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MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

ROTEIRO DE PRÁTICAS

Professora: Jéssica Bomfim de Almeida

2014

Universidade Federal da BahiaCampus Anísio Teixeira

Instituto Multidisciplinar em Saúde

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RECOMENDAÇÕES GERAIS

O estudante deverá usar em aula prática "OBRIGATORIAMENTE" o jaleco. Lembre-se que de alguma forma você estará em contato com micro-organismos, e, portanto deve tomar todo cuidado para evitar se contaminar, ou transmitir infecção às pessoas do seu convívio. A bancada de trabalho deve estar livre, portanto é adequado que não se coloque nela cadernos e bolsas que não serão utilizados durante a fase experimental, evitando assim acidentes.

Em todos os trabalhos práticos, observe os seguintes critérios:

a) Bico de Bunsen com chama azulada - A utilização deste, visa flambar a alça ou a agulha bacteriológica e propiciar um ambiente asséptico ao redor do material que você manuseará, evitando assim resultados indesejáveis e diminuindo o risco de infecção por aspiração de partículas.

b) Alça ou agulha bacteriológica - Devem ser flambadas até o rubor, antes e após cada experimento. Saiba que antes elas são flambadas, para evitar resultados indesejáveis ao seu estudo, pois micro-organismos contaminantes do ar podem estar assentados sobre o material; e depois, a flambagem é obrigatória, pois esse material posteriormente poderá contaminar outras pessoas. Procure executar esse procedimento colocando o instrumento sobre a chama, numa posição vertical e nunca em posição horizontal, pois desta última forma você estará esterilizando apenas a porção final.

c) Abrir o tubo de cultura - Segure o tubo com a mão esquerda e retire a tampa com os dedos mínimo e anelar da mão direita, deixando livres os dedos médio, indicador e polegar para manuseio da alça bacteriológica ou pipeta, evitando assim deixar a tampa sobre a bancada o que levaria à sua contaminação.

e) Sempre que houver algum acidente, como quebra de tubos ou placas com micro-organismos, contato com material contaminado, etc. Avise ao professor no local, para que ele tome providências imediatas, dependendo do caso ou acidente, e jamais seja relaxado com os cuidados pessoais.

d) Ao final de todo trabalho prático além de organizar o seu local de trabalho e passar álcool 70 na bancada. Não se esqueça de lavar as mãos com água e sabão e posteriormente, álcool.

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SUMÁRIO

PRÁTICA I - CONSERVAÇÃO DE ALIMENTOS....................................................................3

PRÁTICA II – TÉCNICAS DE SEMEADURA E MEIOS DE CULTURA......................................4

PRÁTICA III – DILUIÇÃO E CONTAGEM DE UFC................................................................7

PRÁTICA IV - CONTAGEM TOTAL DE AERÓBIOS MESÓFILOS, PSICROTRÓFICOS, BOLORES E LEVEDURAS...................................................................................................9

PRÁTICA V - CONTAGEM DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS EM ALIMENTOS....................11

PRÁTICA VI - ANÁLISE DE COLIFORMES TOTAIS E FECAIS..............................................13

PRÁTICA VII - PROVAS BIOQUÍMICAS PARA IDENTIFICAÇÃO DE E. COLI........................16

PRÁTICA VII - DETECÇÃO DE SALMONELLA SPP. EM ALIMENTOS..................................19

PRÁTICA VIII - CONTAGEM TOTAL DE BACTÉRIAS LÁTICAS EM LEITES FERMENTADOS. 21

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PRÁTICA I - CONSERVAÇÃO DE ALIMENTOS

1. INTRODUÇÃOOs métodos de conservação têm o objetivo de aumentar a vida útil dos

alimentos através de técnicas que evitam alterações microbianas, enzimáticas, químicas e físicas, mantendo seus nutrientes e suas características organolépticas. As alterações mais importantes são as de origem microbiana, pois além de deteriorar os alimentos também podem provocar doenças. Sendo assim, os fatores intrínsecos e extrínsecos são utilizados nos processos de conservação com intuito de eliminar os micro-organismos ou inibir o crescimento microbiano.

2. OBJETIVOSAvaliar a importância dos fatores extrínsecos e intrínsecos na conservação de

alimentos e identificar qual forma de conservação de alimentos usuais no cotidiano é mais eficiente.

3.MATERIAIS: 7 béqueres, 1 pedaço de parafilme para vedação; 10 ml de vinagre; 2 colheres de sal; 1 panela pequena; 4 colheres de amido de milho; 500 ml de água.

4. PROCEDIMENTO:Em uma panela dissolva o amido de milho em água, misture bem e leve ao fogo

até engrossar. Adicione até a metade de cada béquer em seguida siga o procedimento a seguir:- Béquer 1- Deixe aberto em temperatura ambiente.- Béquer 2 - Cubra com o filme plástico, vede-o, e deixe-o em temperatura ambiente.- Béquer 3 - Adicionar vinagre e deixar em temperatura ambiente.- Béquer 4 - Adicionar sal e deixar em temperatura ambiente.- Béquer 5 - Colocá-lo na geladeira, sem cobertura.- Béquer 6 - Colocá-lo na geladeira, com cobertura.- Béquer 7 - Colocá-lo no freezer, sem cobertura.

5. RESULTADOS E DISCUSSÃOQual dos métodos testados é o mais eficiente e o menos eficiente para a

conservação dos alimentos? Por quê?

