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SARITA MAC CORNICK
EXPRESSÃO DE GENES RELACIONADOS À VIA
DE SINALIZAÇÃO DOS RECEPTORES TOLL-
LIKE EM QUERATINÓCITOS CULTIVADOS DE
PACIENTES COM QUEIMADURA EXTENSA
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo,
para obtenção do Título de Doutor em Ciências.
SÃO PAULO
2015
SARITA MAC CORNICK
EXPRESSÃO DE GENES RELACIONADOS À VIA
DE SINALIZAÇÃO DOS RECEPTORES TOLL-
LIKE EM QUERATINÓCITOS CULTIVADOS DE
PACIENTES COM QUEIMADURA EXTENSA
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo,
para obtenção do Título de Doutor em Ciências.
ORIENTADOR: Prof. Dr. ALFREDO GRAGNANI FILHO
COORIENTADORES: Profa. SILVANA APARECIDA ALVES CORRÊA
Prof. SAMUEL MARCOS RIBEIRO DE NORONHA
SÃO PAULO
2015
iii
Mac Cornick, Sarita
Expressão de genes relacionados à via de sinalização dos receptores Toll-
Like em queratinócitos cultivados de pacientes com queimadura extensa. /
Sarita Mac Cornick -- São Paulo, 2015.
xiii, 94f.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de
Medicina. Programa de Pós-Graduação em Cirurgia Translacional.
Título em inglês: Toll-Like receptors gene expression of human keratinocytes
cultured of large burn injury.
1. Expressão Gênica 2. Receptor Toll-Like 3. Queratinócitos
4. Queimadura 5. Transdução de Sinal.
iv
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
PROGRAMA DE PÓS–GRADUAÇÃO EM CIRURGIA TRANSLACIONAL
COORDENADOR: PROF. DR. MIGUEL SABINO NETO
v
DEDICATÓRIA
Primeiramente a DEUS.
Ao Prof. Dr. Alfredo Gragnani pela oportunidade,
Ao Dr. Rogério pelo incentivo.
E, especialmente aos amigos Jane Dias, Sandra da Silva, Dione
Batista V.N. da Silva, Ivan H. Cordeiro e Silvana A. A. Correa,
pela força nos momentos difíceis, pelo grande auxílio e atenção.
E a TODAS as pessoas que passaram por minha vida e que de
uma forma ou de outra contribuíram para o nascimento desta tese
de doutorado.
vii
AGRADECIMENTOS
À PROFESSORA DOUTORA LYDIA MASAKO FERREIRA,
Professora Titular da Disciplina de Cirurgia Plástica da Universidade
Federal de São Paulo (UNIFESP/EPM), pela oportunidade e confiança,
pelo exemplo de ética e profissionalismo.
Ao PROFESSOR DOUTOR MIGUEL SABINO NETO,
Professor Adjunto Livre-Docente da Disciplina de Cirurgia Plástica,
Coordenador do Programa de Pós-Graduação de Cirurgia Translacional da
Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), pela sua atenção, estímulo
constante e orientação em todos os estudos realizados neste Programa.
Ao PROFESSOR DOUTOR ALFREDO GRAGNANI FILHO,
Professor Adjunto da Disciplina de Cirurgia Plástica da Universidade
Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina (UNIFESP/EPM),
orientador deste estudo, por ser um exemplo de professor e pesquisador,
pelo seu talento, coerência, competência, pelas suas inúmeras sugestões e
pela dedicação.
À PROFESSORA SILVANA APARECIDA ALVES CORRÊA,
Pesquisadora do Programa de Cirurgia Translacional da UNIFESP–Escola
Paulista de Medicina, coorientadora da presente tese, pela competência,
disponibilidade, dedicação e colaboração imprescindível na finalização
vii
deste trabalho.
Ao PROFESSOR SAMUEL MARCOS RIBEIRO DE
NORONHA, Pesquisador do Programa de Cirurgia Translacional da
UNIFESP–Escola Paulista de Medicina, coorientação da presente tese,
pelos ensinamentos ministrados.
À Dra. DIONE BATISTA VILA-NOVA DA SILVA, pela
amizade, pelas dicas, críticas, comentários e sugestões.
A TODOS OS PROFESSORES DO PROGRAMA DE PÓS-
GRADUAÇÃO EM CIRURGIA TRANSLACIONAL DA UNIFESP pelas
críticas construtivas e sugestões apresentadas.
AOS COLEGAS PÓS-GRADUANDOS DO PROGRAMA DE
PÓS-GRADUAÇÃO EM CIRURGIA PLÁSTICA DA UNIFESP, em
especial, Juan Carlos Montano, pelas dicas e orientações.
Às secretárias da Disciplina de Cirurgia Plástica da Universidade
Federal de São Paulo, Marta Rejane dos Reis Silva, Sandra da Silva e
Silvana Aparecida Costa pela atenção, consideração e profissionalismo.
À todos que nos auxiliaram e, que direta ou indiretamente,
colaboraram na execução deste trabalho.
viii
“Todo o conhecimento humano
começou com intuições,
passou daí aos conceitos e
terminou com idéias.”
(Immanuel Kant)
ix
SUMÁRIO
DEDICATÓRIA…………………………………………….. v
AGRADECIMENTOS……………………………………… vi
LISTA DE FIGURAS E TABELA…………………………. x
LISTA DE SIMBOLOS E ABREVIATURAS xi
RESUMO…………………………………………………….. xiii
1. INTRODUÇÃO…………………………………………... 1
2. OBJETIVO……………………………………………….. 8
3. LITERATURA…………………………………………… 10
4. MÉTODOS……………………………………………….. 32
5. RESULTADOS…………………………………………… 46
6. DISCUSSÃO……………………………………………… 53
7. CONCLUSÃO…………………………………………….. 64
8. REFERÊNCIAS………………………………………….. 66
NORMAS ADOTADAS……………………………………. 80
ABSTRACT…………………………………………………. 82
ANEXOS......………………………………………………… 84
FONTES CONSULTADAS………………………………… 93
xi
LISTA DE FIGURAS E TABELA
Figura 01 Demonstração das quatro etapas do PCR Array: 1) Conversão
de RNA total em cDNA; 2) Adicionar cDNA ao RT² q PCR Master Mix &
Aliquot Mixture por toda placa de PCR Array; 3) Correr a placa em
aparelho de PCR em tempo real; 4) Análise dos dados de expressão gênica
(exemplo retirado do website com amostra de tumor de mama versus mama
normal).
43
Figura 02 Exemplo de plotagem de dados obtidos de células provenientes
de uma mama normal e de um tumor mamário. No gráfico visualizam-se os
genes hiperregulados (vermelho) e hiporegulados (verde).
44
Figura 03 Plots de Amplificação obtidos após curvas de expressão gênica
para pacientes controle e queimados.
48
Figura 04 Mapa de calor para vias de sinalização de receptores Toll-Like
para queratinócitos de pacientes queimados em cultivo primário. Em
vermelho genes, hiperregulados; em verde, genes hiporregulados; e em
preto, os genes não regulados.
50
Figura 05 Gráfico de dispersão para as vias de sinalização TLR em
cultura de queratinócitos de pacientes queimados. Em vermelho genes,
hiperregulados; em verde, genes hiporregulados; e em preto, os genes não
regulados.
51
Figura 06 Genes hipoexpressos para as vias de sinalização TLR em
cultivo de queratinócitos de pacientes queimados.
52
xi
LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS
AP-1, proteína 1
AP-1, proteína ativadora 1
ARs, adrenérgicos locais
BM-MSCs, células estaminais mesenquimais derivadas da medula óssea
humana
cDNA, Ácido Desoxidenuclêico complementar; do inglês: complementar
desoxid ribonucleic acid
CLR, receptores Toll-like (RTLs) da família do gene Caterpiller
DA, dermatite atópica
DD, dermatofitoses disseminada
ELISA, ensaio de imunossorvente ligado a enzima
EPI, epinefrina
ES, esclerose sistêmica
FACS, separação celular ativada por fluorescência; do inglês:
Fluorescence-activated cell sorting
ICAM -1, molécula de adesão intercelular-1
IL, interleucina
IL-1beta, interleucina 1beta
IL-6, interleucina 6
JO, junções oclusivas
KGF, Fator de Crescimento de Queratinócitos
KC, queratinócitos
LD, dermatofitoses localizada
LPS, Lipopolissacarídeo
LPS, lipopolissarídeo
xii
MALP2, macrófagos lipopéptido-2
MIP-1alfa, proteínas inflamatórias de macrófagos alfa
MIP-1beta, proteínas inflamatórias de macrófagos beta
MPC, 2-metacriloiloxietil fosforilcolina
ncRNA, RNA não-codificante
NF-kB, fator nuclear Kappa
NHKs, queratinócitos neonatais
PAMPs, Vias moleculares associadas ao patógeno; do inglês Pathogen-
associated molecular patterns
PCR, Reação em cadeia da Polimerase; do inglês: Polimerase chain
reaction
RNAm/t, Ácido Ribonuclêico mensageiro/total, do inglês: ribonucleic acid
RPM, rotações por minuto
RTL/RTLs, Receptor/Receptores do tipo Toll-Like
RT-PCR, Reação em cadeia da Polimerase em tempo real; do inglês: Real
Time Polimerase chain reaction
SCQ, superfície corporal queimada
shRNA, pequeno RNA em grampo; do inglês: small hairpin RNA or short
hairpin RNA
siRNA, pequeno RNA de interferência; do inglês: small interfering RNA
STM, trombomodulina solúvel liberada
Th17, macrófago T helper tipo 17
TM, trombomodulina
TNF-alfa, fator de necrose tumoral alfa
TSLP, linfopoietina estromal tímica
UV, ultra-violeta
UVB, radiação ultravioleta B
RAS, receptores adrenérgicos locais
TNF, fator de necrose tumoral
xiii
RESUMO
INTRODUÇÃO: A queimadura extensa pode evoluir com infecção grave
e sepse com aumento da morbidade e mortalidade. Ocorre um estado
contínuo de inflamação e o nível sérico de citocinas é elevado. Os
receptores do tipo Toll-Like são importantes receptores de células do
sistema imune inato que reconhecem antígenos. Portanto, existe a
necessidade da obtenção de perfil da expressão gênica da pele em
queimaduras extensas para análise inicial. OBJETIVO: Avaliar o perfil de
expressão de genes relacionados às vias de receptores Toll-Like em
amostras de cultura primária de queratinócitos humanos epidérmicos de
pacientes com queimadura grave. MÉTODOS: Após a obtenção de
fragmentos de pele viáveis com e sem queimadura, a cultura de
queratinócitos foi iniciada pelo método enzimático utilizando dispase
(Sigma-Aldrich) e Tripsina (Sigma-Aldrich). Após o estabelecimento da
linhagem celular, estas células foram tratadas com QIAzol Reagent®
(Qiagen) para a extração de RNA total. Este foi quantificado e analisado
quanto à pureza para se obter cDNA para a análise da expressão de 84
genes específico de vias TLR de placas de PCR Arrays (SA Biosciences).
RESULTADOS: Após a análise da expressão dos genes verificou-se que
21% destes genes estavam expressos diferencialmente, dos quais 100%
foram reprimidos ou hiporregulados. Dentre estes, os seguintes genes
(vezes de diminuição): HSPA1A (-58), HRAS (-36), MAP2K3 (-23),
TOLLIP (-23), RELA (-18), FOS (-16), e TLR1 (-6,0). CONCLUSÃO: O
perfil da expressão gênica da pele de pacientes com grande queimadura
mostrou 21% de genes alterados, destes 100% apresentaram-se
hiporregulados.
