Selaginella convoluta (Arn.) Spring uma abordagem

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

DOUTORADO

Pós-Graduação em Desenvolvimento e Inovação Tecnológica em Medicamentos

Selaginella convoluta (Arn.) Spring:

uma abordagem fitoquímica aliada a

estudos ômicos

FERNANDA PRISCILA SANTOS REGINALDO

Natal/RN, 2021

Selaginella convoluta (Arn.) Spring:

uma abordagem fitoquímica aliada a estudos

ômicos

Tese apresentada por Fernanda Priscila Santos Reginaldo para obtenção

do GRAU DE DOUTOR em Desenvolvimento e Inovação Tecnológica em

Medicamentos

Departamento de Farmácia

Universidade Federal do Rio Grande do Norte

Orientador (a): Prof. Dr. Raquel Brandt Giordani

Co-orientador: Prof. Dr. Alberto José Cavalheiro

Co-orientador: Prof. Dr. Túlio Flávio Accioly de Lima e Moura

Natal/RN, 2021

“Para ser grande, sê inteiro: nada teu exagera ou exclui.

Sê todo em cada coisa. Põe quanto és no mínimo que fazes”.

Fernando Pessoa

Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Farmacognosia da Faculdade de

Farmácia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte. As análises de metaboloma

foram desenvolvidas nos laboratórios do NuBBE (Núcleo de Bioensaios, Biossíntese e

Ecofisiologia de Produtos Naturais) na Universidade Estadual Paulista (Unesp -

Araraquara, SP). As análises de proteoma foram desenvolvidas em colaboração com o

Laboratório de Bioquímica e Química de Proteínas da Universidade de Brasília (UnB).

Um estágio doutoral na Universidade de Granada, Espanha com enfoque em

desenvolvimento de sistemas farmacêuticos baseados em argilas para otimização da

eficácia de moléculas bioativas foi realizado.

A bolsa de estudos CAPES contemplou todo o período de desenvolvimento deste trabalho.

AGRADECIMENTOS

A CAPES pela bolsa de estudos;

Ao Programa de Pós-graduação em Desenvolvimento e Inovação Tecnológica em

Medicamentos pela oportunidade de formação de qualidade.

A Pro-Reitoria de pesquisa ‒ UFRN pelo auxílio financeiro que possibilitou meu

estágio doutoral no exterior.

A minha orientadora, Prof. Dr. Raquel Brandt Giordani, agradeço a confiança e

as oportunidades dadas, as quais me proporcionaram um grande crescimento profissional.

Muito obrigada por sempre nos ensinar com seu exemplo de diplomacia e

profissionalismo.

Ao Prof. Dr. Alberto José Cavalheiro pela orientação durante meu estágio doutoral

no NuBBE – Unesp; O mentor que mudou meu olhar sobre a ciência, que me orientou e

tanto me ensinou pacientemente, contribuindo imensamente para o meu crescimento

profissional. Muito obrigada.

Aos técnicos do NuBBE – João Bronzel, Juliana Rodrigues e Nivaldo Boralle por

toda paciência, disponibilidade e ajuda em cada análise.

A todos os colegas do NuBBE pela troca de experiência e os divertidos cafés da

tarde que nos renderam muito insights sobre Ciência.

A todos os colaboradores desta tese: Prof. Dr. Ian Castro-Gamboa, Dr. Rafael

Freire, Prof. Dr. Fernando Hallwass, Prof. Dr. Arthur Germano Fett-Neto, Prof. Dr.

Marcelo Valle de Sousa, Prof. Dr. Paulo Costa Carvalho, Marlon Dias Mariano Santos e

Euzébio Guimarães.

A Prof. Dr. Fernanda Nervo Raffin por toda paciência e orientação no

desenvolvimento de sistemas farmacêuticos; tenho muita admiração; para mim é um

grande exemplo de professora, pesquisadora, humildade e simplicidade; muito obrigada

por tudo.

Ao Prof. Dr. Cesar Viseras Iborra por permitir minha estada em seu laboratório

na Universidade de Granada, Espanha e aprender um pouco sobre o desenvolvimento de

sistemas farmacêuticas baseados em argilas; a todo seu grupo de pesquisa ‒ especialmente

agradeço: Rita, Ana e Fátima.

Ao Prof. Túlio Moura pela co-orientação no desenvolvimento de sistemas

farmacêuticos.

A todos os professores da Faculdade de Farmácia da UFRN que participaram da

construção da minha vida acadêmica. Muito obrigada.

A todos os co-autores das publicações relacionadas a esta tese, pela dedicação e

parceria. Muito obrigada.

A Paula Bueno pela amizade, troca de experiências e colaboração nas análises de

quimiometria.

A Estela Lourenço pela amizade e colaboração nas análises de potencial bioativo

in-silico.

A Isabelly Costa pela amizade, paciência, companheirismo e parceria nos

experimentos.

A Letícia Gondim pela tão linda amizade e troca de experiências.

Aos amigos que o PNBio me concedeu: Bárbara, Themístocles, Emerson, Larissa,

Ariane e Ivan. Muito obrigada por tudo.

A todos os colegas do PNBio.

A Bruno Ekawa pelo carinho, companheirismo, apoio e incentivo. Muito

obrigada.

A minha família por todo carinho e incentivo – especialmente agradeço: aos meus

pais e também a minha irmã Silvania, a quem tanto admiro como ser humano e

profissional; exemplo de perseverança, inteligência e coragem. Muito obrigada por

acreditar em mim, sempre me incentivar e ajudar na construção da minha carreira

acadêmica. Obrigada por tudo.

RESUMO

O gênero Selaginella, o maior gênero de Lycopodiophyta compreende cerca de

700-750 espécies, das quais várias espécies são reconhecidas por suas atividades

farmacológicas. Nosso overview sobre os aspectos fitoquímico e bioativos apontaram que

futuros estudos devem fornecer dados para melhor explorar o potencial biológico das

moléculas bioativas de Selaginellaceae, desenvolver estudos sobre a toxicidade e, por

último, concentrar esforços em elucidar mecanismos de ação para propriedades

biológicas já relatadas. A família conseguiu sobreviver a múltiplas pressões bióticas e

abióticas durante os últimos 400 milhões de anos. Diversas espécies do gênero

Selaginella adquiriram um interessante traço evolutivo: tolerância à dessecação (TD).

Selaginella convoluta é uma planta tolerante à dessecação nativa do semiárido brasileiro.

Plantas TD possuem mecanismos de resistência à seca altamente eficazes que permitem

sua sobrevivência em condições extremas. Neste estudo, investigamos S. convoluta em

dois estados de hidratação: (i) planta no estado desidratado ‒ conforme encontrada em

campo na Caatinga; e (ii) planta no estado hidratado ‒ reidratação adquirida em

laboratório. Os dados de proteoma apontaram que partes aéreas (PA) e raízes (RZ)

parecem ter diferentes estratégias em resposta aos diferentes estados de hidratação; no

entanto, PA e RZ parecem ter uma resposta bem orquestrada para regular a tolerância à

dessecação. A presença de enzimas envolvidas na biossíntese de metabólitos

especializados como fenólicos, terpenoides, bem como metabólitos contendo

nitrogênio/enxofre foram apontadas através da análise do proteoma. O perfil metabólico

baseado em RMN apontou a presença de metabólitos como carboidratos e fenólicos

relacionados aos eventos de tolerância à dessecação, corroborando com os dados de

proteoma. Como um achado inédito, o alcaloide anotado mais importante foi a anabasina.

Os metabólitos especializados, flavonoides, biflavonoides e selaginelinas foram os

principais derivados fenólicos anotados. Assim, realizamos uma análise de LC-MS/MS

combinada com a abordagem de molecular networking (MN) para avaliar a

quimiodiversidade de flavonoides e selaginelinas. Até o momento, este foi o primeiro

estudo sobre Selaginella spp. usando a abordagem de MN que mostrou não somente uma

proposta do padrão de fragmentação para todas as selaginelinas anotadas, mas também a

predição de novas selaginelinas com base nos dados espectrais MS/MS. Diversos

potenciais biológicos de selaginelinas de Selaginella spp. foram relatados. As

selaginelinas são produzidas naturalmente em níveis baixos na planta, o que torna a

extração química desses metabólitos difícil e demorada. Nesse contexto, o metil

jasmonato (MeJA) tem sido utilizado para induzir metabólitos especializados de interesse

farmacêutico. Os nossos dados apontaram que o MeJA pode ser uma interessante

alternativa para induzir o acúmulo de selaginelinas em S. convoluta. Ainda, os estudos in

silico apontaram potenciais alvos biológicos para as selaginelinas: antineurodegenerativo,

antiproliferativo e antiparasitário. A abordagem de MN permitiu a predição de sete

selaginelinas até então não descritas na literatura, as quais contribuem como uma nova

informação química para esta espécie.

Palavras-chave: Selaginelinas. Anabasina. Proteoma. Metaboloma. Tolerância à

dessecação. Metiljasmonato.

ABSTRACT

The genus Selaginella, the largest genus of Lycopodiophyta comprise about 700-

750 species, which several species are recognized for their pharmacological activities.

Our overview of the phytochemical and bioactive aspects pointed out that future studies

should afford valuable new data on better explore the biological potential of the flavonoid

amentoflavone and their derivatives as chemical bioactive entities; develop studies about

toxicity and, finally, concentrate efforts on elucidate mechanisms of action for biological

properties already reported. The family Selaginellaceae managed to survive the many

biotic and abiotic pressures during the last 400 million years. Several species of the genus

Selaginella have been acquired an interesting evolutionary trait: desiccation tolerance

(DT). Selaginella convoluta is a desiccation-tolerant plant native from Brazilian semiarid.

DT plants have highly effective drought-resistance mechanisms that allow their survival

under extreme conditions. In this study we investigate Selaginella convoluta in two

hydration states: (i) dehydrated – harvested in the natural semiarid environment; and (ii)

hydrated – after acclimatization in lab. The proteome dataset pointed out that shoots and

roots appear to have different strategies in response to different hydration states; however,

appear to have a well-orchestrated response to regulate desiccation tolerance. The

presence of enzymes involved in the biosynthesis of specialized metabolites such as

phenolic, terpenoid, as well as metabolites containing nitrogen/sulfur were identified

through proteomic analysis. The NMR-based metabolite profiling showed the presence

of metabolites such as carbohydrates and phenolic derivatives related to desiccation

tolerance events, corroborating with the proteome data. As an unprecedented finding, the

most important annotated alkaloid was anabasine. The specialized metabolites,

flavonoids, bioflavonoids and selaginellins were the main phenolic derivatives annotated.

Thus, we performed a LC-MS/MS analysis combined with the molecular networking

(MN) approach to assess the chemodiversity of flavonoids and selaginellins. So far, this

has been the first study on Selaginella spp. using the MN approach that showed not only

a proposal of the fragmentation pattern for all the selaginellins annotated, but also the

prediction of new selaginellins based on the MS/MS spectral data. Several biological

potentials of selaginellin from Selaginella spp. have been reported. Selaginellins are

naturally produced at low levels in the plant, which makes the chemical extraction of

these metabolites difficult and time consuming. In this context, methyl jasmonate (MeJA)

has been used to induce specialized metabolites of pharmaceutical interest. Our data

showed that MeJA can be an interesting alternative to induce the accumulation of

selaginellins in S. convoluta. In addition, the in-silico studies pointed out interesting

bioactive potentials for selaginellins: antineurodegenerative, antiproliferative and

antiparasitic. The MN approach allowed the prediction of seven unprecedent

selaginellins, which contribute as a new chemical information for this species.

Keywords: Selaginellins. Anabasine. Proteoma. Metaboloma. Desiccation tolerance.

Metiljasmonato.

ÍNDICE DE FIGURAS

I.INTRODUÇÃO

Figura 1 Representação esquemática dos eventos orquestrados no mecanismo de

tolerância à dessecação.................................................................................................. 22

Figura 2 Representação esquemática de respostas à tolerância à dessecação

compartilhadas e espécie-específica baseado nos estudos de proteoma e transcriptoma de

espécies de Selaginella...................................................................................................... 26

CAPÍTULO 2

Figure 1. (A) Plant in the field found in the dehydrated state; (B) Plant acclimated in the

laboratory fully rehydrated. (C) Venn diagram of annotated proteins of S. convoluta

showing the distribution of proteins related to dehydrated /hydrated states for each part of

the plant; SD: Shoots at dehydrated state; SH: Shoots at hydrated state; RD: roots at

dehydrated state; RH: roots at hydrated state. (D) Proteins with higher abundance in the

dehydrated state compared with the hydrated state. * Protein characterized by Blastp

performed in NCBI platform - Supplementary material. (E) Analysis of a functional

network by STRING. Protein-protein interactions presented by differentially abundant

proteins of S. convoluta. EFJ07076-SD: photosystem I reaction center subunit II,

chloroplastic-like; EFJ22479-RD: heat shock cognate 70 kDa protein 2; EFJ30779-SD:

heat shock cognate 70 kDa protein 2; EFJ09686-RD: 14-3-3-like protein 16R;

EFJ30676-SD: elongation factor 1-alpha; EFJ14934-RD: 14-3-3-like protein GF14 nu

isoform X2; EFJ22122-SD: actin; MDH1-1-SH: malate dehydrogenase, glyoxysomal;

EFJ35703-SD: ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase activase 1, chloroplastic

isoform X3; EFJ38136-SD: peroxisomal (S)-2-hydroxy-acid oxidase; EFJ23777- RD:

26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 7 homolog A; EFJ23890-RD: Bet_v_1

domain containing protein; EFJ17357-SD: Tubulin alpha chain; EFJ16343-SH:

Glutathione S-transferase U 19; EFJ16371-SH: Aldedh domain-containing protein.

Color text reflects the differentially abundant protein. Green: up-regulated; Red: down-

regulated.…………………………………………………………………………………………………………………… 5

CAPÍTULO 3

Figure 1. The Selaginella convoluta annotated metabolites with spectral similarity among

50-100% were assembled in schematic colors showing its distribution at

dehydrated/hydrated states for each part of the plant …….………………………………………………. 5

CAPÍTULO 4

Figure 1. Representative images of S. convoluta………………………………………114

Figure 2 a Cluster MN 1: Representation of MN after blank removal showing a

selaginellin cluster in S. convoluta extract. b Original selaginellins based on MS/MS

spectra.............................................................................................................................. 118

Figure 3. Biflavonoids clusters: Representation of MN after blank removal showing

biflavonoids clusters in S. convoluta extract…..............................................................120

Figure 4. Schematic Venn diagram showing the annotated metabolites by LC ‑ MS/MS

of S. convoluta related to dehydrated/hydrated states for each part of plant………………….121

CAPÍTULO 5

Figure 1. (A) Selaginellins Cluster: Representation of molecular networking after blank

removal showing the selaginellins molecular family in S. convoluta extract. Original

selaginellins based on MS/MS spectra…….…………………………………………………………………… 9

Figure 2. Heatmaps on the methanolic extract of Selaginella convoluta MeJA-treated vs

control: (A) Shoots: MeJA 50 µM; MeJA 100 µM; (B) Roots: MeJA 50 µM; MeJA

100µM…………………………………………………………………………………. 12

DISCUSSÃO GERAL

Figura 1 Resumo dos mais importantes aspectos descritos na literatura sobre uso popular,

fitoquímica e farmacologia de Selaginellaceae ................................................................ 66

Figura 2 Representação esquemática de respostas compartilhadas e específicas de

espécies de Selaginella estudadas pela abordagem de proteoma. ................................... 68

Figura 3 (A): Diagrama de venn mostrando a distribuição dos metabólitos anotados por

RMN de Selaginella convoluta; (B): anabasina – alcaloide isolado. ................................70

Figura 4 (A): Molecular networking dos dados de EM/EM obtidos no modo positivo de

ionização para Selaginella convoluta mostrando as principais famílias moleculares

associadas ao estresse hídrico; (B): Diagrama de Venn com o total de íons observados

entre as amostras. Self-loops foram excluídos. ................................................................. 71

ÍNDICE DE TABELAS E QUADROS

INTRODUÇÃO

Quadro 1 Comparação entre as técnicas de espectroscopia de ressonância magnética nuclear

(RMN) e a espectrometria de massa (EM) no contexto das análises de metaboloma.................37

CAPÍTULO 1 Table 1. Metabolites from Selaginella...................................................................... 249

Table 2. Metabolites from Selaginella........................................................................ 250

Table 3. Pharmacological potential of Selaginella.................................................... 262

CAPÍTULO 2

Table 1. Comparison of the differentially abundant proteins in S. convoluta with

experimental proteomic datasets of other desiccation tolerant Selaginella species……8

CAPÍTULO 4

Table 1. Metabolites detected in the methanolic extracts of S. convoluta by LC ‑ ESI ‑ TOF ‑ MS/MS. .............................................................................................................115

CAPÍTULO 5 Table 1 Metabolites of Selaginella convoluta affected by MeJA treatment analyzed by

LC-ESI-TOF-MS/MS and Their Fold-Change Analysis.............................................. 16

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

TD Tolerância à dessecação

RMN Ressonância Magnética Nuclear

CL Cromatografia líquida

EM Espectrometria de Massas

EM/EM Espectrometria de Massas/ Espectrometria de Massas

GNPS Global Natural Products Social Molecular Networking

MN Molecular Networking

SUMÁRIO

I.INTRODUÇÃO ...................................................................................................................... 20

I.1 Selaginellaceae e tolerância à dessecação ........................................................................ 22

I.2 Estudos ômicos de espécies tolerantes à dessecação ‒ Selaginellaceae ........................... 25

I.2.1 Análises de transcriptoma ........................................................................................... 26

I.2.2 Análises de proteoma .................................................................................................. 27

I.2.3 Análises de metaboloma ............................................................................................. 29

I.2.4 O que os estudos utilizando abordagens ômicas sobre as espécies de Selaginella

tolerantes à dessecação podem nos ensinar até agora? ..................................................... 31

I.3 Estudos ômicos e sua relevância para fitoquímica ............................................................ 32

I.4 Proteoma ............................................................................................................................ 33

I.5 Metaboloma ....................................................................................................................... 35

I.5.1 Ressonância magnética nuclear.................................................................................. 36

I.5.2.1 Global Natural Products Social Molecular Networking ‒ GNPS: Classical Molecular

Networking .......................................................................................................................... 38

I.5.3 Comparação das técnicas de RMN e EM sob o prisma das análises de metaboloma 39

II.OBJETIVOS .......................................................................................................................... 43

III.ARTIGOS CIENTÍFICOS ................................................................................................. 46

III.I CAPÍTULO 1: Fernanda P. Santos Reginaldo; Isabelly C. Matos Costa; Raquel B.

