Sequenciamento usando o Método de Sanger

Luiz Claudio Santana da SilvaMaira Cicero Ferreira

Histórico• 1975: primeira descrição do sequenciamento.

• Esse procedimento foi feito usando DNA polimerase, primer, dNTP e ddNTP marcadas por 32P.

Sanger, Coulson, 1975.

dNTPs

Paulo José Pereira Lima Teixeira. Tecnologias de sequenciamento de DNA.

ddNTPS

SANGER, NICKLEN, COULSON. 1997

ddNTPS

• Atkinson mostrou a atividade inibitória do ddTTP (2´3´dideoxitimidina trifosfato).

• Após a incorporação do ddTTP ocorre a inibição da síntese da cadeia.

ATKINSON, DEUTSCHER, KORNBERG, RUSSELL, MOFFATT. 1969 SANGER, NICKLEN, COULSON. 1997

Metodologia

• Desnaturação do DNA de dupla fita.

• Primers: iniciam a reação feita pela DNA polimerase, nesse momento será definido qual a cadeia que será usada como molde.

Sanger, Coulson, 1975.

Metodologia

• Usam-se baixas concentrações de ddNTPs e altas concentrações de dNTPs.

• Em cada reação, um ddNTP é incorporado aleatoriamente ao invés do dNTP correspondente, provocando a terminação da polimerização.

Sanger, Coulson, 1975.

ddNTP marcada por 32P

• Feitas 4 reações: uma para cada base ddNTP marcada por 32P.

• Formados diversos fragmentos com tamanhos variados, de acordo com a posição e o ddNTP incorporado.

Sanger, Coulson, 1975.

ddNTP marcada por 32P

• Feito gel desnaturante de poliacrilamida.

• A autoradiografia é feita após a corrida do gel.

Sanger, Coulson, 1975.

Leitura

• Após autoradiografia a ordem dos nucleotídeos, pode ser visualizada.

• Porém, esta será complementar ao molde.

Sanger, Coulson, 1975.

Paulo José Pereira Lima Teixeira. Tecnologias de sequenciamento de DNA.

Sanger, Coulson, 1975.

Sequenciadores automáticos

• Criado em 1986 pela Applied Biosystems.

• O princípio é o mesmo do sequenciamento manual feito por Sanger.

• ddNTPs são marcados por fluorescência característica, permitindo a distinção das cadeias truncada pela respectiva fluorescência.

Sequenciadores automáticos

• Feita a eletroinjeção onde as moléculas de DNA(-) em suspensão são introduzidas nos capilares.

• Cada fragmento, recebe um feixe de laser de argônio, que será detectado por um sistema óptico e uma câmara de CCD.

Sequenciadores automáticos

• A ordem em que os diferentes fragmentos passam pelo detector de fluorescência indica a sequência da cadeia de DNA complementar à cadeia usada como molde.

Paulo José Pereira Lima Teixeira. Tecnologias de sequenciamento de DNA.

Formato de saída – AB1

Formato de saída- AB1

Formato de saída – AB1

Formato de saída – PHD

NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTCTTATATANNATTCCCGCCTTCNNTAAAGTATGCAAATAATGTCTGGTTTTAAAGTAATGATTAACTGCATGCTCAGGATAATAGGGTTTGATGCCTTTATCCATGGGAAAATATTTGGTAACCTTAGGATAAAATCTAGCTGGCATAACCAATTTTAATCTTCGTAATTCATTTTTAGTAAGTGGGCCTACAAATTGTTCACATTTAGAAATCAGGTCTTGATGCAAATGAATATTAGGAAAAGAAGNANTGNACCAGTTAGGATTAAAAGCAGGCACAGTAGAAGAGTAAAGCCCCGTAAAGTTTCCCACCTTATGAGTCCAAGGAATACTAACATTGGNAAGCTGGAGATTGAGATCTGCGGCGACGCGGTGATTGAGATCTTCGTCTGCGAGGNGAGNNAGTTCTTCTNCTAGGGGACCTGCCTCGTCGNCTAACAACAGTAGTTTCCGGAAGTGTGNATAGGATAGGGGCNTTTGGTGGTCTGTANGCAGGANGAGTGCGAATCNNCACTCNNAAGGACACCAAATACTCTAGNACTGTNCTCTTCCAAAAGTAAGGCAGGAAATGTGANNNNACANCAGNNGTCTANNTTNNNNNNNNNNNNNNNNAACNTAGNNAACTACTAAANCCCTANCTNNNNCNNNNCANNNNNNNNNNCNCCCNAGNNNGCNANNNNCATNNCCTNNNNCNNNANANNNNNNANNNTNNCTNNNNNCCNTNNNGNNNNNAANNNNNNANNNNCAGNNNANNNNNNNNNNNNNNNNNAANNNNNNNNNNNNNNNTNNNNNANNNNNNNNNNNNGGNNNANNCANNNNNN

Formato de saída – SEQ

Resumo do método Sanger

Paulo José Pereira Lima Teixeira. Tecnologias de sequenciamento de DNA.

Principal aspecto positivo

• Leitura de fragmentos longos.

Principal aspecto negativo

• Valor elevado por base sequenciada.

Paulo José Pereira Lima Teixeira. Tecnologias de sequenciamento de DNA.

RESUMO DAS PLATAFORMAS

RESUMO DAS PLATAFORMAS

Björn Nystedt, 2011

RESUMO DAS PLATAFORMAS

Björn Nystedt, 2011Glenn, 2011

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