QFL-5922

Espectrometria de Massa

Luiz Henrique Catalani

Data   Tópicos  

30/03 Espectrometria de massas – Técnicas básicas

06/04 Espectrometria de massas – Teoria de fragmentação

13/04 Espectrometria de massas – Teoria de fragmentação

20/04 Resolução de problemas

27/04 1ª Prova

04/05 Seminários

Períodicos especializados em

espectrometria de massas:

1.  International Journal of Mass Spectrometry

2.  International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes

3.  Journal of Chromatography. A, Including Electrophoresis, Mass

Spectrometry and other Separation and Detection Methods

4.  Journal of Mass Spectrometry

5.  Journal of the American Society for Mass Spectrometry

6.  Mass Spectrometry for Biotechnology

7.  Mass Spectrometry Reviews

8.  Rapid Communications in Mass Spectrometry

Histórico 1897: J.J. Thompson descobre elétron e determina m/z

1912: J.J. Thompson constrói o primeiro espectrômetro de massas

1942: Demster desenvolve a fonte de impacto de elétrons

1942: Primeiro instrumento comercial para análise orgânica

1953: Quadrupolo e ion trap (W. Paul e H.S. Steinwedel, Nobel 1989)

1956: Primeiro GC-MS

1974: Primeiro HPLC-MS

1987: Demonstração de MALDI

1988: Demonstração de ESI

1990s: Crescimento explosivo de MS, devido a ESI e MALDI

2002: Nobel para inventores ESI (Fenn e Tanaka)

A massa molecular

A fórmula molecular

Detalhes estruturais do composto

Informações Obtidas da Espectrometria de Massa

A massa de fragmentos

Espectrometria de Massas

Técnica analítica para: identificação de compostos desconhecidos quantificação de compostos conhecidos.

Sensibilidade: Substâncias podem ser detectadas com

quantidades mínimas de amostra (10-12 g, 10-15 moles pra um composto de massa 1000 Daltons.

Seletividade: Substâncias podem ser identificadas e

quantificadas em concentrações muito baixas (uma parte em 1012) em misturas complexas.

Definição IUPAC Espectrometria de Massas: Estudo de sistemas pela formação de íons em fase gasosa, com ou sem fragmentação, que são caracterizados por suas relações massa carga e abundâncias relativas

Fonte

Ionização

Analisador

Separação dos íons

Detector

Detecção dos íons

Sistema de dados

Manipulação dos dados

Entrada

Introdução da amostra Saída dos

dados

Espectro de massas

m/z0 50 100 150 200 250

Ion

Abun

danc

e (%

)

0

20

40

60

80

100

Em que consiste EM

Espectro de massas

m/z

Ion

abun

danc

e (%

)

100

60

40

80

20

Pico base (ion 100%) Pico do íon molecular (Precursor)

Íons fragmentários

Isótopos

Remoção de elétrons

M M+• – e-

Captura de elétrons

M M– • + e-

Protonação

M + H+ [MH]+

Cationização

M + Na+ [MNa]+

Desprotonação

M H M– – H+

Reações de produção de íons em EM

Necessidade de vácuo

Passo livre médio percorrido por uma

molécula entre colisões

mTorr) em( 95,4cm) (em

pL =

Sugere pressões da ordem de 10-5 torr para mover uma molécula um metro sem colisão

Espectrômetro de massas

Fonte de íons Analisador Detector

Quadrupolo TOF Ion trap FT-ICR Setor Magnético

Alto vácuo 10-5-10-8 mbar

Fotomultiplicador Multiplicador de elétrons Microchannel Plate

Sistema de dados

ESI* APCI* MALDI EI CI

*Fonte de íons a pressão atmosférica

Sistema de inserção

HPLC GC Bomba seringa

Métodos de produção de íons em EM

Métodos de produção de íons em EM

• EI (electron impact)

• CI (chemical ionization)

• FAB (fast atom bombardment)

• MALDI (matrix-assisted laser desorption/ionization)

• API (atmospheric pressure ionization)

• ESI (electrospray ionization)

• APCI (atmospheric pressure chemical ionization)

• ICP (inductively-coupled plasma)

• TIS (thermal ionization source)

Como ocorre a ionização por EI?

