Seminário RadioFotob3

5/13/2018 Semin rio RadioFotob3 - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/seminario-radiofotob3 1/50

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOFÍSICA

RADIOBIOLOGIA E FOTOBIOLOGIA

PROFº ÁLVARO LEITÃO

Journal of Molecular Biology (1974)

Diogo Neves G. da Silva

Francisco Carlos da Silva



INTRODUÇÃO

Em mutantes de E. coli K12 uvr , deficientes em excisão e,consequentemente, mais sensíveis do que o tipo selvagem para UV, os dímerospermanecem no DNA, ou em moléculas que podem ser precipitadas pelo ácidotricloroacético (Howard-Flanders et al ., 1966, Boyle & Setlow, 1970).

O DNA sintetizado por células uvr, logo após irradiação com UV, contémfragmentos que sedimentam mais lentamente em gradientes de sacarosealcalino em relação a células controle com o DNA não irradiado (Rupp &Howard-Flanders, 1968; Howard-Flanders et al , 1968).



INTRODUÇÃO

O objetivo do trabalho foi demonstrar se dímeros de pirimidina, induzidospor UV, permanecem no DNA após a irradiação ou se são transferidos paraalgum componente da fração precipitada com ácido.

Três premissas do modelo atual para o reparo pós-replicação foramtestados:

1) O número de dímeros de pirimidina no DNA irradiado deve permanecerconstante em células uvr ao longo do reparo;

2) Nenhum dímero deve aparecer no DNA replicado, mesmo que ocorram

trocas entre fitas irradiadas e moléculas filhas;

3) Fitas-molde sem dímeros devem ser detectadas em células irradiadas quecomeçaram a produzir moléculas-filhas de DNA de alto peso molecular.



MATERIAIS E MÉTODOS

Cepas bacterianas:

As bactérias utilizadas foram cepas derivadas de E. coli K12, como:

AB2487 recA13 ,

AB2499 uvrB5 ,

AB2500 uvrA6 ,

SR72 uvrB5 recA56 ,

SR111 recA13 , recB21 e SR159 recB21, uvrB5.

As colônias foram cultivadas à 37ºC, com meio mínimo, contendo glicose,aminoácidos, tiamina e timina.

Foram utilizados para o experimento culturas na fase exponencial, com cercade 108 células/mL.




Irradiações:

Aproximadamente de 2 a 4108 células/mL foram irradiadas com uma lâmpadagermicida a 254 nm.

A taxa de dose incidente foi 0,73 ergs/mm2.

As suspensões de células foram estimuladas durante a irradiação por umaplataforma rotativa shaker.

As culturas foram mantidas no escuro ou em luz amarela após a irradiação paraevitar a fotorreativação.




Fotorreativação:

As células foram fotorreativadas pela exposição à luz de uma lâmpada demercúrio de alta pressão (200W) filtrada numa placa de Petri para removercomprimentos de onda abaixo de 390nm.

A suspensão de células foi exposta por 30s, depois removida da luz por 30s enovamente exposta por 30s (total: 20min de exposição).




Marcação Radioativa:

1) Marcação simples

As cepas foram cultivadas por, pelo menos, 3 gerações em meio contendo 2g/mLde timina não-radioativa e 50Ci de [metil-3H] timina/mL. Após crescerem, foram

centrifugadas, lavadas 2 vezes e ressuspensas em 2mL de meio fresco contendo10g/mL de timina não-radioativa. As culturas foram então incubadas por 30minantes de serem irradiadas.

timina não-radioativa+ 50Ci de [metil-3H]

timina/mL




2) Marcação dupla

As cepas foram cultivadas por, pelo menos, 3 gerações em meio contendo 2Ci de[2-14C] timina/mL. Após crescerem, foram centrifugadas, lavadas 2 vezes eressuspensas em 2 ou 4mL de meio fresco contendo 1,610-5 M de timina não-radioativa. As culturas foram então incubadas por 30min antes de serem irradiadas.

Após a irradiação, [3

H] timidina foi adicionada para dar uma concentração final de10Ci/mL e as células foram reincubadas. Várias amostras em diferentes temposforam retiradas.

Controle: não-irradiado, tratado de forma igual, com marcação de [3H] timidina por60min.

2Ci de [2-14C]timina/mL

10Ci/mL de




3) Marcação dupla


Após a irradiação, [3

H] timidina foi adicionada para dar uma concentração final de10Ci/mL, e depois removida em 10, 15 e 20 min. As células foram filtradas, lavadase ressuspensas em 2 ou 4mL de meio contendo 810-5 M de timina não-radioativa.Após a reincubação, várias amostras em diferentes tempos foram retiradas.

Controle: não-irradiado, tratado de forma igual, com retirada de amostra após 10 ou

15min de incubação com [3

H] timidina.

2Ci de [2-14C] timina/mL

10Ci/mL de

10, 15 e 20min




4) Marcação dupla


Após a irradiação, as células foram reincubadas em meio contendo 1,610-5 metil-timina por 2h, seguido da adição de [3H] timidina (concentração final de 10Ci/mL).