Giordani. Selaginellaceae: traditional use, phytochemistry and pharmacology. Boletín

Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas 19:3 (2020). ................ 48

III.II CAPÍTULO 2: Fernanda P. Santos Reginaldo, Luiz F. Rodrigues de Souza, Marlon D.

Mariano dos Santos, Daisy S. Chacon, Taffarel M. Torres, Ivanice B. Silva, Alan A. Roque,

José Angelo S. Zuanazzi, Carlos André O. Ricart, Mariana S. Castro, Paulo C. Carvalho,

Wagner Fontes, Marcelo V. Sousa, Arthur G. Fett-Neto, Raquel B. Giordani. Proteomic

analysis of Selaginella convoluta: can the organ-specific approach provide insights into the

orchestrated events in the desiccation tolerance? .................................................................... 51

III.III CAPÍTULO 3: Fernanda P. Santos Reginaldo, Rafael Freire, Isabelly C. M. Costa,

Ivanice Bezerra da Silva, Alan de Araújo Roque, Fernando Hallwass, Ian Castro-Gamboa,

Arthur Germano Fett-Neto, Alberto J. Cavalheiro, Raquel B. Giordani. NMR-based metabolite

profiling of Selaginella convoluta in different hydration states and the unprecedented

occurrence of anabasine in lycophytes. Phytochemistry Letters. 43: 75-79. 2021. ................ 54

III.IV CAPÍTULO 4: Fernanda P. Santos Reginaldo, Paula C. Pires Bueno, Isabelly C. Matos

Costa, Alan A. Roque, Arthur G. Fett-Neto5, Alberto J. Cavalheiro, Raquel B. Giordani.

Molecular networking discloses the chemical diversity of flavonoids and selaginellins in

Selaginella convoluta. Planta Medica 87:113–123. 2020 ....................................................... 57

III.V CAPÍTULO 5: Fernanda Priscila Santos Reginaldo, Paula Carolina Pires Bueno,

Estela Mariana Guimarães Lourenço, Isabelly Cristina de Matos Costa, Letícia Gondim

Lambert Moreira, Alan de Araújo Roque4, Euzébio Guimarães Barbosa, Arthur Germano Fett-

Neto, Alberto José Cavalheiro, Raquel Brandt Giordani. Methyl jasmonate-induced

potentially bioactive selaginellins accumulation in Selaginella convoluta. ………………. 60

IV.DISCUSSÃO GERAL ......................................................................................................... 64

V.CONCLUSÕES GERAIS ..................................................................................................... 76

VI. REFERÊNCIAS .................................................................................................................. 81

I.INTRODUÇÃO

Selaginella convoluta (Arn.) Spring: uma abordagem fitoquímica aliada a estudos ômicos

Fernanda Priscila Santos Reginaldo 22

O processo evolutivo de 400 milhões de anos e a capacidade de adaptação da

família Selaginellaceae (MARTÍNEZ-CORTÉS et al., 2012) tem destacado suas espécies

como uma interessante ferramenta de pesquisa a fim de entender habilidades adaptativas.

Nesse contexto, a investigação do metabolismo de Selaginella convoluta, espécie

nativa do Brasil e endêmica do Nordeste no bioma Caatinga torna-se relevante. Aliado a

isso, a espécie é importante do ponto de vista evolutivo, uma vez que está englobada na

mais antiga linhagem de plantas vasculares da Terra. Encontra-se no gênero que possui

cerca de 700 espécies (LITTLE et al., 2007), das quais apenas algumas evoluíram com

capacidades únicas de resistência à dessecação (OLIVER et al., 2000). Ainda, não foram

encontrados dados na literatura que se concentrem em investigar a capacidade de

tolerância à dessecação da espécie S. convoluta.

Selaginella convoluta é usada popularmente no nordeste do Brasil para tratar

enfermidades relacionadas ao sistema reprodutor feminino (SETYAWAN, 2009),

evidenciando, dessa maneira, a potencialidade de obtenção de moléculas bioativas a partir

dessa espécie. Destaca-se sua importância tanto sob o prisma da fitoquímica quanto da

farmacologia, demonstrando assim, a necessidade de entender as rotas de biossíntese

envolvidas na produção desses metabólitos, bem como os fatores abióticos que modulam

estas vias.

Diante disso, esta tese objetivou realizar uma abordagem fitoquímica aliada a

estudos ômicos da espécie Selaginella convoluta. Aliando o fato dessa espécie ser

endêmica na Caatinga, bioma que possui condições edafoclimáticas bastante adversas que

potencialmente influenciam de maneira peculiar na produção de metabólitos (i), a

ausência de pesquisas visando o entendimento dos eventos orquestrados na tolerância a

dessecação dessa planta (ii), e seu potencial bioativo (iii), torna essa espécie uma

importante ferramenta de estudo, contribuindo amplamente para a área de produtos

naturais.

I.1 Selaginellaceae e tolerância à dessecação

As licófitas constituem um grupo monofilético que representam um ponto-chave

na linhagem de plantas vasculares que incluem as famílias Lycopodiaceae, Isoetaceae e



Selaginellaceae, as quais surgiram há mais de 400 milhões de anos, durante o Siluriano,

dominando a flora da Terra a partir do Devoniano através do Carbonífero até o fim do

Permiano (MARTÍNEZ-CORTÉS et al., 2012). Dentre estas, Selaginellaceae, tem se

destacado pelo fato de ter resistido à extinção nos períodos Triássico e Permiano (WENG;

NOEL, 2013), sendo por isso considerada um ponto-chave no estudo de evolução, uma

vez que preserva algumas características típicas das plantas não vasculares, mas também

apresenta algumas inovações evolucionárias, tais como tecidos vasculares, folhas e caule

(FRIEDMAN, 2011; YOBI et al., 2013).

Selaginella constitui o único gênero dessa família, possuindo cerca de 700-750

espécies distribuídas no mundo inteiro (LITTLE et al., 2007). O processo evolutivo de

400 milhões de anos e a capacidade de adaptação da família Selaginellaceae

(MARTÍNEZ-CORTÉS et al., 2012) tem destacado suas espécies como uma interessante

ferramenta de pesquisa a fim de entender suas habilidades adaptativas. A família

sobreviveu a diversas pressões bióticas e abióticas o que conferiu a algumas espécies a

aquisição de um interessante traço evolutivo: tolerância a dessecação.

Tolerância a dessecação (TD) é a capacidade que um organismo possui de

promover a reativação da atividade metabólica após reidratação depois de permanecer

num estado extremamente seco (GAFF, 1971). As plantas TD mantem um conteúdo de

água intracelular extremamente baixo (podendo chegar a <10%), as funções celulares são

suspensas, e o tecido entra num estado quiescente. O tecido pode permanecer neste estado

quiescente por períodos curtos a extremamente longos e reiniciar suas funções normais

quando reidratado novamente. Diante disso, a tolerância à dessecação pode ser vista como

uma estratégia de resistência à seca (FERNÁNDEZ-MARÍN et al., 2016).

Dois tipos de organismos TD podem ser distinguidos: homoioclorófilos e

poiquiloclorófilos. A maioria dos organismos TD retém sua clorofila e as estruturas

fotossintéticas durante a dessecação, o que permite uma rápida retomada da fotossíntese

após a reidratação (horas, geralmente). Esses organismos são chamados de

homoioclorófilos. Para reduzir o risco de estresse foto-oxidativo durante a dessecação,

um grupo limitado de plantas TD – poiquiloclorófilas – desenvolveram uma estratégia

contrastante pela qual a ultraestrutura do cloroplasto é desmontada e a clorofila é

degradada durante a perda de água. Poiquiloclorofilia é uma estratégia escassa entre os

organismos TD que implica num período mais longo de estabelecimento da reidratação



(dias, geralmente) até que a atividade fotossintética seja completamente restaurada

(FARRANT et al., 2007; FARRANT, 2008; FERNÁNDEZ-MARÍN et al., 2016).

O processo de dessecação implica em danos bioquímicos/físicos que os

organismos tolerantes tem que prevenir e/ou reparar como a ruptura de ultraestruturas

(perda de integridade da membrana e mudanças na configuração de macromoléculas,

como enzimas) (HOEKSTRA et al., 2001), e estresse oxidativo devido ao acúmulo de

espécies reativas de oxigênio (DINAKAR et al., 2012). Consequentemente, essa condição

de estresse ativa diversos mecanismos para tolerar a desidratação dos tecidos, com o

intuito de garantir a integridade celular com baixo teor de água. Esses mecanismos podem

ser constitutivos ou desencadeados durante a desidratação. Geralmente, organismos TD

submetidos a ciclos rápidos e frequentes de dessecação/reidratação em seus habitats

naturais parecem basear sua estratégia de TD em mecanismos constitutivos e no

mecanismo de reparo ativado durante a reidratação (DINAKAR et al., 2012;

FERNÁNDEZ-MARÍN et al., 2016).

Os mecanismos de TD englobam desde mecanismos morfológicos, síntese de

osmólitos e proteínas induzidos pela seca, bem como a ativação de mecanismos

antioxidantes (Figura 1). O enrolamento do caule e dobramento das folhas são

mecanismos morfológicos que contribuem para a TD, uma vez que reduzem quase que

completamente a excitação da clorofila no estado dessecado, reduzindo a consequente

formação de espécies reativas de oxigênio devido à retenção do aparato fotossintético

(RAFSANJANI et al., 2015). Estudos tem destacado o potencial papel de metabólitos

como carboidratos, poliois, e aminoácidos na preservação de tecidos fotossintéticos secos

(YOBI et al., 2013). Além disso, proteínas como desidrinas, late embryogenesis abundant

[LEA], early light-induced proteins [ELIPs] e heat shock protein (HPS) parecem estar

relacionadas a TD (DINAKAR; BARTELS, 2013; FERNÁNDEZ-MARÍN et al., 2016).

Os mecanismos antioxidantes de organismos TD desempenham um papel

fundamental não apenas de assegurar a sobrevivência durante a dessecação, mas também

durante as etapas iniciais de reidratação, quando uma explosão oxidativa acompanha a

retomada da atividade metabólica (KRANNER et al., 2002; KRANNER; BIRTIĆ, 2005);

a ativação eficiente do sistema antioxidante determina a longevidade dos tecidos no

estado dessecado (KRANNER et al., 2002).

No contexto da tolerância a dessecação, podemos destacar algumas espécies do

gênero Selaginella, incluindo S. lepidophylla (ITURRIAGA et al., 2006), S. bryopteris



(DEEBA et al., 2009), S. tamariscina (WANG et al., 2010), S. sellowii (OLIVEIRA;

MORAES, 2015), e S. convoluta (GAFF, 1987) que adquiriram esse traço durante seu

processo evolutivo de TD.

Fonte: elaborado pelo autor

Dentre essas espécies, S. convoluta destaca-se como sendo uma das plantas mais

bem adaptadas ao clima semiárido da Caatinga (XAVIER et al., 2012), uma vez que

possuem a peculiaridade de ser homoioclorofílica e poiquilohídrica, interessantes

mecanismos de resistência à dessecação (AMBRÓSIO; MELO, 2001). Entretanto, ainda

não foram encontrados dados na literatura que se concentrem em investigar a capacidade

de tolerância à dessecação da espécie S. convoluta. Nesse contexto, abordagens ômicas

demonstram ser uma interessante ferramenta que pode fornecer insights sobre os eventos

orquestrados na tolerância a dessecação.

I.2 Estudos ômicos de espécies tolerantes à dessecação ‒ Selaginellaceae

As abordagens ômicas podem fornecer uma compreensão abrangente do papel das

proteínas, metabólitos e genes expressos envolvidos na tolerância à dessecação. Algumas

espécies de Selaginella (ITURRIAGA et al., 2006; DEEBA et al., 2009; WANG et al.,

2010), que evoluíram com capacidade de tolerância à dessecação tem atraído a atenção

de muitos pesquisadores com interesse em compreender os mecanismos envolvidos na

Figure 1 Representação esquemática dos eventos orquestrados no mecanismo de

tolerância à dessecação.



TD através de abordagens de genômicas funcionais (CUSHMAN; OLIVER, 2011). O

sequenciamento do genoma da espécies S. moellendorffii, S. lepidophylla e S. tamariscina

forneceu subsídios para a compreensão dos mecanismos envolvidos na adaptação dessa

família que conseguiu sobreviver às inúmeras pressões bióticas e abióticas durante esses

400 milhões de anos de evolução (BANKS, 2009).

I.2.1 Análises de transcriptoma

Estudos de transcriptoma foram desenvolvidos com o intuito de entender a base

molecular da tolerância à dessecação em espécies de Selaginella. No estudo de

transcriptoma de Selaginella lepidophylla, uma biblioteca de DNA complementar foi

construída e um banco de dados de expressed sequence tag (ESTs) foi gerado. Os clones

obtidos foram comparados com bancos de dados de proteínas, permitindo a anotação de

653 (62,4%) sequências. Dentre essas, 212 (20,2%) sequências apresentaram semelhança

significativa com sequências conhecidas, cujas funções ainda são desconhecidas, e 181

(17,3%) sequências não apresentaram semelhança com sequências conhecidas. Além

disso, os ESTs de S. lepidophylla foram comparados com o banco de dados de ESTs de

S. moellendorffii. Consequentemente, foi observada uma semelhança de 36-38% das

ESTs de S. lepidophylla em comparação com ESTs de S. moellendorffii; 62% mostraram

sequência única para S. lepidophylla e 63% para S. moellendorffii. Algumas atribuições

funcionais para ESTs de S. lepidophylla demonstraram proteínas relacionadas ao estresse

abiótico, que podem estar relacionadas à tolerância à dessecação. Desta forma, este artigo

destaca que S. lepidophylla pode servir como um interessante recurso genético para a

identificação de novos genes associados ao estresse ambiental e tolerância à dessecação

(ITURRIAGA et al., 2006).

