RNA BIOLOGY 2007-12-15

(Manuel Santos)

Exam preparation: The 5´and 3´ ends processing of Pre-mRNA

1. O que é a estrutura 5’-CAP do m RNA? Como é sintetizada?

A estrutura 5’CAP pode ser encontrada na extremidade 5’ da molecula de

RNA e consiste num nucleotido de guanina ligado ao mRNA atraves de

uma ligação trifosfatidica. Esta guanosina é metilada na setima posição

por uma metil transferase e designa-se por 7-metilguanosina cap

2. Further modifications include the possible methylation of the 2' hydroxy-groups of the first 3 ribose sugars of the 5' end of the mRNA. The methylation of both 2' hydroxy-groups is shown on the diagram.

3. Functionally the 5' cap looks like the 3' end of an RNA molecule (the 5' carbon of the cap ribose is bonded, and the 3' unbonded). This provides significant resistance to 5' exonucleases.

The starting point is the unaltered 5' end of an RNA molecule. This features a final nucleotide followed by three phosphate groups attached to the 5' carbon.

1. One of the terminal phosphate groups is removed (by a phosphatase), leaving two terminal phosphates.

2. GTP is added to the terminal phosphates (by a guanylyl transferase), losing two phosphate groups (from the GTP) in the process. This results in the 5' to 5' triphosphate linkage.

3. The 7-Nitrogen of guanine is methylated (by a methyl transferase).4. Other methyltransferases are optionally used to carry out methylation of 5' proximal

nucleotides.

Para ocorrer formação da CAP um fosfato da extremidade 5’ do RNA deve ser

liberado por hidrólise, gerando uma extremidade 5’ difosfato, Essa

extremidade difosfato deve então se ligar a um átomo de fósforo a de um

GTP, gerando uma ligação incomum 5’-5’ trifosfato. O nitrogênio que se

encontra na posição 7 da guanina da extremidade deve então sofrer uma

metilação, mediada pela enzima S-adenosil-metionina, formando o chamado

cap 0. As riboses dos dois primeiros nucleotídeos do RNA podem também ser

metiladas na extremidade 2'-OH, formando os chamados cap 1 e cap 2.

4. Quais as funções principais da estrutura CAP?

É uma modificação que ocorre na extremidade 5’ e que confere á molecula de

mRNA maior estabilidade, protége-a da acção de fosfatases e nucleases e

aumenta a probabilidade desse RNA ser capturado pelos ribossomas para

tradução, esta estrutura não está presente no tRNA e no rRNA acontecendo

principalmente nos mRNA e hnRNA.

1. Regulation of nuclear export.2. Prevention of degradation by exonucleases.3. Promotion of translation (see ribosome and translation).4. Promotion of 5' proximal intron excision.

3. O que é a poliadenilação do pre-mRNA?

É a adição de uma cauda de poliadenilato ao mRNA na sua extremidade 3’, esta

cauda é composta por múltiplas adenosinas monofosfatadas (só com adeninas),

tem a função de actuar como acentuadora da tradução, proteger o mRNA da

digestão por nucleases presentes no meio e proporcionar uma maior

estabilidade à molécula. Especula-se que ela também tenha um papel importante

no transporte do mRNA para o citoplasma.

É interessante notar que o nucleotídeo que se encontra logo antes da cauda poli-

A não é o último que será traduzido e podem haver mais centenas de

nucleotídeos além da extremidade 3’ de um RNA maduro.

4. O que é o sinal de poliadenilação? Para que serve?

O mRNA é clivados através de uma endonuclease específica que reconhece a

seqüência AAUAAA, no entanto, apenas essa seqüência não é suficiente para que

ocorra o corte, é também necessário que haja um contexto ainda desconhecido

de nucleotídeos próximos que caracterizem a região.

Após o corte, uma enzima polimerase poli-A, dependente de ATP, acrescenta os

nucleotídeos contendo a base adenina na extremidade 3’ do RNA. Serve para

acentuadora da tradução, proteger o mRNA da digestão por nucleases presentes

no meio e proporcionar uma maior estabilidade à molécula.

5. O que é um forte sinal de poliadenilação? O que é um sinal fraco de

poliadenilação?

Um sinal forte de poliadenilação é a sequencia AAUAAA (NNUANA).

