RODRIGO ROCHA LATADORODRIGO ROCHA LATADO

2

CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS INFRAESTRUTURA

Área de Preparo de Meios de Cultura

- água: destilador e deionizador, osmose reversaultra purificação

- balanças: analítica ou eletrônica (g até Kg) e (mg até g)

- agitador magnético, com aquecimento

- distribuidor de meio de cultivo - pHmetro

- drogas (sais)

- vidrarias

3

INFRAESTRUTURA

Área de Esterilização e Lavagem de Vidraria

- autoclave

- estufa para secagem

- estufa para esterilização

- máquina de lavar vidraria

4

INFRAESTRUTURA

Área de Manipulação e Exame das Culturas

- Capela (câmara) de fluxo laminar

- Microscópios: comum, invertido (com fluorescência) (câmara fotográfica ou acoplamento a

vídeo)

- Material para manipulação (pinças, bisturis, espátulas, etc...)

- Lupa

- Centrífuga

- Eletroporador

5

INFRAESTRUTURA

Câmara de fluxo laminar vertical

6

INFRAESTRUTURA

Câmara de fluxo laminar horizontal

7

INFRAESTRUTURA

Área de Incubação das Culturas

- sala com luz e temperatura, controladas

- incubadora

- agitador orbital (Shaker)

Área de Aclimatização das Plantas

- câmara úmida

- casa-de-vegetação

- telado

8

MEIOS NUTRITIVOS

Desenvolvimento de Plantas Inteiras

- nutrientes minerais (solo, água)- CO2

- Cfixado + minerais: síntese de vitaminas e hormônios- síntese de compostos orgânicos ocorre em diferentes órgãos

Desenvolvimento de Segmentos de Tecidos ou Órgãos Isolados

Cultivo in vitro- condições inadequadas de iluminação e CO2

- plantas não são completamente autotróficas- explantes com baixo teor ou ausência de clorofila

- necessidade de fornecer compostos orgânicos

9

MEIOS NUTRITIVOS

Meio Nutritivo ou Meio de Cultura

- fornecer substâncias essenciais para o crescimento- permitir que os explantes se desenvolvam em ambiente artificial- baseados nas exigências das plantas inteiras em sais minerais- suplementados com componentes orgânicos- controlam o padrão de desenvolvimento in vitro

10

MEIOS NUTRITIVOS

HISTÓRICO

- primeiros trabalhos: soluções inorgânicas simples

solução de Knop (1865)solução de Knudson (1925)solução de Hoagland & Arnon (1938)

- atualmente: meios de cultura mais completos

White (White, 1943)MS (Murashige & Skoog, 1962)B5 (Gamborg et al., 1968)KM (Kao & Michayluk, 1975)WPM

11

ÁGUA - Métodos de Purificação

Água grau primário - alto índice de impurezas - alta condutividade - utilizada para lavar vidraria

Água grau de laboratório - alto índice de pureza- baixo nível de orgânicos e microorganismos- utilizada no preparo de meios de cultura (microbiologia)

Água ultrapura (tipo 1)- estádio posterior à destilação e deionização- alta resistividade, baixo nível de orgânicos e microorganismos- utilizada em técnicas analíticas (HPLC, eletroforese capilar)- utilizada em biologia molecular

12

MÉTODOS DE PURIFICAÇÃO DE ÁGUA

Destilação: aquecer – ferver – evaporar a águacondensar o vapor e coletar

alto consumo de energia (1KW/litro)alto consumo de água (30l/litro)resistividade 1M-cmnão elimina CO2, amônia e voláteisprocesso lento

Deionização: resina de troca iônica

H+ cátionsOH- ánions

processo contínuoresistividade 18M-cmnão elimina orgânicos

13

MÉTODOS DE PURIFICAÇÃO DE ÁGUA

Osmose Reversa: pressão > pressão osmótica

90-98% íons orgânicos100% contaminantes não iônicos

moléculas orgânicas PM >100não remove gases

normalmente associado a resina de troca iônica

Adsorção por Carvão Ativado

remove cloro, orgânicos dissolvidosinstalado antes do equipamento de purificação

Filtração em Microporo: filtro de 0.22m

elimina bactérias e esporos de fungos

14

MEIOS NUTRITIVOS

Componentes Inorgânicos

macronutrientesmicronutrientes

Componentes Orgânicos

vitaminasfonte de C

reguladores vegetais outros: mio-inositol

aminoácidos antioxidantes

substâncias complexascarvão ativado

15

MEIOS NUTRITIVOS

COMPONENTES INORGÂNICOS

MACRONUTRIENTES

Nitrogênio: NH4NO3 e KNO3

Fósforo: KH2PO4 ou K2HPO4

Potássio: KH2PO4 e KI Cálcio: CaCl2*2H2O

Magnésio: MgSO4*7H2O

Enxofre: MgSO4*7H2O, MnSO4*H2O, ZnSO4*7H2O, CuSO4*H2O e FeSO4*7H2O

16

MEIOS NUTRITIVOS

COMPONENTES INORGÂNICOS

MACRONUTRIENTES

Nitrogênio: participa do desenvolvimento geral das plantas

NO3-: nitrato [25 - 40mM] Norg: aminoácidos

NH4+: amônia [2 - 20mM] ác. orgânicos

Total de N: [25 - 60mM] caseína hidrolisada

Fósforo: parte integrante de ác. nucléicos e compostos estruturais

PO4-: [1 - 3mM] Fosfato de sódio ou de potássio

aminoácidos proteínasNinorg

17

MACRONUTRIENTES

Potássio: atividades de membrana, controle da osmolaridade K+ : [20 - 30mM] acompanha nitratos e fosfatos

