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Descripción de los mecanismos de patogenicidad y virulencia del grupo microbiológico Rickettsias (incluyendo a Rickettsias, Coxiella y Ehrlichia), tratando las patologías humanas que producen, los principales métodos de diagnóstico microbiológicos aplicados en la actualidad. Y por último se hace una aproximación práctica real tratando técnicas de cultivos celulares, inmunofluorescencias y PCR de segmentos génicos recientemente caracterizados.
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Diagnóstico microbiológico del grupo Rickettsias Realizado por: Manuel Pedro Jiménez García Asignatura: Diagnóstico microbiológico Curso: 4º curso, 2011-12.
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ÍNDICE DEL SEMINARIO DIAGNOSTICO MICROBIOLOGICO DE RICKETTSIAS
PARTE 1: Introducción al grupo Rickettsia.
1. Grupos Rickettsia, Ehrlichia y Coxiella.
a. Breve descripción fisiológica y de sus respectivos ciclos biológicos
b. Estrategias virulentas conocidas de este grupo.
2. Epidemiología de grupo: Clasificación de las diferentes especies según las patologías que producen.
a. Productoras de Fiebres exantemáticas (7 especies de Rickettsias).
b. Productoras de Tifus (3 especies de Rickettsias y 1 de Orientia)
c. Productoras de Ehrlichiosis (2 grupos de especies de Ehrlichias)
d. Productoras de Fiebre Q (1 especie de Coxiella).
3. Distribución geográfica de las diferentes patologías.
PARTE 2: Diagnóstico microbiológico de las diferentes especies que producen patologías concretas.
1. Fiebres exantemáticas
a. Fiebre botonosa mediterránea
b. Fiebre manchada de las montañas rocosas
c. Viruela Rickettsial o Rickettsiosis vesicular
2. Tifus
a. Tifus murino o tifus endémico
b. Tifus epidémico
c. Enfermedad de Brill-Zinsser
d. Tifus de las malezas
3. Ehrlichiosis
4. Fiebre Q
PARTE 3: Aproximación práctica de las técnicas principales del diagnóstico microbiológico del grupo Rickettsias.
1. Aislamiento de Rickettsias a partir de muestras clínicas mediante cultivo.
a. Cultivo con células VERO
b. Cultivo Shell vial
2. Diagnóstico de las Rickettsiosis mediante inmunofluorescencia indirecta.
3. Detección directa de Rickettsias en muestras clínicas mediante amplificación genómica y secuenciación del
gen gltA.
Bibliografía
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SEMINARIO DIAGNOSTICO MICROBIOLOGICO DE RICKETTSIAS
PARTE 1: Introducción al grupo Rickettsia. Esta parte será introductoria y por tanto, breve, con imágenes
didácticas y cuadros de clasificación, y de distribución geográfica.
1. Grupos Rickettsia, Ehrlichia y Coxiella.
a. Breve descripción fisiológica y de sus respectivos ciclos biológicos.
Los múltiples miembros del grupo Rickettsias, entre los que se encuentran Rickettsia, Ehrlichia y Coxiella, son
bacterias aerobias cocobacilos gramnegativos pleomórficos inmóviles pertenecientes al grupo filogenético
gammaproteobacterias, además, son parásitos intracelulares obligados o estrictos, es decir, sobreviven muy poco
tiempo fuera del huésped (con la excepción de Coxiella burnetii). El hecho de que sean parásitos intracelulares
estrictos quiere decir que requieren de células eucariotas para poder multiplicarse y desarrollarse.
Tratando su fisiología bacteriana, podemos decir que no son hospedadores energéticos ya que presentan
una cadena de transporte electrónico completa, cuyo donador de electrones es el NADH, sin embargo, requieren
energía en forma de ATP de sus células hospedadoras, además de NAD, coenzima-A, etc. Además, en general el
grupo Rickettsia (salvo Coxiella) no presenta rutas glucolíticas, es decir, no oxidan la glucosa pero sí oxidan otros
intermediarios como el glutamato.
En cuanto a su ciclo biológico, tienen en común un ciclo vital epidemiológico en el que intervienen vectores
artrópodos y reservorios en mamíferos, salvo en el caso de la patología tifus epidémico, donde el ser humano es un
huésped accidental.
Centrándonos en los tipos celulares que presentan a lo largo de su ciclo biológico intracelular, encontramos
una fase celular vegetativa, caracterizada porque la célula bacteriana es de mayor tamaño debido a que el espacio
periplásmico se agranda; y posteriormente encontramos una fase celular pequeña, donde son muy similares a
endosporas y con inclusiones membranosas complejas que confieren electrodensidad cuando se las observa al
microscopio electrónico de transmisión. Cabe añadir que en la fase celular vegetativa se produce una diferenciación
vegetativa, mientras que en la fase de células pequeñas se produce una diferenciación esporogénica, confiriendo a la
célula mayor grado de resistencia a las inclemencias del medio externo, en cualquier caso, el ciclo biológico culmina
con una fisión binaria de la célula bacteriana.
b. Estrategias virulentas conocidas de este grupo.
En cuanto a las estrategias virulentas conocidas de este grupo, destacamos las estrategias de supervivencia
intracelular, que podemos diferenciarlas según hablemos del grupo Rickettsia o del grupo Coxiella.
Así pues, las bacterias del grupo Rickettsia se caracterizan porque entran a la célula hospedadora eucariota
mediante fagocitosis inducida, además, presentan unas fosfoliasas que impiden que el lisosoma se una al fagosoma
formando el fagolisosoma, impidiendo que se acidifique la vesícula de la célula hospedadora eucariota permitiendo
la viabilidad de la bacteria patógena, así como el desarrollo y multiplicación de la misma.