Finalmente, um estudo de transcriptoma foi realizado para as espécies S. sellowii,

(tolerante à dessecação) e S. denticulata (sensível à dessecação). A análise também

incluiu dados de transcriptoma de S. lepidophylla (tolerante à dessecação), a fim de

identificar mecanismos de TD que são independentes de adaptações morfológicas. A

maioria dos genes responsivos à dessecação diferem entre as espécies. Apesar dessas

diferenças, a análise funcional revelou que as espécies tolerantes com morfologias

diferentes empregam mecanismos semelhantes para tolerar à dessecação. As funções

significativas envolvidas na TD e compartilhadas pelas espécies tolerantes foram:



indução de sistemas antioxidantes, aminoácidos e metabolismo secundário; enquanto as

respostas espécie-específica estavam relacionadas à modificação da parede celular e

metabolismo de carboidratos (Figura 2). Os resultados desse estudo fornecem evidências

de evolução convergente entre S. sellowii e S. lepidophylla devido aos diferentes

conjuntos de genes relacionados à aquisição de TD (ALEJO-JACUINDE et al., 2020).

I.2.2 Análises de proteoma

O panorama proteico das partes aéreas de S. bryopteris foi estudado em resposta

à desidratação e reidratação. Um total de 250 proteínas foram detectadas. Os resultados

mostraram que as proteínas responsivas à desidratação estavam relacionadas a processos

como transporte, direcionamento e degradação. Diante disso, os autores destacaram que

algumas dessas proteínas podem ser uma vantagem fisiológica para S. bryopteris sob

dessecação (DEEBA et al., 2009).

Em outro estudo, Deeba e colaboradores (2016) usaram a estratégia de proteoma

órgão-especifico com o intuito de obter uma visão mais abrangente dos eventos

coordenados entre raízes e partes aéreas envolvidos na tolerância à dessecação. S.

bryopteris foi submetida a 7 dias de desidratação seguida de 2h e 24h de reidratação. Nas

raízes, dentre as 59 proteínas detectadas, 58 foram reguladas positivamente durante o

estado desidratado. As proteínas identificadas foram relacionadas à sinalização, estresse

e defesa, metabolismo de proteínas e nucleotídeos, metabolismo de carboidratos e

energia, armazenamento e controle epigenético. Entre as 90 proteínas identificadas nas

partes aéreas, cerca de 49% foram reguladas positivamente durante o estado desidratado.

Um grande número de proteínas envolvidas na eliminação de espécies reativas de

oxigênio aumentou durante a desidratação. Muitas outras proteínas envolvidas em

energia, metabolismo de nucleotídeos, controle epigenético foram altamente reguladas.

Os resultados forneceram uma visão mais abrangente das diferentes respostas celulares

envolvidas na mudança do panorama proteico durante a desidratação e reidratação em

raízes e partes aéreas, mostrando uma resposta bem coreografada, conforme esperado de

uma planta da ressurreição (DEEBA et al., 2016).

Com o intuito de entender melhor o mecanismo de tolerância à dessecação,

análises fisiológicas e proteômicas foram realizadas em espécimes de S. tamariscina.

Durante o período de uma semana, após a privação de água por 0 dias (d), 1 d, 3 d, 5 d, 7



d e 12 h após a reidratação, as partes aéreas das respectivas plantas foram coletadas. Os

resultados obtidos mostraram um aumento de ABA, açúcares solúveis e prolina durante

o processo de desidratação, assim como as enzimas antioxidantes superóxido dismutase

(SOD), peroxidase (POD), catalase (CAT) e glutationa redutase (GR) tiveram sua

atividade aumentada. Por outro lado, a taxa de fotossíntese e o conteúdo de clorofila

diminuíram, bem como a integridade da membrana plasmática foi perdida. Um total de

138 proteínas em resposta à dessecação foram anotadas, dentre as quais 103

representaram proteínas únicas. A análise de agrupamento hierárquico revelou que 83%

das proteínas foram reguladas negativamente após a desidratação e que as mudanças da

expressão dinâmica das proteínas responsivas à dessecação fornecem evidências de que

a modificação da estrutura celular, redução da fotossíntese, ativação do sistema

antioxidante e modificações pós-transcricionais/traducionais são essenciais para a

resposta a desidratação da planta poiquiloclorofila S. tamariscina. Além disso, a análise

comparativa de proteínas responsivas à desidratação em tecidos vegetativos de 19

espécies de plantas TD e SD sugeriu que S. tamariscina desenvolveu um mecanismo

específico de tolerância à dessecação (WANG et al., 2010).

Em Selaginella lepidophylla, os padrões de expressão de proteínas nos estados

hidratado e desidratado foram investigados. Este estudo detectou 1.700 spots, dos quais

184 foram sequenciados. Algumas das proteínas com maior abundância no estado

desidratado foram Rubisco, RCA, proteínas LEA, HSPs, proteínas 14-3-3 e proteínas com

funções relacionadas à fotossíntese, armazenamento de energia, controle de RUBISCO,

vitrificação do citoplasma, proteção da integridade da membrana, auxílio ao dobramento

de proteínas e resposta de defesa (CASTANO-DUQUE; CUSHMAN, 2010).

Comparando esses estudos de proteoma é possível observar que alguns processos

envolvidos na TD parecem ser compartilhados pelas espécies estudadas e ainda alguns

parecem ser espécie-específicos (Figura 2). É possível que um estudo de análise funcional

comparativa possa esclarecer melhor essa hipótese. De modo geral, as investigações do

panorama proteico foram realizadas utilizando apenas as partes aéreas; entretanto, um

estudo utilizou a abordagem órgão-específica. Essa abordagem interessantemente

forneceu uma visão mais abrangente não somente dos eventos envolvidos na tolerância à

dessecação, mas também na reativação do metabolismo da planta durante o processo de

reidratação, apontando que raízes e partes aéreas trabalham de modo coordenado para

regular a TD. De modo geral, os estudos de proteoma de Selaginella utilizaram a clássica



técnica de 2-DE; no entanto, estudos apontam suas diversas limitações. Nesse contexto,

a técnica de gel-free pode permitir uma análise de panorama proteico mais abrangente,

visto que é uma abordagem mais moderna e que supera as limitações da 2-DE (GUTSCH

et al., 2020).


I.2.3 Análises de metaboloma

O metaboloma tem sido usado como uma ferramenta para fornecer uma

compreensão abrangente dos metabólitos que podem estar envolvidos na DT. Um estudo

de perfil metabólico, utilizando as técnicas analíticas GC/MS e UHLC/MS/MS2,

comparou S. lepidophylla (tolerante à dessecação ‒ TD) e S. moellendorffii (sensível à

dessecação ‒ SD), com conteúdo relativo de água em 100% e 50%. Um total de 301

metabólitos foram anotados. Diversos metabólitos foram mais abundantes em S.

lepidophylla do que em S. moellendorffii, como sacarose, mono- e polissacarídeos,

Figura 2 Representação esquemática de respostas à tolerância à dessecação

compartilhadas e espécie-específica baseado nos estudos de proteoma e transcriptoma

de espécies de Selaginella.



álcoois de açúcar, aminoácidos aromáticos e c-glutamil aminoácido. Ainda, poliois como

o sorbitol e xilitol foram bem mais abundantes em S. lepidophylla em comparação com

S. moellendorffii. Os dados químicos abordados focaram principalmente em metabólitos

primários, sendo que a caracterização e comparação entre as espécies no que se refere aos

metabólitos secundários não foi discutido. De modo geral, o estudo concluiu que S.

lepidophylla parece tolerar a dessecação de uma maneira constitutiva usando uma ampla

gama de metabólitos com alguns componentes induzíveis, enquanto S. moellendorffii

demonstrou apenas respostas metabólicas limitadas referentes ao estado de desidratação

(YOBI et al., 2012).

Em outro estudo de perfil metabólico, Selaginella lepidophylla foi submetida a

um ciclo de reidratação/desidratação de cinco estágios e 251 metabólitos foram

caracterizados pelas técnicas analíticas GC/MS e UHLC/MS/MS2. Vários intermediários

do ciclo de glicólise/gliconeogênese e ácido tricarboxílico, bem como vanilato (um

potente antioxidante), e muitos álcoois de açúcar foram mais abundantes no estado

hidratado. Ainda, aminoácidos ricos em nitrogênio e γ-glutamil aminoácidos, citrulina e

produtos de catabolismo de nucleotídeos, bem como 3- (3-hidroxifenil) propionato,

apigenina, e naringenina foram mais abundantes no estado desidratado. Finalmente, foi

observado que S. lepidophylla exibiu sete metabólitos não anotados que exibiram maior

abundância no estado desidratado, sugerindo que esses compostos podem desempenhar

papeis adaptativos na tolerância à dessecação (YOBI et al., 2013). Novamente, o maior

enfoque de discussão foi dado aos metabólitos primários.

A natureza da tolerância à dessecação em S. tamariscina foi avaliada comparando

a composição de açúcares solúveis e as razões de saturação de fosfolipídios entre tecidos

hidratados e dessecados da planta por cromatografia gasosa, bem como diferenças na

expressão gênica e conteúdo de ABA durante a desidratação. Os resultados mostraram

que a trealose foi o principal açúcar solúvel e o baixo teor de ácidos graxos saturados em

fosfolipídios foi mantido em tecidos hidratados e dessecados. Além disso, o conteúdo de

ABA de S. tamariscina aumentou 3 vezes, e os genes envolvidos na sinalização ABA e

na proteção celular foram regulados positivamente, enquanto os genes relacionados ao

fotossistema foram regulados negativamente durante a desidratação. Os resultados

bioquímicos e moleculares desse estudo apontaram que as moléculas protetoras

constitutivas e induzíveis contribuem para a tolerância à dessecação de S. tamariscina

(LIU et al., 2008).



De acordo com Liu et al. (2008) a trealose foi o principal açúcar que se acumulou

tanto no estado desidratado quanto no estado hidratado de S. tamariscina, enquanto Yobi

et al. (2012) relataram que a sacarose foi mais abundante em S. lepidophylla durante o

estado hidratado. Vários estudos relataram que esses carboidratos parecem desempenhar

papeis importantes em espécies de Selaginella tolerantes à dessecação, uma vez que tanto

a sacarose quanto a trealose se acumulam em tecidos dessecados e hidratados. Esses

achados apontam que essas espécies TD mantem níveis de açúcar constitutivamente altos

que não aumentam mais durante a dessecação, indicando que esses metabólitos podem

estar associados a uma resposta constitutiva a TD. No entanto, o perfil metabólico

comparativo entre S. lepidophylla (TD) e S. moellendorffii (SD) revelou que altos níveis

de trealose não são exclusivos de S. lepidophylla. De modo geral, isso pode indicar que

altos níveis de açúcar podem contribuir para a tolerância à dessecação, mas não são

suficientes, indicando que esse constitui um dos eventos que englobam a base dos

mecanismos envolvidos na TD

I.2.4 O que os estudos utilizando abordagens ômicas sobre as espécies de Selaginella

tolerantes à dessecação podem nos ensinar até agora?

De modo geral, os estudos ômicos de espécies de Selaginellaceae fornecem

diversos insights sobre os eventos envolvidos na TD. Essas espécies parecem

compartilhar respostas a TD, bem como parecem possuir respostas espécie-específicas.

Os estudos de modo geral, apontam que trealose é um carboidrato importante na TD; no

entanto, dados de transcriptoma apontaram que carboidratos da família das rafinoses

parecem também desempenhar um interessante papel em TD. Altos níveis de açúcar

podem contribuir para a tolerância à dessecação, mas não são suficientes, indicando que

o mecanismo de TD pode ocorrer de modo intrinsecamente coordenado englobando

eventos morfológicos e fisiológicos, ativação de sistema antioxidante e síntese de

proteínas; portanto, a base dos mecanismos de TD são complexos e integrados. A

complexidade de eventos envolvidos na TD demonstra claramente que seria muito difícil

transferir as características de TD para uma planta de cultivo. É possível que estudos

ômicos integrativos (transcriptoma-proteoma-metaboloma) em conjunto com a

abordagem órgão-específico possam fornecer uma visão mais abrangente dos eventos



orquestrados na TD relevando um ponto-chave, que possibilite a transferência do traço

de TD a plantas de cultivo.

I.3 Estudos ômicos e sua relevância para fitoquímica

As plantas produzem cerca de 200.000 produtos naturais, e a enorme variedade de

substâncias produzidas por elas são potencialmente úteis no desenvolvimento de novos

medicamentos (DIXON; STRACK, 2003). Em decorrência da possibilidade dos

metabólitos secundários se tornarem um recurso terapêutico, pesquisas se concentram em

isolar esses metabólitos, testando em alvos potenciais, como fungos, bactérias, vírus,

parasitos, diversas linhagens de câncer, doenças neurodegenerativas, dentre outros. No

entanto, em muitos casos, o baixo rendimento dessas substâncias isoladas e a

inviabilidade de obtenção por meio de síntese química dificultam a utilização de

substâncias importantes na terapêutica. Diante disso, pesquisas tem se concentrado em

tentar entender os mecanismos que estão envolvidos e os fatores que influenciam as rotas

de biossíntese dos metabólitos secundários.

Nesse cenário, podemos destacar que a fitoquímica está entrando em uma nova

era: a era da genômica funcional, constituindo assim, uma maneira de tentar resolver os

percalços encontrados na pesquisa de produtos naturais visando seu uso na medicina.

Genômica é a ciência que estuda o genoma dos organismos a partir do sequenciamento

completo de seus genes, visando entender a sua estrutura, organização e função (DIXON;

STRACK, 2003). No contexto da química de produtos naturais, a genômica funcional,

tem sido bastante relevante, uma vez que é a ciência que tenta compreender as mudanças

no funcionamento do genoma em diversas etapas do desenvolvimento de um organismo,

bem como sob influência de diversos fatores ambientais (TOHGE et al., 2005).

Os aliados da pesquisa em genômica funcional, no contexto dos produtos naturais,

são os estudos ômicos, como transcriptoma e proteoma, os quais permitem determinação

da função dos genes num organismo, possibilitando o fornecimento de informações

objetivando o entendimento da modulação de rotas de biossíntese de metabólitos de

interesse farmacêutico, abrindo perspectivas de melhoramento em espécies vegetais,

permitindo ainda, a modulação de rotas de biossíntese. Outra ferramenta importante no

contexto da genômica funcional é o metaboloma, que uma vez integrado à análise de

transcriptoma pode fornecer informações precisas sobre a determinação das correlações



gene-metabólito, a identificação da função de genes desconhecidos, e ainda o gene que

responde a determinados fatores abióticos, culminando na produção de metabólito

secundário específico (MERCKE et al., 2004; TOHGE et al., 2005). Tomando em

conjunto essas considerações, as abordagens “ômicas” visam o entendimento do

metabolismo celular como um todo, de maneira integrada (ZHANG et al., 2010)

consistindo numa abordagem de fronteira para a química de produtos naturais.

I.4 Proteoma

O termo Proteoma significa a análise de todas as proteínas expressas por um

genoma (WILKINS et al., 1996). Proteoma é, assim, a análise em larga escala de proteínas

numa célula, tecido ou organismo inteiro num determinado momento, sob condições

definidas (ABDALLAH et al., 2012), é o produto direto do genoma transcrito e traduzido

gerando informações cruciais para a compreensão global do funcionamento celular

(BAGINSKY, 2009). Análise proteômica é uma poderosa ferramenta na caracterização

funcional de plantas. Devido à disponibilidade de uma vasta informação de sequências de

nucleotídeos, com base nos progressos realizados na identificação rápida e sensível de

proteínas por espectrometria de massa, as abordagens proteômicas abrem novas

perspectivas para analisar as funções complexas nas plantas (CANOVAS et al., 2004).

Para a análise proteômica as duas principais abordagens utilizadas são bottom-up

e top-down. A abordagem de bottom-up é baseada na digestão de proteínas, identificação

de peptídeos e, finalmente, atribuição de proteínas; ao passo que a abordagem de top-

down, a etapa inicial é baseada em toda a sequência da proteína, incluindo modificações

pós-traducionais (ABDALLAH et al., 2012). Enquanto, as análises quantitativas são

realizadas a nível de peptídeo para a abordagem de bottom-up, estas são realizadas a nível

de proteínas na abordagem de top-down (GUTSCH et al., 2020).