Cálcio: cofator de enzimas, síntese da parede celular

Ca+2: [1 - 3mM] cloreto ou nitrato de cálcio

Magnésio: integrante da clorofila, atividade de enzimas

Mg+2 : [1 - 3mM] sulfato de magnésio

Enxofre: estrutura das proteínas, presente em aminoácidos

SO4-2 : [1 - 3 mM] sulfato de magnésio

18

MICRONUTRIENTES

Boro: atividade enzimática, biossíntese de lignina ácido bórico: [100mM]

Cobalto: cloreto de cobalto: [0.1mM]

Cobre: atividade enzimática sulfato de cobre: [0.1mM]

Iodo: iodeto de potássio [5mM]

Ferro: síntese de clorofila, reações de oxi-redução presente na forma de quelato (EDTA) sulfato de ferro: [100mM]

19

MICRONUTRIENTES

Manganês: atividade enzimática (respiração e fotossíntese) sulfato de manganês: [30 - 100mM]

Molibdênio: cofator de enzimas molibdato de sódio: [1mM]

Zinco: atividade enzimática sulfato de zinco: [5 - 30mM]

20

COMPONENTES ORGÂNICOS

- Fontes de C: sacarose [2 - 5%] hidrolisado em glicose + frutose glicose

manitol, maltose, outros

- Vitaminas: (mg/l) tiamina: essencial (metabolismo de carboidratos e biossíntese de aminoácidos) ác. nicotínico piridoxina

- Outros: mio-inositol: carbohidrato (desenvolvimento de membranas e parede celular)

21

- Substâncias Complexas: água de coco extrato de levedura extrato de malte

caseína hidrolisada

- Antioxidantes: ácido ascórbico PVP (adsorção de fenóis) ácido cítrico

- Carvão Ativado: [0.2 - 3.0%] - adsorção fenóis liberados no meio de cultura - adsorção de componentes orgânicos (auxinas, citocininas) - contribui com o desenvolvimento de raízes

22

HORMÔNIOS / REGULADORES DE CRESCIMENTO

- essenciais, pois direcionam o processo morfogenético em cultura de tecidos vegetais ( 1 M até 40 M) Auxinas: primeiro hormônio vegetal identificado (AIA) associadas a sítios de alta divisão celular

in vivo: alongamento de célulasdominância apicalformação de raiz adventícia

in vitro: divisão celular, associada a citocininaformação de calodiferenciação de raízesinibe desenvolvimento de gemas

lateraisindução de embriogênese somática

23

Auxinas

auxina natural: IAA - ácido 3-indol acéticoIBA - ácido 3-indol butírico

auxina sintética: NAA - ácido naftaleno acético2,4-D - ácido 2,4-diclorofenoxi acético2,4,5-T - ácido 2,4,5-triclorofenoxi acético

substitutos de auxina: picloram, dicamba- alta concentração são herbicidas- in vitro atividade de auxina

inibidores da síntese de auxina: HNB - 5-hidroxi-nitrobenzil bromide7-AZA - 7-azaindole

inibidores do transporte de auxina: TIBA - ácido 2,3,5-triiodobenzóicoPCIB - acido isobutírico clorofenoxi acético NPA - ácido naftilphthalamico

COMPONENTES ORGÂNICOS

24

COMPONENTES ORGÂNICOS

Citocininas - dominância apical (indução de brotações múltiplas)

- balanço citocinina/auxina - divisão celular

citocinina natural: zeatina 2iP - 2-isopentenil adenina

citocinina sintética: BAP - 6-benzilaminopurinacinetina

derivados de feniluréia: TDZ – thidiazuronatividade de citocinina in vitroestimula síntese de citocinina natural

25

Giberelinas: isolada do fungo Gibberella fujikoroirelacionada com alongamento (altura) das plantasácido giberélico (GA3)

in vitro: inibe organogêneseinibe enraizamentoestimula alongamento de brotos

Ácido Abscísico: relacionado com a dormência de sementes e gemas

relacionado com a senescência, abscisão de folhas

in vitro: diminui o crescimento modera efeito de auxina/citocinina

regula desenvolvimento de embriões somáticos

COMPONENTES ORGÂNICOS

26

AGENTES GELIFICANTES

polissacarídeos, que servem como suporte as plantas ou explantes.