En cuanto al grupo Coxiella se produce la entrada a la célula hospedadora eucariota por fagocitosis inducida
también, sin embargo, no posee mecanismos para evitar la fusión del fagosoma con el lisosoma, así pues, esta
bacteria permite soportar condiciones de pH ácidas, incluso pudiendo multiplicarse en el fagolisosoma. Cabe añadir,
que Coxiella posee mecanismos para evitar la acción de las hidrolasas lisosomales.
2. Epidemiología de grupo: Clasificación de las diferentes especies según las patologías que producen.
En base a diversas características, las diferentes especies de Rickettsias han sido tradicionalmente agrupadas en
dos grupos: las causantes de fiebres exantemáticas y las productoras de tifus. A continuación, se tratarán de manera
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somera los principales cuadros sintomatológicos, así como el diagnóstico de las patologías nombradas, y de la
ehrlichiosis, y de la fiebre Q.
A modo de resumen inicial, se presenta esta tabla con las características clínicas y epidemiológicas de las
rickettsiosis, que las iremos detallando poco a poco:
a. Productoras de Fiebres exantemáticas (7 especies de Rickettsias).
Rikettsia conorii, R. rickettsii, R. akari, R. africae, R. australis, R. sibirica, y R. japonica.
b. Productoras de Tifus (3 especies de Rickettsias y 1 de Orientia).
Rickettsia typhi, R. fetis, R. prowazekii, Orientia tsutsugamushi.
c. Productoras de Ehrlichiosis (2 grupos de especies de Ehrlichias).
Ehrlichia chaffeensis y el grupo de la E. phagocytophila.
d. Productoras de Fiebre Q (1 especie de Coxiella).
Coxiella burnetii.
3. Distribución geográfica de las diferentes patologías.
Las fiebres exantemáticas, dependiendo del agente etiológico, afectan a las zonas del Mediterráneo, América del
Norte, África subsahariana, Australia, y el sudeste asiático fundamentalmente.
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Las patologías cuyo cuadro sintomatológico se ajustan a tifus de etiología de Rickettsia se distribuyen por las
zonas del pacífico sur, Asia oriental-sur, pudiendo afectar a nivel mundial debido a los inmigrantes y residentes
viajeros.
Por último, las ehrlichiosis se distribuyen fundamentalmente a nivel de América del Norte (Estados Unidos), y la
fiebre Q, a nivel mundial.
PARTE 2: Diagnóstico microbiológico de las diferentes especies que producen patologías concretas. Se hará una
descripción breve de la enfermedad y las técnicas de diagnóstico microbiológico accesibles en microbiología
clínica aplicada a cada enfermedad.
4. Fiebres exantemáticas
a. Fiebre botonosa mediterránea
Está producida por Rickettsia conorii, transmitida por la garrapata
Rhicicephalus sanguineus. Ha sido descrita en el sur de Europa, África y centro
y sur de Asia. La mayor incidencia de la infección tiene lugar en los meses
estivales. Desde el punto de vista patogénico se produce un daño endotelial
con aumento de permeabilidad vascular, edema perivascular y necrosis
secundaria.
En cuanto a las manifestaciones clínicas más notorias, tras un período
de incubación de una semana, el paciente comienza con fiebre alta, cefalea,
exantema y artromialgias. Una característica típica de esta enfermedad es la
presencia de una escara necrótica en la zona de inoculación, denominada
“tache noire” o “mancha negra”.
Para el diagnóstico de la fiebre botonosa mediterránea se realizan:
• Pruebas serológicas de diverso tipo, sin embargo el resultado
siempre se positiviza en la fase de convalecencia, por lo tanto hay
que extremar precauciones con la metodología y
acompañarla con pruebas adicionales.
• Además, se realiza la clásica reacción de Weil-Félix, que
se trata de una prueba de aglutinación altamente
insensible e inespecífica, ya que su fundamento se basa
en la reacción cruzada con antígenos de Rickettsias y de
ciertos serotipos de bacterias del género Proteus.
• El diagnóstico precoz, por tanto, no va tanto al área
microbiológica, sino al diagnóstico clínico y
epidemiológico, a partir de la mancha negra,
generalmente.
• Aunque también se pueden utilizar procedimientos más sofisticados como:
o Cultivos celulares que se inoculan con una muestra del paciente posible portador.
o Métodos inmunohistológicos o de biología molecular de biopsias de piel.
o Detección del agente patógeno en células endoteliales por inmunofluorescencia.
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b. Fiebre manchada de las montañas rocosas
La fiebre manchada de las montañas rocosas es una grave infección causada por Rickettsia rickettsii, que se
presenta fundamentalmente en el continente americano. Sus principales vectores artrópodos son las garrapatas
Dermacentor variabilis, D. andersoni, Rhipicephalus sanguineus y Amblyoma cajennense, dependiendo del área
geográfica. La mayor incidencia de la patología se observa en primavera y verano, coincidiendo con la mayor
actividad de las garrapatas.
El microorganismo se inocula a través de la piel, pasando a los vasos linfáticos y capilares sanguíneos, afectando
a las células endoteliales, produciendo un aumento de la permeabilidad
vascular con edema secundario, hipovolemia, hipoalbuminemia e isquemia
(falta de oxígeno) local con necrosis.
En cuanto a las manifestaciones clínicas, tras un período de incubación
medio de una semana, se inicia el cuadro sintomatológico con malestar
general, fiebre, cefalea, mialgias, acompañándose de náuseas, vómitos y
diarrea. Lo más característico son las lesiones cutáneas, y aparecen algo
más tardíamente. Además, en fases muy tardías se afecta al sistema
nervioso central (SNC).
Para el diagnóstico de esta patología:
• Inicialmente se basa en la epidemiología y la clínica.