1 INTRODUÇÃO
Introdução
2
1 Introdução
O número de publicações com relação à queimadura é crescente. Nos
últimos cinco anos mais de 3.300 artigos relacionados à queimadura de
pele tem sido publicados, segundo dados obtidos após pesquisa na base de
dados PubMed ao ser utilizados os descritores skin burn ou skin burned. De
acordo com esta mesma base de dados, somente em 2013,
aproximadamente 600 novos artigos foram publicados.
Em 2010, 1446 novos artigos foram identificados em revistas
científicas. Esse número reflete o contínuo avanço nas pesquisas e no
conhecimento sobre os processos que envolvem as vitimas de queimadura
(WOLF et al., 2011). Esta área de conhecimento tem uma importância
notória, por serem lesões traumáticas de alto custo para o sistema de saúde,
além de serem lesões que levam à longa hospitalização e reabilitação,
assim como o alto custo do tratamento de feridas e cicatrizes
(BRUSSELAERS et al., 2010). O agente causador da queimadura pode ser
térmico, elétrico, químico, por radiação e, em especial, os agentes
inflamáveis. A morbidade e a mortalidade da queimadura estão
relacionadas à extensão da superfície corporal atingida e à profundidade
das queimaduras na pele (HERNDON et al., 1989).
Introdução
3
As lesões por queimadura são classificadas de acordo com a
profundidade, em espessura superficial, espessura parcial superficial e
profunda e espessura total (RANGEL & PEREIRA, 2007; TIWARI, 2012).
Em relação à extensão das lesões, a superfície corporal queimada (SCQ) é
classificada como pequena, quando atinge até 10% de SCQ; média, entre
10 e 25% de SCQ; e grande, quando acomete 25% ou mais de SCQ
(NGUYEN et al., 1996; VALE, 2005; EVERS, BHAVSAR,
MAILANDER, 2010; DEGIM, et al., 2011).
Em grandes queimados ocorrem várias alterações, entre essas, o
choque da queimadura devido ao acometimento da função cardiovascular.
A perfusão é insuficiente para manter a oxigenação e nutrição dos tecidos e
o catabolismo é acentuado. Queimaduras extensas resultam em choque
hipovolêmico e trauma tecidual substancial, que causam a formação e a
liberação de muitos mediadores locais e sistêmicos. Tais disfunções
cardiovasculares podem exacerbar a resposta inflamatória (KECK et al.,
2009).
A perda da função normal da barreira da pele faz com que as
condições patológicas mais comuns associadas à queimadura sejam
infecção, perda de calor corporal, aumento da perda de água por
evaporação e mudanças nas principais funções interativas, como toque e
aparência (KECK et al., 2009; REZAEI et al., 2011).
Introdução
4
A infecção bacteriana é uma complicação comum em pacientes
queimados, pela falta da barreira primária e também pela imunodepressão,
além da presença de vários focos infecciosos durante a evolução do
tratamento podendo até evoluir para óbito. A bacteremia e a sepse
consecutivas se desenvolvem, e a mortalidade aumenta, sendo que cerca de
75% dos pacientes com queimadura extensa morrem em consequência de
uma infecção grave por falência de múltiplos órgãos. Forma invasiva de
infecção do tecido subcutâneo desempenha um papel importante, como
infecção relacionada à cirurgia e infecção de ferida superficial
(SPANHOLTZ et al., 2009).
Em relação a, o calor causa desnaturação de proteínas e perda da
integridade da membrana plasmática. Ocorre necrose no centro da lesão,
que se torna menos grave na periferia. Alterações tais como edema,
perfusão diminuída e infecção promovem a progressão da lesão para a
morte celular. Além disso, os danos nas membranas celulares resultam
numa cascata dinâmica de mediadores inflamatórios que exacerbam a já
anormal permeabilidade celular, agravando a regulação de fluidos e a
resposta inflamatória sistêmica (KECK et al., 2009).
Introdução
5
A inflamação é um fator importante para promover a reepitelização e
a cicatrização da ferida causada pela queimadura. Os efeitos benéficos da
inflamação local incluem a retirada de restos celulares, a proteção contra
agentes microbianos, além do crescimento e da proliferação celular. Porém,
o prolongamento do processo inflamatório agudo dificulta a cicatrização na
medida em que o nível elevado de citocinas promove a degradação de
colágeno, a apoptose de queratinócitos, o comprometimento vascular e a
produção de radicais livres de oxigênio (SHUPP et al., 2010).
Durante a reação inflamatória, observa-se uma alteração
hipermetabólica sistêmica com o aumento do catabolismo e com a extensa
destruição de proteínas. A estrutura e a função de órgãos essenciais como
coração, sistema imunológico, sistema renal e fígado são comprometidos,
contribuindo para a falência de múltiplos órgãos aumentando os índices de
mortalidade (GAUGLITZ et al., 2008).
Em queimadura extensa, o nível sérico de citocinas aumenta. As
citocinas são pequenas proteínas ou peptídeos que atuam como mediadores
primários da resposta inflamatória à injúria térmica promovendo a
comunicação entre diversos tipos de células via sinalização autócrina,
parácrina e endócrina (GAUGLITZ et al., 2008).
Os receptores do tipo Toll (RTLs) são importantes receptores de
células do sistema imune inato que reconhecem antígenos. Células do
Introdução
6
sistema imune inato do hospedeiro são capazes de reconhecer moléculas
padrões associadas ao patógeno (ou PAMPs, do inglês Pathogen-associated
molecular patterns). O primeiro RTL em mamíferos foi descrito em 1997,
atualmente existem 13 tipos descritos (NICOTRA et al., 2012), porém 10
RTLs são identificados em humanos até o momento (SCHWACHA et al.,
2012). A ativação destes receptores induz a produção de citocinas e de
quimiocinas antiinflamatórias (WEST, KOBLANSKY, GHOSH, 2006;
DRAGE et al., 2009).
O RTL4 reconhece predominantemente o lipopolissarídeo (LPS)
chamado endotoxina, componente das bactérias gram-negativas (TSAN &
GAO, 2004). Já o RTL2 reconhece o ligante exógeno lipopeptídico de
bactérias Gram positivas (KAWAI & AKIRA, 2007). Após a ligação entre
o ligante exógeno e o RTL2, ocorre dimerização do receptor e alterações
conformacionais. As vias de sinalização ativadas por estes receptores
incluem o gene da resposta primária de diferenciação mielóide (88)
(MYD88), o MyD88-dependente e o TIR-domínio adaptador de indução
interferon-β (TRIF-dependente). A via MyD88 é utilizada por todos os
RTLs, exceto para o RTL3, cuja ativação resulta na ativação dos fatores de
transcrição como o fator nuclear kappaB (NF–kappaB), e a proteína
ativadora 1 (AP-1). Após a ativação destes fatores, numerosas citocinas
pró-inflamatórias são produzidas pelas células, como as interleucinas 6 e
Introdução
7
1beta (IL-6, IL-1β) e o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) (NICOTRA
et al., 2012).
A epiderme contém uma camada basal de queratinócitos em
constante proliferação. Essas células permanecem aderidas à membrana
basal subjacente. Periodicamente, os queratinócitos param seu ciclo celular,
se destacam da membrana basal e iniciam um processo de diferenciação
terminal enquanto se movem para a superfície da pele. Esse processo
gradativo culmina com a formação de três camadas distintas, a espinhosa, a
granulosa e a córnea (PINCELLI & MARCONI, 2010).
Pela falta de dados na literatura acerca de um perfil de expressão
gênica de RTLs e da interação funcional das vias de sinalização
relacionadas a estes receptores em queratinócitos de pacientes queimados,
faz-se necessária a aquisição de um perfil da expressão gênica em
queimadura extensa para análise inicial e em posteriores projetos
relacionados a protocolo de tratamento.
2 OBJETIVO
Objetivo
9
2. Objetivo
Avaliar a expressão de 84 genes relacionados à via
de sinalização dos receptores Toll-like em cultura de
queratinócitos cultivados de pacientes com extensa
queimadura.
3 LITERATURA
Literatura
11
3 Literatura
3.1. Receptores Toll-Like
MOORE et al. (2007) investigaram o padrão temporal de expressão
de três importantes famílias de genes de detecção de patógenos e
sinalização incluindo os receptores Toll-like (RTLs), fator nuclear Kappa
(NF-kB), e da família do gene Caterpiller (CLR) em amostras de células
mononucleares de sangue periférico de pacientes queimados. Os pacientes
com queimaduras menores de 30% de superfície corpórea queimada (SCQ)
não apresentavam cultura de sangue infectado ou bacteremia. Isto contrasta
com os pacientes queimados em mais de 30% de SCQ, que tiveram
infecções nosocomiais, tais como Acinetobacter, Aspergillus e Cândida.
Além desses, as culturas de sangue infectadas foram apenas observadas no
grupo de pacientes com queimadura grave. Ao estudar a expressão gênica
das amostras, verificaram que pacientes com mais de 30% da SCQ
apresentavam a redução da expressão dos genes de sinalização NF-kB. Os
autores não encontraram correlação entre a expressão dos RTLs e SCQ.
Literatura
12
DUAN et al. (2009) demonstraram que o polimorfismo 11367 de
gene RTL4 mostrou-se fortemente associado com menor capacidade de
leucócitos periféricos para a produção de TNF-α e Interleucina-6 em
resposta à estimulação ex vivo com lipopolissacarídeo em pacientes com
trauma no momento da internação. Os resultados do estudo de associação
indicaram que pacientes com trauma que carregam o alelo 11367C do gene
RTL4 eram menos propensos a ter sepse e disfunção de múltiplos órgãos,
podendo ser um bom indicador da probabilidade de desenvolver
complicações, como sepse ou síndrome de disfunção de múltiplos órgãos.
CHEN et al. (2011) investigaram a relevância clínica de diferentes
polimorfismos do gene RTL2 em pacientes com trauma grave. Três
polimorfismos foram encontrados na população (n=410), sendo que dois
deles, rs1898830 e rs3804099, foram associados com a produção de
citocinas por leucócitos de sangue periférico em resposta à estimulação de
lipoproteína bacteriana. Já o polimorfismo do gene rs3804099 foi associado
com maior taxa de morbidade e sepse em pacientes com trauma grave. Os
autores concluíram, portanto, que Polimorfismo do Gene rs3804099 pode
ser usado como preditor de risco para o desenvolvimento de sepse e para
Literatura
13
maior taxa de mortalidade em pacientes com trauma grave.
WANG et al. (2011) demonstraram que lipopolissacarídeo (LPS)
estimula a expressão de citocinas pró-inflamatórias em fibroblastos
dérmicos. A transfecção das células com siRNA MyD88 elimina a
expressão das citocinas. Ao se comparar a expressão gênica de fibroblastos
dérmicos cultivados de pacientes com cicatriz hipertrófica, descobriu-se
que nos últimos ocorre um aumento da expressão de RTLs e suas
moléculas sinalizadoras, bem como de citocinas pró-inflamatórias.
Também se descobriu que LPSs induzem a expressão de citocinas pró-
inflamatórias em fibroblastos. Com isso, os autores concluem que controlar
a inflamação e manipular os RTLs e a sinalização nas células da pele pode
resultar em novas estratégias de tratamento para desordens inflamatórias da
pele.
