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SISTEMAS MICELARES DE DUAS FASES AQUOSAS

SISTEMAS MICELARES DE DUAS FASES AQUOSAS. TENSOATIVOS E MICELAS IÔNICOS: brometo de dodeciltrimetilamônio CH 3 CH 3 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH

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SISTEMAS MICELARES  DE DUAS FASES

AQUOSAS

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TENSOATIVOS E MICELAS

IÔNICOS:

brometo de dodeciltrimetilamônio CH3

CH3-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-N-CH3+

Br-

CH3

dodecil sulfato de sódio

CH3-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-OSO3- Na+

cauda apolar

cabeça polar

Catiônicos

Aniônicos

Moléculas anfifílicas: grupo liofóbico grupo liofílico

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TENSOATIVOS E MICELAS

NÃO-IÔNICOS: CH3-(CH2)9-OCH2CH2 -OCH2CH2 -OCH2CH2 -OCH2CH2 -OH

óxido de n-deciltetraetileno (C10E4)

ZWITERIÔNICOS: CH-CH2-PO4

--(CH2)2-N(CH3)3+

dioctanoil fosfatidil colina (C8-lecitina)

QUANTO À CAUDA:

CH3-(CH2)6-COOCHCH3-(CH2)6-COOCH

Saturada/insaturada Cadeias duplas Cadeia ramificada

halogenadas (fluorcarbonetos) cadeia de polióxido de propileno

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Lisina (zweterion)

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SURFACTANT = Surface Active Agent

Líquidos contração da superfície (< energia livre)

força de atração para dentro exercida pelas moléculas presentes na solução sobre as moléculas na superfície

TENSÃO SUPERFICIAL - (mN/m)

Moléculas anfifílicas – procuram orientar-se na superfície (< energia livre)

Interação H2O-Tens. < interação H2O-H2O

tensão superficial

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Formação de micelas balanço complexo de forças intermoleculares:

van der Waals

eletrostáticas

hidrofóbicas estéricas

ligações de hidrogênio

MICELAS = agregados de tensoativos

Micelização = mecanismo alternativo à adsorção na superfície/interface para a remoção do grupo hidrofóbico do contato com a água.

Razão principal para a formação de micelas = obtenção de estado mínimo de energia livre

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tensão superficial

CMC Concentração de tensoativo

condutividade

detergência

pressão osmótica

Tempo de reação: milissegundos a minutos

As micelas são colóides de associação

Dinâmicas, reversíveis, distribuição estatística de tamanhos (polidispersão)

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micela esférica

bicamada

micela cilíndrica

TIPOS DE AGREGADOS FORMADOS (MICELAS)

vesícula (lipossoma)

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temperatura

SEPARAÇÃO DE FASES

“Solução” micelar homogênea

Fase rica em micelas

Fase pobre em micelas

- turvação “cloud point” - “ponto de névoa”

- aumento da temperatura redução na solubilidade da micela

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Extração Líquido-Líquido em Sistema Micelar de Duas Fases Aquosas

PROCESSO DE SEPARAÇÃO DE FASES

Sistema Monofásico Sistema Bifásico

Fase Rica em

micelas

Fase Pobre

em micelas>> TºC tempo

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SISTEMA MICELAR DE DUAS FASES AQUOSAS

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Tem

pera

tura

Região Bifásica

Região Monofásica Ponto Crítico

Linha de amarração “Tie-Line”

Ci CB CT

V’B V’T

Concentração de tensoativo

Cd Cc

V´c V´d

CURVA BINODAL (C10E4)

Cc e Vc

Cd e Vd

T (oC)

(ou vice-versa)

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Yagui, C. O. R., Pessoa A., Blankschtein, d. Two- phase aqueous micellar systems - an alternative method for protein purification. Brazilian Journal of Chemical Engineering. 21(4):531- 544, 2004

DIAGRAMA DE FASES

Extração Líquido-Líquido em Sistema Micelar de Duas Fases Aquosas - SMDFA

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T (oC)

19,00

13,05C10E4 + 0,5 M Li2SO4

C10E4 + 0,5 M NaCl

C10E4

C10E4 + 0,1 M KI

23,60

4,75

Influência de alguns sais sobre o ponto crítico

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SMDFA – aplicações: Purificar e concentrar compostos como: BSA, bacteriófagos, antibióticos,

colesterol oxidase, lisozima e outras enzimas, vitaminas lipossolúveis e compostos orgânicos.

