REAÇÕES AG X AC Aplicações em Diagnóstico e

Pesquisa

Dra. Rosa Maria Tavares HaidoProfa. Associada – Disciplina de

Imunologia

Características das Reações Ag/Ac

• Especificidade

Acs são formados sob influência das caracaterísticas estruturais do Ag.

A sequência de Aa do sítio combinatório tem a configuração espacial mais adequada para complementar a configuração espacial do epítopo

Características das Reações Ag/Ac

A capacidade de um único sítio combinatório do Ac reagir com somente um epítopo.

• Especificidade

A capacidade de uma população de moléculas de Acs de reagir somente com um Ag

Ligações não covalentes - Pontes de Hidrogênio - Interações eletrostáticas - Forças de Van der Waal - Interações hidrofóbicas

Ab

Ag

Alta afinidade

Ab

Ag

Baixa afinidade

• Afinidade

Força de reação entre um único epítopo e um único sítio combinatório do Ac

• Afinidade > ou < afinidade depende da complementariedade entre Ag e Ac > complementariedade reconhece grande porção do epítopo < complementariedade reconhece pequena porção do epítopo e podem interagir com moléculas que tenham estruturas semelhantes com < afinidade

REAÇÃO CRUZADA

Reação Cruzada• A capacidade de um único sítio combinatório do Ac de

reagir com mais de um epítopo.• Ocorre entre Ags que compartilham os mesmos epítopos

ou possuem epítopos similares

Ac Anti-A

Ag A

Ac Anti-A

Ag B

Epítopo igual

Anti-A Ac

Ag C

Epítopo similar

Reações cruzadas

• Avidez A força de ligação total entre um Ag com muitos epítopos e

Acs multivalentes

Keq = 104

Afinidade106

Avidez1010

Avidez

IgG - Ligação bivalente - Afinidade alta (maturação de afinidade) - Avidez alta só para Ags solúveis (epítopos acessíveis)

IgM - Ligação pentavalente (sítios de ligação idênticos) - Afinidade de cada sítio para o Ag é baixa - Avidez total do Ac para Ag multivalente elevada

DIVERSIDADE

Acs específicos sintetizados em resposta a um único epítopo são diferentes entre si e tem propriedades diferentes, especialmente em relação a afinidade

• Interações em proporções múltiplas

• Reversíveis

Etapas das Reações Ag x Ac Combinação do Ag com o Ac Manifestações visíveis dessa combinação Expressão biológica da reação Ag x Ac

Fatores Que Influenciam Nos Resultados Das Reações Imunológicas

Antígenos

Anti-soros padronizados

Reações padronizadas (técnicas)

Avaliação: Sensibilidade, especificidade e valor preditivo

Fatores que influenciam a medição das Reações Ag/Ac

• Afinidade

• Avidez• Concentração Ag:Ab

• Estado físico do Ag

Fatores que influenciam a medição das Reações Ag/Ac

Concentração relativa de Ag e Ac

Excesso de Ac Equivalência Excesso de Agentre Ag e Ac

Formação de Rede

Reações Ag x AcReações Ag x Ac

Pesquisa

Ags ou Acs Ags

no Soro nos Tecidos

Sorologia Imunohistoquímica

Diagnóstico de infecções Detecção de Ags / Acs

Monitoramento do tratamento

DETECÇÃO DE ANTÍGENOS E ANTICORPOSDETECÇÃO DE ANTÍGENOS E ANTICORPOS

AG AC SISTEMAREVELADOR

Íntegro

Recombinante

Peptídeo

Monoclonais

PrecipitaçãoAglutinação

Enzima

Radioisótopo

Fixaçãodo C`

Extrato

Policlonais

FluorocromoPurificado

FONTES ANTIGÊNICAS

• Antígenos totais• Antígenos de superfície• Frações purificadas• Proteínas recombinantes• Peptídeos sintéticos

Conter epítopos específicos

Ser comum as diferentes cepas do patógeno

De fácil obtenção e através de metodologia reprodutível

Características Ideais de um Antígeno

TÍTULO maior diluição do Ag ou Ac onde ainda há manifestação visível da reação

Quantitativa = Titulação

é a dosagem semi-quantitativa do Ag /Ac usando Ac/Ag conhecido

Titulação do Ag

Determina a concentração mínima de Ag a ser usada numa reação sorológica

Titulação de Ac

Determina a quantidade de Ac presente em um soro = SORODIAGNÓSTICO

SOROLOGIASOROLOGIA Qualitativa

PRINCÍPIO DA PRODUÇÃO DE ANTICORPOS

CARACTERÍSTICAS DOS ANTICORPOS MONOCLONAIS

Homogeneidade

Especificidade

Reprodutibilidade

Diagnóstico e terapia de tumores

Imunodiagnóstico de doenças infecciosas

APLICAÇÕES DOS ANTICORPOS MONOCLONAISAPLICAÇÕES DOS ANTICORPOS MONOCLONAIS

Identificação de marcadores fenotípicos e análise funcional de moléculas de superfície celular