SCHWACHA et al. (2012) avaliaram o impacto dos RTLs na
inflamação induzida por leucócitos circulantes após queimadura. As
amostras de cultura de sangue foram responsivas à ativação mediada dos
RTL2 e RTL4 resultando na produção de Interleucinas como IL-6, IL-10,
IL-17, TNF-α, quimiocina derivada de queratinócitos (KC), proteínas
inflamatórias de macrófagos alfa (MIP-1α) e beta (MIP-1β). A produção de
RTL2 induzida por KC e MIP-1β foi maior no grupo de 3 a 7 dias após a
queimadura, enquanto que a IL-6, IL-10, KC e MIP-1β.
Literatura
14
foram maiores para RTL4 induzida por ativação no grupo de pós-
queimadura. Os RTLs são hipermodulados no período de 3 a 7 dias após a
queimadura.
BORKOWSKI et al. (2015) analisaram danos UV sobre a pele que
leva à liberação de RNA não-codificante (ncRNA) a partir de
queratinócitos necróticos que ativa o receptor Toll-like 3 (RTL3). Esta
versão do ncRNA desencadeia a inflamação na pele após dano por radiação
ultravioleta (UV). Recentemente, a ativação de RTL3 também foi mostrada
por ajudar a cicatrização de feridas e aumentar a expressão de genes
associados com a reparação da barreira de permeabilidade. Então,
procurou-se testar se a reparação da barreira da pele após danos UVB é
dependente da ativação de RTL3. Foi observado que múltiplos ncRNAs
determinam expressão induzida de genes de reparação da barreira da pele,
que o RTL3 ligando (I:C) também induziu a expressão e função das
junções, e que o ncRNA U1 atua de um modo dependente-RTL3 para
induzir a expressão dos genes de reparo da barreira cutânea. Estas
observações foram mostradas por ter relevância funcional como RTL3 -/-
ratos exibido um atraso na reparação da barreira seguida ao dano UVB.
Combinados, estes dados validam ainda mais a conclusão de que o
reconhecimento de RNA endógeno, através de RTL3 é um passo
importante no programa de reparação da barreira da pele.
Literatura
15
3.2. Queratinócitos e Expressão Gênica
KUPPER et al. (1987) identificaram que queratinócitos expostos à
radiação ultravioleta B (UVB) com comprimento de onda parecido com a
radiação solar tiveram um aumento nos níveis de RNAm de IL-1α e IL-1 β
com relação ao grupo controle. Os níveis de RNAm de actina, uma proteína
estrutural que pode ser usada como controle, não se modificaram. Assim
sendo, a radiação aumentou especificamente a expressão gênica de IL-1.
KOPP et al. (2004) demonstraram que feridas de queimadura de 2º
grau superficial criadas em porcos apresentaram processo de restauração
acelerado a partir de enxertos de pele contendo queratinócitos que hiper-
expressavam Fator de Crescimento de Queratinócitos (KGF). Com isso foi
demonstrado o poder de reepitelização desse fator de crescimento com sua
expressão gênica aumentada em queratinócitos.
BASHIR, SHARMA, WERTH (2009) relataram que queratinócitos
primários humanos expostos à radiação UVB e a IL-1α aumentaram a
secreção e os níveis de RNAm de TNF-α. Esses resultados, parecidos
Literatura
16
com o de estudos anteriores realizados com fibroblastos por esses mesmos
autores, foram atingidos através da extração de RNAm dos queratinócitos,
com posterior análise em RT-PCR e Northern blot. Os níveis da proteína
TNF-α foram quantificados por ELISA.
ZHANG et al. (2011) estudaram a molécula de adesão intercelular-1
(ICAM -1), cuja expressão tem sido detectada em melanócitos em torno de
lesões pigmentadas de vitiligo ativas. Deste estudo demonstraram, por meio
de FACS e de RT-PCR, que o RNA produzido por queratinócitos ligados a
estes melanócitos induziram hiper-regulação de RNAm e da respectiva
proteína ICAM-1. Utilizando um lentivírus expressando shRNA,
demonstrou-se que em melanócitos humanos, o RTL3 parece ser necessário
para a hiper-expressão de ICAM-1. Além disto, utilizando microarrays, os
autores demonstraram um aumento dramático na produção de transcritos de
citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias (CXCL10, CXCL11, TNFSF10,
CCL5, CCL4, CCL2, IFNB1, CCL20, IL -8, e CCL11). Estas observações
sugerem que o RNA liberado de queratinócitos pode atuar como um ligante
endógeno para o RTL3 e desta maneira estimular a expressão de ICAM-1 e
de outros genes pró-inflamatórios em melanócitos humanos, os quais
podem estar envolvidos na patogênese do vitiligo e do trauma físico na
pele.
CHEN et al. (2013) através de análise por microarray e
Literatura
17
PCR observaram que a expressão de RTL4 aumentou em feridas de pele de
murinos nas fases iniciais. Além disto, o fechamento das feridas excisionais
foi significativamente retardado em animais deficientes em RTL4
comparados ao selvagem. E a produção de IL-1beta, de IL-6 e de EGF foi
significativamente menor nestes animais. Em estudos in vitro estes dados
também foram confirmados através da quantificação da expressão do
mRNA em queratinócitos epidérmicos humanos normais. Os autores
sugerem que a produção de citocinas inflamatórias por queratinócitos
cultivados lesionados é estimulada através das vias de sinalização RTL4-
JNK e p38-MAPK. Assim, os resultados evidenciam um papel de RTL4
nos locais de lesão tecidual, e sugerem que RTL4 é um importante
regulador da inflamação na ferida.
3.3. Expressão Gênica de Toll-Like em Queratinócitos
KUBO et al. (2014a) mostraram que ΔNp63, um homólogo de
p53, predominantemente expresso em queratinócitos e regulados pelo
complexo receptor de thymic stromal lymphopoietin (TSLP), que
determina a susceptibilidade a auto-derivados de TSLP. A expressão de
receptores de TSLP em tecidos da pele e queratinócitos foi avaliada por
imuno-histoquímica e RT-PCR quantitativo, e estudos in vitro também
Literatura
18
foram realizados para examinar a relevância funcional ΔNp63 na expressão
de receptores de TSLP constituindo a via autócrina e/ou parácrina de TSLP
sob a condição de estímulos aos receptores inatos sensíveis a danos celular.
Os resultados mostraram que em queratinócitos normais a epiderme
superior preferencialmente expressa receptores de TSLP e inversamente
faltava ΔNp63, o qual tem um efeito inibitório sobre a expressão de
receptores de TSLP. Curiosamente, foi encontrada na epiderme de lesões
de dermatite atópica (DA) muitos queratinócitos com níveis baixos ou
indetectáveis de ΔNp63 (ΔNp63 [lo/-]). Além disso, na ausência de ΔNp63,
queratinócitos prontamente apresentam TSLP e outras citocinas por
estímulos através de receptores Toll-like 3 (RTL3). Em conjunto com a
evidência de que a própria TSLP extrínseca aumenta a produção de TSLP
sem ΔNp63 pelos queratinócitos, os resultados indicam que queratinócitos
ΔNp63 (lo/-) geram TSLP através de uma via autócrina e/ou parácrina após
estimulação de RTL3 em lesões da DA, uma vez que porções de células
danificadas e patógenos estimulam produção de RTL3.
KUBO et al. (2014b) analisou a epiderme, na qual as junções
oclusivas (JO) são especificamente localizadas no estrato granuloso, em
que a expressão de ΔNp63, um fator de transcrição da família p53, é
atenuado.
Uma vez que a relação entre ΔNp63 e a função de barreira não
Literatura
19
foi completamente descoberta, avaliaram-se perfis de expressão de
proteínas dessas junções em tecidos da pele e em cultura de queratinócitos.
Os resultados mostraram que a expressão de ΔNp63 e que de claudin-4
foram inversamente correlacionada na epiderme de humanos saudáveis. Em
estudos in vitro utilizando queratinócitos da linhagem HaCaT
(spontaneously transformed aneuploid immortal keratinocyte cell line from
adult human skin) mostrou relevância funcional de ΔNp63 e de claudin-4.
O ligante do receptor Toll-like 3 (RTL-3), que é conhecido por ser liberado
a partir de células danificadas, suprimiu a expressão ΔNp63 e
concomitantemente regulou a expressão de claudin-4 em queratinócitos
primários. Um amplo padrão de expressão de claudin-4 foi encontrado na
epiderme de dermatite atópica (DA), que é uma doença que causa defeito
na barreira, que contém queratinócitos ΔNp63-falta como relatado
anteriormente. Portanto, a suprarregulação da expressão de claudin-4
regulada por ΔNp63 pode estar associado a respostas complementares ou
pela reparação de queratinócitos danificados com DA.
SHIRLEY et al. (2014) examinaram a capacidade de
calprotectina, um heterodímero de S100A8 e S100A9, de estimular a
proliferação e a migração de melanócitos humanos normais e células de
melanoma in vitro. Os autores mostraram primeiro, por imunofluorescência
Literatura
20
e RT-PCR quantitativa, que as células melanocíticas expressam um
receptor de calprotectina, o receptor toll-like 4 (RTL-4). Em seguida,
demonstraram que calprotectina melhora significativamente a proliferação,
a migração e a invasão em matrigel tanto dos melanócitos humanos quanto
de células de melanoma normal. Assim, calprotectina é um dos inúmeros
fatores parácrinos liberados pela radiação ultravioleta em queratinócitos
expostos que podem promover melanomagenese e é um alvo potencial para
a prevenção ou tratamento de melanoma.
JEONG et al. (2014) investigaram os efeitos de calcitriol sobre
a expressão de RTL2, RTL4, peptídeo antimicrobiano LL-37, citocinas
pró-inflamatórias e em queratinócitos humanos cultivados. Os níveis de
expressão de RNAm para RTL2, RTL4, fator de necrose tumoral alfa
(TNF-α), interleucina (IL) -1beta e LL-37 cultivados em queratinócitos
humanos foram analisados por meio de reação em cadeia da polimerase em
tempo real (PCR) e por transcrição reversa (RT). Além disso, foram
medidos os níveis de TNF-α no sobrenadante por um ensaio de
imunossorvente ligado a enzima (ELISA) para confirmar o efeito do
calcitriol em RTL2 e RTL4. Tal como medido por RT-PCR e PCR em
tempo real, encontrou-se que o calcitriol suprimiu a indução mediada por
radiação ultravioleta B e lipossacarídeo de expressão de RTL, LL-37 e
Literatura
21
das citoquinas pró-inflamatórias, tais como TNF-α e IL-1β em
queratinócitos normais humano. Os níveis de TNF-α no sobrenadante
medida por meio de ELISA foram também suprimidos após tratamento
com calcitriol. O calcitriol pode regular negativamente a inflamação
indicado pela super-expressão de citoquinas pró-inflamatórias e LL-37.
NIKITOROWICZ-BUNIAK et al. (2014) avaliaram o envolvimento
da pele com a fibrose dérmica em esclerose sistêmica (ES), e os
queratinócitos como importantes reguladores da função dos fibroblastos
através da secreção de agentes de quimio-atração, bem como por meio de
fatores de crescimento e citocinas que influenciam o fenótipo e a taxa de
proliferação de fibroblastos. Interações epiteliais dos fibroblastos têm um
papel importante na formação da fibrose. Os autores caracterizaram a
epiderme da ES e avaliaram se as células epidérmicas ES-lesionadas
liberam fatores capazes de promover fibrose. Os resultados mostraram que
a epiderme da ES é hipertrófica, e alterou a expressão de marcadores de
diferenciação terminal involucrina, loricrina, e filagrina. O perfilamento
multiplex revelou que o explante de pele da ES liberou níveis aumentados
de CCN2 e S100A9. Indução CCN2 foi identificado por estar espalhado na
derme papilar, enquanto que S100A9 induziu a proliferação de fibroblastos
e reforçou a expressão de CCN2 via RTL4. Estes dados sugerem
Literatura
22
que a epiderme da ES forneceu uma importante fonte de CCN2 pró-
fibrótica e S100A9 pró-inflamatória na pele da ES, e, por conseguinte,
contribui para a inflamação e fibrose observada na doença.