Após 15min, foram retiradas amostras das células.

2Ci de [2-14C] timina/mL

10Ci/mL de




Esquemas de marcação radioativa:




Tratamento com a endonuclease:

A preparação da endonuclease continha 1200 unidades/mL e foi purificada poreletroforese de gel de acrilamida.

Unidade na presença de células infectadas pelo fago T4, libera 1 nmol de

nucleotídeos solúveis em ácido por hora. A enzima produzirá rupturas dos filamentossimples no DNA irradiado.

Amostras de 0,5mL de culturas contendo de 1 a 5108 células/mL foramcentrifugadas a 0°C, lavadas e ressuspensas em tampão de sacarose.

As células a serem tratados com a enzima foram primeiramente expostas a umalisozima e a um detergente para se tornarem permeáveis por 30min a 0ºC, seguidopelo tratamento com a endonuclease por 15min.

As condições da reação foram escolhidos para produzir o máximo número de

quebras de fita simples no DNA irradiado.




Gradientes alcalinos de sacarose:

O gradiente alcalino inibe a reação da endonuclease.

Foram usados gradientes lineares de 5 a 20% de sacarose, contendo 4,8 ou 3,7mLde solução, que foram centrifugados e coletados em frações para detectar

radioatividade (espectrofotômetro de cintilação).

As frações contendo os picos de energia foram usadas para calcular o pesomolecular médio, através do DNA do bacteriófago .




Síntese de DNA:

A síntese de DNA foi medida pela incorporação de timina radioativa usando umamodificação de um procedimento descrito por Smith et al ., 1968.

[metil-3H] timina foi adidionada às culturas em fase exponencial em meio contendo

1,610-5M de timina não-radioativa.

As células foram incubadas até chegar a uma densidade de cerca de 1108

células/mL (por pelo menos duas gerações).

Cada cultura foi dividido em três partes, duas das quais foram irradiadas, enquanto aterceiro serviu como controle não-irradiado.

As culturas foram reincubadas e amostras foram retiradas em diferentes intervalos,e a radioatividade no precipitado foi determinada.



RESULTADOS

a) Perda dos sítios sensíveis à endonuclease no DNA irradiado de célulasdeficientes em excisão:

Os dímeros de pirimidina induzidos pela UV permanecem no DNA irradiado aolongo do reparo pós-replicação?

O DNA foi marcado em células uvr antes da irradiação e foi observada suasensibilidade à endonuclease específica à UV do fago T4 em tempos diferentes.

O DNA das células incubadas 60 ou 120 minutos após a irradiação com UVsedimentaram mais rápido que o DNA das células retiradas imediatamente após

a irradiação, sugerindo uma perda progressiva de sítios sensíveis àendonuclease durante a incubação.

Essa reposta indica que dímeros são removidos do DNA irradiado sob essascondições ou são alterados, de modo que eles não seriam mais sensíveis ànuclease. Essa perda não é causada por excisão ou fotorreativação residual.



RESULTADOS



RESULTADOS= controle (não-irradiadas tratadas com enzima)

tratamento com endonuclease

em diferentes tempos



RESULTADOS

b) Aparecimento de sítios sensíveis à endonuclease no DNA após airradiação:

Existem sítios sensíveis à endonuclease no DNA sintetizado?

Célular marcadas com [14C] timina antes da irradiação e [3H] timidina após airradiação.

Após 2h, o tratamento com a enzima reduziu os DNAs a aproximadamente omesmo tamanho = a distância entre os sítios sensíveis eram os mesmos noDNA sintetizado e na fita-molde.

Após 10min, o DNA marcado com [3H] timidina foi heterogêneo em seutamanho.

Quando os gaps na fita filha foram preenchidos, e os fragmentos unidos em

moléculas maiores, a junção causou a inserção de sítios sensíveis à enzima.



RESULTADOS



RESULTADOS= controle (não-irradiadas tratadas com enzima)

tratamento com

endonuclease em DNAirradiado e sintetizado

2 h a p ó s i r r a d i a ç ã

o

1 0 m i n a p ó s i r r a d i a ç ã o



RESULTADOS

= controle (não-irradiadastratadas com enzima)

tratamento comendonuclease em DNAirradiado e sintetizado


o




RESULTADOS

= controle (não-irradiadastratadas com enzima)



o


DNA marcado com [3H]timidina = sintetizado



RESULTADOS

As posições relativas dos picos nas amostras tratadas com endonucleasesugerem que a distância entre os sítios sensíveis à endonuclease no DNAparental e sintetizado aumenta conforme o tempo de incubação.

Os sítios sensíveis à endonuclease também se tornaram menos frequentes noDNA com o aumento do tempo de incubação após a irradiação.

Essa perda de sítios ocorreu mais devagar em doses maiores (40 e 20ergs/mm2).