Um sinal fraco de poliadenilação é a sequencia AAUAAG

6. O que é um sinal DSE? Descreve o sinal de poliadenilação. Indica os

elementos cis.

Dois sinais directos indicam á RNA polymerase II para parar a transcrição: os

sinais localizados junto á polyA e um elemento adicional a jusante (DSE-

downstream element) localizado na região de termino. O sinal de DSE

(135pb) actua pausando a elongação da polymerase.

7. Quais são as funções mais importantes da poliadenilação do mRNA?

A poliadenilação do mRNA adiciona a este uma cauda que protégé a

molecula de mRNA de degradação enzimatica, adiciona uma terminação

transcripcional, ajuda na translação do mRNA do nucleo para o

citoplasma.

Mecanismo da poliadenilação:

A maquinaria da poliadenilação no nucleo dos eucariotas trabalha em productos

da RNA polymerase II como o mRNA. Neste um complexo de multi-proteinas

CPSF: cleavage/polyadenylation specificity factor

CstF: cleavage stimulation factor

PAP: polyadenylate polymerase

PAB2: polyadenylate binding protein 2

CFI: cleavage factor I

CFII: cleavage factor II

Cliva a maior parte do RNA recentemente produzido junto á extremidade 3’ e

poliadenila o final produzido por esta clivagem. A civagem é catalizada pela

enzima CPSF e ocorre cerca de 10-30 nucleotidos a jusante do sitio de ligação,

geralmente designado pela sequencia de AAUAAA embora existam algumas

variantes que se ligam mais fracamente ao CPSF). Duas outras proteinas

especificas em se ligarem ao RNA são a CstF e a CFI. A Cstf liga-se a uma região

rica em GU a jusante da ligação (2ª regiao de ligação) do CPSF e a CFI reconhece

um terceiro sitio de ligação no RNA ( a sequencia UGUAA nos mamiferos) e

recruta a CPSF mesmo que a sequencia AAUAA não exista. O RNA é clivado apos a

trasncrição e o CstF liga-se á RNA polymerase II, esta clivagem envolve a

proteina CFII. Quando o RNA é clivado a poliadenliação começa catalisada pela

poliadenilato polymerase que construi uma cauda PoliA adicionando unidades

de adenosina monofosfatada ao RNA clivando o pirofosfato, a proteina PAB2 liga-

se á nova cauda PoliA e aumenta a afinidade da poliadenilato polymerase para o

RNA. Quando a cauda tem aproximadamente 250 nucleotidos a enzima não se

consegue ligar mais ao complexo CPSF e a poliadenilação pára. Esta maquinaria

tambem está ligada fisicamente ao spliceossoma (um complexo que remove

intrões do RNA)

8. Onde se situa o sitio de clivagem em relação ao maior sinal de poliadenilação?

Entre 15 e 30 nucleotideos á frente do sinal AAUAAA

9. O que é o complexo CPSF? Como é formado e qual a sua principal função?

CPSF – Cleavage and polyadenylation specificity factor

Está envolvido na clivagem do pré-mRNA sendo a primeira proteina a ligar-se

junto á zona de sinalização (á sua esquerda a AAUAAA) á qual a cauda de

poliadenilação se vai ligar atraves da poliadenina polymerase.

É um complexo proteico formado por quarto proteinas, a CPSF-30, a CPSF-73, a

CPSF-100 e a CPSF-160. A CPSF-73 é a endonuclease que cliva o mRNA

precursor, a ligação da poliadenina polymerase é um requesito para ocorrer a

clivagem.

10. O que é o complexo CstF? Aonde se vai ligar? Qual a sua principal função?

CstF - Cleavage stimulation factor

É uma proteina heteromerica com cerca de 200 kd que está envolvida na

clivagem da região 3’ sinalizada de uma molecula de mRNA. Esta proteina é

recrutada pela CPSF e contem um complexo proteico que monta a sintese

functional de uma cauda de poliadenilação da qual resulta uma molecula de

RNA Madura para exportar do nucleo para o citoplasma.

Este factor é dependente das fases do ciclo cellular estando

significativamente aumentado na transição da fase G0 para a fase S.

11. Qual a função da polyA polimerase? Que tipo de Poly A polimerases

existem?

A função da poliA polymerase é catalizar a adição de adenosina ao terminal 3’

do RNA numa seuquencia de forma independente recorrendo ao uso de ATP

e produzindo pirofosfato e um residuo nucleotidico mais longo.