BORKOWSKI & GALLO (2014) investigaram a radiação UV
que representa um risco significativo para a saúde humana. Os mecanismos
que ajudam as células danificadas por radiação UV de serem reparadas
foram recentemente definidos com a observação de que o RTL3 pode ser
liberado de queratinócitos necróticos. A ativação de RTL3 na pele induz
inflamação e aumenta a expressão de genes envolvidos na reparação da
barreira da pele. A ativação de RTL2 na pele pelos produtos microbianos
comensais impede a inflamação excessiva, bloqueando a sinalização a
jusante de RTL3. Os resultados apontam que o dano induzido por UV e a
inflamação na pele é propagada por produtos de acolhimento e
regulamentada pelos microorganismos desse meio ambiente.
SETTA-KAFFETZI (2014) avaliou o adaptador de complexo
de proteína 1 (AP-1) que é um heterotetrâmero conservado evolutivamente
que promove tráfico vesicular entre a rede trans-Golgi e os endossomas. O
nocaute da maioria das subunidades complexas AP-1 de murino é
embrionariamente letal, por isso a identificação de alelos associados à
doença em humanos tem o potencial único para entregar insights sobre a
função do gene. O autor relatou duas mutações fundadoras
Literatura
23
(c.11T> G [p.Phe4Cys] e c.97C> T [p.Arg33Trp]) em AP1S3, o gene que
codifica o complexo AP-1 subunidade σ1C, em 15 indivíduos não
aparentados com uma severa doença de pele auto inflamatória conhecida
como psoríase pustulosa. Uma vez que as variantes estão previstas para
desestabilizar a estrutura 3D do complexo AP-1, foram geradas linhagens
celulares AP1S3-knockdown para estudar as consequências da deficiência
de AP-1 em queratinócitos de pele. Relatado que o silenciamento de
AP1S3 interrompeu a translocação endossomal do receptor de
reconhecimento de padrão inato de RTL3 e resultou numa inibição
acentuada de sinalização à jusante. Estes resultados identificam a psoríase
pustular como um fenótipo auto inflamatório causados por defeitos em
tráfico vesicular e demonstram uma exigência de AP-1 para a homeostase
do receptor do tipo Toll.
DASU et al. (2014) apresentaram estudos anteriores que
demonstraram que as feridas de pele que geram epinefrina (EPI) podem
ativar receptores adrenérgicos locais (RAs), prejudicando a cicatrização.
Ativadores em bactérias derivadas de RTLS dentro da ferida iniciam
respostas inflamatórias e também pode prejudicar a cicatrização. Os
estudos analisaram estas duas vias de diafonia, utilizando EPI e a ativação
de macrófagos lipopéptido-2 (MALP2) para ativar os RA e RTL2,
respectivamente, em células estaminais (pluripotentes) mesenquimais
Literatura
24
derivadas da medula óssea humana (BM-MSCs) e queratinócitos neonatais
(NHKs). BM-MSCs expostos a EPI de forma significativa (p <0,05)
aumentaram a sinalização de RTL2 (sete vezes, em BM-MSCs), proteína
RTL2 (duas vezes), e fator de diferenciação mielóide 88 (MyD88) (quatro
vezes). Por outro lado, a ativação de RTL2 por MALP2 nestas células
aumentou a sinalização de β2-AR (duas vezes, em BM-MSCs, 2,7 vezes na
NHKs), proteína β2-AR (2,5 vezes), a fosforilação da quinase β-AR-
activado (p- BARK, duplo), e liberação induzida de EPI de ambos os tipos
de células (duas vezes). O tratamento de células com IPE e MALP2 em
conjunto, como seria encontrado em uma ferida, aumentou β2-AR e a
expressão da proteína p-BARK (seis vezes), a migração celular diminuída
(BM-MSCs-21% menor e NHKs-60% menor, p<0,002), e resultou em um
aumento de 10 vezes de BM-MSCs e 51 vezes de NHKs, aumentou a
liberação da resposta de IL-6 (p<0,001) que foram notavelmente reduzidas
pelo pré tratamento com antagonistas de β2-AR. In vivo, os animais IMR-
estressados exibiram inibição da cicatrização, com níveis elevados de
RTL2, MyD88, e IL-6 nas feridas (p<0,05) em relação aos controles não
estressados. Portanto, os resultados descreveram um protocolo para
diminuir a migração celular exarcebada e a inflamação via crosstalk entre
as vias de sinalização adrenérgica e as vias de RTL no BM-MSCs e NHKs.
YUMOTO et al. (2015) avaliaram a periodontite, uma doença
Literatura
25
inflamatória crônica iniciada por um biofilme microbiano formado na bolsa
periodontal. O epitélio gengival desempenha papel importante como a
primeira barreira física para a invasão bacteriana e em orquestrar a resposta
imune inata via RTLs, que reconhecem vários produtos bacterianos, e por
manter a sua função. Recentemente foram desenvolvidos produtos de
higiene bucal para inibir a aderência bacteriana, reação inflamatória
subsequente e proteger o epitélio gengival. Os autores relataram que o
polímero de revestimento 2-metacriloiloxietil fosforilcolina (MPC)
diminuiu a adesão bacteriana a queratinócitos humanos por via oral, a RT-
7, e com o polímero MPC de gargarejo inibiu o aumento de bactérias orais.
Neste estudo, a respeito da possibilidade de aplicação MPC-polímero para
evitar a aderência de micróbios patogênicos periodontal, reação
inflamatória subsequente e proteção do epitélio gengival, foram
examinados os efeitos do polímero MPC sobre a adesão de Porphyromonas
gingivalis. Este é um importante agente patogênico relacionadas com
periodontite, RTL2 e ligante de RT-7 e subsequente produção de
interleucina (IL)-8. O polímero MPC de tratamento reduziu
significativamente a adesão de P. gingivalis em 44% e da produção de IL-8
mediada por RTL2, bloqueando a ligação do seu ligante específico, de uma
forma dependente da concentração. Além disso, o pré tratamento com o
polímero MPC protegido RT-7 a partir de lesões por agentes químicos
irritantes, como o cloreto de cetilpiridínio. Os resultados sugerem que
Literatura
26
polímero MPC é potencialmente útil para higiene bucal para prevenir a
infecção oral e para manter a função do epitélio oral.
MEISGEN et al. (2014) avaliaram queratinócitos que
representam a primeira linha de defesa contra patógenos na pele e têm um
papel importante na iniciação e regulação da inflamação durante a infecção
e autoimunidade. Os autores investigaram o papel de miR-146a na
regulação da resposta imune inata de queratinócitos. A estimulação do
RTL2 em queratinócitos primários humanos resultou em uma suprar-
regulação de NF-e κB- e de uma proteina quinase dependente de mitógeno
da expressão de miR-146a, que foi duradouro, contrastando com a indução
rápida e transitória de mediadores inflamatórios. A supra expressão de
miR-146a suprimiu significativamente a produção de IL-8, CCL20, e fator
de necrose tumoral-alfa (TNF-α), que funcionalmente suprimiu a atração
quimiotáctica de neutrófilos pelos queratinócitos. A inibição da produção
endógena de miR-146a induziu a produção de mediadores inflamatórias em
queratinócitos ainda não estimulados, e potenciou o efeito de estimulação
de RTL2. O perfilamento transcriptômico revelou que o miR-146a suprime
a expressão de um grande número de genes relacionados à imunidade em
queratinócitos. MiR-146a suprarregulou a interleucina-1 associada a
receptor quinase e um fator associado ao receptor do TNF 6, duas
moléculas adaptadoras chave a jusante de sinalização de RTL, e suprimiu a
Literatura
27
atividade de NF-kB de ligação do promotor, como mostrado por
experiências de promotor de luciferase. Juntos, estes dados identificam
miR-146a como um elemento regulador na imunidade inata de
queratinócitos, o que impede a produção de mediadores inflamatórios em
condições homeostáticas e serve como um potente regulador de feedback
negativo após estimulação RTL2.
KIM & KRUEGER (2015) analisaram a psoríase vulgar, que é uma
doença inflamatória crônica da pele que resulta da interação complexa
entre os queratinócitos, células dendríticas e células T. Os queratinócitos
desencadeiam respostas imune inata e adaptativa. As células dendríticas
mielóides dérmicas regulam a ativação das células T e a produção de
citocinas e quimiocinas que amplificam a inflamação. A maioria das
células T de psoríase produzem interferon-gama, interleucina (IL) -17, e
IL-22. A fase de iniciação da psoríase envolve receptores do tipo Toll,
LL37 peptídeo antimicrobiano e células dendríticas plasmocitóides. Os
queratinócitos são o principal tipo de células que expressam receptores de
interleucina cutânea e, portanto, o circuito imunitário é amplificado por
queratinócitos que suprarregulam RNAm para uma série de produtos
inflamatórios.
YU et al. (2015) analisaram a interleucina -1beta que emerge
como uma citocina mediada pela T helper tipo 17 (Th17) crítica na
Literatura
28
patogênese de doenças de pele, incluindo a psoríase. Os queratinócitos
psoriáticos são uma importante fonte de IL-1beta. No entanto, os
mecanismos que desencadeiam o processamento de IL-1beta permanecem
desconhecidos. Recentemente, um de fase aguda no soro proteína amilóide
A (SAA) foi identificado como sendo um sinal de perigo que desencadeia a
ativação de inflamatossomo e secreção de IL-1beta. Neste estudo,
verificou-se aumento de RNAm de SAA e a expressão da proteína em
epiderme psoriática. Na cultura de queratinócitos, SAA suprarregula a
expressão de pró-IL-1beta e a secreção de IL-1β madura. Ao nível
transcricional, bloqueando o RTL2, RTL4 ou o fator nuclear kappa B (NF-
kB) atenua-se a expressão de RNAm de IL-1β induzida por SAA. Esta
proteína suprarregulou a expressão de caspase-1 e NACHT, LRR e PYD
contendo domínio proteína 3 (NLRP3) em queratinócitos. Ao inibir a
atividade da caspase-1 e silenciando NLRP3 diminuída pela secreção de
IL-1β, confirma-se o NLRP3 como o inflamatossomo responsivo a SAA
em nível de pós-transcricional. O mecanismo de ativação de SAA
desencadeando NLRP3 e subsequente secreção de IL-1β foi encontrado
envolver a geração de espécies reativas de oxigênio. Finalmente, a
expressão de SAA por queratinócitos foi regulada para cima por IL-17A.
Tomados em conjunto, os autores, de acordo com estes resultados
indicaram que o derivado de queratinócito SAA desencadeia um mediador
inflamatório chave, IL-1β, através da ativação do inflamatossomo NLRP3,
Literatura
29
fornecendo novos alvos potenciais para o tratamento da doença crônica de
pele.