• Sin embargo, existen diversas pruebas serológicas que reportan falsos negativos en fases iniciales de la
enfermedad, pero que confirman el diagnóstico en la enfermedad tardía.
• En la fase aguda de la enfermedad, únicamente es útil la biopsia cutánea y su examen inmunohistoquímico.
• Como procedimientos diagnósticos fiables, pero considerados alternativos debido a que no están disponibles
en todos los laboratorios son: la amplificación de DNA por PCR, y el cultivo celular.
c. Viruela Rickettsial o Rickettsiosis vesicular
Enfermedad causada por Rickettsia akari, especie transmitida por el ácaro Liponyssoides sanguineus, y cuyo
reservorio son los ratones. Es una enfermedad poco frecuente, descrita en zonas urbanas de Estados Unidos, Rusia,
Corea y África.
Tras ser inoculadas por la picadura del ácaro, las bacterias proliferan localmente y producen una pápula
indolora que progresa a úlcera y escara. A nivel histológico hay una infiltración epidérmica de células polimórficas
nucleares y hay una afectación vascular con extravasación y formación de trombos.
A nivel clínico, tras un período de incubación de 1-2
semanas se inicia un cuadro brusco caracterizado por fiebre,
escalofríos, mialgias, cefalea, fotofobia, sudoración intensa e
incluso trastornos gastrointestinales. Poco después aparece un
exantema papular generalizado que evoluciona a vesículas y
costras similares a las que aparecen en la viruela viral. La
enfermedad no es severa, resolviéndose en 2-3 semanas aún sin
tratamiento.
Como curiosidad, si se quieren observar los efectos de esta patología, en la serie de televisión “House”, en la
séptima temporada, en el capítulo 7, se trata esta patología concreta y está muy bien documentada.
En cuanto al diagnóstico:
• Se realiza fundamentalmente por inmunofluorescencia indirecta.
• Aunque también se puede aplicar la inmunofluorescencia directa, pero es de elevado coste en comparación
con la anterior.
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• El diagnóstico diferencial se plantea con otras rickettsiosis, infecciones por varicela-zoster y enterovirus.
5. Tifus
a. Tifus murino o tifus endémico
El agente etiológico de esta patología es la Rickettsia typhi, que produce
esta zoonosis mundial. Su reservorio natural son las ratas, y el vector artrópodo es
la pulga de la rata Xenopsylla cheopis. Existe una variedad de este cuadro causado
por R. felis y transmitido desde los gatos por pulgas del género Ctenocefalides felis.
En cualquier caso, el tifus murino se presenta en pacientes de cualquier
edad, sobre todo en los meses de verano y otoño, y en zonas con mal control a
nivel del reservorio y los vectores artrópodos, ya que la pulga adquiere la infección
a raíz de picar a las ratas infectadas, propiciando que las bacterias se acumulen en
las células de la mucosa intestinal de la pulga, y se eliminan con las deposiciones.
El mecanismo de inoculación en humanos es por rascado de la zona de la picadura
de la pulga, alrededor de la cual se depositan las heces contaminadas de la misma.
En cuanto al cuadro clínico de la enfermedad, tras un período de
incubación de 1-2 semanas se inicia un cuadro de fiebre, escalofríos, malestar
general, náuseas, vómitos, mialgias, etc, y se produce una afectación endotelial
con vasculitis en múltiples órganos. Dicha lesión produce pérdida de contenido vascular por aumento de la
permeabilidad hipovolemia, hipoalbuminemia y pérdida de electrolitos. Aunque generalmente el tifus murino es una
enfermedad benigna, puede, por tanto, presentar complicaciones graves.
Las complicaciones graves alcanzan la insuficiencia respiratoria, afectación renal, miocarditis, síntomas
neurológicos, afectación hepática, y por tanto, fracaso multiorgánico.
El diagnóstico de la patología, se basa en:
• La sospecha clínica inicial a partir de la cual se debe comenzar un tratamiento de choque.
• Posteriormente ha de realizarse una confirmación serológica mediante aglutinación con látex o
inmunofluorescencia indirecta.
• Además, se puede demostrar inmunohistoquímicamente a partir de muestras de biopsias, o del cultivo
celular de Rickettsias en células hospedadoras adecuadas, o a través de la detección de DNA por PCR de
sangre periférica.
• La reacción de Weil-Félix, como en todos los casos de rickettsiosis ha de evitar realizarse, a no ser que no se
disponga de otra técnica diagnóstica, debido a que es muy poco sensible y no es específica.
• Como diagnóstico diferencial, se puede confundir con las siguientes patologías: sarampión, fiebre tifoidea,
meningitis bacteriana o vírica, sífilis secundaria y síndrme de shock tóxico.
b. Tifus epidémico o exantemático
El tifus epidémico o exantemático está causado por Rickettsia prowazekii. El
vector es el piojo humano Pediculus humanus corporis, que vive en la ropa, se
transmite de persona a persona, y aumenta su presencia en épocas frías del año, en
situaciones de poca higiene, hacinamiento y catástrofes naturales y/o guerras. Además,
presuntamente se ha descubierto en EEUU una variedad transmitida por pulgas y
piojos de las ardillas voladoras.
Al picar al huésped infectado, el piojo adquiere el microorganismo que pasa al
tubo digestivo del artrópodo. A partir de aquí se elimina por las heces y se inocula en
un nuevo huésped mediante el rascado tras una nueva picadura. Tras la inoculación se disemina por vía sanguínea y
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afecta a las células endoteliales de venas, arteriolas y capilares, lo que provoca trombosis de la luz por depósito de
fibrina y plaquetas, pudiendo producir necrosis distal de los miembros por isquemia continuada.