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PRÁTICA II – TÉCNICAS DE SEMEADURA E MEIOS DE CULTURA

1. INTRODUÇÃOO estudo dos micro-organismos necessita normalmente do seu prévio

isolamento e identificação. Para tanto diversos meios de cultura são utilizados e define-se meio de cultura como uma mistura de nutrientes, incluindo fontes de carbono, nitrogênio, sais minerais e água, que propiciam o crescimento in vitro dos micro-organismos. A semeadura visa transferir para o meio de cultivo o material que se deseja avaliar. Semear um micro-organismo é colocá-lo em um ambiente adequado, em meio de cultura apropriado ao seu desenvolvimento e reprodução. Ao semear, é preciso levar em conta as técnicas de assepsia nas manipulações, esterilidade do instrumento e dos meios de cultura empregados. A finalidade é isolar do material uma ou mais espécies microbianas, (repicar) uma cepa pura, visando conservá-la ou estudar as suas características morfológicas e bioquímicas. A semeadura, plantio ou inoculação de bactérias em meios de cultura pode ser feita mediante diversos procedimentos.

2. OBJETIVOS Introduzir técnicas de isolamento de bactérias.

3. MATERIAIS: Tubo com cultivo ativado por 24 horas Agar nutritivo em placas Tubo com caldo nutritivo Tubo com Agar nutritivo inclinado Placa de Petri esterilizada Alça bacteriológica (ou de platina) Alça de Drigalski Pipetas Ponteiras estereis Agar fundido a 45ºC Estufa de incubação

4. PROCEDIMENTO 4.1 Inoculação em superfície por esgotamento - estrias ou espalhamento em placas a) ESTRIAS 1) Flambar a alça na chama do bico de Bunsen, colocando-a verticalmente, até atingir a cor rubra. Repita este procedimento, se necessário.

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2) Resfriar a alça de platina calibrada na tampa do tubo de ensaio ou na lateral do tubo, no qual encontra-se a amostra a ser inoculada; 3) Realizar a inoculação primária, fazendo uma estria que cruza o centro da placa. Espalhar o inóculo uniformemente. 4) Girar a placa em ângulo de 90º e disseminar o inóculo até cobrir toda superfície, produzindo uma “esteira” de crescimento. 5) Identificar a placa e incubar a 35º-37ºC por 24 horas. As placas devem ser incubadas em posição invertida para evitar que a água de condensação formada caia sobre o

Agar.

b) ESPALHAMENTO – Spread plate 1) Com auxílio da pipeta, transferir 0,1ml da cultura para o centro da placa contendo o meio sólido; 2) Com auxílio da alça de Drigalsky estéril espalhar todo o inóculo até que seja todo absorvido pelo meio de cultura. 3) Entre o espalhamento de uma placa e outra, a alça de Drigalsky deverá ser flambada – embeber no álcool a 70% e levar a chama. (ATENÇÃO: redobrar o cuidado e atenção durante este procedimento, para evitar acidentes); 4) Identificar a placa, incubar em posição invertida por 35º-37ºC por 24 horas. As placas devem ser incubadas em posição invertida para evitar que a água de condensação formada caia em cima do agar.

4.3 Inoculação em Profundidade (pour plate) 1) Com auxílio da pipeta, adicionar assepticamente 1mL do inóculo fora do centro (para facilitar a homogeneização) da placa de Petri, estéreis e vazias (abrindo a placa apenas o suficiente para inserir a pipeta, próximo ao bico de Bunsen);

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2) Adicionar 15 a 20 ml do ágar previamente fundido e resfriado a 45ºC. 3) Misturar delicadamente o inóculo com o meio de cultura, em movimentos circulares no sentido horário e anti-horário. 4) Esperar solidificar completamente, incubar em posição invertida a temperatura de 35º-37ºC, por 18 a 24 horas.

4.2 Técnica da inoculação em tubo de ensaio - Agar inclinado 1) Flambar a alça de platina na chama do bico de Bunsen, colocando-a verticalmente, até atingir a cor rubra. Repita este procedimento, se necessário. 2) Resfriar a alça no meio de cultura, de preferência nas bordas do meio, caso amostra a ser inoculada esteja em suspensão resfriar na tampa do tubo de ensaio ou na lateral do tubo; 3) Introduzir a agulha no meio até 2 a 3mm do fundo do tubo, em seguida retira-se a agulha e estria a superfície do meio, em movimento em “s”, de baixo para cima.

4.3 Técnica da inoculação em tubo com caldo - difusão 1)Flambar a alça de platina na chama do bico de Bunsen, colocando-a verticalmente, até atingir a cor rubra. Repita este procedimento, se necessário. 2) Resfriar a alça no meio de cultura, de preferência nas bordas do meio, caso amostra a ser inoculada esteja em suspensão resfriar na tampa do tubo de ensaio ou na lateral do tubo; 3)Inclinar e inocular na lateral do tubo próximo ao nível do meio de cultura; 4)Recolocar o tubo na posição vertical; 5)Homogeneizar o tubo no agitador de tubo.

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PRÁTICA III – DILUIÇÃO E CONTAGEM DE UFC

1. INTRODUÇÃO Em alguns ensaios microbiológicos, em especial os destinados à contagem, se faz necessário diluir a amostra com o intuito de reduzir a população para facilitar a contagem. Para tanto, chamamos esta etapa inicial durante o ensaio microbiológico de Diluição Seriada – a amostra é diluída sucessivamente em ordem decimal em um diluente, podendo ser: água peptonada, água estéril, solução salina 0,85% e outros.