ágar-ágar produzido pela alga (Gelidium amansii) sofre hidrólise, quando autoclavado em meio ácido

Gelrite (Merck) produzido pela bactéria (Pseudomonas elodea) usado em menor quantidade (2,5 g/L)

mais transparente

Phytagel (Sigma) usado em menor quantidade (3,0 g/L) mais transparente

27

AGENTES GELIFICANTES

Agarose purificado a partir do ágar

Mais puro, porém muito mais caro vários tipos (diferentes pontos de solidificação)

-Agentes gelificantes podem podem induzir a hiperhidricidade (vitrificação) dos brotos ou plantas cultivadas in vitro.

Hiperhidricidade ou vitrificação - anomalia do tecido, na qual este fica rígido e quebradiço, havendo mal formação dos estômatos na plântula e dificuldade de enraizar.

28

PREPARO DE MEIOS DE CULTURA

PROCEDIMENTOS E CUIDADOS

- dissolver sais em água pura - dissolver auxinas em KOH+ água pura e estéril- dissolver citocininas em HCl + água pura e estéril

- não misturar produtos que podem precipitar- armazenar soluções de sais e vitaminas em geladeira- armazenar reguladores de crescimento em freezer- antes do uso, verificar se não há contaminação ou precipitação

29

PREPARO DE MEIOS DE CULTURA

UNIDADES DE CONCENTRAÇÃO

- Porcentagem de volume (% v/v):

exemplo: 5% de água de coco = 50ml água coco + 950ml água

- Porcentagem de peso (% p/v):

exemplo: 2% de sacarose = 20g de sacarose em 1000ml

- Molar (M): peso molecular (g/L)

ex. PM do AIA=175,18g 1M de AIA= 175,18g/L

30

UNIDADES DE CONCENTRAÇÃO

- Milimolar (mM): 1 M = 1.000 mM 1 mM = 1/1000M = 0,001M = 10-3 M

ex. PM do AIA=175,18g logo 1M de AIA= 175,18g/L

1 mM AIA = ??

como 1mM = 1/1000 M

1 mM = 0,1758 g/L = 175,18 mg/L de AIA

31

UNIDADES DE CONCENTRAÇÃO

- Micromolar ( M): 1 M = 1.000.000 M 1 M = 1/1.000.000 M = 10-6 M

ex. PM do AIA=175,18g logo 1M de AIA= 175,18g/L

1 M AIA = ?? como 1 M = 1/1.000.000 M

1 mM = 0,1758 g/L ou 175,18 mg/L de AIA

1 M = 0,0001758 g/L ou 0,17518 mg/L de AIA

32

UNIDADES DE CONCENTRAÇÃO

- mg/L ex. reguladores de crescimento

- Ppm: partes por milhão = mg/L

1 ppm = 1 parte em 1.000.000 partes

1 L água pura pesa 1 Kg 1 mL pesa 1 g 1 L pesa 1 mg logo 1 ppm = 1 mg em 1 Kg (mg/K) ou 1 L em 1 L (L/L) ou 1 mg em 1 L (mg/L)

33

MEIO DE CULTURA MS (Murashige & Skoog, 1962)

Meio líquido

ajustar o pH 5,8 a 6,0 esterilizar (filtração ou autoclavagem)

Meio semi-sólido ou sólido

ajustar o pH 5,8 a 6,0 acrescentar agente gelificante (Phytagel, ágar) esterilizar (filtração ou autoclavagem)

34

ASSEPSIA E ESTERILIZAÇÃO Assepsia - Conjunto de procedimentos para tornar um explante livre de microorganismos (bactérias, fungos filamentosos, leveduras, etc...).

Contaminação: crescimento de microorganismos (fungo e/ou bactéria) no meio de cultura.

Fontes: explante meio de cultura meio ambiente (área de trabalho/materiais) operador

Explantes: obtidos de plantas cultivadas no campo, em estufas ou in vitro.

35

ASSEPSIA E ESTERILIZAÇÃO Assepsia: folhas, sementes, gemas, etc...)

- lavar em água corrente com detergente- lavar em água corrente- banho em álcool 70%- hipoclorito de sódio (3:1) + gotas de tween- agitar 15 - 20 min.- na câmara asséptica, lavar com água esterilizada (3x)

Meios de Cultura

- Autoclave: calor úmido (121o C/ 15 - 20min.)

- Filtração: produtos sensíveis à temperatura (membrana 0,22m)

36

ASSEPSIA E ESTERILIZAÇÃO •Área de Trabalho/Materiais

- Esterilização de Vidraria e Material: calor seco (estufa: 140 - 180o C/ 2 a 4h.) calor úmido (autoclave) + secagem (estufa) raios-gama: plásticos descartáveis

Flambagem das pinças e bisturis durante o trabalho

- Limpeza Laboratório e Vidraria álcool: balcão e capela detergente + H2O destilada: vidraria desinfetante: chão