En cuanto a las manifestaciones clínicas, éstas se producen tras un período de incubación de una semana, y
los síntomas son fiebre alta, cefalea intensa, mialgias, y la aparición de un exantema maculoso en la parte superior
del tronco y las axilas. Además, puede haber una afección sistémica que consiste en alteraciones oculares, tos seca,
infiltrados pulmonares e incluso fracaso renal.
El diagnóstico se basa:
• Inicialmente en la epidemiología y la clínica.
• Posteriormente se busca una confirmación serológica mediante inmunofluorescencia indirecta.
• Al igual que en el tifus murino la prueba de Weil-Félix tiene importantes limitaciones.
• Además, la realización de amplificación de DNA por PCR, y la realización de cultivos celulares son eficaces
pero no están disponibles en todos los laboratorios.
c. Enfermedad de Brill-Zinsser
Se trata de una forma recidivante de tifus epidémico. La
distribución geográfica es universal debido a los flujos migratorios de
personas previamente infectadas.
Las manifestaciones clínicas son similares, pero menos intensas,
asemejándose más al tifus murino. Incluso se han asociado a situaciones
de estrés o debilitamiento inmunológico en personas de edad avanzada
que habían padecido el primer episodio incluso muchos años atrás.
El diagnóstico se basa:
• En un diagnóstico clínico y epidemiológico.
• Se apoya con análisis serológicos.
• Es conveniente determinar el tipo de anticuerpos específicos, ya que en esta entidad se desarrollan
anticuerpos IgG mientras que en el tifus epidérmico o murino se desarrollan IgM.
d. Tifus de las malezas
Se trata de una zoonosis extendida en Asia, Australia y el área sur y
occidental del océano Pacífico. Está causada por Orientia tsutsugamushi
(anteriormente denominada Rickettsia tsutsugamushi). Se transmite por
picadura de las larvas de ciertos ácaros infectados como Leptotrombidium
deliense. Son más frecuentes en zonas de maleza y en épocas húmedas.
Las manifestraciones clínicas propias de la enfermedad se dan tras
la inoculación de O. tsutsugamushi, que se multiplica en la zona de la
picadura, produciendo una pápula que se ulcera, y da lugar a una escara con
costra negruzca. En los siguientes días se da un cuadro de fiebre, esplenomegalia, linfadenopatía, cefalea y mialgias.
Incluso en casos graves se añade neumonía intersticial y alteración del SNC.
En cuanto al diagnóstico de la patología:
• Se recurre, ésta vez con éxito, a la prueba Weil-Félix, que se utiliza conjuntamente con la
inmunofluorescencia indirecta, y ambas técnicas tienen la misma sensibilidad y especificidad.
• Se hace un diagnóstico diferencial con otros tipos de tifus, mononucleosis infecciosa, toxoplasmosis, dengue,
etc.
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6. Ehrlichiosis
Esta patología se produce por dos microorganismos, que dependiendo de cual
sea produce una patología u otra, así pues, si la estirpe celular que infecta es
Ehrlichia chaffeensis produce la ehrlichiosis monocítica humana; mientras que si el
microorganismo que infecta es Ehrlichia phagocytophila la patología que se
produce es la ehrlichiosis granulocítica humana.
Estos agentes son transmitidos por picaduras de garrapatas, aunque también
se ha descrito la afectación profesional en carniceros que trabajan con carne
infectada, o que tienen trato con perros con ehrlichiosis canina. Existen
personas que no desarrollan síntomas de la enfermedad. Y se suele desarrollar
más en primavera-verano.
En cuanto a las manifestaciones clínicas, una vez se ha inoculado el
microorganismo, se disemina por la vía cutánea, sanguínea y linfática, para
invadir las células correspondientes de los sistemas hematopoyéticos y
linforreticular. El cuadro sintomatológico de ambas patologías es muy similar, y
suele ser notorio en pacientes inmunodeprimidos, donde puede ser fatal, pasando por etapas de fiebre, cefalea,
mialgias, náuseas y posibles fallos a nivel renal.
El diagnóstico se lleva a cabo:
• Mediante una epidemiología previa y clínica.
• Es de elevada importancia realizar un examen microscópico para comprobar que se observan mórulas de
Ehrlichia, que se detectan en el diagnóstico temprano y con tinción directa.
• Los cultivos Ehrlichia son insensibles, complejos y no se hacen rutinariamente, así como la técnica de
amplificación de DNA por PCR.
• El método diagnóstico más fiable es la inmunofluorescencia indirecta.
7. Fiebre Q (aguda y crónica)
Es una zoonosis de presentación universal. Tratando nuestro país, es común en España en la época estival de
primavera-verano. Está causada por Coxiella burnetii, un microorganismo que difiere de los anteriores en que resiste
mejor las inclemencias del medio ambiente, permitiendo que sea viable durante meses expuesto a la desecación, a
temperaturas extremas o contaminando alimentos. Como peculiaridad sufre cambios en su estructura antigénica en
un proceso denominado “variación o cambio de fase”, donde en animales y humanos se manifiesta como fase I o
virulenta, que supone la fase contagiosa, y en cultivos celulares in vitro se pasa a la forma II o avirulenta.
Este microorganismo se aisla de múltiples reservorios animales, desde artrópodos a mamíferos, aunque la
fuente más importante de infección en el hombre es el ganado bovino, ovino y caprino.
En el animal infectado los microorganismos se acumulan en el útero y glándulas mamarias, transmitiéndose al
hombre por inhalación de aerosoles en el momento del parto, por contacto directo o exposición a materiales
contaminados (incluyendo heces, orina, paja, ropa, placentas o productos de despiece), o por ingestión de leche.