Fonte de Impacto Eletrônico (EI)

70 eV e- A-B-C

Elétrons de baixa energia

<70 eV e-

A-B-C+. A+ + B-C.

A. + B-C+

B + C+

A-B . + C+

A-B+ + C .

B+ + C A + B+ A+ + B

cátion radicalar

• Método robusto e simples

• Fragmentação fornece informações estruturais;

• Espectros são facilmente reprodutíveis;

• Existência de biblioteca de “impressões digitais”;

Vantagens

Limitações

• Requer volatilização da amostra ou derivatização;

• Para substâncias de massa molar <800 uma

• Amostra deve ser termicamente estável;

• Íon molecular pode ser de difícil identificação;

• Fragmentação pode ser extensa (moléculas maiores).

Vantagens e desvantagens de EI

Ionização química - CI

Como ocorre a ionização química?

• Modificação de EI

• Resulta em pouca ou nenhuma fragmentação

• Gás e amostra entram junto

• Amostra é tipicamente 1% da mistura

• Maior pressão do gás gera ionização preferencial

• Espécie iônica gerada transfere carga para o analito

Mecanismos de ionização química Troca de carga (hélio como reagente)

Reações ácido-base

Adição de grupo alquila

He+ + M → He + M+

Com metano: CH5+ + M → CH4 + M+ (P elevadas)

Com água: OH- + MH → H2O + M-

C2H5+ + M → MC2H5

+

Como ocorre a ionização química?

A fonte CI é uma fonte EI modificada

O gás reagente pode ser:

• Introduzido diretamente na fonte

• Misturado com a amostra antes de entrar na fonte.

• Requer colisão, logo, as pressões são mais altas

mTorr 495

4,95 01,0

95,4

=

=

=

ppcm

pL

• Determinação do peso molecular (íon molecular)

• Baixa fragmentação

Vantagens

Limitações

• Vários parâmetros (gás, reagente e pressão relativa) dificultam a reprodutibilidade

• Ausência de espectros de referência

• Perda de informações estruturais devido à baixa fragmentação

Vantagens e desvantagens de CI

Bombardeamento rápido de átomos (FAB)

• Técnica rápida e simples para análise de compostos de 300 a 6000 Da;

• Amostra é dissolvida numa matriz líquida, viscosa e com baixa pressão de vapor (glicerol ou álcool 3-nitrobenzílico);

• Matriz é bombardeada com feixe de átomos (xenônio ou argônio) ou íons (césio) de alta energia cinética;

• Moléculas são removidas da superfície da matriz, entram na fase gasosa e se ionizam por protonação ou desprotonação;

• Íon resultante é estável e fragmenta pouco.

Como ocorre a ionização por FAB?

• Rapidez e simplicidade

• Tolerante às variações na amostra

• Corrente intensa de íons (bom para altas resoluções)

Vantagens

Limitações

• Requer que o analito seja solúvel na matriz líquida

• Requer pureza e boa quantidade de amostra

• Não é adequado para compostos com mais de duas cargas

Vantagens e desvantagens de FAB

EM via FAB de 5 peptídeos íons (M+H)+;

Seqüenciamento do m/z 872

•  Preparação de amostra: analito dissolvido junto com uma substancia orgânica, “matriz”, que possui absorção intensa no λ do laser (λ = 337 nm para laser de N2);

•  Dessorção da solução sólida por um laser pulsado (ns) de alta intensidade;

•  Matrizes típicas: ácido 2,5-dihidroxibenzóico; ácido 3,5-dimetóxi-4-hidroxicinâmico; ácido 5-clorosalicílico;

•  Espectro resultante inclui íons (M+H)+, e outros com prótons adicionais, retirados da matriz.

