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Sequenciamento de DNASequenciamento de DNA
19771977• Max & Gilbert (Harvard – USA)Max & Gilbert (Harvard – USA)• Fred Sanger (Cambridge – Inglaterra)Fred Sanger (Cambridge – Inglaterra)
Método para determinar a sequência de Método para determinar a sequência de nucleotídeos em um fragmento de DNAnucleotídeos em um fragmento de DNApela síntese dessa molécula pela síntese dessa molécula in vitroin vitro
Método de SangerMétodo de Sanger(enzimático ou de terminação de cadeia)(enzimático ou de terminação de cadeia)
DNA em fita simples (molde)DNA em fita simples (molde)
PrimerPrimer (iniciador da síntese) (iniciador da síntese)
Desoxinucleotídeos (dNTP – A, T, G, C – marcados Desoxinucleotídeos (dNTP – A, T, G, C – marcados radioativamente)radioativamente)
Dideoxinucleotídeo (ddNTP)Dideoxinucleotídeo (ddNTP)
Enzima polimeraseEnzima polimerase
Componentes do sequenciamento Componentes do sequenciamento
Desoxi
Permite extensão da fita no final 3’ Previne a extensão da fita no final 3’
rribonucleosídeo trifosfato didesoxi rribonucleosídeo trifosfato
HHHHHHHH
HH
Método enzimático para sequenciamento de DNA
(Sanger e col., 1977)GCATATGTCAGTCCAG
CGTATACAGTCAGGTC
5’5’3’
3’DNA
fita dupla
CGTATACAGTCAGGTC3’ 5’DNA
fita simplesGCAT5’ 3’Iniciador + DNA polimerase
+ excesso de dATP, dTTP, dGTP, dCTP
GCAT AATGTCAATGTCAGTCCA ATGTCAGT
ATGTAT
ATGTCAGTCCATGTCAGTCATGTC
ATGTCAGTCCAGGCATGCAT
GCATGCATGCAT
GCATGCATGCAT
GCATGCATGCAT
ATGTCAGATG
+ddATP +ddTTP +ddCTP +ddGTP
Método de sequenciamentoenzimático (manual)
Método enzimático para sequenciamento de DNA
(Sanger e col., 1977)
A T C G GACCTGACTGTA
3’
5’
GGTTGGCCAACC GGGGCCCCTTCCCCCCTTGG
Sequenciamento direto de DNA (gene Sequenciamento direto de DNA (gene 22) de portador da) de portador da Hb Westmead (Hb Westmead (122 122 HisHisGln)Gln)
His His GlnGln
GG AA CC TT
Sequenciamento automáticoSequenciamento automático
Permite a análise simultânea de diversos segmentos de Permite a análise simultânea de diversos segmentos de DNADNA
Utilizado para sequenciamento de larga escalaUtilizado para sequenciamento de larga escala
Nucleotídeos marcados com fluorocromo (quatro Nucleotídeos marcados com fluorocromo (quatro corantes diferentes)corantes diferentes)
Emitem luz em diferentes comprimentos de ondas Emitem luz em diferentes comprimentos de ondas quando excitados por um quando excitados por um laserlaser
SequenciamentoSequenciamentoautomático de automático de
DNADNA
DNA de fita simplescom o inserto clonadoa ser sequenciado
Adição deconstituintes dasreações desequenciamento
Terminadores didesoxi
Primer universal doM13 com marcadorfluorescente
Fitas de DNA sintetizadomarcadas
Mistura dasquatro reações
Processamento dos por um computador
Detecção com fotomultiplicador
Excitação do marcador fluorescente com laser
Sequenciamento de DNA automático
GCATATGAGCGTATACTC
5’3’ 5’
3’ DNAfita dupla
ddATP ddCTP ddTTP ddGTP Terminadoresdideoxi+ + + +
CGTATACTC CGTATACTC CGTATACTC CGTATACTCGCAT GCAT GCAT GCAT
Primer com marcadores fluorescentes
Sequenciamento de DNA automático
Gel de sequenciamentoLaserFotomultiplicador
Resultados processados em um
computador
Mistura das 4 reaçõesde sequenciamento
TiminaTimina
AdeninaAdenina
GuaninaGuanina
CitosinaCitosina
Sequenciamentode DNA
C T C G A A A C A A A A A A G G A A T T A G G T C
GGA nt 30.864, aa248, ArgA nt 30.864, aa248, Arg Gln Gln
11 22
11 22 33 44
11 CCGGA A CCAAAA
22
G (normal)G (normal)
11
11 22 33 44
11
G/A (heterozigota)G/A (heterozigota)
RR
11 22
11 22 33 44
11