Diluição é o procedimento de adição de uma substância a outra para reduzir a concentração de uma das substâncias. O uso mais comum da palavra diluição ocorre no sentido de que “tantas partes de um material estão sendo diluídas em um número total de partes do produto final (diluente + material)”. Diluições decimais seriadas: São diluições decimais preparadas em série e que possuem um fator de diluição único e igual a 10. A contagem em placa consiste em nada mais que inocular a amostra que se deseja quantificar em um meio sólido não seletivo para que, após incubação adequada, possam ser contadas as colônias, que na verdade chamamos de UFC (unidade formadora de colônia). A semeadura em placas ou plaqueamento revela o número de microrganismos capazes de se multiplicarem e formarem colônias em meios de cultivo apropriados e sob condições de incubação adequadas. Cada colônia de bactéria desenvolvida é supostamente originada a partir de uma unidade viável, a qual pode ser um organismo ou muitos.

2. OBJETIVO Entender a metodologia das diluições e a contagem de UFC viáveis.

3. MATERIAL 3 Tubos com 9 ml de água peptonada 1% 3 Placas de Petri com Agar PCA 3 Placas estéreis Frasco com Agar PCA fundido Alça de Drigalski Pipetas de 1ml Pipeta de 0,1ml Ponteiras Cultura bacteriana em caldo

4. PROCEDIMENTO

4.1 Diluição seriada Preparar diluições de 10-1 até 10-3 da amostra com água peptonada 0,1%. A partir da cultura bacteriana, inocular 1 mL em 9 mL de água peptonada, homogeneizar, retirar

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1mL e transferir para outro tubo com 9mL de salina obtendo assim, as diluições 1/10, 1/100, 1/1000.

4.2 Plaqueamento em superfície 1. Inocular 0,1 mL de cada diluição nas placas contendo o meio solidificado PCA; 2. Com o auxílio de alça de Drigalski, espalhar o inóculo cuidadosamente por toda a superfície do meio, até sua completa absorção. 3. Incubar as placas invertidas em estufa.

4.3 Plaqueamento em profundidade 1. Inocular 1,0 mL de cada diluição em placas de Petri estéreis vazias. 2. Verter nas placas inoculadas ± 20 mL do Agar Padrão para Contagem (PCA), previamente fundido e resfriado a 45º C. Homogeneizar. Esperar solidificar; 3. Incubar as placas invertidas em estufa.

Contagem das colônias: Plaqueamento em superfície:

Calcular o número de unidades formadora de colônia (UFC) por mL ou grama, multiplicar pelo inverso da diluição inoculada e depois por 10 (já que foi inoculado 0,1 ml e não 1 ml)

Plaqueamento em profundidade: Selecionar as placas que tenha entre 25 a 250 colônias. Calcular o número de unidade formadora de colônia (UFC) por mL ou grama, multiplicar pelo inverso da diluição inoculada.

5. RESULTADOS

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PRÁTICA IV - CONTAGEM TOTAL DE AERÓBIOS MESÓFILOS, PSICROTRÓFICOS, BOLORES E

LEVEDURAS

1. INTRODUÇÃO O alimento é quem determina qual micro-organismo é capaz ou incapaz de se

desenvolver. Conhecendo-se as características do alimento, podemos predizer a flora microbiana que nele poderá se multiplicar. Daí se dá a importância da análise microbiológica, pois inúmeros métodos laboratoriais podem ser utilizados para investigar a ausência ou presença destes micro-organismos.

Segundo a ICMSF (International Commission on Microbiological Specifications for Foods) micro-organismos indicadores podem ser agrupados em: (I) Microrganismos que não oferecem um riscos direto a saúde: contagem padrão de mesófila, contagem de psicrotróficos e termófilos, contagem de bolores e leveduras. (II) Microrganismos que oferecem um risco baixo ou indireto à saúde: coliformes totais, coliformes fecais, Enterococcus, Enterobacteriaceae totais e Escherichia coli. Os números e tipos de micro-organismos presentes dentro ou sobre os alimentos produzidos podem ser usados para avaliar com segurança a qualidade microbiológica dos mesmos.

A segurança é determinada pela ausência ou presença de micro-organismos patogênicos ou suas toxinas, a quantidade do inóculo, e o tempo de controle ou destruição desses agentes. Os seguintes tópicos são importantes no estudo dos métodos de análise microbiológica de alimentos: amostragem, preparação da amostra para análise, métodos de contagem de microrganismos e isolamento e identificação de patógenos.

2. OBJETIVO Compreender os fundamentos da contagem de micro-organismos em placa,

através das técnicas de contagem total de mesófilos, psicotróficos, bolores e leveduras em amostra de alimento.

3. MATERIAL Frasco com 225 ml de água peptonada 0,1%. Espátulas estéreis Placa estéril para pesagem. 3 Agar batata glicose 2% em placa para fungos 3 Agar PCA em placa para contagem total de psicrotróficos 2 Tubos com 9 ml de água peptonada 0,1% 3 Placa de Petri esterilizada para contagem total mesófilos Agar PCA fundido a 45ºC para contagem total mesófilos Alça de Drigalski Pipetas Ponteiras

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Estufa de incubação.