Separar contaminantes com características hidrofóbicas presentes em soluções biológicas.

Primeiro trabalho - BORDIER (1981) - agente tensoativo não-iônico Triton X-114 - proteínas hidrofílicas X proteínas hidrofóbicas.

Pode ser aplicado a sistemas envolvendo células intactas.

Alternativa na purificação de proteínas de plantas - compostos presentes em plantas que interferem nas técnicas convencionais de extração, como fenóis e clorofila, podem ser facilmente removidos por SMDFA.

Pode separar: íons metálicos, estriol, progesterona, -estradiol, estrona, clorofila, bacteriófagos, células, fenóis e outras moléculas orgânicas de baixa massa molar.

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SISTEMA MICELAR DE DUAS FASES AQUOSAS (SMDFA) APLICADO À PURIFICAÇÃO DE

PROTEÍNAS

Ambiente ameno para materiais biológicos;

Método seguro, não utiliza compostos inflamáveis ou explosivos;

Fácil ampliação de escala;

Baixo custo (em princípio requer somente um tensoativo e em baixas concentrações);

Gera resíduos de fácil manuseio (baixa toxicidade, fácil acondicionamento, etc.);

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Micelas fornecem ambientes hidrofílicos e hidrofóbicos;

Controle e otimização da partição através do ajuste das características micelares (tamanho e forma);

Fácil separação do material desejado das moléculas de tensoativo após a purificação;

A seletividade da partição pode ser melhorada com a utilização de micelas contendo ligantes de afinidade ou misturas de tensoativos;

Técnica não interfere em metodologias como cromatografia líquida, eletroforese, ELISA, etc.

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SISTEMA MICELAR NÃO-IÔNICO DE DUAS FASES AQUOSAS PARA PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS

proteína hidrofílica

proteína hidrofóbica

BORDIER (1981) apresentou a possibilidade de separação de proteínas em SMDFA – tensoativo Triton X-114.

Purificação de proteínas hidrofóbicas: colesterol oxidase, lipase, proteínas de membrana.

Altos valores de Kp

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EXPERIMENTO [C10E4] (% p/p)

T (oC)

R (Vt/Vb)

KG6PD BMG6PD (%)

1 2,50 19,5 0,76 0,53 0,04 97 9

2 3,60 20,0 1,00 0,36 0,00 104 4

3 3,25 20,4 0,60 0,33 0,01 108 7

4 3,00 21,5 0,35 0,20 0,04 101 6

5 5,00 22,0 0,60 0,10 0,01 101 2

PARTIÇÃO DA ENZIMA GLICOSE-6-FOSFATO DESIDROGENASE (G6PD) EM SISTEMA

C10E4/TAMPÃO

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SISTEMA MICELAR MISTO (NÃO-IÔNICO/IÔNICO) DE DUAS FASES AQUOSAS

- G6PD negativamente carregada

- C10E4

- CnTAB (n = 8, 10, or 12) – carga positiva+

- G6PD negativamente carregada

- C10E4

- CnTAB (n = 8, 10, or 12) – carga positiva+

- G6PD negativamente carregada

- C10E4

- CnTAB (n = 8, 10, or 12) – carga positiva+

- G6PD negativamente carregada

- C10E4

- CnTAB (n = 8, 10, or 12) – carga positiva+ ou

Micelas mistas são formadas in situ, sem necessidade de síntese como os polímeros + eletrólitos

Condições da solução (pH, FI) podem ser variadas

melhorar a partição alterando as interações eletrostáticas e de

volume de exclusão

Reverter as interações e separar as proteínas das micelas

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TENSOATIVOS CATIÔNICOS X DESNATURAÇÃO PROTÉICA

0

20

40

60

80

100

0 100 200 300 400

Time (min)

