da capacidade virulenta da estirpe, mas, também, da
contagem microbiana presente. Dessa forma, a quantificação de bactérias bucais
por técnicas de biologia molecular pode ser de grande relevância para determinar a
abundância com que determinado microrganismo invade o tecido (LYONS,
GRIFFEN; LEYS, 2000; MORILLO et al., 2003).
A eliminação da placa bacteriana consiste no principal objetivo do tratamento
convencional. No entanto, novas abordagens capazes de modular a imunidade são
necessárias para pacientes acometidos por periodontite agressiva e pela
periodontite refratária ao tratamento convencional (HOULE; GRENIER, 2003).
A terapia pelo uso de probióticos consiste em impedir que a microbiota
patogênica prevaleça e cause gengivite ou periodontite, além de serem capazes de
modular a resposta imune local (DHAWAN; DHAWAN, 2013). A redução de
determinados microrganismos relacionados com a doença periodontal ocorre devido
ao potencial antagonista dos probióticos, seja pela inibição da adesão de patógenos,
da colonização e formação de biofilme bacteriano, além da inibição do crescimento
de bactérias patogênicas devido à produção de diversas substâncias, tais como
bacteriocinas, ácidos orgânicos e peróxido de hidrogênio. Além disso, os probióticos
tem efeito sobre a resposta imunológica do hospedeiro e podem inibir a produção de
colagenases, reduzir a inflamação, prevenir a apoptose induzida por citocina, além
de modular a resposta imune do indivíduo (PRITHIKASIMON; KARTHIKEYAN,
2014).
Assim, é possível considerar que, reduzindo-se a colonização de bactérias
periodontopatogênicas, a cascata de reações imunoinflamatórias pode também ser
menor, com menos danos aos tecidos e os probióticos possam contribuir como
coadjuvante no tratamento da doença periodontal (MAKINO et al., 2014).
21
Vivekananda; Vandana; Bhat (2010) avaliaram os efeitos de L. reuteri
isoladamente e em combinação com tratamento periodontal de raspagem e
alisamento radicular. Para tal, dividiram a boca em quadrantes, nos quais os dois
quadrantes direitos receberam a terapia de raspagem periodontal e os outros dois
quadrantes esquerdos não. Foram fornecidas pastilhas contendo L. reuteri
DSM17938 associado com L. reuteri PTA 5289 (Prodentis) com contagem de 108
UFC por pastilha de cada microrganismo ou as pastilhas placebo, ambas ingeridas
duas vezes ao dia. Foram avaliados os parâmetros: índice de placa, índice gengival,
índice de sangramento gengival, profundidade de sondagem, nível clínico de
inserção e contagens microbiológicas dos patógenos A. actinomycetemcomitans, P.
gingivalis e P. intermedia. O estudo confirmou a redução de placa bacteriana, assim
como efeitos antinflamatórios e antimicrobianos de L. reuteri (Prodentis) e
considerou que, mediante os benefícios encontrados, tal probiótico pode contribuir
como um coadjuvante ou como uma alternativa para o tratamento periodontal.
Para investigar o efeito de uma goma de mascar contendo bactérias
probióticas sobre a inflamação gengival e nos níveis de mediadores inflamatórios no
fluido crevicular gengival, Twetman et al. (2009) avaliaram 42 adultos saudáveis com
inflamação gengival moderada. As gomas de mascar continham duas estirpes de L.
reuteri ATCC 55730 e ATCC PTA 5289 com 108 UFC por goma, respectivamente.
Os indivíduos foram instruídos a mastigar a goma durante 10 minutos, ao longo de
duas semanas. Foi avaliado o sangramento à sondagem e realizada a amostragem
do líquido crevicular no início do estudo e após uma, duas e quatro semanas. A
redução de citocinas pró-inflamatórias no líquido crevicular demonstrou a ação do
probiótico no combate à inflamação na cavidade oral.
Harini; Anegundi (2010) observaram que o enxaguatório bucal com probiótico
reduziu o acúmulo de placa bacteriana e inflamação gengival em crianças, o que
encorajou os autores a reconhecerem o valor terapêutico do produto e
recomendaram mais estudos, sobretudo a longo prazo para determinar a sua
eficácia.
22
3.3.3. Influência dos probióticos na prevenção e tratamento de candidíase na
cavidade bucal
Entre as espécies de cândida, C. albicans é a encontrada com mais
frequência na cavidade bucal e em outras regiões do corpo de indivíduos saudáveis
(WECKWERTH et al., 2012). A presença de C. albicans na cavidade bucal tem sido
demonstrada em diversos estudos (ISHIKAWA, 2011; MENDONÇA et al., 2012;
MARTINS et al., 2016).
Ishikawa (2011) constatou que 37% dos indivíduos pesquisados
apresentavam Candida sp., de forma subclínica, enquanto que entre as espécies de
Cândidas isoladas e identificadas por Martins et al. (2016) em próteses dentárias, C.
albicans foi o microrganismo encontrado com mais frequência (63%). Essas
leveduras tem capacidade de formar biofilme, tanto com uma única espécie, quanto
em associação com outras espécies de cândida.
O usuário de prótese total é um candidato em potencial a apresentar irritação
na mucosa oral e estomatite protética. Alguns materiais odontológicos para
reembasamento de próteses apresentam propriedades físicas que favorecem o
acúmulo de placa e facilitam a instalação da levedura (MARTINS et al.,2016),
sobretudo em pessoas idosas mais propensas a apresentar fatores predisponentes,
como baixa imunidade, deficiência de higienização e má adaptação da prótese
dentária (SHAY; TRUHLAR; RENNER, 1997).
De acordo com Ohshima et al. (2016), Candida sp. convive em simbiose com
outros microrganismos no organismo humano, inclusive na cavidade oral. No
entanto, quando há um desequilíbrio na microbiota, apresenta potencial para
desenvolvimento de infecções fúngicas definidas como candidíase (SHAY;
TRUHLAR; RENNER, 1997; HATAKKA et al., 2007; ISHIKAWA et al., 2015), o que
pode ser um fator de risco para o indivíduo imunodeficiente, e o predispõe a
infecções fúngicas invasivas (ISHIKAWA et al., 2015).
O tratamento convencional com nistatina ou nitrato de miconazol, de duas a
três vezes ao dia, por 15 dias é eficaz, no entanto, alguns idosos relataram certo
desconforto gastrointestinal com o uso da medicação. Por outro lado, tem-se
valorizado as ações preventivas, assim como, tratamentos alternativos que
23
proporcionem a melhoria da qualidade de vida (ISHIKAWA, 2011), sendo a
manutenção do equilíbrio da microbiota uma estratégia preventiva contra o
desenvolvimento de infecções oportunistas bucais (MENDONÇA et al., 2012).
De acordo com Ohshima et al. (2016), os produtos simbióticos apresentam
potencial terapêutico contra a candidíase. Os prebióticos atuam estimulando a
multiplicação de microrganismos benéficos, em detrimento aos potenciais patógenos
presentes na cavidade bucal e representam uma boa alternativa de prevenção e
tratamento para esses pacientes (ISHIKAWA, 2011; NYANZI et al., 2014), enquanto
que os probióticos desempenham proteção local contra agentes patogênicos e
produzem um efeito indireto no fortalecimento da imunidade do hospedeiro. Enfim,
produtos simbióticos são uma alternativa para a manutenção da saúde (OHSHIMA
et al., 2016; HATAKKA et al., 2007).
Nyanzi et al. (2014) observaram que compostos alcoólicos extraídos de
células probióticas liofilizadas de estirpes de Lactobacillus tem elevada ação
antifúngica contra C. albicans e podem contribuir com um efeito terapêutico,
enquanto Hatakka et al. (2007) observaram que bactérias probióticas adicionadas
em queijo podem ser eficazes no controle de cândida oral e hipossalivação nos
idosos .
Ishikawa et al. (2015) avaliaram 59 indivíduos que apresentavam cândida na
cavidade bucal e eram usuários de prótese total. Os voluntários foram orientados a
colocar o conteúdo de uma cápsula contendo L. rhamnosus HS111, L. acidophillus
HS101 e Bifidobacterium bifidum diariamente na superfície palatina da prótese. O
grupo controle recebeu cápsulas placebo. Amostras da mucosa foram avaliadas
antes e após cinco semanas de tratamento e detectou-se cândida em apenas 16,7%
no grupo que recebeu probiótico,enquanto que o grupo controle apresentou 92%. Os
autores sugeriram que o produto pode representar um tratamento alternativo contra
Candida ssp. para usuários de próteses.
Os resultados do estudo de Mendonça et al. (2012) demonstraram que
produtos probióticos apresentam potencial para manutenção do equilíbrio da
microbiota, eliminando algumas espécies de Candida sp. com potencial patogênico
evitando-se, dessa forma, a instalação de infecções oportunistas. Os autores
observaram que após 30 dias de consumo, três vezes por semana dos probióticos
24
Lactobacillus casei e de Bifidobacterium brevis não se detectou a levedura em
alguns indivíduos ou, em outros, observou-se uma redução na contagem de cândida
na cavidade oral. Para os pesquisadores, é possível que a eliminação ou a redução
de cândida tenha ocorrido devido a estimulação imunológica secretora, uma vez que
observou-se um aumento significativo nos níveis de IgA específica anti cândida.
3.4. A técnica de hibridização in situ fluorescente para identificação e
quantificação de microrganismos da saliva
A técnica de FISH (Fluorescence in situ Hybridization) foi introduzida há mais
de 20 anos por Giovannoni et al. (1988), em um estudo em que utilizavam sondas
radioativas de oligonucleotídeos de RNAr para detecção microscópica de bactérias.
Consiste em uma técnica de biologia molecular que identifica e quantifica
microrganismos com a utilização de sondas com marcadores fluorescentes
específicos para cada espécie ou grupos microbianos (MOTER; GÖBEL, 2000;
DEL’DUCA; CÉSAR, 2007; DEL’DUCA, 2013). As sondas construídas a partir de
oligonucleotídeos de RNAr são mais comumente utilizadas devido à propriedade
conservativa deste RNA e por estar presente em todos os organismos. Fluorocromos
como o Cy3 (carbocianina), podem ser utilizados como marcadores das
sondas(AMANN; KRUMHOLZ; STAHL, 1990; DEL’DUCA; CÉSAR, 2007).
Para a realização da técnica são necessários os procedimentos de fixação da
amostra, preparo da amostra, hibridização, lavagem dos filtros para remoção do
excesso de sonda; montagem, visualização e documentação dos resultados das
contagens (MOTER; GÖBEL, 2000). A Figura 1 ilustra as etapas dos procedimentos
necessários para a execução da técnica de FISH.
Os resultados podem ser visualizados por microscopia de epifluorescência,
confocal ou ainda, em citometria de fluxo (ZWIRGLMAIER, 2005; DEL’DUCA;
CÉSAR, 2007). A técnica possibilita a visualização, identificação, quantificação e
localização de microrganismos em uma microbiota normal ou alterada (MOTER;
GÖBEL, 2000) além de permitir a reconstrução do arranjo espacial de comunidades
de bactérias em seu habitat (SCHILLINGER et al., 2012).
25
Figura 1. Etapas básicas da FISH. Fonte: AMANN; FUCHS (2008).
A cavidade bucal apresenta uma diversidade microbiana de,
aproximadamente, 300 espécies, muitas delas de difícil crescimento em meio de
cultura convencional e com potencial para serem identificados por FISH (MOTER;
GÖBEL, 2000), que apresenta resultados altamente confiáveis desde que cuidados
sejam tomados durante a execução do método para se evitar possíveis problemas
(MARTÍNEZ; OTERO, 2013). Alguns trabalhos utilizam tal técnica para identificação
e quantificação da microbiota bucal cariogênica ou periodontopatogênica (SUNDE et
al., 2003; COLOMBO et al., 2007; MACHADO et al., 2012; SCALONI, 2013;
HARIRIAN et al., 2014; LEMOS, 2014; CARRADA, 2015).
Sunde et al. (2003) utilizaram a técnica FISH em associação com microscopia
de epifluorescência e microscopia confocal de varredura à laser para pesquisar
microrganismos em lesões periapicais de dentes sem sintomas de dor. Os autores
observaram diferentes morfologias de bactérias, formando agregados ou
26
microcolônias em 50% das lesões. Sondas espécies-específicas permitiram a
identificação de P. gingivalis, P. intermedia, T. forsythia e Treponemas, além de
terem constatado Streptococcus em algumas lesões. Uma variedade de outras
espécies estavam presentes, mas não puderam ser identificadas, demonstrando a
diversidade microbiana no interior das lesões.
Dige et al. (2007) estudaram as populações microbianas em desenvolvimento
nos biofilmes bucais, por meio da aplicação da técnica FISH, além da microscopia
eletrônica de varredura. Foram utilizadas sondas específicas para Streptococcus
(STR405) e para o grupo de outras bactérias (EUB338) que permitiram a
diferenciação dos microrganismos e a determinação da sua organização espacial.