SOROLOGIA

PESQUISA DA CLASSE DE AC

Detecção de IgM – Infecção primária

- Diagnóstico de infecção em recém-nascido Detecção de IgM e IgG – Infecção em curso

Deteção de IgG – Convalescência

- Vacinação

- Cicatriz sorológica

- Teste de avidez para IgG

SOROLOGIA PAREADAColeta e análise de duas amostras do

pacienteSegunda coleta 2-4 semanas após a

primeira coletaConversão sorológica

Aumento de 4 vezes no título de Acs do soro da fase convalescente(2ª coleta) em relação ao soro da fase aguda(1ª coleta)

A escolha do teste sorológico a ser utilizado no diagnóstico de infecções agudas deve levar em consideração a sensibilidade e

a duração do período necessário para o aparecimento de títulos de anticorpos detectáveis

SOROLOGIASOROLOGIA

Resultados positivos necessitam de testes confirmatórios

Resultados devem ser interpretados dentro de um contexto clínico e epidemiológico

Testes Sorológicos Baseados nas Reações Ag/Ac

Todos os testes baseados nas reações Ag/Ac dependem da formação de rede ou utilizam recursos (sistemas reveladores) para detectar pequenos complexos imunes

Todos os testes baseados nas reações Ag/Ac podem ser usados para detectar ou Ag ou Ac

Testes de Formação de Rede

Aglutinação

Antígeno = Partícula

Aglutinação/Hemaglutinação Direta

+ =

Direta

Ag particulado

Ac solúvel

Agregado

Execução da técnica: - tubo, lâmina ou microplacas- qualitativa ou quantitativa

Aglutinação/Hemaglutinação Direta Direta Qualitativa

Ac anti-Ag A

Hemácias A

Tipagem sanguínea

A B AB O

Aglutinação/Hemaglutinação Direta

Infecções Bacterianas

Pesquisa de Acs para infecções (salmonelose, leptospirose,toxoplasmose...)

Sorotipagem de bactérias

Direta Qualitativa

+ =

Ex: REAÇÃO DE WIDAL - Febre tifóide

50 L do soro

1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640

0,950 mL PBS

0,5 mL PBS

0,5 mL PBS

0,5 mL PBS

0,5 mL PBS

0,5 mL PBS

0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL

Acrescentar 0,5 mL de Ag em cada tubo

Armazenar a 4ºC por 72 horas

Realizar a leitura a cada 24 horas

Aglutinação/Hemaglutinação Direta Direta quantitativa

Aglutinação/Hemaglutinação Direta

Aglutinação Quantitativa

• Título

• Prozona• ControleAg + tampão salina fosfato(PBS)

Aglutinação/Hemaglutinação Direta

• Prozona Falso

Negativos

1:256

1:512

Título

Aglutinação/Hemaglutinação Direta• Aglutinação Quantitativa

Botão = Teste negativo

Rede = Teste positivo

Aglutinação/Hemaglutinação Direta

Considerações Práticas– Fácilidade de execução– Baixo custo– Elevada sensibilidade– Leitura visual– Semi-quantitativo

1/2

1/4

1/8

1/16

1/32

1/64

1/12

81/

256

1/51

2

Ex: Tipagem de grupos sanguineos

Sorotipagem de bactérias

Reação de Widal (febre tifóide)

Aglutinação /Hemaglutinação Indireta

Definição – Antigeno solúvel adsorvido a superfície de uma particula (látex, hemácia)

AplicaçõesEx: TPHA – Hemácias de Carneiro sensibilizadas com Ag

deTreponema pallidum

Sorodiagnóstico de sífilis  

Resultado negativo (microscópio óptico x 100)

Resultado positivo (microscópio óptico x 100)

(VDRL latex)

(VDRL- floculação)

Testes de Coombs (Antiglobulina)

•Teste Coombs Direto– Detecta anticorpos nos eritrócitos do cordão umbilical

+

Eritrócitos do Paciente Reagente de Coombs(Anti-imunoglobulina)

Teste de Coombs (Antiglobulina) Teste de Coombs Indireto

―Detecta anticorpos anti-eritrócitos no soro da mãe

Soro do paciente Eritrócito teste+

Etapa 1

+

Reagente de Coombs(Antiglobulina)