Rec

over

y G

6PD

(%)

C8TABC10TABC12TAB

2.5 mM CnTAB + 0.068 mg/mL G6PD

Rec

uper

ação

Tempo

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TENSOATIVOS X DESNATURAÇÃO PROTÉICA

Tensoativos não-iônicos – apresentam apenas interações hidrofóbicas não-específicas em concentrações ~ CMC (exceção: BSA e Tritons)

Tensoativos iônicos: 1- interações eletrostáticas com resíduos de aminoácidos de carga oposta

na superfície da proteína (ligação sítio-específica)

2- interações hidrofóbicas das caudas apolares com o interior apolar da proteína (ligação cooperativa, não-específica).

maior a tendência a formar micelas - maior a afinidade pelas proteínas

em geral, tensoativos aniônicos interagem mais fortemente que os catiônicos

cadeias laterais da arginina e lisina (ligação com aniônico) são mais “projetadas” que as do ác. glutâmico e aspartato (ligação com catiônicos)

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PURIFICAÇÃO DE G6PD EM HOMOGENEIZADO DE S. Cerevisiae

FONTE DE G6PD PROCESSO UTILIZADO KG6PD YG6PD (%)

Enzima pura sistema C10E4/C10TAB/tampão 7,7 71

Homogeneizado de S.cerevisiae

sistema C10E4/C10TAB/tampão 1,91 48

Homogeneizado de S.cerevisiae

purificação em dois estágios: I - C10E4/tampão

II -C10E4/C10TAB/tampão

I – 0,35 II – 3,82

59

            

SISTEMA IC10E4/Tampão

separação de fases

coleta da fase Inferior

SISTEMA IIC10E4/C10TAB/Tampão

separação de fases

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GFP CBM9

liga à celulose, di- e monossacarídeos

CBM9GFP

C10G1

Surfactant - C10G1

(Decyl -D-glucopyranoside)

+

EXTRAÇÃO DA PROTEÍNA VERDE FLUORESCENTEGFPuv

UTILIZANDO LIGANTE DE AFINIDADE

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C10G1 (5%) Lisado Celular + CBM9-GFP Tampão pH 7,2

29oC, após 6h Fase Pobre em Micelas

Fase Rica em Micelas (GFPuv)

Micela +

ligante + GFP

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Procion red Cibacron blue

Inibidores de G6PD - Mimetizam a coenzima NAD(P)+

H

N

O

NH2

H H

O

OHOH

OP

OO

PO

-O O CH2

-O

N

N

N

N

NH2

H

CH2

HH

OROH

H

O

+

NADP+

UTILIZAÇÃO DE INIBIDORES ENZIMÁTICOS COMO LIGANTES DE AFINIDADE

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PARTIÇÃO DOS LIGANTES CIBACRON BLUE E PROCION RED EM SISTEMA C10E4/TAMPÃO

0

5

10

15

20

25

30

35

Procion red Cibacron blue

K lig

ante

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PARTIÇÃO DA G6PD EM SISTEMA C10E4/TAMPÃO CONTENDO CIBACRON BLUE E PROCION RED

0,20

0,30

0,40

sem ligante cibacron blue procion red

K G6P

D

Interações de afinidade não são suficientemente fortes para influenciar significantemente o perfil de partição da G6PD.

Ocorrência de interação do ligante com as micelas, diminuindo a probabilidade de formação de complexo enzima inibidor.

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Estrutura da Endotoxina: LipoPoliSsacarídeo (LPS)

porç

ão

hidr

ofób

ica

por

ção

hidr

ofíli

ca

4-(C

8H17

)-C 6

H4-

(OCH

2CH

2)n-

OH

,n~

8

TRITON X-114 polioxietileno p-t-octil fenol

Remoção de Endotoxina (pirogênio) por Extração Líquido-LíquidoRemoção de Endotoxina (pirogênio) por Extração Líquido-Líquido

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Tubo em câmara de

luz UV

Tubo visto aolho nu

Comportamento da GFPuv ( ) e do LPS ( ) na Extração em SMDFA Utilizando Triton X-114 ( )