4. PROCEDIMENTO Adicionar 25g ou ml do alimento em 225 ml de água peptonada e preparar

diluições de 10-1 até 10-3 da amostra com água peptonada 0,1%. Mesma diluição para todas as contagens.

a) Contagem total de aeróbios mesófilos 1. Inocular 1,0mL de cada diluição em placas de Petri estéreis vazias. 2. Verter nas placas inoculadas ± 20 mL do Agar Padrão para Contagem (PCA), previamente fundido e resfriado a 45º C. Homogeneizar. Esperar solidificar; 3. Incubar as placas invertidas a 35ºC/48h. - Leitura: Selecionar as placas que contenham entre 25 e 150 colônias.

b) Contagem total de aeróbios psicrotrófilos 1. Inocular 0,1 mL de cada diluição nas placas contendo o meio solidificado PCA; 2. Com o auxílio de alça de Drigalski, espalhar o inóculo cuidadosamente por toda a superfície do meio, até sua completa absorção. 3. Incubar as placas invertidas a 7ºC/10 dias. - Leitura: Selecionar as placas que contenham entre 25 e 250 colônias.

c) Contagem de bolores e leveduras 1. Inocular 0,1 mL das diluições selecionadas sobre a superfície seca de ágar batata glicose 2% acidificado. 2. Com o auxílio de alça de Drigalski, espalhar o inóculo cuidadosamente por toda a superfície do meio, até sua completa absorção. 3. Incubação: Incubar as placas, sem inverter, a 25º C por 3 a 5 dias, em incubadora de B.O.D. - Leitura: Selecionar as placas que contenham entre 15 e 150 colônias.

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PRÁTICA V - CONTAGEM DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS EM ALIMENTOS

1. INTRODUÇÃOA contagem de S. aureus em alimentos pode ser feita com dois objetivos, um

relacionado com a saúde pública, para confirmar o envolvimento em surtos de intoxicação alimentar, e outro relacionado com o controle de qualidade higiênico-sanitária dos processos de produção de alimentos, condição em que S. aureus serve como indicador de contaminação pós-processo ou das condições de sanificação das superfícies destinadas ao contato com alimentos.

A contagem baseia-se na inoculação das diluições desejadas das amostras em ágar Baird-Parker, cuja composição evidencia a habilidade desse micro-organismo de crescer na presença de 0,01 a 0,05% de telurito de potássio em combinação com 0,2 a 0,5 % de cloreto de lítio e 0,12 a 1,26% de glicina. O Staphylococcus aureus reduz anaeróbia e aerobiamente o telurito de potássio, produzindo colônias negras. O ágar Baird-Parker suplementado com solução de gema de ovo possibilita a verificação das atividades proteolítica e lipolítica do Staphylococcus aureus, por meio do aparecimento de um halo de transparência e um de precipitação ao redor da colônia, respectivamente.

2. OBJETIVOAvaliar a presença de Staphylococcus coagulase positiva em alimentos, por

meio da técnica de contagem em placas.

3. MATERIAL 225 mL de água peptonada estéril. 2 tubos com 9 ml de água peptonada estéril Pipeta graduada (10 ou 25ml) Micropipeta 0,1 ml 3 placas com Agar BP- Baird-Parker 1 alça de Drigalski 3 lâminas Peróxido de hidrogênio Plasma bovino Kit para coloração de gram

4. PROCEDIMENTO

1. Triturar 25g ou diluir 25ml de amostra em 225 mL de água peptonada estéril. 2. Fazer 3 diluições 10-1,10-2 e e 10-3

3. Pipetar 0,1 mL de suspensão de cada diluição e colocar em placa contendo ágar BP- Baird-Parker e espalhar com uma alça de Drigalski até completa absorção.

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4. Incubar a 35ºC por 48h 5. Contar as colônias típicas de S. aureus selecionando as placas que tenha entre 25 a 250 colônias. Colônias típicas: colônias circulares, pretas, pequenas, lisas, convexas, com bordas perfeitas, massa de células esbranquiçadas nas bordas, rodeadas por uma zona opaca e/ou um halo transparente se estendendo para além da zona opaca. Colônias atípicas: cinzentas, sem um ou ambos os halos típicos.

Selecionar colônias típicas e realizar as provas bioquímicas.

PROVAS BIOQUÍMICAS: 1. Teste de catalase: colocar a massa celular em uma lâmina e gotejar

peróxido de hidrogênio, se houver desprendimento de gás o teste é catalase +. Baseia-se na capacidade da enzima catalase de decompor o peróxido de hidrogênio, liberando oxigênio, o que é evidenciado por meio da formação de borbulhas.

2. Teste de coagulase: adicionar 1 gota de soro bovino e depois adicionar uma colônia de células se houver formação de coágulo é coagulase +. Baseia-se na comprovação da capacidade de coagular o plasma de coelho pela ação da enzima coagulase produzida pelo micro-organismo.

3. Coloração de Gram: Baseia-se na verificação das características morfológicas e tintoriais do micro-organismo. O esfregaço é feito em lâmina e fixado, em seguida é realizada a coloração adicionando o cristal de violeta de genciana deixando agir por 1 minuto escorre e adiciona-se o lugol deixando mais 1 minuto, lava com água e adiciona álcool-cetona (descorante) e deixa 30 segundos, depois adiciona fucsina e deixa mais 30 segundos. Lave a lâmina em um filete de água, seque a lâmina com auxílio de um papel de filtro limpo ou deixe-a secar ao ar livre e aplique uma gota de óleo de imersão sobre o esfregaço e observe no microscópico com objetiva de imersão (100 X).

Será considerado Staphylococcus coagulase positiva se apresentarem Coagulase +, Catalase + e Gram +.