A princípio os estudos de proteoma em plantas foram baseados na técnica de

eletroforese em gel bi-dimensional (2-DE), uma abordagem top-down. Desde então, a

ferramenta de proteoma tem sido aplicada em todos os aspectos da pesquisa de plantas,

incluindo o desenvolvimento da planta, a resposta às condições ambientais (estresse

abiótico e biótico), bem como na influência nutritiva de plantas de interesse agronômico

(GUTSCH et al., 2020).



A 2-DE é uma técnica bem estabelecida, sendo o método padrão para estudar o

proteoma de uma célula, tecido, órgão ou organismo, separando as proteínas através de

eletroforese bidimensional, seguida da identificação das proteínas separadas por

espectrometria de massa. A maioria dos estudos de proteômica hoje ainda segue esta

abordagem (STEEL et al., 2005). No entanto, esta técnica possui limitações como baixa

reprodutibilidade quantitativa e baixa sensibilidade para detecção de certas classes de

proteínas. A técnica 2-DE não consegue visualizar todas as proteínas numa amostra

complexa. Um gel típico 2-DE permite a visualização de 30-50% de todo o proteoma. Em

particular as proteínas presentes em concentrações extremamente baixas ou proteínas que

não podem ser separados num gel de 2-DE, devido às suas propriedades físico-químicas

(Ponto Isoelétrico, hidrofobicidade, peso molecular) não podem ser detectadas através

desse método (GYGI et al., 2000). Visto isso, nos últimos anos, abordagens alternativas,

tais como o Gel-free tem demonstrado ser uma técnica promissora, sendo mais sensível

uma vez que consegue detectar proteínas de baixo peso molecular e possui uma melhor

reprodutibilidade. A análise proteômica por Gel-free, realizada por espectrometria de

massas, permite ainda a análise quantitativa das proteínas presentes na amostra analisada

(ZHANG et al., 2010).

A abordagem de Gel-free é uma estratégia de bottom up. Nessa abordagem as

amostras de proteínas são digeridas e as misturas de peptídeos complexos são separadas

por cromatografia líquida seguida pela análise por espectrometria de massas. A

identificação e quantificação por espectrometria de massas desses peptídeos permite a

determinação do teor de proteína na amostra inicial, uma vez que os peptídeos são

uniformes na composição física e química. Ainda, essas propriedades impactam numa

separação mais uniforme por cromatografia líquida, resultando em um certo grau de

automação. Essa abordagem acelerou o ritmo das análises de proteoma, tornando-o um

estudo de alto rendimento. As etapas da abordagem de gel-free são as seguintes: (i)

extração, redução, alquilação e digestão de proteínas; (ii) separação por cromatografia

líquida, seguida por análise espectrometria de massas sequencial; e (iii) análise de dados

(GUTSCH et al., 2020).

O processamento preciso dos dados é obrigatório para as análises quantitativas,

bem como para as análises estatísticas com o intuito de fornecer informações confiáveis

quanto as alterações das proteínas. Assim é importante realizar um processamento de

dados, seguindo etapas como eliminação do ruído de fundo para a detecção de pico,



alinhamentos de pico para combinar corretamente os picos correspondentes entre vários

dados espectrais e normalização. A identificação das proteínas é realizada por pesquisas

em bancos de dados para os quais diferentes softwares estão disponíveis (SANDIN et al.,

2014).

A abordagem de gel-free é uma técnica de desenvolvimento rápido que supera

algumas desvantagens apresentadas pela técnica de 2-DE. Além disso, o tempo

experimental necessário é curto, e a otimização da aquisição e análise de dados tornaram

possível o alto rendimento das análises de proteoma. No entanto, até o momento, a

eletroforese em gel bi-dimensional é a única abordagem top-down que permite a

visualização de modificações pós-traducionais e isoformas que fornecem informações

complementares sobre a resposta ao estresse por exemplo, sendo por este motivo ainda a

ferramenta comumente mais usada em análises de proteoma.

I.5 Metaboloma

Os metabólitos são os produtos finais dos processos celulares, e seus níveis podem

ser considerados como a resposta final de sistemas biológicos às mudanças genéticas ou

ambientais. Da mesma maneira que o termo transcriptoma significa a informação dos

transcritos e proteoma de todas as proteínas, o conjunto de metabólitos sintetizados por

um sistema biológico constitui o seu metaboloma (FIEHN, 2002), sendo esse bastante

relevante na abordagem da genômica funcional, contribuindo assim, para o entendimento

das interações moleculares complexas em sistemas biológicos (HALL et al., 2002).

Analisar o conjunto de metabólitos presentes num organismo é muito complexo,

visto que esses diferem sob vários aspectos, como em relação à sua polaridade,

comportamento químico, a estabilidade e a concentração, o que torna a análise de todos

os metabólitos em um único experimento extremamente difícil. Nesse contexto, duas

principais abordagens tem sido amplamente utilizadas para investigar o metaboloma:

análise direcionada (targeted analysis) e análise não direcionada (untargeted analysis)

(SHULAEV et al., 2008; SCHUHMACHER et al., 2013).

Na abordagem direcionada, um conjunto de metabólitos de interesse são

predefinidas e monitorados, permitindo a quantificação absoluta e a identificação

definitiva através do uso de metabólitos disponíveis como padrões de referência

autênticos. Em contraste, os métodos de perfil não direcionados visam encontrar



características analíticas de todos os metabólitos detectáveis e, portanto, tem o potencial

de explorar todo o espaço metabólico, incluindo metabólitos desconhecidos (SHULAEV

et al., 2008; SCHUHMACHER et al., 2013).

A análise não direcionada engloba duas abordagens: fingerprinting metabólico e

perfil metabólico. Fingerprinting metabólico é uma estratégia definida como um

screening qualitativo de um organismo ou tecido com o objetivo primário de comparar

assinaturas metabólicas e executar análises discriminatórias (HALL, 2006; SHULAEV et

al., 2008; SCHUHMACHER et al., 2013), sem identificação ou precisa quantificação dos

metabólitos presentes na amostra. Por outro lado, o perfil metabólico é uma estratégia que

possui não somente o intuito de fornecer o panorama metabólico, mas também a

identificação e quantificação de metabólitos (SHULAEV et al., 2008).

Diversas técnicas analíticas podem ser empregadas para análises de metaboloma,

incluindo a Ressonância Magnética Nuclear (RMN) e a Cromatografia Líquida acoplada

à espectrometria de massas (CL-EM/EM).

I.5.1 Ressonância magnética nuclear

Ressonância Magnética Nuclear (RMN) é um método considerado bastante

adequado, uma vez que permite a detecção simultânea de diversos grupos de metabólitos

secundários (compostos fenólicos, alcaloides e terpenos), além de metabólitos primários

(açúcares, ácidos orgânicos, aminoácidos, dentre outros) (KIM et al., 2010) em extratos

não purificados de plantas.

Os espectros unidimensionais de 1H RMN são bastante utilizados para estudos de

metaboloma, visto que a técnica, é altamente automatizável, portanto reprodutível,

confiável e rápida. A aquisição de um único espectro de 1H RMN ocorre em apenas alguns

minutos. Apesar das diversas vantagens da espectroscopia de 1H RMN, uma grande

limitação dessa técnica é justamente a sobreposição de sinais, dificultando a identificação

e quantificação de metabólitos. Em metaboloma, uma alternativa para superar essa

limitação de sobreposição de sinais, seria a deconvolução de sinais via experimentos 2D

RMN. Os experimentos 2D RMN conferem uma resolução adicional que permite

potencialmente detectar e identificar mais metabólitos do que é possível com 1D RMN

(KIM et al., 2010; SCHRIPSEMA, 2010; EMWAS, A. H. et al., 2019).



Dentre os experimentos 2D RMN, TOCSY (espectroscopia de correlação total),

também conhecido como experimento homonuclear de Hartmann-Hahn (HOHAHA),

tem demonstrado ser uma interessante ferramenta para análises de misturas complexas

em metaboloma. O TOCSY é uma extensão do experimento COSY, em que o

deslocamento químico de um determinado núcleo está correlacionado com o

deslocamento químico de outros núcleos dentro de um sistema de spin de um determinado

metabólito. O espectro TOCSY mostra os picos cruzados não apenas para hidrogênios

acoplados, mas também para hidrogênios que são conectados por uma cadeia de

acoplamentos escalares (quatro ou mais ligações covalentes de distância)

(SCHRIPSEMA, 2010).

Diante disso, podemos destacar que a técnica de RMN é uma ferramenta

interessante para análises de metaboloma, visto que permite a detecção de metabólitos

primários e secundários simultaneamente em misturas complexas, principalmente nos

casos em que seus resultados experimentais são comparados a bancos de dados teóricos.

I.5.2 Cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas ‒ CL-EM/EM.

Dentre as diferentes ferramentas analíticas disponíveis para as análises de

metaboloma, a espectrometria de massa é atualmente a técnica mais popular para detecção

e identificação de metabólitos devido à sua capacidade de ser combinada com

cromatografia líquida (CL-EM) e também pela possibilidade de obtenção de fragmentos

das moléculas através do uso desta técnica em sequencial (EM/EM) (DUNN et al., 2013).

O acoplamento de cromatografia líquida à espectrometria de massas (CL-EM/EM)

facilita a identificação e quantificação de metabólitos reduzindo a complexidade da

amostra e permitindo separação de metabólitos antes da detecção. Usando a estratégia

CL-EM/EM, de centenas a milhares de metabólitos podem ser detectados num

organismo. A anotação de metabólitos em CL-EM é obtida por meio da determinação

precisa da massa, bem como pela análise espectral dos dados de EM/EM (XIA;

WISHART, 2011; XIAO et al., 2012; VINAIXA et al., 2016).

LC acoplado a ionização por electrospray (CL-ESI-EM) tem demonstrado ser um

interessante método de escolha para a detecção de metabólitos em amostras biológicas

complexas. Em CL-ESI-EM, CL de fase reversa, normalmente usando colunas C18, pode

separar compostos semi-polares (ácidos fenólicos, flavonoides, esteroides glicosilados,



alcaloides e outras espécies glicosiladas). No entanto, o uso de coluna polares – interação

hidrofílica (HILIC) – pode ser usada para separar compostos polares (por exemplo,

açúcares, amino açúcares, aminoácidos, ácidos carboxílicos e nucleotídeos) (XIAO et al.,

2012).

Embora CL de fase normal também possa separar compostos polares, o uso de

fases móveis orgânicas não polares o torna mais compatível com APCI-EM em vez de

ESI-EM, sendo mais comumente aplicado a análise de lipídios não polares (por exemplo,

triacilgliceróis, esteróis e ésteres de ácidos graxos) e outros estudos lipidômicos (HAN;

JIANG, 2009; XIAO et al., 2012).

Portanto, as vantagens do acoplamento da separação por cromatografia com

detecção de espectrometria de massas incluem o aprimoramento da sensibilidade da EM,

bem como a reprodutibilidade do sinal, implicando na redução da complexidade da

amostra, reduzindo, desse modo, as interferências da matriz no processo de ionização.

I.5.2.1 Global Natural Products Social Molecular Networking ‒ GNPS: Classical

Molecular Networking

Nos processos de análises do metaboloma, uma grande quantidade de dados é

gerada para detectar metabólitos conhecidos, bem como identificar possíveis análogos

relacionados. Diversas ferramentas de bioinformática que utilizam dados de EM/EM

foram desenvolvidas com o intuito de promover uma rápida caracterização química, bem

como a anotação de metabólitos em misturas complexas. Nesse contexto, a ferramenta de

molecular networking pode fornecer um método rápido e sensível para visualizar

simultaneamente a composição química dos extratos de plantas, minimizando o trabalho

árduo de dados analisados manualmente (YANG et al., 2013; WANG et al., 2016). Essa

ferramenta encontra-se disponível na plataforma GNPS, a qual possui uma grande

biblioteca espectral englobando banco de dados como MassBank, ReSpect e NIST,

contando com mais de 70.000 metabólitos e ainda permite que os usuários inseriram seus

dados espectrais, os quais são disponibilizados para toda comunidade científica (WANG

et al., 2016).

Molecular networking organiza grandes conjuntos de dados de espectros de massa

sequencial (EM/EM) com base na similaridade entre padrões de fragmentação de íons

precursores relacionados e compara os espectros de EM/EM com bancos de dados



robustos (YANG et al., 2013; ALLARD et al., 2016; WANG et al., 2016). No contexto

de produtos naturais, os metabólitos relacionados compartilham padrões de fragmentação

semelhantes e agrupam-se de acordo com a origem biossintética. As famílias moleculares

resultantes permitem a exploração visual de moléculas idênticas e análogas, acelerando a

detecção de metabólitos conhecidos por comparação com banco de dados de produtos

naturais e a identificação de análogos com base em estudos de fragmentação (YANG et

al., 2013; ALLARD et al., 2016).

Desde sua criação, a plataforma GNPS tem sido utilizada em diversos estudos

com as mais diversas aplicações. Em nosso grupo, diversos trabalhos tem utilizado essa

estratégia no contexto da química de produtos naturais. Dentre os trabalhos podemos

destacar o estudo realizado com Erytrhina velutina baseado nas abordagens de

transcriptoma e metaboloma, no qual essa ferramenta permitiu a anotação de 40 alcaloides

(CHACON et al., 2021). Além disso, estudando a espécie S. convoluta conseguimos

realizar a predição três novas selaginelinas, bem como a proposta do perfil de

fragmentação de todas as selaginelinas anotadas (REGINALDO et al., 2020).

Diante disso, a abordagem de análise de dados baseada em molecular networking

constitui uma interessante ferramenta para análises de metaboloma, visto que permite

uma rápida visualização do perfil metabólito, bem como a anotação de metabólitos

conhecidos de modo rápido e sensível, proporcionado ainda a possibilidade de anotação

de metabólitos não conhecidos baseado no perfil de fragmentação de análogos.

I.5.3 Comparação das técnicas de RMN e EM sob o prisma das análises de metaboloma

A sensibilidade é talvez o requisito mais importante para as análises de

metaboloma, uma vez que a alta sensibilidade favorece a análise de uma fração maior do

metaboloma. 1H RMN, possui um limite de detecção muito menos sensível que EM

(SUMNER et al., 2003). Esta diferença de sensibilidade é conferida por uma cobertura

mais completa do metaboloma com a técnica de EM – 326 metabólitos polares e

lipofílicos foram detectados, e 164 identificados nas folhas de Arabidopsis thaliana

(FIEHN et al., 2000); enquanto mais de 150 metabólitos polares foram detectados, e 77

identificados, em um extrato de tecido de tubérculo de batata (ROESSNER et al., 2000).

Esses números excedem significativamente os 20 – 40 metabólitos normalmente



identificados em estudos de perfil de metabólitos de amostras de plantas por 1H RMN

(SOBOLEV et al., 2003; GALL, LE et al., 2004; KRISHNAN, 2004).

Além disso, a técnica de MS requer uma quantidade de amostra menor para uma

boa detecção quando comparado ao RMN. Considerando um metabólito especifico que

possui uma concentração restrita de 0.1 nmol g -1 em tecido fresco – a extração de 50 g

de tecido pode permitir a detecção de “todo metaboloma” por 1H RMN; enquanto, apenas

10 mg de tecido seriam suficientes para MS (KRISHNAN, 2004).

A sobreposição de sinais num espectro de 1H RMN é um grande obstáculo para a

identificação de metabólitos; no entanto, esse problema pode ser amenizado usando

técnicas de RMN bidimensionais (SCHRIPSEMA, 2010). As análises de metaboloma

usando a técnica de MS, em geral são realizadas de modo integrado com a cromatografia

líquida, conferindo de modo geral, uma boa separação de metabólitos. Os problemas de

co-eluição de metabólitos, comumente encontrados quando se utiliza CL-EM, podem ser

facilmente solucionados usando a deconvolução das bandas através de software de pré-

processamento de dados (XIAO et al., 2012; VINAIXA et al., 2016).

