Síntese e caracterização físico-química de ...sites.poli.usp.br/p/augusto.neiva/TCC/arquivos/1349295147.pdf · 3 DANILO HENRIQUE STAVRO DUARTE Síntese e caracterização físico-química

Escola Politécnica da Universidade de São Paulo

DANILO HENRIQUE STAVRO DUARTE

Síntese e caracterização físico-química de nanopartículas proteína-

DNA-metal visando à aplicação em estudos de entrega gênica

São Paulo

2012

2

3

DANILO HENRIQUE STAVRO DUARTE

Síntese e caracterização físico-química de nanopartículas proteína-

DNA-metal visando à aplicação em estudos de entrega gênica

Trabalho de conclusão do curso de Engenharia

Química da Escola Politécnica da Universidade de

São Paulo

Orientadores: Prof. Dr. Adriano Rodrigues Azzoni

Prof. Dr. Marcelo Seckler

São Paulo

2012

4

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho ao meu avô Constantino (em memória).

5

AGRADECIMENTOS

Aos professores orientadores, pela paciência, dedicação e prontidão no

auxílio à execução deste trabalho.

À amiga Renata Lippi pela grande contribuição na primeira etapa deste TCC.

Ao Roberto Ângelo, mestrando em síntese de nanopartículas de prata, pelo

auxílio com o tema de sua especialidade.

Ao Rafael Alves, aluno de mestrado em bioquímica, pelo acompanhamento e

instrução.

À Juliana Grijo, aluna de graduação, pelo auxílio nos experimentos realizados.

Ao Marcelo Szymanski, doutorando em bioquímica na Unicamp, pela ajuda

com a transfecção das células.

Aos amigos e família pelo apoio moral, por estarem sempre prontos a me

ajudar e pelo carinho. Especialmente minha mãe, Cláudia, minha namorada,

Gabriele e minha avó Denilde.

6

RESUMO

A terapia gênica tem sido apontada como uma alternativa promissora para o

tratamento de diversas doenças. Essa técnica baseia-se na inserção de genes em

células de indivíduos, carregados por meio de diferentes vetores (virais e não virais).

Os vetores não virais são complexos formados pela associação de material genético

(pDNA) com proteínas, lipídeos, polímeros, nanopartículas metálicas, etc. Apesar de

menos eficientes, tem a vantagem de serem de simples manipulação, podendo ser

sintetizados de acordo com a finalidade do uso. Como característica fundamental,

estes complexos procuram mimetizar as estratégias utilizadas pelos vírus para

superar as barreiras físicas, enzimáticas e difusionais que limitam a entrega gênica.

Contudo, a falta de estudos sistemáticos sobre a estabilidade e formação destes

complexos dificulta seu emprego e a reprodutibilidade de resultados. Este trabalho

tem como objetivo o estudo sistemático da formação de complexos pDNA-proteína-

nano partículas metálicas, utilizando-se um pDNA modelo (com gene repórter), uma

proteína modelo (Protamina) e nano partículas sintetizadas a partir de sais de prata

(Lee, et al., 1982). A cinética de formação, a estabilidade e parâmetros físico-

químicos, como tamanho e a carga dos complexos, foram analisados, através de

experimentos como o DLS, eletroforese e potencial Zeta, e relacionados com a

entrada das partículas nas células. Como resultados, a eletroforese em gel de

agarose confirma a formação do complexo. O potencial Zeta, ainda que preliminar,

indicou que as partículas são carregadas positivamente. Os ensaios de microscopia

eletrônica de varredura não foram conclusivos, por causa de possíveis

sobreposições de partículas. O DLS nos forneceu um tamanho de complexo maior

para as razões mássicas maiores de AgNPs, mas não está condizente com a

transfecção, que resultou numa eficiência igual para todas as amostras com prata.

Podemos afirmar com certeza que as nanopartículas de prata influenciam na

entrega gênica, pois os resultados de transfecção para essas amostras são maiores

que as restantes. É difícil, por enquanto, dizer o mecanismo ou o por quê isso

acontece, mas é efetivo.

Palavras-chave: entrega gênica, nanopartículas de prata, complexo

pDNA:Protamina:Metal.

7

ABSTRACT

The gene therapy has been pointed as a promising alternative with respect to

the treatment of diverse illnesses. This technique is based on the insertion of genes

in cells of individuals, carried by different vectors (viral and non viral). The non viral

vectors are complexes formed by the association of genetic material (pDNA) with

proteins, lipids, polymers, metallic nanoparticles, etc. Although less efficient, it has

the advantage to be of simple manipulation, being able to be synthesized in

accordance with the purpose of the use. As characteristic basic, these complexes try

to copy the strategies used for the viruses to surpass the physical, enzymatic and

diffusional barriers that limit the gene delivery. However, the lack of systematic

studies on the stability and formation of these complexes make it difficult its job and

the reproducibility of results. This work has as objective the systematic study of the

formation of complexes pDNA-protein-metallic nanoparticles, using one model pDNA

(with a reporter gene), a model protein (Protamina) and nanoparticles synthecized

from silver salts (Lee, et al., 1982). The formation kinetic, the stability and the

physicist-chemistries parameters, as the complexes’ size and load, had been

analyzed, through experiments as the DLS, electrophoresis and Zeta potential, and

related with the entrance of particles into the cells. As results, we have that

electrophoresis is only a data that confirms the formation of the complex. The Zeta

potential make us conclude that the complex is positive. The scanning electron

microscopy is not conclusive, because of the overlapping particles. The DLS has

provided us a bigger size of complex for the bigger mass reasons of AgNPs, but he is

not consistent with the transfection, that resulted in an equal efficiency for all the

samples with silver. We can affirm with certainty that silver nanoparticles influences

in the gene delivery, therefore the results of transfection for these samples are better

that the remains. It is difficult to say the mechanism or the reason it happens, but it is

effective.

Key words: gene delivery, silver nanoparticles, pDNA:Protemine:Metal complex.

8

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Tipos de vetores de terapia gênica usados em testes clínicos (Park, et al.,

2011), maioria vetores virais. .................................................................................... 16

Figura 2 - Principais barreiras à expressão gênica durante o tráfego de vetores de

pDNA: (1) degradação por nucleases extracelulares; (2) entrada na célula; (3)

endocitose; (4) degradação no endossoma; (5) escape do endossoma; (6)

degradação por nucleases citosólicas; (7) entrada no núcleo; (8) transcrição; (9)

exportação do mRNA; (10) tradução. ........................................................................ 16

Figura 3 - Caminhos do vetor de entrega gênica. (a) Polinfecção e (b) Lipofecção. . 18

Figura 4 - Mecanismo de transfecção, suas dificuldades e caminhos (Cartier, et al.,

2002) ......................................................................................................................... 20

Figura 5 - Entrada de um vetor viral na célula alvo ................................................... 22

Figura 6 - a) Partículas carregadas se repelem umas das outras, enquanto b)

partículas sem carga ficam livres para colidirem e agregarem.................................. 31

Figura 7 - Ilustração das camadas de Stern e da camada Difusa. ............................ 32

Figura 8 - Potencial Zeta e potencial de superfície. .................................................. 33

Figura 9 - Amostra a ser analisada ........................................................................... 35

Figura 10 - Demonstração da dependência do espalhamento em relação à fase da

onda. ......................................................................................................................... 35

Figura 11 - Diferença da variação da intensidade com o tempo para partículas

grandes e pequenas. ................................................................................................. 36

Figura 12 - Intensidade de sinal no tempo. ............................................................... 36

Figura 13 - Coeficiente de correlação em função do tempo. ..................................... 37

Figura 14 - Dependência do volume e da intensidade com o tamanho das partículas

para duas populações com igual quantidade. ........................................................... 38

Figura 15 - Equipamento de eletroforese em gel. ..................................................... 38

Figura 16 - Gel de agarose após electroforese de fragmentos de DNA. ................... 40

Figura 17 - Amostra de nanopartículas de prata com 15 minutos de reação ............ 42

Figura 18 - Curva espectrofotométrica das nanopartículas de prata ......................... 43

Figura 19 - Amostra de nanopartículas de prata centrifugadas ................................. 44

Figura 20 - MEV das nanopartículas de prata a pH = 9 e 90°C ................................ 47

Figura 21 - Eletroforese em agarose de partículas pDNA e protamina ..................... 51

9

Figura 22 - Amostra de complexo pDNA-Protamina-Metal para ensaio de

eletroforese ............................................................................................................... 53

Figura 23 - Eletroforese em gel dos complexos ternários ......................................... 54

Figura 24 - MEV para razão mássica 1:5:0,5 ............................................................ 57

Figura 25 – Microscopia eletrônica de varredura de amostra diluída e razão mássica

1:5:0,5 ....................................................................................................................... 59

Figura 26 - Resultados de transfecção celular, nas diferentes razões mássicas de

pDNA:protamina:NpAg estudas, utilizando-se células HeLa cultivadas in vitro. ....... 62

Figura 27 - Laudo 1 do Zeta para nanopartículas em pH = 7,4 ................................. 69



Figura 30 - Laudo 1 do Zeta para nanopartículas em pH = 9 .................................... 70



Figura 33 - Laudo 1 do Zeta para complexos ternários razão 1:5:0,5 ....................... 72



Figura 36 - Laudo 1 do Zeta para complexos ternários razão 1:5:2 .......................... 73






Figura 42 - Laudo 1 do DLS para complexos ternários razão 1:5:0,5 ....................... 77



Figura 45 - Laudo 1 do DLS para complexos ternários razão 1:5:2 .......................... 78






Figura 51 - MEV para razão mássica 1:5:0,5 aumentada ......................................... 82

10

Figura 52 - MEV para razão mássica 1:5:4 ............................................................... 83

Figura 53 - MEV para razão mássica 1:5:4 aumentada ............................................ 83


1:5:0 .......................................................................................................................... 84


1:5:0,5 com zoom ...................................................................................................... 84


1:5:4 com zoom ......................................................................................................... 85


1:5:4 .......................................................................................................................... 85

Figura 58 - EDS da amostra de razão mássica 1:5:0 ................................................ 86

Figura 59 - EDS do aglomerado da amostra de razão mássica 1:5:0 ....................... 86

Figura 60 - EDS 1 da amostra de razão mássica 1:5:0,5 .......................................... 87



Figura 63 - EDS 1 da amostra de razão mássica 1:5:4 ............................................. 88



11

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Comparação dos métodos de transfecção. .............................................. 21

Tabela 2 - Comparação entre tipos de vetores de entrega gênica. ........................... 23

Tabela 3 - Resultado do ensaio de potencial Zeta para as nanopartículas de prata . 45

Tabela 4 - Amostras de ensaio de eletroforese ......................................................... 51

Tabela 5 - Volume das composições das amostras .................................................. 52

Tabela 6 - Valores do potencial Zeta para os complexos ternários ........................... 55

Tabela 7 - Resultados do ensaio DLS ....................................................................... 55

Tabela 8 - Ensaio de EDS das amostras de MEV com diluição ................................ 60