RESULTADOS

Calcular os resultados em UFC/g ou mL UFC/mL = nº col. x diluição x 10

Pare e pense: a) O alimento analisado encontra-se dentro dos padrões baseado na RDC nº12? b) Qual a importância da pesquisa de S.aureus em alimentos?

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PRÁTICA VI - ANÁLISE DE COLIFORMES TOTAIS E FECAIS

1. INTRODUÇÃOO grupo de coliformes totais é um subgrupo da família Enterobacteriaceae,

inclui bactérias na forma de bastonetes Gram negativos, não esporogênicos, aeróbios ou anaeróbios facultativos, capazes de fermentar a lactose com produção de gás, em 24 a 48 horas à 35ºC. O grupo inclui cerca de 20 espécies, dentre as quais se encontram tanto bactérias originárias do trato gastrintestinal do homem e dos animais como espécies não entéricas. O grupo de coliformes termotolerantes é um subgrupo dos coliformes totais, restringe-se aos membros capazes de fermentar a lactose com produção de gás, em 24 horas à 44,5-45,5ºC. Coliformes Totais: Habitat intestinal e ambiental: Ex.:espécies de Escherichia, Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella, Serratia, etc. Coliformes Termotolerantes: representados principalmente pela Escherichia coli e, também por algumas bactérias dos gêneros Klebsiella, Enterobacter e Citrobacter. Dentre esses micro-organismos, somente a E. coli é de origem exclusivamente fecal.

A técnica do NMP é um método de quantificação indireta de micro-organismos. Na realidade, não podemos contar UFCs, já que a análise é realizada em meio líquido, o que se faz é comparar o resultado encontrado com tabelas pré-escolhidas, obtendo um resultado aproximado da quantidade de micro-organismos na amostra analisada. Estas tabelas são elaboradas a partir de dados estatísticos, com os respectivos intervalos de confiança (95%) para diversas combinações de número de tubos positivos em cada série de diluição. Significa dizer que existe uma probabilidade de 95% de que o número “verdadeiro” de bactérias presentes na amostra se encontre dentro dos intervalos mínimos e máximos em torno do NMP. Muito embora o método dos tubos múltiplos apresente sensibilidade elevada, permitindo a detecção de baixas densidades de bactérias, o NMP não é um valor preciso, e a precisão do teste depende do número de tubos utilizados e dos volumes de amostra inoculados. Este método é muito usado para quantificar coliformes, mas pode ser utilizado para micro-organismos em geral, pois o meio utilizado é adaptado ao micro-organismo que se deseja quantificar, com agentes seletivos e indicadores.

2. OBJETIVODetectar a presença de coliformes totais e termotolerantes em água e em

alimentos utilizando o método do Número Mais Provável (NMP).

3. MATERIAL 225 mL de água peptonada 0,1% 2 tubos com 9 ml de água peptonada estéril 9 Tubos contendo Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST) (com tubos de Durham) 9 Tubos contendo Caldo Verde Brilhante (com tubos de Durham) 9 Tubos contendo caldo EC (com tubos de Durham)

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3 Placas de agar EMB – eosina azul de metileno Micropipeta 1 ml ou Pipetas estéreis 1 alça bacteriológica Meios para prova bioquímica de E.coli – Citrato de Simonns, Caldo triptona e

caldo VM-VP;

4. PROCEDIMENTO PARTE 1: A) Teste Presuntivo de NMP (Amostra_alimentos) - Presume-se que os micro-organismos que crescem e produzem gás a partir da lactose sejam coliformes. Meio de enriquecimento: caldo LST. 1. Triturar 25g ou diluir 25ml de amostra em 225 mL de água peptonada estéril. 2. Fazer 3 diluições 10-1, 10-2 e 10-3, inocular 1 ml de cada diluição em série de três tubos contendo caldo Lauril Sulfato Triptose (LST).3. Incubar 35 - 37ºC por 24 a 48h.4. Contar o número de tubos positivos: com produção de gás e turvação do meio.

B) Teste Confirmativo de Coliformes totais ou à 35ºCMeio seletivo caldo Verde Brilhante bile. Neste meio, os sais de bile têm a função de inibir o crescimento de bactérias não entéricas e o verde brilhante de inibir as bactérias Gram-positivas, selecionando desta forma os coliformes. 1. De cada tubo positivo de LST retirar 1 (uma) alçada e inocular em tubo correspondente contendo caldo Verde Brilhante.2. Incubar a 35-37 ºC por 24 a 48h. 3. Considerar como positivos os tubos turvos com produção de gás nos tubos de Durhan. 4. Usar a tabela de NMP para verificar qual o número mais provável de coliformes totais por grama ou mL correspondente aos tubos positivos.

PARTE 2:C. Teste Confirmativo de Coliformes termotolerantes à 45ºC.Os coliformes termotolerantes têm em seu ambiente natural (trato intestinal) temperaturas mais elevadas. Eles são capazes de crescer a 44,5º C, possibilitando, assim, de uma forma prática, serem avaliados separadamente. 1. De cada tubo positivo de LST retirar 1(uma) alçada e inocular em tubo correspondente contendo caldo EC.2. Incubar a 45,5 ºC em banho-maria por 24h. 3. Considerar como positivos os tubos turvos com produção de gás nos tubos de Durhan. 4. Usar a tabela de NMP para verificar qual o número mais provável de coliformes totais por grama ou mL correspondente aos tubos positivos.

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D. Teste confirmativo para E. coli 1. Dos tubos positivos do meio EC retirar uma alçada e inocular em estrias em esgotamento em placa contendo meio EMB para confirmação da presença de E. coli e incubar a 35ºC por 24h.