Com o emprego da técnica FISH, foram obtidas informações adicionais às
conhecidas previamente por métodos de microscopia eletrônica clássica, o que
aumentou a compreensão dos autores sobre a estrutura de biofilmes em
desenvolvimento.
Colombo et al. (2007) utilizaram a FISH e a microscopia para detectar P.
gingivalis, A. actinomycetemcomitans, T. forsythia e T. denticola em células do
epitélio de bolsas periodontais, do sulco gengival e da mucosa bucal. Amostras
foram coletadas de 14 indivíduos com periodontite crônica e de 8 pessoas com boa
saúde periodontal. Os resultados demonstraram que bactérias estão presentes na
mucosa bucal e no sulco gengival independente da presença ou não de patologia
periodontal. No entanto, observou-se contagens bacterianas mais elevadas em
indivíduos com periodontite.
De acordo com Haririan et al. (2014), a coleta de amostras subgengivais tem
sido utilizada para a determinação de bactérias periodontopatogênicas. No entanto,
a amostragem de microrganismos na saliva permite a quantificação de vários grupos
microbianos de forma simples e seu uso pode ser um indicador representativo do
potencial de risco para o desenvolvimento de alterações no periodonto.
27
4. MATERIAL E MÉTODOS
O presente estudo foi desenvolvido no Departamento de Ciência e Tecnologia
de Alimentos do Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Sudeste de
Minas Gerais (IF Sudeste MG), Campus Rio Pomba, em parceria com a
Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF) e Instituto Federal de Educação,
Ciência e Tecnologia do Sudeste de Minas Gerais (IF Sudeste MG), Campus Juiz de
Fora.
As análises microbiológicas dos produtos foram realizadas no Laboratório de
Microbiologia de Alimentos do IF Sudeste MG, Campus Rio Pomba, e as análises de
identificação e quantificação das espécies microbianas presentes nas amostras de
saliva foram realizadas pela técnica de FISH, no Laboratório de Ecologia e Biologia
Molecular de Microrganismos (LEBIOMM), do Instituto de Ciências Biológicas da
Universidade Federal de Juiz de Fora. A contagem dos microrganismos presentes
nas amostras foi realizada por meio de microscopia de epifluorescência, no
Laboratório de Microbiologia do Departamento de Biologia do IF Sudeste MG,
Campus Juiz de Fora.
O trabalho foi conduzido em três etapas. Na primeira, realizou-se ensaio in
vitro, com o objetivo de identificar os probióticos com capacidade de inibir potenciais
patógenos bucais. Na segunda etapa, elaborou-se petit suisse adicionado de farinha
de banana verde (controle) e o adicionado de farinha de banana verde e L. casei
(probiótico). Na terceira etapa esses produtos foram administrados às crianças e
suas salivas coletadas em diferentes tempos a fim de se identificar e quantificar os
microrganismos presentes nas suas cavidades orais.
4.1. Ensaio in vitro
Foram realizados testes preliminares in vitro, com o objetivo de identificar
bactérias láticas (BAL) probióticas com a melhor capacidade de inibir
microrganismos potencialmente patogênicos bucais (Tabela 1).
28
Tabela 1 - Microrganismos utilizados para o ensaio in vitro no teste de antagonismo.
Bactérias láticas Microrganismos potencialmente
patogênicos bucais
L. rhamnosus INCQS 00223 (ATCC 9595)
L. rhamnosus ATCC 7469
L. paracasei subsp. paracasei INCQS 00222 (ATCC 335)
L. acidophilus INCQS 00076 (ATCC 4356)
L. acidophilus (LA-5 CHR HANSEN)
L. casei (L. casei-01 CHR HANSEN)
L. rhamnosus (LRB SACCO)
S. mutans ATCC 25175
S. sobrinus ATCC 27351
Eikenella corrodens ATCC 23834
A. actinomycetemcomitans INCQS 00078ATCC 29522
C. albicans INCQS 40006 (ATCC 10231)
C. albicans INCQS 40260 (ATCC 24433)
Primeiramente, as bactérias láticas foram reativadas em caldo de Man
Rogosa e Sharpe- MRS (Merck KGaA, Germany) e os potenciais patógenos bucais
em caldo Infusão de Cérebro e Coração - BHI (HiMedia Laboratories Pvt. Ltda.,
Mumbai, Índia). Para ativação, as culturas foram repicadas três vezes consecutivas
com incubação a 37 oC por 24 horas. Foram realizadas transferências de 0,1 mL de
cada cultura do primeiro tubo para o tubo seguinte, incubados por 24 horas à 37 oC,
até completar três reativações. Para as duas estirpes de C. albicans, que estavam
liofilizadas, os inóculos foram reidratados inicialmente com água Mili-Q e, em
seguida, a etapa de reativação foi realizada com a utilização de caldo Sabouraud à
2% de glicose, tendo sido as temperaturas de incubação de 25 oC para C. albicans
ATCC 10231 e de 35 oC para C. albicans ATCC 24433, ambas foram incubadas por
24 horas.
Após a ativação, o excedente das culturas utilizadas para o teste do
antagonismo foi transferido para criotubos estéreis contendo glicerol à 50% e
armazenados em ultrafreezer à -80 oC para estoque e enriquecimento do acervo da
coleção de cultura de microrganismos do Laboratório de Microbiologia de Alimentos
do IF Sudeste MG, Campus Rio Pomba. O protocolo de ativação dos
microrganismos foi realizado conforme a Tabela 2.
29
Tabela 2 - Condições de ativação utilizadas previamente ao teste de antagonismo
Microrganismo Meio de
cultura (caldo)
Tempo de incubação
(horas)
Condição de incubação (oC)
A. actinomycetemcomitans ATCC
29522 BHI 24-48 37/ microaerofilia
S. mutans ATCC 25175 BHI 24 37/ aerobiose
S. sobrinus ATCC 27351 BHI 24 37/ aerobiose
E. corrodens ATCC 23834 BHI 24 37/ aerobiose
C. albicans ATCC 10231 Sabouraud 2%
glicose 48 25/ aerobiose
C. albicans ATCC 24443 Sabouraud 2%
glicose 48 35/ aerobiose
L. rhamnosus ATCC 7469 MRS 24-48 37/ microaerofilia
L rhamnosus ATCC 9595 MRS 24 37/ microaerofilia
L. acidophillus ATCC 4356 MRS 24-48 37/ microaerofilia
L. paracasei ssp. paracasei
ATCC 335 MRS 24-48 37/ microaerofilia
L. casei (L. casei-01) MRS 24-48 37/ microaerofilia
L. rhamnosus (LRB) MRS 24-48 37/ microaerofilia
L. acidophillus (LA-5) MRS 24-48 37/ microaerofilia
A atividade antagonista foi realizada pelo teste spot on the lown (teste da
gota), utilizando-se as BAL frente aos potenciais patógenos, de acordo com
metodologia realizada no trabalho de Nogueira (2013) com adaptações.
Após a ativação das culturas, procedeu-se com a etapa de padronização da
concentração celular com a utilização, para as bactérias láticas, da solução padrão 2
da escala de Mc Farland (6,0 x 108 UFC.mL-1) e para os potenciais patógenos
bucais, da solução padrão 1 de Mc Farland (3,0 x 108 UFC.mL-1). Para a
padronização do inóculo, as culturas ativadas foram submetidas à centrifugação
(centrífuga Sorvall Biofuge Stratos, EUA) à 7000 rpm por 15 minutos a 5 oC. Após
este processo, desprezou-se o sobrenadante e o pellet foi acrescido de solução
salina estéril (0,1%). Uma pequena alíquota dessa solução foi adicionada em um
30
tubo com solução salina estéril até se obter a turbidez representativa da escala de
Mc Farland.
Posteriormente, 2 µL de cada bactéria lática padronizada foi colocada em um
ponto da placa com ágar MRS (KASVI, Itália) e incubada a 37 ºC por 18-24 horas
em jarra de anaerobiose. Os pontos de inoculação nas placas foram previamente
identificados com as iniciais das culturas dos microrganismos inoculados.
Repetiu-se então o mesmo processo de padronização, descrito anteriormente
para as BAL, para as culturas potencialmente patogênicas. Em seguida, uma
sobrecamada de 8 mL de ágar BHI (HiMedia Laboratories Pvt. Ltda., Mumbai, India)
semissólido, contendo 0,8% de ágar-ágar e inoculado com 2 mL da cultura
patogênica padronizada, foi vertida nas placas de ágar MRS que continha as
colônias das bactérias láticas. As placas foram novamente incubadas a 37 ºC por 24
horas em aerobiose.
Os testes foram realizados em triplicata para cada microrganismo patogênico
e comparados às placas controle, sem as bactérias láticas e com a sobrecamada
contendo a cultura patogênica.
Após o período de incubação, foi avaliado o potencial antagonista de cada
bactéria lática frente ao microrganismo patogênico, pela observação e medição dos
halos de inibição ao redor da gota/colônia, em milímetros, com a utilização de
paquímetro digital (Homis, São Paulo).
4.2. Elaboração do queijo petit suisse
4.2.1. Aquisição da farinha de banana verde
A farinha de banana verde da marca Pazze foi adquirida no comércio de Rio
Pomba, MG, mantida estocada na própria embalagem, lacrada, e armazenada em
local seco e arejado até o uso. Conforme informação nutricional, cada 50 g de
farinha contém 144 kcal/605 KJ, 5 g de fibra alimentar, 0 g de sódio, 32 g de
carboidratos, 0,22 g de proteínas, 1,7g de gorduras totais, 0,7 g de gorduras
saturadas, 0 g de gorduras trans e ausência de glúten.
31
4.2.2. Preparo da cultura lática probiótica
Pacotes contendo 25 g de L. casei-1 (CHR. HANSEN, lote 3191141, fabricado
em 08/2014 e válido até 08/2016) liofilizado foi diluído em 1 litro de leite em pó
desnatado, previamente reconstituído a 12% e esterilizado a 121°C por 15 minutos
em autoclave. Em seguida, o inóculo foi mantido a 5°C por 4 horas para reidratação
das células microbianas, sendo posteriormente fracionado em frascos estéreis de 10
mL, congelados e mantidos em freezer a temperatura entre -18°C a -20°C até o
momento da utilização.
4.2.3. Elaboração do queijo petit suisse potencialmente probiótico acrescido
de farinha de banana verde
Para elaboração das três repetições do queijo petit suisse, utilizou-se leite
fresco produzido no próprio IF Sudeste MG, Campus Rio Pomba, desnatado no
laticínio do Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos. Após a obtenção, o
leite foi pasteurizado em tanque inox (90 °C/ 5 min.), conforme Balbi (2015) e
imediatamente resfriado à temperatura de 35 °C. Logo após o resfriamento,
adicionou-se 0,04% de cloreto de cálcio (Casa Forte) a 5% (m/v), 1% do fermento
tipo O (Rica Nata Ind. e Com. Ltda) e 0,04% de coalho (Proregi) diluído em água
pasteurizada. Para a coagulação (aproximadamente 18 h), o produto foi mantido
tampado, à temperatura ambiente de 25-30 oC. Posteriormente, a massa foi cortada,
acondicionada em dessoradores e pendurada em BOD (CIENLAB) previamente
sanitizada (solução clorada a 200 mg/L) e mantida a temperatura de 4 oC por 24
horas para drenagem.
Após a drenagem, a massa foi adicionada de 5,4% de açúcar, 3,5% de polpa
de morango e 1,5% de farinha de banana verde, além de 7,5% de creme com 20%
de gordura. O produto obtido foi pesado e dividido em duas partes iguais, sendo o
petit suisse probiótico adicionado de 3% de L. casei (L. casei -1, CHR. HANSEN) e
homogeneizado em batedeira e, a outra porção, petit suisse controle não foi
acrescido de probiótico. Os produtos foram envasados em porções individuais de 50
gramas cada, em potes plásticos previamente sanitizados por imersão por 2 horas
32
em solução de água clorada a 200 mg.L-1 e imediatamente armazenados a 4 oC ± 1
oC.
Ressalta-se que, durante todo o processo produtivo do queijo petit suisse,
foram seguidas as normas de Boas Práticas de Fabricação (BPF) preconizadas para
produtos alimentícios e que, logo após o processamento, foram realizadas as
análises microbiológicas dos produtos elaborados requeridas para queijo com muito
alta umidade (BRASIL, 1996).