12

LISTA DE ABREVIATURA E SIGLAS

AgNP ou NPAg Nanopartículas de prata

pDNA DNA plasmidial

MEV Microscopia eletrônica de varredura

Rcf Força centrífuga relativa

PBS Tampão fosfato salino

TAE Tris-Acetato-EDTA

EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético

DLS Dynamic Light Scattering

EDS Espectroscopia de raios X por dispersão em energia

13

SUMÁRIO

2.1. DIFICULDADES DE ENTREGA GÊNICA .................................................... 18

2.2. VETORES VIRAIS ....................................................................................... 21

2.3. VETORES NÃO VIRAIS ............................................................................... 23

2.3.1. Proteína e pDNA .................................................................................... 24

2.3.2. Nano partículas como vetores ............................................................... 25

3.1. MATERIAIS UTILIZADOS ............................................................................ 27

3.1.1. Método para síntese das AgNPs ........................................................... 27

3.1.2. Método de síntese de partículas de pDNA-Proteína .............................. 27

3.1.3. Preparo de complexos pDNA-Proteína- AgNP ...................................... 28

3.1.4. Transfecção em células animais ............................................................ 29

3.2. CARACTERIZAÇÃO DOS VETORES ......................................................... 30

3.2.1. Potencial Zeta ........................................................................................ 30

3.2.2. Tamanho das partículas por DLS (Dynamic Light Scattering) ............... 33

3.2.3. Eletroforese em gel de agarose ............................................................. 38

4.1. CARACTERIZAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS DE PRATA ....................... 42

4.1.1. Síntese das nanopartículas ................................................................... 42

4.1.2. Potencial Zeta ........................................................................................ 44


4.1.4. Microscopia eletrônica de varredura ...................................................... 46

4.2. CARACTERIZAÇÃO DOS COMPLEXOS TERNÁRIOS .............................. 49

4.2.1. Eletroforese ........................................................................................... 49

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................... 15

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................... 18

3. MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................. 27

4. RESULTADOS E DISCUSSÕES ........................................................................ 42

14

4.2.2. Potencial Zeta ........................................................................................ 54


4.3. MICROCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA ......................................... 56

4.4. TRANSFECÇÃO CELULAR ......................................................................... 61

Em pH = 7,4 ........................................................................................................ 69

Em pH = 9 ........................................................................................................... 70

ANEXO B – LAUDOS DO ZETA PARA OS COMPLEXOS TERNÁRIOS .............. 72

Razão 1:5:0,5 ..................................................................................................... 72

Razão 1:5:2 ........................................................................................................ 73

Razão 1:5:4 ........................................................................................................ 75

ANEXO C – LAUDOS DO DLS PARA OS COMPLEXOS TERNÁRIOS ................ 77

Razão 1:5:0,5 ..................................................................................................... 77

Razão 1:5:2 ........................................................................................................ 78

Razão 1:5:4 ........................................................................................................ 80

ANEXO D – MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA DOS COMPLEXOS

TERNÁRIOS .......................................................................................................... 82

Amostras sem diluição ........................................................................................ 82

Amostras com diluição ........................................................................................ 84

EDS das amostras com diluição ......................................................................... 86

5. CONCLUSÃO ..................................................................................................... 64

6. SUGESTÃO PARA FUTUROS TRABALHOS .................................................... 65

REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 66

ANEXOS ................................................................................................................... 69

ANEXO A - LAUDOS DO ZETA DAS NANOPARTÍCULAS ...................................... 69

15

1. INTRODUÇÃO

O desenvolvimento da transferência genética de forma segura e eficiente é

indispensável para o sucesso da terapia gênica (Shim, et al., 2010). Moléculas de

DNA não entram na célula de modo eficiente devido ao tamanho e natureza

aniônica. Além disso, são também muito suscetíveis a degradação por enzimas

(nucleases). O grande desafio da terapia gênica é realizar essa entrega de forma

eficiente e segura (Al-Dosari, et al., 2009).

Embora os vetores virais sejam mais usados para este fim, as preocupações

com segurança (os vetores virais são de difícil produção e podem causar sérias

reações inflamatórias em organismos) mudaram o foco para as técnicas de vetores

não virais. Estes vetores além de serem mais seguros são também mais versáteis,

pois podem ser construídos de acordo com o seu destino (Shim, et al., 2010). A

Figura 1 apresenta os diferentes tipos de vetores utilizados até o momento em testes

clínicos.

Alguns vetores não virais tem se mostrado eficientes para a transposição das

barreiras físicas e químicas que o impedem de realizar a transfecção gênica (Al-

Dosari, et al., 2009). Dentre as barreiras, temos a matriz extracelular, a membrana

da célula, a matriz intracelular e a membrana nuclear. Segundo (Shim, et al., 2010) e

(Cartier, et al., 2002), dentre as várias barreiras enfrentadas pelo vetor, o

rompimento das vesículas endossomais (após a entrada na célula por endocitose) e

a dissociação dos ácidos nucleicos do vetor de entrega quando este chega ao

interior da célula são as principais. Para ultrapassar esses obstáculos os vetores não

virais são complexos formados por diferentes combinações de DNA (normalmente

na forma de pDNA plasmidial), elementos catiônicos para a condensação deste,

compostos lipídicos para aumentar a proteção e a afinidade com a membrana da

célula, e ligantes adicionais para ajudar na entrega.

Os parâmetros a serem considerados para avaliar a eficácia dos vetores na

entrega gênica são o tamanho, formato, carga superficial e estabilidade (Adler, et al.,

2010).

16

Figura 1 - Tipos de vetores de terapia gênica usados em testes clínicos (Park, et al., 2011), maioria vetores virais.

A Figura 2 ilustra as principais barreiras que um vetor de entrega gênica pode

enfrentar, sendo eles: (1) degradação por nucleases extracelulares; (2) entrada na

célula; (3) endocitose; (4) degradação no endossoma; (5) escape do endossoma; (6)

degradação por nucleases citosólicas; (7) entrada no núcleo; (8) transcrição; (9)

exportação do mRNA; (10) tradução.

1

2 3

4

5

6

7

8

9

10

Figura 2 - Principais barreiras à expressão gênica durante o tráfego de vetores de pDNA: (1) degradação por nucleases extracelulares; (2) entrada na célula; (3) endocitose; (4) degradação

no endossoma; (5) escape do endossoma; (6) degradação por nucleases citosólicas; (7) entrada no núcleo; (8) transcrição; (9) exportação do mRNA; (10) tradução.

Adenovirus 24,7% (n=331)

Retrovirus 22,8% (n=305)

Naked/Plasmid DNA 18% (n=241)

Lipofection 7,6% (n=102)

Vaccinia virus 6,8% (n=91)

Poxvirus 6,4% (n=86)

Adeno-associated virus 3,5% (n=47)

Herpes simplex virus 3,2% (n=43)

RNA transfer 1,3% (n=17)

Other categories 2,7% (n=36)

Unknown 3% (n=40)

17

Uma tecnologia que começou a ser usada na entrega de genes é a adição de

nano partículas metálicas ao complexo pDNA - proteína. Partículas de ouro, por

exemplo, conferem maior resistência à degradação da protease e à temperatura

(DeLong, et al., 2009).

Com isso, vamos focar nossos estudos nas caracterizações de parâmetros

que influenciam essa entrega gênica, tanto em complexos formados pela associação

de pDNA - proteína (complexos binários) como, principalmente, complexos ternários

formados por pDNA-proteína-metal.

18

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1. DIFICULDADES DE ENTREGA GÊNICA

A terapia gênica se baseia em entrega de um gene em uma célula para que

esta possa realizar uma função nova ou para a substituição de um gene defeituoso.

Algumas entregas de RNA no citoplasma da célula são suficientes para realizar a

tarefa desejada, mas na maioria dos casos um DNA deve ser entregue no núcleo

para produzir um RNA que produzirá uma proteína de interesse, por exemplo

(Wagner, 1999).

Diversas barreiras são enfrentadas e afetam a eficiência da entrega do DNA.

Dentre essas barreiras temos: epitélio e endotélio (para inserção in vivo), matriz

extracelular, membrana celular, matriz citoplasmática, membrana nuclear e matriz

nuclear (Al-Dosari, et al., 2009).

A matriz extracelular pode ter nucleases que destruiriam facilmente o DNA,

logo este deve estar protegido. A etapa mais crítica, considerada limitante do

processo, é a passagem pela membrana da célula. Segundo a figura abaixo, o vetor

tem dois caminhos de interação com membranas. A: transferência direta do DNA na

membrana celular por fusão das membranas celulares e vetoriais ou passagem do

vetor através da membrana celular. B: entrada através de endossomo ou outra

vesícula interna, seguido de uma passagem para o citoplasma com rompimento da

membrana vesicular (Wagner, 1999) (Al-Dosari, et al., 2009) (Cartier, et al., 2002).

Figura 3 - Caminhos do vetor de entrega gênica. (a) Polinfecção e (b) Lipofecção.

19

Para os vetores capturados via endocitose, a vesícula é transformada em

vacúolo digestivo. Para escapar desta barreira, dois mecanismos são propostos. O

primeiro envolve o uso de membranas ativas ou moléculas que possam romper com

os vacúolos, tais como proteínas ou lipídios com porções hidrofóbicas. O segundo é

o uso de pressão osmótica, que é feita ligando-se o DNA com componentes de

amina ou polímeros catiônicos que absorvem prótons e diminuem a acidificação que

é essencial na transformação de endossomo para lisossomo. Consequentemente,

contra íons cloreto produzem uma pressão osmótica no endossomo.

A próxima barreira é o citoplasma celular. Nele o vetor encontra alguns

obstáculos, tais como, proteínas e o citoesqueleto celular, além de nucleases que

podem degradar o material genético. DNAs sem ligantes são ineficientes nesta

passagem e precisam de algum ligante para chegar ao núcleo com maior eficiência.

Em contra partida, o núcleo tem uma membrana dupla que possui proteínas, de

acesso ao seu interior, acopladas. Esta membrana não permite a passagem de

moléculas grandes. Estas são transportadas pelas proteínas acopladas que fazem,

por transporte ativo, a passagem de moléculas para o interior. Já quando a célula

está em fase de duplicação, ela deixa entrar no núcleo a maioria do DNA que está

dentro dela (Al-Dosari, et al., 2009) (Adler, et al., 2010).

20

Figura 4 - Mecanismo de transfecção, suas dificuldades e caminhos (Cartier, et al., 2002)

Depois que o gene está entregue, ele não é expresso de forma normal por

todo o tempo. Ele começa num nível alto de expressão e vai caindo com o tempo.

Diversas razões para isso podem ser citadas. O DNA injetado fica no núcleo na

forma de DNA episomal, sem chances de integrar o genoma celular. Como o

epissomo não é duplicado quando a célula se duplica, este não existirá em todas as

células filha e se diluirá entre as células. Outra razão para a diminuição da

expressão do transgene é que a célula pode se destruir ao ser infectada pelo vetor,

fazendo com que o número de células transfectadas caia. Para processo in vivo a

resposta imunológica pode fazer com que células sejam perdidas ou descartadas na

tentativa de controle de inflamação e com isso a expressão gênica também cairá.

Por outro lado, já foram encontrados plasmídeos em células de animais até dois

anos depois de sua transfecção (Al-Dosari, et al., 2009).

Na terapia gênica, os vetores virais, os métodos físicos de inserção de gene e

os métodos químicos (com as abordagens não virais inclusas) estão sendo

21

explorados, como mostra a Tabela 1 (Wagner, 1999). Vamos abordar a seguir os

vetores virais e não viras.

Tabela 1 - Comparação dos métodos de transfecção.