O quadro 1 sumariza as vantagens e limitações mais importantes entre as técnicas

de RMN e EM relacionadas as aplicações de análises de metaboloma. De modo geral, a

comparação entre EM e RMN mostra claramente que a EM tem uma vantagem em termos

de sensibilidade, bem como confere um melhor processo de separação em misturas

complexas devido a integração com a técnica de CL. No entanto, a facilidade com que os

espectros de RMN podem ser registrados, além do fato de que mesmo EM parece ser

capaz de identificar apenas uma pequena fração do metaboloma, indica que a análise do

metabólito por RMN agrega valor à análise de metaboloma por meio da

complementaridade. Atualmente, EM está mais perto do ideal no que se refere a análises

de metaboloma do que RMN, entretanto, essas técnicas se complementam.



Quadro 1 Comparação entre as técnicas de espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) e a

espectrometria de massa (EM) no contexto das análises de metaboloma.

RMN EM

Reprodutibilidade A alta reprodutibilidade é uma de

suas vantagens fundamentais.

Em comparação com a RMN, os dados

EM são menos reproduzíveis.

Sensibilidade

Intrinsecamente baixo. Um maior

tempo e número de varreduras,

maior força de campo magnético,

criossonda e microssondas podem

melhorar a sensibilidade.

Alta sensibilidade é uma importante

vantagem do EM; metabólitos em

baixas concentrações (nanomolares)

são possíveis de ser detectados.

Seletividade

Geralmente usada para análises não

seletivas. As sobreposições de sinais

de vários metabólitos detectados

representam uma limitação.

Seletivo. Em combinação com a

cromatografia, é uma ferramenta

superior para análise direcionada.

Medição de amostra

Permite medição relativamente

rápida usando 1H-RMN ‒ todos os

metabólitos são detectáveis a nível

de concentração ‒ em uma medição.

Diferentes métodos de ionização são

requeridos para maximizar o número de

metabólitos detectados.

Recuperação da amostra Não destrutiva e, portanto, várias

análises podem ser realizadas com a

mesma amostra.

É uma técnica destrutiva, a amostra não

pode ser recuperada. Entretanto, uma

pequena quantidade de amostra é

requerida nas análises.

Análise quantitativa

Inerentemente quantitativo; a

intensidade do sinal é diretamente

proporcional às concentrações dos

metabólitos.

A intensidade da linha RMS

frequentemente não está correlacionada

com as concentrações de metabólitos,

pois a eficiência da ionização também é

um fator determinante.

Número de metabólitos

detectáveis

Dependendo da resolução espectral,

geralmente menos de 200

metabólitos podem ser detectados

e identificados de forma inequívoca

em uma medição.

Usando diferentes técnicas de EM,

é possível detectar milhares de

diferentes metabólitos; identificam

várias centenas.

Adaptado: EMWAS et al., 2019 NMR Spectroscopy for Metabolomics Research. Metabolites; 9, 123.

II.OBJETIVOS


Fernanda Priscila Santos Reginaldo

44

Considerando a diversidade de potencial fitoquímico e bioativo da família

Selaginellaceae, o fato de Selaginella convoluta ser endêmica na Caatinga, bioma que

possui condições edafoclimáticas peculiares, bem como a capacidade de tolerância a

dessecação dessa espécie, assim como seu potencial bioativo, os objetivos gerais dessa

tese foram: (i) realizar uma revisão bibliográfica da família Selaginellaceae; (ii) investigar

os metabólitos e proteínas envolvidos na tolerância a dessecação de S. convoluta; e por

fim (iii) avaliar a influência do metil jasmonato nos metabólitos especializados dessa

espécie.

Dessa maneira, os objetivos específicos propostos foram:

1. Realizar uma revisão do uso popular, potencial fitoquímico e bioativo da família

Selaginellaceae;

2. Investigar as proteínas possivelmente relacionadas à tolerância a dessecação (TD);

3. Realizar uma análise de metaboloma não direcionada através da técnica de RMN a fim

de anotar metabólitos primários e especializados relacionado à TD;

4. Realizar uma análise de metaboloma não direcionada através da técnica de CL-EM/EM

combinada com abordagem de molecular networking avaliando os metabólitos

especializados relacionados a TD, bem como a influência do metil jasmonato sobre estes.

III.ARTIGOS CIENTÍFICOS



III.I CAPÍTULO 1: Fernanda P. Santos Reginaldo; Isabelly C. Matos Costa; Raquel

B. Giordani. Selaginellaceae: traditional use, phytochemistry and

pharmacology. Boletín Latinoamericano y del Caribe de

Plantas Medicinales y Aromáticas 19:3 (2020).



Selaginellaceae: traditional use, phytochemistry and pharmacology

Fernanda P. Santos Reginaldo, Isabelly C. Matos Costa, Raquel B. Giordani

College of Pharmacy, Pharmacy Department. University of Rio Grande do Norte, Natal,

RN, Brazil.

Contacts: Raquel Brandt Giordani - E-mail address: [email protected]



Abstract

Selaginella is the only genus from Selaginellaceae, and it is considered a key factor in

studying evolution. The family managed to survive the many biotic and abiotic pressures

during the last 400 million years. The purpose of this review is to provide an up-to-date

overview of Selaginella in order to recognize their potential and evaluate future research

opportunities. Carbohydrates, pigments, steroids, phenolic derivatives, mainly

flavonoids, and alkaloids are the main natural products in Selaginella. A wide spectrum

of in vitro and in vivo pharmacological activities, some of them pointed out by folk

medicine, has been reported. Future studies should afford valuable new data on better

explore the biological potential of the flavonoid amentoflavone and their derivatives as

chemical bioactive entities; develop studies about toxicity and, finally, concentrate efforts

on elucidate mechanisms of action for biological properties already reported.

Keywords

Selaginella; Natural Products; Overview.



III.II CAPÍTULO 2: Fernanda P. Santos Reginaldo, Luiz F. Rodrigues de Souza,

Marlon D. Mariano dos Santos, Daisy S. Chacon, Taffarel M.

Torres, Ivanice B. Silva, Alan A. Roque, José Angelo S.

Zuanazzi, Carlos André O. Ricart, Mariana S. Castro, Paulo C.

Carvalho, Wagner Fontes, Marcelo V. Sousa, Arthur G. Fett-

Neto, Raquel B. Giordani. Proteomic analysis of Selaginella

convoluta: can the organ-specific approach provide insights into

the orchestrated events in the desiccation tolerance?

MANUSCRITO A SER SUBMETIDO AO PERIÓDICO Proteomics.



Proteomic analysis of Selaginella convoluta: can the organ-specific approach

provide insights into the orchestrated events in the desiccation tolerance?

“Dataset brief”

Fernanda Priscila Santos Reginaldo1#, Luiz Fernando Rodrigues de Souza1#, Marlon

Dias Mariano Santos7, Daisy Sotero Chacon1, Taffarel Melo Torres2, Ivanice Bezerra da

Silva1, Alan de Araújo Roque3, José Angelo S. Zuanazzi4, Carlos André O. Ricart5,

Mariana S. Castro5, Wagner Fontes5, Paulo Costa Carvalho7, Marcelo Valle de Sousa5,

Arthur Germano Fett-Neto6, Raquel Brandt Giordani1*

1 Laboratory of Pharmacognosy, Department of Pharmacy, Federal University of Rio

Grande do Norte, Natal, RN, Brazil.

2 Bioinformatic, Biostatistics and Computer Biology Nucleus, Rural Federal University

of Semiarid, Mossoró, RN, Brazil.

3 Institute for Sustainable Development and Environment, Dunas Park Herbario, Natal,

RN, Brazil.

4 Laboratory of Pharmacognosy, Federal University of Rio Grande do Sul, Porto Alegre,

RS, Brazil.

5 Laboratory of Protein Chemistry and Biochemistry, Department of Cell Biology,

University of Brasilia, Brasilia, DF, Brazil.

6 Plant Physiology Laboratory, Center for Biotechnology and Department of Botany,

Federal University of Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brazil.

7 Laboratory for Structural and Computational Proteomics, Carlos Chagas Institute,

Fiocruz, Curitiba, PR, Brazil.

Corresponding author: *[email protected] / Phone: +55(84)3342-9818 / Fax:

+55(84)3342-9834.

#Fernanda Priscila Santos Reginaldo and Luiz Fernando Rodrigues de Souza should be

considered joint first authors’.



Abstract

Selaginella convoluta is a desiccation tolerant (DT) plant native from Brazilian semiarid.

DT plants have highly effective drought-resistance mechanisms that allow their survival

under extreme conditions. This study aimed to perform a proteomics dataset brief of

shoots and roots of Selaginella convoluta in two hydration conditions: dehydrated –

harvested in the natural semiarid environment; and hydrated – after acclimatization in lab.

The proteome analysis was performed by gel-free liquid chromatography coupled to mass

spectrometry and data analysis using PatternLab for proteomics; this approach allowed

the annotation of 1176 proteins. The differentially abundant proteins were related to

signaling and regulation, stress and defense, carbohydrates and energy metabolism,

protein destination and storage, and protein synthesis. Interestingly, the major responses

showed by shoots were photosynthesis and proteins involved in stress and defense;

otherwise, roots showed as major response signaling and protein regulation. Overall, roots

and shoots appear to have the capacity to establish an antioxidant protective system both

in the dehydration and in the hydration by a well-orchestrated response for regulating

desiccation tolerance.

Keywords

Desiccation tolerant; LC-MS/MS; organ-specific; proteome; Selaginella convoluta.



III.III CAPÍTULO 3: Fernanda P. Santos Reginaldo, Rafael Freire, Isabelly C. M.

Costa, Ivanice Bezerra da Silva, Alan de Araújo Roque,

Fernando Hallwass, Ian Castro-Gamboa, Arthur Germano Fett-

Neto, Alberto J. Cavalheiro, Raquel B. Giordani. NMR-based

metabolite profiling of Selaginella convoluta in different

hydration states and the unprecedented occurrence of anabasine

in lycophytes. Phytochemistry Letters. 43: 75-79. 2021.



NMR-based metabolite profiling of Selaginella convoluta in different hydration

states and the unprecedented occurrence of anabasine in lycophytes

Fernanda P. Santos Reginaldo,a Rafael Freire,b Isabelly C. M. Costa,a Ivanice Bezerra

da Silva,a Alan de Araújo Roque,c Fernando Hallwass,d Ian Castro-Gamboa,e Arthur

Germano Fett-Neto,f Alberto J. Cavalheiro,e Raquel B. Giordani a,*

a Pharmacognosy Laboratory, Department of Pharmacy; Federal University of Rio

Grande do Norte (UFRN); Natal, RN, 59012-570; Brazil

b Medway Metabonomics Research Group; University of Greenwich (UoG); Chatham

Maritime, Kent, ME4 4TB; United Kingdom

c Institute for Sustainable Development and Environment, Dunas Park Herbarium;

Natal, RN, 59015-350; Brazil

d Department of Fundamental Chemistry; Federal University of Pernambuco (UFPE);

Recife, 50670-901; Brazil

e Chemistry Institute; São Paulo State University (UNESP); Araraquara, São Paulo,

14800-060; Brazil

f Plant Physiology Laboratory, Center for Biotechnology and Dept. of Botany, Federal

University of Rio Grande do Sul (UFRGS); Porto Alegre, RS, 91501970; Brazil

*[email protected] / Phone: +55(84)3342-9818 / Fax: +55(84)3342-9834.

Address: Gal. Gustavo Cordeiro de Farias Street, s/n, 59012-570, Natal, RN, Brazil.



ABSTRACT

Selaginella convoluta is a Brazilian endemic, desiccation tolerant plant with an effective

drought-resistance mechanism. Herein, nuclear magnetic resonance (NMR-based

metabolite profiling was used to investigate this species in different hydration states: dried

(harvested in the natural semiarid environment) and after rehydration. NMR is a suitable

tool for this analysis because it allows the simultaneous detection of secondary and

primary metabolites. To support NMR-based metabolite annotation, an in-house database

was built by including all the experimental 1H NMR spectral data reported for the natural

products previously identified in Selaginella spp. The analysis criteria were related to

spectral similarity values based on the algorithm of pattern recognition between the in-

house database and the 2D 1H-TOCSY-NMR experimental data. The in silico strategy

with a similarity threshold of 50%−100% between the experimental and virtual spectra

enabled the annotation of 86 metabolites. Among these, 49 metabolites showed a spectral

similarity of 100%. Notably, the isolation of the pyridine alkaloid anabasine from S.

convoluta shoots and its structural assignment provided new chemical information for

lycophytes. The multi-edaphoclimatic features of the Caatinga, an exclusively Brazilian

semiarid biome, may contribute to an altered metabolite profile associated with

desiccation.

Keywords:

NMR, nuclear magnetic resonance; SPE, solid-phase extraction



III.IV CAPÍTULO 4: Fernanda P. Santos Reginaldo, Paula C. Pires Bueno, Isabelly C.

Matos Costa, Alan A. Roque, Arthur G. Fett-Neto5, Alberto J.

Cavalheiro, Raquel B. Giordani. Molecular networking discloses

the chemical diversity of flavonoids and selaginellins in

Selaginella convoluta. Planta Medica 87:113–123. 2020



Molecular networking discloses the chemical diversity of flavonoids and

selaginellins in Selaginella convoluta

Fernanda Priscila Santos Reginaldo1, Paula Carolina Pires Bueno2,3, Isabelly Cristina

de Matos Costa1, Alan de Araújo Roque4, Arthur Germano Fett-Neto5, Alberto José

Cavalheiro6, Raquel Brandt Giordani1*

Affiliations

1 Department of Pharmacy; Federal University of Rio Grande do Norte (UFRN),

Natal/RN, Brazil.

2 Faculty of Pharmaceutical Sciences of Ribeirão Preto, University of São Paulo (FCFRP-

USP), Ribeirão Preto/SP, Brazil.

3 Max-Planck Institute of Molecular Plant Physiology, Potsdam-Golm, Germany.

4 Institute for Sustainable Development and Environment, Dunas Park Herbarium,

Natal/RN, Brazil.

5 Laboratory of Plant Physiology, Center for Biotechnology and Department of Botany,

Federal University of Rio Grande do Sul (UFRGS), Porto Alegre/RS, Brazil.

6 Institute of Chemistry, São Paulo State University (UNESP), Araraquara/SP, Brazil.

Correspondence

*Professor Raquel Brandt Giordani - [email protected] / Phone: +55(84)3342-9818

/ Fax: +55(84)3342-9834. Address: Gal. Gustavo Cordeiro de Farias Street, s/n, 59012-

570, Natal/RN, Brazil.



ABSTRACT

Selaginella convoluta is a desiccation tolerant plant native from the Brazilian semiarid

(Caatinga), endowed with an effective drought-resistance mechanism. As part of our

research efforts to understand the chemical diversity of Selaginella convoluta, dehydrated

(harvested in natural habitat under dry season) and hydrated (plant acclimated in

laboratory after rehydration) specimens were analyzed by HR-LC-ESI-MS/MS followed

by a structural annotation on the Global Natural Products Social Molecular Networking

(GNPS) Web platform. Molecular networking approach allowed the putative annotation

of 39 metabolites, mainly selaginellins and flavonoids. Based on MS/MS data, three

unprecedented selaginellin were annotated: 29-hydroxy selaginellin O, 29-hydroxy

selaginellin A, and 4-{[2-(4-hydrophenyl)-6-[2-(4-hydroxyphenyl)ethynyl]phenyl](4-

oxocyclohexa-2,5-dien-1-ylidene)methyl}cbenzaldehyde, Results pointed out that

valuable scientific knowledge can be obtained from studies conducted with plants in their

natural habitat by allowing a more realistic profile of chemical diversity. The present

study adds new information on specialized metabolites of S. convoluta, mainly flavonoids

and selaginellins, and highlights the species as an untapped source of chemobiodiversity

from Caatinga.

Keywords

Selaginella convoluta, Selaginellaceae, selaginellins, flavonoids, Caatinga.



III.V CAPÍTULO 5: Fernanda Priscila Santos Reginaldo, Paula Carolina Pires Bueno,

Estela Mariana Guimarães Lourenço, Isabelly Cristina de Matos

Costa, Letícia Gondim Lambert Moreira, Alan de Araújo Roque4,

Euzébio Guimarães Barbosa, Arthur Germano Fett-Neto, Alberto

José Cavalheiro, Raquel Brandt Giordani. Methyl jasmonate-

induced potentially bioactive selaginellins accumulation in

Selaginella convoluta.