Células mutantes em recA foram utilizadas para testar se o DNA sintetizado

sedimenta da mesma forma que o DNA parental e se há efeitos após aincubação com a endonuclease.



RESULTADOS= controle (não-irradiadastratadas com enzima)

tratamento semendonuclease em DNAsintetizado = gaps não

preenchidos





tratamento semendonuclease em DNAsintetizado = gaps não

preenchidos



RESULTADOS

c) Sítios sensíveis à endonuclease no DNA sintetizado em 2 ou mais horasapós a irradiação:

Quando células deficientes em excisão são incubadas em meio de crescimentopor 2 ou mais horas após a irradiação e marcadas por 10min, a maioria do DNAmarcado sedimenta da mesma forma que o DNA controle não-irradiado.

Células marcadas por 10min imediatamente após a irradiação sedimentam maislentamente.

O DNA aparentemente intacto após 2 ou mais horas após a irradiação contêm

sítios sensíveis à endonuclease?

Após 2h de incubação, as fitas filhas apresentam sítios sensíveis àendonuclease, pois elas são clivadas e assim, aparecem fragmentos menoresno gradiente de sacarose.




2h / 15min com [3H]timidina

15min com [3H] timidina

15min com [3H] timidina/ 2h

tratamento comendonuclease emDNA irradiado e

sintetizado




2h / 15min com [3H]timidina

15min com [3H] timidina

15min com [3H] timidina/ 2h


sintetizado

DNA marcado com [3H]timidina = sintetizado



RESULTADOS

d) Fotorreativação de sítios sensíveis à endonuclease:

É específica para dímeros de pirimidina.

Os sítios sensíveis à endonuclease, particularmente aqueles observados noDNA sintetizado após a irradiação, são dímeros?

Após marcação com [3H] timidina, a cultura irradiada foi dividida em 2 partes:uma foi exposta à fotorreativação e a outra permaneceu no escuro.

Os sítios sensíveis à endonuclease foram removidos, tanto no DNA parental

quanto no DNA sintetizado.

As cópias de DNA sintetizado (não-irradiado) parecem ter dímeros.



RESULTADOS

E s c u r o

F o t o r r e a t i v a ç ã

o

= controle (não-irradiadas

tratadas com enzima)


sintetizado



RESULTADOS

e) Síntese de DNA e perda de sítios sensíveis à endonuclease após a

irradiação:

Os sítios sensíveis à endonuclease diminuem gradualmente no DNA parental esintetizado após a irradiação, com células em crescimento.

Dímeros produzidos pela irradiação podem ser gradualmente distribuídos entresucessivas gerações de moléculas-filhas de DNA.

A diminuição desses sítios deve se correlacionar com a quantidade relativa donovo DNA sintetizado após a irradiação.



RESULTADOS



RESULTADOS



RESULTADOS



DISCUSSÃO

A presença de dímeros de pirimidina torna o DNA suscetível à clivagem pela

endonuclease específica ao UV do fago T4.

A diminuição gradual dos sítios sensíveis à endonuclease nas células uvr irradiadas reflete uma remoção lenta dos dímeros.

Este processo é inibido pela ausência de aminoácidos requeridos pela célula,porém ela permanece passível de fotorreativação.

Os dímeros permanecem no DNA numa forma que pode ser reconhecida ereparada pela enzima de fotorreativação.

Os dímeros induzidos pela UV não são alterados ou removidos pelo DNAirradiado em células uvr quando o ciclo de replicação é terminado pela ausênciade aminoácidos.

Qualquer reparo nessas células requer a síntese de DNA.



DISCUSSÃO

A perda de sítios sensíveis à endonuclease no DNA irradiado poderia refletir a

remoção de dímeros nas fitas irradiadas, ou uma alteração tornando-asirreconhecíveis à enzima.

Como esses sítios aparecem nas fitas filhas, é provável que os dímeros sejamremovidos das fitas irradiadas e incorporados à moléculas-filhas.

Realmente são dímeros pois a fotorreativação diminiu os sítios sensíveis.

Experimentos de transferência de densidade evidenciaram que o DNA parentalirradiado troca fragmentos com fitas-filhas, sob condições similares. Esses

fragmentos podem incluir os dímeros.

Essa troca não ocorre de forma rápida, a tornar o DNA intacto. Uma lentadiluição de dímeros pode ocorrer gradualmente ao longo das sucessivasgerações de moléculas-filhas.



DISCUSSÃO

Enquanto houver dímeros persistindo na célula, a troca de dímeros continuará

ocorrendo.



DISCUSSÃO



AGRADECEMOSA ATENÇÃO!!!



Reparo pós-replicação em E. coli uvr (no escuro)




ó




selvagem

ó




selvagem

ó ã




R ó li ã E li ( )




R ó li ã E li ( )




R ó li ã E li ( )




R ó li ã E li ( )




R ó li ã E li ( )




R ó li ã E li ( )




recA

Documents

Seminário RadioFotob3