Método de transfecção

Vantagens Desvantagens

Métodos virais

Altamente eficiente Inflações, imunogênico,

cancerígeno

Métodos físicos

eletroporação Fácil desempenho

eficiente

Otimização para cada linhagem de célula requerida; grande

quantidade de DNA necessária

Micro injeção Exato direcionamento do ácido nucleico em

uma célula

Método sequencial e lento; abrange apenas

uma célula por vez

Biobalística Útil para vacina

gênica Penetração rasa do DNA

no tecido Métodos químicos

Compostos catiônicos

Fácil preparo Tóxico

Proteínas

recombinantes Alta

biocompatibilidade Alto custo

Nano

partículas poliméricas

Fácil preparo, tamanho controlável, fácil funcionalização

Eficiência limitada; algumas são tóxicas

Nano

partículas inorgânicas

Fácil preparo, tamanho controlável, fácil funcionalização

Eficiência limitada; algumas são tóxicas

2.2. VETORES VIRAIS

Os primeiros e mais usados vetores de entrega genica são os vetores virais.

Estes são mais eficientes que os vetores não virais por terem todo o maquinário

preciso para entrar nas celulas (Mastrobattista, et al., 2005). Entre suas

desvantagens podemos citar duas em especial: reação inflamatório para processos

in vivo e especificidade em relação às celulas (Smith, et al., 1998) Os adenovirus

são um exemplo de alta eficiencia com o pesar de provocar uma alta resposta imune

nas celulas.

22

Os vetores virais entram nas celulas através de endossomos. A proteina da

membrana da celula faz o reconhecimento do virus e este entra envolto por uma

vesicula, que tem a vantagem de conseguir passar pelas barreiras postas pelo

citoesqueleto do citoplasma celular. O esquema de entrada do virus na celula esta

ilustrado na figura abaixo.

Figura 5 - Entrada de um vetor viral na célula alvo

Um meio termo entre os vetores virais e não virais, é o vírus artificial. Este é

um vetor não viral que possui proteínas ou lipídios de alguns vírus. Outro método de

se fazê-lo é tirar uma proteína altamente infecciosa de um vírus para que este cause

menos respostas imunológicas. O intuito dessa técnica é aliar a segurança dos

vetores não virais com a eficiência dos virais e criar uma categoria com perspectivas

melhores para o futuro da entrega gênica (Mastrobattista, et al., 2005).

23

Tabela 2 - Comparação entre tipos de vetores de entrega gênica.

Vetores virais Vetores não virais Vírus artificiais

Prós

Transferência gênica muito eficiente;

expressão gênica persistente possível

Não infecciosos; manufatura de baixo custo; sem limite de

armazenagem de DNA

Não infecciosos; manufatura de baixo custo; sem limite de

armazenagem de DNA; transfecção de tipos

específicos de células

Contras

Imunogênico; potencialmente

infeccioso; alguns vírus são cancerígenos; manufatura de alto custo; capacidade

limitada de armazenagem de DNA

Transferência gênica ineficiente; expressão

gênica transiente

Potencialmente imunogênico; expressão

gênica transiente

2.3. VETORES NÃO VIRAIS

O estudo de vetores não virais para entrega gênica começou há quatro

décadas e esses estudos mostraram que a transfecção pode ser alcançada com a

junção de DNA com proteína, lipídio (o meio mais usado para em terapia gênica com

vetores não virais (Al-Dosari, et al., 2009)) ou polímero. Devido ao pequeno tamanho

(40 nm – 200 nm) e carga positiva, essas partículas são eficientes na entrega

genética.

Entrega gênica realizada por genes não virais são atrativas pelas seguintes

razões:

i. Eles podem ser gerados por alguns poucos componentes;

ii. Eles podem ser muito flexíveis em relação ao tamanho do DNA a ser

transportado.

iii. Plasmídeo e reagentes de transfecção podem ser produzidos em grande

escala com custos bastante baixos.

iv. Testes de segurança de um material sintético são menos trabalhosos do que

os testes de material recombinante.

Algumas características têm de ser olhadas com atenção na hora de construir

um vetor não viral para que ele tenha sucesso na entrada do núcleo. A química da

partícula é uma característica que influi nisso. Um complexo com lipídio é mais

24

eficiente na travessia do epitélio quanto menor sua porção hidrofóbica. O tamanho

de partícula influi na chegada do gene e seu método de medição deve ser

padronizado para possibilitar comparação. A carga da partícula possibilita que esta

seja positiva para entrar na membrana celular que é negativa. O formato do

complexo facilita a endocitose da célula, formatos cônicos não são tão absorvidos

por vacúolos como as esferas. A adição de ligantes para facilitar a ultrapassagem

das barreiras de entrada na célula (Adler, et al., 2010).

Mesmo com todo esse conhecimento sobre os vetores não virais, apenas 0,1

– 0,001% das partículas chegam intactas no núcleo de uma célula. Isso motiva os

estudos na área, não somente para a entrada na célula, mas também para o

rompimento do endossomo e entrada no núcleo (Mastrobattista, et al., 2005).

Neste trabalho iremos concentrar-nos nos complexos pDNA - Proteína e

pDNA - Proteína - Metal e vamos descrevê-los nos capítulos seguintes.

2.3.1. Proteína e pDNA

Na busca por algo que entregue genes às células com uma eficiência tão

grande quanto os vírus o fazem, surgiu o complexo pDNA-proteína. Os sistemas de

sítios ativos de enzimas, receptores e anticorpos envolvem de 5 a 20 aminoácidos,

ou seja, um complexo deste tipo pode ser construído com um peptídeo pequeno,

para poder interagir com essas estruturas.

As vantagens de se usar esse tipo de complexo é que a estrutura molecular e

a pureza dos reagentes já são conhecidas. Esse sistema sintético é muito versátil e

importantíssimo para provar que podem ocorrer mudanças significativas no cenário

de entrega gênica no sentido de estabilizar o complexo pDNA - proteína para que

este atinja uma maior eficiência.

A parte mais importante em se estudar esse tipo de partícula é poder

caracterizá-los, pois existem poucos estudos ao redor disso. Pouco se sabe sobre a

influência dos fatores na travessia de cada uma das barreiras do processo de

transfecção. As proteínas virais são conhecidas por ajudarem no rompimento do

25

endossomo e na captação nuclear, mas deve haver outras funções para elas que

ainda não são conhecidas. Ter o conhecimento sobre essas proteínas pode

estender os conhecimentos sobre como os vírus entram e se replicam numa célula

(Smith, et al., 1998).

2.3.2. Nano partículas como vetores

As possibilidades de se explorar as estruturas e processos das biomoléculas

para novas aplicações em materiais, biossensores e em atividades médicas, criou

um rápido crescimento no campo da nanobiotecnologia (Niemeyer, et al., 2004) e

consequentemente surgem os estudos referentes a nanopartículas. Como

característica principal, as nanopartículas (NPs) possuem o tamanho reduzido, o que

lhes permite penetrar em paredes e membranas celulares para fins terapêuticos

(Epple, et al., 2008).

As NPs são promissoras para a entrega de drogas como também podem ter

grande utilidade como ferramentas de diagnóstico. Diferentes sistemas de NPs que

possuem potencial para serem utilizadas em entrega de medicamentos são

estudados no intuito de diminuir a distância do descobrimento de uma droga até a

entrega eficiente desta droga no organismo (Parveen, et al., 2011).

As NPs metálicas podem ser sintetizadas em diversos tamanhos, podendo

chegar a tamanhos inferiores a 25 nm an e , et al., 2006). Sua grande superfície

pode proporcionar o transporte de doses relativamente altas de drogas (Parveen, et

al., 2011). A química de nanopartículas metálicas está sendo largamente estudada,

particularmente as NPs de metais nobres como ouro, prata, paládio e platina (Epple,

et al., 2008). As NPs de ouro, chamadas de AuNPs, são as mais comumente

utilizadas (Parveen, et al., 2011), no entanto existem muitos estudos sobre as NPs

de prata, também citadas como AgNPs an e , et al., 2006) (Yu, et al., 2007), as

quais serão utilizadas no trabalho de conclusão de curso em questão.

Existem estudos que citam NPs de prata (AgNPs) com atividade

antimicrobiana (Pan e , et al., 2006). No entanto, a atividade biocida depende de

várias características morfológicas e físico-químicas das partículas. A ação

26

bactericida das NPs de prata tem ocorrido para as menores partículas, ou seja, as

com menos de 10 nm (Martinez-Castanon, et al., 2008). O grupo de pesquisas do

Prof. Marcelo Seckler já obteve resultados sobre o controle da síntese das AgNPs

para diferentes condições de pH, além de ter desenvolvido um método novo para a

síntese das AgNPs, o qual permite a extinção da reação de síntese das NPs pelo

resfriamento da solução. O grupo também já conseguiu resultados de atividade

antibacteriana das AgNPs.

Este trabalho de conclusão de curso terá como objetivo estudar a viabilidade

bioquímica da utilização de AgNPs como vetores de entrega gênica, estudando

quais propriedades são necessárias para tanto.

27

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. MATERIAIS UTILIZADOS

3.1.1. Método para síntese das AgNPs

O método de Turkevich (Turkevich, et al., 1951), foi inicialmente desenvolvido

para partículas de ouro e depois foi modificado por Lee e Meisel (Lee, et al., 1982)

para nano partículas de prata (AgNPs), este último método será utilizado com

algumas modificações.

Nanopartículas de prata (AgNPs) serão sintetizadas pela redução química de

nitrato de prata com citrato de sódio em solução aquosa num reator encamisado sob

temperatura constante e agitação. Inicialmente, uma solução de 1 mM de citrato de

sódio deverá ter o pH ajustado ao valor desejado com hidróxido de sódio. Logo

após, 500 mL desta solução será adicionado ao reator e aquecido até a temperatura

desejada. A seguir 10 mL de solução de nitrato de prata 50 mM será adicionada,

como resultado a concentração de citrato e de sódio no reator devem ser de

aproximadamente 1 mM. O reator será mantido sob refluxo durante todo o curso da

reação, para reduzir a evaporação de água. A reação deverá ser conduzida por

períodos de tempo pré-determidados, sendo posteriormente resfriada pelo rápido

contato do meio de reação com um banho de gelo. Durante a reação, alíquotas de 5

mL serão retiradas a cada 5 minutos para caracterização da partícula. Os

experimentos devem ser feitos sob temperaturas entre 85°C e 95°C e sob um

intervalo de pH entre 7 e 9. O resfriamento será feito após 20 min e 40 min.

3.1.2. Método de síntese de partículas de pDNA-Proteína

3.1.2.1. DNA plasmidial (pDNA)

Será utilizado o plasmídeo modelo pVAX1GFP (3697 bp) purificado segundo

o kit Roche Miniprep (Roche, Alemanha). Este vetor, já disponível no laboratório, foi

construído a partir do vetor comercial pVAX1LacZ (Invitrogen), desenhado para o

desenvolvimento de vacinas de pDNA (descrito em detalhes por Azzoni et al. (2007)

(Azzoni, et al., 2007)). Em resumo, o vetor possui um promotor do citomegalovirus

28

humano CMV), gene repórter “green fluorescent protein” - GFP), gene de

resistência a Kanamicina para seleção em E. coli, e origem de replicação procariota

pMB1. O pDNA tem um tamanho de 500nm.

3.1.2.2. Preparação dos complexos binários pDNA-Proteína

Para a formação da do complexo binário pDNA-Proteína, o DNA plasmidial

modelo pVAX1GFP será primeiramente associado à proteína nuclear Protamina

(Sigma-Aldrich) em diferentes razões molares pDNA:Protamina (1:100, 1:500 e

1:1000, por exemplo).

Esta proteína já vem sendo estudada no grupo de pesquisa do Prof. Adriano

Azzoni. A interação entre estas proteínas de fusão e o pDNA (pVAX1GFP) é

conhecida por ser muito forte. Com isso, a preparação deste tipo de complexo será

feita pipetando as duas amostras em uma cubeta e esperando 10 minutos para que

a interação total entre elas aconteça.