E. Confirmação bioquímica para E. coli 1. Observar a formação de colônias de cor púrpura com centro preto, e brilho metálico verde no meio EMB, típicas de E. coli. 2. Inocular as colônias típicas em ágar PCA – 35ºC/24h; 3. Retirar inóculo do meio PCA e transferir com alça e/ou agulha para os meios citrato de Simonns, caldo VM-VP e caldo triptona, conforme esquema:

5.RESULTADOS

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PRÁTICA VII - PROVAS BIOQUÍMICAS PARA IDENTIFICAÇÃO DE E. COLI

1. INTRODUÇÃOTodas as subculturas positivas em caldo EC são repicadas para ágar EMB, com

auxílio de alça de platina, fazendo estrias (por esgotamento). Para cada tubo positivo em caldo EC corresponderá uma placa de ágar EMB, identificada para a perfeita correspondência;

OBS.: Meio EMB-Eosina e azul de metileno são corantes inibidores de Gram +. O micro-organismo ao crescer fermenta a lactose, produzindo ácido e precipitando a eosina e o azul de metileno, que ao se interagir, fornecem o brilho verde metálico característico da E. coli.- Incubar a 35ºC por 18-24h;- Transcorrido este tempo, verificar o crescimento de colônias com características de E. coli, ou seja, 2 a 3 mm de diâmetro, com brilho metálico esverdeado ou com o centro escuro abrangendo praticamente toda a colônia;- De cada placa de EMB correspondente a cada tubo de EC, repicar de 2 a 3 colônias características para tubo com ágar nutriente inclinado, e incubar por 18-24h a 35-37ºC;- Efetuar de cada cultura em ágar nutriente, as seguintes provas bioquímicas denominado IMVIC: Indol; Vermelho de metila-VM; Voges-Proskauer-VP e Citrato.

2. METODOLOGIA2.1 Prova do Indola) Procedimento: transferir o micro-organismo a ser testado para o meio de cultura (caldo triptona). Adicionar 3 a 4 gotas do reativo de Kovacs. b) Objetivo: testar a habilidade de alguns micro-organismos de degradarem a molécula de triptofano c) Princípio: bactérias que possuem a enzima triptofanase são capazes de hidrolisar o triptofano, produzindo indol, piruvato (ácido pirúvico) e amônia. Estes dois últimos produtos são utilizados diretamente no metabolismo da célula, enquanto o indol acumula-se no meio. A presença de indol pode ser detectada pela adição do reativo de Kovacs ao meio de cultura que resultará na formação de uma coloração vermelha na superfície do líquido.Resultado: após incubação a 37ºC por 48 horas e adição do reativo, tem-se:

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Positivo: a presença de uma coloração vermelha na superfície do líquido; Negativo: a presença de uma coloração amarela (cor de reativo de kovacs) na

superfície do líquido.

2.2 Vermelho de metila-VM.a) Procedimento: transferir o micro-organismo a ser testado para tubos de ensaio com caldo VM-VP (meio de Clark e Lubs). Incubar os tubos a 37°C por 24 a 48 horas. Na leitura é adicionado 5 gotas de uma solução de vermelho de metila.b) Objetivo: determinar a habilidade de algumas bactérias em oxidar a glicose e levar à produção de ácidos orgânicos como produto final.c) Princípio: muitas bactérias utilizam glicose para suprir suas necessidades nutricionais. Apesar disso, os produtos finais resultantes da oxidação da glicose podem variar dependendo das vias metabólicas presentes em cada micro-organismo. Algumas bactérias, ao fermentarem a glicose, produzem ácidos orgânicos (fórmico, acético, lático, succínico, etc) que reduzem o pH do meio. Essas diferenças metabólicas podem ser evidenciadas, então, pela adição de uma solução de vermelho de metila (indicador de pH) ao meio onde foi cultivado o micro-organismo de interesse. Em meios acidificados, com pH menor que 4,0, o indicador torna-se vermelho. Em meios com o pH maior ou igual a 6 o indicador adquire cor amarelaResultado: após a incubação a 37ºC por 48 horas, adicionar o reagente (vermelho de metila), tem-se:

Positivo: coloração vermelha (pH menor que 4,0); Negativo: cor original (amarela) do meio (pH maior ou igual a 6,0).

2.3 Prova do Voges Proskauer (VP)a) Procedimento: transferir a bactéria a ser testada para o meio VM-VP (meio de Clark e Lubs). Incubar os tubos a 37ºC por 24 a 48 horas. Retirar 2ml da cultura para novo tubo e adicionar a cada tubo 15 gotas do reagente ∝-naftol 5% (reagente A) e 5 gotas de solução de KOH a 40% (reagente B); por cada mL de meio de cultura. Agitar levemente o tubo.b) Objetivo: evidenciar a produção de compostos não acídicos obtidos a partir da fermentação da glicose.

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c) Princípio: bactérias que fermentam a glicose e levam à produção final de compostos não acídicos, como a acetoína (acetilmetilcarbinol), podem ser identificadas pela adição ao meio de cultivo dos reagentes A e B. Na presença deles, a acetoína é oxidada transformando-se em diacetil, o que leva ao aparecimento de uma coloração róseo-avermelhada, na superfície do meio em torno de 15 a 20 minutos após a adição dos reagentes.Resultado: para cada mL da cultura incubada durante 48 horas, adicionar os reagentes, agitando sempre após a inclusão de cada solução, deixar em repouso por 5 a 30 minutos.