Estas enzimas pertencem á familia das transferases, ou seja enzimas que

transferem grupos nucleotideos que contêm fosforo.

Existem as Poly(A) polymerase, Poly(A) synthetase, Polyadenylate

nucleotidyltransferase, Polyadenylate polymerase, Polyadenylate synthetase,

Polyadenylic acid polymerase, Polyadenylic polymerase

12. Como são formadas as primeiras 10 As formadas durante a poliadenilação?

Indica os factores cis e trans envolvidos.

Estes dependem do sinal da sequencia inicial e a sua adição ocorre de forma

lenta

13. O que acontece após a adição das primeiras 10 As? Descreve o mecanismo da

elongação da poliA.

A elongação é independente do sinal da sequencia inicial, depende da oligoA

adicionada durante a inicição, a adição de bases de A é rapida (mais 200) e

requer o factor PABPN1 ou PABPII (poly-adenine binding protein II) que

aumenta o processamento da poliA polymerase.

14. Como é a poliA degradada? Indica as enzimas envolvidas no encurtamento da

cauda poliA?

A deadenilação e degradação pode ocorre no citoplasma, em mamiferos, a poliA

ribonuclease PARN pode-se ligar á 5’CAP e remover nucleotidos da cauda poliA.

O nivel de acesso á 5’CAP e á cauda poliA é importante no controlo do tempo de

degradação do mRNA. A PARN pode remover menos As se o RNA estiver ligado

aos factores de inicição 4E no 5’CAP e ao 4G na cauda poliA, desta forma a

translação reduz a eliminação de bases. O racio de deadenilação pode ser

regulado por proteinas com especificidade para o RNA, assim que a cauda poliA é

removida o complexo de deccaping remove a 5’CAP e degrada o RNA

15. O que acontece quando a cauda poliA do mRNA é removida ou degradada?

As caudas de PoliA no citoplasma são encurtadas gradualmente e os mRNAs com

caudas mais pequenas são traduzidos menos vezes e degradados mais depressa.

16. O que é um elemento cis de nome ARE?

Uma sequência rica em adeninase uracilos(ARE)localizada 60nt a montante da

cadeia de poli(A) confere o controlo.

17. Descreve a maturação citoplasmatica da cauda poli A? Indica os elementos cis

e trans que participam neste processo biologico?

18. Qual é a função da proteina de ligação da poliA PABP?

É uma proteina que se liga á cauda da poliA, a sua isoforma nuclear liga-se

selectivamente a cerca de 50 nucleotidos e estimula a actividade da poliA

polymerase.

19. Comente a frase: a poliadenilação ocorre no nucleo e é cotranscricional.

A poliadenilação ocorre no nucleo e sem ela o RNA seria degradado no

citoplasma portanto pode-se considerar cotranscicional.

20. Comente a frase: Nem todos os genes possuem um sinal de poliadenilação.

21. Comente a frase O sinal AAUAAA é necessario mas não é suficiente para a

poliadenilação.

22. Quais as consequencias de mutações no sinal AAUAAA

As consequencias podem resultar num sinal mais fraco ou num sinal

irreconhecivel.

23. Comente a frase: Um sinal de poliA fraco é mais propenso á regulação.

24. What is the function of the USE signal in polyadenylation? Does it always

exist?

25. As histonas pre-mRNA não são poliadeniladas. Porque?

Estas acabam num stem-loop seguido de uma sequencia rica em purinas (cerca

de 20 nucleotidos) chamada de histone downstream element HDE que dirige

onde o RNA é cortado de modo a que a finalização das histonas se forme.

26. Pre-mRNA 3´-end formation can be regulated. How? Describe an example?

27. How can defective 3´-end pre-mRNA processing cause disease?

28. What is alternative polyadenylation? What is its function?

Uma vez que a poliadenilação alternativa altera o comprimento da 3’UTR pode

alterar os sitios de ligação para os microRNA que esta região pode ter. Os

microRNA têm tendencia a reprimir a translação e promovem a degradação dos

mRNAs a que se ligam, embora existam alguns que estabilizem a transcrição. A

poliadenilação alternativa pode tambem encurtar a regiao codificada o que pode

fazer um mRNA para uma proteina diferente embora seja raro.

Ou seja poliadenila em sitios diferentes??