En cualquier caso el ciclo de infestación se inicia con la picadura de la garrapata u otros artrópodos infectados a
los mamíferos, transmitiéndoles la infección por la misma picadura o a través de heces contaminadas. El
microorganismo se multiplica y se acumula en útero y placenta, liberándose en el parto gran cantidad en aerosoles
que pueden persistir durante mucho tiempo, y tras ser inhalados por el hombre, las coxiellas proliferan en los
pulmones y se diseminan por vía hematógena.
En cuanto a las manifestaciones clínicas, existen dos grandes síndromes causados por C. burnetii, que son la
fiebre Q aguda y la fiebre Q crónica, que recientemente se ha demostrado que son factores atribuibles al huésped y
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no a la cepa infectante, los que determinan la posible cronificación, como pueden ser la inmunodepresión, lesiones
vasculares, etc.
La fiebre Q aguda comienza con un cuadro febril autolimitado, de 1-2
semanas de duración, acompañado de una hepatitis, e incluso una
neumonía. Por otro lado la fiebre Q crónica se puede presentar de
múltiples formas, sin embargo la más típica es la endocarditis unido a
hepatoesplenomegalia, anemia y neumonía.
El diagnóstico de la fiebre Q aguda reside en la serología, que se
puede efectuar por diferentes técnicas, siendo la inmunofluorescencia
indirecta la más sensible y específica.
• Tiene interés la determinación de anticuerpos IgM, y no es
necesario esperar a ver si ha habido seroconversión.
• El cultivo del microorganismo en cultivos celulares se suele descartar debido a que se transmite por
aerosoles, requeriría una bioseguridad elevada (tipo III), que no es factible con la mayoría de laboratorios.
• La técnica basada en amplificación de DNA por PCR también suele descartarse debido a que no se dispone
en todos los laboratorios.
En contraposición, el diagnóstico de la fiebre Q crónica, las determinaciones serológicas muestran que existe
elevado título de IgG contra el antígeno de fase I (virulento), que contra el de fase II (avirulento).
• Además se requiere determinar IgA contra antígeno de fase I para el seguimiento de la fase crónica.
Cabe añadir, que el tratamiento de todas estas patologías ha de iniciarse lo antes posible para evitar las posibles
complicaciones de cada patología que se puedan producir. Generalmente el antibiótico doxiciclina es muy efectivo,
aunque también se pueden utilizar tetraciclinas, ciprofloxacino y/o cloranfenicol. Se suele acompañar de
antipiréticos y antiinflamatorios específicos.
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PARTE 3: Aproximación práctica de las técnicas principales del diagnóstico microbiológico del grupo Rickettsias. Se
hará una descripción más metodológica de las técnicas utilizadas, que son precisamente las que más se utilizan
actualmente en microbiología clínica.
Antes de adentrarnos en el procedimiento experimental de las técnicas más comúnmente llevadas a la
práctica, nos detendremos en el tipo de muestra para cada tipo de prueba diagnóstica (se refleja en una tabla
adjunta más abajo), y se detallarán los puntos más relevantes de cada tipo de prueba diagnóstica.
Así pues, podemos hablar de los siguientes grupos de pruebas diagnósticas, antes de pasar a protocolos de
técnicas concretas:
• Tinción de Giménez para observación microscópica: las muestras de
tejidos pueden examinarse microscópicamente mediante esta tinción, que
permite visualizar las rickettsias, pero no diferencia en cuanto a la especie
ni tampoco otros microorganismos, por lo que su detección suele ser
dudosa.
• Serología: la inmunofluorescencia indirecta (IFI) es una de las técnicas más sensibles y la más ampliamente
utilizada en la actualidad para el diagnóstico de las rickettsiosis exantemáticas. Los antígenos están
comercializados, estandarizados y prefijados en los portaobjetos sobre los que se añaden las diluciones seriadas
del suero del paciente. La confirmación del diagnóstico requiere detectar una seroconversión, que se ha
nombrado con anterioridad, que se produce en la fase de convalecencia entre la 3-4 semana.
Para una correcta interpretación de los resultados de serología, se deben tener en cuenta los datos de
reactividad basal de la población en zonas endémicas. Como técnicas experimentales para evitar la reactividad
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cruzada, en algunos casos, se utilizan ensayos de inmunobloting con sueros sometidos a absorciones con
antígenos heterólogos, aumentando la especificidad, pero resultando en una baja sensibilidad.
• Cultivo celular: para el cultivo de rickettsias, se requiere, en términos generales, un medio mínimo esencial sin
antibióticos, suplementado con suero bovino fetal, glutamina, aminoácidos no esenciales, y una incubación a
33-35ºC en ausencia de CO2.
Para el diagnóstico definitivo de las rickettsiosis se requiere el aislamiento e identificación de la especie a
partir del cultivo en células VERO o fibroblastos (por Shell vial).
Para la detección específica y todo el proceso de incubación hay que extremar las precauciones, de ahí que
se requiera un laboratorio de bioseguridad 3.
• Detección molecular: las técnicas moleculares, como la PCR, permiten un diagnóstico rápido y específico al
detectar DNA de rickettsia en tejidos infectados, cultivos celulares y garrapatas u otros artrópodos vectores. Por
el momento la mayor parte de técnicas descritas son de desarrollo propio (in house), y no están
comercializadas, y los genes más comúnmente analizados son los que codifican dos proteínas de membrana
externa: rOmpA (presente en todas las especies de rickettsias excepto en R. helvética, R. australis, R. bellii, R.
canadensis), y rOmpB (presente en todas las especies excepto R. helvética, R. bellii y R. massiliae). Además,
también se utiliza el gen gltA (del cual hablaremos), que codifica la citrato sintetasa, y es válido para la
identificación de todas las especies de rickettsias, y el gen 17-kDa (válido para las rickettsias del grupo de fiebres
manchadas).