Positivo: desenvolvimento de uma coloração rósea a vermelho rubro; Negativo: ausência de coloração rósea ou vermelha.

2.4 Citratoa) Procedimento: transferir a bactéria a ser testada para ágar citrato de Simmons. Incubar os tubos a 37ºC por 24 a 48 horas. Após a incubação, examinar as culturas contidas nos tubos com o meio inclinado e avaliar a presença ou a ausência de crescimento da bactéria, verificando qualquer alteração na cor do meio de verde para azul.b) Objetivo: caracterizar micro-organismos capazes de utilizar o citrato como a única fonte de carbono, os quais provocam a elevação do pH do meio de cultivo devido a metabolização de íons citrato.c) Princípio: para utilizar o citrato como única fonte de carbono, é necessário que a bactéria possua a enzima citrato permease que facilita o transporte do citrato pra o interior da célula. Do metabolismo do citrato são produzidos piruvato e CO2. Este último, ao reagir com o sódio presente no meio, forma o carbonato de sódio, de natureza alcalina. O meio ágar citrato de Simmons possui o citrato de sódio como única fonte de carbono, e o azul de bromotimol como indicador de pH. Com o aumento do pH do meio, o azul de bromotimol adquire uma cor azul, o que indica resultado positivo para o teste de utilização do citrato.Resultado: após a incubação a 37ºC, tem-se:Positivo: o meio se torna azul intenso, principalmente no ápice;Negativo: a cor natural do meio não muda, permanecendo verde.

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PRÁTICA VII - DETECÇÃO DE SALMONELLA SPP. EM ALIMENTOS

1.INTRODUÇÃOTodas as salmonelas são consideradas potencialmente patogênicas para o

homem. São bacilos gram-negativos, moveis e não fermentam lactose. A única via de entrada destes microrganismos no corpo humano é a oral, por isso é de suma importância a análise dos alimentos para detectar sua presença. A metodologia recomendada segue 4 etapas que podem ser aplicadas a qualquer tipo de alimentos:

2. METODOLOGIAa) Pré-enriquecimento em caldo não seletivo:Objetiva a recuperação de células injuriadas.Adicionar 25g ou mL da amostra em 225 mL do caldo de pré-enriquecimento

(diluição 10-1). Homogeneizar e incubar a 35º C/ 24h. Para uso geral recomenda-se o caldo lactosado ou a água peptonada 0,1% tamponada.

b) Enriquecimento Seletivo: Estimula a multiplicação de salmonelas e reduz ou inibe o crescimento dos

organismos competitivos, tais como coliformes, Proteus e Pseudomonas.Alíquotas de 0,1mL das amostras pré-enriquecidas serão pipetadas em tubo

contendo 10 mL de caldo Rappaport Vassiliadis e 1,0 mL para tubo contendo 10mL de caldo Selenito-Cistina. Os tubos serão incubados a 37ºC por 24 horas.

c) Plaqueamento seletivo diferencial: Objetiva promover o desenvolvimento preferencial de colônias de Salmonella,

com características típicas que as distingam dos competidores, para posterior confirmação sorológica e bioquímica.

- Agitar o tubo de enriquecimento seletivo e estriar uma alçada nos meios ágar Salmonella-Shigella, Agar entérico de Hectoen (HE) e Ágar xilose lisina descarboxilado (XLD). Incubar as placas invertidas a 35º C/24h. Verificar se há desenvolvimento de colônias típicas de Salmonella:

Agar SS: Colônias com centro negro (H2S) ou colônias incolores, as colônias das bactérias não fermentadoras de lactose são incolores.

Agar HE: colônias transparentes, verde-azuladas, com ou sem centro preto. Agar XLD: colônias transparentes, cor de rosa escuro, com ou sem centro preto.

Confirmação Preliminar das colônias típicas de Salmonella Com o auxílio de uma agulha de inoculação, remover uma porção da massa de

células, do centro da colônia típica (no mínimo 2 colônias) e semear em tubos inclinados de Agar Lisina Ferro (LIA) e Ágar Tríplice Açúcar. A semeadura deve ser feita por picada e estrias na rampa. Incubar os tubos a 35º C/24h. Observar reação típica:

TSI- rampa alcalina (vermelha) e fundo ácido (amarelo), com ou sem produção de H2S (escurecimento do agar). Reação atípica que não deve ser descartada se as

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demais reações em LIA se apresentarem típicas: rampa e fundo ácidos (amarelos), com ou sem produção de H2S. LIA – fundo e rampa alcalinos (púrpura, sem alteração da cor do meio), com ou sem produção de H2S. Reação atípica, que não devem ser descartada se as demais reaçãoes em TSI se apresentarem típicas: fundo amarelado com rampa alcalina, com ou sem produção de H2S.