OLIVEIRA et al. (2015) mostraram que existem poucos
estudos sobre o papel da resposta imune inata em dermatofitose. Os autores
realizaram estudo para definir a participação de RTL2 e 4, nas
dermatofitoses localizada (DL) e disseminada (DD) devido a T. rubrum.
Foram utilizados neste estudo quinze pacientes recém-diagnosticados, oito
pacientes com DL e sete com DD, definidos por envolvimento de pelo
menos três segmentos corporais. O grupo controle foi composto por vinte
amostras de pele de indivíduos saudáveis submetidos à cirurgia plástica.
RTL2 e RTL4 foram quantificados em lesões cutâneas por imuno-
histoquímica. A expressão reduzida de RTL4 na epiderme superior e
inferior de ambos os pacientes com DL e DD foi encontrado em
comparação aos controles. A expressão de RTL2 foi preservada na
epiderme superior e inferior de todos os três grupos. A sinalização de RTL4
induz a produção de citocinas inflamatórias e o recrutamento de
neutrófilos, a sua expressão reduzida provavelmente contribuiu para a falta
de resolução da infecção e a consequente natureza crônica da
dermatofitose. Como a expressão de RTL2 atua para limitar o processo
inflamatório e preservar a estrutura epidérmica, a sua expressão preservada
pode também contribuir para a persistência da infecção e inflamação
Literatura
30
limitada que é característico de infecções dermatófitas.
CHENG et al. (2015) analisaram queratinócitos expressando
trombomodulina (TM), sendo que a TM solúvel liberada (STM) promove a
cicatrização de feridas. No entanto, os efeitos de alto teor de glicose na
expressão da TM em queratinócitos e o papel de TM em úlceras diabéticas
permanecem obscuros. Estes autores demonstraram que a expressão da TM
e do RTL4 estavam diminuídas em alta concentração de glicose de cultura
de queratinócitos humanos e em queratinócitos de pacientes diabéticos.
Além disso, a ferida causa regulação aumentada de TM sendo que a
produção de TMs foi abolida em ambos os de alta glicose em
queratinócitos humanos cultivados de pele do rato diabético induzido por
estreptozotocina. Além disso, a suplementação de TMs recombinante
poderia aumentar a expressão de RTL4 e promover a cicatrização de
feridas cutâneas em ambos queratinócitos humanos cultivados e em
camundongos diabéticos. No entanto, em camundongos com deleção de
RTL4, que exibiram atraso na cicatrização de feridas, o benefício
terapêutico dos TMs recombinante foi anulado. Além disso, seus resultados
mostraram que a expressão do fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α) foi
regulada de forma dose-dependente pela glicose, e o tratamento com TNF-
α regulou negativamente a expressão de TM e de RTL4. Tomados em
conjunto, o ambiente de alto teor de glicose reduz a expressão de TM e
Literatura
31
RTL4 em queratinócitos, possivelmente através da ação de TNF-α, e das
TMs recombinantes, o que pode aumentar a expressão do RTL4 e
promover a cicatrização de feridas sob condição diabética.
4 MÉTODOS
Métodos
33
4 MÉTODOS
O presente estudo possui um delineamento de pesquisa
observacional, prospectiva, analítica, experimental, in vitro. O projeto foi
submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa e aprovado sob número 72752
de 13/08/2012, da Universidade Federal de São Paulo (Anexo 1).
Foram incluídos neste estudo seis (06) pacientes, divididos em dois
(2) grupos: três (03) pacientes no grupo grande queimado e três (03)
pacientes no grupo controle.
O número de pacientes foi considerado adequado por se tratar de
linhagem celular primária estabelecidas no laboratório com a criação de um
Banco de Células dessa população, não existindo outras variáveis
envolvidas no experimento, além da carga genética celular individual, e por
ser realizado o experimento após a segunda passagem, próximo do
momento do trauma da queimadura após a obtenção do fragmento de pele.
O experimento de PCR é padronizado por ser realizado em pool dos
pacientes, sendo apresentado valores da média de todos pacientes,
comparados ao grupo controle, também realizado em pool, sendo realizado
em triplicata.
Métodos
34
Foi aplicado o termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Anexos
2 e 3) a todos os pacientes que aceitaram participar do estudo, dos grupos
queimado e controle, respectivamente.
Os pacientes do grupo grande queimado foram aqueles que se
apresentavam internados na Unidade de Tratamento de Queimaduras da
Disciplina de Cirurgia Plástica da Universidade Federal de São Paulo
(UNIFESP) localizada no Hospital Universitário – Hospital São Paulo, e
pelo número reduzido de internações e heterogeneidade dos casos de
queimadura, a seleção foi a de entrada dos pacientes, sendo os que
apresentaram critérios de inclusão, foram selecionados.
A fase experimental, in vitro, foi realizada no Laboratório de
Cirurgia Translacional da Disciplina de Cirurgia Plástica, localizado no
Edifício Acadêmico Prof. Dr. Horácio Knesse de Mello, na Rua Pedro de
Toledo, 871 – quarto andar fundos - Vila Clementino-São Paulo. Esta fase
compreendeu o cultivo de queratinócitos primários, extração de RNA,
PCR-array e análise dos dados.
Métodos
35
GRUPO GRANDE QUEIMADO
Critérios de Inclusão
Pacientes de ambos os sexos, idade acima de 18 anos, que
concordaram em participar da pesquisa e que assinaram o termo de
consentimento, estavam internados na UTQ-DCP-UNIFESP-HU-HSP,
apresentavam necessidade de procedimento(s) operatório(s), com
queimadura de 2º grau profundo ou 3º grau acometendo entre 25% e 50%
da superfície corpórea queimada (SCQ) ou que necessitavam de enxertia de
pele parcial em 10% de superfície corpórea queimada.
Critérios de Não-Inclusão
Não concordaram em participar da pesquisa, apresentavam doença
prévia de pele ou lesão superficial (Psoríase e similares), doenças clínicas
que interferem diretamente com o processo infeccioso e com o processo de
cicatrização de feridas (Colagenoses como lúpus eritematoso,
esclerodermia, dermatopolimiosite, doença mista do tecido conjuntivo), e
pacientes que apresentavam choque séptico e falência de múltiplos órgãos.
Critérios de Exclusão
Contaminação das garrafas de cultivo, taxa de proliferação baixa sem
obter confluência de 80% das células nas garrafas, quantidade insuficiente
de RNA extraído que impeça a avaliação dos dados do paciente, e perda do
Metodos
36
material extraído.
GRUPO CONTROLE
Idade acima de 18 anos, ambos os sexos, concordaram em participar
da pesquisa e assinaram o termo de consentimento, apresentavam
necessidade de procedimento operatório – cirurgia estética –
abdominoplastia ou mamoplastia, com retirada de pele que foi descartada,
não apresentavam doenças prévias, e não eram fumantes.
Instrumentos de Pesquisa
Procedimento operatório
A obtenção das amostras de pele necessárias para o desenvolvimento
da pesquisa foi realizada por meio do procedimento operatório padrão
utilizado para o tratamento de queimados da UTQ-DCP-UNIFESP-HSP.
Normalmente, o desbridamento do tecido desvitalizado de um paciente
com queimadura de 2° grau profundo ou de 3° grau, que não apresenta
complicações, é realizado após três a quatro dias após a queimadura, não
modificando o aspecto da fase a ser estudada, fase aguda após a
ressuscitação inicial e ainda sem quadro de infecção grave.
Durante essa limpeza operatória, a pele normal adjacente à pele
necrosada acaba sendo retirada parcialmente por conta do próprio
Métodos
37
procedimento operatório. Como os limites da lesão são irregulares e o
instrumento utilizado para a excisão, a faca de Blair, não é precisa, parte do
tecido vivo é descartado também.
Para os fins desse estudo, a pele íntegra que seria descartada foi
aproveitada para a execução do experimento. O material foi enviado ao
laboratório para o isolamento das células, cultivo e experimentos.
Cultura de Queratinócitos
O isolamento de células para a cultura de queratinócitos primários
humanos foi realizado a partir de fragmentos de pele normais que seriam
descartados nos procedimentos operatórios realizados na UTQ-DCP-
UNIFESP-HU-HSP.
Queratinócitos humanos normais derivados de fragmento de pele de
pacientes vítimas de queimadura foram isolados e cultivados de acordo
com o método padrão (GREEN, KEHINDE, THOMAS, 1979;
GRAGNANI, MORGAN, FERREIRA, 2002; SOBRAL et al., 2007) com
adaptações, descrito a seguir.
Em uma placa de cultura de 60 mm o fragmento foi colocado e
seccionado em pequenos pedaços com tamanho aproximado de 0,5 cm3.
Esses fragmentos foram colocados em tubo estéril de 50 ml, com 30 ml de
dispase (4,7 U/mL) (Roche REF 04942078001) em DMEM sendo
Métodos
38
mantidos refrigerados a 4ºC por 15 horas para ação da dispase II humana
recombinante.
Após esse período, cada fragmento teve a epiderme destacada
delicadamente da derme com o auxílio de pinças e a epiderme foi destinada
ao cultivo de queratinócitos pelo protocolo padrão do laboratório de cultura
de células da Disciplina de Cirurgia Plástica da Universidade Federal de
São Paulo/Escola Paulista de Medicina (GRAGNANI, MORGAN,
FERREIRA, 2002).
O protocolo necessita da utilização da camada sustentadora de
fibroblastos de rato da linhagem 3T3-J2 (ATCC, USA), que quando esta
com 50% de confluência sofre a ação por duas horas de 15 µg/ml da
mitomicina C (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.) para que as
células continuem viáveis, mas não proliferativas, portanto, existe área na
garrafa para que os queratinócitos isolados possam aderir ao substrato e
proliferar com o auxílio dos fatores de crescimento produzidos pelos
fibroblastos.
Quando os queratinócitos apresentam a confluência de 80% na
garrafa, eles sofrem tratamento enzimático com tripsina 0,25% e são
passados para nova garrafa para aumentar a população de queratinócitos,
que posteriormente podem ser crio armazenadas ou utilizadas até a terceira
passagem em experimentos (GRAGNANI, MORGAN, FERREIRA, 2002).
Métodos
39
Extração do RNA total em Queratinócitos
Em cada uma das amostras celulares foi adicionado 750 µl de QIAzol
Lysis Reagent (Qiagen), agitado vigorosamente e incubado a temperatura
ambiente por quinze minutos. Foi adicionado 200µL de clorofórmio com
posterior agitação por quinze segundos. Após a incubação de quinze
minutos a temperatura ambiente, foi centrifugado o material por quinze
minutos a 12.000rpm 4ºC. A fase aquosa foi transferida para tubo de
Eppendorf de 1,5mL, adicionado 500µl de álcool isopropílico, agitado
gentilmente e incubado por dez minutos a 12000 rpm a 4ºC, sendo o
sobrenadante descartado. Etanol 70% foi adicionado e centrifugado
novamente por cinco (5) minutos a 12.000 rpm a 4ºC. O sobrenadante foi
removido e o excesso de álcool foi retirado com a pipeta. Depois de seco, o
RNA foi ressuspenso em 50µL de água ultra pura livre de nucleasse e
armazenado no freezer -80ºC até sua utilização.
Purificação do RNA total
As amostras do RNA dos indivíduos do grupo controle ou do grupo
grande queimadura foram purificadas utilizando o RNeasy Mini Kit
(Qiagen) conforme o protocolo do fabricante.
