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5/7/2018 SDS - slidepdf.com

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SDS-PAGE

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Imagem de um SDS-PAGE. O marcador molecular é na faixa da esquerda

SDS-PAGE, de sódio dodecil sulfato de gel de poliacrilamida eletroforese , é umatécnica amplamente utilizada em bioquímica , ciência forense , genética e biologiamolecular para separar as proteínas de acordo com sua mobilidade eletroforética (umafunção do comprimento da cadeia polipeptídica ou peso molecular). SDS eletroforeseem gel de amostras que têm a seu cargo idêntico por unidade de massa devido à ligaçãode resultados SDS no fracionamento por tamanho.

Conteúdo

[hide]

y Um Procedimento o 1,1 a preparação do tecido o 1,2 Preparar gel de acrilamida o 1,3 Eletroforese o 1,4 Coloração

y 2 ingredientes químicos e seus papéis o 2,1 gel de empilhamento o 2,2 ingredientes químicos o 2,3 Químicos para processamento e visualização

y 3 Redução SDS-PAGE y 4 coloração prata y 5 sistemas tampão y 6 SDS eletroforese em gel de gradiente de proteínas y 7 Veja também y 8 Referências



y 9 Ligações externas

[ editar ] Procedimento

[ editar ] preparação do tecido

Amostras podem ser colhidas a partir de tecido todo ou de cultura de células. Namaioria dos casos, os tecidos sólidos são primeiro divididos mecanicamente usando umliquidificador (para maiores volumes de amostra), usando umhomogeneizador (volumes menores), por sonicador ou usando ciclismo de alta pressão. As células podemtambém ser arrombado por um dos métodos acima mecânica. No entanto, deve notar-seque as bactérias, vírus ou amostras ambientais pode ser a fonte de proteína e, assim,SDS-PAGE não se restringe a apenas estudos celulares.

Uma combinação de técnicas bioquímicas e mecânicas - incluindo vários tipos defiltragem e centrifugação - pode ser usado para separar os compartimentos celulares

diferentes e organelas .

A solução de proteínas a ser analisado é misturado comSDS , uma aniônica detergente que desnatura secundário e não-dissulfeto-linked estruturas terciárias, e aplica umacarga negativa para cada proteína na proporção de sua massa. Aquecimento dasamostras a pelo menos 60 graus C agita as moléculas, ajudando SDS para ligar.[1] [2] [3] [4]

Um corante de rastreamento pode ser adicionado à solução de proteína (de um tamanhomenor do que a proteína) para permitir que o experimentador para acompanhar o

progresso da solução de proteína através do gel durante a corrida eletroforética.

[ editar ] Preparando gel de acrilamida

Os géis geralmente consistem de acrilamida , bisacrylamide , SDS , e um tampão Tris-Cl com pH ajustado. A solução é desgaseificado sob vácuo para evitar bolhas de ar durante a polimerização. [5] persulfato de amônio e Temed são adicionados quando o gelestá pronto para ser polimerizada. O gel de separação ou de resolução é normalmente



mais básicos e tem um teor mais elevado do que o gel de poliacrilamida carregamento.[6]

Géis são polimerizados em um rodízio gel. Primeiro, o gel de separação é derramado e permitiu a polimerizar. Uma camada fina de próxima isopropanol é adicionado, fazendocom que o topo do gel de separação para formar uma superfície lisa. Em seguida, o gelde carregamento é derramado e um pente é colocado para criar os poços. Após a cargade gel é polimerizado o pente pode ser retirado eo gel está pronto para eletroforese.

[ editar ] Eletroforese

Primeiro, o anodo eo catodo buffers estão preparados. O buffer de anodo geralmentecontém Tris-Cl, água destilada deionizada e é ajustado para um pH mais alto do que o

buffer cátodo. O buffer de catodo contém SDS, Tris, tricine, e água destiladadeionizada. [7] [8]



O aparelho é configurado eletroforese com tampão cátodocobrindo o gel na câmara deeletrodo negativo, e buffer anodo na câmara inferior do eletrodo positivo. Em seguida,as proteínas desnaturadas amostra são adicionados à uma poços final do gel com uma

seringa ou pipeta. Finalmente, o aparelho é ligado a uma fonte de energia sob condiçõesapropriadas de execução para separar as bandas de proteínas.