29. Comment the sentence: “Formation of mRNA 3´-ends in eukaryotes is

regulated and interrelated with other steps in mRNA synthesis?

30. Comment the sentence: “Transcription and pre-mRNA processing are

coordinated processes”.

RNA BIOLOGY 2007

(Manuel Santos)

Exam preparation: mRNA translation.

1. Describe in general terms the mechanism of 5´-UTR scanning?

2. What is the role of the context of the AUG initiation codon?

3. What is the effect of mRNA secondary structure on 5´-UTR scanning?

4. What is the function of eIF1, eIF1A and eIF2 in translation initiation?

5. What is the function of eIF3 in translation initiation? And eIF4?, eIF5? and

eIF6?

6. Describe the composition of the 40S-eIFs complex during the initial stages of

scanning?

7. What is the main function of eIF4E? what is eIF4F? describe its composition

and

how it activates mRNA translation?

8. What is the main function of the ternary complex?

9. What is the role of GTP hydrolysis during the initiation phase of mRNA

translation?

10. How is GDP recycled on the eIF2 subunit?γ

11. Which eIF is an helicase? What is its function during translation?

12. What is the functional relevance of eIF2 phosphorylation by HRI, PKR, PERKα

and

GNC2 kinases?

13. eIF4G is called an adaptor initiation factor? Why? Describe its function in CAP

and

non-CAP mediated initiation?

14. What is an IRES? How does it work?

15. Why is the polyA binding protein (PABP) relevant for translation initiation?

16. Some mRNA are not capped but still translate efficiently. Explain how is this

possible?

17. Describe all types of alternative translation initiation?

18. What is an uORF? What is its main function? And when is it used?

19. Why do translation initiaton defects cause disease?

20. Comment the sentence: “Cells respond to stress by reprogramming gene

expression

at the translational level”

21. Comment the sentence: “Virus reprogram gene expression of the host cell at

the

translational level”.

22. mRNA translation defects causes neurodegenerative disease. How?

23. Comment the sentence: “the 5´-UTR is an important control point of mRNA

translation”

24. Comment the sentence: “The interaction of the 5´-UTR and the 3´-UTR is

important

for translation efficiency.”

25. How do the ends of mRNAs interact?

RNA BIOLOGY 2007

(Manuel Santos)

Exam preparation: Splicing

1. O que é um intrão? Define o conceito de splicing nos termos gerais?

Um intrão é uma zona do gene não codificada. O splicing apenas ocorre em

celulas eucarioticas e remove os intrões juntando os exões durante a transcrição.

A estrutura que cliva essas ligações nucleotidicas é o spliceossoma.

2. O que é um sinal de splicing? Descreve os varios elementos de um sinal de

splicing?

A maioria dos intrões começa com GU - dador de splice - e acaba com AG – splice

acceptor site.

A sequencia de consenso na extremidade 5’ é AGGUAAGU e na extremidade 3’

são 10 C ou U, seguidos de uma base qualquer, de um C e de AG.

O splicing ocorre em duas estapas: duas transesterificações. A transesterificação

é a transferência da ligação fosfodiester. A primeira reação ocorre pelo ataque

nucleofílico da adenina do sítio de ramificação à Guanina no sítio de splice 5'.

Com a transferência da ligação fosfodiéster, é formada uma estrutura de alça. A

segunda reação se dá pela ligação de um éxon com o outro, soltando assim o

íntron, que será degradado e reciclado na célula.

3. What is a strong splicing signal? How does it differ from a weak signal?

As sequencias GU e AG não são suficientes para se denotar a presença de um

intrão, outra sequencia importante é o branch site localizado 20 a 50 bases á

frente do sitio de aceitador. A sequencia de consenso deste sitio é a

CU(A/G)A(C/U) onde A é conservado em todos os genes.

4. O que é um spliceossoma? Qual a sua função?

Um spliceossoma é um complexo que remove introes de mRNA transcrito, é

composto por 5 pequenas snRNPs ou seja pequenas unidades proteicas de RNA

nuclear, que são a U1, U2, U4, U5 e a U6 que participam em diversas interacções

entre RNA-RNA ou RNA-proteina. O RNA que as compoe é rico em U.