Por otro lado, se ha desarrollado recientemente una técnica denominada PCR-RLB (reverse line blotting), la
cual utiliza como diana el espacio intergénico 23S-5S-ARNr16, que permite la identificación de la especie
implicada sin necesidad de secuenciación, siendo un método altamente sensible, y específico y se realiza en
poco tiempo, en torno a 1-2 horas.
Además, se pueden utilizar técnicas como la PCR cuantitativa a tiempo real, que permite obtener resultados
en menos de 1 hora.
Ahora trataremos protocolos específicos llevados a la práctica en los laboratorios de microbiología clínica de los
principales hospitales de España y del mundo:
1. Aislamiento de Rickettsias a partir de muestras clínicas mediante cultivo.
a. Cultivo con células VERO o cultivos Shell vial de fibroblastos
Inicialmente se ha de tener en cuenta que el objetivo de esta
técnica es obtener cultivos celulares inoculados con muestras de
pacientes en los que se sospecha una rickettsiosis. Se requiere un
laboratorio de bioseguridad 3.
Este proceso es laborioso, ya que aparte del componente
metodológico, el efecto citopático no se observa siempre, y cuando se
produce no es específico de la especie de Rickettsia.
En cualquier caso, tras unos días de cultivo, se puede detectar la
presencia de rickettsias mediante una tinción directa Gimenez, o
mediante una inmunofluorescencia indirecta con anticuerpos específicos, o por técnicas moleculares como PCR. Se
ha de tener en cuenta que para la identificación de la especie de rickettsia aislada, se precisa de secuenciación de
una diana específica de la especie a nivel de DNA.
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Protocolo:
1) Recogida de muestras. La muestra más adecuada para el cultivo de
rickettsias es la sangre recogida con citrato o heparina. Las muestras se
recogen en contenedores estériles de un solo uso con cierre hermético y
han de analizarse el mismo día.
2) Si el envío no se realiza de manera inmediata, conviene congelar a -80ºC
hasta su envío.
3) Hay que tener en cuenta, que cuando se analiza una muestra de posible
rickettsiosis, dichas muestras mostrarán una bacteriemia de menor
intensidad que en el caso de otras infecciones bacterianas, lo que obliga
a recoger mayor cantidad de muestra para obtener un rendimiento
óptimo.
4) Las muestras deben manejarse como potencialmente peligrosas, y antes
de procesarse se han de someter a una inspección previa para
asegurarnos de que no existe ningún criterio de rechazo de la misma.
5) Para realizar el cultivo celular, se requiere de células VERO o SHELL VIAL
en cultivo con crecimiento en monocapa confluente, en torno a 50.000
células viables (comprobadas con azul tripán) por mililitro.
6) Se inoculan 0.2 ml de la muestra del paciente por cada vial de 50.000
células viables/ml. Hay que incubar durante 4-6 días en estufa a 33-35ºC sin CO2 ambiental. Hay que comprobar
diariamente si hay contaminación del cultivo mediante la visualización con el microscopio invertido.
7) Posteriormente hay que realizar un subcultivo o pase de los cultivos con nuevo medio de cultivo. Se dejan
incubando otros 5-7 días.
8) Posteriormente se raspa el cultivo para comprobar si hay crecimiento de rickettsias, mediante la tinción
Gimenez, IFI con suero específico o técnicas como PCR.
9) Hay que tener en cuenta, que aún teniendo un resultado negativo, no se puede descartar la presencia de
rickettsias en el cultivo hasta pasados 20 días de incubación.
Limitaciones del procedimiento:
• Debido a la baja sensibilidad de la técnica, no se recomienda realizar este procedimiento en el caso de muestras
procedentes de pacientes que hayan comenzado un tratamiento antibiótico.
• En el caso de desconocer la especie concreta, se deberá remitir a un centro de referencia para identificarla.
• Una limitación de la técnica es el aumento de la toxicidad de la muestra sobre la monocapa celular durante el
proceso.
2. Diagnóstico de las Rickettsiosis mediante inmunofluorescencia indirecta.
Se describirá el diagnóstico serológico de las rickettsiosis mediante la utilización de la técnica de
inmunofluorescencia indirecta (IFI), procedimiento aplicable a todos los laboratorios clínicos que reciben muestras
de sueros procedentes de pacientes con sospecha de infección por Rickettsia spp.
Los métodos serológicos, como hemos comentado, se basan en la detección de anticuerpos específicos frente a
Rickettsia spp., generalmente de tipo IgG e IgM. Al igual que otras serologías, este método se puede utilizar para el
diagnóstico de la infección, para el seguimiento de la respuesta inmune específica y para conocer la prevalencia de
anticuerpos frente a este microorganismo.
En el caso de que existan anticuerpos frente al correspondiente antígeno, se formará un complejo antígeno-
anticuerpo que será revelado mediante una anti-inmunoglobulina humana de origen animal, marcada con
isotiocianato de fluoresceína (FITC) generalmente, y visualizado con un microscopio de fluorescencia.
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Protocolo:
1) Recogida de muestras. Las muestras a
analizar mediante IFI de rickettsias es el
suero, que se recoge y se envía a
contenedores estériles de un solo uso y
con cierre hermético.
2) El suero debe enviarse refrigerado lo
antes posible. Si el envío no se va a
realizar de inmediato, conviene congelarlo
a -20ºC hasta su envío.
3) Procesado de las muestras. Se ha de
someter a las muestras a una inspección
previa para asegurarse de que ha sido
bien seleccionada, recogida y
transportada. No se aceptará suero
hemolítico ni hiperlipémico.