A protamina utilizada tem tamanho de 1 nm e massa molar de 5100 g/gmol

(5,1 kDa). A Protamina é muito menor que o pDNA, por este motivo muitas proteínas

conseguem se acoplar ao pDNA e a razão molar tem essa alta diferença entre a

quantidade de ambos os compostos. Para ficar mais fácil, são usadas razões

mássicas, que são números mais próximos e mais fáceis de manipular.

O pDNA e a protamina usadas nos nossos experimentos têm concentrações

de 77,5 ng/µl ou 676,4 ng/µl para o pDNA e 1 µg/µl para a Protamina. Essas

concentrações servirão de base para o cálculo do volume de amostra que será

adicionado.

3.1.3. Preparo de complexos pDNA-Proteína-AgNP

Ao pDNA:Protamina será também adicionado a nano partícula metálica em

diferentes razões mássicas pDNA:Proteína:nano partícula metálica (1:5:1, 1:5:2 e

2:5:1, por exemplo). O procedimento abaixo foi retirado de um artigo cuja associação

29

envolve NPs de ouro (DeLong, et al., 2009), no entanto, o método será testado para

NPs de prata. Para o caso de complexos binários pDNA-Metal, a adição da proteína

deverá ser ignorada.

As AgNPs poderão ser associadas a proteínas e pDNA sendo adicionadas (à

vazão de 1 mL/s) em bateladas de 3-3,5 mg misturadas manualmente ou agitadas

num vórtex, adiciona-se então a protamina na razão mássica pDNA:Protamina (ou

RP3) 1:1, 1:2 e 1:5, por exemplo, a seguir adiciona-se pDNA na razão mássica

pDNA:nano partícula metálica 1:1, 1:2 e 2:1. As partículas serão precipitadas com

solução de etanol 70%, ou estocadas em solução de etanol 70% até o uso. Em

alguns casos, as NPs poderão ser separadas por centrifugação (DeLong, et al.,

2009).

No nosso caso, adicionamos as AgNps aos complexos pDNA:Protamina

(após eles interagirem por 10 minutos) e aguardamos mais 10 minutos para que o

complexo ternário seja formado, para que, após isso, possamos fazer qualquer

análise ou experimento. As AgNps estão armazenadas em seu próprio meio de

reação, ou seja, meio contendo citrato (agente estabilizante), sódio, nitrato e íons

prata. Assim o complexo ternário fica armazenado em tampão PBS (pH = 7,4), mas

com algumas substâncias do meio reativo das AgNps. Outra maneira é centrifugar

as nano partículas e resuspendê-las em meio PBS.

Os complexos ternários assim formados serão então analisados também por

métodos, como o potencial zeta, espalhamento de luz e eletroforese em gel de

agarose.

3.1.4. Transfecção em células animais

Células HeLa “Human epitheloid carcinoma”), serão crescidas em meio F-12

(Ham - nutrient mixture, Gibco, Inglaterra) contendo 10% (v/v) de soro fetal bovino

(Gibco, Inglaterra). As células serão crescidas em frascos de cultura para células

aderentes de 75 cm2 e incubadas em ambiente umidificado contendo 5% de CO2 e

a temperatura de 37ºC. Após atingirem a confluência, as células serão tripsinizadas

e semeadas em placas de cultura de 24 poços (5 x 104 células por poço). As células

30

serão incubadas por 24 horas e então transfectadas com as diferentes soluções

contendo os complexos carreadores em diferentes razões pDNA/proteína ou

pDNA/proteína/Metal. Transfecções controle serão feitas utilizando-se o reagente de

transfecção (lipídeo catiônico) Lipofectamine 2000TM Invitrogen, EUA), 1 μg

pDNA/proteína mais 1.5 μL lipídeo em 100 μL de meio por poço). A avaliação e

quantificação do nível de transfecção das células em cultura serão baseadas na

quantificação dos níveis de transfecção por citometria de fluxo: Vinte e quatro horas

após a transfecção, células em cultura serão lavadas, tripsinizadas, centrifugadas

(160g por 8 min) e suspensas em tampão PBS (tampão a pH = 7,4 de cloreto de

sódio, cloreto de potássio, fosfato de sódio e fosfato de potássio, isotônica em

relação ao corpo humano) (Azzoni, et al., 2007). As células transfectadas e não

transfectadas (controle negativo) serão então analisadas em um citômetro de fluxo

FACscan Scalibur (Becton-Dickinson, EUA), que analisará o espalhamento de luz

frontal (forward scatter - FSC), lateral (side scatter - SSC), e fluorescência em verde

FL1). A partir disso, os dados relativos às células serão isolados dos “debris”

através das características FSC versus SSC, e o nível de transfecção será

determinado através da subtração dos dados de background FL1 (células não

transfectadas) da população celular total. Os dados serão analisados utilizando-se o

software CellQuest Pro (Becton-Dickinson, EUA).

3.2. CARACTERIZAÇÃO DOS VETORES

3.2.1. Potencial Zeta

As forças superficiais na interface da partícula e do líquido possuem um efeito

eletrocinético e são responsáveis tanto por possíveis aglomerações entre as

partículas quanto pela repulsão entre elas. Quanto menores as cargas das

partículas, estas ficam livres para se colidirem e aglomerarem, enquanto partículas

carregadas tendem a se repelir, tendo probabilidade maior de ficarem dispersas

(como mostra a Figura 6).

31

Figura 6 - a) Partículas carregadas se repelem umas das outras, enquanto b) partículas sem carga ficam livres para colidirem e agregarem.

A carga de uma partícula em suspensão pode ser controlada modificando-se

o pH ou a natureza de espécies iônicas na solução. Uma técnica comum é o uso de

tensoativos que adsorvem diretamente na superfície da partícula, mudando suas

características.

O modelo de dupla camada é utilizado para a descrever a região iônica na

vizinhança da partícula carregada e explica como as forças de repulsão ocorrem. Se

usarmos uma partícula carregada negativamente, podemos identificar o efeito sobre

os íons positivos (contra-íons) na solução. Inicialmente, a atração da partícula

negativa sobre os contra-íons forma uma camada firmemente anexada à volta da

superfície da partícula, essa camada de contra-íons é conhecida como Camada de

Stern. Devido à quantidade de íons positivos na camada de Stern outros íons

positivos são repelidos ao tentar se aproximar da partícula negativa, esse equilíbrio

dinâmico resulta na formação de uma camada difusa de contra-íons, pois íons

negativos podem ser atraídos pela quantidade de íons positivos nas proximidades

da partícula (A Figura 7 ilustra a distribuição de íons em torno de uma partícula).

Portanto o modelo de dupla camada diz que existem duas camadas, uma formada

apenas por contra-íons, a camada de Stern, e outra mais distante da partícula, a

camada difusa, formada por contra-íons e co-íons onde a concentração de contra-

íons cai com o distanciamento da partícula e a concentração de co-íons aumenta

com o distanciamento da partícula até o equilíbrio.

32

Figura 7 - Ilustração das camadas de Stern e da camada Difusa.

A dupla camada é formada para neutralizar a carga da partícula, no entanto,

causa um potencial eletrocinético entre a superfície da partícula e qualquer ponto na

massa do liquido de suspenção. A diferença de voltagem é da ordem de milivolts e

se refere ao potencial da superfície. A magnitude do potencial de superfície é

relacionado à carga superficial e à espessura da dupla camada. Conforme nos

distanciamos da superfície o potencial cai linearmente na camada de Stern e

exponencialmente pela camada difusa chegando a zero no limite imaginário da

dupla camada. A camada de Stern é considerada sendo rigidamente presa à

partícula, enquanto a camada difusa não é. Como resultado o potencial elétrico

nessa união de camadas está relacionado com a mobilidade da partícula e é

chamado de potencial zeta (Zeta-Meter).

O potencial zeta, apesar de ser uma medida de potencial elétrico, pode ser

ainda relacionado com a carga da partícula, visto que é mais facilmente medido (ver

Figura 8).

33

Figura 8 - Potencial Zeta e potencial de superfície.

O potencial zeta é de grande importância, pois os vetores devem ter carga

positiva para interagirem e serem endocitados pela célula, caso contrário haverá

repulsão entre os vetores e as membranas celulares, as quais possuem carga

negativa.

3.2.2. Tamanho das partículas por DLS (Dynamic Light Scattering)

A técnica de DLS é usada para medir o tamanho de partículas pequenas.

Esta técnica mede o movimento browniano (o movimento browniano é o movimento

aleatório de partículas macroscópicas num fluido como consequência dos choques

das moléculas do fluido nas partículas) e o relaciona com o tamanho das partículas.

Quanto maior a partícula menor o movimento browniano, partículas grandes são

difíceis de serem movidas pelo meio. A temperatura deve ser precisa, pois ela pode

causar correntes de convecção que causariam movimentos ordenados e a

viscosidade (que depende da temperatura) também deve ser fixa, pois influi no meio.

(Instruments)

O diâmetro hidrodinâmico reflete como a partícula se difunde no meio e é

calculado pela equação abaixo. O coeficiente de difusão translacional depende do

tamanho da partícula e da concentração e tipos de íons do meio.

34

Onde:

d(H) = diâmetro hidrodinâmico;

D = coeficiente de difusão translacional;

k = constante de Boltzman;

T = temperatura absoluta do meio;

η = viscosidade do meio.

O tipo de íon e sua força e concentração podem interferir na velocidade de

difusão da partícula mudando a espessura da dupla camada elétrica. Num meio de

baixa condutividade a difusão é menor e o diâmetro H é maior aparentemente, o

inverso é verdadeiro. Para minimizar estas interferências usa-se um meio padrão

que diminui a dupla camada elétrica e mede-se o diâmetro hidrodinâmico esperado.

A intensidade de espalhamento de luz se relaciona com o diâmetro de

partícula e com o comprimento de onda da seguinte maneira:

Onde:

I = intensidade de espalhamento de luz;

d = diâmetro de partícula;

λ = comprimento de onda da luz.

Com isso podemos perceber que uma partícula de 50nm de diâmetro espalha

1.000.000 de vezes mais luz que uma de 5 nm.

A medição é feita incidindo-se um feixe de luz na amostra e capturando de

novo esta luz através de um arranjo ótico como na figura abaixo.

35

Figura 9 - Amostra a ser analisada

As partes pretas representam as ondas destrutivas e as brancas representam

as ondas construtivas, que se somam (Figura 10). Esta configuração está em

constante modificação, visto que o movimento browniano move as partículas.

Figura 10 - Demonstração da dependência do espalhamento em relação à fase da onda.

Quanto menor elas são, mais rápido elas se movem (Figura 11).

36

Figura 11 - Diferença da variação da intensidade com o tempo para partículas grandes e pequenas.

O sistema ótico capta o sinal de luz, mas é necessário um comparador de

sinais para relacionar a intensidade de sinais em um pequeno δt. Com isso,

podemos relacionar dois sinais bem parecidos, pois o tempo entre eles é curto

(Figura 12).

Figura 12 - Intensidade de sinal no tempo.

37

Se o sinal é comparado com ele mesmo o coeficiente de correlação é perfeito

e vale 1, se é totalmente imperfeito vale 0. Se um sinal é comparado com um sinal

padrão em um tempo “t” ele começa perfeito e no infinito tende a ser 0. Se as

partículas são grandes o sinal tende a mudar devagar e a curva demora a cair

(Figura lado esquerdo), e vice versa (figura lado direito). Quanto mais rápido o

decaimento, mais monodispersa é a amostra, pelo contrário, quanto mais devagar o

decaimento, mais polidispersa a amostra.