4.3.Avaliação microbiológica dos queijos elaborados
Conforme preconizado pela Portaria nº 146, de 07 de março de 1996 que
consiste em um Regulamento técnico geral para fixação dos requisitos
microbiológicos para derivados lácteos, realizou-se análises de coliformes a 30 °C e
45 °C (KORNACKI; JOHNSON, 2001), estafilococos coagulase positiva
(LANCETTE; BENNETT, 2001), Salmonella sp. (ANDREWS et al., 2001), Listeria
monocytogenes (RYSER; DONNELLY, 2001) e fungos filamentosos e leveduras
(BEUCHAT; COUSIN, 2001), adotando-se a metodologia proposta pelo APHA
(2001), a fim de atestar a conformidade dos produtos frente aos padrões de
qualidade microbiológica.
As análises microbiológicas foram realizadas em duplicata imediatamente
após o processamento (tempo 0) nos tratamentos (petit suisse controle e petit suisse
probiótico), a partir da pesagem asséptica de 25 g de cada amostra, seguidas de
diluição em 225 mL em solução salina peptonada e homogeneização em Stomacher
(Marcon, MA -162).
4.3.1. Coliformes a 30 oC e a 45 oC
Amostras de 25 g de petit suisse de ambos os tratamentos foram pesadas
assepticamente e homogeneizadas em 225 mL de solução salina peptonada (0,85 %
de NaCl e 0,1 % de peptona), seguidas das diluições e do teste presuntivo em caldo
Lauril Sulfato de Sódio (LST) e confirmativo de coliformes a 30 oC em caldo Verde
33
Brilhante (VB) e de coliformes a 45 oC em caldo EC. Os resultados foram expresso
em NMP.g-1 (KORNACKI; JOHNSON, 2001).
4.3.2. Listeria monocytogenes
A determinação de L. monocytogenes foi realizada pela diluição inicial de 25 g
de cada produto em 225 mL de caldo de enriquecimento para Listeria Half-Fraser
(LEB 1) e incubação a 30 °C ± 0,2 °C por 24 horas. Em seguida, transferiu-se 0,1 mL
de cada frasco para tubos de ensaio contendo 10 mL de caldo Fraser com posterior
incubação a 30 °C ± 0,2 °C por 24 horas, seguido do plaqueamento em ágar Palcam
e ágar Oxford e incubação a 30 °C ± 0,2 °C por 24 a 48 horas (RYSER; DONNELLY,
2001).
4.3.3. Salmonella sp.
A determinação de Salmonella sp. foi realizada a partir da diluição de 25 g da
amostra de cada tratamento em 225 mL de caldo lactosado com posterior incubação
a 35 °C ± 0,2 °C por 24 horas. Após este período, 0,1 mL de cada amostra foi
transferida para o meio de enriquecimento seletivo caldo Rappaport Vassilidis (42 °C
± 0,2 °C por 24 horas) e 1 mL para o caldo Tetrationato de Sódio (35 °C ± 0,2 °C por
24 horas). Os meios foram estriados em placas contendo Ágar Xilose Lisina
Desoxicolato, Ágar Bismuto Sulfito e Agar Entérico Hektoen com incubação a 35 °C
por 24 horas (ANDREWS et al., 2001).
4.3.4. Fungos filamentosos e Leveduras
A partir de 25 g do produto em 225 mL de água peptonada tamponada, foram
realizadas diluições seriadas e com o auxilio da alça de Drigalski, espalhou-se 0,1
mL de cada diluição (10-1, 10-2, 10-3) cuidadosamente por toda a superfície do BDA
(Himedia, Índia) incubou-se as placas em BOD a 25 °C ± 1 °C, sem inverter, por 5
dias. Após este período, realizou-se a contagem das placas e os resultados foram
expressos em UFC.g-1 (BEUCHAT; COUSIN, 2001).
34
4.3.5. Estafilococos coagulase positiva
A determinação de estafilococos coagulase positiva foi realizada a partir de 25
g do produto homogeneizado em 225 mL de água peptonada (10-1), seguida das
diluições 10-2 e 10-3. Para o plaqueamento foi utilizado Petrifilm™ (AOAC 2003.11 –
Staphy Express Count Sistem), segundo instruções do fabricante. Uma alíquota de
1,0 mL de cada diluição, de ambos os tratamentos de petit suisse foi inoculada no
centro do filme quadriculado, com pipeta automática posicionada
perpendicularmente à placa Petrifilm™. Em seguida, o filme superior foi fechado
cuidadosamente para evitar a formação de bolhas de ar, com auxílio de difusor. As
placas foram incubadas a 37 ºC ± 1 ºC, por 24 horas.
4.3.6. Determinação da viabilidade de bactérias láticas em queijo petit suisse
por meio da técnica de cultivo convencional em placas
A viabilidade das bactérias láticas foi determinada logo após a fabricação
(tempo 0) e nos tempos 7, 14, 21 e 28 dias de armazenamento a 4°C. Foi adotada a
metodologia proposta por Richter e Vedamuthu (2001) no cultivo em placas em meio
de cultura de Man Rogosa Sharpe (MRS – Himedia, Mumbai, Índia) adicionado de
púrpura de bromocrezol, carbonato cálcio e Tween 80. Foram realizadas as diluições
seriadas das amostras e, em seguida, o plaqueamento em profundidade em MRS.
As placas de Petri foram incubadas invertidas em jarras de anaerobiose a 37 °C por
72 horas e o resultado foi expresso em UFC.g-1.
4.4. Seleção e avaliação clínica das crianças para o teste in vivo
Inicialmente, o projeto foi submetido ao Comitê de Ética do IF Sudeste MG e
obteve o número de autorização 50340815.0.0000.5588. Os pais e/ou responsáveis
pelas crianças com idades entre 10 e 12 anos, estudantes da Escola Municipal São
José, receberam informações sobre a pesquisa e assinaram um Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido - TCLE (Apêndice A), inclusive com o
35
assentimento dos menores, no qual permitiram ou não a participação da criança no
estudo, assim como, a realização do exame clínico, coleta da saliva e a
administração de petit suisse durante as duas semanas em ambiente escolar, caso a
criança se enquadrasse nos critérios de inclusão abaixo. Em seguida, responderam
a um questionário de anamnese (Apêndice B), solicitando informações acerca da
saúde da criança e ainda receberam uma lista de instrução aos voluntários
(Apêndice C).
As crianças foram selecionadas sem distinção de sexo, raça ou condição
sócio-econômica. Para serem selecionadas a participar do estudo, foram obedecidos
os seguintes critérios de inclusão: ter idade entre 10 e 12 anos; apresentar hábito de
higiene bucal regular; não estar em tratamento odontológico, não utilizar aparelho
ortodôntico; não usar medicação antibiótica ou antinflamatória; não utilizar
antissépticos bucais; ter o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido assinado
pelo pai e/ou responsável; não apresentar intolerância à lactose, diabetes ou
qualquer problema de saúde que contra-indique o consumo de petit suisse, permitir
a realização do exame intra bucal, assim como, a coleta da saliva e gostar de petit
suisse de morango.
Os critérios de exclusão foram o uso de antibioticoterapia ou de digluconato
de clorexidina nas últimas 3 semanas previamente ao consumo dos produtos,
intolerância à lactose ou a outros componentes do produto, ser diabético, ausência
de hábito de higienização regular, uso de aparelho ortodôntico, não permissão do
exame clínico ou que os pais e/ou responsáveis não assinaram o TCLE , além
daquelas com idades diferentes de 10 a 12 anos.
As crianças participantes deste estudo foram submetidas à avaliação clínica,
executada pela pesquisadora. O exame clínico foi realizado no consultório
odontológico da Escola Municipal São José, situada na Av. Dr. José Neves, 158,
Centro, Rio Pomba- MG, no período da manhã.
Antes da coleta dos dados, foi verificada a calibração intraexaminador de
acordo com o coeficiente de Kappa (COHEN, 1960), para uma maior confiabilidade
do exame. Foram realizadas avaliações clínicas consecutivas em 10 voluntários com
uma semana de intervalo entre elas e o resultado obtido da aferição da
36
concordância intraexaminador pelo coeficiente de Kappa foi 1, o que indicou a
concordância perfeita entre os exames realizados.
Foram avaliadas as condições de saúde bucal das crianças conforme
preconizado pela Organização Mundial de Saúde (OMS, 1997), com relação à
presença de cárie, condição periodontal e hábitos de higiene bucal com o voluntário
sentado em cadeira odontológica, sob a luz do refletor e obedecendo-se as regras
de biossegurança. O material utilizado para examinar as crianças foi esterilizado e
transportado até o local pela pesquisadora responsável, sem acarretar custos para a
escola municipal.
Foi realizado o exame clínico odontológico e os instrumentais utilizados foram
espelho plano com cabo (Duflex - SS White, Brasil) e sonda periodontal (Golgran,
Brasil) de acordo com o recomendado pela OMS (1997), além do uso de gaze estéril
por criança. Os dados foram anotados em um prontuário clínico individual por
auxiliar previamente treinada, a qual preencheu o odontograma de cada prontuário.
Todos os dentes presentes foram avaliados, inclusive os incompletamente
erupcionados e observada a presença ou ausência de cárie.
O Quadro 3, extraído do Manual de Instruções da OMS (1997) foi utilizado
para a avaliação clínica das crianças.
Quadro 3.Códigos para a condição da dentição permanente e decídua (coroa e raiz)
Código Condição Dentes decíduos Dentes permanentes
Coroa Coroa Raíz A 0 0 Hígido B 1 1 Cariado C 2 2 Restaurado com cárie D 3 3 Restaurado sem cárie E 4 - Perdido por cárie - 5 - Perdido por outras razões F 6 - Selante
G 7 7 Apoio de ponte, coroa ou faceta/implante
- 8 8 Dente não erupcionado (coroa), raiz não exposta
T T - Trauma (fratura) - 9 9 Sem registro
Fonte: OMS (1997).
37
A medida quantitativa da doença periodontal baseia-se em sistemas de
índices, o qual deve ser simples e com instrumentação mínima da gengiva
(REBELO; QUEIROZ, 2011). O Índice de Sangramento Gengival (ISG) foi realizado
conforme proposto por Ainamo e Bay (1975), por meio de suave sondagem gengival.
Se em 10 segundos houvesse sangramento, o resultado positivo era anotado e
assim, sucessivamente, para todas as regiões avaliadas. Para se calcular a
prevalência de gengivite no grupo, adotou-se o critério de pelo menos uma área
sangrante. De acordo com Rebelo; Queiroz (2011), escores obtidos com este índice
apresentam correlação com o índice de placa proposto por Löe e Silness (1963) e
estes parâmetros tem sido utilizados em estudos clínicos de curto prazo e de perfil
populacional.
O índice de placa (IP) foi avaliado através do registro de placa bacteriana nas
faces vestibular, lingual, mesial e distal dos dentes índices, nos quais atribuiu-se
escores de 0 a 3 de acordo com a versão modificada de Silness e Löe (1964), da
seguinte forma: (0) – ausência de placa bacteriana na cervical do dente; (1) –
percepção da placa bacteriana através da remoção com a sonda periodontal; (2) –
visualização da placa a olho nu; (3) – abundância de placa bacteriana nas
superfícies dentárias.
Para a determinação dos dentes índices, a arcada dentária foi dividida em
seis sextantes e cada sextante representado por dentes decíduos, pelo seu
sucessor permanente, como nos casos dos dentes 11 e 31 que já estavam
erupcionados em todos os voluntários, ou por outro dente do sextante, os quais
foram examinados: 51 (incisivo central decíduo superior direito), 71 (incisivo central
decíduo inferior esquerdo), 54, 55 (primeiro e segundo molares decíduos superiores
respectivamente, lado direito), 64, 65 (primeiro e segundo molares decíduos
superiores respectivamente, lado esquerdo), 74, 75 (primeiro e segundo molares
decíduos inferiores, respectivamente, lado esquerdo), 84, 85 (primeiro e segundo
molares decíduos inferiores, respectivamente, lado direito) de acordo com
metodologia usada por Santos et al. (2010) e por Carrada (2015). As Figuras 2 e 3,
extraídas do Manual de Instruções sobre Levantamento Epidemiológico em Saúde
Bucal (OMS, 1997) traz o desenho esquemático dos dentes decíduos e
permanentes e seus respectivos códigos.
Figura 2.Códigos para os dentes decíduos.Fonte: OMS (1997).
Figura 3. Códigos para os dentes permanentes.Fonte: OMS (1997).
4.5. Estudo in vivo da influência do consumo de
probiótico na microbiota da saliva de crianças
Realizou-se um estudo clínico randomizado, placebo controlado, com 41
crianças com idades entre 10 e 12 anos divididos em 2 grupos, sendo o grupo
controle constituído por
e o grupo 2, composto por 21 crianças que consumiram
casei (probiótico).
Os participantes foram orientados a manter os hábitos de higiene bucal
normalmente, com dentifrício fluoretado e escova fornecidos pela equipe de
pesquisadores, a não realizar profilaxia dentária em consultório odontológico e a não
usar outros produtos pro
não realizarem bochechos antissépticos durante o período do estudo e a não fazer
higiene bucal ou consumo de alimentos uma hora antes e uma hora após a
administração do produto. Os participantes e seus
38
Códigos para os dentes decíduos.