4) Ya que resulta importante realizar
estudios cuantitativos de sueros del
mismo paciente a lo largo del tiempo, es fundamental conservar una alícuota congelada a -20ºC de cada
muestra que se analice para poder realizar en paralelo el estudio comparativo con las diferentes muestras.
5) Adentrándonos en el procedimiento de inmunofluorescencia indirecta, se parte de placas de microtitulación,
donde se realizan diluciones seriadas 1/10, 1/20, 1/40, 1/80, hasta 1/5120, con tampón PBS.
6) Tras realizar las diluciones con el antígeno, y la realización de un control negativo y positivo, se incuban a 37ºC
durante 30 minutos en cámara húmeda.
7) Tras los lavados pertinentes, se añade la solución del conjugado (anti IgG, anti IgM y anti inmunoglobulinas
totales), a la dilución recomendada de cada pocillo, la dilución del conjugado se prepara con Azul de Evans. Se
incuba durante 30 minutos a 37 ºC.
8) Se repiten los lavados y se deja secar y se procede al montaje.
9) Lectura e interpretación de resultados. Se realiza en el microscopio de fluorescencia. En el caso de un resultado
positivo, se observa una fluorescencia puntiforme característica que evidencia la presencia de las rickettsias y
contrasta con el rojo del citoplasma celular producido por el azul de Evans. Los sueros negativos dan lugar a una
coloración roja uniforme sin punteado. Hay que tener en cuenta que a veces no se utiliza azul de Evans.
Para ilustrar los posibles resultados obtenidos utilizo
estas imágenes de un ensayo de inmunofluorescencia
indirecta, que se ha realizado a partir de muestras de
suero de pacientes con signos clínicos de rickettsiosis,
y con antígenos de especies de Rickettsias conocidas.
Se observarán diferentes intensidades de reacción de
IFI (y no se usa azul de Evans). Las columnas muestran
los antígenos ya conocidos de cada especie (columna
1: R. conorii, columna 2: R. felis, columna 3: R. typhi).
Las filas muestran el suero con infección y
anticuerpos específicos (fila A: R. conorii, fila B: R.
felis, fila C: R. typhi). Se observa que el suero con
infección por R. conorii reacciona con los antígenos
de R. conorii y R. felis pero no con el de R. typhi. Por
el contrario, el suero con infección por R. typhi
reacciona con los antígenos de R. typhi y R. felis, pero
no con R. conorii. Por último, el suero con la infección
por R. felis reacciona con R. conorii y R. typhi.
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10) Hay que tener en cuenta que el control positivo
debe presentar una fluorescencia intensa y brillante,
y que el control negativo debe presentar ausencia de
fluorescencia. Una fluorescencia amarillenta o verde
oscura corresponde con una actividad inespecífica y
no debe tenerse en cuenta. Además, durante la
observación al microscopio de fluorescencia se
recomienda no concentrarse mucho tiempo en la
misma área, siendo preferible desplazarse por toda
la preparación con el fin de evitar pérdidas de
fluorescencia.
11) La evaluación de un resultado positivo ha de
detallar que se trata de una fluorescencia específica de
color verde manzana con una intensidad de 1+ (débil),
2+ (moderada), 3+ (brillante), 4+ (muy brillante).
12) Se considera que ha tenido lugar una
seroconversión cuando al analizar dos muestras de
suero obtenidas de un paciente con 20 días de
diferencia, se observa un aumento de cuatro veces el
título de anticuerpos inicial.
Limitaciones del procedimiento:
• Hay que tener en cuenta que para minimizar la variabilidad deben analizarse simultáneamente todos los sueros
del paciente.
• Además, hay que tener en cuenta que sólo existen portaobjetos comerciales para R. coronii, R. rickettsii y R.
thypi. Para el estudio serológico de otras especies se deben producir los antígenos y preparar los portaobjetos
en el propio laboratorio. Requiere personal especializado y laboratorio de bioseguridad 3.
• La IFI para la detección de anticuerpo frente a rickettsias está considerada la mejor prueba diagnóstica
serológica.
• Otra limitación común a otros ensayos serológicos es la necesidad del estudio de sueros pareados, para poder
demostrar una seroconversión.
• Además, en algunos casos no se produce la seroconversión, por lo que no se puede excluir la enfermedad.
3. Detección directa de Rickettsias en muestras clínicas mediante amplificación genómica y secuenciación del
gen gltA.
El objetivo de este procedimiento, es la detección de las especies de Rickettsia en muestras clínicas mediante
PCR (reacción en cadena de la polimerasa) convencional, y una secuenciación posterior del producto amplificado.
Este procedimiento es aplicable a todas las muestras clínicas con sospecha de rickettsiosis que se reciben en los
laboratorios de microbiología clínica que realicen diagnóstico molecular. Además, también se puede aplicar al DNA
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extraído a partir de cultivos celulares infectados con Rickettsia spp. a partir de muestras clínicas, como hemos
explicado en el punto anterior.
Así pues, esta técnica molecular permite detectar en poco tiempo el genoma de cualquier patógeno potencial
del grupo Rickettsia independientemente de la viabilidad del microorganismo. Estas técnicas presentan como
ventaja que son más sensibles debido a que el tratamiento previo con antibióticos disminuye la sensibilidad, pero en
menor grado que en las anteriores técnicas.
La diana génica específica que trataremos será el gen gltA, que codifica para la enzima citrato sintetasa que está
presente en todas las especies de Rickettsia.
Protocolo:
1) Recogida de muestras. Las muestrás más adecuadas para el diagnóstico molecular de rickettsias son sangre
extraída con citrato o EDTA, muestra cutánea de la escara de inoculación, contenido de pápulas o máculas, y en
el caso de afectación neurológica, muestra de líquido cefalorraquídeo (LCR). Se han de depositar y enviar en
contenedores estériles de un solo uso y con cierre hermético.