•  Deve ser usado com analisadores compatíveis com métodos pulsados (TOF ou FT-ICR)

Dessorção/ionização a LASER assistida por matriz - MALDI

MALDI

Placa de amostras para MALDI 100 poços padrão

Matrizes típicas Utilizadas em MALDI

• Baixa concentração do analito

• Velocidade

• Análise de polímeros e macromoléculas polares e não-polares (M>50.000)

Vantagens

Limitações

• Não compatível com LC/MS

• Difícil obtenção de espectros de MS/MS

• Deve ser usado com analisadores compatíveis com métodos pulsados (TOF ou FT-ICR)

Vantagens e desvantagens de MALDI

EM via MALDI de um anticorpo monoclonal

EM via MALDI de poli(metil metacrilato) Mw = 7100 Da

MW mero = 100

Ionização por electrospray - ESI

•  Substância dissolvida numa mistura, p.ex. agua-metanol, é injetada diretamente, ou por HPLC, ou por eletroforese capilar.

•  Íons são formados a partir das gotas a pressão atmosférica e formam um jato por expansão livre. O mecanismo exato ainda é objeto de especulações. Amostragem ocorre através de um “skimmer”, e introduzidos no alto vácuo do espectrômetro.

•  Íons com número elevado de cargas. •  Íons com carga múltipla podem ser detectados mesmos com

instrumentos menos sofisticados. •  O número de cargas pode depender do pH, da presença de sais,

desnaturação da proteína, quebra de ligações S-S, etc.

Ionização por electrospray

• Amostras não-voláteis

• Ionização “branda” a pressão atmosférica

• Análise de compostos de elevado peso molecular

• Acoplamento com HPLC e eletroforese capilar

Vantagens

Limitações

• Espécies multiplamente carregadas exigem transformações matemáticas para interpretação do espectro

• Complementar à APCI. Não é boa para compostos não carregados, não básicos e de baixa polaridade, como esteróides

• Muito sensível a contaminantes, tais como metais alcalinos ou compostos básicos

• Corrente de íons relativamente baixa

Vantagens e desvantagens de ESI

EM da lisozima: MW calculado = 17828 ± 2.0 Da

Mioglobina de cavalo MW = 16.951,5 Da

A.  Íons de carga +12 a +24 em

baixa resolução

B.  Ampliação do +17 mostrando picos isotópicos (resolução 15.000)

Determinação do número de cargas e de M em espectros contendo íons com cargas múltiplas

a) Em espectros electrospray, a massa de um íon m1 com carga z1 pode ser equacionada com a massa da molécula (M) e da massa do próton (mp)

)()( 112 jzmMjzm p −+=−

)( 11

111

p

p

mmzMzmMzm

−=

+=

b) Escolhendo outro pico no espectro, separado por (j-1) picos em ordem crescente de m/z, podemos equacionar a massa m2 como

c) Da combinação de (1) e (2):

(2)

(1)

)()(

12

21 mm

mmjz p

−

−= (3)

Ionização química a pressão atmosférica (APCI)

Ionização similar à electrospray, com exceção de que:

• Ocorre em uma coroa de descarga e não no capilar

• Capilar encontra-se aquecido e não está submetido à alta voltagem

• As moléculas de solvente são ionizadas primeiramente

.

NATUREZA DA AMOSTRA   MÉTODO DE IONIZAÇÃO   EXEMPLO  Amostras gasosas, voláteis e

termicamente estáveis  EI, CI   CO2, NO, solventes,PAH, dioxinas  

Moléculas pequenas (< 1000 u), puras e suficientemente estáveis e voláteis para serem dessorvidas de

uma sonda  

EI, CI (Em EI o pico do íon molecular pode

não aparecer)  

Muitas moléculas orgânicas  

Moléculas pequenas (< 1500 u) que não são voláteis ou termicamente estáveis. Devem ter um grau de

afinidade de próton  

FAB (se pura), ESI ou APCI (infusão ou via HPLC,

se necessário).  