Um campo elétrico é aplicado em todo o gel, fazendo com que as proteínas de carganegativa para migrar através do gel em direção ao eletrodo positivo (+) (anodo).Dependendo do seu tamanho, cada proteína vai passar de forma diferente através damatriz de gel: proteínas curta será mais fácil passar pela poros no gel, enquanto asmaiores terão mais dificuldade (que encontram mais resistência). Após um determinado

período de tempo (geralmente algumas horas, embora isso depende da voltagemaplicada através do gel; voltagens mais altas correr mais rápido, mas tendem a produzir um pouco mais pobres resolução), as proteínas diferencialmente terão migrado com

base em seu tamanho; proteínas menores serão ter viajado mais para baixo do gel,enquanto as maiores terão permaneceu mais perto do ponto deorigem. Portanto, as

proteínas podem ser separados cerca de acordo com o tamanho (e, portanto, o pesomolecular), certas glicoproteínas comportar anormalmente em gel de SDS.



[ editar ] Coloração

Dois SDS-PAGE em gel depois de uma corrida concluída

Após a eletroforese, o gel pode ser manchada (mais comumente comCoomassieBrilliant Blue R-250 ou mancha de prata ), permitindo a visualização das proteínasseparadas, ou ulteriormente tratados (por exemplo, Western blot ). Após a coloração,diferentes proteínas aparecerá como bandas distintasdentro do gel. É comum paraexecutar marcadores de peso molecular tamanhoda conhecida peso molecular em umafaixa separada no gel, a fim de calibrar o gel e determinar o aproximadade massamolecular de proteínas desconhecidas, comparando a distância percorrida em relação aomarcador. O gel é formado, na verdade, porque a solução de acrilamida contém uma

pequena quantidade, geralmente cerca de 1 parte em 35 de bisacrylamide, que podemformar ligações cruzadas entre duas moléculas de poliacrilamida. A proporção deacrilamida a bisacrylamide pode ser variado para fins especiais. A concentração deacrilamida do gel também podem ser variadas, geralmente na faixa de 5% a 25%. Géismenor percentagem são melhores para a resolução muito alta de proteínas de pesomolecular, enquanto percentuais bem mais elevados são necessários para resolver

proteínas menores. Determinar quanto das várias soluções para misturar juntos para

fazer géis de concentração de acrilamida em particular pode ser feitoon-line SDS-PAGE é geralmente a primeira escolha como um ensaio de pureza da proteína,devido à sua confiabilidade e facilidade. A presença de SDS e da etapa de desnaturaçãode proteínas faz com que sejam separados apenas com base no tamanho. Falsosnegativos e positivos são possíveis. Um contaminante comigrating pode aparecer comoa mesma banda como a proteína desejada. Este comigration também poderia causar uma

proteína para ser executado em uma posição diferente ou não ser capaz de penetrar ogel. É por isso que é importante para manchar o gel inteiro, incluindo a seção deempilhamento. Coomassie Brilliant Blue também se ligam com menos afinidade comglicoproteínas e proteínas fibrosas, o que interfere com a quantificação.