- Assegura a conservação da sequencia reconhecendo os splicing sites

- Precisão nucleotidica na junção de exões

- Condensa os exões (informação importante)

5. O que é um snurp? Quantos snurps existem? Descreve os seus components.

São as subunidades do spliceossoma ou snRNPs – small nuclear RNA proteins, ou

seja pequenas unidades proteicas de RNA nuclear, que são a U1, U2, U4, U5 e a

U6 que participam em diversas interacções entre RNA-RNA ou RNA-proteina.

6. Comenta a frase: O spliceossoma é uma maquina molecular.

7. Qual é a função dos factores de splicing não-snRNP?

E Complex-U1 binds to the GU sequence at the 5' splice site, along with

accessory proteins/enzymes ASF/SF2, U2AF (binds at the Py-AG site),

SF1/BBP (BBP=Branch Binding Protein);

A Complex-U2 binds to the branch site and ATP is hydrolyzed;

B1 Complex-U5/U4/U6 trimer binds, and the U5 binds exons at the 5' site,

with U6 binding to U2;

B2 Complex-U1 is released, U5 shifts from exon to intron and the U6 binds

at the 5' splice site;

C1 Complex-U4 is released, U6/U2 catalyzes transesterification, that make

5'end of introns ligate to the A on intron and from a lariat ,U5 binds exon

at 3' splice site, and the 5' site is cleaved, resulting in the formation of the

lariat;

C2 Complex-U2/U5/U6 remain bound to the lariat, and the 3' site is

cleaved and exons are ligated using ATP hydrolysis. The spliced RNA is

released and the lariat debranches.

8. Describe the mechanism of splice site selection?

The model for formation of the spliceosome active site involves an ordered, stepwise assembly of discrete snRNP particles on the hnRNA substrate. The first recognition of hnRNAs involves U1 snRNP binding to the 5' end splice site of the hnRNA and other non-snRNP associated factors to form the commitment complex, or early (E) complex in mammals.[8][9] The commitment complex is an ATP-independent complex that commits the hnRNA to the splicing pathway.[10] U2 snRNP is recruited to the branch region through interactions with the E complex component U2AF (U2 snRNP auxiliary factor) and possibly U1 snRNP. In an ATP-dependent reaction, U2 snRNP becomes tightly associated with the branch point sequence (BPS) to form complex A. A duplex formed between U2 snRNP and the hnRNA branch region bulges out the branch adenosine specifying it as the nucleophile for the first transesterification.[11]

The presence of a pseudouridine residue in U2 snRNA, nearly opposite of the branch site, results in an altered conformation of the RNA-RNA duplex upon the U2 snRNP binding. Specifically, the altered structure of the duplex induced by the pseudouridine places the 2' OH of the bulged adenosine in a favorable position for the first step of splicing.[12] The U4/U5/U6 tri-snRNP (see Figure 1) is recruited to the assembling spliceosome to form complex B, and following several rearrangements, complex C (the spliceosome) is activated for catalysis.[13][14] It is unclear how the triple snRNP is recruited to complex A, but this process may be mediated through protein-protein interactions and/or base pairing interactions between U2 snRNA and U6 snRNA.The U5 snRNP interacts with sequences at the 5' and 3' splice sites via the invariant loop of U5 snRNA[15] and U5 protein components interact with the 3' splice site region.[16]

Upon recruitment of the triple snRNP, several RNA-RNA rearrangements precede the first catalytic step and further rearrangements occur in the catalytically active spliceosome. Several of the RNA-RNA interactions are mutually exclusive; however, it is not known what triggers these interactions, nor the order of these rearrangements. The first rearrangement is probably the displacement of U1 snRNP from the 5' splice site and formation of a U6 snRNA interaction. It is known that U1 snRNP is only weakly associated with fully formed spliceosomes[17], and U1 snRNP is inhibitory to the formation of a U6-5' splice site interaction on a model of substrate oligonucleotide containing a short 5' exon and 5' splice site.[18] Binding of U2 snRNP to the branch point sequence (BPS) is one example of an RNA-RNA interaction displacing a protein-RNA interaction. Upon recruitment of U2 snRNP, the branch binding

protein SF1 in the commitment complex is displaced since the binding site of U2 snRNA and SF1 are mutually exclusive events.Within the U2 snRNA, there are other mutually exclusive rearrangements that occur between competing conformations. For example, in the active form, stem loop IIa is favored; in the inactive form a mutually exclusive interaction between the loop and a downstream sequence predominates.[14] It is unclear how U4 is displaced from U6 snRNAm, although RNA has been implicated in spliceosome assembly, and may function to unwind U4/U6 and promote the formation of a U2/U6 snRNA interaction. The interactions of U4/U6 stem loops I and II dissociate and the freed stem loop II region of U6 folds on itself to form an intramolecular stem loop and U4 is no longer required in further spliceosome assembly. The freed stem loop I region of U6 base pairs with U2 snRNA forming the U2/U6 helix I. However, the helix I structure is mutually exclusive with the 3' half of an internal 5' stem loop region of U2 snRNA.