Métodos
40
Quantificação do RNA total
A quantificação e pureza do RNA foram avaliadas através de
espectofotometria no aparelho NanoDrop ND-2000 (Nanodrop
Technologies Inc., Rockland, DE). A absorbância das amostras foi medida
nos comprimentos de onda 260nm e 280nm, sendo que DO260=1
corresponde a 40ng/µl de concentração. Foi considerado RNA de boa
qualidade quando a razão DO260/ DO280, foi superior a 1,8 (SAMBROOK,
FRITSCHI, MANIATIS, 1989).
RT-PCR Array quantitativo
O volume final de RNA de cada paciente de 750ng foi usado para
síntese de cDNA. Amostras foram tratadas com o tampão oriundo do Kit, e
reações de transcrição reversa foram realizadas usando o RT² First Strand
kit da Superarray Bioscience, de acordo com o protocolo do fabricante.
qRT-PCR foram realizadas usando-se o RT² Profiler ® PCR array da
Superarray Bioscience
(http://www.sabiosciences.com/howpcarrayworks.php).
Métodos
41
Para cada paciente, 84 genes relevantes envolvidos na transdução da
sinalização através de receptores Toll-like (código Kit Qiagen- PAHS-
018Z) foram analisados. A amplificação, aquisição dos dados, análise de
curvas foram realizadas em um ABI Prism 7500 Sequence Detection
System (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Em cada curva, cada gene foi checado quanto a eficiência, limiar
máximo e mínimo na curva padrão. Para garantir comparações entre
curvas, o mesmo limiar foi estabelecido para os cinco (5) genes e corridas:
ACTB, B2M, GAPDH, HPRT1 e RPLPO. Foram usados como controle
interno e a média do valor Ct foi usado para padronizar a expressão gênica
(2-Ct) e determinou a diferença entre os grupos. A expressão gênica foi
considerada regulada para cima ou regulada para baixo quando a diferença
fosse maior que dois.
Métodos
42
A Figura 1 mostra as quatro etapas do PCR Array para obtenção dos
dados de expressão gênica e a Figura 2 apresenta exemplo de plotagem
dos dados de expressão gênica no gráfico de dispersão.
Ambas as figuras a seguir foram retiradas do website:
(http://www.sabiosciences.com/rt_pcr_product/HTML/PAHS-011A.html).
Métodos
43
Figura 1 – Demonstração das quatro etapas do PCR Array: 1) Conversão
de RNA total em cDNA; 2) Adição de cDNA ao RT² qPCR Master Mix &
Aliquot Mixture por toda placa de PCR Array; 3) Correr a placa em
aparelho de PCR em tempo real; 4) Análise dos dados de expressão gênica
(exemplo retirado do website com amostra de tumor de mama versus mama
normal).
Métodos
44
Figura 2 – Exemplo de plotagem de dados obtidos de células
provenientes de uma mama normal e de um tumor mamário. No gráfico
visualizam-se os genes hiperregulados (vermelho) e hiporregulados
(verde).
Métodos
45
Análise Estatística
Foi utilizado o teste não paramétrico de Wilcoxon para análises
pareadas e o de Friedman para análises múltiplas. O nível de significância
estatística foi fixado em 0,05 e assinalado com asterisco quando os valores
apresentaram diferença estatística.
5 RESULTADOS
Resultados
47
5. Resultados
Após corrida da placa de PCR Array e obtenção dos dados por meio
de curvas de amplificação (Figura 3) em aparelho Real Time PCR, foram
obtidos os dados brutos para a análise dos 84 genes estudados para a via de
expressão de receptores Toll-Like. Após a obtenção dos dados de Fold
Regulation e os valores de p, utilizando o programa específico no site da
SA Biosciences, somente foram selecionados os genes que possuíam
valores de p menor que 0,05 e também que apresentaram Fold Regulation
maior que 2,0 ou menor que -2,0. Assim, observou-se que 21% destes
genes foram diferencialmente expressos (Tabela 1), dentre estes 100%
foram regulados negativamente (Figuras 4 e 5).
Resultados
48
Figura 3 - Plots de Amplificação obtidos após curvas de expressão gênica
para pacientes controle e queimados.
Resultados
49
Tabela 1 - Os 18 genes diferencialmente expressos (hipoexpressos) após
análise da expressão gênica para as vias de sinalização para os receptores
Toll-Like, todos com p significante (em vermelho).
GENES DESCRIÇÃO
FOLD
REGULATION
VALOR DE
p
CD86 CD86 molecule -26,1039 0,001075
FOS FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog -16,0914 0,001006
HRAS V-Ha-ras Harvey rat sarcoma viral oncogene homolog -35,5553 0,005025
HSPA1A Heat shock 70kDa protein 1A -58,205 0,00003
IKBKB
Inhibitor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells, kinase
beta -8,9138 0,01725
IRF1 Interferon regulatory factor 1 -13,2128 0,026903
JUN Jun proto-oncogene -9,1403 0,016826
MAP2K3 Mitogen-activated protein kinase kinase 3 -23,468 0,001859
MAP3K1 Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 1 -8,9057 0,012927
NFKB1 Nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells 1 -8,7216 0,041253
NFKBIA
Nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells
inhibitor, alpha -7,9519 0,034324
PPARA Peroxisome proliferator-activated receptor alpha -11,0821 0,036433
RELA V-rel reticuloendotheliosis viral oncogene homolog A (avian) -17,6243 0,000071
TAB1 TGF-beta activated kinase 1/MAP3K7 binding protein 1 -11,3652 0,044825
TLR1 Toll-like receptor 1 -5,9581 0,046205
TNF Tumor necrosis factor -28,7301 0,002698
TNFRSF1A Tumor necrosis factor receptor superfamily, member 1A -14,106 0,0045
TOLLIP Toll interacting protein -21,9264 0,005648
Teste t de Student.
Resultados
50
Figura 4 - Mapa de calor para vias de sinalização de receptores Toll-Like
para queratinócitos de pacientes queimados em cultivo primário. Em
vermelho genes, hiperregulados; em verde, genes hiporregulados; e em
preto, os genes não regulados.
Resultados
51
Figura 5 - Gráfico de dispersão para as vias de sinalização RTL em cultura
de queratinócitos de pacientes queimados. Em vermelho genes,
hiperregulados; em verde, genes hiporregulados; e em preto, os genes não
regulados.
Resultados
52
Entre genes diferencialmente expressos, destacamos os sete genes
mais hipoexpressos, que foram: HSPA1A (-58 vezes), HRAS (-36 vezes),
MAP2K3 (-23 vezes), TOLLIP (-23 vezes), RELA (-18 vezes), FOS (-16
vezes), e TLR1 (-6,0 vezes) (Figura 6).
Figura 6 - Genes hipoexpressos para as vias de sinalização RTL em
cultivo de queratinócitos de pacientes queimados.
52
6 DISCUSSÃO
Discussão
54
6 Discussão
Para atualização da literatura sobre a expressão gênica de receptores
toll-like (RTL) na pele de pacientes queimados, realizou-se extensa
pesquisa, no entanto, até o momento, não foi encontrado nenhum resultado
para este tema. A maioria dos artigos que tratam separadamente dos genes
envolvidos neste sistema; além disto, são realizados em modelos animais, e
algumas vezes foram realizadas análises de proteínas e não de genes, como
realizamos no presente trabalho. A seguir foram discutidos alguns genes
importantes que apresentaram expressão diminuída em pacientes com
queimaduras graves em relação aos controles.
O gene da proteína de choque térmico de 70kDa 1A (HSPA1A)
codifica uma proteína de choque térmico que é um membro da família de
proteínas de choque térmico 70. Em conjunto com outras proteínas de
choque térmico, esta proteína estabiliza proteínas existentes contra a
agregação e medeia a dobradura das proteínas recentemente traduzidas no
citosol e nas organelas. Para entender melhor as respostas celulares e
moleculares para a superexposição a ondas milimétricas, foram
investigados alterações no perfil de expressão gênica e histológica da pele
após a exposição à radiação de radiofrequência de 35 GHz.
Discussão
55
A suprarregulação de HSPA1A em 24 h por 35 GHz por exposição
de ondas milimétricas foi confirmada, porém por meio de RT-PCR. Os
resultados indicaram que a exposição prolongada a 35 GHz em ondas
milimétricas causa estresse e lesão térmica relacionada em pele, enquanto
desencadeando processos de reparação que envolve inflamação e matriz
extracelular (MILLENBAUGH et al., 2008).
No presente estudo o gene HSPA1A apresentou-se como o gene mais
hiporegulado, -58 vezes, sugerindo que no trauma da queimadura, a
intensidade de alteração na sua expressão pode levar a alteração do
processo de reparação, podendo aprofundar as lesões e estas ficando sem
capacidade de restauração ou processo cicatricial normal local.
Oncogene homólogo viral do sarcoma de Harvey em rato (HRAS)
pertence à família do oncogene Ras, cujos membros estão relacionados
com os genes de transformação de sarcoma por retrovírus em mamíferos.
Os produtos codificados por estes genes funcionam em vias de transdução
de sinal. Essas proteínas podem se ligar a GTP, GDP, e eles tem uma
atividade intrínseca de GTPase. Mutações neste gene estão associadas com
melanoma causados pela exposição do sol, e à vários outros tipos de câncer
(JIVESKOG et al., 1998).
Discussão
56
No presente estudo o gene HRAS apresentou-se como gene
hiporegulado, -36 vezes, podendo sugerir a capacidade de alteração
relacionada ao controle e gasto energético intracelular dependente de GTP
e GTPase.
O gene da proteína ativada por mitógeno quinase 3 (MAP2K3)
possui uma proteína quinase de dupla especificidade que pertence à família
da MAP quinase. Esta quinase é ativada pelo estresse ambiental, e participa
na cascata de sinalização mediada pela MAP quinase. Esta fosforila e ativa
a MAPK14 / p38- MAPK. Esta quinase pode ser ativada pela insulina, e é
necessária para a expressão do transportador de glicose. A expressão de
RAS pode resultar do acumulo da forma ativa desta quinase, que, assim,
leva à ativação constitutiva de MAPK14, e confere a transformação
ontogênica de células primárias. Ele está envolvido na resposta protetora
para a lesão celular por hipoxia em epitélio pulmonar (POWELL et al.,
2004).
No presente estudo o gene MAP2K3 apresentou-se como gene
hiporegulado, -23 vezes, podendo sugerir a capacidade de alteração
relacionada ao controle da glicemia que no grande queimado é alterada,
aparecendo em associação à infecção grave e septicemia. JESCHKE et al.
Discussão
57
(2014) analisaram retrospectivamente um painel de marcadores biomédicos
comuns para seguir a trajetória de pacientes queimados pediátricos em
relação à sobrevivência.
Os não sobreviventes apresentaram níveis maiores significante no
sangue de IL-6, IL-8, fator estimulante de colonia de granulócitos, proteína
quimioatrativa de monócitos -1, proteína-C reativa, glicose, insulina, uréia,
creatinina e bilirrubina, sendo que um marcador de não sobrevivente é o
aparecimento precoce de resistência à insulina no grande queimado.
O gene da proteína integradora a Toll (TOLLIP) codifica uma
proteína de ligação da ubiquitina que interage com vários receptores de tipo
Toll-like (RTL) de componentes da cascata de sinalização. A proteína
codificada regula a sinalização inflamatória e está envolvida com o
receptor de tráfico da interleucina-1 e com o volume de quinase associada a
IL1R. Os polimorfismos neste gene estão associados com dermatite atópica
( SCHIMMING et al., 2007).