[ editar ] ingredientes químicos e seus papéis

Gel de poliacrilamida (PAG) havia sido conhecido como um meio potencial para aincorporação de corte de tecidos, já em 1964. Dois grupos independentes, Davis eRaymond, PAG empregados em eletroforese em 1959. [9] [10] Ele possui váriascaracterísticas desejáveis eletroforeticamente que fazem dele um médio versátil. PAGE separa as moléculas de proteína de acordo com o tamanho e carga. É um gel sintético,termo-estável, transparente, forte, relativamente quimicamente inerte, pode ser

preparada com uma ampla gama de tamanhos de poros médio. [11] O tamanho dos poros



de um gel é determinada por dois fatores, a quantidade total de acrilamida presente (% T) (T = concentração de monômero de acrilamida bisacrylamide total) ea quantidade decross-linker (% C) (C = concentração de Agente de crosslinking). Tamanho dos porosdiminui com o aumento da T%, com cross-linking, C 5% dá o menor tamanho de poros.Qualquer aumento ou diminuição no C% aumenta o tamanho dos poros, como otamanho dos poros em relação ao% C é uma função parabólica com vértice como C. 5%

Esta parece ser por causa da agregação não homogênea de fios no gel.

Este material gel também pode suportar a alta tensão gradientes, viável para a coloraçãode vários e procedimentos de descoloração, e pode ser digerida para extrair fraçõesseparadas ou secas para autoradiografia e gravação permanente. Eletroforese DISCutiliza géis de diferentes tamanhos de poros. [12] [13] O DISC nome era derivado dodescontinuidades na matriz eletroforética e coincidentemente da forma discóide daszonas separadas de íons. Há duas camadas de gel, ou seja, o empilhamento ou gelespaçador, e resolver ou separar gel.

Eletrônica de transmissão de imagem microscópica de um gel de poliacrilamida. Um gelde poliacrilamida é um labirinto de túneis, o tamanho dos poros é determinada pelaquantidade total de presentes monômero (% T) ea quantidade de cross-linker (C%).

[ editar ] gel de empilhamento

O gel de empilhamento é um PAG poros grandes (4% T). Este gel é preparado comTris / HCl tampão pH 6,8 de cerca de 2 unidades de pH mais baixo do que o tampão deeletroforese ( Tris / glicina ). Estas condições proporcionam um ambiente paraKohlrausch reações determinação de condutividade molar , como resultado, SDS-revestido proteínas estão concentrados para várias vezes e uma zona fina de partida daordem de 19 mM é alcançado em poucos minutos. Este gel é lançada sobre o gel deresolução. A altura da região de gel de empilhamento é sempre mantido mais que odobro da altura e do volume da amostra a ser aplicada. Isto é baseado emisotachophoresis .



[ edi ] i edientes quí i s

y Tris (tris (hidróxi metil ) aminometano) (C 4 H 11 NO 3; mW: 121,14). El t si usada como um amor t cedor, pois é uma subst cia i cua para amaior ia das proteí as. Seu pKa é de 8,3 a 20 ° C, tornando-se um buffer muitosatisfat r ia na fai a de pH de cerca de 7-9.

y Gli ina (ácido acético Amino) (C 2 H 5 NO 2; mW: 75,07). Gl cine tem sidoutili ado como fonte de trailing ion ion ou lento porque o seu pKa é 9,69 eamobilidade dos glicinato são tais que a mobilidade efecti a pode ser def inido emum valor infer ior ao do mais lento proteínas conhecidas da net carga negativa nafai a de pH. O pH mínimo deste intervalo é de aproximadamente 8.0.

y Acrilamida (C 3 H NO 5; mW: 71,08). É um pó branco cr istalino. Enquantodissolver em água, auto polimer i ação de acr ilamida ocorre. É um processolento espont nea pela qual as moléculas se juntam acr ilamida por cabeça emforma de cauda. Mas, em presença de radicais livres gerando sistema, acr ilamidamonômeros são ativadas em um estado livre-radical. Estes monômeros ativados

polimer i a rapidamente e formam longas cadeias de polímeros . Este ti po dereação é conhecida como vinil de polimer i ação de adição . Uma solução destascadeias de polímeros torna-se viscoso, mas não formam um gel, porque ascadeias simplesmente desli am uns sobre os outros. Formação de gel requer ligar vár ias cadeias juntos. A acr ilamida é uma neurotoxina . É também essencial

para armazenar acr ilamida em um lugar fresco e escuro e seco para reduzir autopol

mer isation e hidrólise .y Bisacrylamide ( N, N'-Methylenebisacrylamide ) (C 7 H 10 N 2 O 2; mW:

154,17). Bisacrylamide é o mais freqüentemente usados agente reticulação paragéis de acr ilamida poly. Quimicamente é o pensamento de ter duas moléculas deacr ilamida-cabeça acoplada a cabeça em suas extremidades não-reativo.

y Dodecilsul ato de sódio (SDS) (C 12 H 25 NaO 4 S; mW: 288,38). SDS é oagente dissociar mais comum usado para desnaturar proteínas nativas

individuais poli peptídeos . Quando uma mistura de proteínas é aquecido a 100 °C na presença de SDS, o detergente envolve a espinha dorsal poli peptídica.Liga-se a poli peptídeos em uma proporção de peso constante de 1,4 g / g de

poli peptídeo. Neste processo, as acusações de poli peptídeos intr ínseca torna-seinsignif icante quando comparado com as cargas negativas contr i buiu por SDS.Assim, após o tratamento torna-se poli peptídeos uma vara como a estrutura que

possui uma densidade de carga uniforme, que é carga líquida negativa mesmo por unidade de compr imento. Mobilidades destas proteínas será uma funçãolinear dos logar itmos de seus pesos moleculares.

Sem SDS, as proteínas diferentes, com pesos moleculares semelhantes ser iamigrar de maneira diferente devido a diferenças na relação carga massa, já que

cada proteína tem um ponto isoelétr ico e peso molecular par ticular, a suaestrutura pr imár ia . Isto é conhecido como PAGE nativo . Adicionando SDSresolve este problema, uma vez que se liga e se desdobra a proteína, dando umacarga negativa uniforme per to ao longo do compr imento do poli peptídeo.

y Persul ato de amônio (APS) (N 2 H 2 O 8 S 8; mW: 228,2). APS é um iniciador para a formação de gel.

y Temed (N, N, N ', N'-tetrametiletilenodiamina) (C 6 H 16 N 2; mW: 116,21).Polimer ização química do gel de acr ilamida é utilizada para SDS-PAGE. Ele



pode ser iniciado por persulfato de amônio e amina quaternár ia , N, N, N ', N'tetrametiletilenodiamina (Temed). A taxa de polimer ização e as propr iedadesdo gel resultante depende da concentração de APS e Temed. Aumentar aquantidade de APS e os resultados Temed em uma diminuição da duração médiacadeia polimér ica, um aumento na turbidez gel e uma diminuição da elasticidadedo gel. Diminuindo a quantidade de iniciadores mostra o efeito inverso. O

menor catalítico concentrações que permitirá polimer ização no per íodo ideal detempo deve ser usado. APS e Temed são utilizados, aproximadamente, emconcentrações equimolares na faixa de 1 a 10 mM.

[ editar ] Produtos quí micos para o processamento e visualização

Os seguintes produtos químicos são usados para processamento do gel de proteínas e asamostras visualizadas em que:

y Azul de bromofenol (BPB) (3 ', 3 ", 5', 5" tetrabromophenolsulfonphthalein) (C

19 H 10 O 5 Br 4 S; mW: 669,99). BPB é o corante marcador universal. Proteínase ácidos nucléicos são na sua maior ia incolor. Quando são submetidos àeletroforese, é impor tante para parar o processo antes de executar fora do gel.BPB é o corante mais comumente empregada de rastreamento, porque é viável em pH alcalino e neutro, é uma molécula pequena, é ionizável e é carregadanegativamente acima de pH 4,6 e, por tanto, se move em direção ao ânodo .Sendo uma pequena molécula que se move à frente da maior ia das proteínas eácidos nucléicos. Ao atingir o anódica f inal da eletroforese meio de eletroforeseestá parado. Ele pode se ligar com as proteínas fracamente e dar cor azul.