Códigos para os dentes permanentes.
da influência do consumo de petit suisse
probiótico na microbiota da saliva de crianças
se um estudo clínico randomizado, placebo controlado, com 41
crianças com idades entre 10 e 12 anos divididos em 2 grupos, sendo o grupo
20 crianças, as quais consumiram o produto sem probiótico
e o grupo 2, composto por 21 crianças que consumiram petit suisse
Os participantes foram orientados a manter os hábitos de higiene bucal
normalmente, com dentifrício fluoretado e escova fornecidos pela equipe de
pesquisadores, a não realizar profilaxia dentária em consultório odontológico e a não
usar outros produtos probióticos associados. Também receberam orientações para
não realizarem bochechos antissépticos durante o período do estudo e a não fazer
higiene bucal ou consumo de alimentos uma hora antes e uma hora após a
administração do produto. Os participantes e seus responsáveis também foram
petit suisse potencialmente
se um estudo clínico randomizado, placebo controlado, com 41
crianças com idades entre 10 e 12 anos divididos em 2 grupos, sendo o grupo
20 crianças, as quais consumiram o produto sem probiótico
petit suisse contendo L.
Os participantes foram orientados a manter os hábitos de higiene bucal
normalmente, com dentifrício fluoretado e escova fornecidos pela equipe de
pesquisadores, a não realizar profilaxia dentária em consultório odontológico e a não
bióticos associados. Também receberam orientações para
não realizarem bochechos antissépticos durante o período do estudo e a não fazer
higiene bucal ou consumo de alimentos uma hora antes e uma hora após a
responsáveis também foram
39
orientados a comunicar os pesquisadores caso houvesse necessidade de uso de
medicação antibiótica ou antinflamatória, e que o mesmo seria eliminado da
pesquisa.
4.5.1. Avaliação da aceitação sensorial
A avaliação sensorial foi realizada por 41 crianças não treinadas, com idade
entre 10 e 12 anos de idade, na Escola Municipal São José, Rio Pomba-MG.
Amostras de 50 gramas foram apresentadas para as crianças em T0, em
embalagens plásticas descartáveis codificadas com três números aleatórios, e, após
a apreciação dos produtos, elas foram incentivadas a marcar na Ficha de avaliação
sensorial a carinha que melhor representasse sua opinião ao consumir o produto
(Anexo D). A escala hedônica de 5 pontos apresenta escores que variam de
Detestei = 1 a Adorei = 5, de acordo com Minim (2013).
Foi resguardada a identidade de cada criança conforme expresso no Termo
de Consentimento Livre e Esclarecido assinado pelo responsável.
Foram adotadas as normas de Boas Práticas de Fabricação (BPF) durante
todo o processamento do petit suisse, fazendo com que os riscos para os julgadores
fossem mínimos, além de se verificar a qualidade microbiológica do produto antes
da análise sensorial. As amostras permaneceram estocadas sob refrigeração a 4 oC
até o momento da análise e foram transportadas até a escola e acondicionadas em
caixas térmicas pela própria pesquisadora.
4.5.2. Coleta das amostras
Os dois grupos de crianças consumiram diariamente os petit suisses controle
e probiótico de segunda-feira à sexta-feira, e na semana seguinte de segunda-feira à
quinta-feira, em horário escolar. As amostras de saliva foram coletadas (Figura 4)
nos tempos T0 (antes do início do consumo do petit suisse controle e probiótico), em
T1 (último dia de consumo dos produtos) e em T2 (após 15 dias do término do
consumo dos petit suisses).
40
T0/0 dias T1/11° dia T2/26° dia
Coleta de Coleta de Coleta de amostras amostras amostras Figura 4. Representação esquemática dos tempos de coleta das amostras de saliva.
A saliva foi coletada por técnica não estimulada com o uso de pipeta
automática e ponteiras novas estéreis para cada voluntário, pelo menos uma hora
após a alimentação ou higienização bucal.
Uma hora após o início do período de aula, coletou-se a saliva de cada
criança (T0) e em seguida foram administrados os produtos. Em T1 os produtos
foram oferecidos uma hora após o início das aulas e a coleta da saliva foi realizada
no fim do horário escolar e a última coleta de saliva (T2) foi realizada após uma hora
do início da aula, sendo que, nesse período o consumo dos petit suisses já havia
sido interrompido.
Todas as amostras de saliva coletadas dos voluntários foram codificadas
durante o período de coleta e processamento das amostras. As amostras coletadas
foram imediatamente fixadas com solução de paraformaldeído à 20%, com a
utilização de pipeta automática e ponteiras estéreis, obedecida a proporção de 9:1 (9
volumes da amostra de saliva para 1 volume de paraformaldeído a 20%). As
amostras fixadas foram mantidas refrigeradas no laboratório de Microbiologia de
Alimentos do IF Sudeste MG, Campus Rio Pomba, até serem encaminhadas ao
Laboratório de Ecologia e Biologia Molecular de Microrganismos da UFJF, onde
realizou-se as análises de FISH.
41
4.6. Identificação e quantificação da microbiota da saliva: S. mutans, S.
sobrinus, P. gingivalis, A. actinomycetemcomitans, C. albicans e L. casei
Para identificação e quantificação dos microrganismos presentes nas
amostras de saliva nos diferentes tempos de coleta, adotou-se a técnica de FISH
(COTTREL; KIRCHMAN, 2000), seguindo o protocolo utilizado por Carrada (2015) e
Machado (2012) com algumas adaptações. Após serem fixadas com
paraformaldeído 20%, numa concentração final de 2%, as amostras foram mantidas
refrigeradas por, aproximadamente, 5 dias. A seguir, elas foram vortexadas,
transferidas para tubos Falcon, acrescidas de 5mL de água destilada e mantidas
imersas em caixa de isopor com gelo, para o processo de sonicação com a
utilização da sonda sônica Vibra Cell VCX 130PB (Sonics e Materials Inc., Newton,
CT, EUA) por três repetições de um minuto cada, com um minuto de pausa entre
uma repetição e outra.
Após a sonicação, realizou-se três ciclos de centrifugação, com duração de
cinco minutos cada ciclo. Tal procedimento foi realizado para cada amostra, com
acréscimo de 5 mL de água destilada antes do segundo e do terceiro ciclos de
centrifugação. A cada ciclo foi reservado o sobrenadante devidamente identificado.
Finalmente, 1 mL de cada amostra foi filtrado em filtro branco de policarbonato
(Sterlitech Corporation, USA) de 0,22 µm e 25mm.
Sondas espécie-específicas de oligonucleotídeos compostos por RNA
ribossomal (Operon Technologies Inc., Alameda, CA, USA), com o marcador
flluorescente Cy3 foram utilizados para identificação dos microrganismos L. casei, S.
mutans, S. sobrinus, A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis, C. albicans, conforme
descrito no Quadro 4.
Para avaliar a eficiência da hibridização, um oligonucleotídeo (NON-5’-
3CCTAGTGACGCCGTCGAC-3’) foi utilizado como controle negativo por não
apresentar especificidade por nenhum microrganismo (COTTRELL; KIRCHMAN,
2000). De acordo com o número de sondas utilizadas, foram cortadas 7 pequenas
partes do filtro e cada pedaço foi colocado em lâmina de vidro previamente coberta
por parafilme e, em seguida, coberto por 30 µL da solução de hibridização. A
solução de hibridização foi preparada de acordo com cada sonda, e composta por
42
0,9M de NaCl, 20mM de Tris-HCL com pH 7,4, dodecil sulfato de sódio (SDS) à
0,01% e à concentração específica de formamida para cada microrganismo (Quadro
4).
Quadro 4.Sondas de oligonucleotídeo de RNAr utilizadas para a identificação de microrganismos bucais em saliva pela técnica de FISH
Sonda Especificidade Sequência da sonda (5’-3’)
Formamida Referência
MUT 590
S. mutans ACTCCAGACTTTCCTGAC 30% -
SOB 174 S. sobrinus TTAACTCCTCTTATGCGG 40% -
POGI P. gingivalis CAATACTCGTATCGCCCGT
TATTATTC 30% Sunde et al. (2003)
ACAC A.
actinomycetemcomitans
TCCATAAGACAGATTC 30% Sunde et al. (2003)
Caal C. albicans GCCAAGGCTTATACTCGCT
30%
Kempf; Trebesius; Autenrieth
(2000)
L-para L. paracasei e L. casei
GTTCCATGTTGAATCTCGG 30%
Blasco; Ferrer; Pardo (2003)
NON controle negativo CCTAGTGACGCCGTCGAC 30%
Cottrell; Kirchman
(2000)
Posteriormente, as lâminas foram acondicionadas em câmaras umidificadas
com a solução de hibridização correspondentes e incubadas por uma noite, em
estufa, à 42 oC.
Após a hibridização, as amostras foram lavadas em uma solução de lavagem
(também com concentração específica para cada marcador utilizado) composta por
20mM de Tris-HCL (pH 7,4), 5mM de EDTA (ácido etilenodiamino tetracético), SDS
à 0,01% e NaCl e novamente incubadas por 15 minutos à 48 oC.
A seguir as amostras foram coradas com DAPI (4’,6-diamidino-2-
phenylindole) para permitir a identificação da densidade microbiana da amostra e
43
logo após, cada pedaço do filtro foi imerso por três vezes em etanol 80% e deixado
secar.
As lâminas foram montadas utilizando-se glicerol e Vectashield (Vector
Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA) na proporção de 4:1, e identificadas com o
nome do pesquisador e do projeto, data, tipo de amostra e número da amostra
correspondente e armazenadas em caixas para lâminas até o momento da
contagem em microscópio de epifluorescência.
A contagem foi realizada pela pesquisadora, previamente treinada e
calibrada, até que se obteve 100% de concordância com a pesquisadora experiente
que realizou o treinamento, no laboratório de Microbiologia do IF Sudeste MG,
Campus Juiz de Fora com a utilização do microscópio de epifluorescência Olympus
BX60 com filtro 31000 para DAPI e filtro 41007 para sondas Cy3 (Chroma, Bellows
Falls, VT, USA) em aumento de 1000X. Calculou-se o número final de cada espécie
bacteriana levando-se em conta as diluições realizadas durante todo o processo
laboratorial e os resultados foram expressos em células.mL-1 de saliva. Foram
realizadas fotomicrografias em DAPI e nos campos referentes às sondas
específicas.
4.7. Análises estatísticas
As análises estatísticas foram realizadas utilizando o software R 3.2.5 (R Core
team, 2015) com o pacote ExpDes.pt (FERREIRA; CAVALCANTI; NOGUEIRA,
2013). Para os ensaios in vitro, realizou-se a análise de variância seguida pela
comparação de médias pelo teste Scott-Knott à 5% de probabilidade. As
comparações entre os tratamentos para um mesmo tempo de análise foram
realizadas pelo test t para amostras independentes. Para a análise sensorial, as
médias foram comparadas pelo teste Scott-Knott à 5% de probabilidade.
Nas análises in vivo, foi realizado o teste t à 5 % de probabilidade para dados
pareados para comparação das contagens de microrganismos ao longo do tempo
para o mesmo tratamento. Todos os experimentos foram conduzidos utilizando o
delineamento inteiramente casualizado.
44
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Dos 82 formulários enviados aos responsáveis contendo o TCLE e
anamnese, 52 (63,4%) retornaram permitindo a participação dos filhos na pesquisa.
Porém 11 crianças foram enquadradas nos critérios de exclusão por utilizarem
aparelho ortodôntico ou por questões de saúde como diabetes, por exemplo.
Potanto, 41 crianças foram selecionadas para o estudo, sendo que 21
crianças consumiram o produto probiótico e 20 o petit suisse controle. Durante o
experimento duas crianças foram excluídas e não tiveram a saliva coletada em T1,
totalizando-se 39 coletas neste tempo. O período pós probiótico (T2) coincidiu com o
último mês letivo, no qual muitas crianças faltaram à aula. Dessa forma, coletou-se
em T2 amostras de saliva de 31 crianças. Amostragem próxima ao presente estudo
foi utilizada por Montalto et al. (2009) que avaliaram 35 voluntários saudáveis para
verificar a ação de Lactobacillus sp. frente a S. mutans e por Pinto et al. (2014) que
avaliaram contagens de Lactobacillus sp. e S. mutans em saliva e placa bacteriana
de 26 voluntários que consumiram iogurte probiótico e placebo.
Os dados obtidos a partir da avaliação clínica realizada nas crianças
voluntárias estão dispostos no Apêndice 4 .
5.1. Antagonismo in vitro
Os resultados encontrados no teste de antagonismo encontram-se nas
tabelas 3 e 4.