No presente estudo o gene TOLLIP apresentou-se como gene
hiporegulado, -23 vezes, sugerindo alteração importante na sinalização do
processo inflamatório envolvida com a via da interleucina-1 e seu receptor.
Discussão
58
Em estudos anteriores do coordenador do grupo de pesquisa,
inicialmente foi estudado genes específicos (KGF, TNF-α e IL-1β) na pele
de pacientes com grande e pequena queimadura, sendo que a IL-1β
apresentou hiperexpressa (15 vezes) no grupo grande queimadura,
enquanto estava hipoexpresso (28 vezes) no pequeno queimado
(GRAGNANI et al., 2013).
Em estudo posterior, onde foram avaliados 84 genes relacionados a
marcadores do processo inflamatório por q-PCR na pele de pacientes
grande e pequeno queimados, encontrou-se a IL-1beta hiperexpressa no
pequeno queimado em valor maior que no grande queimado,
respectivamente, 29 versus 2,3 vezes. Como nos dois estudos anteriores, a
IL-1beta apresentava-se hiperexpressa no grande queimado, que foi a
mesma extensão de queimadura analisada no estudo atual, no qual o gene
TOLLIP apresentou hipoexpressão importante, sugerindo que esse gene
pode participar na via de sinalização da IL-1 de forma inversamente
proporcional, por estar hipoexpresso possibilita o aumento da expressão de
IL-1beta no grande queimado (GRAGNANI et al., 2014).
Discussão
59
NF-kappa-B é um fator de transcrição onipresente envolvido em
vários processos biológicos. Encontra-se no citoplasma em um estado
inativo por inibidores específicos. Após a degradação do inibidor, o NF-
kappa-B move-se para o núcleo e ativa a transcrição de genes específicos.
NF-kappa-B é composto por NFKB1 ou NFKB2 relacionado a REL,
RELA, ou RELB.
A forma mais abundante de NF-kappa-B é NFKB1 complexado com
o produto deste gene, RELA, gene de codificação da proteina homólogo A
do oncogene da reticuloendoteliose aviária viral. RELA tem uma ação na
proliferação epidérmica e na regulação da homeostase, um papel
profibrogênico na pele, e é identificada uma ligação entre a expressão
epidérmica RELA e a esclerose sistêmica. A modulação das ações destas
subunidades podem ser benéficas para o tratamento de doenças
hiperproliferativas ou fibrogênicas da pele (FULLARD et al., 2013).
No presente estudo o gene RELA apresentou-se como gene
hiporegulado, -18 vezes, sugerindo possível alteração na proliferação
epidérmica e na regulação da homeostase da pele.
Discussão
60
No estudo anterior, onde foram analisados 84 genes marcadores do
processo inflamatório em pele de pacientes queimados, observou-se um
valor intenso de hipoexpressão (-3873,) de CXCL11, que é um ligante para
o receptor da quimiocina CXCR3, e essa interação esta presente em
doenças inflamatórias e é regulada por elementos como o fator NF-kappaB
que atua no núcleo como um fator transcricional e na resposta imune,
conexão com o atual resultado, que também se apresentou hipoexpresso em
grande queimado (GRAGNANI et al., 2014).
O oncogene de osteossarcoma FBJ (FOS) responde a estímulos
extracelulares e sofre robusta e transiente ativação da transcrição. O gene c-
FOS pode ser considerado como alvo para identificar injúria elétrica
(GHANDOUR et al., 2014). Um modelo animal de úlceras cutâneas
induzidas por radiação em ratos irradiados com 35-55 Gy foi estabelecida
pelos autores, e os resultados sugerem que as alterações em c-FOS pode
estar relacionada com a má cicatrização da pele da úlcera induzida por
radiação (GHANDOUR et al., 2014). No presente estudo, o gene FOS
apresentou-se hipoexpresso (-16 vezes), podendo estar envolvido no
processo de restauração das lesões, seja em reepitelização alterada em
lesões mais superficiais ou na cicatrização alterada em lesões profundas.
Discussão
61
O gene Toll-like receptor 1 (TLR1) é membro da família de
receptores de tipo Toll (RTL), que desempenha um papel fundamental no
reconhecimento do patógeno e ativação da imunidade inata. RTLs foram
estudadas a partir de Drosophila e o conhecimento foi transposto para os
seres humanos por partilharem semelhanças estruturais e funcionais. Eles
reconhecem padrões moleculares associados a agentes patogênicos
(PAMPs) que são expressos em agentes infecciosos, e medeia a produção
de citocinas necessárias para o desenvolvimento de uma imunidade
eficaz.Os polimorfismos de RTL1 estão associados com o aumento da
susceptibilidade a infecções da pele e alteração da estrutura da pele. O
mecanismo para mediar esse efeito em RTL1 determinando a produção
diminuída de citocinas pró-inflamatórias seja devido ao polimorfismo (GU
et al., 1999).
O gene RTL1 foi observado nas camadas superiores da epiderme
psoriática não lesionais e lesionais, mas não na pele normal. Estes
resultados sugerem que RTLs expressas pelos queratinócitos epidérmicos
constituem parte do sistema imune inato da pele. A relevância da expressão
alterada de RTL continua a ser determinada, em queratinócitos, na psoríase
(STAPPERS et al., 2014).
Discussão
62
No presente estudo, o gene RTL1 apresentou-se hipoexpresso (-6
vezes), sendo compatível com a evolução clínica habitual dos pacientes
grande queimados, em que a infecção é um dos fatores quase sempre
presente e determinante da evolução clínica dos pacientes, por existir
alteração importante na imunidade inata, ou seja, na resposta adequada nas
vias de Toll-Like concordante à essa hipoexpressão de RTL1.
Portanto, pode-se observar que os genes acima mencionados, estão
implicados na restauração de lesão ou ferida da pele, e em especial na
imunidade inata ou primeira defesa do organismo aos agentes de infecção
tão presentes no paciente grande queimado. E a expressão reprimida destes
genes, que vimos nos resultados do presente estudo, significa uma piora na
função da pele como um órgão imune protetor.
Como perspectiva do presente estudo temos a necessidade da
continuação desse projeto, expandindo inicialmente para os pacientes que
apresentam na sua evolução o quadro de septicemia para podermos
comparar a presença de um diagnóstico de infecção apresenta diferenças
com o estudo atual que foi realizado em pacientes com o quadro de
Síndrome da Resposta Inflamatória sistêmica (SIRS) em que se encontram
pacientes grande queimados nos primeiros dias de internação.
Discussão
63
Ainda existe a necessidade da realização do estudo relativo à evolução
temporal desses pacientes, coletando amostras de pele nos diferentes
momentos de excisão da necrose, normalmente são múltiplos atos
operatórios e também na fase de enxertia, para ser analisado como se
comporta a imunidade inata relacionada a via de sinalização Toll-Like.
Este estudo contribuiu para a compreensão de mecanismos
moleculares relacionados com as vias de RTL e subjacente à infecção da
ferida causada pela queimadura e no paciente queimado relacionada ao
desenvolvimento de infecção grave e mortalidade. Além disso, pode
fornecer novas estratégias para restaurar a normal expressão destes genes e
assim, mudar o processo de cura e melhorar o protocolo de tratamento e a
evolução clínica.
Entretanto, estudos futuros sobre estes genes e drogas que possam
alterar sua expressão perante o trauma pode contribuir para o
desenvolvimento de novas terapias que possam restaurar pacientes com
queimaduras na pele de forma mais rápida e eficaz.
7 CONCLUSÃO
Conclusão 65
7 Conclusão
O perfil da expressão gênica da cultura de
queratinócitos epidérmicos de pacientes com grande
queimadura mostrou 21% de genes alterados, destes
100% apresentaram-se hiporregulados.
8 REFERÊNCIAS
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NORMAS ADOTADAS
Normas adotadas 81
Normas Adotadas
International Committee of Medical Journal Editors. Uniform requirements
for manuscripts submitted to biomedical journals: writing and editing for
biomedical publication [Internet]. Philadelphia (PA): ICMJE Secretariat
office, American College of Physicians; [updated 2008 Oct; cited 2010
May 23]. Available from: URL: http://www.icmje.org.
Orientação normativa para elaboração e apresentação de teses: guia prático.
Ferreira LM, coordenadora; Goldenberg S, Nahas FX, Barbosa MVJ, Ely
PB, organizadores. São Paulo: Livraria Médica Editora; 2008.
ABSTRACT
Abstract
83
Abstract
INTRODUCTION: Large burn injury can progress to severe infection and
sepsis with increased morbidity and mortality. There is a continuous state
of inflammation and serum levels of cytokines are high. The Toll-like
receptors are important receptors of the innate immune system that
recognize antigens. Therefore, a need exists for obtaining the gene
expression profile of the skin of extensive burns for initial analysis.
PURPOSE: To evaluate the expression profile of genes related to Toll
Like Receptors (TLR) pathways of human primary epidermal keratinocytes
(hKEp) of patients with severe burns. METHODS: After obtaining viable
fragments of skin with and without burn injury, culture hKEp was initiated
by the enzymatic method using Dispase (Sigma-Aldrich) and Trypsin
(Sigma-Aldrich). These cells were treated with Trizol® (Life
Technologies) for extraction of total RNA. This was quantified and
analyzed for purity for obtaining cDNA for the analysis of gene expression
using specific TLR pathways PCR Arrays plates (SA Biosciences).
RESULTS: After the analysis of gene expression we found that 21% of
these genes were differentially expressed, of which 100% were repressed or
hyporegulated. Among these, the following genes (fold decrease):
HSPA1A (-58), HRAS (-36), MAP2K3 (-23), TOLLIP (-23), RELA (-18),
FOS (-16), and TLR1 (-6.0). CONCLUSION: The gene expression profile
of skin of patients with large burn injury showed 21% altered genes, and
100% of them were downregulated.
ANEXOS
Anexos
85
ANEXOS 1
Parecer Consubstanciado do CEP nº 72752 de 13/08/2012
Anexos
86
Anexos
87
ANEXO 2
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
Este é um convite à participação em estudo de pesquisa experimental (grupo
“pesquisa”).
1 – Título do projeto: “EXPRESSÃO GÊNICA DE RECEPTORES TOLL-LIKE
EM CULTIVO DE FIBROBLASTOS DÉRMICOS PRIMÁRIOS DE
PACIENTES ADULTOS COM QUEIMADURA.”
2 – Desenho do estudo e objetivo(s): “Essas informações estão sendo fornecidas para
sua participação voluntária neste estudo, que tem como objetivo avaliar o que acontece
após o acidente da queimadura, pesquisando a quantidade de receptores Toll-Like, ou
seja, proteínas produzidas pelas células na área da queimadura que podem causar
inflamação e que podem piorar ou melhorar a cicatrização da queimadura. Essa
avaliação será realizada nas células da sua pele normal, sem queimadura, que fica ao
redor da lesão da queimadura e que durante o procedimento operatório de limpeza do
tecido morto (necrosado) da queimadura sai junto da mesma, e que será enviada ao
laboratório para cultivo.
3 – Descrição dos procedimentos que serão realizados: durante o procedimento
operatório a que o paciente vítima de queimadura é normalmente submetido quando
apresenta lesão de II grau profundo ou de III grau, para a retirada do tecido morto
(necrosado), que acontece normalmente ao redor do terceiro ou quarto dia após a
queimadura, e a pele normal ao redor da área da retirada do tecido morto será coletada
para o envio ao laboratório para o isolamento das células e a avaliação. Não será
realizada nenhuma conduta diferente da que é feita na cirurgia dos pacientes que não
estão no estudo, pois a pele normal ao redor da área necrosada é retirada pelo fato da
área queimada não ser regular e o procedimento ser realizado com a faca de Blair,
instrumento desenvolvido para a retirada desse tecido morto, mas que tem uma
dimensão que sempre retira pele normal ao redor da necrose, portanto, o paciente não
será submetido a nenhuma mudança na rotina do protocolo da Unidade de Tratamento
de Queimaduras.