Mechanism of Splicing

  U1 snRNP   binds specifically to the 5′ splicing site sequences in the RNA  

and   also binds to conserved residues on the 3′ splice site                               

    U2 snRNP   binds to the branch  point ,  helped  by the U2 snRNP

auxiliary factor (U2AF).

(U2AF binds to the   polypyrimidine U-C rich region    adjacent to the 3′

splice site and positions the U2 snRNP on the branch point.)

Tri-snRNP complex  (U4+U5+U6) joins in. The 5′ splice site has an

adjacent conserved sequenceof exon to which the U5snRNA binds,

forming the spliceosome sites where the catalysis can occur 

For initiation, nucleophilic substitution occurs at the 5′ splice junction by

the 2′-hydroxyl group of the branch point adenosine.

Pairimg between  U1 and intromn sequence is destabilized and U5 SnRNA

bonds more strongly with 5' site

Bond between U4 and U6  atrophies and U6 now bonds with both 5'site

and branch point

U1 (used for identification of 5' splice site) and U4 quits(needed for

bringing  U6 to catalytic site)

Newly freed  5'exon replaces the 3' splice junction y  by 3'OH group

U5   retains  contact with 5'end and  free exon but also contacts  with 3'

splice junction

Eventually the introns are removed and the exons form the mature mRNA

by larhiat structure formation

9. What is an ESE? What is a ESS? What is an ISE? What is an ISS?

10. Qual a função das proteinas SR no splicing?

Estas proteinas são ricas em serina e arginina e estão envolvidas na regulação e

selecção dos sitios propicios a splicing no mRNA.

Tambem o splicing alternativo requer estas proteinas uma vez que seleccionam

os sitios alternativos de splicing a usar.

11. Describe the Spliceosome assembly cycle?

12. Quanto spliceossomas existem nos eucariotas? Quais as principais diferenças

entre eles?

Existem 3 tipos de spliceossoma:

- O maior que divide os introes com GU a 5’ e AG a 3’, é composto pelos

snRNPs U1, U2, U4, U5 e U6 e está activo no nucleo.

- O menor que é similar ao maio embora remova introes raros com sequencias

de splice diferentes, é composto por snRNP U5, U11, U12, U4atac e U6atac,

pode ser encontrado no nucleo.

- Trans-splicing que é uma forma de splicing que junta dois exoes que não

estão no mesmo RNA a ser transcrito.

13. Porque é que alterações no splicing causam doenças?

Alterações no splicing implicam alterações nas proteinas traduzidas, erros

comum de splicing passam pela perda de função de um sitio de splice resultando

na exposição permatura de um codao de stop, perda de um exão ou inclusão de

um intrão; mutação de um sitio de splice reduzindo a sua especificidade

causando deleções ou inserções de aminoacidos,; inclusão ou exclusão de mais

RNA que o esperado resultando em exões maiores ou mais pequenos.

14. What is alternative splicing? What is its main function?

Splicing alternativo é a recombinação de diferentes exoes, tem como função

possibilitar uma maior diversidade genetica nos eucariotas.

15. Does alternative splicing exist in all eukaryotes? Where is it prevalent?w

16. How does alternative splicing switch off gene expression?

17. How does a cell choose a splice site during alternative splicing?

18. What are alternative splicing regulators? Give examples of each type?

19. Why is the concentration of splicing factors so critical during alternative

splicing?

20. Comment the sentence: “alternative splicing is co-transcriptional and

sometimes

depends on speed of transcription”.

21. What is the exon junction complex (EJC)? What does it do?

22. Why is the EJC relevant to mRNA nonsense mediated decay?

23. Comment the sentence “splicing is an ancient biological process”. If you agree

with

the sentence describe the molecular evidence for early evolution of splicing?