y Glicerol (C 3 H 8 O 3; mW: 92,09). É um conservante e um agente de pesagem.Adição de glicerol (20-30 ou 50%) é frequentemente recomendada para oarmazenamento de enzimas. Glicerol mantém a solução de proteína a umatemperatura muito baixa, sem congelamento. Também a juda a pesar a amostra

nos poços sem ser distr i buídos durante o carregamento.y Coomassie Brilliant Blue R-250 (CBB) (C 45 H 44 N 3 NaO 7 S 2; mW:

825,97). CBB é a proteína mais popular mancha. É um corante aniônico, queliga a proteínas não-especif icamente. A estrutura da CBB é predominantementenão-polar. Então, é normalmente usado (0,025%) em solução de metanol (40%)e ácido acético (7%). Proteínas no gel são f ixos pelo ácido acético e,simultaneamente, manchado. O excesso de corante incorporado no gel pode ser removido por descoloração com a mesma solução, mas sem o corante. As

proteínas são detectados como faixas azuis sobre um fundo claro. Como SDStambém está aniônicos, pode interfer ir com o processo de coloração. Por tanto,grande volume de solução de coloração é recomendada, aproximadamente dezvezes o volume do gel.

y n-butanol (C 4 H 10 O; mW: 74,12). butanol saturado de água é usada comouma solução de sobreposição no gel de resolução.y Ditiotreitol (DTT; C 4 H 10 O 2 S 2; mW: 154,25). TDT é um agente redutor

usado para interromper pontes dissulfeto para garantir a proteína é totalmentedesnaturado antes de carregar no gel, garantindo a proteína funciona de maneirauniforme. Tradicionalmente, o tóxico e menos potente 2-mercaptoetanol foi usado.

[ editar ] Redução da SDS-PAGE



Além da adição de SDS, as proteínas podem, opcionalmente, ser brevemente aquecida para per to de ebulição na presença de um agente redutor, como ditiotreitol (DTT) outradicionalmente 2-mercaptoetanol (beta-mercaptoethanol/BME) , o que mais desnaturaas proteínas, reduzindo dissulfeto ligações, superando assim algumas formas deenovelamento de proteínas super ior, e quebrando a estrutura da proteína quaternár ia(subunidades oligomér ica). Isto é conhecido como a redução da SDS-PAGE, e é ma is

comumente usado. Não-redução da SDS-PAGE (nenhum agente de ebulição e não aredução) pode ser usado quando a estrutura nativa é impor tante para análise poster ior (por exemplo, atividade enzimática, mostrado pelo uso de zimogramas ). Por exemplo,q uantitative p reparadora n ative c p ontinuous oly um crylamide g el lectrophoresis e (QPNC-PAGE ) é um novo método para a separação de nativos metaloproteínas emmatr izes biológicas complexas.

[ editar ] coloração prata



Géis de poliacrilamida prata manchada SDS

No século 14 a coloração pela prata técnica foi desenvolvida para colorir a superfície dovidro. Tem sido amplamente utilizado para este fim desde o século 16. A cor produzida

pela manchas de prata início variou entre amarelo claro e um laranja-avermelhado.

Camillo Golgi aperfeiçoou a coloração pela prata para o estudo dosistema nervoso .Golgi do método manchas um número limitado de células ao acaso em sua totalidade.[14] A mecanismo químico exato pelo qual isso acontece ainda é largamentedesconhecida. [15] coloração de prata foi introduzido por Kerenyi e Gallyas como um

procedimento sensível para detectar pequenas quantidades de proteínas emgéis . [16] Atécnica foi estendida para o estudo da diversidade biológica outros macromoléculas queforam separadas em uma variedade de suportes. [17] Classical Coomassie Brilliant Blue coloração geralmente pode detectar a 50 ng banda de proteína, coloração de prataaumenta a sensibilidade tipicamente 50 vezes. Muitas variáveis podem influenciar a cor e intensidade de cada proteína tem suas características próprias coloração;. limpar vidros, reagentes e água pura da mais alta pureza são os pontos chave para a coloraçãode sucesso [18]