MANUSCRITO A SER SUBMETIDO AO PERIÓDICO Journal of Natural Products



Methyl jasmonate-induced potentially bioactive selaginellins accumulation in

Selaginella convoluta

Fernanda Priscila Santos Reginaldo1, Paula Carolina Pires Bueno2,3, Estela Mariana

Guimarães Lourenço1,7, Isabelly Cristina de Matos Costa1, Letícia Gondim Lambert

Moreira1, Alan de Araújo Roque4, Euzébio Guimarães Barbosa1, Arthur Germano Fett-

Neto5, Alberto José Cavalheiro6, Raquel Brandt Giordani1*

Affiliations

1 Department of Pharmacy; Federal University of Rio Grande do Norte (UFRN),

Natal/RN, Brazil.

2 Faculty of Pharmaceutical Sciences of Ribeirão Preto, University of São Paulo (FCFRP-

USP), Ribeirão Preto/SP, Brazil.

3 Max-Planck Institute of Molecular Plant Physiology, Potsdam-Golm, Germany.

4 Institute for Sustainable Development and Environment, Dunas Park Herbarium,

Natal/RN, Brazil.

5 Laboratory of Plant Physiology, Center for Biotechnology and Department of Botany,

Federal University of Rio Grande do Sul (UFRGS), Porto Alegre/RS, Brazil.

6 Institute of Chemistry, São Paulo State University (UNESP), Araraquara/SP, Brazil.

7 Faculty of Pharmaceutical Sciences, Food and Nutrition, Federal University of Mato

Grosso do Sul, Campo Grande, MS, Brazil.

Correspondence

*Professor Raquel Brandt Giordani - [email protected] / Phone: +55(84)3342-9818

/ Fax: +55(84)3342-9834. Address: Gal. Gustavo Cordeiro de Farias Street, s/n, 59012-

570, Natal/RN, Brazil.



Abstract

The chemotaxonomy of Selaginella spp. is interesting mainly regarding selaginellins an

unusual pigment class potentially bioactive. Although being important chemical markers

for the genus, selaginellins are naturally produced at low levels in the plant, which makes

their isolation and chemical characterization difficult, time consuming and impair

biological tests. However, the induction of the corresponded biosynthetic pathways with

methyl jasmonate (MeJA) could be an alternative to increase the content of specialized

metabolites, especially those with pharmaceutical interest. As part of our efforts in

investigate the desiccation tolerant Selaginella convoluta, a medicinal plant found in

northeastern Brazil, herein, specimens MeJa-treated (50, 100 M; 12, 24 and 48h) were

analyzed by liquid chromatography coupled to mass spectrometry. The results pointed

out that the exogenous MeJA significantly increased the phenolic derivatives content, and

selaginellins was the main metabolite class affected by the MeJA treatment. The amount

of Selaginellin G increased in 5.63-fold relative to control. Seven unprecedented

selaginellins were annotated herein by molecular networking approach, besides other

ones previously reported. Additionally, the in silico bioactive potential of the annotated

selaginellins was evaluated. The results pointed out significant antineurodegenerative,

antiproliferative, and antiparasitic potential activities. Taken together, our results pointed

out that the phytohormone MeJA could be an interesting alternative to induce potentially

bioactive selaginellins accumulation in S. convoluta.

Keywords

Selaginellaceae. MeJA. Selaginellins. Phenolic derivatives. Lycophytes

IV.DISCUSSÃO GERAL



A família Selaginellaceae possui diversas espécies que são reconhecidas por suas

atividades farmacológicas, as quais tem sido evidenciada por sua ampla utilização pelas

culturas indígenas (WENG; NOEL, 2013) e na medicina tradicional indiana (Sistema

Ayurverda) (SAH et al., 2005). Em Shen Nong Ben Cao Jing (The Divine Farmer’s

Materia Medica) 2737 a.C. está relatada a mais antiga documentação de tratamentos

baseados no uso da Selaginella, na qual espécies deste gênero foram usadas para tratar

inflamação, amenorreia e protuberâncias abdominais em mulheres (YANG, 1998).

Selaginella tem sido utilizada, em vários países para tratamento de uma diversidade de

doenças como câncer, problemas cardiovasculares diabetes, gastrite, hepatite, doenças de

pele e infecções do trato urinário (REGINALDO, F.P.S. et al., 2020). Estudos evidenciam

que extratos de algumas espécies de Selaginella demonstraram ter atividade

antinociceptiva (SÁ et al., 2012), anti-inflamatória, atividade antimutagênica,

antiespasmódica, imunoestimulante e como agente inibidor de transcriptase reversa

(REGINALDO, F.P.S. et al., 2020).

Selaginellaceae demonstra ser um interessante objeto de estudo com uma enorme

gama de potenciais a serem explorados. Conforme descrito no capítulo I, um amplo

espectro de atividades farmacológicas de espécies dessa família foi relatado, nas quais

algumas delas foram apontadas pela medicina popular. De modo geral, os principais

potenciais bioativos investigados para as espécies de Selaginella foram antimicrobiano,

antiparasitário, antifúngico, citotóxico, antioxidante e anti-hiperglicemiante.

Carboidratos, pigmentos, esteroides, derivados fenólicos, principalmente flavonoides, e

alcaloides são os principais produtos naturais de Selaginella. Além disso, diversas

espécies de Selaginellaceae tem demonstrado também ser um interessante objeto de

estudo no tocante aos potenciais químico e bioativo, visto que ainda foram pouco

explorados. Os estudos futuros devem fornecer dados para melhor explorar o (i) potencial

biológico das moléculas bioativas dessa família; (ii) desenvolver estudos sobre a

toxicidade e, (iii) por último, concentrar esforços em elucidar mecanismos de ação para

propriedades biológicas já relatadas. (Dados compilados e publicados em: Reginaldo et

al. 2020. Selaginellaceae: traditional use, phytochemistry and pharmacology.

Blacpma 19:3). Os principais dados de uso popular, fitoquímica e farmacologia da família

Selaginellaceae estão sumarizados na figura 1.



Além dos pontos acima elencados apontando a família Selaginellaceae como uma

interessante ferramenta de estudo, é importante destacar que essa é uma família possui

mais de 400 milhões de anos de evolução, resistindo a diversas pressões bióticas e

abióticas durante seu processo evolutivo, conferindo a algumas espécies o interessante

traço evolutivo de tolerância à dessecação (BANKS, 2009).

Figura 1 Resumo dos mais importantes aspectos descritos na literatura sobre uso

popular, fitoquímica e farmacologia de Selaginellaceae.


Nesse contexto, a investigação de redes regulatórias e metabólicas que conferem

tolerância à dessecação demonstram ser um interessante objeto de estudo, visto que

possuem um enorme potencial para o melhoramento de plantas agrícolas, particularmente

à medida em que os padrões climáticos globais mudam e os períodos de seca e

precipitação inconsistente se tornam mais comuns (FERNÁNDEZ-MARÍN et al., 2016).

A tolerância à dessecação (TD) envolve mais do que simplesmente ser capaz de resistir

ao estado desidratado – plantas tolerantes à dessecação podem resistir a um conteúdo de

água < 10% nos seus tecidos vegetativos e se recuperar desse estado (CUSHMAN;

OLIVER, 2011). TD é um traço evolutivo muito raro e algumas espécies de

Selaginellaceae possuem essa habilidade adaptativa (BANKS, 2009). Selaginella

convoluta é uma espécie endêmica na Caatinga, dotada do interessante traço evolutivo de



tolerância a dessecação (GAFF, 1987). Estudos ômicos tem investigado os mecanismos

moleculares envolvidos na tolerância à dessecação das espécies S. tamariscina (WANG

et al., 2010), S. lepidophylla (YOBI et al., 2013) e S. bryopteris (DEEBA et al., 2016).

No entanto, no tocante a S. convoluta não havia dados reportados na literatura sobre os

eventos orquestrados na tolerância dessecação para essa espécie antes do presente

trabalho.

Os capítulos II, III e IV reportam a investigação de S. convoluta em dois estados

de hidratação: (i) planta no estado desidratado ‒ conforme encontrada em campo na

Caatinga; e (ii) planta no estado hidratado ‒ reidratação adquirida em laboratório.

Conforme descrito no capítulo II, partes aéreas e raízes parecem ter estratégias similares

em resposta aos diferentes estados de hidratação. Além disso, a estratégia de análise

proteômica órgão-específica mostrou um maior número de proteínas diferencialmente

abundantes no estado desidratado nas partes aéreas do que nas raízes.

A estratégia órgão-específico apontou que os eventos envolvidos na TD não

somente ocorrem de forma bem orquestrada entre partes aéreas e raízes, mas também são

complexos e integrados. A figura 2 mostra uma representação esquemática integrando as

respostas a TD baseado em estudos de proteoma de espécies de Selaginella tolerantes à

dessecação. Nessa representação esquemática das respostas envolvidas na TD,

observamos que S. convoluta parece compartilhar com outras espécies de Selaginella

processos relacionados à TD principalmente a fotossíntese, sistema antioxidante e

metabolismo de proteínas, bem como o mecanismo morfológico do enrolamento do caule.

Além disso, a homoioclorofila, é uma resposta fisiológica ao TD que S. convoluta

compartilha com S. bryopteris e S. lepidophylla. Por outro lado, não observamos nenhuma

resposta espécie-específica relacionada à TD em S. convoluta; entretanto, foi possível

observar que outras espécies de Selaginella parecem ter respostas espécie-específicas

relacionadas à TD (Figura 2).

De modo geral, partes aéreas e raízes parecem ter a capacidade de estabelecer um

sistema de proteção antioxidante tanto durante a desidratação quanto no processo de

reidratação. A análise de interações proteína-proteína sugeriu que partes aéreas e raízes

parecem ter uma resposta bem orquestrada para regular a tolerância à dessecação nesta

espécie. A análise por Blastkoala indicou a presença de enzimas envolvidas na

biossíntese de metabólitos especializados como fenólicos, terpenoides, bem como

metabólitos contendo nitrogênio/enxofre.



Figura 2 Representação esquemática de respostas compartilhadas e específicas de

espécies de Selaginella estudadas pela abordagem de proteoma.


No capítulo III, o perfil metabólico baseado em RMN apontou a presença de

metabólitos como carboidratos e fenólicos numa resposta bem coordenada para regular

os eventos relacionados a TD, corroborando com os dados de proteoma ‒ capítulo II. As

análises de dados tiveram como critérios os valores de similaridade espectral baseados no

algoritmo de reconhecimento de padrões entre o banco de dados interno e os dados

experimentais 2D 1H-TOCSY-RMN. Essa estratégia in silico permitiu a anotação de 86

metabólitos com uma faixa de similaridade de 50% − 100% frente a dados espectrais de

metabólitos (primários e secundários) previamente relatados na literatura para o gênero.

Dentre eles, 49 metabólitos apresentaram similaridade espectral de 100%. O diagrama de

venn mostrou a distribuição dos metabólitos anotados entre os órgãos e estados de

hidratação (Figura 3). Diversos metabólitos primários foram anotados (carboidratos,

aminoácidos, poliaminas e nucleotídeos), os quais possuem uma relação bem estabelecida

com estresse abiótico em vários estudos disponíveis na literatura. Os metabólitos

especializados, flavonoides, biflavonoides e selaginelinas foram os principais derivados



fenólicos anotados. Essa quimiodiversidade de derivados fenólicos é intrinsecamente

relacionada com as características de TD, visto que as características mais típicas não são

apenas um alto acúmulo de carboidratos e aminoácidos, mas também alterações nos

fenilpropanoides, levando a perfis diferenciais de flavonoides (RASMUSSEN et al.,

2012; ARBONA et al., 2013). O gênero Selaginella é caracterizado pela presença de

amentoflavona como o principal biflavonoide (metabólito majoritário) (GEIGER, H.,

QUINN, 1988), que também foi caracterizado em S. convoluta.

Além disso, treze alcaloides foram anotados em S. convoluta. Embora dados

reportados na literatura apontem que os alcaloides possam ter um interessante potencial

antioxidante (MATSUURA et al., 2014), o papel específico desses metabólitos nos

processos de hidratação/desidratação ainda precisa ser estabelecido. Como um achado

inédito, o alcaloide anotado mais importante foi a anabasina. A anabasina foi isolada a

partir das PA, sendo caracterizada e elucidada através das técnicas de RMN e EM (Figura

3). Os sinais propostos para anabasina no espectro de 1H-TOCSY-RMN do extrato

metanólico de partes aéreas (antes dos procedimentos de isolamento) reforçam a

descoberta de que é um produto natural, descartando a possibilidade de um artefato

(Dados compilados e publicados em: Reginaldo et al. 2021. NMR-based metabolite

profiling of Selaginella convoluta in different hydration states and the unprecedented

occurrence of anabasine in lycophytes. Phytochemistry Letters. 43: 75-79).

A anabasina é um alcaloide encontrado em espécies de Nicotiana, que também

ocorre junto com a nicotina em algumas angiospermas. Até o momento, não existem

relatos da presença deste alcaloide em Selaginellaceae. Alcaloides foram relatados em S.

doederleinii (CHAO et al., 1987, 1990), S. moellendorfii (WANG et al., 2009) e S.

tamariscina (ZHENG et al., 2004); entretanto, nenhum deles está biossinteticamente

relacionado à anabasina. A relevância da anabasina contra o estresse biótico está bem

estabelecida (SINCLAIR et al., 2004), particularmente em Nicotiana glauca (DEBOER

et al., 2013). No entanto, não há dados reportados na literatura apontando a função da

anabasina no estresse abiótico. S. convoluta é uma das linhagens mais antigas de plantas

vasculares, e a ocorrência de anabasina em licófitas é inesperada. Não está claro se esta

ocorrência está relacionada às condições ambientais peculiares da Caatinga onde S.

convoluta ocorre e se uma função desse alcaloide poderia estar relacionada à mitigação



de espécies reativas de oxigênio e/ou proteção UV (LARSON; MARLEY, 1984;

NASCIMENTO et al., 2013).

Figura 3 (A): Diagrama de venn mostrando a distribuição dos metabólitos anotados

por RMN de Selaginella convoluta; (B): anabasina – alcaloide isolado.


Conforme descrito no capítulo III, a quimiodiversidade nas amostras estudo

quando analisadas pela ferramenta de RMN permite apenas verificar se em S. convoluta

ocorre ou não metabólitos previamente descritos no gênero. Embora essa estratégia

apresente a vantagem de analisar em uma mesma amostra simultaneamente metabólitos

de diferentes polaridades e características estruturais, percebe-se a desvantagem de

identificar estruturas inéditas na literatura. Considerando que flavonoides e selaginelinas

foram os principais metabólitos especializados anotados na análise por RMN, abriu-se a

perspectiva de investigar de forma mais detalhada a ocorrência de novas entidades

químicas por outras ferramentas analíticas.

Desse modo, o capítulo IV tem como enfoque reportar a quimiodiversidade de

flavonoides e selaginelinas utilizando a técnica de LC-MS/MS combinada com a

abordagem de molecular networking (MN). A abordagem de MN permitiu a anotação de

39 metabólitos especializados, principalmente selaginelinas e flavonoides. Na figura 4 as

principais famílias moleculares associadas ao estresse hídrico foram destacadas, bem



como um diagrama de venn gerado usando o plugin Venn and Euler Diagrams do

software cytoscape para comparação quantitativa de íons registrados no Molecular

Networking entre os órgãos e os diferentes estados de hidratação. Baseado nos dados de

MS/MS, três selaginelinas não descritas na literatura até o momento foram anotadas: 29-

hidroxi-selaginelina O, 29-hidroxi-selaginelina A e 4 - {[2- (4-hidrofenil) -6- [2- (4-

hidroxifenil) etinil] fenil] (4-oxociclohexa-2,5-dien-1-ilideno) metil} benzaldeído. Até o

momento, este foi o primeiro estudo sobre Selaginella spp. usando a abordagem de MN

que mostrou não somente uma proposta do padrão de fragmentação para todas as

selaginelinas anotadas, mas também a predição de novas selaginelinas com base nos

dados espectrais MS/MS (Dados compilados e publicados em: Reginaldo et al. 2020.

Molecular networking discloses the chemical diversity of flavonoids and selaginellins in

Selaginella convoluta. Planta Medica. 87:113–123).