Figura 13 - Coeficiente de correlação em função do tempo.

Para duas amostras de mesma população com diâmetros de 5nm e 50nm o

volume delas fica na proporção de 1:1.000 por causa da dependência com d3 do

volume e a intensidade do sinal fica na proporção de 1:1.000.000, pois a

dependência é com d6 (Figura 14). Assim o equipamento consegue medir o tamanho

das partículas.

38

Figura 14 - Dependência do volume e da intensidade com o tamanho das partículas para duas populações com igual quantidade.

3.2.3. Eletroforese em gel de agarose

A eletroforese, método de separação de moléculas carregadas sob a

influência de um campo elétrico, é um processo que tem sido extensivamente

utilizado, principalmente no campo da bioquímica, desde a década de 30 (Santos, et

al., 2000).

Figura 15 - Equipamento de eletroforese em gel.

39

A eletroforese em gel de agarose consiste no método padrão usado para

separar, identificar, analisar, caracterizar e purificar fragmentos de DNA. A técnica é

simples, rápida e capaz de separar misturas de fragmentos de DNA que não podem

ser separados por outros métodos, tais como centrifugação com densidade de

gradiente ou por velocidade de sedimentação. A localização do DNA no gel pode ser

determinada diretamente. As bandas no gel são coloridas principalmente por

Brometo de Etídeo em baixa concentração, que colore por intercalar-se na dupla fita

de DNA. Quantidades de até 1 ng de DNA podem ser visualizadas por exame direto

de gel na luz ultravioleta. Na Figura 16, o DNA é visível como bandas de cor

alaranjada, a cor se deve à fluorescência do corante usado, o brometo de etídio.

Uma molécula de DNA, quando exposta a um campo elétrico, migra para o

eletrodo na velocidade ou mobilidade eletroforética, proporcional a força do campo e

a carga líquida da molécula. A mobilidade eletroforética é também inversamente

proporcional ao coeficiente friccional da molécula, que, por sua vez, é função do

tamanho e forma da molécula, e da viscosidade do meio (ZE=vf). Portanto, uma

mistura de moléculas diferentes pode ser separada eletroforeticamente com base

em:

tamanho da molécula;

forma ou conformação da molécula;

magnitude das cargas elétricas líquida na molécula;

Quando aplicadas na mesma posição num campo elétrico, as moléculas

serão separadas em bandas e migrarão a velocidades diferentes para posições

diferentes no meio.

Sob condições fisiológicas, os grupos fosfatos dos ácidos nucléicos

encontram-se ionizados. Cadeias de polinucleotídeos de DNA e RNA são chamados

de poli-ânions e migram para o eletrodo positivo (anodo) quando colocados em

campo elétrico. Devido à natureza repetitiva dos fosfatos, o DNA dupla fita possuem

aproximadamente a mesma relação de massa e carga líquida. Ajustando a

viscosidade do meio, entretanto, os efeitos da fricção e o formato das moléculas

podem ser usados, permitindo separar os ácidos nucléicos eletroforeticamente por

40

tamanho. A viscosidade do meio pode ser determinada pelo tamanho dos poros do

meio através da concentração de agarose.

Figura 16 - Gel de agarose após electroforese de fragmentos de DNA.

A agarose consiste num polissacarídeo linear de galactose e um derivativo de

galactose associados através de ponte de hidrogênio. Agarose é composta de

unidades de b-D-galactopiranose com ligação 1,3 e 3,6 anidro-a-L-galactopiranose

com ligação 1,4. Essa unidade básica de agarobiose é repetida cerca de 4000

vezes, formando longas cadeias com peso molecular médio de 120.000 Daltons.

Também podem ocorrer no polissacarídeo, grupos com carga, tipicamente piruvato e

sulfato. Esses grupos são responsáveis por várias propriedades da agarose, e a

seleção cuidadosa de matéria prima para o preparo da agarose controla a qualidade

para fins específicos (Compri-Nardy, et al., 2009).

Para o ensaio de eletroforese foram misturados 0,4g de agarose com 50ml de

tampão TAE (solução tampão usada em eletroforese em agarose, tipicamente para

a separação de ácidos nucleicos tais como o DNA e RNA. Ele é feito de tampão

acetato da base Tris, normalmente a pH 8.0, e EDTA, os quais sequestram cátions

divalentes) em um erlenmeyer para fazer o gel. A agarose é misturada e aquecida

até dissolver totalmente para depois ser colocada no equipamento.

Após solidificado o gel, basta colocar as amostras nos espaços

correspondentes e ligar o equipamento a 60V. As amostras a serem analisadas são

41

misturadas com 5 µl de glicerol. Depois de corrido o ensaio (2 horas depois),

colocamos o gel em um corante chamado SYBR Safe, que é um corante

fluorescente marcador de DNA para a leitura dos resultados, por 20 minutos. Para

finalizar colocamos o gel em água destilada por 20 minutos para tirar o excesso de

corante. Agora basta ler os resultados em camara de ultravioleta.

42

4. RESULTADOS E DISCUSSÕES

4.1. CARACTERIZAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS DE PRATA

4.1.1. Síntese das nanopartículas

As partículas foram feitas nas condições de pH = 9 e temperatura de reação =

90⁰C em reator encamisado com agitação moderada.

A solução começa incolor e vai se tornando amarelada ou caramelo escuro,

de acordo com a conversão (Figura 17). A coloração se dá porque as nanopartículas

de prata têm um tamanho tal que elas entram em ressonância com as ondas do

comprimento da luz amarela, emitindo luz neste comprimento de onda.

Figura 17 - Amostra de nanopartículas de prata com 15 minutos de reação

43

O teste de espectrofotometria das partículas nos mostra o comprimento de

onda que a solução mais absorve. Este máximo de comprimento de onda é

característico de cada substância e o da prata é perto dos 390 nm.

Figura 18 - Curva espectrofotométrica das nanopartículas de prata

De acordo com a curva acima, o máximo se dá em 430 nm. A curva foi feita

subtraindo-se os valores de absorbância da amostra de água dos valores da

amostra das partículas, para eliminar os ruídos. O pico foi deslocado para a direita

em relação ao valor de referência, possivelmente por causa da oxidação da prata

diante da luz, devido á forma não esférica das partículas, ou ainda pela presença de

agregados (Lok, et al., 2007) (Yan, et al., 2006) (Wan, et al., 2005) (Santana, et al.).

As nanopartículas de prata estão imersas em meio contendo citrato de sódio

e nitrato de prata. Como o complexo ternário pDNA-Protamina-Metal será formado

em solução do tampão PBS, decidimos centrifugar a amostra e tentar suspendê-la

novamente no tampão desejado sem a interferência dos componentes da dispersão

original. A centrifugação foi feita a 9000 rcf (unidades de força g) por 10 minutos.

Depois da centrifugação a solução ficou límpida e com um aglomerado de partículas

no fundo (Figura 19).

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

0,16

0,18

0,2

200 300 400 500 600 700 800

Ab

sorb

ânci

a

Comprimento de onda (nm)

Espectrofotometria de AgNps

44

Figura 19 - Amostra de nanopartículas de prata centrifugadas

O líquido sobrenadante foi retirado com pipeta e o PBS foi acrescentado.

Aparentemente as nanopartículas tinham resuspendido, pois a solução voltou a ficar

amarela como antes. Mas, no dia seguinte, a solução tinha ficado transparente como

água, o que indica que as nanopartículas não estavam em solução. Era possível ver

pequenos pontos metálicos na parede do tubo.

Uma possível explicação é que a alta salinidade do PBS comparada ao outro

meio, que também continha citrato que é um bom agente estabilizante, provocou a

aglomeração das partículas de prata. Com isso, para os ensaios posteriores,

procuramos resuspender as partículas logo antes de fazer os experimentos, ou

simplesmente não resuspender.


A carga resultante do complexo pDNA:Protamina:AgNPs deve ser positiva

para entrar na membrana da célula que é negativa. Sabemos que o pDNA é

negativo e a protamina é positiva, fazendo com que um complexo binário de razão

mássica 1:5 resulte numa partícula positiva a pH = 7,4 (+24 mV segundo ensaios já

realizados pelo grupo).

Para as AgNPs, o ensaio de potencial Zeta foi realizado a pH = 7,4 (em

tampão PBS) e a pH = 9 (em solução de citrato). As medições foram realizadas em

triplicata para cada pH. De acordo com a tabela abaixo temos os resultados.

45

Tabela 3 - Resultado do ensaio de potencial Zeta para as nanopartículas de prata

Amostra (mV)

pH 1 2 3 Média Desvio Padrão

9,0 -18,6 -14,7 -23,6 -19,2 6,3

7,4 -49,7 -51,1 -50,0 -50,3 0,7

De acordo com os resultados podemos ver que com a diminuição do pH a

partícula fica mais negativa. A carga da partícula a pH = 7,4 é, em média, 2,5 vezes

mais negativo que a pH = 9. O desvio padrão é muito alto para as amostras a pH

mais alto, requerendo mais amostras.

Como a partícula é negativa, principalmente para pH = 7,4 que é a condição

do tampão PBS e na qual se realizarão os experimentos, agora podemos determinar

razões mássicas para os ensaios seguintes.

Esta carga sendo muito negativa a pH = 7,4 nos remete aos resultados de

excesso de protamina em relação às AgNPs. Esta carga é, em módulo, o dobro da

carga da protamina e faz com que uma partícula tenha mais “força” que uma de

protamina, devido às altas forças eletrostáticas.

Os laudos do experimento são encontrados no ANEXO A - LAUDOS DO ZETA

DAS NANOPARTÍCULAS.


No ensaio de DLS apareceram duas populações de partículas, com tamanhos

médios de 3,4 e 75 nm. Não foi possível estimar a quantidade de cada uma das

populações.

A população menor (3,4 nm) é praticamente desprezível no ponto de vista de

aumentar o tamanho do complexo ternário. Por outro lado, se apenas uma

nanopartícula de 75 nm interagir com o complexo pDNA-protamina, ela já aumentará

46

significativamente o seu tamanho (o tamanho do complexo binário é da ordem de

500 nm).

Em contrapartida, a quantidade de partículas menores pode ser maior,

aumentando a probabilidade de interação.

Este tamanho realmente é da escala nanométrica como esperado. De acordo

com a cor da solução (amarelada) já tínhamos uma noção de que o experimento

tinha produzido as nanopartículas, mas o DLS veio para quantificar e qualificar isso.

O tamanho de partícula segundo o ensaio de DLS será comparada com a

medição a seguir para o ensaio de microscopia eletrônica de varredura.

4.1.4. Microscopia eletrônica de varredura

Foi realizada a microscopia eletrônica de varredura das nanopartículas de

prata. O ensaio é feito pingando-se umas gotas da solução de nanopartículas numa

superfície metálica apoiadora de amostra, com posterior evaporação do líquido e

sobra da amostra sólida. Com isso, podemos fazer medições de tamanho de

partícula de acordo com a escala da foto. Além disso, este teste serve para

confirmar o ensaio de DLS, pois para que este seja válido as partículas devem ser

esféricas, de acordo com as aproximações feitas para se chegar ao resultado.

47

Figura 20 - MEV das nanopartículas de prata a pH = 9 e 90°C

De acordo com a figura acima, podemos dizer que as partículas são

aproximadamente esféricas e o resultado do DLS não pode ser rejeitado por este

quesito. Algumas partículas, às vezes, podem ficar em formato de agulha, o que

afetaria o resultado do DLS.