[ editar ] Buffer sistemas

Migração postulada de proteínas em um sistema de gel Laemmli A: gel deempilhamento, B: Solução de gel, o: aplicação de exemplo c: descontinuidades no

buffer e matriz eletroforética

Separações mais proteínas são realizadas usando um "descontínuo" buffer de sistemaque aumenta significativamente a nitidez das bandas dentro do gel. Durante aeletroforese em gel de um sistema descontínuo, um gradiente de íons é formado na faseinicial de eletroforese que faz com que todas as proteínas para se concentrar em umaúnica banda afiada. Isso ocorre em uma região do gel que tem poros maiores para que a



matriz de gel não retardar a migração durante a focagem ou "empilhamento" de eventos.Íons negativos do buffer no tanque e depois "fugir" da SDS-cobertas de proteína "pilha"e eliminar o gradiente de íons, para que posteriormente as proteínas separadas pela açãode peneiramento na parte inferior, "resolver" região do gel.

Muitas pessoas continuam a usar um tris-glicina ou " Laemmli "sistema de

tamponamento que as pilhas em um pH de 6,8 e resolve em um pH de ~ 8,3-9,0. Estes pHs promover dissulfeto de formação da ligação entre cisteína resíduos nas proteínas,especialmente quando eles estão presentes em altas concentrações porque o pKa dacisteína gamas 8-9 e porque agente redutor presente no tampão de carregamento não co-migram com as proteínas. Recentes avanços na tecnologia de buffer aliviar este

problema, resolvendo as proteínas em um pH muito abaixo do pKa da cisteína (por exemplo, bis-tris , pH 6,5) e incluem agentes redutores (por exemplo, bissulfito desódio) que se movem na frente do gel de proteínas para manter um ambiente redutor.Um benefício adicional do uso de buffers com pHs mais baixos é que o gel deacrilamida é mais estável para que o gel pode ser armazenado porlongos períodos detempo antes de usar. [19] [20]

[ editar ] SDS eletroforese em gel de gradiente de

proteínas

Migração de proteínas em géis SDS das concentrações de acrilamidavariadas (% T). Amigração de nove proteínas variando de 94kDa a 14,4 kDa é mostrado. Empilhar edesempilhar ocorre continuamente no gel, para cada proteína em um gel deconcentração diferente. A linha pontilhada indica a descontinuidade na Gly ° / Cl ¯ fronteira em movimento. proteínas entre o eletrólito líder rápido eo eletrólito lento nofinal não são diluídas por difusão .

Como a voltagem é aplicada, os ânions (as moléculas da amostra carregadanegativamente) migram em direção ao eletrodo positivo (ânodo) na câmara baixa, o íoné líder Cl ° (alta mobilidade e alta concentração); glicinato é o íon à direita (baixamobilidade e baixa concentração). SDS-proteína partículas não migrar livremente nafronteira entre o ° Cl do buffer de gel eo Gly ° do tampão cátodo. Friedrich Kohlrausch descobriu que a lei de Ohm também se aplica aos dissolvidoeletrólitos . Por causa daqueda de tensão entre o Cl-e-Glycine buffers, as proteínas são compactados(empilhados) em camadas finas micrômetro. [21] A fronteira se move através de umgradiente de poros ea pilha de proteína gradualmente dispersa devido a um aumento daresistência de atrito do gel matriz. Empilhar e desempilhar ocorre continuamente no gelde gradiente, para cada proteína em uma posição diferente. Para uma proteína completadesempilhar a concentração em gel de poliacrilamida-deve ser superior a 16% T. O



sistema de dois-gel de "Laemmli" é um gel de gradiente simples. A descontinuidade pHdos buffers não é signif icativa para a qualidade de separação, e um "empilhamento gel" com um pH diferente, não é necessár io.

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