Aminoácidos, carboidratos, lipídios  

Moléculas como as acima, mas que podem ser derivatizadas para dar

produtos voláteis e estáveis  

EI ou CI usando CG/MS.   Ácidos como ésteres, álcoois como silil-éteres  

Peptídeos, proteínas e oligonucleotídeos  

ESI (via bomba de infusão ou acoplada com micro-CLAE).  

Proteínas intactas.  

Proteínas, peptídeos e misturas do mesmos  

MALDI   PPG, PEG  

Interações não-covalentes ESI (nanoflluxo) com MS-MS. Interações droga-droga ou droga-proteína

Análise elementar ICP ou TIS Solo

Métodos de análise de íons em EM

Métodos de análise de íons em EM

• Deflexão elétrica

• Deflexão magnética

• Quadrupolo

• Tempo de vôo – TOF (time of flight)

• Aprisionamento de íons – IT (Ion trap)

• Ressonância ciclotrônica de íons – FT-ICR (Fourrier-

transform ion cyclotron resonance)

Deflexão magnética

Deflexão magnética

Deflexão elétrica

Deflexão elétrica

Foco duplo – alta resolução

Modelo Nier-Johnson - E constante H variável

Quadrupolo

-+

- ++

-- +

Quadrupolo

22

2υDV

zM

=

D

Para um determinado V, D e ν só existe um M/z que tem uma oscilação estável através do quadrupolo sem chocar-se com os polos.

TOF (tempo de vôo)

TOF tipo Reflectron

TOF (tempo de vôo)

TOF = t0 + ta + tD + td

Onde: t0 = tempo de formação do íon

ta = tempo de aceleração tD = tempo de percurso

td = tempo de resposta do detector

TOF (tempo de vôo)

Aprisionamento de íons (Ion trap)

• Íons são presos através da ação de três eletrodos (2 end-cap e um anel)

• Voltagens aplicadas geram uma cavidade onde os íons oscilam em uma trajetória estável

• A trajetória exata dos íons é dependente das voltagens aplicadas e da razão m/z

• A alteração dos potenciais destabiliza a trajetória resultando em sua ejeção através do endcap de saída, em ordem crescente de m/z

• É possível isolar um valor particular de m/z e, assim, permitir experimentos CID (collision induced dissociation), para análise de íons-filho e MSn

Aprisionamento de íons (Ion trap)

Ressonância ciclotrônica de íons

FT-ICR (Fourrier-transform ion cyclotron resonance)

• Íons se movem em um movimento circular em um campo magnético

• A freqüência ciclotrônica do movimento circular é dependente da massa

• Sob excitação externa de mesma freqüência (ressonante), a orbita aumenta e, quando se aproxima do receiver plate, induz uma corrente imagem que é amplificada e digitalizada

• Um unico pulso contendo todas as freqüências gera uma corrente-imagem contendo informações sobre todos os íons de diferentes massas (diferentes freqüências)

• Transformada de Fourrier do sinal da corrente-imagem gera espectro de massa

Ressonância ciclotrônica de íons

Ressonância ciclotrônica de íons

• Técnica de grande resolução (maior entre TOF, IT e anteriores)

• Adequado para técnicas pulsadas como MALDI

• Magneto supercondutor provém calibração estável

• Faixa dinâmica de trabalho é baixa

• Apresenta artefatos como harmonicas e bandas laterais

Ressonância ciclotrônica de íons

Orbitrap

- Similar ao FT-ICR

- Maior resolução (~200.000)

- Maior faixa dinâmica de trabalho

(~5000 Da)

Análise em série – Tandem MS

Análise em série – Tandem MS

• Combina dois ou mais analisadores diferentes ou do mesmo tipo

• O primeiro analisador isola o íon de interesse (íon parente)

• Íons são fragmentados entre o primeiro e segundo analisador através

de colisões ou irradiação

• O último analisador obtém o MS dos fragmentos (íons filho)

Detectores

Detectores - Fotomultiplicadoras

Detectores – Multiplicadora de dinôdo contínuo

Detectores – Microchannel plate

12,5 µm de diâmetro

Fim