Figure 4 (A): Molecular networking dos dados de EM/EM obtidos no modo positivo

de ionização para Selaginella convoluta mostrando as principais famílias moleculares

associadas ao estresse hídrico; (B): Diagrama de venn com o total de íons observados

entre as amostras. Self-loops foram excluídos.




Diversos potenciais biológicos de biflavonoides e selaginelinas de Selaginella

spp. foram relatados, dentre eles citotóxico, antiviral, antiprotozoário, antioxidante e anti-

hiperglicemiante. Ainda, esses metabólitos demonstraram ter um potencial protetor em

doenças cardiovasculares e neurodegenerativas (REGINALDO, F.P.S. et al., 2020). As

selaginelinas são produzidas naturalmente em níveis baixos na planta, o que torna a

extração química desses metabólitos difícil e demorada. Nesse contexto, o metil

jasmonato (MeJA) tem sido utilizado para induzir metabólitos especializados de interesse

farmacêutico. MeJA é um fitohormônio que desempenha papeis importantes na regulação

do crescimento vegetal e na sinalização de estresse endógeno e/ou exógeno (BLECHERT

et al., 1995; MEMELINK et al., 2001). Estudos relataram o uso de MeJA exógeno como

indutor de estresse para aumentar metabólitos especializados com importante potencial

bioativo em várias espécies de angiospermas (ZHANG et al., 2018; FRASER et al., 2020;

CHEN et al., 2020). No entanto, até o momento, não há relatos de tratamento com MeJA

para plantas da divisão Lycopodiophyta. Diante disso, conforme descrito no capítulo V,

realizamos um ensaio para examinar os efeitos do fitohormônio MeJA na indução de

metabólitos especializados, principalmente selaginelinas em S. convoluta. Os resultados

apontaram que o MeJA exógeno aumentou significativamente o conteúdo de derivados

fenólicos, sugerindo que as rotas biossintéticas associadas a esses metabólitos poderiam

ser reguladas positivamente pelo MeJA. A principal classe de metabólitos anotada e

afetada pelo tratamento com MeJA foram as selaginelinas. A selaginelina G foi a

selaginelina mais afetada pelo tratamento com MeJA, aumentando 5,63 vezes em relação

ao controle. De acordo com a rota de biossíntese das selaginelinas, a selaginelina G é

produzida sequencialmente por meio de desidroxilação, hidrogenação, desidroxilação e

redução a partir do intermediário β-hidroxicetona. As demais selaginelinas são

produzidas a partir da selaginelina G (SHI et al., 2012). Portanto, um maior acúmulo de

Selaginelina G pode resultar em um acúmulo de outras selaginelinas. Este padrão foi

observado para selaginelina, selaginelina A e selaginelina B nas partes aéreas na

concentração de 50 µM e 100 µM de MeJA em 24h, bem como em 100 µM de MeJA em

48h. No entanto, na concentração de 50 µM MeJA em 48h este padrão não foi observado

para selaginelina e selaginelina B. Adicionalmente, neste estudo, foi realizado o potencial

bioativo das selaginelinas por atividade in silico. Os resultados apontaram um interessante

potencial antineurodegenerativo, antiproliferativo e antiparasitário. Ainda, a abordagem

de molecular networking permitiu a predição de sete selaginelinas até então não descritas



na literatura. Essas selaginelinas preditas contribuem como uma nova informação química

para esta espécie. De modo geral, os nossos resultados apontaram que o MeJA pode ser

uma alternativa interessante para induzir o acúmulo de selaginelinas.

Finalmente, os dados aqui obtidos demonstram que a família Selaginellaceae é um

interessante objeto de estudo, visto que possui potencial bioativo e muitas espécies com

a quimiodiversidade até então pouco explorada. A aplicação de diferentes abordagens

ômicas num cenário complementar entre proteoma e metaboloma (RMN e LC-MS/MS-

MN) mostra ser uma estratégia correta capaz de fornecer dados robustos e mais próximos

do que ocorre naturalmente na planta. A expressiva quimiodiversidade observada em S.

convoluta, principalmente representada pela ocorrência de anabasina com grande

relevância quimiotaxonômica e pela anotação de dez moléculas inéditas de selaginelinas.

Finalmente, os resultados apontam para novas perspectivas de aprofundamento de

estudos de viés biotecnológico com a espécie, uma vez que indicamos a eficiência do

MeJA na elicitação de selaginelinas e exploramos dados de proteoma em diferentes

aspectos de hidratação. Os desdobramentos científicos desta tese são imensuráveis neste

momento, e os resultados aqui apresentados apontam para a necessidade de pesquisas na

área de produtos naturais utilizando ferramentas na fronteira do conhecimento para que

os resultados sejam efetivamente robustos.

V.CONCLUSÕES GERAIS



Os resultados apresentados nesta tese demonstraram que a família Selaginellaceae

tem diversos potenciais de estudo a serem explorados englobando da fitoquímica a

atividade biológica. Ainda, S. convoluta é uma interessante ferramenta de estudo tanto no

que se refere a investigação dos eventos envolvidos na tolerância a dessecação como em

relação a sua interessante diversidade química e potenciais bioativos pouco explorados.

Os dados aqui obtidos permitem as seguintes conclusões:

1. A família Selaginellaceae demonstra ser uma interessante ferramenta de estudos no que

se refere ao potencial fitoquímico e bioativo. Estudos de toxicidade e mecanismo de ação

até então ainda não foram explorados para os metabólitos de diversas espécies desta

família com potencial bioativo reportado.

2. Os dados de proteoma indicaram que partes aéreas e raízes parecem utilizar estratégias

similares para lidar com os eventos relacionados a tolerância à dessecação, possuindo um

robusto sistema antioxidante. Ainda, os dados de interação proteína-proteína apontam

que raízes e partes aéreas respondem a esses eventos de modo bem orquestrado.

3. Carboidratos, aminoácidos, poliaminas, e nucleotídeos foram os principais metabólitos

primários anotados por RMN. Ao passo que, flavonoides, biflavonoides e selaginelinas

foram os principais metabólitos secundários anotados. Ainda, um alcaloide inédito para

licófitas foi isolado, caracterizado e elucidado: anabasina. Este achado contribuiu como

uma importante informação referente à quimiotaxonomia das licófitas.

4. Abordagem de Molecular Networking revelou a diversidade química de uma

interessante classe de metabólitos: selaginelinas. Esta abordagem permitiu ainda a

predição de 3 novas selaginelinas com base nos dados espectrais, bem a proposta do perfil

de fragmentação para todas as selaginelinas anotadas.



5. O Metil jasmonato exógeno parece regular positivamente a biossíntese dos derivados

fenólicos. Selaginelina foi a principal classe de metabólitos anotada e verificou-se que

seu teor é influenciado pelo tratamento com MeJA. Os estudos in silico apontaram que

esta classe demonstrou ter um interessante potencial antineurodegenerativo,

antiproliferativo e antiparasitário. Os dados de molecular networking permitiram a

predição de sete novas selaginelinas.

VI. REFERÊNCIAS

82

ABDALLAH, C.; DUMAS-GAUDOT, E.; RENAUT, J.; SERGEANT, K. Gel-Based and Gel-

Free Quantitative Proteomics Approaches at a Glance. International Journal of Plant Genomics,

v. 2012, p. 1–17, 2012.

ALEJO-JACUINDE, G.; GONZÁLEZ-MORALES, S. I.; OROPEZA-ABURTO, A.;

SIMPSON, J.; HERRERA-ESTRELLA, L. Comparative transcriptome analysis suggests

convergent evolution of desiccation tolerance in Selaginella species. BMC Plant Biology, v. 20,

n. 1, 2020.

ALLARD, P.-M.; PÉRESSE, T.; BISSON, J.; et al. Integration of Molecular Networking and

In-Silico MS/MS Fragmentation for Natural Products Dereplication. Analytical Chemistry, v.

88, n. 6, p. 3317–3323, 2016.

AMBRÓSIO, S. T.; MELO, N. F. New Records of Pteridophytes in the Semi-Arid Region of

Brazil. American Fern Journal, v. 91, n. 4, 2001.

ARBONA, V.; MANZI, M.; OLLAS, C.; GÓMEZ-CADENAS, A. Metabolomics as a Tool to

Investigate Abiotic Stress Tolerance in Plants. International Journal of Molecular Sciences, v.

14, n. 3, p. 4885–4911, 2013.

BAGINSKY, S. Plant proteomics: Concepts, applications, and novel strategies for data

interpretation. Mass Spectrometry Reviews, v. 28, n. 1, 2009.

BANKS, J. A. Selaginella and 400 million years of separation. Annual Review of Plant

Biology, v. 60, 2009.

BLECHERT, S.; BRODSCHELM, W.; HOLDER, S.; et al. The octadecanoic pathway: signal

molecules for the regulation of secondary pathways. Proceedings of the National Academy of

Sciences, v. 92, n. 10, p. 4099–4105, 1995.

CANOVAS, F. M.; DUMAS-GAUDOT, E.; RECORBET, G.; JORRIN, J.; MOCK, H. P.;

ROSSIGNOL, M. Plant proteome analysis. Proteomics, v. 4(2), p. 285–98, 2004.

CASTANO-DUQUE, L. M.; CUSHMAN, J. C. University of Nevada , Reno. 2010.

CHACON, D. S.; TORRES, T. M.; SILVA, I. B. DA; et al. Erythrina velutina Willd. alkaloids:

Piecing biosynthesis together from transcriptome analysis and metabolite profiling of seeds and

leaves. Journal of Advanced Research, 2021.

CHAO, L. R.; SEGUIN, E.; SKALTSOUNIS, A.-L.; TILLEQUIN, F.; KOCH, M. Synthesis of

the Glycoalkaloids of Selaginella doederleinii and Structure Revision of One of Them. Journal

of Natural Products, v. 53, n. 4, p. 882–893, 1990.

CHAO, L. R.; SEGUIN, E.; TILLEQUIN, F.; KOCH, M. New Alkaloid Glycosides from

Selaginella doederleinii. Journal of Natural Products, v. 50, n. 3, p. 422–426, 1987.

CHEN, J.; WANG, J.; WANG, R.; et al. Integrated metabolomics and transcriptome analysis on

flavonoid biosynthesis in safflower (Carthamus tinctorius L.) under MeJA treatment. BMC

Plant Biology, v. 20, n. 1, p. 353, 2020.

83

CUSHMAN, J. C.; OLIVER, M. J. Understanding Vegetative Desiccation Tolerance Using

Integrated Functional Genomics Approaches Within a Comparative Evolutionary Framework.

2011.

DEBOER, K. D.; DALTON, H. L.; EDWARD, F. J.; RYAN, S. M.; HAMILL, J. D. RNAi-

mediated down-regulation of ornithine decarboxylase (ODC) impedes wound-stress stimulation

of anabasine synthesis in Nicotiana glauca. Phytochemistry, v. 86, p. 21–28, 2013.

DEEBA, F.; PANDEY, A. K.; PANDEY, V. Organ specific proteomic dissection of Selaginella

bryopteris undergoing dehydration and rehydration. Frontiers in Plant Science, v. 7, n.

APR2016, 2016.

DEEBA, F.; PANDEY, V.; PATHRE, U.; KANOJIYA, S. Proteome analysis of detached

fronds from a resurrection plant Selaginella bryopteris - response to dehydration and

rehydration. Journal of Proteomics and Bioinformatics, v. 2, n. 2, 2009.

DINAKAR, C.; BARTELS, D. Desiccation tolerance in resurrection plants: New insights from

transcriptome, proteome, and metabolome analysis. Frontiers in Plant Science, 2013.

DINAKAR, C.; DJILIANOV, D.; BARTELS, D. Photosynthesis in desiccation tolerant plants:

Energy metabolism and antioxidative stress defense. Plant Science, v. 182, p. 29–41, 2012.

DIXON, R. A.; STRACK, D. Phytochemistry meets genome analysis, and beyond.

Phytochemistry, 2003.

DUNN, W. B.; ERBAN, A.; WEBER, R. J. M.; et al. Mass appeal: Metabolite identification in

mass spectrometry-focused untargeted metabolomics. Metabolomics, 2013.

EMWAS, A.-H.; ROY, R.; MCKAY, R. T.; et al. NMR Spectroscopy for Metabolomics

Research. Metabolites, v. 9, n. 7, p. 123, 2019.

FARRANT, J.; BRANDT, W.; LINDSEY, G. An overview of mechanisms of desiccation

tolerance in selected angiosperm resurrection plants. Plant Stress, v. 1, n. 1, 2007.

FARRANT, J. M. Mechanisms of Desiccation Tolerance in Angiosperm Resurrection Plants.

Plant Desiccation Tolerance, 2008.

FERNÁNDEZ-MARÍN, B.; HOLZINGER, A.; GARCÍA-PLAZAOLA, J. I. Photosynthetic

strategies of desiccation-tolerant organisms. Handbook of Photosynthesis, Third Edition, 2016.

FIEHN, O. Metabolomics - The link between genotypes and phenotypes. Plant Molecular

Biology, v. 48, n. 1–2, 2002.

FIEHN, O.; KOPKA, J.; DÖRMANN, P.; et al. Metabolite profiling for plant functional

genomics. Nature Biotechnology, v. 18, n. 11, p. 1157–1161, 2000.

FRASER, V. N.; PHILMUS, B.; MEGRAW, M. Metabolomics analysis reveals both plant

variety and choice of hormone treatment modulate vinca alkaloid production in Catharanthus

roseus. Plant Direct, v. 4, n. 9, 2020.

FRIEDMAN, W. E. Plant genomics: Homoplasy heaven in a lycophyte genome. Current

Biology, 2011.

84

GAFF, D. F. Desiccation-tolerant flowering plants in Southern Africa. Science, v. 174, n. 4013,

1971.

GAFF, D. F. Desiccation tolerant plants in South America. Oecologia, v. 74, n. 1, 1987.

GALL, G. LE; COLQUHOUN, I. J.; DEFERNEZ, M. Metabolite Profiling Using 1 H NMR

Spectroscopy for Quality Assessment of Green Tea, Camellia sinensis (L.). Journal of

Agricultural and Food Chemistry, v. 52, n. 4, p. 692–700, 2004.

GEIGER, H., QUINN, C. Biflavonoids, in: The flavonoids: advances in research since 1980. . d.

J. B. H ed., v. 99–124, 1988.

GUTSCH, A.; SERGEANT, K.; RENAUT, J. Application of bottom‑up and top‑down

proteomics in Medicago spp. The Model Legume Medicago truncatula. p.1087–1095, 2020.

Wiley.

GYGI, S. P.; CORTHALS, G. L.; ZHANG, Y.; ROCHON, Y.; AEBERSOLD, R. Evaluation of

two-dimensional gel electrophoresis-based proteome analysis technology. Proceedings of the

National Academy of Sciences of the United States of America, v. 97, n. 17, 2000.

HALL, R.; BEALE, M.; FIEHN, O.; et al. Plant metabolomics: The missing link in functional

genomics strategies. Plant Cell. v. 14, 2002.

HALL, R. D. Plant metabolomics: From holistic hope, to hype, to hot topic. New Phytologist,

2006.

HAN, X.; JIANG, X. A review of lipidomic technologies applicable to sphingolipidomics and

their relevant applications. European Journal of Lipid Science and Technology, v. 111, n. 1, p.

39–52, 2009.

HOEKSTRA, F. A.; GOLOVINA, E. A.; BUITINK, J. Mechanisms of plant desiccation

tolerance. Trends in Plant Science, v. 6, n. 9, p. 431–438, 2001.

ITURRIAGA, G.; CUSHMAN, M. A. F.; CUSHMAN, J. C. An EST catalogue from the

resurrection plant Selaginella lepidophylla reveals abiotic stress-adaptive genes. Plant Science,

v. 170, n. 6, 2006.

KIM, H. K.; CHOI, Y. H.; VERPOORTE, R. NMR-based metabolomic analysis of plants.

Nature Protocols, 2010.

KRANNER, I.; BECKETT, R. P.; WORNIK, S.; ZORN, M.; PFEIFHOFER, H. W. Revival of

a resurrection plant correlates with its antioxidant status. Plant Journal, v. 31, n. 1, 2002.

KRANNER, I.; BIRTIĆ, S. A modulating role for antioxidants in desiccation tolerance.

Integrative and Comparative Biology. v. 45, 2005.