Lactobacillus paracasei ssp. paracasei ATCC 335 inibiu todos os
microrganismos potencialmente patogênicos, sendo que os maiores halos de
inibição foram para S. mutans, S. sobrinus e A. actinomycetemcomitans, seguidos
por E. corrodens e das duas estirpes de C. albicans (Tabela 3).
Lactobacillus rhamnosus ATCC 7469 e L. rhamnosus ATCC 9595
apresentaram maiores efeitos inibitórios para S. mutans e A.
actinomycetemcomitans (Tabela 3). Não se detectou a formação de halos de
inibição por L. acidophillus ATCC 4356 (Tabela 3).
45
Tabela 3. Valores médios dos halos de inibição (mm) de microrganismos bucais potencialmente patogênicos por bactérias láticas probióticas (estirpes ATCC)
S. mutans
ATCC 25175 S. sobrinus
ATCC 27351 E. corrodens ATCC 23834
A. actinomycetemcomitans ATCC 29522
C. albicans ATCC 10231
C. albicans ATCC 24433
L. paracasei ssp. paracasei ATCC 335
9,45 ± 3,3 aA 7,71 ± 1,0 aA 5,37 ± 0,4 bB 11,08 ± 2,9 aA 3,17 ± 2,7 aB 4,37 ± 3,9 aB
L. rhamnosus ATCC 7469 12,06 ± 1,9 aA 8,65 ± 0,8 aB 8,13 ± 0,9 aB 11,72 ± 3,7 aA 4,96 ± 0,8 aC 5,5 ± 1,25 aC
L rhamnosus ATCC 9595 11,20 ± 4,6 aA 7,55 ± 1,9 aB 5,35 ± 0,1 bB 10,71 ± 2,6 aA 5,64 ± 2,84 aB 4,79 ± 1,4 aB
L. acidophillus ATCC 4356 0 ± 0 bA 0 ± 0 bA 0 ± 0 cA 0 ± 0 bA 0 ± 0 aA 0 ± 0 aA
Letras maiúsculas indicam comparações entre a inibição de uma determinada bactéria lática frente a cada um dos potenciais patógenos bucais (comparações entre as colunas de uma mesma linha). Letras minúsculas indicam as comparações dos halos de inibição de um potencial patógeno por todas as bactérias láticas (comparações entre as linhas de uma mesma coluna). Médias seguidas por uma mesma letra, dentro de cada coluna/linha não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott à 5% de probabilidade.
Tabela 4. Valores médios dos halos de inibição (mm) de microrganismos bucais potencialmente patogênicos por bactérias láticas comerciais
S. mutans
ATCC 25175 S. sobrinus
ATCC 27351 E. corrodens ATCC 23834
A. actinomycetemcomitans ATCC 29522
C. albicans ATCC 10231
C. albicans ATCC 24433
L. casei (L. casei-01) 21,62 ± 4,0 aA 16,91 ± 5,4 bA 20,92 ± 3,6 aA 24,03 ± 7,3 aA 23,76 ± 0,3 aA 29,13 ± 4,2 aA
L. rhamnosus (LRB) 0,0 ± 0,0 bA 0,0 ± 0,0 cA 0,0 ± 0,0 cA 0,0 ± 0,0 cA 0,0 ± 0,0 bA 0,0 ± 0,0 bA
L. acidophillus (LA-5) 18,03 ± 1,46 aB 24,77 ± 4,0 aB 15,02 ± 0,05 bB 19,73 ± 6,0 bB 0,0 ± 0,0 bA 0,0 ± 0,0 bA
Letras maiúsculas indicam comparações entre a inibição de uma determinada bactéria lática frente a cada um dos potenciais patógenos bucais (comparações entre as colunas de uma mesma linha). Letras minúsculas indicam a comparação dos halos de inibição de um potencial patógeno por todas as bactérias láticas (comparações entre as linhas de uma mesma coluna). Médias seguidas por uma mesma letra, dentro de cada coluna/linha não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott à 5% de probabilidade.
46
Para S. mutans, S. sobrinus, A. actinomycetemcomitans, C. albicans ATCC
10231 e C. albicans ATCC 24433 não houve diferença significativa entre o tamanho
dos halos de inibição produzidos estirpes L. paracasei ssp. paracasei ATCC 335, L.
rhamnosus ATCC 7469 e L. rhamnosus ATCC 9595 (Tabela 3). O maior halo de
inibição do crescimento de E. corrodens ATCC 23834 foi produzido pela bactéria
lática L. rhamnosus ATCC 7469, seguido de L. paracasei ssp. paracasei ATCC 335
e L. rhamnosus ATCC 9595 (Tabela 3).
Das culturas comerciais utilizadas, constatou-se que L. casei-01 (CHR
HANSEN) inibiu todos os potenciais patógenos bucais, sem diferença significativa
(p>0,05) entre os tamanhos dos halos de inibição, apresentando os maiores halos,
exceto frente a S. sobrinus (Tabela 4). L. acidophillus LA-5 (CHR HANSEN) não
apresentou efeito antagônico contra C. albicans, porém inibiu os demais patógenos
avaliados sem diferença significativa (p>0,05) entre eles (Tabela 4). Já L. rhamnosus
LRB (Sacco) não produziu halos inibitórios frente aos microrganismos avaliados.
Teanpaisan; Piwat e Dahle ́N (2011) e Reboledo; Rojas; Salgado (2013) ao
realizarem estudos in vitro, também constataram que L. casei inibiu o crescimento de
S. mutans. Teanpaisan; Piwat; Dahle ́N (2011) verificaram, ainda, que L. paracasei e
L. rhamnosus apresentaram grande capacidade para inibir microrganismos
cariogênicos e periodontopatogênicos como S. sobrinus, P. gingivalis e A.
actinomycetemcomitans. Segundo os autores, os resultados indicaram que alguns
Lactobacillus sp. apresentam potencial para prevenção de patologias bucais.
Kojima et al. (2016), ao desenvolverem um produto simbiótico com efeito
antagonista contra patógenos orais, observaram que L. paracasei foi um dos
potenciais probióticos identificados no estudo por inibir C. albicans e P. gingivalis.
Mousquès; Listgarten; Phillips (1980) afirmaram que existe variação entre a
atividade antagonista, in vitro, produzida por Lactobacillus sp. frente a
microrganismos orais, inclusive contra potenciais patógenos periodontais como A.
actinomycetemcomitans e P. gingivalis.
Devido ao potencial da estirpe comercial L. casei (L. casei-01) em inibir o
crescimento de potenciais patógenos bucais, demonstrado no ensaio in vitro, tal
cultura probiótica foi selecionada para ser inoculada no petit suisse.
47
5.2. Qualidade microbiológica do queijo Petit suisse
O Número mais provável (NMP) de coliformes foi < 3,0 NMP/g e a contagem
de estafilococos coagulase positiva e de fungos filamentosos e leveduras foi < 1,0 x
101 UFC.g-1 nas amostras de queijo petit suisse controle e contendo L. casei-01.
Constatou-se também ausência de Salmonella sp. e de L. monocytogenes em 25 g
dos produtos (Tabela 5). Portanto, os mesmos estão de acordo com a legislação
vigente e são microbiologicamente seguros para o consumo humano, demonstrando
a adequação do tratamento térmico e a manutenção de condições higiênico-
sanitárias desde o processamento até o envase. A inocuidade do produto
desenvolvido foi essencial para a segurança dos voluntários.
Tabela 5.Qualidade microbiológica das amostras de queijo petit suisse.
Repetição
Coliformes à 30 oC e 45 oC
(NMP.g-1)
Fungos filamentosose leveduras (UFC.g-1)
Estafilococos coagulase
positivo (UFC.g-1)
Salmonella
sp. (em 25 g)
L.
monocytogenes
(em 25 g)
1 < 3,0 <1,0 x101 <1,0 x101 Ausente Ausente 2 < 3,0 <1,0 x101 <1,0 x101 Ausente Ausente 3 < 3,0 <1,0 x101 <1,0 x101 Ausente Ausente
Brasil, (1996)
Máx. 1,0 x 103 UFC.g-1 e Máx. 1,0 x 102 UFC.g-1*
Máx. 5,0 x 103 UFC.g-1
Máx. 1,0 x 102 UFC.g-1
Ausência em 25 g
Ausência em 25 g
*Limites respectivos para contagem de coliformes à 30 oC e 45 oC em queijos de muito alta umidade (>55%) com adição de bactérias láticas em forma viável e abundante.
Resultados semelhantes foram obtidos por Balbi (2015), Saito (2014) que ao
avaliarem a qualidade microbiológica de diferentes formulações petit suisses
verificaram valores inferiores aos preconizados pela legislação, assim como, Yuhara
et al. (2014) que pesquisaram as contagens de coliformes totais, coliformes
termotolerantes e Staphylococcus aureus nas formulações de queijo tipo Quark
simbióticas e constataram adequada qualidade microbiológica dos produtos.
Após a obtenção de petit suisse com adição de L. casei, Delfino (2013),
realizou a análise microbiológica do produto com relação a contagem de coliformes,
Staphylococcus coagulase positiva, Salmonella sp., L. monocytogenes, fungos
filamentosos e leveduras. Os resultados obtidos demonstraram que o produto
48
potencialmente probiótico atendeu a todos os parâmetros microbiológicos exigidos
pela Portaria no. 146 de 07 de março de 1996, o que, segundo o autor,ocorreu
devido a adoção de boas práticas de fabricação durante todo o processamento,
além do pH do meio, que por ser ácido, não favoreceu o desenvolvimento de
microrganismos indesejáveis. Ressaltou, ainda, que em relação a presença de
fungos filamentosos e leveduras, estes são originários do ambiente e os valores
encontrados não são preocupantes por estarem inferiores ao limite permitido pela
legislação.
Buriti e Saad (2007) afirmaram que, alimentos adicionados de L casei, pode
conferir potenciais benefícios à saúde de quem os consome e que estes
microrganismos contribuem na bioconservação do produto em que são veiculados,
enquanto que Wagner; Moberg (1989) afirmaram que alimentos com presença de
bactérias láticas, alta acidez e baixo pH apresentam menor deterioração microbiana
devido às características antimicrobianas naturais intrínsecas dos produtos.
5.3. Viabilidade das bactérias láticas
Observou-se que o queijo petit suisse em associação com a farinha de
banana verde, foi uma matriz adequada para veicular as bactérias láticas, tanto da
cultura tipo O, composta por Lactococcus lactis ssp. lactis e Lactococcus lactis ssp.
cremoris (fermento starter utilizado como cultura iniciadora, em ambos os
tratamentos), quanto na amostra potencialmente probiótica, tendo em vista que a
contagem de bactérias láticas esteve entre 108 e 109 UFC.g-1 durante o período
avaliado (Figura 5).
A porção diária mínima de microrganismos probióticos viáveis que devem ser
ingeridos para efeitos terapêuticos é de 108 a 109 UFC.g-1, o que implica em um
consumo de 10g diárias de um produto contendo 107 a 108 UFC.g-1 ou mL ou de 100
g diárias de um produto contendo 106 a 107 UFC.g-1 ou mL (FAO, 2001;
KRASAEKOOP; BHANDARI; DEETH, 2003; BRASIL, 2008; REID, 2008; BANSAL et
al., 2016).
Figura 5. Contagem de bactérias láticas nas amostras de queijo longo da vida de prateleira.
Balbi (2015) constatou que o tratamento com
suisse associado a farinha de banana verde apresentou maior contagem de
bactérias láticas quando comparado aos tratamentos com outros potenciais
probióticos avaliados.
Zamora-Vega et al. (2013) produziram queijos simbióticos acrescidos
deSacharomyces boulardii
um decréscimo na contagem do microrganismo no produto, durante os 30 dias de
estocagem à 4 oC. No entanto, o queijo foi considerado probiótico por atender a
quantidade mínima de microrganismos viáveis
produto elaborado com o simbiótico encapsulado apresentou menor perda de
viabilidade de S. boulardii
e mucilagem protegeu o microrganismo. Os autores concluíram que o q
um bom veículo para carrear probiótico.
Resultado interessante foi obtido por Araújo et al. (2010) que desenvolveram
um queijo cottage simbiótico contendo
(5%). As contagens de células de
recomendados para que o produto fosse considerado probiótico. Além disso, o
queijo foi exposto às condições simuladas do trato gastrointestinal
microrganismo apresentou resistência satisfatória para baixos v
concentração de sais biliares.49
Contagem de bactérias láticas nas amostras de queijo longo da vida de prateleira.