Como mostra a figura, temos algumas partículas com medições de tamanho

em vermelho. Pegando uma grande amostra destas, ou seja, não podemos

considerar apenas as medições desta foto, conseguimos um valor da média do

tamanho das partículas de prata. O tamanho médio das partículas por este método é

64 nm.

Além desta população, temos uma outra população de partículas menores,

cujo tamanho médio é de 18 nm segundo a foto.

Comparando com o DLS, o erro, em relação à população maior, é pequeno

de aproximadamente 15%. Já o erro da população menor é maior da ordem de

500%. Levando em conta que as medições são feitas à mão, a principal fonte de

erro neste método é a imprecisão do olho humano ao fazer o traço que liga os

extremos das partículas, principalmente no que diz respeito às partículas menores.

Existem erros, também, ligados ao fato de que a amostra é pequena em relação ao

conteúdo do reator, podendo não representar o conjunto das partículas. Finalmente,

48

como as partículas não são totalmente esféricas, não existe uma dimensão ideal

para se medir este “tamanho” de partícula.

O ensaio de microscopia nos revela que as partículas de prata não estão

altamente aglomeradas, o que seria um efeito indesejado, pois não seria viável a

transfecção de complexos muito grandes.

Um cálculo simples foi feito para avaliar se há excesso de AgNPs ou de

Protamina nas nossas amostras. Como o complexo binário é formado e não corre no

gel a partir da razão mássica 1:1 (Figura 21), podemos pensar que ao se

acrescentar a protamina até a nossa razão mássica de estudo (1:5) temos um

excesso de partículas positivas.

Hipóteses e dados iniciais do cálculo:

massa de pDNA = 0,6 µg;

massa de protamina = 3 µg (segundo razão mássica 1:5) sendo que

2,4 µg estão em excesso, pois a razão 1:1 já é positiva;

massas de AgNPs 0,3 µg (1:5:0,5), 1,2 µg (1:5:2) e 2,4 µg (1:5:4);

partículas de prata são esféricas de tamanho médio 3,4 nm (este

tamanho de partícula é o tamanho médio de uma das distribuições de

população dadas pelo DLS);

50% da prata usada para sintetizar as nanopartículas de prata são

convertidas nelas, valor assumido desde o início, inclusive para definir

os volumes de amostra para adição no complexo binário.

O cálculo de excesso de protamina segue como abaixo:

Onde:

QP é a quantidade de protamina em excesso;

NA é a constante de Avogadro;

ME é a massa de protamina em excesso;

49

MMP é a massa molar da protamina;

O cálculo da quantidade de AgNPs é dado abaixo:

Onde:

dp é o diâmetro das nanopoartículas (3,4 nm);

Vp é o volume de uma partícula de prata;

QAgNPs é a quantidade de nanopartículas de prata;

VA é o volume de amostra utilizado na razão mássica 1:5:4, que é a

que mais possui prata (5,74 µl);

µ é a massa específica da prata (10,5 g/ml);

MMAg é a massa molar da prata que é 108 g/mol;

CAg é a concentração de prata na solução = 1 mM;

Conv é a taxa de conversão de prata em nanopartículas = 50%.

Avaliando as quantidades de protamina e nanopartículas vemos que a

primeira esta em excesso de 200 vezes em relação a esta última.

4.2. CARACTERIZAÇÃO DOS COMPLEXOS TERNÁRIOS

4.2.1. Eletroforese

O objetivo do experimento é caracterizar se o complexo

pDNA:Protamina:AgNPs foi ou não formado e se a sua carga é positiva, para que a

sua entrada na célula seja possivel, já que a carga da membrana celular é negativa.

Para isso, as bandas formadas na eletroforese da solução de complexo foram

comparadas com as bandas formadas na eletroforese da solução de pDNA puro e

pDNA:Protamina de mesma concentração e de marcador ou ladder (fragmentos de

50

DNA com tamanho e concentração conhecidos, que permite determinar o tamanho

dos fragmentos de DNA presentes na amostra).

A migração do DNA na direção do polo positivo ocorre porque, em meio

neutro ou básico, o DNA assume carga negativa. Assim, ele penetra no gel em

direção ao polo positivo, devido ao efeito eletroforético que atua sobre suas

moléculas. O fator de maior influência na migração do DNA através do gel de

agarose é a massa molecular ou o tamanho dos fragmentos de DNA. Isso porque o

gel funciona como uma peneira molecular, o que significa que moléculas com

massas moleculares mais elevadas são retidas pelas malhas do gel, tendo sua

migração retardada. A mobilidade de um fragmento é inversamente proporcional ao

log10 de sua massa molecular. Assim, grupos de mesmo tamanho migram juntos e

assumem da forma do poço, formando as chamadas bandas de DNA. Apesar disso,

a linearidade e a condensação do DNA também influenciam na velocidade de

migração deste.

O DNA utilizado no experimento é plasmidial (circular) e pode assumir três

formas diferentes: relaxada ou Nick (com corte), superenovelada ou supercoiled

(condensado) e circular (DNA não condensado em forma de anel). Como foi utilizado

apenas um tipo de pDNA, e não fragmentos de massas moleculares diferentes, a

velocidade de migração do pDNA puro só foi afetada pelo formato do DNA. Sendo

assim, na solução de pDNA puro é esperada a formação de 3 bandas. A primeira

corresponde à forma relaxada (menor velocidade de migração), a segunda à forma

circular e a terceira à forma superenovelada (maior velocidade de migração). A

formação de complexos faz com que o DNA plasmidial em solução não assuma as

três formas citadas acima. Ao invés disso, ele interage com as proteínas, formando

as partículas do complexo. Logo, é esperado que, após a formação completa das

partículas de complexo, deixe de haver três bandas, e ocorra a formação de uma

única banda extensa (devido à distribuição de tamanhos das partículas do

complexo).

Resultados de eletroforese para diferentes razões mássicas pDNA:Protamina

são mostrados na Figura 21. Observa-se, as bandas DNA1 e DNA2 representam o

DNA puro e a primeira amostra é o controle mássico com DNA de vários tamanhos.

Nas diferentes proporcoes pDNA-proteina, observa-se que não há migração.

51

Figura 21 - Eletroforese em agarose de partículas pDNA e protamina

Dentre as amostras colocadas todas são positivas, inclusive 1:1. Com isso,

podemos dizer que a amostra 1:5, que contém uma maior proporção de moléculas

positivas de proteína, é muito positiva. Esta condição no complexo binário é

desejável, pois assim, mesmo após a adição das AgNPs negativas, os complexos

ternários continuem positivos, sendo assim capazes de adentrar nas células.

Após a etapa de escolha da quantidade de protamina a ser adicionada,

devemos avaliar a quantidade de AgNPs. Esta etapa foi mais complicada, pois não

tínhamos nenhuma informação de eletroforese em amostras de complexos ternários

com prata, por isso não sabíamos em que quantidades as nossas amostras

continuariam positivas. Decidimos montar o experimento com valores pequenos de

prata devido à sua carga ser muito negativa (Tabela 3). O ensaio comporta oito

amostras, com isso, montamos a seguinte disposição, segundo a Tabela 4.

Tabela 4 - Amostras de ensaio de eletroforese

Amostra

1 2 3 4 5 6 7 8

Controle de massa Controle pDNA 1:5:0 1:5:0,5 1:5:1 1:5:2 1:5:4 1:5:6

DNA1 1:20 DNA2 1:10 1:5 1:2 1:1

52

Onde:

Controle de massa são pedaços pequenos de pDNA corados em azul,

representando a menor massa entre as amostras, ou seja, enquanto ela

continuar percorrendo o gel as outras também estão lá. Serve para garantir a

validade do ensaio.

Controle de pDNA representa o resultado para o pDNA puro, serve de

comparação.

As demais proporções são representadas por pDNA:protamina:NpAg. Com

isso, a amostra 3 é a comparação de amostra sem NpAg e as demais estão

em relação crescente de partícula de prata.

Com isso, temos 3 controles e 5 amostras de complexo ternário. Aumentamos

a razão de NpAg gradativamente, para obtermos complexos positivos e talvez poder

quantificar o ponto de viragem para carga negativa.

De acordo com a concentração de pDNA e protamina que temos, a razão de

proteína escolhida e a estimativa de conversão das nanopartículas de prata (50%),

já que não temos esta informação, podemos determinar os volumes a ser misturado

para a formação dos complexos.

Os volumes de pDNA e protamina são fixos de acordo com a razão mássica,

os volumes de NpAg variam com a sua razão e o volume de PBS usado serve para

completar o volume da amostra para 20µl (Tabela 5) (Figura 22).

Tabela 5 - Volume das composições das amostras

Volumes de amostra (µl)

Amostras pDNA Protamina NpAg PBS Total

2 7,75 0,00 0,00 12,25 20,00

3 7,75 3,00 0,00 9,25 20,00

4 7,75 3,00 0,72 8,53 20,00

5 7,75 3,00 1,43 7,82 20,00

6 7,75 3,00 2,90 6,35 20,00

7 7,75 3,00 5,74 3,51 20,00

8 7,75 3,00 8,61 0,64 20,00

53

Figura 22 - Amostra de complexo pDNA-Protamina-Metal para ensaio de eletroforese

De acordo com a Figura 23 vemos que os controles correram no gel,

validando o ensaio. Tendo e vista que apenas as partículas negativas correm no gel

e as positivas ficam retidas no local onde foram inseridas, devido à diferença de

potencial colocada no gel, podemos afirmar que o complexo permaneceu formado,

pois nenhum pDNA foi encontrado no gel, em comparação com a amostra 1

(controle).

Esse resultado indica que, nas razões mássicas estudadas, o complexo

pDNA-protamina se manteve estável, formando uma partícula que não percorre a

malha do gel, independentemente da quantidade de NpAgs adicionada.

No entanto, conforme os nossos cálculos de quantidade de protamina em

excesso e quantidade de partículas de prata, pode ter ocorrido aglomeração dessas

duas substâncias, fazendo eventualmente com que a prata não interagisse com o

complexo.

54

Figura 23 - Eletroforese em gel dos complexos ternários

Para completar a analise precisamos do ensaio de potencial Zeta e DLS para

avaliar se a carga e o tamanho dos complexos, respectivamente, mudaram. Com

isso poderemos ter mais ferramentas para tentar observar a formação do complexo

ternário.


O ensaio de potencial Zeta foi realizado para complexos ternários em

diferentes razões de nanopartículas de prata. O intuito deste ensaio era avaliar a

mudança de carga dos complexos com o aumento da concentração de NpAg, visto

que, o potencial para uma partícula binária com razão pDNA:Protamina de 1:5 o

potencial era de +24mV. Os laudos deste experimento foram anexados no final do

relatório no ANEXO B – LAUDOS DO ZETA PARA OS COMPLEXOS TERNÁRIOS.

55

Tabela 6 - Valores do potencial Zeta para os complexos ternários

Teste (mV)

Razões mássicas

1 2 3 Média Desvio Padrão

1:5:0,5 21,0 22,5 21,9 21,8 0,8

1:5:2 19,1 17,5 20,2 18,9 1,4

1:5:4 20,7 23,1 21,8 21,9 1,2

De acordo com a Tabela 6, não obtemos o resultado esperado, que seria o

abaixamento do potencial do complexo com a adição de nanopartículas de prata.

Podemos dizer que, de acordo com os valores de desvio padrão, os valores

de carga são iguais para as três condições do ensaio. Mais do que isso,

dependendo do valor do desvio padrão da carga do complexo pDNA:Protamina

(+24mV) poderíamos dizer que as nanopartículas não afetaram a carga deste

complexo binário.