4 – Relação dos procedimentos rotineiros e como serão realizados: amostras de pele
normal ao redor da área necrosada retirada serão coletadas e enviadas ao laboratório de
cultura de células.
5 – Descrição dos desconfortos e riscos esperados nos procedimentos do estudo:
nenhum desconforto fora do habitual aos pacientes que são submetidos à cirurgia na
unidade será acrescentado ao paciente; a cirurgia sempre é realizada sob anestesia geral
e com analgesia rotineira com opióide forte (morfina, fentanil) após a cirurgia.
6 – Benefícios para o participante: Não há benefício direto ao paciente no presente
estudo. Porém, a queimadura é um trauma complexo de difícil tratamento com grande
número de infecções e alta taxa de óbito. Assim, com a obtenção de novos
conhecimentos sobre mediadores inflamatórios que estão envolvidos na evolução da
queimadura, o estudo estará colaborando com todos os pacientes queimados no futuro
com as possíveis mudanças em protocolos se os dados mostrarem essa necessidade.
Anexos
88
7 – Relação de procedimentos alternativos que possam ser vantajosos, pelos quais o
paciente pode optar: não existem, pois os procedimentos relacionados no estudo são
realizados de rotina, sem nenhuma mudança, somente que, a pele normal que sai junto
do tecido necrótico ou morto seria desprezada, e no estudo será coletada e enviada ao
laboratório.
8 – Garantia de acesso: em qualquer etapa do estudo, você terá acesso aos profissionais
responsáveis pela pesquisa para esclarecimento de eventuais dúvidas. O principal
investigador é o Prof. Alfredo Gragnani Filho, que pode ser encontrado no endereço
Rua Napoleão de Barros, 715 – 4o andar – Telefone(s): 5576.4118. E-mail:
[email protected] Se você tiver alguma consideração ou dúvida sobre a ética da
pesquisa, entre em contato com o Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) – Rua Botucatu,
572 – 1º andar – cj 14, 5571-1062, FAX: 5539-7162 – E-mail: [email protected]
9 – É garantida a liberdade da retirada de consentimento a qualquer momento e deixar
de participar do estudo, sem qualquer prejuízo à continuidade de seu tratamento na
Instituição;
10 – Direito de confidencialidade – As informações obtidas serão analisadas em
conjunto com as de outros voluntários, não sendo divulgada a identificação de nenhum
paciente;
11 – Direito de ser mantido atualizado sobre os resultados parciais das pesquisas,
quando em estudos abertos, ou de resultados que sejam do conhecimento dos
pesquisadores;
12 – Despesas e compensações: não há despesas pessoais para o participante em
qualquer fase do estudo, incluindo exames e consultas. Também não há compensação
financeira relacionada à sua participação. Se existir qualquer despesa adicional, ela será
absorvida pelo orçamento da pesquisa.
13 – Em caso de dano pessoal, diretamente causado pelos procedimentos ou tratamentos
propostos neste estudo (nexo causal comprovado), o participante tem direito a
tratamento médico na Instituição, bem como às indenizações legalmente estabelecidas.
14 - Compromisso do pesquisador de utilizar os dados e o material coletado somente
para esta pesquisa.
Acredito ter sido suficientemente informado a respeito das informações que li ou que
foram lidas para mim, descrevendo o estudo: “EXPRESSÃO GÊNICA DE
RECEPTORES TOLL-LIKE EM CULTIVO DE FIBROBLASTOS DÉRMICOS
PRIMÁRIOS DE PACIENTES ADULTOS COM QUEIMADURA.”.
Eu discuti com o Prof. Alfredo Gragnani Filho, sobre a minha decisão em
participar nesse estudo. Ficaram claros para mim quais são os propósitos do estudo, os
procedimentos a serem realizados, seus desconfortos e riscos, as garantias de
confidencialidade e de esclarecimentos permanentes. Ficou claro também que minha
participação é isenta de despesas e que tenho garantia do acesso a tratamento hospitalar
quando necessário. Concordo voluntariamente em participar deste estudo e poderei
retirar o meu consentimento a qualquer momento, antes ou durante o mesmo, sem
penalidades ou prejuízo ou perda de qualquer benefício que eu possa ter adquirido, ou
no meu atendimento neste Serviço.
Anexos
89
Assinatura do paciente/representante legal
Data / /
Assinatura da testemunha
Data / /
para casos de voluntários menores de 18 anos, analfabetos, semi-analfabetos ou portadores de deficiência auditiva ou visual.
Declaro que obtive de forma apropriada e voluntária o
Consentimento Livre e Esclarecido deste paciente ou
representante legal para a participação neste estudo.
Prof. Alfredo Gragnani Filho Data / /
Anexos
90
ANEXO 3
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
Este é um convite à participação em estudo de pesquisa experimental (grupo
“controle”).
1 – Título do projeto: “EXPRESSÃO GÊNICA DE RECEPTORES TOLL-LIKE
EM CULTIVO DE FIBROBLASTOS DÉRMICOS PRIMÁRIOS DE
PACIENTES ADULTOS COM QUEIMADURA.”
2 – Desenho do estudo e objetivo(s): “Essas informações estão sendo fornecidas para sua participação voluntária neste estudo, que tem como objetivo avaliar o que acontece após o
acidente da queimadura, pesquisando a quantidade de receptores Toll-Like, ou seja, proteínas
produzidas pelas células na área da queimadura que podem causar inflamação e que podem
piorar ou melhorar a cicatrização da queimadura. Essa avaliação será realizada nas células da sua pele normal, sem queimadura, que fica ao redor da lesão da queimadura e que durante o
procedimento operatório de limpeza do tecido morto (necrosado) da queimadura sai junto da
mesma, e que será enviada ao laboratório para cultivo
3 – Descrição dos procedimentos que serão realizados: na Cirurgia Plástica são retirados
fragmentos de pele quando existe flacidez ou excesso importante, como na Mamaplastia
redutora, abdominoplastia, dermolipectomia crural, ritidoplastia, entre outras, e esses
fragmentos são descartados, sem nenhum uso, e os mesmos serão enviados ao
laboratório de cultura de células da UNIFESP/EPM para que as células sejam isoladas e
possam ser usadas em experimentos.
4 – Relação dos procedimentos rotineiros e como serão realizados: nada da rotina de sua
cirurgia será mudado, somente que após sua permissão, o fragmento de pele que seria
desprezado, será encaminhado ao laboratório para isolamento das células.
5 – Descrição dos desconfortos e riscos esperados nos procedimentos do estudo:
nenhum desconforto fora do habitual aos pacientes que são submetidos à cirurgia na
unidade será acrescentado ao paciente; a cirurgia sempre é realizada sob anestesia geral
e com analgesia rotineira com opióide forte (morfina, fentanil) após a cirurgia.
6 – Benefícios para o participante: Não há benefício direto ao paciente no presente
estudo. Porém, a queimadura é um trauma complexo de difícil tratamento com grande
número de infecções e alta taxa de óbito. Assim, com a obtenção de novos
conhecimentos sobre mediadores inflamatórios que estão envolvidos na evolução da
queimadura, o estudo estará colaborando com todos os pacientes queimados no futuro
com as possíveis mudanças em protocolos se os dados mostrarem essa necessidade.
7 – Relação de procedimentos alternativos que possam ser vantajosos, pelos quais o
paciente pode optar: não existem, pois os procedimentos relacionados no estudo são
realizados de rotina, sem nenhuma mudança, somente que, a pele normal que sai junto
do tecido necrótico ou morto seria desprezada, e no estudo será coletada e enviada ao
laboratório.
Anexos
91
8 – Garantia de acesso: em qualquer etapa do estudo, você terá acesso aos profissionais
responsáveis pela pesquisa para esclarecimento de eventuais dúvidas. O principal
investigador é o Prof. Alfredo Gragnani Filho, que pode ser encontrado no endereço
Rua Napoleão de Barros, 715 – 4o andar – Telefone(s): 5576.4118. E-mail:
[email protected] Se você tiver alguma consideração ou dúvida sobre a ética da
pesquisa, entre em contato com o Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) – Rua Botucatu,
572 – 1º andar – cj 14, 5571-1062, FAX: 5539-7162 – E-mail: [email protected]
9 – É garantida a liberdade da retirada de consentimento a qualquer momento e deixar
de participar do estudo, sem qualquer prejuízo à continuidade de seu tratamento na
Instituição;
10 – Direito de confidencialidade – As informações obtidas serão analisadas em
conjunto com as de outros voluntários, não sendo divulgada a identificação de nenhum
paciente;
11 – Direito de ser mantido atualizado sobre os resultados parciais das pesquisas,
quando em estudos abertos, ou de resultados que sejam do conhecimento dos
pesquisadores;
12 – Despesas e compensações: não há despesas pessoais para o participante em
qualquer fase do estudo, incluindo exames e consultas. Também não há compensação
financeira relacionada à sua participação. Se existir qualquer despesa adicional, ela será
absorvida pelo orçamento da pesquisa.
13 – Em caso de dano pessoal, diretamente causado pelos procedimentos ou tratamentos
propostos neste estudo (nexo causal comprovado), o participante tem direito a
tratamento médico na Instituição, bem como às indenizações legalmente estabelecidas.
14 - Compromisso do pesquisador de utilizar os dados e o material coletado somente
para esta pesquisa.
Acredito ter sido suficientemente informado a respeito das informações que li ou que
foram lidas para mim, descrevendo o estudo: “EXPRESSÃO GÊNICA DE
RECEPTORES TOLL-LIKE EM CULTIVO DE FIBROBLASTOS DÉRMICOS
PRIMÁRIOS DE PACIENTES ADULTOS COM QUEIMADURA.”.
Eu discuti com o Prof. Alfredo Gragnani Filho, sobre a minha decisão em
participar nesse estudo. Ficaram claros para mim quais são os propósitos do estudo, os
procedimentos a serem realizados, seus desconfortos e riscos, as garantias de
confidencialidade e de esclarecimentos permanentes. Ficou claro também que minha
participação é isenta de despesas e que tenho garantia do acesso a tratamento hospitalar
quando necessário. Concordo voluntariamente em participar deste estudo e poderei
retirar o meu consentimento a qualquer momento, antes ou durante o mesmo, sem
penalidades ou prejuízo ou perda de qualquer benefício que eu possa ter adquirido, ou
no meu atendimento neste Serviço.
Assinatura do paciente/representante legal
Data / /
Assinatura da testemunha
Data / /
para casos de voluntários menores de 18 anos, analfabetos, semi-analfabetos ou portadores de deficiência auditiva ou visual.
Anexos
92
Declaro que obtive de forma apropriada e voluntária o Consentimento Livre e Esclarecido deste paciente ou representante legal para a participação neste estudo.
Prof. Alfredo Gragnani Filho Data / /
FONTES CONSULTADAS
Fontes Consultadas
94
Fontes Consultadas
BIREME. Centro Latinoamericano e do Caribe de Informação em Ciências
da Saúde. DeCS: descritores em ciências da saúde. Disponível em:
http://decs.bvs.br/.