Balbi (2015) constatou que o tratamento com L. casei
associado a farinha de banana verde apresentou maior contagem de
bactérias láticas quando comparado aos tratamentos com outros potenciais
et al. (2013) produziram queijos simbióticos acrescidos
Sacharomyces boulardii e inulina, encapsulados ou não. Os autores observaram
um decréscimo na contagem do microrganismo no produto, durante os 30 dias de
C. No entanto, o queijo foi considerado probiótico por atender a
quantidade mínima de microrganismos viáveis recomendada pela FAO/WHO.
produto elaborado com o simbiótico encapsulado apresentou menor perda de
S. boulardii. Acredita-se que a microcápsula feita com inulina, alginato
o microrganismo. Os autores concluíram que o q
um bom veículo para carrear probiótico.
Resultado interessante foi obtido por Araújo et al. (2010) que desenvolveram
simbiótico contendo Lactobacillus delbrueckii UFV H2b20 e inulina
(5%). As contagens de células de L. delbrueckii estiveram acima dos limites mínimos
recomendados para que o produto fosse considerado probiótico. Além disso, o
queijo foi exposto às condições simuladas do trato gastrointestinal
microrganismo apresentou resistência satisfatória para baixos v
de sais biliares.
Contagem de bactérias láticas nas amostras de queijo petit suisse ao
L. casei veiculado por petit
associado a farinha de banana verde apresentou maior contagem de
bactérias láticas quando comparado aos tratamentos com outros potenciais
et al. (2013) produziram queijos simbióticos acrescidos
e inulina, encapsulados ou não. Os autores observaram
um decréscimo na contagem do microrganismo no produto, durante os 30 dias de
C. No entanto, o queijo foi considerado probiótico por atender a
recomendada pela FAO/WHO. O
produto elaborado com o simbiótico encapsulado apresentou menor perda de
se que a microcápsula feita com inulina, alginato
o microrganismo. Os autores concluíram que o queijo fresco é
Resultado interessante foi obtido por Araújo et al. (2010) que desenvolveram
UFV H2b20 e inulina
estiveram acima dos limites mínimos
recomendados para que o produto fosse considerado probiótico. Além disso, o
queijo foi exposto às condições simuladas do trato gastrointestinal e o
microrganismo apresentou resistência satisfatória para baixos valores de pH e alta
50
Lima et al. (2014) incorporaram L. casei microencapsulado em queijo tipo
coalho e constataram viabilidade das células microbianas com contagens de acordo
com os limites preconizados pela legislação. Nas condições investigadas, L. casei
apresentou características de hidrofobicidade e de superfície celular com caráter
ácido que indicam um bom potencial de adesão ao epitélio intestinal, confirmando o
potencial probiótico do microrganismo.
Başyiğit; Kuleaşan; Karahan (2006) avaliaram a sobrevivência de uma mistura
de bactérias láticas composta por L. acidophilus, Lactobacillus agilis e L. rhamnosus
utilizadas na fabricação de sorvetes com diferentes formulações (aspartame ou
sacarose). Os autores constataram que os microrganismos probióticos não alteraram
as características dos sorvetes e mantiveram-se viáveis até seis meses de
estocagem dos produtos a -20 oC.
5.4. Aceitação sensorial dos produtos pelas crianças
As amostras avaliadas apresentaram escores médios entre Gostei (escore 4)
e Adorei (escore 5) conforme a tabela 6. Não se observou diferença significativa
(p>0,05) na aceitação sensorial realizada pelas crianças que consumiram o petit
suisse probiótico e controle, sendo os escores médios de 4,76 e 4,70,
respectivamente, demonstrando que a adição de L. casei não alterou as
propriedades sensoriais do produto.
Tabela 6. Aceitação sensorial das amostras de queijo petit suisse.
*Letras iguais na mesma coluna indicam que não há diferença significativa (p>0,05) pelo teste de Scott-Knott à 5% de probabilidade entre os escores médios.
Em um mercado cada vez mais competitivo, a indústria de alimentos precisa
identificar as necessidades e expectativas dos consumidores para buscar atendê-
las. Nesse contexto, a análise sensorial tem-se mostrado importante ferramenta,
sendo os testes de aceitação muito utilizados para avaliar se os consumidores
gostam ou desgostam de um determinado produto (DELFINO; OLIVEIRA; BARROS,
2014).
Amostras Gostei (escore 4) Adorei (escore 5) Escore médio
Probiótica (n=21) 5 (23,8%) 16 (76,2%) 4,76a Controle (n=20) 6 (30%) 14 (70%) 4,70a
51
De acordo com Balbi (2015), os testes sensoriais realizados com crianças
demonstraram que as amostras de petit suisse contendo L. casei e adicionadas de
farinha de banana verde à 1% e 2% de fibras não diferiram quanto à aceitação com
o passar do tempo. No entanto, as amostras contendo 3% de farinha de banana
verde apresentaram maiores escores após 30 dias de armazenamento quando
comparada ao tempo inicial (T0). Esse tratamento apresentou melhor aceitação
sensorial provavelmente devido à absorção de água pela fibra adicionada, o que
conferiu uma melhor consistência ao produto.
Delfino; Oliveira; Barros (2014) concluíram que petit suisse adicionado de L.
casei BGP 93 apresentou boa aceitação sensorial por 120 indivíduos com idades
entre 18 e 66 anos que participaram da análise com escala hedônica de 9 pontos.
Os autores, ainda, afirmaram que petit suisse probiótico é um produto inovador entre
os lácteos, sendo uma proposta interessante para um mercado com demanda
crescente por produtos funcionais.
De acordo com Buriti; Saad (2007), L. casei, em conjunto com os
microrganismos tradicionais usados em produtos alimentícios, pode resultar ou não
em diferença sensorial perceptível pelo consumidor. No entanto, os autores
acrescentaram que, além dos efeitos benéficos produzidos por L. casei, esses
microrganismos, ainda, podem ser utilizados para conferir aroma, sabor e textura
aos alimentos.
Araújo et al. (2010) realizaram teste de aceitação utilizando escala hedônica
de 9 pontos referente a ''desgostei extremamente'' a ''gostei extremamente'', para
avaliar o sabor, a textura e a impressão global de queijo cottage simbiótico
adicionado de L. delbrueckii UFV H2b20 e inulina. O queijo simbiótico foi bem aceito
e os julgadores não observaram nenhuma diferença significativa quando comparado
ao queijo controle.
5.5. Identificação e quantificação de microrganismos na saliva de voluntários pela técnica de FISH
A densidade de microrganismos marcada por DAPI em amostras de saliva de
crianças que consumiram petit suisse potencialmente probiótico e o controle, nos
diferentes tempos de coleta pode ser visualizada na Figura 6.
52
Para a amostra controle, observou-se redução significativa (p<0,05) na
contagem total de microrganismos presentes na saliva das amostras marcadas por
DAPI no11o dia de consumo do produto e essa redução se manteve no período pós
tratamento (26o dia). Já para a amostra acrescida de L. casei-01 houve redução
significativa (p<0,05) no 11o dia de consumo do petit suisse, porém, no período pós
tratamento (26o dia) a densidade de microrganismos não diferiu (p<0,05) da
contagem inicial apresentada (Figura 6).
Figura 6. Contagem total de microrganismos (DAPI) em saliva de crianças antes do consumo (Tempo 0) de petit suisse adicionado de L. casei (PROB) ou não adicionado de L. casei (CONT),no último dia de consumo (Tempo 1- 11o dia) e após 15 dias de sua interrupção (Tempo 2 - 26o dia). (*) Indica diferença significativa (p<0,05) entre a contagem inicial de microrganismos e a realizada aos 11o e 26o dia de tratamento pelo teste t com dados pareados à 5% de probabilidade. Barras de erros indicam o erro padrão da média, com n=14 para CONT e n=17 para PROB.
Os resultados do presente estudo sugerem que ambos os produtos
apresentaram efeito sobre a microbiota presente na saliva, uma vez que se
observou redução do número total de microrganismos nas amostras coletadas.
Tong et al. (2012) observaram que L. lactis pode colonizar a superfície do
esmalte dentário. Segundo os autores, esta capacidade de colonização é importante
na competição com potenciais patógenos encontrados no biofilme dentário e
favorece a inibição do crescimento de microrganismos cariogênicos bucais.
53
Comelli et al. (2002) demonstraram, em estudos in vitro, que Streptococcus
thermophilus NCC1561 e L. lactis ssp lactis NCC2211 colonizaram o biofilme
supragengival do esmalte dentário revestido de saliva de forma semelhante ao
microrganismo cariogênico S. sobrinus OMZ176. Além disso, L. lactis NCC2211
interferiu na microbiota bucal reduzindo a colonização por Streptococcus oralis
OMZ607, Veillonella dispar OMZ493, Actinomyces naeslundii OMZ745 e S. sobrinus
OMZ176.
Produtos comerciais probióticos podem alterar o ecossistema bucal pela
modificação na composição das proteínas salivares. A falta de aglutinina GP340 e
de peroxidase na saliva tratada com probiótico reduziu a adesão de S. mutans
(HAUKIOJA; LOIMARANTA; TENOVUO,2008).
Makino et al. (2014) pesquisaram a influência de L. casei na aderência de
Enterobacter cloacae em células epiteliais da mucosa jugal (entre a bochecha e
gengiva) de dez indivíduos adultos e observaram que a aderência de L. casei às
células epiteliais foi significativamente maior que a aderência de Enterobacter
cloacae às mesmas células, o que in vivo poderá resultar no controle de algumas
patologias, inclusive na doença periodontal.
Pinto et al.(2014) avaliaram amostras de saliva e placa bacteriana de 26
voluntários e observaram redução de contagens de microrganismos totais na placa
bacteriana após consumo de iogurte contendo ou não probiótico, porém, nas
amostras de saliva não se observou redução microbiana.
Os resultados das contagens das espécies microbianas antes do início do
consumo dos queijos petit suisses controle e probiótico, após o término do consumo
(11o dia) e após 15 dias de interrompido o consumo dos produtos (26o dia) em saliva
coletadas de crianças estão representados na Figura 7.
Ambos os tratamentos, nos mesmos tempos (0, 11 e 26 dias), não
apresentaram diferença significativa (p>0,05) entre as amostras para os diferentes
microrganismos avaliados (Figura 7).
54
Figura 7. Contagens de L. casei (A) e microrganismos potencialmente patogênicos bucais S. mutans (B); S. sobrinus (C); P. gingivalis (D); A. actinomycetemcomitans (E); C. albicans (F) em saliva de crianças nos diferentes tempos do consumo de petit suisse adicionado (PROB) ou não de probiótico (CONT). (*) Indica diferença (p<0,05) entre a contagem inicial de microrganismos e a realizada após 11º e 26º dias de coleta das amostras pelo teste t com dados pareados à 5% de probabilidade. Barras de erros indicam o erro padrão da média, com n=14 para o tratamento controle sem probiótico e n=17 para o tratamento com probiótico. Observou-se um aumento significativo (p<0,05) de L. casei após 11 dias de
iniciado o consumo de petit suisses, assim como no período de pós tratamento (26o
dia) para as duas amostras avaliadas (Figura 7-A).
Observa-se semelhança entre os resultados obtidos quando bactérias
probióticas são veiculadas em produtos de base láctea. Acredita-se que, além da
55
influência do pH do alimento na microbiota da saliva, a presença da cultura starter
viável, presente em ambos os produtos, também pode ter tido efeito sobre a
microbiota da saliva dos voluntários.
De acordo com Caglar et al. (2006); Cildir et al. (2009); Bhalla et al. (2015),
quando os probióticos são administrados por meio do queijo, iogurte, sorvete, leites
fermentados e lácteos em geral, há uma tendência de que a redução do pH bucal
seja atenuado pela capacidade tampão desses alimentos. Além disso, os
componentes do leite como o cálcio e o lactato de cálcio possuem propriedades
anticariogênicas independente da adição dos probióticos.
Pinto et al. (2014) observaram comportamentos semelhantes para
Lactobacillus sp. e S. mutans após o consumo de produtos lácteos e sugerem um
grupo controle para o veículo, quando a pesquisa envolver esse tipo de alimento.
Montalto et al. (2004), também, observaram que a administração oral de
Lactobacillus sp. veiculados em líquidos ou em cápsulas aumenta as contagens
desse microrganismo na saliva, assim como, Keller; Twetman (2012) relataram
aumento significativo na contagem de Lactobacillus sp. após consumo de 3
comprimidos por dia contendo L. reuteri durante duas semanas.
Çaglar; Kargul; Tonboga (2005), também, encontraram a bactéria probiótica
L. rhamnosus GG na saliva de indivíduos que a consumiram-na diariamente, após
duas semanas de interrupção do uso do mesmo.
Uma vez que uma das características de Lactobacillus sp.é o potencial
acidúrico e acidogênico (MARSH, 2006) questiona-se se o consumo habitual de
probióticos poderia acarretar uma maior produção de ácido lático na placa
bacteriana (MONTALTO et al.,2004). Marttinen et al. (2012) investigaram se o
consumo de L. reuteri e L. rhamnosus GG alteram a acidogenicidade da placa. Os
autores concluíram que, mesmo os indivíduos que apresentaram aumento nas
contagens de S. mutans ou de Lactobacillus sp. após um período de consumo de
comprimidos probióticos, não tiveram maior produção de ácido na placa bacteriana.