3. Teste bioquímico a) Meio SIMTransferir com uma agulha através de picada a cultura de colônia típica do TSI

para o meio. Incubar 35º C/24h. Produção de H2S: escurecimento do ágar. Salmonela pode produzir ou não

H2S.Motilidade: crescimento na região da picada – imóvel crescimento em todo

agar ou ao redor da região da picada: móvel. Salmonela é móvel. Após a leitura do H2S e da motilidade, adicionar 5 gotas de reativo de Erlich ou

Kovacs no tubo. Aparecimento de cor rósea: indol positivo e aparecimento de cor amarelado: indol negativo. Salmonela é indol negativo.

b) Teste do vermelho de metila (VM) e Voges-Proskauer (VP):Transferir uma alçada com inoculo da cultura em TSI, para dois tubo com caldo

3mL VM-VP e incubar a 35º C/48h para VP e 96h VM. Após o período de incubação, no tubo VP adicionar 1,8 mL de solução de alfa naftol 5% e agitar. Adicionar em seguida 0,6 mL de solução KOH 40%, agitar. Observar até 1 hora. Desenvolvimento de cor vermelha ou rosea – teste positivo

Permanência do meio na cor do reagente (amarelado ou ligeiramente esverdeado) – teste negativo. A maioria das Salmonelas são VP negativas. No tubo VM – adicionar 5 gotas de solução vermelho metila e observar imediatamente se o meio adquire uma coloração vermelha – teste positivo ou amarela - teste negativo. A maioria das cepas de Salmonela são VM positivas.

c) Teste do citrato: Com uma agulha de inoculação, transferir um inoculo da cultura para um tubo

de agar citrato de Simmons inclinado, estriando a rampa e picando o fundo. Incubar a 35º C/ 96h. Observar o crescimento: Cor azul: citrato positivo: a maioria das cepas de Salmonelas são citrato positivo. Cor do meio inalterado: citrato negativo.

d) Teste de urease: Transferir uma alçada da cultura crescida no TSI para um tubo com caldo uréia

de Chistensen. Incubar 35º C/24h. Observar crescimento. Cor do meio original (pêssego): teste negativo. A maioria das cepas de Salmonelas são uréases negativa. Cor do meio rosa escuro: teste positivo.

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PRÁTICA VIII - CONTAGEM TOTAL DE BACTÉRIAS LÁTICAS EM LEITES FERMENTADOS

1. INTRODUÇÃOSegundo o Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade de Leites

Fermentados (Instrução Normativa nº46, de 23 de outubro de 2007 – MAPA) entende-se por Leites Fermentados os produtos adicionados ou não de outras substâncias alimentícias, obtidas por coagulação e diminuição do pH do leite, ou reconstituído, adicionado ou não de outros produtos lácteos, por fermentação láctica mediante ação de cultivos de micro-organismos específicos. Estes microrganismos específicos devem ser viáveis, ativos e abundantes no produto final durante seu prazo de validade. De acordo com este regulamento, os leites fermentados devem apresentar, no mínimo, o número de 106 UFC/mL de bactérias láticas totais, não sendo esse valor alcançado, o produto se encontra em não conformidade.

Para terem o apelo funcional deverão conter probióticos - microrganismos vivos capazes de melhorar o equilíbrio microbiano intestinal produzindo efeitos benéficos à saúde do indivíduo. Algumas bactérias láticas são consideradas micro-organismo probióticos, a exemplo da Lactobacillus paracasei, Lactococcus lactis, Bifidobacterium bifidum, entre outras. Segundo a ANVISA a quantidade mínima viável para os probióticos deve estar situada na faixa de 108 a 109 UFC/mL na recomendação diária do produto pronto para o consumo, conforme indicação do fabricante. Valores menores podem ser aceitos (mín. 106), desde que a empresa comprove sua eficácia e atenda as legislações vigentes.

2. OBJETIVOSAvaliar diferentes marcas de leites fermentados através da contagem total de

bactérias láticas, para verificar se os mesmos estão em conformidade com o seu Padrão de Identidade e Qualidade – PIQ.

3. MATERIAIS 5 placas com Agar MRS (Man, Rogosa e Sharpe) fundido a 45ºC 5 unid.- Tubos contendo 9mL água peptonada 0,1% 5 unid.- Placa de Petri vazias esterilizadas Pipetas e ponteiras estéreis Estufa de incubação

4. PROCEDIMENTO Preparar diluições com a amostra de 10-1 até 10-5 em água peptonada 0,1%.

Partir de 1mL da amostra para 9mL do diluente.1. Inocular 1,0mL de cada diluição em placas de Petri estéreis vazias;2. Verter nas placas inoculadas ± 20 mL do Agar MRS, previamente fundido e resfriado a 45º C. Homogeneizar cuidadosamente. Esperar solidificar e colocar uma sobrecamada. Esperar solidificar novamente. 3. Incubar as placas invertidas a 35ºC/48h.

4.1 Confirmação

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a) Teste de catalase: colocar a massa celular em uma lâmina e gotejar peróxido de hidrogênio. Bactérias são CATALASE NEGATIVO.b) Coloração de Gram: cocos ou bastonetes Gram positivos

Contagem: Selecionar as placas que tenha entre 25 a 250 colônias. Calcular o número de unidade formadora de colônia (UFC) por mL ou grama, multiplicar pelo inverso da diluição inoculada. Ex: 100 colônias na diluição 10-2 = 100 x 102 = 10000 = 1,0 x 104UFC/g ou mL

5. RESULTADOS:

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

• SILVA, N. da; JUNQUEIRA, V.C.A.; SILVEIRA, N.F.A.; TANIWAKI; SANTOS, M. H.; R. F. S. dos; GOMES, R. A. R. Manual de métodos de análise microbiológica de alimentos e água. São Paulo: Livraria Varela, 2010. 630p.

• DOWNES, F. P.; ITO, K. Compendium of methods for the microbiological examination of foods (4aed.). Washington: American Public Health Association, 2001. 676p.

• JAY, J. M. Microbiologia de Alimentos. 6. ed., Artmed, Porto Alegre, p. 712, 2005

• FRANCO, B. D. G. M.; LANDGRAF, M. Microbiologia de Alimentos. Atheneu, São Paulo, 2002.

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