As amostras como estão dadas confirmam os nossos cálculos de excesso de

protamina. Isso é notável, pois mesmo após a adição das nanopartículas de prata

(que são negativas) as cargas do complexo ternário continuam positivas, e

praticamente invariáveis para todas as razões mássicas utilizadas.


O ensaio de DLS foi feito para comprovar o tamanho das partículas do

complexo ternário.

Tabela 7 - Resultados do ensaio DLS

1° população 2° população

Razão mássica

Número de pontos

Média de tamanho (nm)

Desvio padrão (nm)

Média de quantidade (%)

Número de pontos

Média de tamanho (nm)

Desvio padrão (nm)

Média de quantidade (%)

1:5:0,5 2,00 435,50 23,76 100,00 3,00 4581,00 411,25 0,00

1:5:2 3,00 845,07 182,27 100,00 3,00 4781,67 482,81 0,00

1:5:4 3,00 623,30 9,73 100,00 1,00 5560,00 0,00 0,00

56

A intensidade do sinal do DLS é inversamente proporcional ao diâmetro da

partícula elevado à 6ª potência. Como os sinais obtidos para as 2 populações

mostradas na Tabela 7 são similares (ver distribuição de tamanhos completa no

ANEXO C – LAUDOS DO DLS PARA OS COMPLEXOS TERNÁRIOS), concluímos

que a 1ª população, a das partículas menores, corresponde a quase a totalidade das

partículas.

A expectativa é que quanto maior a razão de NpAg maior o tamanho final do

complexo, pois mais partículas se agregarão nele. Excluindo a amostra de razão

1:5:2, que teve alto desvio padrão, podemos dizer que o tamanho do complexo

aumenta 50% da razão 1:5:0,5 para a 1:5:4, ou seja, com o aumento de 8 vezes das

partículas de prata.

A nossa razão de pDNA:Protamina tem um excesso de proteína, que é muito

positiva. Com isso, podemos dizer que com a adição de poucas nanopartículas de

prata, estas interagem fortemente com o excesso de proteínas e formam agregados

de partículas, que podemos evidenciar, pois aparecem dois picos no resultado.

Estes aglomerados podem ser, não apenas, resultados de interações destes dois

tipos de compostos, mas na verdade uma aglomeração de complexos binários com

AgNPs e protaminas.

Para a primeira razão mássica temos que a média de tamanho é a menor de

todas, já as outras duas, se levarmos em conta o alto desvio padrão da amostra 2,

são praticamente iguais. Essa análise pode ser completada dizendo que para a

primeira razão temos poucas AgNPs, ou seja, temos poucas chances de

aglomeração e por isso o tamanho menor. Já para as outras temos maior chance de

aglomeração pela maior quantidade de partículas de prata, mas sem distinção entre

elas.

4.3. MICROCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA

O ensaio de MEV foi feito pensando em visualizar o complexo ternário, apesar

de não terem sido encontrados artigos que fazem uso deste tipo de teste para este

57

tipo de amostra. Realizamos os ensaios (ANEXO D – MICROSCOPIA ELETRÔNICA

DE VARREDURA DOS COMPLEXOS TERNÁRIOS) em duas condições, uma sem

diluição da amostra e outra com diluição da mesma.

No primeiro ensaio, as amostras foram feitas sem diluição do sal contido no

PBS, 50 mM. Com isso, as imagens não ficaram boas e o sal predomina. Podemos

constatar isso pelo aparecimento de partículas facetadas com dimensões de

aproximadamente 1000 nm, características de sal (Figura 24). As microscopias

foram realizadas para as razões 1:5:0,5 e 1:5:4, mas não houve diferença entre elas,

ou seja, elas apresentaram partículas de mesma forma e aparência.

Figura 24 - MEV para razão mássica 1:5:0,5

De acordo com o tamanho e formato das formas que aparecem na

microscopia eletrônica de varredura, observamos aglomerações, mas não sabemos

58

se são realmente partículas aglomeradas ou até que ponto houve sobreposição de

moléculas ou partículas quando as amostras foram evaporadas.

Foram observadas partículas com as seguintes características:

- partículas facetadas com dimensões de aproximadamente 1000 nm, que são

sais oriundos da solução tampão, formados pela evaporação da solução sobre o

porta-amostras.

- partículas irregulares com dimensões entre 100 a 500 nm, que

provavelmente corresponde ao tamanho do complexo DNA- proteína (Figura 51 do

ANEXO D).

- partículas irregulares com dimensões variáveis, possivelmente aglomerados

de complexos DNA-proteína.

Possivelmente, parte das AgNPs encontram-se aderidas à superfíce dos

complexos DNA-proteína, mas este fenômeno não pode ser observado devido ao

pequeno aumento.

Por outro lado, algumas partículas parecem ter o tamanho e a aparência de

complexos, até mesmos com as nanopartículas grudadas. Mas mais uma vez não

podemos dizer se eles já estavam formados em solução ou se foram sobrepostos na

evaporação da água.

No segundo ensaio, utilizamos as razões 1:5:0, 1:5:0,5 (por exemplo na

Figura 25) e 1:5:4. Além disso, fizemos a diluição dessas amostras para 50 vezes,

em volume, com água destilada para que o sal não atrapalhe.

59

Figura 25 – Microscopia eletrônica de varredura de amostra diluída e razão mássica 1:5:0,5

As imagens deste novo ensaio não mostram claramente cristais facetados e

grandes como nas imagens sem diluição, mostrando que esta foi eficaz. Mas agora,

temos outro problema que antes não existia, a aparição de aglomerados muito

grandes, da ordem de 10 µm. Estes aglomerados podem ter surgido do efeito de

diluição que desestabilizou as partículas, não as conservando em seu meio natural,

o PBS, fazendo com que elas se juntassem. Outra possibilidade é a aglomeração na

evaporação, sendo estes aglomerados as últimas gotas a evaporarem.

Na Figura 54 do Anexo D, há partículas isoladas com dimensões da ordem de

50 nm, cujo formato não pode ser determinado devido à pequena ampliação das

imagens. Estas partículas podem ser AgNPs.

Não obtivemos diferença visual entre as amostras de diferentes razões

mássicas com diluição e conseguimos também aqui encontrar partículas que

aparentam e tem tamanho suficiente para ser o nosso complexo (as MEVs estão no

ANEXO D – MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA DOS COMPLEXOS

TERNÁRIOS.

Resultados de EDS de partículas selecionadas são mostrados na Tabela 8.

60

Tabela 8 - Ensaio de EDS das amostras de MEV com diluição

% Atômica

Razão mássica

Ponto Figura Carbono Oxigênio Fósforo Cloro Chumbo Berílio

1:5:0 1 Figura 58 45.64 51.21 2.97 0.17

1:5:0 2 Figura 58 47.90 49.31 1.81 0.98

1:5:0 1 Figura 59 39.49 50.56 0.94 1.97 7.03

1:5:0,5 1 Figura 60 43.74 52.96 3.25 0.04

1:5:0,5 1 Figura 61 39.02 43.19 2.31 5.29 10.20

1:5:0,5 1 Figura 62 46.98 48.47 3.38 1.17

1:5:0,5 2 Figura 62 46.30 49.85 3.85

1:5:4 1 Figura 63 47.31 49.76 2.92

1:5:4 2 Figura 63 51.84 45.99 2.17

1:5:4 3 Figura 63 46.28 49.55 4.17

1:5:4 1 Figura 64 54.44 37.17 1.44 6.95

1:5:4 1 Figura 65 47.49 9.31 1.01 42.19

1:5:4 2 Figura 65 46.98 50.62 2.28 0.11

1:5:4 3 Figura 65 49.89 47.86 2.26

1:5:4 4 Figura 65 54.29 45.71

1:5:4 5 Figura 65 44.42 55.14 0.43

A nossa amostra contém os componentes que foram adicionados na solução

de AgNPs (que contém citrato, sódio, nitrato e prata), o tampão PBS (sódio, fosfato,

cloreto), o pDNA, a Protamina, menos a água destilada, que foi evaporada.

Estes componentes fazem a nossa amostra ser rica em carbono, oxigênio,

nitrogênio e fósforo. Alguns componentes de menor quantidade são a prata, cloreto

e sódio.

A tabela acima vem quantificar as nossas amostras e confirmar algumas de

nossas suposições. Realmente a quantidade de carbono e oxigênio são maioria,

com isso, podemos dizer que nessas partículas contém Protamina ou pDNA. Uma

surpresa foi a não detecção de nitrogênio, muito presente nas duas substâncias,

apesar da menor quantidade.

O fósforo encontrado pode ter vindo tanto do pDNA como do tampão PBS,

com isso não podemos afirmar a procedência exata delas. O cloro encontrado em

pequena quantidade também veio do tampão, cristalizado pela evaporação da água

na preparação da amostra.

61

Podemos notar o aparecimento de picos de chumbo, que teoricamente não

teria de onde sair, mas uma solução pensada para este pico é a contaminação do

porta amostra de latão com chumbo. O único pico de berílio encontrado também é

estranho e não tem procedência e nem explicação para a sua aparição.

A maior surpresa deste teste foi o não aparecimento de prata em nenhuma

das imagens. A explicação para isso é a pequena quantidade de prata colocada

frente aos outros componentes.

4.4. TRANSFECÇÃO CELULAR

O ensaio final e mais importante deste trabalho é a transfecção celular. Ele

nos dirá se as nanopartículas de prata tem algum efeito sobre a entrada de genes

nas células, comparativamente com amostras sem prata. O resultado da transfecção

é indicado pela quantificação da atividade da enzima repórter luciferase no extrato

celular 24 horas após a transfecção. O gene que codifica a luciferase só expressa

quando o pDNA chega ao núcleo das células, sendo um indicativo da eficiência da

transfecção.

As amostras estão dispostas como na Figura 26. São seis amostras, células

somente, células com pDNA, células com pDNA:Protamina, células com complexo

ternário de razões mássicas 1:5:0,5; 1:5:2 e 1:5:4.

Estes resultados são preliminares, não tendo sido ainda normalizados pela

concentração de proteína total nos extratos celulares. Precisamos de um valor que

nos quantifique o número de células que continuaram vivas em cada ensaio para

dividir os resultados por este valor. Apesar de visualmente não serem constatadas

células mortas, a prata pode ter algum efeito tóxico para as células, o que não é do

escopo do trabalho, e aumentaria os nossos valores para as amostras com prata.

Podemos constatar claramente que as amostras que contem AgNPs são mais

eficientes na transfecção de genes para o interior dos núcleos das células. Os

valores chegam a ser 100 vezes mais eficientes que a amostra que possui células

62

com o complexo binário pDNA:Protamina e 1000 vezes melhor que a amostra de

células com pDNA.

Figura 26 - Resultados de transfecção celular, nas diferentes razões mássicas de pDNA:protamina:NpAg estudas, utilizando-se células HeLa cultivadas in vitro.

As amostras que possuem AgNPs não podem ser diferenciadas entre si em

relação à eficiência da entrega gênica. A barra de erros mostrada no gráfico nos

mostra isso, e os resultados se equivalem. Se tivéssemos mais amostras

poderíamos melhorar os resultados e tirar alguma conclusão.

Essa equivalência pode ser explicada pela pequena quantidade de prata nas

três amostras, fazendo com que elas causem o mesmo efeito. Outra possível

explicação pode vir do fato de a prata produzir algum mecanismo, desconhecido por

nós, de entrada do complexo nas células não importando a quantidade adicionada.