Tong et al. (2012) demonstraram que L. lactis, assim como a maioria das
bactérias láticas, produz ácido. No entanto, o potencial de desmineralização dentária
após 30 dias de colonização por L. lactis é muito pouca quando comparado com o
poder de corrosão que S. mutans apresenta. O microrganismo cariogênico, através
da glicosiltransferase, pode utilizar a sacarose para sintetizar um glucano insolúvel
56
em água, formando um biofilme muito mais denso e compacto. Em contrapartida, L.
lactis não sintetiza glicosiltransferase, produzindo menos glucano e resultando em
um biofilme menos denso que ocasiona pouca corrosão ao esmalte. Adiciona-se,
ainda, o fato de L. lactis exercer efeito antagonista contra S. mutans na superfície
dentária, aumentando o potencial dessas bactérias exercerem uma efeito protetor
contra a ocorrência de cáries.
Com o objetivo de investigar o comportamento do pH da placa bacteriana
frente a administração de Lactobacillus sp., o que seria um possível efeito colateral
do consumo de produtos probióticos, Keller; Twetman (2012) encontraram
diferenças na produção de ácido lático em suspensões de placa acrescidas de L.
reuteri, de L. plantarum e em placas controle (sem probióticos). Os autores
concluíram que a acidogenicidade do meio é dependente da estirpe bacteriana
utilizada e altamente influenciada pelo tipo de açúcar disponível na dieta (frutose ou
xilitol).
Sudhir et al.(2012) investigaram se o consumo de coalhada probiótica,
adicionada de L. acidophilus, tem efeito inibitório sobre S. mutans e no pH salivar de
crianças sem lesões de cárie. Os autores observaram que houve um decréscimo no
pH bucal, porém acima do pH considerado crítico (5,2- 5,5) que propicia o início ou
evolução da cárie, e atribuíram esse comportamento à natureza ácida do alimento
(coalhada), o qual não representa risco para crianças cárie-ativas e, ainda, podem
conferir benefícios para a saúde bucal em virtude de seu teor de cálcio, fósforo,
proteínas e vitaminas.
No entanto, Montalto et al. (2004) alertaram para a necessidade de avaliação
da saúde bucal de pessoas que consomem probióticos a longo prazo e Marttinen et
al. (2012) recomendam a necessidade de mais estudos relativos a saúde bucal, uma
vez que produtos probióticos tem sido ofertados com mais frequência, inclusive para
crianças.
Outros trabalhos não observaram aumento de Lactobacillus sp.em saliva após
o consumo de produtos probióticos. Mortazavi; Akhlaghi (2012) não observaram
nenhuma alteração significativa na contagem de Lactobacillus sp. na saliva de
adultos após o consumo de 50g/dia de queijo contendo 1,0 x 106 UFC.g-1 de L. casei
durante duas semanas, assim como Cildir et al. (2009) não encontraram mudanças
57
significativas na contagem de Lactobacillus sp. após consumo de iogurte de fruta
contendo Bifidobacterium animalis ssp. lactis DN-173010.
Em relação ao grupo de microrganismos cariogênicos, foi observada redução
significativa (p<0,05) de S. mutans (Figura 7-B) após 11 dias de iniciado o consumo
e no período de duas semana de pós tratamento (26o dia) nas amostras de saliva
das crianças que consumiram petit suisse controle. Nas amostras do produto
acrescido de L. casei a redução de S. mutans foi significativa no período de pós
tratamento (26o dia). Quanto à contagem de S. sobrinus (Figura 7-C), não se
observou diferença significativa (p>0,05) para ambos os produtos nos diferentes
tempos avaliados.
Os resultados sugerem que ambos os produtos apresentam potencial para a
redução da ocorrência de doenças bucais relacionadas com a presença de S.
mutans, como as lesões de manchas brancas e a cárie dentária.
Tong et al. (2012) demonstraram que o probiótico L. lactis apresenta atividade
antagonista contra S. mutans por ser dominante na competição por nutrientes e, em
situação de estresse nutricional, ou seja, em alta densidade populacional, apresentar
o mecanismo conhecido como quorum sensing e produzir nisina. Além disso, o dano
causado ao esmalte dentário por L. lactis é significantemente menor do que o
causado pelo S. mutans. Estes resultados demonstram que L. lactis tem potencial
para reduzir a colonização de S. mutans na superfície dentária e prevenir a
ocorrência de cárie.
Resultado compatível com o presente estudo foi relatado por Ahola et al.
(2002) que observaram que o grupo probiótico apresentou contagens
significativamente menores da bactéria cariogênica S. mutans na saliva no pós
tratamento, após três semanas de interrupção do consumo de queijo adicionado de
L. rhamnosus GG e L. rhamnosus LC 705, quando comparado ao grupo controle.No
entanto, os autores não observaram menores contagens de S. mutans
imediatamente após o consumo dos produtos.
Chuang et al. (2011) também detectaram uma redução significativa de S.
mutans após duas semanas da interrupção do consumo de comprimidos
adicionados de L. paracasei GMNL-33 e afirmaram que pode ser necessário um
período de duas semanas para que a ação do probiótico seja efetiva. Os autores
relataram que diversos fatores podem contribuir para que a contagem de S. mutans
58
não seja reduzida imediatamente após o consumo do produto, entre eles, a
concentração do probiótico, o tipo de veículo utilizado e o tempo de intervenção.
Segundo os autores, parece ser provável que o probiótico necessite de um período
para colonizar a cavidade oral e, a partir daí, ocorrer a redução de S. mutans,
justificando assim porque essa redução só foi significativa no pós tratamento.
Näse et al. (2001), também, observaram uma menor contagem de S. mutans
em crianças que consumiram leite acrescido de L. rhamnosus GG por sete meses.
Além disso, foi observada uma redução do risco de cárie de acordo com parâmetros
clínicos e microbiológicos avaliados e que o leite probiótico teve efeitos benéficos
para a saúde bucal das crianças.
Mortazavi; Akhlaghi (2012) demonstraram que indivíduos com contagens
bacterianas iniciais elevadas (≥ 105 UFC.mL-1) apresentaram significativa redução na
contagem de S. mutans após o consumo do produto probiótico.
Com relação aos potenciais periodontopatógenos (Figuras 7-D e 7-E),
observou-se redução de P. gingivalis na amostra coletada no 11o dia de consumo de
ambos os produtos, porém, no pós tratamento essa redução manteve-se apenas
para o produto adicionado de L. casei.
Os resultados, também, demonstram menor contagem (p<0,05) do
microrganismo A. actinomycetemcomitans (Figura 7-E) nas amostras de saliva das
crianças após 11 dias de iniciada a ingestão do petit suisse acrescido de L. casei-01,
porém essa redução não se manteve após interrompido o consumo do produto. Para
a amostra controle não houve diferença significativa (p>0,05) entre os diferentes
tempos de coleta.
Dessa forma, apenas o produto acrescido de L. casei demonstrou ser capaz
de reduzir A. actinomycetemcomitans, assim como, mostrou-se capaz de manter a
redução de P. gingivalis no pós tratamento. Ressalta-se, portanto que, petit suisse
acrescido de L. casei-01 pode apresentar potencial para a prevenção de doenças
periodontais.
Vivekananda; Vandana; Bhat (2010) observaram que os microrganismos
periodontopatogênicos P. gingivalis, A. actinomycetemcomitans e Prevotella
intermedia são sensíveis ao tratamento com probiótico e constataram uma redução
de 1 ciclo log (106 UFC.mL-1 até inferior a 105 UFC.mL-1) após consumo de pastilha
59
probiótica (Prodentis) acrescida de L. reuteri, além de melhoria nos parâmetros
clínicos periodontais.
Teanpaisan; Piwat; Dahle ́N, (2011) mostraram que alguns Lactobacillus,
entre eles L. casei SD2, inibem microrganismos potencialmente patogênicos, Gram-
negativos, como P. gingivalis e A. actinomycetemcomitans e sugerem que o
consumo de produtos probióticos pode prevenir a ocorrência de doenças bucais.
De acordo com Jones e Versalovic (2009), biofilmes formados por L. reuteri
apresentam potencial antimicrobiano devido a produção de composto denominado
reuterina, além de apresentarem capacidade imunomodulatória específica para
suprimir a produção de fator de necrose tumoral (TNF). Schaefer et al. (2010)
relataram que a interação entre L. reuteri com outros patógenos induz a produção de
reuterina, a qual acarreta estresse oxidativo na célula microbiana patogênica,
destruindo-a.
Com relação a levedura C. albicans (Figura 7-F), não se observou diferença
significativa (p>0,05) em ambas as amostras nos diferentes tempos avaliados, assim
como no estudo de Ahola et al. (2002) em que a redução de Candida sp. não foi
significativa.
Em contrapartida, Hatakka et al. (2007) concluíram que as bactérias
probióticas podem ser eficazes no controle de cândida oral e na hipossalivação em
idosos após o consumo de 50g por dia de queijo adicionado de probiótico, durante
16 semanas.
Dos indivíduos avaliados por Ishikawa et al. (2015), apenas 16,5%
apresentaram Candida ssp. após um período de cinco semanas utilizando a
associação de L. rhamnosus HS111, L. acidophillus HS101 e Bifidobacterium
bifidum na superfície palatina de próteses. Os autores sugeriram que o produto pode
ser uma alternativa de tratamento para portadores de próteses totais que
apresentem candidíase.
De acordo com os resultados obtidos, o petit suisse probiótico apresentou
efeitos benéficos para a saúde bucal das crianças, com a redução do número de
potenciais patógenos relacionados com a ocorrência de cárie e periodontite, sendo
relevante que novas pesquisas sejam realizadas a fim de que os probióticos sejam
efetivamente reconhecidos e indicados para a prevenção de doenças bucais.
60
6. CONCLUSÃO
Concluiu-se, a partir do teste in vitro, que algumas estirpes de bactérias
láticas probióticas apresentam potencial antagonista frente a potenciais patógenos
bucais e que, das cepas comerciais avaliadas, L. casei (L. casei-01) apresentou os
maiores halos de inibição frente aos potenciais patógenos avaliados.
O queijo petit suisse acrescido de L. casei apresentou qualidade
microbiológica satisfatória, sendo, assim seguro para consumo, além de ser um
produto potencialmente probiótico por apresentar viabilidade de bactérias láticas
durante 28 dias de armazenamento de acordo com o preconizado pela legislação.
O produto acrescido de L. casei obteve o mesmo escore na análise de
aceitação sensorial que o controle, indicando que L. casei não interferiu na
aceitabilidade do produto.
Foi possível a identificação e a quantificação de L. casei, S. mutans, S.
sobrinus, P. gingivalis, A. actinomycetemcomitans e C. albicans na saliva, pela
técnica FISH.
Tanto o produto potencialmente probiótico, quanto o controle, foram capazes
de reduzir significativamente (p<0,05) a contagem total de microrganismos e de S.
mutans. Apenas o produto acrescido de L. casei demonstrou ser capaz de reduzir A.
actinomycetemcomitans, assim como, mostrou-se capaz de manter a redução de P.
gingivalis no pós tratamento. Ambos os produtos não tiveram atividade antagônica
sobre S. sobrinus e C. albicans.
Probióticos consistem em uma alternativa em potencial para prevenção e
terapia de patologias bucais, uma vez que obteve-se resultados encorajadores neste
estudo com a redução de potenciais patógenos bucais. Espera-se que novos
trabalhos sejam realizados para se determinar a forma mais adequada para
administrá-los à cavidade oral, bem como, definir o probiótico mais indicado para
esse fim.