Etapa 2

Testes de Coombs (Antiglobulina)

•Aplicações

― Detecção de Ac anti-Rh ― Anemia hemolítica autoimune

Inibição da Aglutinação/Hemaglutinação

• Definição - Teste baseado na inibição da aglutinação devido a competição com um Ag solúvel

Controle Positivo (Sem amostra do paciente)

Detecção / medida de Ag solúveisTeste positivo = Ausência de Aglutinação

Inibição da Aglutinação/Hemaglutinação• Definição - teste baseado na inibição da aglutinação devido a presença de Ac no soro de paciente

Detecção / medida de AcTeste positivo = ausência de aglutinação

Controle positivo (Sem amostra do paciente)

YY YYYYYY

YY

Hemaglutinina viral

(Ac ?)

Ex: diagnótico de vírus hemaglutinantes (Influenza)

Inibição da Aglutinação/Hemaglutinação

Inibição da Aglutinação/Hemaglutinação

• Aplicações- Medição de Ags solúveis

Considerações práticas Mesmas dos testes de aglutinação

- Diagnóstico de viroses por vírus hemaglutinantes ( Influenza)

- Teste de Gravidez

Botão = Teste positivo

Rede = Teste negativo

Testes de Formação de Rede

Ag Solúvel

Testes de Precipitação

• Definição - Testes que têm como resultado final a precipitação

de um Ag solúvel

PrecipitaçãPrecipitaçãoo

AG solúvel + AC solúvel Complexo Insolúvel

(rede tridimensional)

A formação de complexo insolúvel depende de: relativa do Ag e Ac (excesso de um ou outro

forma complexos solúveis)

Nº de epítopos presentes na moléculas

Precipitação em meio Líquido

Em tubos

Imunodifusão Radial Simples (Mancini)

• Interpretação― Diâmetro do anel é

proporcional a concentração

• Quantitativo―Níveis de Igs

• Método– Ac incorporado ao gel– Ag no poço

Precipitação em meio Gelificado

Imunodifusão Radial Simples (Mancini)

Imunodifusão Radial Dupla (Ouchterlony)

Interpretação― Número de linhas de precipitação = quantidade de epítopo

Método– Ag e Ac colocados em poços equidistantes no gel– Permite comparação simultânea de vários sistemas antigênicos

Ex: diagnóstico de micoses, titulação de soros

Imunodifusão Radial Dupla (Ouchterlony)

A- Identidade

B- Não identidade

C- Identidade parcial

Comparação entre frações antigênicas

Contra-imuno - Eletroforese•Método

• Ag e Ac migram um contra o outro por eletroforese• Usado somente quando Ag e Ac tem cargas opostas• O movimento eletroforético e a eletroendosmose concentram

rapidamente Ag e Ac

Ag Ac- +

-- +

Contra-imuno - Eletroforese

Qualitativo Semiquantitativo Mais sensível que a imunodifusão dupla Rápido Uso: detecção rápida de Ags bacterianos (pneumonia, meningite, septicemia)

Imunoeletroforese•Método

Ags são separados por eletroforese

• Interpretação– Arcos de precipitação representam o número de antigenos

Ag

Ab

– Ac é colocado em um recorte no agar

Ag-+ Ag

Ab

Imunoelectroforese•Qualitativo

Concentração relativa

• Aplicação:Caracterização de proteínas – anormalidades estruturais ou alterações nas concentrações

Métodos Automatizados• Nefelometria- Precipitação entre Ag x Ac em soluções dliluidas produzem aumento da reflexão da luz que é medida pela dispersão da luz incidente- Acs específicos purose m concentrações constantes- Concentrações crescentes da amostra em análise- Intensidade da luz dispersada = densidade ótica

-Vantagens:Totalmente automatizado, fácil realização, rápido e preciso-Desvantagem:Custo elevado dos equipamentos e dos soros imunesReações inespecíficas: soros lipêmicos e hemolisadosVárias diluições =Ags concentrados

- Aplicação:Determinação de proteinas de significado clínico em qualquer fluido corporalEx: Fator reumatóide, IgA, IgG, IgM, C3, C4,albumina, Ptn C-reativa, transferrina, fibronectina, etc....

Métodos Automatizados

• Turbidimetria• Método sujeito as mesmas condições da Nefelometrias• Principal diferença: sinal de detecção é a absorbância

• Vantagens:-Não necessita de equipamentos especiais- Reações podem ser medidas em espectrofotômetro

• Aplicações:- As mesmas da nefelometria