A variável de tamanho pode ser relacionada aqui de maneira fácil, mas

contraditória. Como os valores de entrega gênica são iguais entre as 3 amostras

com AgNPs e o tamanho médio das partículas é menor para a amostra de razão

1:5:0,5, temos uma contradição, pois teoricamente as menores partículas

1,55E+02 3,21E+02 3,09E+03

1,53E+05 1,76E+05

2,84E+05

-5,00E+04

0,00E+00

5,00E+04

1,00E+05

1,50E+05

2,00E+05

2,50E+05

3,00E+05

3,50E+05

4,00E+05

Un

idad

es

de

em

issã

o d

e lu

z

Transfecção

Transfecção Celular

63

transfectam melhor. Isso pode ser uma indicação de que quanto mais prata melhor a

entrega dos genes, pois as razões mássicas maiores de prata tem maior tamanho

(dificultador de transfecção).

64

5. CONCLUSÃO

Foram caracterizados, preliminarmente, alguns complexos ternários de

acordo com sua carga, tamanho e eficiência de transfecção, alem da tentativa de

visualização através de microscopia eletrônica de varredura.

A formação dos complexos binários foi confirmada pelo ensaio de

eletroforese. Estes ensaios também são consistentes com complexos

pDNA:proteína:AgNPs, muito embora eles não permitam diferenciar a adesão das

AgNPs nos complexos.

As MEVs permitiram visualizar partículas dos complexos, mas sem distinguir

entre partículas isoladas e sobrepostas.

O EDS é um ensaio considerado interessante, pois pode quantificar as

composições de alguns pontos de interesse na imagem de MEV.

O ensaio de potencial Zeta mostrou que as AgNPs são carregadas

negativamente e que os complexos ternários têm carga positiva. Já o DLS nos

fornece tamanhos diferentes destas partículas, sendo as razões mássicas de 1:5:2

(830 nm ± 180) e 1:5:4 (630 nm ± 10) sendo praticamente iguais, devido ao grande

desvio padrão e pequena quantidade de amostras e, pelo menos, 1,5 vezes maior

que a 1:5:0,5 (430 nm ± 20). Este ensaio pode indicar a formação de agregados,

explicando o aumento de tamanho.

A transfecção dos complexos foi realizada e foi constatado um aumento na

sua eficiência para as amostras que continham as AgNPs. Esta eficácia não teve

variação entre as diferentes razões mássicas de nanopartículas de prata.

A partir dos resultados acima, pode-se resumir os achados deste trabalho.

Complexos pDNA:proteína, com dimensões de cerca de 500 nm e carga positiva,

quando associados em proporções adequadas a AgNPs com dimensões de cerca

de 50 nm e carga negativa, formam partículas de 500 nm e carga positiva. Os

complexos triplos apresentam eficiência de transfecção muito superior aos

complexos sem AgNPs, cerca de cem vezes maior. Estes resultados preliminares

revelam uma rota promissora para entrega gênica baseada em AgNps.

65

6. SUGESTÃO PARA FUTUROS TRABALHOS

Como já foi dito, este trabalho encontrou muitas dificuldades e a maior delas

foi a falta de conhecimento na área. Com isso, nos preocupamos neste item em dar

algumas diretrizes para os trabalhos que futuramente poderão surgir.

1. Avaliar dados de conversão para as nanopartículas de prata, a fim de ter as

razões mássicas calculadas de forma correta;

2. Avaliar a eficiência da transfecção para diferentes tamanhos de AgNPs

acoplada;

3. Utilizar menor razão mássica pDNA:Protamina, preferencialmente menor que

1:1;

4. Usar maior quantidade de AgNPs na construção dos complexos para tentar

ver o ponto de viragem de carga, de positivo para negativo;

5. Avaliar a estabilidade tanto das AgNPs quanto dos complexos, para ver se

eles são estáveis e até quando são.

6. Tentar usar algum outro método de visualização das partículas, que não a

MEV;

7. Normalizar os dados de transfecção para obter os valores corretos e

utilizados no mundo acadêmico.

66

REFERÊNCIAS

Adler, Andrew F. and Leong, Kam W. 2010. Emerging links between surface

nanotechnology and endocytosis: Impact on nonviral gene delivery. Nano Today.

2010, Vol. 5, pp. 553-569.

Al-Dosari, Mohammed S. and Gao, Xiang. 2009. Nonviral Gene Delivery: Principle,

Limitations, and Recent Progress. The AAPS Journal. 2009, Vol. 11, 4, pp. 671-681.

Azzoni, A. R., et al. 2007. The impact of polyadenylation signals on plasmid

nuclease-resistance and transgene expression. The Journal of Gene Medicine. 2007,

Vol. 9, 5, pp. 392-402.

Cartier, Régis and Reszka, Regina. 2002. Biological and Cellular Barriers Limiting

the Clinical Application of Nonviral Gene Delivery Systems. Gene Therapy. 2002,

Vol. 9, 3, pp. 157–167.

Compri-Nardy, M., Stella, M. B. and Oliveira, C. 2009. Práticas de Laboratório de

Bioquímica e Biofísica. s.l. : Guanabara Koogan, 2009.

DeLong, Robert K., et al. 2009. Characterization and performance of nucleic acid

nanoparticles combined with protamine and gold. Biomaterials. 2009, Vol. 30, pp.

6451-6459.

Epple, Matthias and Sokolova, Viktoriya. 2008. Inorganic Nanoparticles as

Carriers of Nucleic Acids into Cells. Angewandte Chemie International Edition. 2008,

Vol. 47, pp. 1382-1395.

Instruments, Malvern. Dynamic Light Scattering: An Introduction in 30 Minutes

(Technical note).

67

Lee, P. C. and Meisel, D. 1982. Adsorption and surface-enhanced Raman of dyes

on silver and gold sols. The Journal of Physical Chemistry. 1982, Vol. 86, 17, pp.

3391–3395.

Lok, Chun-Nam, et al. 2007. Silver nanoparticles: partial oxidation and antibacterial

activities. 2007.

Martinez-Castanon, G. A., et al. 2008. Synthesis and antibacterial activity of silver

nanoparticles with different sizes. J. Nanopart. Res. 2008, Vol. 10, pp. 1343-1348.

Mastrobattista, Enrico, et al. 2005. Nonviral gene delivery systems: From simple

transfection agents to artificial viruses. Drug Discovery Today: Technologies. 2005,

Vol. 2, 1, pp. 103-109.

Niemeyer, Christof M. and Mirkin, Chad A. 2004. Nanobiotechnology: concepts,

applications and perspectives. s.l. : Wiley-VCH, 2004.

, Al š, t l. 2006. Silver Colloid Nanoparticles: Synthesis,

Characterization, and Their Antibacterial Activity. The Journal of Physical Chemistry

B. 2006, Vol. 110, 33, pp. 16248-16253.

Park, Hyun-Ji, Yang, Fan and Cho, Seung-Woo. 2011. Nonviral delivery of genetic

medicine for therapeutic angiogenesis. Advanced Drug Delivery Reviews. 2011, Vol.

Disponível online.

Parveen, Suphiya, Misra, Ranjita and Sahoo, Sanjeeb K. 2011. Nanoparticles: a

boon to drug delivery, therapeutics, diagnostic and imaging. Nanomedicine:

Nanotechnology, Biology, and Medicine. 2011, Vol. Disponível online.

Santana, Henrique de, et al. Preparação e caracterização de substratos SERS

ativos: um estudo da adsorção do cristal violeta sobre nanopartículas de prata.

68

Santos, Marcia R., Tavares, Marina F. M. and Rubim, Joel C. 2000.

Implementação de um Sistema de Eletroforese Capilar com Detecção de

Fluorescência Induzida por Lase. Química Nova. 2000, Vol. 23, 5, pp. 585-589.

Shim, Min Suk and Kwon, Young Jik. 2010. Acid-transforming polypeptide micelles

for targeted nonviral gene delivery. Biomaterials. 2010, Vol. 31, pp. 3404–3413.

Smith, Louis C., et al. 1998. Synthetic peptide-based DNA complexes for nonviral

gene delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 1998, Vol. 30, pp. 115-131.

Turkevich, John, Stevenson, Peter Cooper and Hillier, James. 1951. A study of

the nucleation and growth processes in the synthesis of colloidal gold. Discussions of

the Faraday Society. 1951, Vol. 11, pp. 55-75.

Wagner, Ernst. 1999. Application of membrane-active peptides for nonviral gene

delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 1999, Vol. 38, 3.

Wan, Hongshui, et al. 2005. Preparation of silver nanoparticles by chemical

reduction method. 2005.

Yan, Ya, Kang, Shi-Zhao and Mu, Jin. 2006. Preparation of high quality Ag film

from Ag nanoparticles. 2006.

Yu, Da-Guang, Lin, Wen-Ching and Yang, Ming-Chien. 2007. Surface Modification

of Poly(L-lactic acid) Membrane via Layer-by-Layer Assembly of Silver Nanoparticle-

Embedded Polyelectrolyte Multilayer. Bioconjugate Chemistry. 2007, Vol. 18, 5, pp.

1521-1529.

Zeta-Meter, Inc. Zeta Potential: A Complete Course in Five Minutes.

69

ANEXOS

ANEXO A - LAUDOS DO ZETA DAS NANOPARTÍCULAS

Em pH = 7,4

Figura 27 - Laudo 1 do Zeta para nanopartículas em pH = 7,4


70


Em pH = 9

Figura 30 - Laudo 1 do Zeta para nanopartículas em pH = 9

71



72

ANEXO B – LAUDOS DO ZETA PARA OS COMPLEXOS

TERNÁRIOS

Razão 1:5:0,5

Figura 33 - Laudo 1 do Zeta para complexos ternários razão 1:5:0,5


73


Razão 1:5:2

Figura 36 - Laudo 1 do Zeta para complexos ternários razão 1:5:2

74



75

Razão 1:5:4



76


77

ANEXO C – LAUDOS DO DLS PARA OS COMPLEXOS

TERNÁRIOS

Razão 1:5:0,5

Figura 42 - Laudo 1 do DLS para complexos ternários razão 1:5:0,5


78


Razão 1:5:2

Figura 45 - Laudo 1 do DLS para complexos ternários razão 1:5:2

79



80

Razão 1:5:4



81


82

ANEXO D – MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA DOS

COMPLEXOS TERNÁRIOS

Amostras sem diluição

Figura 51 - MEV para razão mássica 1:5:0,5 aumentada

83

Figura 52 - MEV para razão mássica 1:5:4

Figura 53 - MEV para razão mássica 1:5:4 aumentada

84

Amostras com diluição

Figura 54 – Microscopia eletrônica de varredura de amostra diluída e razão mássica 1:5:0

Figura 55 – Microscopia eletrônica de varredura de amostra diluída e razão mássica 1:5:0,5 com zoom

85

Figura 56 – Microscopia eletrônica de varredura de amostra diluída e razão mássica 1:5:4 com zoom

Figura 57 – Microscopia eletrônica de varredura de amostra diluída e razão mássica 1:5:4

86

EDS das amostras com diluição

Figura 58 - EDS da amostra de razão mássica 1:5:0

Figura 59 - EDS do aglomerado da amostra de razão mássica 1:5:0

87

Figura 60 - EDS 1 da amostra de razão mássica 1:5:0,5


88


Figura 63 - EDS 1 da amostra de razão mássica 1:5:4

89



Documents

Síntese e caracterização físico-química de ...sites.poli.usp.br/p/augusto.neiva/TCC/arquivos/1349295147.pdf · 3 DANILO HENRIQUE STAVRO DUARTE Síntese e caracterização físico-química