61
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8. APÊNDICE
Apêndice A
Termo de Consentimento Livre e esclarecido
TERMO DE ASSENTIMENTO
Você está sendo convidado como voluntário a participar da pesquisa “Efeito de probiótico adicionado em queijo Petit suisse na microbiota bucal de crianças”. Neste estudo pretendemos desenvolver pettit suissse probiótico adicionado de farinha de banana verde e avaliá-lo quanto às características microbiológicas. Nesta proposta, espera-se que o microrganismo probiótico no queijo mantenha-se viável no produto durante a vida de prateleira avaliada, tornando-se mais uma alternativa para os consumidores de produtos lácteos funcionais. O produto será administrado em crianças de 9 a 10 anos de idade e será avaliada a microbiota bucal de um grupo de 40 crianças, antes e após o consumo do produto, através de saliva coletada dos voluntários. Espera-se ainda que os resultados alcançados neste projeto sejam úteis para as indústrias de laticínios, que terão mais uma opção de produto inovador, além de benefícios na área Odontológica. A equipe pretende participar de eventos relevantes das áreas de Ciência e Tecnologia de Alimentos e da Odontologia para apresentação de trabalhos científicos, assim como publicar resumos em eventos e artigos em revistas indexadas. Para participar deste estudo, você não terá nenhum custo, nem receberá qualquer vantagem financeira. Você será esclarecido sobre o estudo em qualquer aspecto que desejar e estará livre para participar ou recuar-se a participar. Poderá retirar seu consentimento ou interromper a participação a qualquer momento. A sua participação é voluntária e a recusa em participação não acarretará em qualquer penalidade ou modificação na forma em que é atendido pelo pesquisador. O pesquisador tratará a sua identidade com padrões profissionais de sigilo. Você não será identificado em nenhuma publicação que possa resultar deste estudo, o qual apresenta risco mínimo, isto é, o mesmo risco existente em atividades rotineiras. Para participar desse estudo você deverá ter de 9 a 10 anos de idade e deverá consumir uma porção de até 100 g de produto. Como se trata de um queijo, você será informado do teor de açúcar e gordura presentes nas amostras e caso seja diabético ou intolerante à lactose, você não poderá participar da presente pesquisa. Será realizada coleta de saliva dos participantes. Serão incluídas no estudo crianças sadias, dentro da faixa etária especificada e que queiram participar da pesquisa, além de apreciarem o produto. Serão excluídas as crianças fora da faixa etária especificada, além daquelas que tiverem problemas de saúde relacionados ao consumo de lactose e de açúcar, ou aquelas que não gostarem do produto ou não queiram participar por algum motivo. Os resultados da pesquisa estarão à sua disposição quando finalizada. Seu nome ou material que indique sua participação não será liberado sem a sua
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permissão. Este termo de consentimento encontra-se impresso em duas vias, sendo que uma cópia será arquivada pelo pesquisador responsável, e a outra será fornecida a você. Eu _____________portador do documento de identidade _________________fui informado dos objetivos do presente estudo de maneira clara e detalhada e esclareci minhas dúvidas. Sei que a qualquer momento poderei solicitar novas informações, assim como o meu responsável, e declaro que concordo em participar deste estudo. Recebi uma cópia deste termo e me foi dada a oportunidade de ler e esclarecer as minhas dúvidas. Rio Pomba, ___________de __________de 2015.
__________________ _________________________
Assinatura do menor Assinatura do pai ou responsável
________________________________
Assinatura do pesquisador
COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA COM SERES HUMANOS CEP/IF SUDESTE MG
Av. Luz Interior, 360, 5o andar, bairro Santa Luzia, Juiz de Fora – MG, CEP 36030-77
Telefone: (32) 3257-4113
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Apêndice B (adaptado de Souza, 2010)
Ficha de Identificação do voluntário Código de identificação: ___ ___
Nome da criança:___________________________________________________ Endereço:___________________________________________________________ Telefones:___________________________________________________________ Idade:________________ Anamnese Você apresenta algum dos problemas de saúde indicados abaixo ou algum outro problema de saúde? ( ) Doenças intestinais ( ) Diabetes ( ) Pressão alta ( ) Intolerância à lactose ( ) Anemia Qual? ___________________________________________________________________ Apresenta alergia a algum alimento ou produto? ( ) SIM ( ) NÃO Qual?_______________________________________________________________ Faz algum tratamento médico? ( ) SIM ( ) NÃO Se sim, qual o motivo?_________________________________________________ Fez uso de alguma medicaçãonas últimas 3 semanas, inclusive antibiótico ou antinflamatório? ( ) SIM ( ) NÃO Qual?_______________________________________________________________ Tem hábito de usar produtos para bochechar? ( ) SIM ( ) NÃO Qual?_______________________________________________________________ Costuma ingerir produtos probióticos regularmente? ( ) SIM ( ) NÃO Com que freqüência? __________________________________________________
Rio Pomba, _____de _______de 2015.
__________________ ____________________________ Assinatura do menor Assinatura do pai ou responsável
________________________________
Assinatura do pesquisador
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Apêndice C
Instruções ao voluntário – Estudo in vivo
1- O petit suisse será oferecidos às crianças em horário escolar, sem custo aos voluntários, que deverão ingerir 50 mL do produto oferecido pela pesquisadora uma vez por dia, no período da manhã, durante 2 semanas.
2- Os voluntários devem evitar faltar à aula durante 2 semanas, para que não sejam eliminados do estudo. No 26o dia do início da pesquisa, a saliva das crianças serão novamente coletadas.
3- Durante todo o período do experimento, a higiene bucal deve ser realizada normalmente, com escova e pasta fornecidos pela equipe de pesquisadores, porém não devem ser usados antissépticos bucais, ou produtos que contenham clorexidine em sua composição. A escovação e a alimentação não deve ser feita em intervalo de tempo menor que uma hora antes e uma hora após o consumo dos produtos.
4- As crianças participantes do estudo não deverão utilizar qualquer tipo de produto fluoretado (exceto água e a pasta de dente). Também não devem utilizar medicação antinflamatória ou antibiótica. Caso haja necessidade de uso de tais medicações, favor comunicar a pesquisadora, para que o voluntário seja excluído do estudo.
5- Os voluntários não deverão ingerir outra fonte de bactéria probiótica durante o experimento.
6- Qualquer dúvida entrar em contato com a pesquisadora Érika Gomes Sarmento pelo telefone (32) 99936-8485.
Obrigada pela colaboração,
Érika Gomes Sarmento
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Apêndice D Dados obtidos nos exames clínicos - Dentes superiores
Dentes
Volunt. 17 16 15/ 55
14/ 54
13/ 53 12 11 21 22
23/ 63
24/ 64
25/ 65 26 27
1 8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 8 2 8 0 0 0 0 0 0 0 0 A 0 0 0 8 3 8 0 0 0 0 0 0 0 0 A 0 0 0 8 4 8 0 0 0 0 0 0 0 0 A 0 0 0 8 5 8 0 0 0 0 0 0 0 0 A 0 0 0 8 6 8 0 A 0 A 0 0 0 0 8 0 A 0 8 7 0 1 D 0 0 0 0 0 0 0 0 A 1 0 8 8 0 A A A 0 0 0 0 A A A 0 8 9 8 0 A A A 0 0 0 0 A A A 0 8
10 8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 8 11 8 0 A 0 8 0 0 0 0 A 0 A 0 8 12 8 0 D D A 0 0 0 0 0 0 D 0 8 13 8 0 0 0 A 0 0 0 0 A 0 0 0 8 14 8 0 0 0 8 0 0 0 0 8 0 0 0 8 15 8 3 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 3 8 16 0 1 0 3 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 17 8 1 A 0 A 0 0 0 0 A 0 B 0 8 18 8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 8 19 8 0 A 0 0 0 0 0 0 0 0 A 0 8 20 8 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 C 0 8 21 8 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 8 22 8 0 0 0 0 0 0 0 8 0 0 D 0 8 23 8 0 A 8 0 0 0 0 0 A 8 A 0 8 24 8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 8 25 8 0 A A A 0 0 0 0 A 8 A 0 8 26 8 0 A 0 0 1 0 0 0 0 0 8 0 8 27 8 1 A 0 8 0 0 0 0 0 0 8 0 8 28 8 0 A A A 0 T T 0 A A A 0 8 29 8 0 E 0 D 0 0 0 0 B 0 0 1 8 30 8 0 0 0 0 0 T 0 0 0 0 0 1 0 31 8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 8 32 8 1 A A A A 0 0 A A 8 A 1 8 33 8 1 0 0 0 8 0 T 8 0 1 0 0 8 34 8 1 0 0 A 0 0 0 0 0 0 0 0 8 35 8 0 0 0 A 0 0 0 0 0 0 0 0 8 36 8 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 37 8 0 D A A 0 0 0 0 A 0 0 0 8 38 8 0 0 0 A 0 0 0 0 A 0 0 0 8 39 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 40 8 1 A 0 A 0 0 0 0 A 0 A 1 8 41 8 0 8 A A 0 0 0 0 A 0 8 0 8
82
Dados obtidos nos exames clínicos - Dentes inferiores
Dentes Volunt. 47 46
45/ 85
44/ 84
43/ 83 42 41 31 32
33/ 73
34/ 74
35/ 75 36 37
1 8 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 8 2 8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 8 3 8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 8 4 8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 8 5 8 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 8 6 8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 8 7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 8 8 0 A A A 0 0 0 0 8 0 A 0 8 9 8 0 A A 0 0 0 0 0 A A A 0 8
10 8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 A 0 8 11 8 0 A 0 A 0 0 0 0 A A A 0 8 12 8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 D D 0 8 13 8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 8 14 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 15 1 3 8 8 0 0 0 0 0 0 0 0 3 1 16 8 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 17 8 0 A 0 0 0 0 0 0 0 0 A 1 8 18 0 0 A 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 8 19 8 0 A 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 8 20 8 1 B 0 0 0 0 0 0 0 0 B 0 8 21 8 3 C D 0 0 0 0 0 0 0 0 3 0 22 8 3 D 0 0 0 0 0 0 0 0 B 3 8 23 8 0 A 0 0 0 0 0 0 0 0 A 0 8 24 8 0 0 0 8 0 0 0 0 8 0 0 0 8 25 8 0 A 0 0 0 0 0 0 0 0 A 0 8 26 8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 D 0 8 27 8 0 D 0 0 0 0 0 0 0 0 A 0 8 28 8 0 A A A 0 0 0 0 A A A 0 8 29 8 1 D 0 0 0 0 0 0 0 0 D 1 8 30 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 2 31 8 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 8 32 8 1 A 0 0 0 0 0 0 0 0 A 1 8 33 8 0 0 8 0 0 0 0 0 0 0 D 1 8 34 8 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 8 35 8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 8 36 2 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 8 37 8 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 A 0 8 38 8 0 A 0 0 0 0 0 0 0 0 A 0 8 39 1 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 40 8 3 A 0 0 0 0 0 0 0 0 A 0 8 41 8 0 8 0 A 0 0 0 0 A 0 8 0 8
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Índice de Sangramento Gengival (ISG) (+ ou -)
Dentes
Volunt.
54/55 ou
14/15
51 ou 11
64/65 ou
24/25
74/75 ou
34/35
71 ou 31
84/85 ou
44/45 1 - - - - - - 2 - - - - - - 3 - - - - - - 4 - - - - - - 5 - - - - - - 6 - - - - - - 7 - - - - - - 8 - - - - - - 9 - - - - - -
10 - - - - - - 11 - - - - - - 12 - - - - - - 13 - - - - - - 14 - - - - - - 15 - - - - - - 16 - - - - - - 17 - - - - - - 18 - - - - - - 19 - - - - - - 20 - - - - - - 21 - - - - - - 22 - - - - - - 23 - - - - - - 24 - - - - - - 25 - - - - - - 26 - - - - - - 27 - - - - - - 28 - - - - - - 29 - - - - - - 30 - - - - - - 31 - + - - - - 32 - - - - - - 33 - - - - - - 34 - - - - - - 35 - - - - - - 36 - - - - - - 37 - - - - - - 38 - - - - - - 39 - - - - - - 40 + + - - - - 41 - - - - - -
84
Índice de Placa (IP) Escores de 0 a 3
Dentes
Volunt.
54/55 ou
14/15
51 ou 11
64/65 ou
24/25
74/75 ou
34/35
71 ou 31
84/85 ou
44/45 1 0 0 0 0 1 0 2 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 4 2 2 2 2 2 2 5 2 2 2 2 2 2 6 1 2 1 1 0 0 7 1 1 1 0 1 1 8 0 0 0 0 0 0 9 1 2 1 1 1 0
10 0 1 1 1 1 1 11 0 0 0 0 1 0 12 2 2 2 1 1 1 13 0 0 0 0 0 0 14 1 1 2 1 2 1 15 1 1 1 0 0 0 16 1 1 1 0 0 1 17 0 2 2 0 0 0 18 3 2 2 2 1 1 19 0 0 0 0 0 0 20 2 1 1 1 2 1 21 1 1 1 1 2 1 22 1 0 1 1 1 0 23 0 0 1 1 0 0 24 0 1 0 0 1 0 25 1 1 1 1 1 0 26 0 1 1 1 1 0 27 0 0 0 0 0 0 28 1 1 2 0 0 0 29 3 3 2 2 2 2 30 1 2 2 1 1 1 31 2 2 2 2 2 2 32 2 2 2 1 1 2 33 0 1 0 0 0 0 34 2 2 2 1 1 1 35 1 1 1 0 1 0 36 2 1 2 1 2 1 37 0 2 0 0 1 0 38 0 0 0 1 1 1 39 1 1 1 0 1 0 40 2 2 1 1 1 1 41 0 0 0 0 0 0
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9. ANEXO
Anexo A
Figura - Ficha de avaliação sensorial. Fonte: MINIM, 2013.