2) Procesamiento de las muestras. Como hemos comentado, la bacteriemia en una rickettsiosis es menor que en
el caso de otras infecciones bacterianas, lo que obliga a recoger mayor cantidad de muestra para obtener un
rendimiento óptimo. Las muestras han de manejarse como si tuvieran microorganismos potencialmente
peligrosos, y antes de su procesado se ha de seguir el protocolo de inspección previa por si se descarta la
muestra.
3) En el procedimiento de la PCR, se utilizarán reactivos para la extracción de DNA comerciales, específicos para
muestras sanguíneas, o muestras de suero, o muestras de LCR. Si se parte de biopsias cutáneas, se utilizarán
reactivos de extracción de DNA específicos de tejidos.
4) Para la amplificación del DNA del gen gltA, se utilizará la mezcla de reacción de PCR estándar, con la
peculiaridad de que los dos cebadores u oligonucleótidos, tendrán el siguiente código y secuencia:
Rp877p: 5’-GGGGACCTGCTCACGGCGG-3’
Rp128n: 5’-ATTGCAAAAAGTACAGTGAACA -3’
5) Tras la realización de la PCR, se procederá a realizar la electroforesis en gel de agarosa, y posteriormente se
procederá a purificar la banda que se corresponde con el producto amplificado por PCR con kits específicos
dependiendo de la muestra de partida (sangre, tejido o LCR). El producto purificado teóricamente será la
secuencia génica del gen gtlA que se procederá a secuenciar para confirmar la especie de rickettsia.
6) Hay que tener en cuenta que todos estos procedimientos se han de llevar a cabo en cabinas de bioseguridad
tipo 3 o incluso de clase IIA. Y que se han de realizar: un control negativo de extracción, que supondrá una
muestra de agua, un control positivo que supondrá DNA de rickettsia a una dilución límite de detección para
comprobar la eficacia de la amplificación de PCR. Además, se requiere de un control interno, según el cual se
amplificará otro gen como el de la betaglobina, con este control aseguramos que el proceso de PCR ha operado
correctamente, y el hecho de que no haya amplificación de un fragmento se deba a que no estaba presente
dicha secuencia en el DNA de partida.
7) Como resultados, obtendremos en un gel de
electroforesis: el control negativo sin ninguna banda de
electroforesis, en el control positivo debe aparecer una
banda de 380 pb, y en las muestras si aparece una banda
de 380 pb será positiva la presencia de rickettiosis (en la
imagen las muestras van de la 1 a la 6 y todas son
positivas para rickettsiosis). Además, debe aparecer una
banda correspondiente al amplificado de control interno.
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8) En el proceso de secuenciación, se utiliza el procedimiento de secuenciación unidireccional mediante un
secuenciador automático, y el resultado se compara con un software específico que realice alineamientos de
secuencia de DNA utilizando secuencias de referencia, o bien mediante comparación on line con secuencias de
bases de datos, como por ejemplo, de Blastn.
9) Por último, los resultados obtenidos con esta técnica se expresan en términos cualitativos de positivo o
negativo para rickettsiosis, y los datos de secuenciación permiten identificar la especie bacteriana. Además,
cuando se notifica un resultado de PCR negativo se debe tener en cuenta que, en ocasiones, la carga bacteriana
en algunas muestras suele ser muy baja y por lo tanto, los métodos moleculares pueden no ser lo
suficientemente sensibles, por lo que un resultado negativo no descarta una infección.
Limitaciones del procedimiento:
• Esta técnica molecular es una prueba ideal para el diagnóstico de las rickettiosis ya que la amplificación del gen
gtlA presenta elevada conservación de las secuencias de DNA en las regiones donde se han diseñado los
oligonucleótidos, confiriendo a esta PCR el título de PCR genérica, sin embargo existen una serie de desventajas
en comparación con el cultivo celular, como son la limitación para realizar pruebas de sensibilidad con
antibióticos.
• Otra desventaja supone la imposibilidad de coleccionar los aislados para futuras investigaciones.
• Además, dependiendo del hospital o del laboratorio de diagnóstico, se han de definir y protocolizar los
controles internos de inhibición, sensibilidad, especificidad y reproducibilidad de la técnica molecular. En este
caso, el control interno de amplificación de DNA ha sido del gen de la betaglobina, que produce un fragmento
de 150 pb.
Bibliografía:
• PRESCOTT, LM, JP HARLEY, DA KLEIN Microbiología (5ª edición). McGraw-Hill Interamericana. 2004.
• Documentos técnicos de protocolos para el Servicio de Microbiología de los hospitales españoles. Códigos PNT-
EMG-07, PNT-EMG-08 y PNT-EMG-09.
• Infecciones por Rickettsias. J Cazallas Tarazagaa, J Collazos Gonzáleza. Sección de enfermedades infecciosas.
Hospital Galdácano (Vizcaya).
• Diagnóstico microbiológico de las infecciones por patógenos bacterianos emergentes: Anaplasma, Bartonella,
Rickettsia, Tropheryma whipplei. José Ramón Blanco et al. Área de enfermedades infecciosas, Centro de
Rickettsiosis y enfermedades transmitidas por artrópodos vectores. Hospital San Pedro CIBIR. Logroño.
• Ruíz Beltrán R, Herrero Herrero JI, Martín Sánchez AM, Martín González JA. Prevalence of antibodies to
Rickettsia conorii, Coxiella burnetii and Rickettsia typhi in Salamanca Province (Spain). Serosurvey in the human
population. Eur J Epidemiol 1990;6:293-9 [Medline].