24. Comment the sentence: “Identical pre-mRNAs are differentially spliced in

different

organs”.

25. Comment the sentence: “In vertebrates, in particular in humans, the number

of

proteins is much higher than the number of genes”.

RNA BIOLOGY 2007

(Manuel Santos)

Exam preparation: mRNA stability and Decay.

1. What are the main functions of the CAP and polyA in mRNA stability?

2. What is a premature termination codon?

3. Describe in general terms the concept on mRNA quality control, referring to

mRNA

surveillance mechanisms?

4. What is the exosome? How does it work? And how is it constituted?

5. Describe the mechanism of 5´to 3´ mRNA degradation? Identify the

ribonucleases

involved in this process.

6. What is mRNA decapping? What is its main function?

7. What is mRNA deadenylation? What is its main function?

8. Why is the interaction between 5´and 3´ mRNA ends relevant for mRNA

stability?

9. How do the 5´ and 3´ ends of mRNA interact? How does the interaction

becomes

disrupted? What happens when it is disrupted?

10. What is an Exon Junction complex (EJC)? What is its function (s)?

11. What is NMD? Describe in general terms how it works?

12. What is the functional relevance of NMD?

13. Describe the roles of UPF1, UPF2 and UPF3 in NMD?

14. What is the role of the eRFs in NMD?

15. How does the NMD machinery recognize a premature termination codon

(PTC)?

16. Explain how the iron metabolism is regulated at the translational level?

17. What is an ARE and how does it work?

RNA BIOLOGY 2007

(Manuel Santos)

Exam preparation: Biology of microRNAs.

1. o que é o microRNA (miRNA)?

MicroRNAs (miRNAs) are short ribonucleic acid (RNA) molecules, on average only 22 nucleotides long and are found in all eukaryotic cells. miRNAs are post-transcriptional regulators that bind to complementary sequences on target messenger RNA transcripts (mRNAs), usually resulting in translational repression and gene silencing.[1][2] The human genome may encode over 1000 miRNAs,[3]

[4] which may target about 60% of mammalian genes[5] and are abundant in many human cell types.[6]

miRNAs show very different characteristics between plants and metazoans. In plants the miRNA complementarity to its mRNA target is nearly perfect, with no or few mismatched bases. In metazoans on the other hand miRNA complementarity is far from perfect and one miRNA can target many different sites on the same mRNA or on many different mRNAs. Another difference is the location of target sites on mRNAs. In metazoans the miRNA target sites are in the three prime untranslated regions (3'UTR) of the mRNA. In plants targets can be located in the 3' UTR but are more often in the coding region itself.[7] MiRNAs are well conserved in eukaryotic organism and are thought to be a vital and evolutionary ancient component of genetic regulation.[8][9][10][11]

2. Describe the biogenesis of miRNAs and siRNAs in detail?

3. What are the main differences between Pri-mRNAs, pre-miRNAs and mature

miRNAs?

4. What is the main function of miRNAs and siRNAs?

Os miRNAs regulam a expressão génica regulando a quantidade de proteinas

produzidas por genes eucarioticos.

Os siRNA defendem e ajudam a proteger a integridade do genoma. Estes RNAs de

interferencia inibem a produção de virus e impedem a dispersão de elementos

de trasnposição para outros loci cromossomicos.

5. What is the main difference between miRNAs and siRNAs?

Os miRNAs regulama expressão génica e os siRNAs defendem o genoma

6. What is the main function of the Drosha complex?

7. What is the function of Dicer?

8. What is the RISC complex? What does it do?

9. What is the main function of argonaut proteins?

10. How do miRNAs control gene expression? Describe the mechanism in detail.

11. What is a stress granule? What is a P-body? What are the main differences

between

Stress granules and P-bodies?

12. Describe the main function of P-bodies?

13. How are P-bodies linked to the NMD pathway?

14. Comment the sentence: “miRNAs are repressors of gene expression”.

15. Why are miRNAs relevant to cancer biology? Describe a general mechanism

of

cancer development associated to miRNA biology.

16. Comment the sentence: “miRNAs are involved development, differentiation,

cell

proliferation and many human diseases”.

17. What is a miRNA expression profile? What is it used for? RNA BIOLOGY

17. What is a miRNA expression profile? What is it used for?