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Sequenciamento de Nova Geração (NGS)
Msc. Frederico Schmitt Kremer // doutorando PPGB
Nos episódios anteriores ...
Sequenciamento “Clássico”
Engloba os métodos desenvolvidos por Sanger et al (1977) e Maxam & Gilbert (1977).
Frederick Sanger
Walter Gilbert
Por questões de praticidade, o método de Sanger acabou se tornando o padrão ouro para sequenciamento até os anos 2000.
Sequenciamento “Clássico”
Engloba os métodos desenvolvidos por Sanger et al (1977) e Maxam & Gilbert (1977).
Frederick Sanger
Walter Gilbert
Por questões de praticidade, o método de Sanger acabou se tornando o padrão ouro para sequenciamento até os anos 2000.
Sequenciamento capilar
Vantagens do método de Sanger
Alta confiabilidade.
Possibilidade de leituras com até 1 Kb.
Baixo custo / amostra.
Ideal para estudo de genes específicos.
mas ...
Baixo throughput.
Grande dificuldade para sequenciar genomas, transcriptomas e metagenomas.
No máximo 96 amostras por vez.
Plataformas de NGS
Roche 454Segunda Geração
454
Primeira plataforma de Next Generation Sequencing (NGS).
Lançado em 2004 pela empresa Roche.
Utiliza como como base o piro-sequenciamento.
Leituras relativamente menores que as obtidas pelo método de Sanger (~700 bp).
454: Vantagens
Tamanho de leitura comparável ao obtido pelo método de Sanger.
Alto throughput.
Disponibilidade de vários tipos de bibliotecas (single-end, paired-end e mate-pair).
454: Desvantagens
Problema em regiões homopoliméricas.
Illumina (Solexa)Segunda Geração
Illumina
Atualmente o padrão-ouro para muitas das análises de NGS.
Utiliza como como base o sequenciamento por síntese (SBS).
Três linhas de equipamentos: MiSeq, NextSeq e HiSeq.
Metodologia extremamente versátil e barata.
Leituras de 30 bp nas primeiras versões, e agora de 120x2 em HiSeq e 250x2 em MiSeq.
Illumina
Illumina MiSeq.
Illumina
Illumina Lane.
Illumina: Vantagens
Alto throughput (principalmente nas versões HiSeq).
Extremamente versátil.
Grande variedade de protocolos para sequenciamento e análise de dados.
Padrão da indústria.
Serviço de sequenciamento NGS
Centros de pesquisa
Empresas nacionais
454: Desvantagens
Problema em regiões com extremo de conteúdo GC (GC%).
SOLiDSegunda Geração
SOLiD
Plataforma de sequenciamento de ultra-high throughput.
Baseado em hibridização e ligação.
Permite o sequenciamento de genomas e transcriptomas com alta confiabilidade e cobertura (depth / coverage).
Trabalha com leituras extremamente curtas (30 - 50 bp).
Suporte à leituras mate-pair.
ABI SOLiD
Sequenciamento por ligação
Sequenciamento por ligação
Vantagens
Alta cobertura.
Excelente para identificação de SNPs e INDELs.
Alta acurácia.
Desvantagem
Problemático para para montagem de novo de genomas devido ao tamanho das leituras.
Grande volume de dados exige grande capacidade computacional.
O equipamento e reagentes são caros se comparado às tecnologias Illumina Ion Torrent.
Ion TorrentSegunda Geração
Ion Torrent
Plataforma de sequenciamento atualmente distribuída pela Thermo Fisher (antiga life technologies).
Baseada em sequenciamento semicondutor (por pH).
Plataforma focada em velocidade e praticidade (é considerada a mais rápida para sequenciamento de genomas).
Baixo custo.
Ion Torrent
Ion Torrent PGM Ion Torrent S5
Sequenciamento semicondutor
Ion Torrent Chip (316) Ion Torrent Chip (estrutura)
Sequenciamento semicondutor
Ion Torrent Chip loading
Vantagem
Equipamento e reagentes são baratos.
Menos de 1 dia para se preparar o DNA e obter os dados do sequenciamento.
Desvantagem
Problema com sequências homopoliméricas (da mesma forma que o 454).
PacBioTerceira Geração
PacBio
Primeira tecnologia comercial de terceira geração.
Possibilita a geração de reads com até 20 Kb.
Baseada em sequenciamento de molécula individual em tempo real, e análise se cinética da polimerase.
Vantagens
Leituras longas facilitam o processo de montagem de genomas e transcriptomas.
Análise de cinética enzimática possibilita a identificação de modificações em bases, incluindo modificações epigenética.
Desvantagens
As primeiras versões apresentavam uma alta taxa de erro (~10% da bases).
Problemas com reads quiméricas que são formadas durante o preparo do DNA.
Custo elevado do equipamento e dos reagentes.
Oxford NanoporeTerceira Geração
Oxford Nanopore
Sequenciamento baseado na análise do sinal elétrico gerado pela passagem de um fragmento de DNA por um poro proteico transmembrânico.
Tecnologia extremamente portátil.
Sequenciador descartável.
Leituras > 20 Kb.
Oxford Nanopore
Oxford Nanopore
Oxford Nanopore
Vantagens
Leituras longas equiparáveis às da PacBio.
Equipamento barato (mas descartável) (~1000 dólares).
Portabilidade permite o uso do sequenciamento de nova geração em pesquisas de campo.
Desvantagem
Alta taxa de erros.
Ainda em estágio beta.
Poucos protocolos disponíveis.
Bibliotecas de NGS
Single-end
Sequenciamento de apenas uma das extremidades dos fragmentos da amostra.
Forma mais simples (e barata) de biblioteca.
Também denominada “biblioteca de fragmento”.
Paired-end
Sequenciamento de ambas as extremidades dos fragmentos da amostra.
Sequências podem ser sobreponíveis ou espaçadas.
Disponível para 454 e Illumina, sendo hoje o padrão de facto.
Paired-end
Mate-pair
Similar ao sequenciamento paired-end, mas com um espaçamento maior entre as leituras.
Mais cara, e com maior taxa de erros (false-mates).
Também denominada “jump library”.
Mate-pair
Aplicações
Whole-Genome Shotgun (WGS)
“Democratizada” pelo NGS.
Sequenciamento, montagem e anotação de genomas.
Genomas rascunho e finalizados.
Resultou em um crescimento exponencial no número de genomas disponíveis em banco de dados públicos.
Whole-Genome Shotgun (WGS)
WGS: Pangenoma
RNA-Seq
Sequenciamento de mRNA e miRNAs através do cDNA.
Análise pode ser de novo ou guiada por um genoma de referência.
Pode ser utilizada para comparar o efeito de diferentes condições na expressão gênica.
RNA-Seq: expressão diferencial
Análise de Variantes
Identificação de regiões mutadas ou divergentes em relação à uma sequência de referência.
INDELs, SNPs e CNVs são as mais analisadas.
Sequenciamento de Exoma
Metagenômica
Sequenciamento do total DNA de uma amostra.
Single-cell sequencing
Dúvidas?
Obrigado! ^^