KRISHNAN, P. Metabolite fingerprinting and profiling in plants using NMR. Journal of

Experimental Botany, v. 56, n. 410, p. 255–265, 2004.

LARSON, R. A.; MARLEY, K. A. Quenching of singlet oxygen by alkaloids and related

nitrogen heterocycles. Phytochemistry, v. 23, n. 10, p. 2351–2354, 1984.

LITTLE, D. P.; MORAN, R. C.; BRENNER, E. D.; STEVENSON, D. W. Nuclear genome size

in Selaginella. Genome, v. 50, n. 4, 2007.

85

LIU, M. SEN; CHIEN, C. TE; LIN, T. P. Constitutive components and induced gene expression

are involved in the desiccation tolerance of Selaginella tamariscina. Plant and Cell Physiology,

v. 49, n. 4, 2008.

MARTÍNEZ-CORTÉS, T.; POMAR, F.; ESPIÑEIRA, J. M.; MERINO, F.; NOVO-UZAL, E.

Purification and kinetic characterization of two peroxidases of Selaginella martensii Spring.

involved in lignification. Plant Physiology and Biochemistry, v. 52, p. 130–139, 2012.

MATSUURA, H. N.; RAU, M. R.; FETT-NETO, A. G. Oxidative stress and production of

bioactive monoterpene indole alkaloids: biotechnological implications. Biotechnology Letters,

v. 36, n. 2, p. 191–200, 2014.

MEMELINK, J.; VERPOORTE, R.; KIJNE, J. W. ORCAnization of jasmonate-responsive gene

expression in alkaloid metabolism. Trends in Plant Science, v. 6, n. 5, p. 212–219, 2001.

MERCKE, P.; KAPPERS, I. F.; VERSTAPPEN, F. W. A.; et al. Combined Transcript and

Metabolite Analysis Reveals Genes Involved in Spider Mite Induced Volatile Formation in

Cucumber Plants. Plant Physiology, v. 135, n. 4, p. 2012–2024, 2004.

NASCIMENTO, N. C.; MENGUER, P. K.; SPEROTTO, R. A.; ALMEIDA, M. R. DE; FETT-

NETO, A. G. Early Changes in Gene Expression Induced by Acute UV Exposure in Leaves of

Psychotria brachyceras, a Bioactive Alkaloid Accumulating Plant. Molecular Biotechnology, v.

54, n. 1, p. 79–91, 2013.

OLIVEIRA, A. A. Q.; MORAES, M. G. Dehydration and rehydration in Selaginella sellowii

Hieron . aerial parts , a desiccation tolerant species. Bol. Mus. Biol. Mello Leitão, v. 37, n. 4, p.

393–403, 2015.

OLIVER, M. J.; TUBA, Z.; MISHLER, B. D. The evolution of vegetative desiccation tolerance

in land plants. Plant Ecology, v. 151, n. 1, 2000.

RAFSANJANI, A.; BRULÉ, V.; WESTERN, T. L.; PASINI, D. Hydro-responsive curling of

the resurrection plant Selaginella lepidophylla. Scientific Reports, v. 5, 2015.

RASMUSSEN, S.; PARSONS, A. J.; JONES, C. S. Metabolomics of forage plants: a review.

Annals of Botany, v. 110, n. 6, p. 1281–1290, 2012.

REGINALDO, F. P. S.; BUENO, P. C. P.; COSTA, I. C. D. M.; et al. Molecular Networking

Discloses the Chemical Diversity of Flavonoids and Selaginellins in Selaginella convoluta.

Planta Medica, 2020.

REGINALDO, F.P.S.; COSTA, I. C. M.; GIORDANI, R. B. Selaginellaceae: traditional use,

phytochemistry and pharmacology. , v. 19, n. 3, p. 247–288, 2020.

ROESSNER, U.; WAGNER, C.; KOPKA, J.; TRETHEWEY, R. N.; WILLMITZER, L.

Simultaneous analysis of metabolites in potato tuber by gas chromatography-mass spectrometry.

The Plant Journal, v. 23, n. 1, p. 131–142, 2000.

SÁ, P. G. S.; GUIMARÃES, A. L.; OLIVEIRA, A. P. DE; et al. Fenóis totais, flavonoides

totais e atividade antioxidante de Selaginella convoluta (Arn.) spring (Selaginellaceae). Revista

de Ciencias Farmaceuticas Basica e Aplicada, v. 33, n. 4, p. 561–566, 2012.

86

SAH, N. K.; SINGH, S. N. P.; SAHDEV, S.; et al. Indian herb “Sanjeevani” (Selaginella

bryopteris) can promote growth and protect against heat shock and apoptotic activities of ultra

violet and oxidative stress. Journal of Biosciences, v. 30, n. 4, p. 499–505, 2005.

SANDIN, M.; TELEMAN, J.; MALMSTRÖM, J.; LEVANDER, F. Data processing methods

and quality control strategies for label-free LC–MS protein quantification. Biochimica et

Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics, v. 1844, n. 1, p. 29–41, 2014.

SCHRIPSEMA, J. Application of NMR in plant metabolomics: Techniques, problems and

prospects. Phytochemical Analysis, 2010.

SCHUHMACHER, R.; KRSKA, R.; WECKWERTH, W.; GOODACRE, R. Metabolomics and

metabolite profiling. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2013.

SETYAWAN, A. D. W. I. Traditionally utilization of Selaginella ; field research and literature

review. Nature, v. 1, n. 3, 2009.

SHI, S.-P.; WANG, Y.-Z.; ZHENG, X.-K.; FENG, W.-S.; TU, P.-F. Chemotaxonomic

significance and biosynthesis of selaginellin from Selaginella tamariscina. Biochemical

Systematics and Ecology, v. 45, p. 151–154, 2012.

SHULAEV, V.; CORTES, D.; MILLER, G.; MITTLER, R. Metabolomics for plant stress

response. Physiologia Plantarum, 2008.

SINCLAIR, S. J.; JOHNSON, R.; HAMILL, J. D. Analysis of wound-induced gene expression

in Nicotiana species with contrasting alkaloid profiles. Functional Plant Biology, v. 31, n. 7, p.

721, 2004.

SOBOLEV, A. P.; SEGRE, A.; LAMANNA, R. Proton high-field NMR study of tomato juice.

Magnetic Resonance in Chemistry, v. 41, n. 4, p. 237–245, 2003.

STEEL, L. F.; HAAB, B. B.; HANASH, S. M. Methods of comparative proteomic profiling for

disease diagnostics. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical

and Life Sciences, 2005.

SUMNER, L. W.; MENDES, P.; DIXON, R. A. Plant metabolomics: large-scale

phytochemistry in the functional genomics era. Phytochemistry, v. 62, n. 6, p. 817–836, 2003.

TOHGE, T.; NISHIYAMA, Y.; HIRAI, M. Y.; et al. Functional genomics by integrated

analysis of metabolome and transcriptome of Arabidopsis plants over-expressing an MYB

transcription factor. Plant Journal, v. 42, n. 2, 2005.

VINAIXA, M.; SCHYMANSKI, E. L.; NEUMANN, S.; et al. Mass spectral databases for

LC/MS- and GC/MS-based metabolomics: State of the field and future prospects. TrAC Trends

in Analytical Chemistry, v. 78, p. 23–35, 2016.

WANG, M.; CARVER, J. J.; PHELAN, V. V; et al. Sharing and community curation of mass

spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nature

Biotechnology, v. 34, n. 8, p. 828–837, 2016.

WANG, X.; CHEN, S.; ZHANG, H.; et al. Desiccation tolerance mechanism in resurrection

fern-ally Selaginella tamariscina revealed by physiological and proteomic analysis. Journal of

Proteome Research, v. 9, n. 12, 2010.

87

WANG, Y.-H.; LONG, C.-L.; YANG, F.-M.; et al. Pyrrolidinoindoline Alkaloids from

Selaginella moellendorfii. Journal of Natural Products, v. 72, n. 6, p. 1151–1154, 2009.

WENG, J.-K.; NOEL, J. P. Chemodiversity in Selaginella: a reference system for parallel and

convergent metabolic evolution in terrestrial plants. Frontiers in Plant Science, v. 4, 2013.

WILKINS, M. R.; SANCHEZ, J. C.; GOOLEY, A. A.; et al. Progress with proteome projects:

Why all proteins expressed by a genome should be identified and how to do it. Biotechnology

and Genetic Engineering Reviews, v. 13, n. 1, 1996.

WOO, S.; KANG, K. BIN; KIM, J.; SUNG, S. H. Molecular Networking Reveals the Chemical

Diversity of Selaginellin Derivatives, Natural Phosphodiesterase-4 Inhibitors from Selaginella

tamariscina. Journal of Natural Products, v. 82, n. 7, p. 1820–1830, 2019.

XAVIER, S. R. DA S.; BARROS, I. C. L.; SANTIAGO, A. C. P. Ferns and lycophytes in

Brazil’s semi-arid region. Rodriguésia, v. 63, n. 2, p. 483–488, 2012. Instituto de Pesquisas

Jardim Botânico do Rio de Janeiro.

XIA, J.; WISHART, D. S. Web-based inference of biological patterns, functions and pathways

from metabolomic data using MetaboAnalyst. Nature Protocols, v. 6, n. 6, 2011.

XIAO, J. F.; ZHOU, B.; RESSOM, H. W. Metabolite identification and quantitation in LC-

MS/MS-based metabolomics. TrAC Trends in Analytical Chemistry, v. 32, p. 1–14, 2012.

YANG, J. Y.; SANCHEZ, L. M.; RATH, C. M.; et al. Molecular Networking as a Dereplication

Strategy. Journal of Natural Products, v. 76, n. 9, p. 1686–1699, 2013.

YANG, S. The divine farmer’s materia medica: a translation of the Shen Nong Ben Cao Jing.

1998.

YOBI, A.; WONE, B. W. M.; XU, W.; et al. Comparative metabolic profiling between

desiccation-sensitive and desiccation-tolerant species of Selaginella reveals insights into the

resurrection trait. Plant Journal, v. 72, n. 6, 2012.

YOBI, A.; WONE, B. W. M.; XU, W.; et al. Metabolomic profiling in Selaginella lepidophylla

at various hydration states provides new insights into the mechanistic basis of desiccation

tolerance. Molecular Plant, v. 6, n. 2, 2013.

ZHANG, W.; LI, F.; NIE, L. Integrating multiple “omics” analysis for microbial biology:

Application and methodologies. Microbiology, 2010.

ZHANG, X.-N.; LIU, J.; LIU, Y.; et al. Metabolomics Analysis Reveals that Ethylene and

Methyl Jasmonate Regulate Different Branch Pathways to Promote the Accumulation of

Terpenoid Indole Alkaloids in Catharanthus roseus. Journal of Natural Products, v. 81, n. 2, p.

335–342, 2018.

ZHENG, X.; BI, Y.; FENG, W.; et al. Study on the chemical constituents of Selaginella

tamariscina (Beauv.) Spring. Yao xue xue bao: Acta pharmaceutica Sinica, v. 39(4), p. 266–

268, 2004.

88

APÊNDICE



APÊNDICE – Artigos publicados durante o período de doutorado

PUBLICADOS:

➢ Reginaldo, F. P. S.; Costa, I. M.; Giordani, R. B. Selaginellaceae: traditional use,

phytochemistry and pharmacology. Boletin Latinoamericano y del Caribe de Plantas

Medicinales y Aromaticas, v. 19, p. 247-288, 2020.

➢ Reginaldo, F.P.S.; Bueno, P.C.P.; Costa, I.C.M.; Roque, A.A; Fett-Neto, A.G.;

Cavalheiro, A.J.; Giordani., R.B. Molecular networking discloses the chemical diversity

of flavonoids and selaginellins in Selaginella convoluta. Planta Medica. 2020.

➢ Damasceno, G. A. B. ; Barreto, S.M.A.G. ; Reginaldo, F. P.S. ; Souto, A.L.; Negreiros,

M. M.F.; Viana, R.L.S.; Pinto, T.K.B. ; Daher, C. C.; Silva-Filho, J.A.A.; Moura, R.

A.O.; Silva, M.A.; Silveira, W.L.L.; Medeiros, A. A.; Ostrosky, E.A.; Veríssimo, L.M.;

Sassaki, G.L.; Lopes, P.S.; Sales, V.S.F.; Rocha, H.A.O.; Cavalheiro, A. J. ; Giordani,

R. B.; Ferrari, M. Prosopis juliflora as a new cosmetic ingredient: Development and

clinical evaluation of a bioactive moisturizing and anti-aging innovative solid core.

Carbohydrate Polymers, v. 233, p. 115854, 2020.

➢ Lambert Moreira, L.G.; Leite Ferreira, M. E.; Reginaldo, F.; Lourenço, E.; Zuanazzi,

J.A.; Barbosa, E.; Santis Ferreira, L.; Fett-Neto, A. G. Cavalheiro, A. J.; Luchiari, A.C.;

Giordani, R.B. Erythroxylum pungens tropane alkaloids: GC-MS analysis and bioactive

potential of 3-(2- methylbutyryloxy) tropan-6,7-diol. Planta Medica. 2020.

➢ Reginaldo, F.P.S.; Freire, F.; Costa, I.C.M; Silva, I.B.; Roque, A.A; Hallwass, F.; Fett-

Neto, A.G.; Cavalheiro, A.J.; Giordani, R.B. NMR-based metabolite profiling of

Selaginella convoluta in different hydration states and the unprecedented occurrence of

anabasine in lycophytes. Phytochemistry Letters. 2021.

➢ Chacon, D.S.; Torres, T.M.; Silva, I.B.; Araújo, T.S.; Roque, A. A.; Selegatto, D.;

Reginaldo, F.P.S.; Pilon, A.; Costa, C.T.; Vilasboa, J.; Freire, R.; Ferreira, L.S.; Voigt,

E.L.; Zuanazzi, J.A.S.; Libonati, R.; Rodrigues, J.A.; Santos, F. L.M.; Peporine Lopes,

N.; Santos, L.V.; Scortecci, K.C.; Cavalheiro, A.J.; Fett-Neto, A.G.; Giordani, R.B.

Erythrina velutina Willd. alkaloids: piecing biosynthesis together from transcriptome

analysis and metabolite profiling of seeds and leaves. Journal of Advanced Research.

2021.

➢ Chacon, D.S.; Torres, T.M.; Silva, I.B.; Torres, T.M; Pereira, G.M; Moreira, L.G.L.;

Souza, L.F.R.; Reginaldo, F.P.S.; Roque, A. A.; Zuanazzi, J.A.S Libonati, R; Rodrigues,

J.A.; Santos, F.L.M.; Ricart, C.A.O.; Castro, M.S.; Fontes, W.; Sousa, M.V.; Fett-Neto,

A.G.; Giordani; R.B. Proteome of Erythroxylum pungens O. E. Shulz (Erythroxylaceae):

an endemic species of the semiarid Caatinga. Plant Systems. 2021.



EM PREPARAÇÃO:

➢ Reginaldo, F.P.S.; Souza, L.F.R.; Santos, M.D.M.; Chacon, D.S.; Torres, T.M.; Silva,

I.B.; Roque, A. A.; Zuanazzi, J.A.S.; Libonati, R; Rodrigues, J.A.; Santos, F.L.M.; Ricart,

C.A.O.; Castro, M.S.; Carvalho, P.C.; Fontes, W.; Sousa, M.V.; Fett-Neto, A.G.;

Giordani; R.B. Proteomic analysis of Selaginella convoluta: can the organ-specific

approach provide insights into the orchestrated events in the desiccation tolerance?

Proteomics.

➢ Reginaldo, F.P.S.; Bueno, P.C.P.; Lourenço, E.M.G.; Costa, I.C.M.; Lambert Moreira,

L.G.; Roque, A.A; Barbosa, E.G.; Fett-Neto, A.G.; Cavalheiro, A.J.; Giordani., R.B.

Methyl jasmonate-induced potentially bioactive selaginellins accumulation in Selaginella

convoluta. Journal of Advanced Research.

PRÊMIOS

➢ POSTER SESSION – NATURAL PRODUCTS: QPN091 - Metabolomic fingerprint at

different hydration states and structural identification of anabasine in Selaginella

convoluta, 42 Reunião Anual da Sociedade Brasileira Química. 2019.

Documents

Selaginella convoluta (Arn.) Spring uma abordagem